As escolhas dos linfócitosquando dão o NotchBiologia do desenvolvimentoBiologia Humana2013/14

Docente: Paulo de OliveiraDiscentes: Helena Pereira e Tatiana Yashechkina

Recetor NOTCH

É uma proteína transmembranar de passagem única, que consiste em apenas um peptídeo.

É composto por:→ uma componente extracelular que é responsável pela interação com os ligandos→ um domínio transmembranar responsável pela ativação do recetor → um domínio de sinalização intracelular

Os ligandos de NOTCH interagem com o recetor de células adjacentes por um processo designado inibição lateral. Essa ligação entre recetor e o ligando, leva a ativação da via NOTCH na célula e a supressão da atividade nas células adjacentes

Estrutura dos recetores NOTCH

É composto por duas subunidades: Um fragmento N-terminal extracelular (NEC) Uma subunidade C-terminal transmembranar (NTM)

As subunidades NEC e NTM permanecem associadas no recetor em repouso através do domínio de heterodimerização (HD).

Estrutura do recetor NOTCH

A subunidade EC é composta pelas porções EGF-Like, LNR e parte do HD. A subunidade TM esta caracterizada por parte de HD, e porções RAM, ANK, TAD e PEST. ICN – intracellular domain of NOTCH1 

Mecanismos de ativação do recetor NOTCH1

O recetor NOTCH1 é ativado, pela interação de ligandos como Delta-Like e Jagged.

Ocorre uma mudança conformacional em LNR e dissociação das duas subunidades do domínio HD.

Seguindo a clivagem do recetor, primeiro pela metaloprotease ADAM10 (clivagem S2) e subsequentemente pelo complexo de gama-secretase (clivagem S3)

Esses processos proteolíticos libertam o domínio intracelular (ICN1) de NOTCH1 da membrana.

O ICN1 interage com o DNA através da sua ligação com CSL e recruta o coactivador MAML1 para ativar a expressão de genes alvos.

HSCDão origem a

todas as células sanguíneas

HEMATOPOIETIC STEM CELL (HSC)

AUTO-RENOVAÇÃO DAS STEM CELLS

Notch

Gene ld E-proteínas Proteínas dediferenciação

Prolonga a

expessão do

GATA-2

Linhagem mieloide

Hes1 E2A EBF e PAX5 Linfócitos B

Notch Notch

HSCno Timo

Linfócitos T

HSCno Timo

Linfócitos B

HSCna Medula

Óssea

Linfócitos T

ESCOLHEM SER T

HSC NO TIMO

HSC DNCD4⁻CD8⁻

pro-T cellsCD34⁺CD33⁻CD1a⁻

pre-T cellsCD34⁺CD33⁻CD1a⁺ Linfócitos T

0,018%

TLMPCD34highCD33⁺ T e NK

DN – percursor mais imaturo dos linfócitos

T

THYMIC LYMPHOMYELOID PRECURSORS (TLMP)

TLMPCD34highCD33⁺

Linhagem

Mieloide

Linfócito

sT

IL-7, SCF, IL-1α, IL-6, GM-CSFGATA-2

HEB, GABPα e GATA3, o gene pTα

Notch

Notch GATA-2

Os percursores timicos

ainda apresentam um

vasto potencial de

diferenciação em NK, DC, e

até macrofagos.

Portanto a expressão de Notch1 é necessária e suficiente para impedir que as TLMPs se diferenciem em células não-T mas não é suficiente para induzir o rearranjo do gene TCR que garante a progressão da diferenciação dos linfócitos T em diferentes tipos de células T. A sinalização intatimica de Notch é iniciada quando o receptor Notch1 recruta o seu ligando Dll4, que leva a activação da transcrição dos genes alvo do Notch.

IL-7R

•Os resultados das experiências sustentam a possibilidade de que o Notch tem importância na regulação do IL-7R.

•A via do IL-7R não influencia a diferenciação dos TLMPs mas proporciona sinais necessários para a sua proliferação e sobrevivência.

TLMP

T

NKMieloide

IL-7Rα

IL-2RβGM-CSFRα

A diferenciação final dos linfócitos T é induzida pelo microambiente do timo!

Células do estroma

TLMP

OP9-DL1

Linfócitos T

PI3K

Notch Hes1mTorc

Intreferir com as funções do Hes1 afeta o desenvolvimento primordial e a expanção das células T e leva a um maior aparecimento de células não-T.

ViaPI3K/Akt

PI3K importante para o desenvolvimento e é regulador crítico da sobrevivência, crescimento e proliferação dos linfocitos.

Gene Rag1 e Rag2

DN1 CD44⁺CD117⁺CD25⁻ multipotentes

DN2 CD44⁺CD117⁺CD25⁺ especificamente T

DN3 CD44⁻CD117⁻CD25⁺ com receptor TCRβ

Checkpoint da β-selecção

DP

Apoptose

CHECKPOINT BETA

COMPLEXO PRE-TCR

Outras vias sinalizadoras mediadas por IL-7R e CXCR4 promovem a ativação da via PI3K/Akt demonstrados agirem juntamente com pre-TCR durante β-selecção

As DN3 que expressam o receptor TCRβ rearranjado e produtivo, juntamente com o pTα e CD3 formam o complexo pre-TCR que medeia a passagem pela β-selecção

Hes1, PTEN e c-Myc moleculas chave para a sobrevivência, diferenciação e poliferação no checkpoint da β-selecção

Expressão aumentada de PTEN resulta na diminuição da capacidade de diferenciar e proseguir na β-selecção.

Notch é necessário para um correto rearranjo do gene TCRβ e activação das moleculas chave

A sinalização de CXCR4 assegura a sobrevivência dos timocitos via

PI3K/Akt ou promove a sua apoptose pela via p38/MAPK.

