ASSOCIAÇÃO ENTRE OS POLIMORFISMOS NOS GENES … · mudanças de peso corporal e consumo alimentar...

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Nutrição Josué de Castro

Programa de Pós-Graduação em Nutrição

ASSOCIAÇÃO ENTRE OS POLIMORFISMOS NOS GENES

RELACIONADOS À OBESIDADE E ÀS MUDANÇAS DE PESO CORPORAL

E CONSUMO ALIMENTAR DE GESTANTES

MAISA CRUZ MARTINS

RIO DE JANEIRO

2017

Associação entre os polimorfismos nos genes relacionados à obesidade e às

mudanças de peso corporal e consumo alimentar de gestantes

MAISA CRUZ MARTINS

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Nutrição (PPGN), do Instituto de Nutrição Josué de Castro da

Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos

requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em

Ciências Nutricionais.

Orientador: Prof. Dr. Gilberto Kac

RIO DE JANEIRO

Julho/2017

ASSOCIAÇÃO ENTRE OS POLIMORFISMOS NOS GENES RELACIONADOS À

OBESIDADE E ÀS MUDANÇAS DE PESO CORPORAL E CONSUMO

ALIMENTAR DE GESTANTES

Maisa Cruz Martins

Tese submetida à banca examinadora e ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição do

Instituto de Nutrição Josué de Castro da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte

dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Nutricionais.

Examinada por:

____________________________________ Prof. Dra. Elisa Maria de Aquino Lacerda



Revisora

____________________________________

Prof. Dra. Gloria Valéria da Veiga



____________________________________

Prof. Dra. Denise Pires de Carvalho


Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

____________________________________

Prof. Dr. Claudio José Struchiner

Fundação Oswaldo Cruz

Escola Nacional de Saúde Pública

____________________________________

Prof. Dra. Vivian Wahrlich

Universidade Federal Fluminense

Faculdade de Nutrição Emília de Jesus Ferreiro

____________________________________

Prof. Dr. Gilberto Kac



Orientador

RIO DE JANEIRO, RJ - BRASIL

Julho de 2017

iv

Martins, Maisa Cruz

Associação entre os polimorfismos nos genes

relacionados à obesidade e às mudanças de peso corporal e

consumo alimentar de gestantes/Maisa Cruz Martins – Rio de

Janeiro: UFRJ/INJC, 2017.

XXVI, 156 p.: il.; 29,7 cm.

Orientador: Gilberto Kac

Tese – UFRJ/INJC/Programa de Pós-graduação em

Nutrição, 2017.

Referências Bibliográficas: p. 140-152.

1. Gestantes. 2. Polimorfismos de nucleotídeo único. 3.

Peso pré-gestacional. 4. Ganho de peso gestacional. 5.

Retenção de peso pós-parto. 6. Consumo alimentar. 7. Estudo

de coorte. I. Martins, Maisa Cruz. II. Universidade Federal

do Rio de Janeiro, INJC, Programa de Pós-graduação em

Nutrição. III. Título.

v

Dedicatória

A todos que, mesmo sem saber a importância dos gestos e palavras, contribuíram para a conclusão deste trabalho e

da realização deste sonho.

vi

Agradecimentos

Primeiramente gostaria de agradecer a Deus por ter me permitido evoluir

constantemente. Sou grata por Sua constante presença em minha vida, que me alenta e

sustenta nos momentos alegres e difíceis, auxiliando para que me transforme em alguém

melhor.

Apesar do processo solitário a que qualquer investigador está destinado ao escrever

uma tese, este trabalho é o resultado de significativas contribuições que recolhi durante

minha trajetória profissional em diversas instituições, convivendo com pessoas dedicadas

ao ensino e a aprendizagem. Assim, agradeço especialmente às professoras Leonor Maria

Pacheco Santos e Ana Marlúcia Oliveira Assis, que incentivaram e contribuíram para

minha formação profissional. A caminhada para chegar até este momento foi repleta de

desafios e conquistas.

Agradeço ao meu orientador, Gilberto Kac, a disponibilidade manifestada para

orientar este trabalho e a confiança no meu potencial, impondo desafios com determinação.

Obrigada pelos ensinamentos, pela dedicação e por tornar o tempo de trabalho uma ótima

convivência.

