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ANDRÉ FILIPE VIEIRA PEREIRA DA SILVA

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Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Patologia da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, para obtenção do título de Mestre em Patologia, área de concentração Morfologia Aplicada.

ORIENTADOR: Prof. Dr. Diógenes Luís da Mota, Professor Adjunto da Departamento de Histologia e Embriologia da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE. CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Luiz Lúcio Soares da Silva, Professor Adjunto do Departamento de Histologia e Embriologia da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.

RECIFE 2006

2

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA

AUTOR: ANDRÉ FILIPE VIEIRA PEREIRA DA SILVA

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: MORFOLOGIA APLICADA

NOME DA DISSERTAÇÃO: ASPECTOS MORFOLÓGICOS E MORFOMÉTRICOS DE HEPATÓCITOS DE CAMUNDONGOS (Mus muscullus) TRATADOS COM EXTRATO AQUOSO DE Dioclea grandiflora (FABACEAE) ORIENTADOR: PROF DR. DIÓGENES LUÍS DA MOTA

CO-ORIENTADOR: PROF DR. LUIZ LÚCIO SOARES DA SILVA

DISSERTAÇÃO DEFENDIDA E APROVADA PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO

DE MESTRE EM PATOLOGIA.

DATA: 12/09/2006

BANCA EXAMINADORA:

PROF. DR. EDVALDO RODRIGUES DE ALMEIDA______________________

PROFA. DRA. PALOMA LYS DE MEDEIROS__________________________

PROF. DR. JENNECY SALES CAVALCANTI___________________________

3

Não posso deixar de dedicar essa realização a meus pais

(Abelardo e Tania); a minha esposa (Valéria Brito) e,

principalmente, dedico à Cecília Brito Silva, minha

primeira filha e maior realização até então.

4

AGRADECIMENTOS

Ao professor Diógenes Luís da Mota, pela amizade, confiança, paciência e compreensiva orientação deste trabalho e também pelas claras e ilustrativas aulas de histologia.

Ao professor Luiz Lúcio Soares da Silva, pelo fornecimento do material e idéias valiosas que contribuíram de maneira singular para confecção deste trabalho.

Ao professor Carlos Eduardo de Queiroz Lima, pelo apoio logístico, cedendo as instalações do Laboratório de Citologia Clínica e Histologia Quantitativa do Departamento de Ciências Farmacêuticas no Centro de Ciências da Saúde da UFPE.

Ao professor Alexandre Motta Bittencourt, por tornar fácil o estudo da neuroanatomia além da preocupação e interesse em ajudar nos momentos que precisei de motivação.

Ao professor Almir Wanderley pela brilhante condução da disciplina de toxicologia experimental que cursei no programa de pós-graduação em Ciências Farmacêuticas do Departamento de Ciências Farmacêuticas no Centro de Ciências da Saúde da UFPE.

À professora Maria Cristina de Farias Agrício, que me ensinou a desenvolver as competências em sala de aula com muito deleite.

Ao professor José Valfrido de Santana, coordenador do Núcleo de Saúde da Faculdade Maurício de Nassau, pelo exemplo de caráter e incentivo no decorrer de minha carreira docente.

Existem alguns cientistas brasileiros que tive a felicidade de conhecer pessoalmente, são neles que me espelho e almejo algum dia chegar perto em termos de realização, cito: Antonio Souto (UFPE); Belmira da Costa (UFPE); Cláudio Gabriel (UFPE); Eduardo Conde Garcia (UFS); Luis Menna-Barreto (USP); e, Luis Carlos Carvalho (UFPB).

Ao amigo e colega no mestrado, professor Raimundo Rosendo, seu bom humor, criatividade, persistência e raciocínio rápido o tornam um gigante.

Aos professores Roberto Melo, pela sua serenidade e sensibilidade e Sílvia Arruda pela sua astúcia e dedicação, que juntos levam à frente a coordenação desta pós-graduação.

À secretária do mestrado Sônia Carvalho, na hora que mais precisamos mostrou-se disposta a tudo, obrigado.

À PROPESQ, pela eficiência e inteligência nas suas ações.

Aos técnicos de laboratório Silvana Rosas, Alex Benício e Sidcley Araújo pelo auxílio prestado para a confecção das lâminas.

A todos os funcionários que pertencem a este mestrado e aos demais professores e colegas que o integram, as minhas cordiais saudações.

5

"É porque há fracasso, que há um freio para os estímulos. Sem este fracasso, os estímulos seriam

valores puros, seriam embriaguez; e por este enorme êxito subjetivo que é uma embriaguez, os estímulos constituiriam o mais irretificável dos

erros objetivos. Assim, em nossa opinião, o homem que tivesse a impressão de nunca enganar-se,

enganar-se-ia sempre." (G. Bachelard, A formação do espírito científico)

6

RESUMO

HISTOLOGIA QUANTITATIVA DO FÍGADO DE CAMUNDONGOS (Mus muscullus) TRATADOS COM EXTRATO AQUOSO DE Dioclea grandiflora (FABACEAE) Na medicina popular, a planta Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth. (Leguminosae), vem sendo freqüentemente utilizada para tratamento de distúrbios da glândula prostática e urolitíase. De acordo com análises histológicas evidenciou-se que o extrato aquoso do caule provoca lesões hepáticas e renais. Sendo o fígado a maior e mais importante glândula metabólica pela qual as substâncias ingeridas são processadas, faz-se necessário uma análise histológica quantitativa que avaliem a toxicidade da planta em questão. Portanto, o presente estudo teve por objetivo quantificar os efeitos histopatológicos do extrato aquoso da casca do caule de Dioclea grandiflora no tecido hepático. Foram utilizados fígados de 20 camundongos albinos suíços (Mus muscullus) mantidos em sala com temperatura média de 23°C, em ciclo claro-escuro das 6:00 às 18:00h e 18:00 às 6:00h, respectivamente, com comida e água ad libitum. Dos 20 animais utilizados, 10 foram tratados com extrato aquoso do caule da Dioclea grandiflora, constituindo o grupo tratado (GT) enquanto os outros 10 foram utilizados como grupo controle (GC). Foi realizada a análise histológica no microscópio OLYMPUS (modelo BX50) e escolhidos, aleatoriamente, 10 campos de cada fígado corado com hematoxilina-eosina para registro fotomicrográfico através da microcâmera SAMSUNG-COLOR DIGITAL (SHC-410 NAD-HL) acoplada ao microscópio e conectado ao computador PENTIUM II de 200MHz ao qual está instalada a placa de captura de imagens. Após a realização da documentação fotográfica foi iniciado a avaliação morfométrica através do software IMAGE-LAB. A partir dos valores obtidos foram geradas planilhas no Microsoft Excel® para posterior análise estatística. Os seguintes valores foram obtidos para os GC e GT: Área = 34,095±2,919 / 48,687±7,339µm2; Perímetro = 22,608±0,957 / 27,255±2,098µm; Diâmetro = 6,255±0,283 / 7,611±0,589µm; Volume = 130,815±17,958 / 244,068±61,441µm3. As alterações morfológicas observadas e os valores quantitativos obtidos por técnicas morfométricas sugerem que a Dioclea grandiflora promove danos no tecido hepático, especialmente no núcleo, indicando um quadro de hepatoxicidade. Palavras-chave: fígado, avaliação morfométrica, toxicidade, Dioclea grandiflora

7

ABSTRACT

QUANTITATIVE HISTOLOGY OF THE LIVER OF MICE (Mus muscullus) TREATIES WITH AQUEOUS EXTRACT OF Dioclea grandiflora (FABACEAE)