CXCR4

CXCR4PI3K/Akt

sobrevivência

p38/MAPKapoptose

Notch Expressão descontinua ou

ausente do Notch

No desenvolvimento das células T o c-Myc é descrito como mediador da proliferação. A indução da expressão do c-Myc pelo Notch leva a proliferação das células que passaram a β-seleção e atingem o estado DP, estado no qual a sinalização Notch cessa para evitar o aparecimento de leucemias.

C-MYC

Notch c-MycDN

proliferação

DPaumento

Leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) Carateriza-se por um grande defeito de maturação, induzindo a um acúmulo de células

imaturas e a uma falha na produção de células hematopoéticas diferenciadas.

Sendo assim, estas células imaturas não são capazes de desempenhar suas funções normais.

Apresentam mutações ativadoras no gene NOTCH1 em mais de 50% dos casos.

Sabe-se que a sinalização constitutiva de NOTCH em progenitores linfóides promove o desenvolvimento de células T imaturas.

Caracteriza-se pela presença de mutações envolvendo os genes que codificam os recetores de células T (TCR) e em vários genes de fatores de transcrição sendo o NOTCH1 o mais frequente.

Mutações do gene NOTCH1 As mutações ativadoras de NOTCH1 normalmente interrompem os bloqueios moleculares

responsáveis pela prevenção da ativação espontânea do recetor na membrana ou mediando o final da sinalização de NOTCH1 no núcleo.

Uma das mutações ocorre no domínio HD, promovendo instabilidade no recetor NOTCH1, que resulta na ativação independente do ligando, aumentando a libertação do ICN e sua consequente deslocação para o núcleo.

Pode ocorrer uma mutação na extremidade 3’ do gene onde está codificado o domínio PEST, que são responsáveis pela eliminação da sequência de reconhecimento para a degradação de ICN pelo complexo FBXW7/SCF no núcleo, assim há um aumento de ICN e uma acentuação da atividade do NOTCH1.

Em casos raros, NOTCH1 é ativado como resultado de inserções in-frame na parte distal do domínio HD, resultando no deslocamento e consecutivo processamento no local de clivagem da protéase ADAM10.

Mutações do gene FBXW7

Podem ocorrer:

Mutações no gene FBXW7 , que normalmente envolvem resíduos de arginina, que são responsáveis pelo reconhecimento dos locais de fosforilação do domínio PEST do recetor NOTCH1.

Mutações duplas no domínio HD e PEST ou em HD e FBXW7. A presença de mutações nestes domínios induzem a ativação na membrana, independentemente do ligando, prejudicando a degradação do recetor ativo do núcleo, resultando em altos níveis de sinalização de NOTCH1.

Inibição do NOTCH através do péptido SAHM1

No processo de ativação de NOTCH1, após a libertação do domínio intracelular (ICN), este vai para o núcleo e liga-se ao fator de transcrição CSL, que por sua vez vai recrutar o coativador MAML1 para que ocorra então a transcrição dos genes alvo de NOTCH1.

Recentemente foi desenvolvido um péptido que se liga ao complexo ICN-CSL, o SAHM1, que diretamente contraria o recrutamento de MAML1, bloqueando a transcrição dos genes alvo de NOTCH1 mesmo este estando ativo.

Mecanismo de inibição de SAHM1

Parte A: Processo de ativação de NOTCH1 no núcleo, mostrando a ligação do fator de transcrição CSL e coactivador MAML1 ao ICN para ativação dos genes alvos.

Parte B: Inibição do processo pelo péptido SAHM1, que impede que a MAML1 se ligue ao complexo ICN-CSL, bloqueando a ativação dos genes alvos.

Inibidores gama-secretase (GSIs)

A inibição a partir de GSIs bloqueia a atividade do complexo gama-secretase, que é necessária para a clivagem do domínio intracelular de NOTCH.

A utilização de anticorpos que ligam no ligando Delta-Like-4, previne a ligação e a ativação de NOTCH a partir de ligandos.

A inibição por anticorpos específicos ao recetor NOTCH1, impede a clivagem proteolítica da região reguladora negativa, mesmo após a ativação pelo ligando.

Inibição por anticorpos específicos

Foram desenvolvidos anticorpos específicos para o recetor NOTCH1 e NOTCH2

Estes anticorpos estabilizam a região reguladora negativa de NOTCH1 e NOTCH2 que está localizada na parte extracelular que por sua vez evita a clivagem do domínio intracelular mesmo na presença dos respetivos ligandos

Os anticorpos mostram inibição, dependente de dose, na sinalização in vitro de ambos os NOTCH e alta especificidade ao seu respetivo recetor

Os resultados deste anticorpo específico de NOTCH1 em linhas celulares de LLA-T (que contêm mutações em NOTCH1) demostram que existe inibição do crescimento celular em in vitro

Anticorpos específicos do ligando delta-like-4

O ligando Delta-Like-4 (Dll4) contribui para a auto-renovação das stem cells e para o desenvolvimento vascular

Haploinsuficiência de Dll4, resulta em letalidade embrionária devido a efeitos de desenvolvimento na vasculatura.

O bloqueio de Dll4 resulta na formação de uma vasculatura não funcional, incapaz de suportar o crescimento tumoral.

Os anticorpos específicos ao ligando DII4, funcionam de modo a prevenir a ligação de ligandos e subsequente ativação de NOTCH.

O bloqueio de Dll4/NOTCH1 poderia aumentar a eficácia de anti-VEGF em tumores sensíveis, podendo assim ter um potencial para aumentar os efeitos de quimioterapias.

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FIM!