À Janet Trujillo, agradeço a iniciação no campo da genética e as valiosas

contribuições durante a elaboração dos artigos que fazem parte deste trabalho.

Ao meu pai João, ‘in memoriam’, agradeço os ensinamentos e o incentivo aos

estudos. À minha mãe Damiana, por sua simplicidade e por entender minha busca pelo

crescimento pessoal e profissional. Aos meus irmãos Rosa, Beto e Sérgio e sobrinhos,

agradeço o orgulho e carinho que sentem de mim, mesmo a distância.

Agradeço à minha grande amiga e família de coração, Janaina Castrioto, o

permanente estímulo que, por vezes, se tornou decisivo em determinados momentos da

elaboração desta tese.

Sou grata às minhas amigas e colegas de trabalho Vanessa Chaia e Marcelly Lopes

pela compreensão e apoio nos momentos em que precisei me afastar das atividades do

LANUTRI para concluir esta tese.

Agradeço aos amigos que acompanharam minha trajetória, tanto de perto quanto de

longe, entendendo muitas vezes a minha ausência. Um agradecimento especial às minhas

vii

amigas nutricionistas Heloisa Gomes, Simone Pinho, Sônia Borba, Audrey Cintra, Thaís

Ferreira e Isabela da Matta, pela nossa amizade e convívio saudável.

Aos membros da equipe do Observatório de Epidemiologia Nutricional, que sempre

estiveram disponíveis para auxiliar nos momentos que precisei, especialmente às minhas

colegas de doutorado Dayana Farias e Jaqueline Lepsch. Muito obrigada a todos!

Sou grata à professora Elisa Maria de Aquino Lacerda pela disponibilidade e

atenção para revisar esse documento, as quais foram importantes para o aprimoramento

deste trabalho.

Agradeço aos membros da banca, por terem aceitado o convite e pelo tempo

dedicado na leitura crítica do presente trabalho.

Aos professores e funcionários do Programa de Pós-graduação em Nutrição do

Instituto de Nutrição Josué de Castro, sou grata pela atenção e dedicação em nos atender.

Às gestantes que participaram do estudo, sem as quais não seria possível realizar

esse trabalho.

Enfim, o meu profundo e sentido agradecimento a todas as pessoas que contribuíram

para a concretização desta tese, estimulando-me intelectual e emocionalmente.

Rio de Janeiro, julho de 2017.

Maisa Cruz Martins

viii

RESUMO

Introdução: Acompanhando o cenário da epidemia global da obesidade, grande parcela das

mulheres está iniciando a gestação com peso acima do recomendado, ganhando peso

excessivamente ao longo da gestação e retendo percentual elevado do peso acumulado nesse

período. Entre os diversos fatores que contribuem para o excesso de massa corporal, as

diferenças genéticas desempenham importante papel no processo de expressividade do

fenótipo da obesidade, provavelmente por meio de mecanismos de controle da

saciedade/apetite e preferências alimentares. Objetivo: Estudar a associação entre os

polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) nos genes relacionados à obesidade (FTO - massa

de gordura e obesidade associadas, rs9939609; MC4R - melanocortina-4 receptor,

rs17782313; LEP – leptina, rs7799039 e LEPR - receptor da leptina, rs1137101) e mudanças

de peso corporal e consumo alimentar de gestantes. Método: Coorte prospectiva de gestantes

acompanhadas em um Centro Municipal de Saúde, localizado no bairro da Tijuca no

município do Rio de Janeiro, nos seguintes períodos: 5-13, 20-26 e 30-36 semanas

gestacionais e 30-45 dias pós-parto. Foram realizadas medidas antropométricas (massa

corporal e estatura) e dosagens das concentrações plasmáticas de leptina. Foram obtidos

dados de consumo alimentar por meio de um questionário de frequência alimentar (QFA),

referentes aos períodos pré-gestacional e gestacional. Os SNPs foram analisados por reação

em cadeia da polimerase em tempo real (PCR). As associações entre os polimorfismos dos

genes e as variáveis dependentes (peso pré-gestacional, ganho de peso gestacional, retenção

de peso pós-parto, concentração plasmática de leptina e consumo alimentar) foram

investigadas por meio de modelos regressão longitudinal linear de efeitos mistos, regressão

linear múltipla e modelos de regressão de Poisson, ajustados por fatores obstétricos,

socioeconômicos, demográfico e ingestão energética total. Resultados: O SNP do gene do

FTO-rs9939609 (alelo-A) foi significativamente associado ao excesso de peso pré-

gestacional e à percentagem mais elevada de energia derivada dos carboidratos no período

pré-gestacional. Este SNP também foi associado à percentagem mais elevada de energia total

e à percentagem mais elevada de energia dos alimentos ultraprocessados durante a gestação.