In the popular medicine, the plant Dioclea grandiflora Mart. Former. Benth. (Leguminosae), it has frequently been used for treatment of disturbances of the prostate gland and stones in the kidneys. In agreement with histological analyses it was evidenced that the aqueous extract of the stem provokes hepatic and renal lesions. Being the liver the largest and more important metabolic gland for the which the ingested substances are processed, it is done necessary a quantitative histological analysis that you evaluate the toxicity of the plant in subject. Therefore, the present study had for objective to quantify the histopathologyc effects of the aqueous extract of the peel of the stem of Dioclea grandiflora in the hepatic fabric. Livers of 20 Swiss albino mice were used (Mus muscullus) maintained at room with medium temperature of 23°C, in clear-dark cycle from the 6:00 to the 18:00hrs and 18:00 at 6:00hrs o'clock, respectively, with food and water ad libitum. Of the 20 used animals, 10 were treated with aqueous extract of the stem of the Dioclea grandiflora, constituting the treated group (GT) while the other ones 10 were used as group controls (GC). The histological analysis was accomplished in the microscope OLYMPUS (model BX50) and chosen, aleatoriamente, 10 fields of each red-faced liver with hematoxilina-eosina for registration fotomicrográfico through the micro camera DIGITAL SAMSUNG-COLOR (SHC-410 NAD-HL) coupled to the microscope and connected to the computer PENTIUM II of 200MHz to which the plate of capture of images is installed. After the accomplishment of the photographic documentation it was initiate the evaluation morphometric through the software IMAGE-LAB. Starting from the obtained values spreadsheets were generated in Microsoft Excel® for subsequent statistical analysis. The following values were obtained for GC and GT: Area = 34,095±2,919 / 48,687±7,339µm2; Perimeter = 22,608±0,957 / 27,255±2,098µm; Diameter = 6,255±0,283 / 7,611±0,589µm; Volume = 130,815±17,958 / 244,068±61,441µm3. The observed morphologic alterations and the quantitative values obtained by techniques morphometrics suggest that the Dioclea grandiflora promotes damages in the hepatic fabric, especially in the nucleus, indicating a hepatoxicity picture. Key-word: liver, evaluation morphometric, toxicity, Dioclea grandiflora

SUMÁRIO

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ________________________________________ 9

LISTA DE TABELAS____________________________________________ 10

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS _____________________________ 11

1 INTRODUÇÃO _____________________________________________ 12

1.1 Considerações gerais ___________________________________ 12

1.2 Justificativa ___________________________________________ 13

2 OBJETIVOS _______________________________________________ 15

2.1 Geral _________________________________________________ 15

2.2 Específicos____________________________________________ 15

3 REVISÃO DA LITERATURA __________________________________ 16

4 MATERIAL E MÉTODOS_____________________________________ 22

4.1 Material utilizado _______________________________________ 22

4.2 Descrição do tratamento dos grupos ______________________ 23

4.3 Preparo do material________________ Erro! Indicador não definido.

4.4 Análise morfométrica ___________________________________ 24

4.5 Análise matemática_____________________________________ 26

4.6 Análise estatística ______________________________________ 27

5 RESULTADOS_____________________________________________ 28

6 DISCUSSÃO ______________________________________________ 32

7 CONCLUSÃO______________________________________________ 36

REFERÊNCIAS ________________________________________________ 37

ANEXO ______________________________________________________ 49

9

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Núcleo de hepatócito sendo selecionado para posterior cálculo da

área. Programa de análise morfométrica IMAGE-LAB 2000. _____________ 25

Figura 2 – Núcleo de hepatócito tendo sua área calculada para posterior

plotagem dos dados em planilha do programa Microsoft Excel®. Programa de

análise morfométrica IMAGE-LAB 2000._____________________________ 26

Figura 3 – Valor da área (µm2) do núcleo de hepatócitos de camundongos

albinos suíços (Mus muscullus) machos tratados com Dioclea grandiflora em

relação ao grupo controle tratado com salina._________________________ 29

Figura 4 – Valor do perímetro (µm) do núcleo de hepatócitos de camundongos

albinos suíços (Mus muscullus) machos tratados com Dioclea grandiflora em

relação ao grupo controle tratado com salina._________________________ 29

Figura 5 – Valor do diâmetro (µm) do núcleo de hepatócitos de camundongos

albinos suíços (Mus muscullus) machos tratados com Dioclea grandiflora em

relação ao grupo controle tratado com salina._________________________ 30

Figura 6 – Valor do volume (µm3) do núcleo de hepatócitos de camundongos

albinos suíços (Mus muscullus) machos tratados com Dioclea grandiflora em

relação ao grupo controle tratado com salina._________________________ 30

Figura 7 – A - Grupo controle - Observam-se hepatócitos apresentando

morfologia nuclear regular e citoplasma acidófilo de aspecto normal quando

comparados com os observados nos cortes do Grupo tratado - B, C e D - cujos

núcleos exibem morfologia alterada, diâmetros variados e citoplasma de

aspecto vacuolizado. Coloração: H-E. x800.__________________________ 31

10

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Valores (média±DP) obtidos a partir de medidas de área, perímetro,

diâmetro e volume, realizadas no núcleo de hepatócitos de camundongos

tratados com Dioclea grandiflora comparados com grupo controle.................. 28

11

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

DL50 Dose Letal capaz de matar 50% da população estudada

GC Grupo controle

GT Grupo tratado

HE Hematoxilina e Eosina

SNC Sistema Nervoso Central

12

1 INTRODUÇÃO

1.1 Considerações gerais

A flora brasileira é conhecida mundialmente por sua vasta biodiversidade

que atrai pesquisadores de todo mundo. A caatinga, único bioma restrito ao

território brasileiro, típico da região nordeste (Barros, 2003), é um dos setores

menos estudados do Brasil e, por isso, sua diversidade biológica tem sido

subestimada (Silva e Dinnouti, 1999).

Segundo Leal, et al. (2003), 41,1% da caatinga ainda não foi amostrada

e 80% da área está subamostrada, mesmo assim, atualmente são conhecidas

932 espécies de plantas, sendo 380 endêmicas.

Plantas que sejam capazes de ocasionar danos que alterem a

homeostase em organismos de animais são classificadas como tóxicas

(Oliveira e Akisue, 2000).

Várias alterações são causadas por estímulos externos como agentes

tóxicos rompendo os mecanismos homeostáticos (Fausto et al., 1995;

Michalopoulos e DeFrances, 1997).

Embora, plantas tóxicas sejam onipresentes (Kingsbury, 1964), a

medicina herbária é usada por até 80% da população nos países em

desenvolvimento, como é o caso do Brasil (Almeida, 1993), onde a utilização

de plantas no tratamento de doenças apresenta, fundamentalmente, influências

da cultura indígena e africana (Martins et al., 2000). Apesar do difundido uso,

13

foram empreendidos poucos estudos científicos para averiguar a segurança e

eficácia de remédios tradicionais (Alexeeff et al., 2002).

A planta Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth. (Leguminosae),

popularmente conhecida como “mucunã”, “mucunã-de-caroço” e “olho-de-boi”,

é encontrada na caatinga e cerrado do nordeste brasileiro (Bacarat, 1995;

Lima, 1989). Na medicina popular ela vem sendo freqüentemente utilizada para

tratamento de distúrbios da glândula prostática e pedras nos rins (Batista,

1993; Batista, et al., 1993).

1.2 Justificativa

Os humanos são expostos a um grande número de substâncias

químicas. A possibilidade de toxicidade a diversos órgãos, devido a interação

biológica de agentes tóxicos freqüentemente presentes em plantas do uso

popular, é o que motiva essa pesquisa. Faz-se, portanto, necessários estudos

que avaliem a toxicidade das chamadas “plantas medicinais de uso popular”.

Afinal, inúmeras substâncias químicas estão presentes nas plantas de uso

popular, como é o caso da Dioclea grandiflora.

