Quim. Nova, Vol. 30, No. 4, 930-934, 2007

Artigo

*e-mail: helder@farmacia.ufrgs.br

ADSORO DE OLIGONUCLEOTDEOS EM NANOEMULSES OBTIDAS POR EMULSIFICAOESPONTNEA

rico Martini, Edison Carvalho e Helder Teixeira*Faculdade de Farmcia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Ipiranga, 2752, 90610-000 Porto Alegre RS, BrasilFabiana Leo e Mnica Cristina de OliveiraFaculdade de Farmcia, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Presidente Antnio Carlos, 6627, 31270-901 Belo Horizonte MG, Brasil

Recebido em 21/7/06; aceito em 12/9/06; publicado na web em 27/4/07

OLIGONUCLEOTIDE ADSORPTION ON NANOEMULSIONS OBTAINED BY SPONTANEOUS EMULSIFICATION. This paperdescribes the adsorption of an oligothymidylate (pdT16) on nanoemulsions obtained by spontaneous emulsification procedures.Formulations were composed by medium chain triglycerides, egg lecithin, glycerol, water (NE) and stearylamine (NESA). Afteroptimization of operating conditions, the mean droplet size was smaller than 255 nm. Adsorption isotherms showed a higher amountof pdT16 adsorbed on cationic NESA (60 mg/g) compared to NE (20 mg/g). pdT16 adsorption was also evidenced by the inversion ofthe -potential of NESA (from +50 to -30 mV) and the morphology of oil droplets examined through transmission electron microscopy.The overall results showed the role of electrostatic interactions on the adsorption of pdT16 on the oil/water interface of nanoemulsions.

Keywords: cationic nanoemulsions; oligonucleotides; adsorption.

INTRODUO

A complexao de polinucleotdeos em sistemas coloidaislipdicos catinicos (i.e., lipossomas, nanopartculas e nanoemul-ses) tem sido considerada como uma estratgia promissora parasua administrao in vivo1-4.

Nos ltimos anos, a formao de complexos entre polinucleo-tdeos e nanoemulses catinicas tem sido particularmente descritana literatura5-14. Nanoemulses catinicas so geralmente constitu-das de um ncleo oleoso (de origem natural ou semi-sinttica) esta-bilizado por mistura binria de fosfolipdeos e lipdeos catinicos.Os polinucleotdeos formam espontaneamente um complexo em meioaquoso atravs de interaes eletrostticas entre os grupamentosfosfato e os grupamentos carregados positivamente dos lipdeoscatinicos. A carga de superfcie positiva dessas nanoestruturas con-duz a um aumento significativo da penetrao intracelular dospolinucleotdeos, em decorrncia das interaes com as membranascelulares carregadas negativamente8,10,14. Alm disso, a formao docomplexo reduz a cintica de degradao dos polinucleotdeos fren-te ao ataque enzimtico6,7,11,12.

Estudos relativos formao de complexos entre polinucleotdeosem fita simples, denominados oligonucleotdeos (ON), e nanoemul-ses catinicas obtidas por microfluidizao foram descritos porTeixeira e colaboradores11-14. A carga de superfcie e o tamanho dofragmento foram identificados como os principais fatores que influ-enciam a eficincia de complexao do ON com a nanoestrutura11.Estudos posteriores de potencial zeta, transferncia de energia defluorescncia e de tenso interfacial permitiram caracterizar a inte-rao dos oligonucleotdeos com os constituintes das formulaes(fosfolipdeos e/ou lipdeos catinicos), sugerindo a adsoro dosON na interface leo/gua (O/A) das nanoemulses12,13.

