AS CARACTERÍSTICAS DOS MECANISMOS E...

AS CARACTERÍSTICAS DOS MECANISMOS E SISTEMAS DE

EDIÇÃO GENÔMICA

LISTIK, Eduardo1; CARMO, Ana Carolina Viegas

2

[email protected]

Centro de Pós-Graduação Oswaldo Cruz; 1Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade

de São Paulo (ICB-USP); 2Universidade Estadual de Montes Claros (UNIMONTE)

Resumo: A edição genômica se baseia na aplicação de tecnologias que exploram,

frequentemente, a função de nucleases programáveis, tal como as nucleases dedo de zinco, as

meganucleases, as TALE nucleases e a Cas9 presente no sistema CRISPR-Cas9; de modo a

introduzirem quebras nas fitas duplas de DNA. Os mecanismos de reparo endógeno, tais

como a união terminal não-homóloga ou o reparo direcionado por homologia, podem

condicionar a modificações no DNA (mutações, correções, deleções, inserções, knock outs)

que possuem finalidades terapêuticas em doenças genéticas, ou até mesmo em doenças

imunes ou neurodegenerativas.

Palavras-chave: Edição genômica, Nucleases programáveis, Engenharia genética.

Abstract: Genomic editing is based on technologies that frequently explore the function of

programmable nucleases, such as zinc finger nucleases (ZNF), meganucleases, TALE

nucleases and Cas9, which comprehends the CRISPR-Cas9 system; as a parameter to induce

double strand breaks (DSBs) into the DNA. Mechanisms of endogenous DNA repair, as non-

homologous end-joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR) can prompt DNA

modifications (mutations, corrections, deletions, insertions, knock outs), which have many

therapeutic values in genetic diseases, or even immune- or neurodegenerative-associated

pathologies.

Keywords: Genomic editing, Programmable nucleases, Genetic engineering.

1 OS FUNDAMENTOS DA EDIÇÃO GENÔMICA

As tecnologias baseadas na edição genômica exploram, frequentemente, a função de

nucleases programáveis, como nucleases dedo de zinco, meganucleases, as TALE nucleases e

a Cas9 presente no sistema CRISPR-Cas9 (HOTTA e YAMANAKA, 2015). Tais tecnologias

possibilitam a edição genômica ao introduzirem quebras na fita dupla de DNA (em inglês,

double strand breaks, DSBs) em loci específicos. Tais DSBs envolvem diversos mecanismos

de reparo endógenos como a união terminal não-homóloga (em inglês, non-homologous end-

joining, NHEJ) ou reparo direcionado por homologia (em inglês, homology-directed repair,

HDR) (COX et al., 2015).

Após a formação da DSB, os mecanismos de reparo por HDR ou por NHEJ podem se

suceder. O reparo por HDR (Erro! Fonte de referência não encontrada.D, E) parte do

ponto clivado, mas exige a existência de um modelo para que este reparo seja sucedido

(SZOSTAK et al., 1983). A HDR pode ser empregada para restaurar a funcionalidade de

genes mutados pela sua correção, retomando sua expressão e finalidade fisiológica benéfica.

Neste caso, o emprego de padrões de DNA exógenos que especificam o resultado do reparo

de DSBs-alvo possibilita este emprego de ferramenta de reparo de forma terapêutica

(CHOULIKA et al., 1995).

O reparo em DSBs por NHEJ (Erro! Fonte de referência não encontrada.A–C), por

outro lado está associado com o religamento direto da quebra. Este procedimento, embora

apresente certa acurácia, está associado com eventuais mutações, quer por deleções ou

inserções, os chamados indels (LIEBER et al., 2003). O aspecto mutagênico associado com a

NHEJ elicita possibilidades de explorar as características desta ferramenta de reparo para a

indução da mutagênese, knock out ou deleção de determinados genes de interesse. Em

determinados eventos patológicos, como ocorre na distrofia muscular de Duchenne, a deleção

de genes pode resultar na expressão de proteínas defectivas. Neste caso, a modificação de tais

genes pelos indels a partir da NHEJ direcionada pode restaurar a função de tais proteínas

(OUSTEROUT et al., 2013). Os reparos induzidos pela NHEJ também têm a capacidade

introduzir códons de parada prematuros em genes de interesse, possibilitando o knock out de

tais genes (PEREZ et al., 2008; ARONIN e DIFIGLIA, 2014). Ademais, a indução de duas

DSBs em determinada sessão do DNA pode acarretar na deleção genômica pela NHEJ (XIAO

et al., 2013).