Considerando que, a maioria dos estudos com plantas medicinais de uso

popular avaliam a interação farmacológica, e não a toxicológica, (Dobrev et al.,

2001; Haddad et al., 2000), e baseando-se no ponto de vista da Agência

Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), publicada na resolução de n°90, de

16 de março de 2004 (Anexo I), onde os dados histológicos, especialmente de

órgãos como o fígado, são de suma importância nas avaliações toxicológicas

14

de plantas usadas na medicina popular, como o caso da Dioclea grandiflora, o

presente estudo tem o papel de quantificar as possíveis alterações

morfoquantitativas nos hepatócitos de camundongos tratados a partir do extrato

aquoso desta planta no intuito de contribuir decisivamente nos resultados de

hepatotoxicidade (Mehendale, 1994, 1995; Mangipudy et al., 1995a; Soni e

Mehendale, 1998a; Soni et al., 1999; Anand et al., 2003a), para a investigação

da Dioclea grandiflora, usada corriqueiramente em pessoas acometidas de

desordens prostáticas e acúmulo de pedras nos rins.

15

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Quantificar os efeitos histopatológicos do extrato aquoso da casca do

caule de Dioclea grandiflora nos núcleos de hepatócitos de camundongos (Mus

muscullus).

2.2 Específicos

• Investigar as possíveis alterações morfológicas no tecido hepático

de camundongos tratados com extrato aquoso da casca do

caule de Dioclea grandiflora;

• Quantificar a área, diâmetro, perímetro e o volume do núcleo dos

hepatócitos por meio de estudo morfométrico.

16

3 REVISÃO DA LITERATURA

Importantes grupos do mundo inteiro se mobilizam na identificação de

novos compostos produzidos por plantas, promovendo modificações químicas

em suas estruturas através de processos biossintéticos e sintéticos. Procuram-

se novos compostos que possam ser utilizados clinicamente, em altas

dosagens, que apresentam baixa toxidade, absorvidos por via oral, por

períodos prolongados e, ainda, com amplo espectro de aplicação (Bras-Filho,

1994).

O uso de plantas no tratamento das enfermidades ainda é bastante

comum, principalmente no meio rural, em populações de baixo poder aquisitivo,

onde a tradição cultural e os problemas sócio-econômicos dificultam o acesso à

medicina convencional (Agra, 1996).

No sertão brasileiro uma patologia freqüentemente tratada com

fitoterápicos é a urolitíase (cálculos renais). A maioria dos cálculos contém

cálcio, constituído, em grande parte, de oxalato de cálcio (Cotran et al., 2000).

Uso da Dioclea grandiflora para tratamento da urolitíase é relatado por Almeida

et al. (1993).

De acordo com a classificação de Cronquist (1968), o gênero Dioclea faz

parte da família Fabaceae, a qual está incluída na ordem Fabales, tem sua

divisão (Reino) nas Magnoliophyta, pertence a classe das Magnoliopsida

(Dicotiledônea) e subclasse Rosidae.

17

A família Fabaceae (Leguminosae) apresenta-se na forma de arbusto,

ou de árvores, distribuídas em uma extensa variedade de habitat, que vai das

regiões temperadas até os trópicos, inclusive nas regiões subtropicais. Inclui,

também, nesta família as plantas aquáticas, xerófitas e trepadeiras. A ordem

Fabales apresenta em torno de 700 gêneros e mais de 17.000 espécies, com

distribuição cosmopolita (Heywood, 1996).

A espécie D. grandiflora é um cipó vigoroso, trepador, que pode atingir

até a copa das árvores ou subir em conjunto com arbustos. Apresenta folhas

alternas com estípulas delgadas, precocemente caducas, com folíolos terminal

suborbicular a suborvado e com suas florescências augusta-paniculada.

Apresenta flores vistosas de cálice arroxeado e com pétalas em estandarte

amplo, de cor amarela; os frutos (legume) são de grande tamanho, sendo suas

sementes duras e ricas em substâncias nutritivas

Os primeiros estudos com Dioclea grandiflora foram realizados por

Chaves et al. (1948) no campo da nutrição. Só após 36 anos é que Richardson

et al. (1984) publicaram algo com a Dioclea grandiflora acerca das

propriedades químicas da lectina.

Esse assunto despertou interesse de Ainouz et al. (1987) e

Bhattacharyya et al. (1988 e 1990) sendo que este último passou a merecer

destaque nos estudos da Dioclea grandiflora a partir dos artigos subseqüentes.

Em 1993, Batista et al. (que pertence ao grupo de Bhattacharyya)

demonstraram que extrato alcoólico de Dioclea grandiflora produzia uma

significativa ação no Sistema Nervoso Central (SNC) de ratos. Através de

18

técnicas de cromatografia (Bhattacharyya et al., 1995) e análise espectral

(Bhattacharyya et al., 1997), foi possível isolar a ‘dioclein’ e evidenciar a sua

estrutura como 5,2’,5’-trihydroxy-6,7-dimethoxy-flavone. No mesmo ano foi

publicado o efeito analgésico da Dioclea grandiflora constatando sua ação no

SNC envolvendo um mecanismo semelhante aos opióides (Batista et al., 1995).

Em estudo acerca da atividade biológica da lectina encontrada nas

sementes de Dioclea grandiflora, Lima et al. (1993) observaram uma reação

inflamatória cutânea. Análises histológicas revelaram um quadro de ulceração

hemorrágica com reação exudativa acompanhada por um influxo de leucócitos

polimorfonucleados e células gigantes (macrófagos). Isto demonstra que a

lectina de Dioclea grandiflora atua, provavelmente, como um agente

inflamatório. Em estudos de Andrade et al. (1999) foi possível descrever a ação

da lectina de Dioclea grandiflora na produção de óxido nítrico pela via

linfocítica.

Majetich et al. (1999) em investigações sistemáticas isolaram da casca

Dioclea grandiflora, três novos flavanóides: agrandol (5, 7-dihidroxi-6-metoxi-8-

prenilflavanona), paraibanol (3,5,7,2’-pentahidroxi-6-metoxi-8-prinilflavanona) e

diosalol (3,5.7.2’.5’-pentahidroxi-6-metoxi-8-prinilflavanona). Também, foram

identificados β-amerina e 5,7,2’,5’-tetrahidroxi-6-metoxi-8-prenilfavanona.

Alguns flavonóides também apresentam atividade hepatotóxica (Formica

e Regelson, 1995; Hertog, 1996; Rice-Evans et al., 1996; Antônio e Brito, 1998;

Middleton et al., 2000; Havsteen, 2002; Bhatia e Jain, 2004). De fato é

importante investigar a atividade hepatotóxica da Dioclea grandiflora.

19

Vários trabalhos também foram realizados com vistas a isolamento e

caracterização de vários tipos de lectinas da semente de D. grandiflora, como

os de Richardson et al. (1984); Toone et al. (1995); Kiessling et al. (1996);

Toone et al. (1996); Sacchetini et al. (1998); Brewer et al. (1998); Brewer et al.

(2000) e Brewer et al. (2002).

A casca do caule de Symplocos cochinchinensis foi analisada por Khan

et al. (2001), na qual observaram a atividade antimicrobiana dos extratos os

quais apresentaram uma ampla variação de atividade contra bactérias e

protozoários. As frações, quando testadas, melhoraram os níveis de atividade

em todos os casos.

Os estudos com Dioclea avançaram muito a partir de 2002. Neste ano,

Almeida et al. estudaram o efeito da diocleína sobre a circulação coronariana

em ratos. Através do método de Langendorff aplicado nos experimentos os

autores demonstraram nos resultados que a diocleína induziu um efeito vaso-

dilatador direto sobre as artérias coronarianas, independente da participação

do óxido nítrico e ciclooxigenase.