O SNP do gene MC4R-rs17782313 (alelo-C) foi positivamente associado à percentagem mais

elevada de energia derivada de alimentos ultraprocessados ao longo da gestação. Os SNPs nos

genes LEP-rs7799039 e LEPR-rs1137101 não foram estatisticamente associados às

ix

concentrações plasmáticas de leptina ao longo da gestação e aos componentes do consumo

alimentar, contudo, o gene LEP-rs7799039 foi significativamente associado ao maior risco de

ganho de peso gestacional excessivo. Conclusão: Os SNPs em genes relacionados à

obesidade estão associados as mudanças do peso corporal e do consumo alimentar de

gestantes.

Palavras-chave: Gestantes; Polimorfismos de nucleotídeo único; Peso pré-gestacional;

Ganho de peso gestacional; Retenção de peso pós-parto; Consumo alimentar; Estudo de

coorte.

x

ABSTRACT

Introduction: A large proportion of women are initiating gestation above the recommended

weight, gaining excessive weight during pregnancy and retaining a high percentage of the

gestational weight gain as a result of the global epidemic of obesity. Among the many factors

contributing to overweight, genetic differences play an important role in the process of

expressiveness of the obesity phenotype, probably through control mechanisms of

satiety/appetite and food preferences. Objective: To study the association between single

nucleotide polymorphisms (SNPs) in obesity-related genes (FTO - fat mass and obesity,

rs9939609; MC4R - melanocortin 4 receptor, rs17782313; LEP – leptin, rs7799039 e LEPR -

leptin receptor, rs1137101) and changes in body weight and dietary intake during gestation.

Method: Prospective cohort of pregnant women attending a Municipal Health Center, located

in the district of Tijuca in the city of Rio de Janeiro, in the following periods: 5-13, 20-26 and

30-36 gestational weeks and 30-45 days postpartum. Anthropometric measurements (weight

and height) and plasma concentration of leptin were performed. Food intake data were

obtained through a food frequency questionnaire (FFQ), referring to the pre-gestational and

gestational periods. SNPs were analyzed by real-time polymerase chain reaction (PCR). The

associations between the gene polymorphisms and the dependent variables (pre-gestational

weight, gestational weight gain, postpartum weight retention, plasma leptin concentration and

dietary intake) were investigated by longitudinal mixed effects regression models, multiple

linear regression and Poisson regression models, adjusted for obstetric, socioeconomic,

demographic factors and energy intake. Results: The FTO-rs9939609 (A-allele) gene SNP

was significantly associated with pre-pregnancy overweight and with the highest percentage

of energy from carbohydrates in pre-pregnancy. This SNP was also associated with the

highest percentage of total energy and with the highest percentage of energy from

ultraprocessed foods during pregnancy. The SNP of the MC4R-rs17782313 gene (C-allele)

was positively associated with the highest percentage of energy derived from ultraprocessed

foods throughout pregnancy. SNPs in the genes LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 were

not statistically associated with plasma concentrations of leptin throughout pregnancy and

with food consumption components, however, the LEP-rs7799039 gene was significantly

associated with the increased risk of excessive gestational weight gain. Conclusion: SNPs in

xi

genes related to obesity are associated with changes in body weight and dietary intake of

pregnant women.

Keywords: Pregnant women; Single nucleotide polymorphisms; Pre-gestational weight;

Gestational weight gain; Postpartum weight retention; Food consumption; Cohort study.

xii

SUMÁRIO

APRESENTAÇÃO.................................................................................................... 27

1 INTRODUÇÃO...................................................................................................... 29

2 REFERENCIAL TEÓRICO................................................................................. 31

2.1 Epidemiologia do excesso de peso...................................................................... 31

2.2 Avaliação da composição corporal...................................................................... 33

2.2.1 Avaliação da composição corporal na população geral................................ 33

2.2.2 Avaliação da composição corporal em gestantes......................................... 35

2.3 Principais fatores condicionantes da obesidade.................................................. 36

2.4 Informações básicas sobre genética humana....................................................... 37

2.4.1 Estrutura do material genético humano........................................................ 37

2.4.2 Variação genética......................................................................................... 38

2.4.3 Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs)................................................ 39