Até este ponto averiguaram-se aspectos da correção, mutação, knock out e deleção de

genes. A inserção de genes é possível mediada quer por HDR ou NHEJ. No caso da HDR, é

possível o uso de um modelo de DNA que apresente transgenes terapêuticos, os quais podem

ser inseridos em determinados loci do genoma, denominados de safe harbor, fato que diminui

os riscos de mutagênese e aumenta a expressão do gene (MOEHLE et al., 2007). Pode-se

adicionar um transgene por NHEJ induzindo a DSB por nucleases de modo a proporcionar

uma clivagem compatível para inserção do transgene como um indel (MARESCA et al.,

2013).

Mecanismos de edição genômica envolvendo NHEJ (A–C) e HDR (D e E). (A) O reparo

por NHEJ pode condicionar à inserção ou deleção (indels) de sequência em genes,

condicionando a formação de códons de parada, promovendo o knock out de tais genes. (B) A

indução de duas DSBs pode promover a deleção de sequências genômicas por NHEJ, de

modo a reparar proteínas mutadas. (C) Transgenes podem ser inseridos por NHEJ em DSBs a

partir de doadores que contenham pontos de reconhecimento. (D) A HDR também pode

condicionar à adição de genes em loci específicos, como os safe harbor loci. A inserção é

condicionada a partir de um modelo de DNA contendo o gene de interesse. (E) Ademais, a

HDR permite corrigir sequências com mutações, necessitando de um modelo corretivo de

DNA para tal.

Figura 1 Mecanismos de Edição Genômica

A) Mutação/Knock out

B) Deleção

C) Inserção (Knock in) por NHEJ

D) Inserção (Knock in) por HDR

E) Correção

2 AS NUCLEASES PROGRAMÁVEIS

Os mecanismos de reparo do DNA quer por NHEJ ou HDR consistem em formas

endógenas de reparo de DSBs. No entanto, tal ferramentário pode ser explorado quando

determinadas DSBs são intencionalmente e direcionalmente realizadas. As possibilidades

terapêuticas neste caso são vastas e abordam as inúmeras técnicas tecidas previamente. De

forma a condicionar DSBs em pontos específicos, tem-se o papel das nucleases programáveis.

2.1 Nucleases dedo de zinco

Os dedos de zinco (em inglês, zinc fingers, ZFs) constituem pequenos domínios proteicos

em que o zinco contribui para a estabilidade térmica e conformacional da estrutura. ZFs estão

presentes em inúmeras proteínas que reconhecem sequências de DNA, atuantes como fatores

de transcrição (KLUG, 2010). Este reconhecimento se faz tanto pela interação entre os

aminoácidos individuais -1, 3 e 6 presentes no ZF e as bases nitrogenadas do DNA, quanto

por potenciais ligações de hidrogênio entre o aminoácido 2 do ZF e a fita complementar de

DNA, numa interação cruzada (em inglês, cross-strand) (PAVLETICH e PABO, 1991;

ISALAN et al., 1997).

Dentre a classificação dos ZFs, os da família C2H2 constituem os mais estudados.

(IUCHI, 2001). Tais ZFs apresentam dois pares de resíduos conservados de cisteínas e

histidinas que quelam o zinco. Estruturalmente, são compostos por um grampo β, associado a

uma hélice em α que se desenvolve em uma unidade ββα (KRISHNA et al., 2003).

As nucleases dedo de zinco (em inglês, zinc finger nucleases, ZFNs) consistem na

associação de séries de ZFs C2H2 com a endonuclease de restrição FokI, a qual apresenta

domínios de ligação no DNA (em inglês, DNA binding domains, DBDs) independentes dos

próprios ZFs (LI et al., 1992). A associação de ZFs com a FokI forma nucleases quiméricas

com novas propriedades e especificidades de ligação (KIM e CHANDRASEGARAN, 1994).

Para gerar a DSB, as ZFNs devem atuar como um dímero na dupla fita (Erro! Fonte de

referência não encontrada.) (SMITH et al., 2000).