No ano seguinte, Almeida et al. (2003) 1 verificaram em ratos e

camundongos depois de tratamento agudo com extrato hidroalcoólico de

sementes de Dioclea grandiflora um efeito analgésico significativo no

movimento da cauda e testes em chapa quente. Os resultados sugerem que o

extrato hidroalcoólico de sementes de Dioclea grandiflora tenha uma ação

analgésica central destituída de tolerância, efeito típico de drogas opióides.

1 O Almeida et al., 2002 e Almeida et al., 2003 são autores diferentes, como pode ser verificado nas referências. O primeiro é da UFMG, enquanto que o segundo é da UFPB.

20

Porém, ainda não existem estudos significativos sobre a toxicidade da

Dioclea grandiflora. Um órgão cuja avaliação histológica seria muito importante

para avaliação da toxicidade é o fígado, segundo maior órgão e maior glândula

do corpo (Goss, 1988), devido a ele ser a interface entre os sistema digestório

e o sangue (Junqueira e Carneiro, 2004).

A maneira clássica para se descrever a unidade funcional do fígado

envolve o conceito do chamado lóbulo hepático. Histologicamente, o lóbulo

hepático apresenta forma hexagonal, com uma veia centro-lobular e com as

tríades portais nas extremidades desse hexágono imaginário. As colunas de

hepatócitos dispõem-se lado a lado, a partir da veia central e entre elas estão

situados os sinusóides hepáticos, que transportam o sangue que chega pelos

ramos da veia porta e da artéria hepática e os chamados espaços de Disse. Há

ainda os canalículos biliares que transportam a bile até os ductos biliares, nos

espaços porta (Gerber e Thung, 1987).

As células que compõe o fígado, hepatócitos, derivam do epitélio do

intestino primitivo (Alberts et al., 2004). São poliédricas, com seis ou mais

superfícies, variam de 12 a 25µm de diâmetro. Contêm um e às vezes dois

núcleos arredondados que apresentam em seu interior uma rede e um ou dois

nucléolos refringentes. Alguns núcleos são poliplóides, contendo múltiplos do

número haplóide de cromossomos. Núcleos poliplóides são caracterizados pelo

seu tamanho maior, que é proporcional a ploidia (Goss, 1988; Junqueira e

Carneiro, 2004).

Aproximadamente 75% de sangue hepático vêm diretamente das

21

vísceras gastrointestinais e baço através da veia de porta. O sangue

proveniente do sistema porta traz drogas absorvidas diretamente pelo intestino

para o fígado em forma concentrada. Os hepatócitos são responsáveis pela

síntese, pela degradação e pelo armazenamento de um imenso número de

substâncias, enzimas droga-metabolizantes tem papel de desintoxicar muitos

compostos mas ativa a toxicidade de outros (Alberts et al., 2004; Jaeschke et

al., 2002).

Weibel et al. (1969) descreveram os dados morfométricos normais em

fígado de ratos. Segundo os autores, estudos pela microscopia de luz

demonstraram que 96% do volume hepático dos ratos é constituído pelo

parênquima lobular, isto é, pelos hepatócitos, sinusóides, espaços de Disse e

capilares biliares, enquanto os 4% restantes constituem o parênquima não

lobular, ou seja, espaços portais, veias centro-lobulares e ramos da veia

hepática.

22

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material utilizado

Para o presente estudo foram utilizados fígados (montados em blocos de

parafina) de 20 camundongos albinos suíços (Mus muscullus) machos com

idade entre 45 e 60 dias com peso médio de 26±6g, provenientes do biotério do

Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco

(UFPE). Esses blocos de parafina foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Luiz

Lúcio Soares da Silva do Departamento de Histologia e Embriologia da UFPE.

Para a realização deste estudo, é necessária a compreensão detalhada

das etapas que antecederam a confecção dos blocos em parafina tais como

manutenção dos animais e tratamento farmacológico realizado. Essas

informações serão detalhadas a seguir de acordo com procedimento realizado

por Silva (2003).

4.2 Obtenção do extrato

Na obtenção do extrato aquoso da casca do caule, foram utilizados 100g

do material seco, previamente triturados, em máquina forrageira. O material

triturado, foi colocado em um becker e adicionada água destilada até cobrir, por

completo, o material, perfazendo um total de 800mL. Foi submetido à agitação

mecânica por 1 hora e em seguida deixado em repouso para maceração

durante 24 horas na geladeira. Logo após, o extrato foi filtrado, em filtro de

23

papel, e submetido à liofilização. O processo foi repetido por mais 24 horas,

nas mesmas condições, com o objetivo de se obter quantidade adicional de

extrato. Após processo de liofilização, os resíduos foram reunidos,

cuidadosamente guardado em dessecador. O extrato foi pesado, calculado e

seu rendimento, lacrado com para-filme e depositado no freezer até o momento

dos testes de atividade biológica.

4.3 Tratamento dos grupos

Os animais foram mantidos em sala com temperatura média de 23°C,

em ciclo claro-escuro das 6:00 às 18:00h e 18:00 às 6:00h, respectivamente.

Todos com idade entre 45 e 60 dias, foram submetidos a dieta padrão (LABINA

– Purina do Brasil S/A) e água ad libitum do biotério do Departamento de

Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco, registrado no COBEA

sob o nº 18.

Dos 20 animais utilizados, 10 foram tratados com extrato aquoso da

casca do caule da Dioclea grandiflora, constituindo o grupo tratado (GT)

enquanto os outros 10 foram utilizados como grupo controle (GC), no período

de sete dias consecutivos. A via utilizada na aplicação dos extratos foi

intraperitonial na dose de 62mg/kg de peso.

24

4.4 Estudo histopatológico

Foi realizada a microtomia, com aproximadamente 80 cortes a

espessura de 3µm. Aleatoriamente foram retirados cortes que apresentavam

boa aparência macroscópica para confecção de lâminas previamente

banhadas com albumina de Mayer. Em seguida, foram mantidas em estufa

(FANEM), durante 1h a 58°C para retirada da parafina e desumedecimento do

material.

Os cortes, depois de desparafinizados e hidratados, foram corados com

hematoxilina-eosina (HE) e em seguida desidratados e clarificados com xilol e

montados em Entelan conforme Tolosa et al. (2003).

4.5 Análise morfométrica

Inicialmente foi realizada a análise histológica no microscópio OLYMPUS

(modelo BX50) no Laboratório de Citologia Clínica e Histologia Quantitativa do

Departamento de Ciências Farmacêuticas no Centro de Ciências da Saúde da

UFPE das lâminas do grupo tratado (GT) em comparação com o grupo controle

(GC). Em seguida, foram escolhidos, aleatoriamente, 10 campos de cada

fígado corado com HE para registro fotomicrográfico através da microcâmera

SAMSUNG-COLOR DIGITAL (SHC-410 NAD-HL) acoplada ao microscópio e

conectado ao computador PENTIUM II de 200MHz ao qual está instalada a

placa de captura de imagens.

Após a realização da documentação fotográfica foi iniciado a avaliação

morfométrica através do software IMAGE-LAB. Selecionou-se a área do núcleo

25

(Figura 1) realizou-se o cálculo (Figura 2) e depois os dados foram plotados em

arquivo com extensão no formato xls (Microsoft Excel – Office XP). Em cada

campo fotografado os núcleos escolhidos foram medidos três vezes e sua

média foi considerada. Foi feita a média e o desvio padrão do fígado analisado

de cada animal e, dessas médias e desvios, foi obtida a média aritmética geral

e a média dos desvios padrão dos animais do GC e do GT para posterior

análise estatística.

Figura 1 – Núcleo de hepatócito sendo selecionado para posterior cálculo da área. Programa

de análise morfométrica IMAGE-LAB 2000.