2.5 SNPs em genes candidatos à obesidade.............................................................. 40

2.5.1 FTO (gene de massa de gordura e obesidade associadas)............................. 42

2.5.2 MC4R (gene receptor da melanocortina-4)................................................... 43

2.5.3 LEP e LEPR (genes da leptina e do seu receptor)........................................ 43

2.6 Determinantes do ganho de peso materno........................................................... 44

2.6.1 IMC pré-gestacional..................................................................................... 44

2.6.2 Ganho de peso gestacional............................................................................ 45

2.6.3 Retenção de peso pós-parto.......................................................................... 47

2.6.4 Leptina.......................................................................................................... 48

2.6.5 Consumo alimentar....................................................................................... 50

3 JUSTIFICATIVA................................................................................................... 53

4 HIPÓTESES............................................................................................................ 54

xiii

5 OBJETIVOS........................................................................................................... 55

5.1 Objetivo geral...................................................................................................... 55

5.2 Objetivos específicos........................................................................................... 55

6 MÉTODOS.............................................................................................................. 56

6.1 Delineamento do estudo...................................................................................... 56

6.2 Aspectos éticos.................................................................................................... 56

6.3 Critérios de elegibilidade..................................................................................... 56

6.4 Critérios de exclusão........................................................................................... 58

6.5 Captação das participantes do estudo.................................................................. 58

6.6 Capacitação da equipe e controle de qualidade dos dados................................. 58

6.7 Procedimentos para coleta dos dados.................................................................. 59

6.8 Logística da coleta de dados................................................................................ 59

6.9 Variáveis do estudo............................................................................................. 60

6.9.1 Informações demográficas, socioeconômicas obstétricas e de estilo de

vida........................................................................................................................ 61

6.9.2 Medidas antropométricas.............................................................................. 61

6.9.3 Consumo alimentar....................................................................................... 62

6.9.4 Dados bioquímicos e genéticos..................................................................... 64

6.9.4.1 Concentração plasmática de leptina....................................................... 64

6.9.4.2 Polimorfismos genéticos (FTO, MC4R, LEP e LEPR)......................... 64

6.10 Análises estatísticas........................................................................................... 65

6.10.1 Análise descritiva........................................................................................ 67

6.10.2 Análise gráfica............................................................................................ 67

6.10.3 Análise de regressão linear múltipla........................................................... 67

6.10.4 Análise de regressão de Poisson................................................................. 67

6.10.5 Análise de regressão longitudinal de efeitos mistos................................... 68

xiv

7 RESULTADOS....................................................................................................... 72

7.1 Artigo 1. Association of the FTO (rs9939609) and MC4R (rs17782313) gene

polymorphisms with maternal body weight during pregnancy

Associação dos polimorfismos dos genes FTO (rs9939609) e MC4R

(rs17782313) com o peso corporal materno durante a gestação................................ 73

7.2 Artigo 2. Leptin (rs7799039) and leptin receptor (rs1137101) gene

polymorphisms and body weight changes and leptin concentrations throughout

pregnancy

Polimorfismos nos genes da leptina (rs7799039) e do receptor da leptina

(rs1137101) e mudanças do peso corporal e das concentrações de leptina ao longo

da gestação................................................................................................................. 94

7.3 Artigo 3. Associations between obesity candidate gene polymorphisms (FTO,

MC4R, LEP and LEPR) and dietary intake in pregnant women

Associações entre polimorfismos nos genes candidatos à obesidade (FTO, MC4R,

LEP e LEPR) e ingestão dietética em mulheres gestantes......................................... 115

8 CONCLUSÕES....................................................................................................... 136

9 CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................. 138

10 REFERÊNCIAS DA TESE DE DOUTORADO................................................ 140

11 APÊNDICES......................................................................................................... 153

12 ANEXOS............................................................................................................... 174

xv

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Panorama dos estudos populacionais brasileiros sobre prevalências do

excesso de peso e obesidade em indivíduos adultos....................................................... 31