Figura 1 Funcionamento das nucleases dedo de zinco. As ZFs Cys2His2 são pequenos

domínios proteicos estabilizados pelo zinco cuja interação direta na fita 3’-5’ (aminoácidos ou

a.a. -1, 3 e 6 do ZF) ou cruzada com a fita 5’-3’ (a.a. 2 do ZF) permitem o reconhecimento de

elementos da fita dupla, especialmente em regiões ricas em guanina (em amarelo, verde e azul

claro). As ZFNs consistem em ZFs associados à FokI, que reconhece a sequência 5’-GGATG-

3’, induzindo à clivagem da fita (região em vermelho). A atuação de dímeros de ZFNs

condiciona à formação de DSBs.

2.2 Meganucleases

Meganucleases, também conhecidas como endonucleases teleguiadas (em inglês, homing

endonucleases, HEs), consistem em endonucleases capazes de reconhecer grandes e

específicas sequências de DNA, normalmente com mais de 14 pares de bases, e clivar a fita

formando DSBs em tais loci (SMITH et al., 2006). O uso de HEs tem se baseado na correção

de determinados genes a partir do reparo por HDR (DONOHO et al., 1998).

As HEs podem ser divididas em cinco famílias com base em sua sequência e motivos

estruturais: His-Cys box, GIY-YIG, HNH, PD-(D/E)XK e LAGLIDADG, sendo esta última a

mais estudada e tendo sido verificada em todos os reinos biológicos. HEs da família

LAGLIDADG possuem, normalmente, a capacidade de facilitar a corte-junção (splicing) de

suas próprias regiões intrônicas; ou de agir como endonucleases altamente específicas,

capazes de clivar a junção exon-exon onde seu intron reside (SILVA et al., 2011).

Dois grupos de HEs da famílias LAGLIDADG largamente empregados são os de único

motivo proteico, I-CreI (Figura 3A), ou de duplo motivo proteico, PI-SceI, que apresentam o

domínio da endonuclease na estrutura αββαββα, a qual promove um centro catalítico

bipartido. No caso da I-CreI, há a formação de um homodímero composto pelos domínios α/β,

ao passo que na PI-SceI, uma HE monomérica, dois domínios estão presentes, em que um

formado por α/β apresenta a função de endonuclease e outro, formado por folhas β, está

associado com modificações transcricionais (DUAN et al., 1997; HEATH et al., 1997).

O que se averigua das HEs é a sua capacidade de identificar, com grande especificidade,

grandes sequências de DNA e promover DSBs. Em HEs sintéticas, busca-se redesenhar tais

endonucleases, de modo a redefinir as sequências de clivagem, mas de modo que a

estabilidade e estrutura terciária das proteínas sejam mantidas. O intuito de tal é promover o

reparo de distintas regiões mutadas do DNA por meio da HDR e proporcionado o aspecto

terapêutico.

Arnould e colaboradores descreveram um método para a obtenção de I-CreI mutantes

capazes de reconhecer sequências de DNA distintas. Em primeira instância, induzem-se

mutações nos distintos DBDs de cada domínio da I-CreI, e posteriormente combinam-se as

regiões mutantes para originar complexos I-CreI homodiméricos mutantes. Pode-se, por fim,

combinar heterodímeros de modo a criar HEs com especificidades completamente

modificadas (

B). (ARNOULD et al., 2007).

Figura 2 Características estruturais e de reconhecimento de meganucleases (A) e princípios

da confecção de HEs mutantes (B). (A) A I-CreI é uma HE da família LAGLIDADG, cuja

estrutura é formada por domínios α/β, permitindo a estrutura em dois DBDs específicos

(marcados de amarelo e verde). A ação da endonuclease é atingida com a estrutura

homodimérica da I-CreI, onde a clivagem ocorre na região destacada em vermelho

(CHEVALIER et al., 2002). (B) Método de síntese de meganucleases mutantes para

reconhecimento de sequências distintas do DNA. Selecionam-se I-CreI com mutações em

regiões específicas (A/A’, B/B’, C/C’ e D/D’), e posteriormente realiza-se a combinação para

formar I-CreI homodiméricas mutantes (AB/B’A’ e CD/D’C’). Por fim, heterodímeros são

confeccionados por co-expressão (AB/D’C’).