26

Figura 2 – Núcleo de hepatócito tendo sua área calculada para posterior plotagem dos dados

em planilha do programa Microsoft Excel®. Programa de análise morfométrica IMAGE-LAB

2000.

4.6 Análise matemática

O volume nuclear foi obtido a partir das médias dos diâmetros dos

núcleos analisados por campo fotografado. Calculou-se o raio médio através da

formula geométrica dividida por dois (Equação 1) e depois aplicando-se a

fórmula para cálculo do volume da esfera (Equação 2).

Equação 1

221 dd

r+

= 1

Equação 2 334 rV ⋅⋅= π Fórmula 2

27

4.7 Análise estatística

A partir dos valores obtidos foram geradas planilhas no Microsoft Excel®

e os valores amostrados em tabelas. A análise comparativa dos valores foram

da análise de variância (ANOVA), duas vias, e o teste de Tukey para

comparação das médias. Ainda na análise estatística utilizou-se o teste “t” de

Student para dados pareados, sendo consideradas significativos os valores

quando p<0,05.

Foi realizada uma análise de variância (ANOVA) entre os valores obtidos

dos campos dentro de cada grupo para analisar o grau de diferença. Aplicou-se

o teste t de Student independente com variância igual de duas amostras

(homoscedástica) entre as médias dos campos. O resultado da análise

demonstrou um p<0,001 para os valores de área, perímetro, diâmetro e

volume.

Os dados foram processados, através do programa Microsoft® Excel

2002 no sistema operacional Windows XP Professional, procedendo-se o

tratamento matemático dos dados e construção de gráficos que facilitem a

visualização.

28

5 RESULTADOS

A partir dos valores obtidos obteve-se a média e o desvio padrão

(Tabela 1). A análise estatística entre os grupos apresentou uma diferença

significativa para um p<0,001.

Tabela 1 – Valores (média±DP) obtidos a partir de medidas de área, perímetro, diâmetro e volume, realizadas no núcleo de hepatócitos de camundongos tratados com Dioclea grandiflora comparados com grupo controle.

Área (µm2)

Perímetro (µm)

Diâmetro (µm)

Volume (µm3)

GC 34,095±2,919 22,608±0,957 6,255±0,283 130,815±17,958

GT 48,687*±7,339 27,255*±2,098 7,611*±0,589 244,068*±61,441

* p<0,001 para área, perímetro, diâmetro e volume no GT em relação ao GC.

Os valores da área (Figura 3), perímetro (Figura 4), diâmetro (Figura 5) e

volume (Figura 6) do núcleo de hepatócitos de camundongos albinos suíços

(Mus muscullus) machos do GC foram superiores aos do GT, apresentando

uma diferença significativa (p<0,001).

Na análise histológica, do grupo tratado com salina (GC) observou-se

hepatócitos com morfologia nuclear regular e citoplasma acidófilo de aspecto

normal, enquanto os cortes histológicos de camundongos tratados com Dioclea

grandiflora foram observados núcleos com morfologia alterada, diâmetros

variados e citoplasma de aspecto vacuolizado (Figura 7).

29

48,687

34,095

0

10

20

30

40

50

60

µm²

GCGT

Figura 3 – Valor da área (µm2) do núcleo de hepatócitos de camundongos albinos suíços (Mus muscullus) machos tratados com Dioclea grandiflora em relação ao grupo controle tratado com salina. * p<0,001 no GT em relação ao GC.

27,255

22,608

0

5

10

15

20

25

30

35

µm

GCGT

Figura 4 – Valor do perímetro (µm) do núcleo de hepatócitos de camundongos albinos suíços (Mus muscullus) machos tratados com Dioclea grandiflora em relação ao grupo controle tratado com salina. * p<0,001 no GT em relação ao GC.

*

*

30

7,611

6,255

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

µm

GT GC

Figura 5 – Valor do diâmetro (µm) do núcleo de hepatócitos de camundongos albinos suíços (Mus muscullus) machos tratados com Dioclea grandiflora em relação ao grupo controle tratado com salina. * p<0,001 no GT em relação ao GC.

244,068

130,810

0

50

100

150

200

250

300

350

µm³

GT GC

Figura 6 – Valor do volume (µm3) do núcleo de hepatócitos de camundongos albinos suíços (Mus muscullus) machos tratados com Dioclea grandiflora em relação ao grupo controle tratado com salina.

* p<0,001 no GT em relação ao GC.

*

*

31

Figura 7 – A - Grupo controle - Observam-se hepatócitos apresentando morfologia nuclear regular e citoplasma acidófilo de aspecto normal quando comparados com os observados nos cortes do Grupo tratado - B, C e D - cujos núcleos exibem morfologia alterada, diâmetros variados e citoplasma de aspecto vacuolizado. Coloração: H-E. x800.

32

6 DISCUSSÃO

Constatou-se, a partir da avaliação quantitativa obtida por técnica

morfométrica, que camundongos Mus muscullus submetidos a tratamento

agudo com extrato aquoso da casca do caule de Dioclea grandiflora, durante 7

dias, apresentam alterações significativas nos núcleos de hepatócitos. A

principal alteração observada foi o aumento do núcleo referente a área,

diâmetro, perímetro e volume.

Em estudo morfoquantitativo dos rins de camundongos Mus muscullus

submetidos a tratamento semelhante, Almeida (2004) verificou redução no

corpúsculo renal, glomérulo e espaço sub-capsular.

Em estudo pioneiro, Chaves et al. (1948), utilizando sementes de

Dioclea grandiflora, preparadas à maneira popular, observou, através de

investigação histopatológica em pombos e em ratos, efeitos degenerativos nos

rins e no fígado. Mas não foi realizada uma análise quantitativa.

Souza, et al. (1997) estudaram, em suínos, outra Fabacea, a Crotalaria

spectabilis. Observaram lesões no tecido hepático, apesar de não terem

realizado uma precisa análise quantitativa, destacaram aumento do tecido

hepático. Corroborando com os resultados encontrados no presente estudo.

Em estudo histológico em bovinos, camundongos, ratos e coelhos

tratados com Riedeliella grandiflora (Fabacea), Riet-Correa et al. (2001)

observaram, no fígado desses animais, desorganização da estrutura trabecular

33

e degeneração e necrose de alguns hepatócitos. Nobre et al. (2004) observou

variados graus de fibrose em tecido hepático de eqüinos tratados com

Crotalaria retusa. Observou ainda necrose e vacuolização citoplasmática nos

hepatócitos. Achados semelhantes também foram observados no presente

estudo.

Os hepatócitos dos camundongos Mus muscullus submetidos a

tratamento agudo com extrato aquoso da casca do caule de Dioclea grandiflora

apresentaram vacuolizações citoplasmáticas e apesar de não terem sido

quantificados morfometricamente, observa-se que, neste grupo tratado,

ocorreram possíveis aumentos nos sinusóides, o que corrobora com Lemos et

al. (1999) que discute o possível efeito vasodilatador do flavonóide diocleína

ativando óxido nítrico e fatores de relaxamento do endotélio. Em Almeida et al.

(2002) foi observado aumento do fluxo coronariano no coração de ratos

tratados com o flavonóide extraído da Dioclea grandiflora.

Nos estudos de Silva (2003), os extratos aquoso e etanólico da casca do

caule de Dioclea grandiflora, apresentaram efeitos tóxicos importantes sobre

fígado e rins de camundongos. Os mesmos efeitos foram observados nos

hepatócitos dos animais tratados no presente trabalho.

O aumento do núcleo observado no presente estudo pode indicar um

aumento da atividade nuclear e pode estar relacionado a processos

apoptóticos, como observado por Vekemans e Braet (2004) em ratos tratados

com 3,3’-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate e com Propidium iodide.