Recentemente, foi descrita na literatura15,16 a viabilidade de pre-parao de nanoemulses catinicas contendo ON, atravs do pro-cedimento de emulsificao espontnea. O interesse desse procedi-

mento reside, entre outros, na sua adequao para preparao depequenos lotes de formulao, a temperaturas moderadas, em estu-dos de bancada e na possibilidade de funcionalizao da interfacedas nanoemulses, atravs da nanodeposio de polmeros pr-for-mados15,17. Esse procedimento baseia-se na emulsificao espont-nea dos constituintes da fase interna (previamente solubilizados emsolvente orgnico) em gua, seguida da retirada do solvente geral-mente por destilao sob presso reduzida. A formao das gotculasocorre quando a fase orgnica vertida na fase aquosa, provocandouma turbulncia interfacial que ocorre durante a difuso do solventeorgnico na gua, observando-se rpido espalhamento da interface,como resultado da difuso mtua entre os solventes, o que forneceenergia suficiente para formao das gotculas18.

Diversos parmetros podem influenciar as propriedades fsico-qumicas das nanoemulses obtidas, entre eles, as condies deemulsificao empregadas e a composio quali e quantitativa dasformulaes18,19. Como um exemplo recente, Bouchemal e colabo-radores18 descreveram o efeito da viscosidade e do equilbrio hi-drfilo-lipfilo do ncleo oleoso e a miscibilidade da fase orgnicaem gua sobre o dimetro de gotcula das nanoemulses.

Neste estudo, a primeira etapa teve por objetivo avaliar a influ-ncia da natureza e quantidade de solvente orgnico utilizado noprocedimento de emulsificao espontnea sobre o dimetro degotcula das nanoemulses. Aps essa etapa de otimizao, aisoterma de adsoro de um oligonucleotdeo politimidilato (pdT16)foi realizada, bem como a avaliao da influncia da adsoro doON sobre a morfologia e as propriedades fsico-qumicas das nano-emulses (i.e., dimetro, potencial zeta e viscosidade).

PARTE EXPERIMENTAL

Materiais

pdT16 e estearilamina (SA) foram adquiridos junto Invitrogen(Brasil) e Sigma (EUA), respectivamente. Triglicerdeos de cadeiamdia dos cidos cprico e caprlico (TCM) e lecitina de gema de

931Adsoro de oligonucleotdeos em nanoemulsesVol. 30, No. 4

ovo (Lipoid E-80) foram gentilmente doados pela Lipoid GmbH(Alemanha). Todos os outros reagentes e solventes utilizados fo-ram de grau analtico.

Preparao das nanoemulses

As nanoemulses foram preparadas atravs do procedimentode emulsificao espontnea. Os constituintes das fases oleosa eaquosa foram solubilizados em solvente orgnico e gua, respecti-vamente. Em seguida, a fase orgnica foi vertida sobre a fase aquo-sa atravs de funil calibrado, sob agitao moderada e constante,seguida da retirada do solvente atravs de evaporao sob pressoreduzida em evaporador rotatrio. A Tabela 1 apresenta a composi-o final das formulaes. A fim de otimizar as condies deemulsificao espontnea, as nanoemulses foram preparadas comquantidades crescentes de acetona/gua e etanol/gua, nas propor-es de 1:2; 2:4; 3:6 e 4:8 (solvente orgnico:gua) para a obten-o de 1 mL de formulao final. Aps o preparo, o pH das formu-laes foi ajustado a cerca de 7.

Validao da metodologia para quantificao do pdT16

Os parmetros de validao selecionados para doseamento dopdT16 por UV seguiram as normas de validao dos procedimentosanalticos e de metodologias do International Conference on theHarmonization of Technical Requirements for the Registration ofPharmaceuticals for Human Use 20. Foram avaliados os parmetrosde linearidade, repetibilidade, preciso intermediria e especifici-dade. Os ensaios foram realizados em um comprimento de onda de266 nm, utilizando-se espectrofotmetro UV-Visvel modeloHewlett-Packard 8452A. O mtodo mostrou-se linear (r =0,9974)em uma gama de concentrao de 2,5 a 25 g/mL e preciso (DPR =2,05 e 1,70%, para repetibilidade e preciso intermediria, respec-tivamente). A especificidade foi testada na presena de glicerol(fase externa das nanoemulses), demonstrando que esse adjuvanteno influencia na quantificao do pdT16.