2.3 TALE Nucleases

TALENs (em inglês, transcription activator-like effector nucleases) consistem em DBDs

cutomizáveis associadas a uma FokI não-específica. As DBDs, neste caso, consistem em

repetições altamente conservadas derivadas dos efetores pseudo-ativador de transcrição (em

inglês, transcription activator-like effectors, TALEs), proteínas secretadas pela Xanthomonas

(JOUNG e SANDER, 2013).

A forma com a qual as TALEs efetivam o reconhecimento de sequências do DNA se

baseia no pareamento de bases com dois resíduos hipervariáveis, normalmente nas posições

12 ou 13 do domínio (BOCH et al., 2009). Desta forma, sequência de resíduos de asparagina-

isoleucina (NI) reconhece a adenina (A); a de histidina-aspartado (HD) reconhece a cisteína

(C), e assim por diante (MOSCOU e BOGDANOVE, 2009). Uma timina (T), no entanto,

sempre precede as repetições. A repetição de asparagina-asparagina (NN) reconhece

preferencialmente a guanina (G), mas também pode reconhecer A. A repetição de resíduos

hipervariáveis asparagina-histidina (NH) possui uma afinidade levemente maior pela guanina

que NN (STREUBEL et al., 2012) (Erro! Fonte de referência não encontrada.).

Similarmente às ZFNs, TALENs podem ser empregadas para promover edição genômica

por NHEJ ou HDR. Mutações induzidas por NHEJ foram utilizadas para efetuar o knock out

de diversos genes, de modo a originar modelos para enfermidades humanas, ou realizar

deleções e inversos de grandes sequências de DNA em gado (CARLSON et al., 2012). As

correções de mutações genéticas por HDR também podem ser precidas por DSBs geradas por

TALENs (HOCKEMEYER et al., 2011).

Figura 3 Esquema de uma TALE nuclease genérica. A proteína que constitui a DBD do

complexo apresenta sequências repetidas, em que dois resíduos hipervariáveis, normalmente

nas posições 12 e 13, efetuam o reconhecimento de bases nitrogenadas do DNA (NI – A; NG

– T; HD – C e NN/NH – G). Uma timina precede a primeira base associada à repetição da

TALE. A FokI encontra-se em um domínio não-específico para realizar a clivagem e

introduzir DSBs no DNA. Para que isto ocorra, as TALENs devem atuar como dímeros.

2.4 Sistema CRISPR-Cas9

O sistema CRISPR (em inglês, clusteres regularly interspaced short palindromic

repeats)-Cas9 (em inglês, CRISPR-associated 9) consiste num dos sistemas mais simples e

eficientes de aplicação para edição genômica (HAEUSSLER e CONCORDET, 2016). Neste

sistema, DSBs podem ser geradas pela associação da Cas9, uma endonuclease, com o

CRISPR RNA (crRNA) e o crRNA de ativação em trans (em inglês, trans-activating crRNA,

tracrRNA) (Erro! Fonte de referência não encontrada.A). Jinek e colaboradores

demonstraram que a Cas9 pode ser programada com a incorporação de um RNA sintético

como transcrito único, quimérico, o sgRNA (em inglês, single guide RNA), para clivar

sequências de DNA de interesse. O sgRNA consiste nos crRNA e tracrRNA hibridizados com

uma ponte GAAA os unindo (JINEK et al., 2012) (Erro! Fonte de referência não

encontrada.B).

A Cas9 apresenta dois domínios característicos com função de nuclease: a RuvC e a

HNH. O domínio da RuvC apresenta três subdomínios (I-III), em que RuvC I encontra-se na

porção amino-terminal da Cas9, e RuvC II/III circundam o domínio HNH próximo à região

central da proteína. Quando esta não se encontra associado ao DNA alvo ou ao RNA, a

endonuclease se autoinibe, com o domínio da RuvC bloqueando o da HNH (JINEK et al.,

2014). Ademais, a Cas9 está atrelada exclusivamente com o locus da CRISPR do tipo II, o

qual é subdividido em três subtipos (IIA-C). Ao passo que o tipo de locus da CRISPR indica o

tipo de gene da cas, de arranjos de CRISPR e tracrRNA, o subtipo revela a arquitetura e

organização de cada locus da CRISPR. Os locus da CRISPR do tipo II normalmente

apresentam genes da cas9, ca1 e cas2. Os subtipos IIA e B apresentam quatro genes cas, e o

IIC apenas três (CHYLINSKI et al., 2013). Uma característica marcante do sistema Cas9 é o

motivo adjacente ao protoespaçador (em inglês, protospacer adjacent motif, PAM), o qual

flanqueia o terminal 3’ do DNA alvo e consititui o mecanismo de busca da proteína. Embora

o PAM seja específico para cada ortólogo de Cas9, sua especificidade pode ser modificada

com domínios flexíveis como 5’-NGG-3’ (HSU et al., 2014; NISHIMASU et al., 2014).