Porém, conclusões mais consistentes exigiriam uma investigação à alta-

34

resolução em nível microscópico, como microscopia de elétron de transmissão,

por exemplo.

A degeneração citoplasmática, possivelmente deve-se (Jaeschke et al.,

2000) a reação de alta energia no citocromo p450 comprometendo a

homeostase do cálcio com a ruptura de fibrilas intracelulares e lise de

hepatócitos deve ser investigada, além de apoptose e estresse oxidativo

gerado por dano a organelas intracelulares, principalmente nos casos de

estudos com extrato etanólico, como realizado por Silva (2004). De acordo com

Bertolami (2005), deve-se realizar o controle das enzimas hepáticas antes de

iniciar o tratamento e depois, periodicamente. Segundo Amacher et al. (1998;

2001) a relação enzimática e alterações histológicas em estudos toxicológicos

deve ser realizada.

Um estudo da DL50, dentro da exigência da ANVISA, deve ser realizado

com a Dioclea grandiflora. Porém, de acordo com Jaeschke et al. (2000) dano

celular e morte não só é determinada pela natureza e dose de uma droga

particular mas também através de fatores como o perfil de expressão genética

do indivíduo, estado de antioxidante, e capacidade regenerativa. Por causa do

muitos mecanismos diretos e indiretos de dano celular droga-induzido no

fígado, a evidencia de hepatotoxicidade permanece uma razão principal para

retirada da droga no seu uso clínico.

Além do interesse da aplicação terapêutica em humanos, alguns estudos

toxicológicos são motivados por interesses na medicina veterinária ou na

fabricação de defensivos agrícolas e inseticidas. Seja qual for o interesse da

35

investigação, os possíveis danos hepáticos desses fitofármacos não podem

deixar de serem analisados, devido a importante interface que o fígado

representa com o meio externo, além das suas propriedades de síntese e, de

acordo com Bohne et al. (2006) biotransformação.

O pioneiro nos estudos morfométricos em fígado são de Weibel et al.

(1969). Os estudos morfométricos do fígado tem sido úteis para uma avaliação

mais precisa, por ser uma análise quantitativa. Parâmetros como volume lobar

têm sido utilizado por Harada et al. (1997) como dado clínico em pacientes

humanos. Engelman et al. (2001) realizou um estudo morfométrico do fígado

de ratos submetidos a doses supra-fisiológicas de tiroxina.

A investigação da histologia hepática, incluindo análise quantitativa por

meio de recursos morfométricos tem sido uma característica importante que

pode ser incorporada aos estudos toxicológicos de elementos

fitofarmacológicos.

No caso da Dioclea grandiflora, deve-se haver melhores investigações

acerca dos compostos já isolados para uma possível aplicação terapêutica dos

mesmos na tentativa de discernir essas ações das alterações hepatotóxicas

aqui observadas. Caso não seja possível, deve-se afastar da cultura popular a

utilização dessa planta no tratamento da urolitíase e dos distúrbios prostáticos.

36

7 CONCLUSÃO

O tratamento agudo com extrato aquoso da casca do caule de Dioclea

grandiflora provoca:

• degeneração hepática com presença de vacuolizações citoplasmáticas;

• aumento na área, perímetro, diâmetro e volume do núcleo do hepatócito;

Não é recomendado o seu uso na medicina popular até que

investigações mais precisas sejam realizadas com os compostos isolados.

37

REFERÊNCIAS

1. ADELAKUM, E.A.; FINBAR, E.A.V.; AGINA,S.E.; MAKINDE, A.A.;.

Antimicrobiol activity of Boswellia dolziellii stem bark. Fitoterapia, v. 72,

p. 82-824, 2001.

2. AGRA, M.F. Planta medicinal popular dos cariris velhos. Editora

União, João Pessoa, p.125, 1996.

3. AINOUZ, I.L.; MOREIRA, R.A.; CAMPOS, F.D.A.P.; RICHARDSON, M.;

BEGBIE, R.; STEWART, J.C.; WATT, W.B.; PUSZTAI, A. The isolation

anda mino acid sequence of the β- and γ- subunits of the lectin from the

seeds of Dioclea grandiflora. Phytochemistry, v.26, n.5, p.1435-1440,

1987.

4. ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.;

WALTER, P. Histologia: vida e morte das células nos tecidos.

In.:_______. Biologia molecular da célula. 4Ed. Porto Alegre: Artmed,

2004, p.1277.

5. ALEXEEFF, G.V., BROADWIN, R., LIAW, J., DAWSON, S.V.

Characterization of the LOAEL-to-NOAEL uncertainty factor for mild

adverse effects from acute inhalation exposures. Regulatory

Toxicology and Pharmacology v.36, p.96–105, 2002.

38

6. ALMEIDA, A.P.; CORTES, S.F.; FERREIRA, A.J.; LEMOS, V.S.

Increase on the coronary flow induced by Dioclein on isolated rat heart.

Life Sciences, v.70, p.1121-1128, 2002.

7. ALMEIDA, E.R. Plantas medicinais brasileiras: conhecimentos

populares e científicos. São Paulo: Hemus Ltda, p.341, 1993.

8. ALMEIDA, E.R.; ALMEIDA, R.N.; NAVARRO, D.S.; BHATTACHARYYA,

J.; SILVA, B.A.; BIRNBAUM, J.S.P. Central antinociceptive effect of a

hydroalcoholic extract of Dioclea grandiflora seeds in rodents. Journal of

Ethnopharmacology, v.88, p.1-4, 2003.

9. ALMEIDA, L.L. Estudo morfoquantitativo dos rins de camundongos

(Mus muscullus) tratados com extrato aquoso de Dioclea

grandiflora (FABACEA). 2004. 39f. Dissertação (Programa de Pós-

Graduação em Patologia) Universidade Federal de Pernambuco, Recife-

PE.

10. AMACHER, D.E.; SCHOMAKER, S.J.; BURKHARDT, J.E. The

relationship among microsomal enzyme induction, liver weight and

histological change in rat toxicology studies. Food and Chemical

Toxicology, v.36, p.831-839, 1998.

11. AMACHER, D.E.; SCHOMAKER, S.J.; BURKHARDT, J.E. The

relationship among microsomal enzyme induction, liver weight and

histological change in beagle dog toxicology studies. Food and

Chemical Toxicology, v.39, p.817–825, 2001.

39

12. ANAND, S.S., SONI, M.G., VAIDYA, V.S., MURTHY, S.N., MUMTAZ,

M.M., MEHENDALE, H.M. Extent and timeliness of tissue repair

determines the dose-related hepatotoxicity of chloroform. Int. J. Toxicol.

v.22, p.25, 2003a.

13. ANDRADE, J.L.; ARRUDA, S.; BARBOSA, T.; PAIM, L.; RAMOS, M.V.;

CAVADA, B.S.; BARRAL-NETTO, M. Lectin-induced nitric oxide

production. Cellular immunologic, v.194, p.98-102, 1999.

14. ANTÔNIO, M.A.; BRITO, A.R.M.S. Oral anti-inflammatory and

antiulcerogenic activities of a hydroalcoholic extract and partitioned

fractions of Turnera ulmifolia (Turneraceae). J. Ethnopharmacol. v.61,

p.215-228, 1998

15. BARACAT, A.B. Caatinga: identificação de leguminosas com alto

potencial para uso forrageiro. Boletim Plantas do Nordeste, n.7, p.1-3,

1995.

16. BARROS, M.L.B. Prefácio. In.: LEAL, I.R.; TABARELLI, M.; SILVA,

J.M.C. Ecologia e conservação da caatinga. Recife: Ed. Universitária

da UFPE, 2003.