Estudos de adsoro do pdT16

Em uma primeira etapa, a recuperao do pdT16 foi determinadaem unidades de ultrafiltrao constitudas de celulose regenerada de30 kDa (Ultrafree, Millipore). Solues aquosas contendo pdT16(25 a 250 g/mL) foram centrifugadas e a quantidade de pdT16 noultrafiltrado foi determinada. Por diferena entre a quantidade inici-al e a detectada foi determinada a taxa de recuperao (%) do pdT16.

Para os estudos de adsoro, solues aquosas contendo o pdT16(25 a 250 g/mL) foram preparadas. As nanoemulses (NE e NESA)foram ento adicionadas s solues aquosas de pdT16 temperatu-ra ambiente. Aps 30 min, as amostras foram colocadas nas unida-des de ultrafiltrao e centrifugadas a uma velocidade de 5.000rpm por 20 min e a concentrao de pdT16 no adsorvida foi deter-minada no ultrafiltrado. Para todas as amostras foi realizado umespectro de absoro no UV na faixa de 200 a 400 nm, a fim de

verificar a ausncia de qualquer pico interferente. Em todos os ca-sos, a concentrao final de fase interna das nanoemulses no meiode adsoro foi de 2 mg/mL. Os resultados foram expressos comoa mdia de trs experimentos independentes e a quantidade de pdT16adsorvida por grama de fase interna de nanoemulso foi obtidaatravs da Equao

qi-qrQa = q

ne

onde, Qa= quantidade de pdT16 adsorvido (mg de pdT16/g de fase inter-

na); qi= quantidade de pdT16 inicial adicionada s nanoemulses (mg);q

r= quantidade de pdT16 recuperada no ultrafiltrado (mg) e, qne= quan-

tidade de fase interna de nanoemulso no meio de adsoro (g).

Caracterizao das nanoemulses

As nanoemulses foram caracterizadas antes e aps a adsorodo pdT16, como segue: o dimetro mdio das gotculas e o potenci-al zeta das formulaes foram determinados atravs de espectros-copia de correlao de ftons e da mobilidade eletrofortica, res-pectivamente, utilizando-se um Zetasizer 3000HS (MalvernInstruments Ltd., Reino Unido), aps adequada diluio das amos-tras. O pH das nanoemulses foi determinado utilizando-sepotencimetro digital Micronal B 474 (Micronal, So Paulo, Bra-sil), antes e aps o seu ajuste a cerca de 7. A viscosidade dasnanoemulses foi determinada por viscosimetria capilar, segundoa Farmacopia Brasileira21. Aps a determinao do tempo de es-coamento, calculou-se a viscosidade das nanoemulses usando adensidade determinada em picnmetro. A morfologia das gotculasde nanoemulses foi avaliada por microscopia eletrnica de trans-misso (MET). As amostras foram adicionadas em suportes met-licos (200 mesh) de cobre com revestimento de carbono e Formvar,sendo o contraste negativo realizado com acetato de uranila a 2%(m/v). Em seguida, as amostras foram armazenadas por 24 h e,ento, submetidas anlise atravs de MET, com aumento de100.000 vezes.

Anlise estatstica

Os resultados foram analisados atravs de teste t de Student,considerando-se um nvel de significncia de 0,05.

RESULTADOS E DISCUSSO

A Figura 1 apresenta a influncia da natureza e do volume dossolventes empregados no procedimento de emulsificao espontneasobre o dimetro de gotcula e ndice de polidispersidade dasnanoemulses NE e NESA. Etanol e acetona foram selecionados para oprocedimento de emulsificao espontnea, uma vez que so solventesmiscveis com gua e classificados como de baixo potencial txico22.Como pode ser observado, independente da natureza do solvente em-pregado e da presena do lipdeo catinico estearilamina, ocorre umareduo do dimetro de gotcula das nanoemulses, at cerca de 250nm, com o aumento progressivo da quantidade de solvente utilizada.A reduo do dimetro das gotculas pode ser atribuda maior velo-cidade de difuso da fase orgnica em gua, como conseqncia damenor concentrao dos componentes da fase interna solubilizados nasoluo orgnica18,23. Contudo, no foi observada uma reduo suple-mentar do dimetro de gotcula (p