O sistema CRISPR-Cas9 pode induzir a DSBs a serem reparadas quer por NHEJ ou

HDR. A aplicação de tal sistema mostra-se promissora, quer para criar novos modelos

animais para experimentação, quer para novas possibilidades de terapias. Long e

colaboradores demonstraram que o uso do sistema CRISPR/Cas9 poderia ser utilizado para a

remoção de um éxon de distrofina incorreto, possibilitando o tratamento da distrofia muscular

em camundongos (LONG et al., 2016). Averiguam-se ainda as probabilidades de tratamento

com tal sistema para as doenças de Huntington, associada com a expansão poliQ, e de

Parkinson, que pode estar associada com o gene da α-sinucleína mutante (YANG et al.,

2016). Tal sistema apresenta diversas vantagens em relação às outras nucleases programáveis.

A Erro! Fonte de referência não encontrada. compara vantagens e desvantagens entre os

sistemas de edição genômica discutidos nesta revisão.

Figura 4 Representação do sistema CRISPR-Cas9. (A) O sistema nativo CRISPR do tipo II

envolve a Cas9, uma endonuclease, e duas pequenas sequências de RNA: crRNA (CRISPR

RNA) e tracrRNA (trans crRNA) para mediar a clivagem em regiões específicas do DNA e

promover DSBs. (B) As duas sequências de RNA podem ser unidas em um RNA quimérico

tracrRNA:crRNA unidos por uma ponte GAAA e formando o sgRNA (single guide RNA),

que pode ser sintetizado, de forma a permitir o reconhecimento do sistema a partir de uma

região de 20 nucleotídeos de DNA.

Tabela 1 Quadro comparativo das nucleases programáveis (ZFNs, meganucleases, TALENs

e sistema CRISPR-Cas9), expondo vantagens e desvantagens de cada uma.

Nucleases programáveis Vantagens Desvantagens

ZFNs As DSBs originadas

podem ser usadas para

reparar o genoma por NHEJ

ou HDR. Podem ser

aplicadas em células

somáticas ou células-tronco

pluripotentes.

O desenho é caro e

trabalhoso e requer o uso de

regiões ricas em guanina

(GNN), que ocorrem

raramente na maioria dos

alvos desejados

(BITINAITE et al., 1998).

Meganucleases A menor classe de

nucleases sintéticas,

podendo facilitar seu

transporte. Proporciona a

formação de um gancho na

fita 3’ propício para o reparo

por HDR.

Difícil de separar os

domínios de clivagem das

DBDs. A funcionalidade de

tais nucleases está mais

associada com correção de

genes mutados.

TALENs Similar às ZFNs, as DSBs

originadas podem ser usadas

para reparar o genoma por

NHEJ ou HDR, mas o

domínio da FokI não é

específico e a DBD é mais

customizável.

Dificuldade de se construir

plasmídeos que codifiquem

TALENs, devido ao

tamanho do complexo.

CRISPR-Cas9 O sistema é de simples

confecção e escalonamento,

além de não ser tão caro.

Sistemas de reparo pela

NHEJ e HDR podem ser

explorados.

Pode induzir a mutações e

rearranjos fora do alvo

desejado. Levando a

preocupações quanto a sua

aplicabilidade terapêutica

3 CONSIDERAÇÕES FINAIS

As ferramentas de edição genômica, como as nucleases programáveis, trouxeram grandes

facilidades e inovações no âmbito da engenharia genética. Busca-se, assim, aprimorar e

enriquecer o arsenal de modelos de doenças, para que estas sejam melhor compreendidas e

prevenidas. Por outro lado, a busca por novas formas terapêuticas também é um objetivo e a

manipulação das ferramentas de edição genômica permite que seja possível grande

flexibilidade para a busca por novos tratamentos.

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