17. BATISTA, J.S. Estudo químico e farmacológico das cascas das

raízes da Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth. Dissertação de

Mestrado, Universidade Federal da Paraíba, 1993.

18. BATISTA, J.S.; ALMEIDA, R.N.; BHATTACHARYYA, J. II Congress de

la federacion farmacêutica sudamericana. Abstract papers.

Montievideo, Uruguay, p.168, 1993.

40

19. BATISTA, J.S.; ALMEIDA, R.N.; BHATTACHARYYA, J. Analgesic effect

of Dioclea grandiflora constituents in rodents. Journal of

Ethnopharmacology, v.45, p.207-210, 1995.

20. BHATIA, A.L.; JAIN, M. Cspinacia oleracea L. Protects against gamma

radiations: a study on glutathione and lipid peroxidation in mouse liver.

Phytomed. v.11, p.607-615, 2004.

21. BHATTACHARYYA, J.; MAJETICH, G.; SPEARING, P.; ALMEIDA, R.N.

Dioclenol, a minor flavanonol from the root-bark of Dioclea grandiflora.

Phytochemistry, v.46, n.2, p.385-387, 1997.

22. BHATTACHARYYA, J.; BATISTA, J.S.; ALMEIDA, R. N. Dioclein, a

flavanone from the roots of Dioclea grandiflora. Phytochemistry, v.38,

n.1, p.277-278, 1995.

23. BHATTACHARYYA, J.; FANT, J.; LONN, H. BREWER, C.F.

Biochemistry, v.29, p.7523-7530, 1990.

24. BHATTACHARYYA, J.; KHAN, M.I.; BREWER, C.F. Biochemistry,

v.27, p.8762-8767, 1988.

25. BOHNE, V.J.B.; HAMRE, K.; ARUKWE, A. Hepatic Biotransformation

and Metabolite Profile during a 2-Week Depuration Period in Atlantic

Salmon Fed Graded Levels of the Synthetic Antioxidant, Ethoxyquin.

Toxicological Sciences v.93, n.1, p.11–21, 2006.

26. BRAS-FILHO, R. Química de produtos naturais: importância,

interdisciplinaridade, dificuldades e perspectivas. A peregrinação de um

pacatubano. Química Nova, v.17, n.5, p.405-445, 1994.

41

27. BREWER, C.F.; DAM, T.K.; CAVADAS, B.S.; GRANGEIRO, T.B.;

SANTOS, C.F.; SOUSA, F.A.M.; OSCARSON, S. Diocleinae lectins are

a group of proteins with coserved binding sites for the core trimannoside

of asparagine-linked oligosaccharides and differential specificities fo

complex carbohydrates. The journal of biological Chemistry, v. 273,

n.20, p.12082-12088, 1998.

28. BREWER, C.F.; DAM, T.K.; ROY, R.; DAS, S.K.; OSCARSON, S.

Bynding of Multivalente carbohydrates to concanavalin A and Dioclea

grandiflora lectin. The Journal of biological chemistry. v.375, n.19,

p.14223-14230, 2000.

29. BREWER, C.F.; DAM, T.K.; ROY, R.; PAGÉ, D. Negative cooperativy

associated with binding of multivalent carbohydrates to lectins.

Thermodynamics analysis of the multivalency effect. Biochemistry,

v.41, p. 1351-1358, 2002.

30. BREWER, C.F.; LEE, H.C.; GORONCY, A.K.; PEISACH, J.; CAVADO,

B.S.; GRANGEIRO, T,B.; RAMOS, M.V.; SAMPAIO, A.H.; DAM, T.K.

Demostratrion at the Mn 2+ site in diocleinae lectin by pulsed EPR

spectroscopy. Biochemistry, v.39, p. 2340-2346, 2000.

31. CHAVES, N.; TEODÓSIO, N.R.; LIMA, O.G.; PESSOA, W. A mucura

vermelha (Dioclea grandiflora) na nutrição. Recife, JC, 1948.

32. COTRAN R.S.; KUMAR V.; COLLINS T. Rim. In____. Robbins

Patologia estrutural e funcional. 6Ed. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, 2000; p.889-890.

42

33. CRONQUIST, A. An integrated system of classification of Floyring

plants. 519 p., 1968.

34. DOBREV, I.D., ANDERSEN, M.E., YANG, R.S. Assessing interaction

thresholds for trichloroethylene in combination with tetrachloroethylene

and 1,1,1-trichloroethane using gas uptake studies and PBPK modeling.

Arch. Toxicol. v.75, p.134. 2001.

35. ENGELMAN, M.F.B.; GUIDUGLI-NETO, J.; ANDRADE, C.H.V.;

HERNANDEZ, R.; GOULART, L.B.N.T. Estudo Morfométrico do Fígado

de Ratos Submetidos a Doses Supra-Fisiológicas de Tiroxina. Arq Bras

Endocrinol Metab, v.45, n.2, p.173-179, 2001.

36. FAUSTO, N.; LAIRD, A.D.; WEBBER, E.M. Liver regeneration. 2. Role of

growth factors and cytokines in hepatic regeneration. FASEB J. v.9,

p.1527–1536, 1995.

37. FORMICA, J.V.; REGELSON, W. Review of the biology of quercetin and

related bioflavonoids. Fd Chem. Toxic. v.33, p.1061–1080, 1995.

38. GERBER M.A.; THUNG S.N. Histology of the liver. Am J Surg Pathol,

v.11, p.709-22, 1987.

39. GOSS, CM. Gray Anatomia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,

p.1017-26. 1988.

40. HADDAD, S., CHAREST-TARDIF, G., KRISHNAN, K. Physiologically

based modeling of the maximal effect of metabolic interactions on the

kinetics of components of complex chemical mixtures. J. Toxicol.

Environ. Health A v.61, p.209, 2000.

43

41. HARADA, H.; IMAMURA, H.; MIYAGAWA, S.; KAWASAKI, S. Fate of

the Human Liver After Hemihepatic Portal Vein Embolization: Cell Kinetic

and Morphometric Study. Hepatology, v.26, n.5, 1997.

42. HAVSTEEN, B.H. The Biochemistry and Medicinal Significance of the

Flavonoids. Pharmacol. & Therap. v.96, p.67-202, 2002.

43. HERTOG, M.G.L. Epidemiological evidence on potential health

properties of flavonoids. Proc. Nutr. Soc. v.55, p.385-397, 1996.

44. HEYWOOD, V. Flowering plants of the worlds. 335 p, 1996.

45. ITOIGAWA, M.; ITO, CHIHIRO,; MIKAMOTO, Y.; RAO, K.S.;

TAKAYASU, J.; OKUDA, Y.; MUKAINATA,T.; TOKUDA, H.; NISHINO,

H.; FURUKWA, H. A New Biflavanóid from Colophyllum panciflorium with

Antitumor-Promoting Activity. J. Nat. Produc, v.62, p. 1668-1671, 1999.

46. JAESCHKE, H.; GORES, G.J.; CEDERBAUM, A.I.; HINSON, J.A.;

PESSAYRE, D.; LEMASTERS, J.J. Mechanisms of Hepatotoxicity.

Toxicological Sciences, v.65, p.166–176, 2002.

47. JUNQUEIRA, LC.; CARNEIRO, J. Histologia básica. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, p.324-34. 2004.

48. KHAN, M.R.; KIMARA, M.; OMOLOSA. A.D. Antimicrobial activity of

Symplocus cochinessis. Fitoterapia. v.72, p.825-828, 2001.

49. KIESSLING, L.L.; TOONE, E.J.; WEATHERMAN, R.V.; MORTEL, K.H,

CHERVENAK, M. Specificity of C-Glycoside Complexation by

Mannose/Glucose Specific Lectins. Biochemistry, v.35, p. 3619-3264,

1996

44

50. KINGSBURY, J.M. Poisonous Plants of the United States and

Canada. Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, NJ, USA. 1964.