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A NE isenta de lipdeo catinico apresenta um potencial zetanegativo (Tabela 2) devido presena de fosfolipdeos cidos nalecitina de gema de ovo, como a fosfatidilserina e o cido fosfatdico24.A adio de estearilamina nanoemulso conduz inverso do po-tencial zeta para valores positivos, demonstrando sua localizao nainterface O/A. A estearilamina um lipdeo catinico que apresentaum pK de 10,6, conferindo assim uma carga global positiva no pHfinal das nanoemulses. A presena do lipdeo catinico tambminfluencia o pH final da formulao NESA, indicando o efeito do seugrupamento polar, amina primria, sobre esse parmetro.

A avaliao da adsoro de ON com nanoemulses tem sidorealizada de maneira indireta11-13. De fato, o ON no complexado quantificado em uma frao da fase aquosa externa das nanoemulses,obtida aps prvia separao utilizando-se membranas de ultrafil-trao. A determinao da recuperao do ON atravs das membra-nas representa uma etapa prvia fundamental para se avaliar se amembrana no representa um fator limitante passagem do ON so-lvel na fase aquosa externa. Neste estudo, a taxa de recuperao dopdT16 em soluo aquosa foi superior a 98%, na faixa de concentra-o das isotermas de adsoro, comprovando que a membrana deultrafiltrao selecionada no representa um fator limitante para apassagem do ON pdT16 solvel na fase aquosa externa.

A Figura 2 apresenta as isotermas de adsoro do pdT16 para asformulaes NE e NESA. Pode-se observar a adsoro do pdT16 atcerca de 20 mg/g de fase interna de NE. Essa reduzida adsoro deveestar relacionada com as propriedades de superfcie dessas formula-es. O potencial zeta negativo da formulao NE (Tabela 2) podelimitar o acesso dos ON interface, devido a fenmenos de repulsoeletrosttica13,17. Contudo, para NESA a adsoro do pdT16 foi signifi-cativamente superior. A isoterma pode ser dividida em duas etapas.Na primeira, ocorre um aumento progressivo da quantidade de pdT16adsorvido at um mximo (~60 mg/g de fase interna). Possivelmen-te, isto ocorre devido elevada afinidade das cargas positivas dasgotculas pelos grupamentos fosfato carregados negativamente doON. Esses resultados indicam que a presena do lipdeo catinico nainterface de NESA aumenta substancialmente a capacidade de adsorodo pdT16, atravs de interaes eletrostticas. Na segunda etapa, quan-tidades suplementares de pdT16 no alteram a quantidade de pdT16associado, sugerindo o alcance da saturao dos stios de interaocarregados positivamente para a associao dos ON.

A Figura 3 apresenta a influncia da adsoro do pdT16 nas pro-priedades fsico-qumicas da NESA. Como pode ser observado, exis-te uma tendncia ao aumento do dimetro de gotcula de NESA (3A)com a adsoro do pdT16. O dimetro mdio encontra-se prximo a300 nm sendo, em todos os casos, superior ao dimetro original (Ta-bela 2), sugerindo que a adsoro do pdT16 conduz a um aumento doraio hidrodinmico das gotculas. No caso especfico das concentra-es compreendidas entre cerca de 3 e 30 mg/g, o dimetro mdio superior a 300 nm. Esse resultado deve estar relacionado com a zonade inverso do potencial zeta de NESA, o que poderia no momento daadsoro do pdT16 (3C) ter originado agregados resultantes daneutralizao de cargas. Apesar das diferenas em relao ao dime-tro (3A), os resultados demonstram que no existe influncia do pdT16na viscosidade das nanoemulses (3B): a viscosidade foi prximade 1 cP, independente da concentrao de pdT16. Contudo, observa-se uma reduo de cerca de 60% na viscosidade em comparao aos

Figura 1. Dimetro mdio de gotcula (barras) e ndice de polidispersidade(smbolos) da nanoemulso isenta de lipdeo catinico (NE) ou contendo olipdeo catinico estearilamina (NESA), utilizando acetona ou etanol comosolvente no procedimento de emulsificao espontnea

Tabela 2. Propriedades fsico-qumicas das nanoemulses NE e NESANE NESA

pH a 6,36 0,10 8,70 0,02Dimetro de gotcula (nm) ,230 7 ,255 14Potencial zeta (mV) ,,-32 2 ,050 8Viscosidade (cP) 1,50 0,02 1,60 0,03(a) pH das nanoemulses antes do ajuste a cerca de 7.