51. LEAL, I.R.; TABARELLI, M.; SILVA, J.M.C. Ecologia e conservação da

caatinga. Recife: Ed. Universitária da UFPE, 2003.

52. LEMOS, V.S.; FREITAS, M.R.; MULLER, B.; LINO, Y.D.; QUEIROGA,

C.E.G.; CORTES, S.F. Dioclein a new nitric oxide and endothelium

dependent vasodilator flavonoid. European Journal of Pharmacology,

v.386, p.41-46, 1999.

53. LIMA, D.A. Plantas da caatinga. Academia Brasileira de Ciências. Rio

de Janeiro, 1989.

54. LIMA, M.S.; ALBUQUERQUE, D.A.; IBAÑEZ, O.M.; SANT’ANNA, O.

Inflammatory cutaneous reaction induced by the lectin of Dioclea

grandiflora (Mart). Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.88, n.4,

p.599-603, 1993.

55. MAJETICH,G.; JENKINS, T.; BHATTACHARYYA, J.; TENG, Q. FATIMA,

A.G.; ALMEIDA, R. Flavanoids from the root-bark of Dioclea grandiflora.

Phytochemistry, v.52, p.723-730, 1999.

56. MANGIPUDY, R.S., CHANDA, S., MEHENDALE, H.M. Hepatocellular

regeneration: key to thioacetamide autoprotection. Pharmacol. Toxicol.

v.77, p.182, 1995b.

57. MARTINS, E.R.; CASTRO, D.M.; CASTELLANI, D,C.; DIAS, J.E.

Plantas medicinais. Editora UFV. Universidade Federal de Viçosa, MG,

Brasil, p.220, 2000.

45

58. MATTEI, R; LEITE, J.R; TUFIK, S. A study of the pharmacological

actions of Dioclea grandiflora Martius ex. Bentham. São Paulo: Medical

Journal, v.113, n.1, p.687-691, 1995.

59. MEHENDALE, H.M. Amplified interactive toxicity of chemicals at nontoxic

levels: mechanistic considerations and implications to public health.

Environ. Health Perspect. v.102, p.139, 1994.

60. MEHENDALE, H.M. Toxicodynamics of low level toxicant interactions of

biological significance: inhibition of tissue repair. Toxicology v.105,

p.251, 1995.

61. MICHALOPOULOS, G.K.; DEFRANCES, M.C. Liver regeneration.

Science, v.276, p.60–66, 1997.

62. MIDDLETON, E. JR.; KANDASWAMI, C.; THEOHARIDES, R. The

Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for

Inflammation, Heart Disease and Cancer. Pharmacol. Rev. v.52, p.673-

751, 2000.

63. NOBRE, V.M.T.; RIET-CORREA, F.; BARBOSA FILHO, J.M.; DANTAS,

A.F.M.; VASCONCELOS, S.J. Intoxicação por Crotalaria retusa

(Fabacea) em eqüinos no semi-árido da Paraíba. Pesq. Vet. Bras. v.24,

n.3, p.132-143, 2004.

64. OLIVEIRA, F.; AKISUE, G. Fundamentos de farmacobotânica. 2Ed.

São Paulo: Atheneu, 2000.

46

65. RICE-EVANS, C.; MILLER, N.J.; PAGANGA, G. Structure-antioxidant

activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biol.

Med. v.20 p.933-956, 1996.

66. RICHARDSON, M.; CAMPOS, D.A.P.; MOREIRA, R.A.; AINOUZ, I.L.;

BEGBIER,R.; WATT, W.B.; PUSZTAI, A.. The complete aminoacid and

sequences of the major α subunit of the lectin from the seeds of Dioclea

grandiflora (Mart). Eur. J. Biochem., v.144, p.101-111. 1984.

67. RICHARDSON, M.; CAMPOS, F.D.A.P.; MOREIRA, R.A.; AINOUZ, I.L.;

BEGBIE, R.; STEWART, J.C.; WATT, W.B.; PUSZTAI, A. The complete

amino acid sequence of the major α subunit of the lectin from the seeds

of Dioclea grandiflora (Mart). European Journal of Biochemistry,

v.144, p.101-111, 1984.

68. RIET-CORREA, K.; GÓRNIAK, L.S.; HARAGUCHI, M.; DAGLI, M.L.Z.

Histological changes caused by experimental Riedeliella grandiflora

(Leg. Papilionoideae) poisoning in cattle and laboratory animals. Pesq.

Vet. Bras. v.21, n.1, p.5-7, 2001.

69. SACCHETTINI, J.C.; BREWER, C.F.; ROZWARSKI, D.A; SWAMI, B.M.

Crystal Structure of the Lectin from Dioclea grandiflora Complexed

withCore Trimannoside of Asparagine-liked Carbohydrates. The Journal

of Biological Chemistry, v.273, n.49, p. 32818-32825, 1998.

70. SILVA, J.M.C.; DINNOUTI, A. Análise da representatividade das

unidades de conservação federais de uso indireto na Floresta Atlântica e

Campos Sulinos. In.: PINTO, L.P. Padrões de biodiversidade da Mata

47

Atlântica do Sul e Sudeste. São Paulo, Campinas. Disponível em:

<www.conservation.org.br/ma/index.html> Acessado em 12/11/2005.

71. SILVA, L.L.S. Aspectos farmacológicos de Dioclea grandiflora Mart.

Ex. Benth. (FABACEA): atividades antimicrobiana, citotóxica e

antitumoral. 2003. 124f. Tese (Doutorado em Produtos Naturais e

Sintéticos Bioativos). Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa.

72. SONI, M.G.; MEHENDALE, H.M. Role of tissue repair in toxicological

interactions among hepatotoxic organics. Environ. Health Perspect.

v.106, p.1301, 1998a.

73. SONI, M.G.; RAMAIAH, S.K.; MUMTAZ, M.M.; CLEWELL, H.;

MEHENDALE, H.M. Toxicant-inflicted injury and stimulated tissue repair

are opposing toxicodynamic forces in predictive toxicology. Regul.

Pharmacol. Toxicol. v.19, p.165, 1999.

74. SOUZA, A.C.; HATAYDE, M.R.; BECHARA, G.H. Aspectos patológicos

da intoxicação de suínos por sementes de Crotalaria spectabilis

(Fabacea). Pesq. Vet. Bras. v.24, n.2, p.74-79, 2004.

75. TOLOSA, E.M.C.; RODRIGUES, C.J.; BEHMER, O.A.; FREITAS-NETO,

A.G. Manual de técnicas para histologia normal e patológica. 2Ed.

São Paulo: Manole, 2003.

76. TOONE, E,J.; WEATHERMAN, R.V.; MORTELL, K.H.; CHERVENAK,

M.; KIESSLING, L.L. Specificity of C-glicoside complexation by

Mannose/glucose Specificity lectins. Biochemistry, v.35, p.3619-3624,

1996.

48

77. TOONE, E.J.; CHERVENAK, M.C. Colorimetric analysis of the binding of

lectins with overlopping carbohydrate binding ligand specificities.

Biochemistry, v. 34, p.5685-5695, 1995.

78. VEKEMANS, K.; BRAET, F. Preparing Liver (Sinusoidal) Cells for

Imaging Apoptosis Events. Current Issues on Multidisciplinary

Microscopy Research and Education, p.81-86, 2004.

79. WEIBEL, E.R.; STÄUBLI, W.; GNÄGI, H.R.; HESS, F.A. Correlated

morphometric and biochemical studies on the liver cell. I. Morphometric

model, stereologic methods, and normal morphometric data for rat liver.

J Cell Biol, v.42, p.63-91, 1969.

49

ANEXO

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