Figura 2. Quantidade de ON pdT16 adsorvido s nanoemulses NE () ouNESA () em funo da quantidade de pdT16 adicionado

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valores obtidos antes da associao do ON (Tabela 2), indicando ainfluncia da concentrao final de fase interna (2 mg/mL), obtidaaps a adio da soluo de ON. Uma menor concentrao de faseinterna reduz as interaes interparticulares, podendo resultar emmenor viscosidade das nanoemulses25,26.

Em relao ao potencial zeta, a adio de quantidades crescen-tes de pdT16 conduz sua reduo (Figura 3C). O potencial zeta deNESA apresenta inicialmente um valor positivo de 50 mV. Aps aadio das menores quantidades de pdT16 (0,325 e 3,25 mg/g), ob-serva-se uma reduo no potencial zeta at cerca de 2030 mV. Asconcentraes maiores de pdT16 conduzem rapidamente a uma in-verso do potencial zeta original para valores negativos de cerca de-30 mV, indicando a neutralizao das cargas positivas dos lipdeoscatinicos na interface da NESA. De fato, nas condies experimen-tais utilizadas, a relao de cargas [+/-] varia de 20 at 0,01, portan-to, justificando os resultados de potencial zeta observados.

A avaliao da morfologia foi realizada por MET antes e apsassociao do pdT16 com NE e NESA (Figura 4). As fotomicrografias(A e B) revelam estruturas esfricas de dimetro na faixa de 200-300 nm, com interface definida e sem influncia da composiodas nanoemulses. Os resultados confirmam aqueles obtidos pelatcnica de espectroscopia a laser de autocorrelao, como demons-trado na Tabela 2. As fotomicrografias C e D demonstram que osdimetros de gotculas no sofrem influncia marcante aps adi-o do pdT16, sendo prximos aos valores observados antes da as-sociao do pdT16. Em contrapartida, os resultados sugerem a for-mao de uma camada mais espessa no limite das gotculas oleo-sas da NESA, indicando a presena do pdT16 associado interface,corroborando os resultados obtidos na adsoro do pdT16 (Figura

Figura 3. Dimetro (A), viscosidade (B) e potencial zeta (C) da nanoemulsoNESA, aps adio de quantidades crescentes do pdT16

2). Assim, as reas mais escuras observadas na interface dasgotculas podem ser atribudas elevada afinidade do reagente decontraste (acetato de uranila) pelos cidos nuclicos27,28.

CONCLUSES

Este estudo demonstrou, na primeira etapa, a possibilidade demodulao do dimetro de gotcula das nanoemulses a partir daotimizao do volume de solventes empregados no procedimento deemulsificao espontnea. A adsoro do pdT16 nas nanoemulsesfoi claramente influenciada pela presena do lipdeo catinicoestearilamina na interface O/A. A maior associao do pdT16 interface das NESA resultante das interaes eletrostticasestabelecidas entre ambos. Essa adsoro foi igualmente evidencia-da pela inverso do potencial zeta e atravs da avaliao da morfologiadas gotculas da fase interna por MET. No seu conjunto, esse traba-lho demonstra as potencialidades de nanoemulses obtidas poremulsificao espontnea como um sistema carreador de ON.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq, FAPERGS, FAPEMIG e CAPES/COFECUB n 540/06 pelo suporte financeiro e ao Centro de Microscopia Eletrnicada UFRGS pelo suporte tcnico nas anlises de MET.

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Figura 4. Fotomicrografias (MET) das nanoemulses antes e aps a associaodo pdT16. Legenda: NE (A), NE/pdT16 (C), NESA (B) e NESA/pdT16 (D)

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