Quadro 2. Panorama dos estudos populacionais brasileiros sobre prevalências do

excesso de peso e obesidade em indivíduos adultos, de acordo com o sexo................... 32

Quadro 3. Recomendações e classificação do ganho de peso gestacional, de acordo

com IMC materno pré-gestacional.................................................................................. 46

Quadro 4. Classificação das variáveis do estudo, de acordo com os artigos da tese...... 60

Quadro 5. Produtos alimentares que representaram o grupo de alimentos

ultraprocessados............................................................................................................... 63

Quadro 6A. Quadro demonstrativo das técnicas de análise estatística do artigo 1........ 69

Quadro 6B. Quadro demonstrativo das técnicas de análise estatística do artigo 2........ 70

Quadro 6C. Quadro demonstrativo das técnicas de análise estatística do artigo 3........ 71

xvi

LISTA DE TABELAS

ARTIGO 1

Table 1. Maternal characteristics according to the FTO (rs9939609) and the MC4R

(rs17782313) gene polymorphisms

Tabela 1. Características maternas de acordo com o polimorfismo nos genes FTO

(rs9939609) e MC4R (rs17782313)............................................................................... 88

Table 2. Associations of adiposity risk alleles (FTO and MC4R) with body weight

changes before, during pregnancy and early postpartum

Tabela 2. Associações dos alelos de risco de adiposidade (FTO e MC4R) com as

mudanças de peso corporal antes e durante a gestação e no pós-parto......................... 89

Table 3. Longitudinal analysis between FTO (rs9939609), MC4R (rs17782313) and

trajectory of body weight during pregnancy

Tabela 3. Análise longitudinal entre FTO (rs9939609), MC4R (rs17782313) e a

trajetória do peso corporal durante a gestação............................................................... 90

Supplementary Table 1. Descriptive characteristics of the study population, by

participation or non-participation in the genetic study

Tabela suplementar 1. Características descritivas da população estudada, por

participação ou não participação no estudo genético..................................................... 91

Supplementary Table 2. Associations of combined effect of FTO (rs9939609) and

MC4R (rs17782313) with body weight changes before, during pregnancy and

immediate postpartum

Tabela suplementar 2. Associações de efeito combinado do FTO (rs9939609) e

MC4R (rs17782313) com mudanças de peso corporal antes e durante a gestação e no

pós-parto......................................................................................................................... 92

xvii

ARTIGO 2

Table 1. Maternal characteristic of the study population stratifying for pre-

pregnancy BMI categories

Tabela 1. Características maternas da população estudada estratificando por

categorias de IMC pré-gestacional................................................................................ 109

Table 2. Genotype and allele frequencies of the LEP-rs7799039 and of the LEPR-

rs1137101 polymorphisms of the study population stratifying for pre-pregnancy BMI

categories

Tabela 2. Frequências dos genótipo e dos alelos dos polimorfismos LEP-rs7799039

e LEPR-rs1137101 da população estudada estratificando por categorias de IMC pré-

gestacional...................................................................................................................... 110

Table 3. Distribution of the pre-pregnancy body weight and BMI, total GWG and

plasma leptin concentrations according to genotypes of the LEP-rs7799039 and of

the LEPR-rs1137101 genes

Tabela 3. Distribuição do peso corporal e do IMC pré-gestacional, GPG total e

concentrações plasmáticas de leptina de acordo com os genótipos dos genes LEP-

rs7799039 e LEPR-rs1137101....................................................................................... 111

Table 4. Associations of the LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 polymorphisms

with pre-pregnancy BMI, GWG and leptin concentrations

Tabela 4. Associações dos polimorfismos LEP-rs7799039 e LEPR-rs1137101 com

IMC pré-gestacional, GPG e concentrações de leptina.................................................. 112

Table 5. Longitudinal analysis between LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 gene

polymorphisms and maternal body weight and leptin concentration throughout

pregnancy

Tabela 5. Análise longitudinal entre os polimorfismos dos genes LEP-rs7799039 e

LEPR-rs1137101 e o peso corporal materno e a concentração de leptina ao longo da

gestação.......................................................................................................................... 113

xviii

ARTIGO 3

Table 1. Maternal descriptive characteristics and dietary intake of the study sample

Tabela 1. Características descritivas maternas e a ingestão dietética da amostra do

estudo............................................................................................................................. 130

Table 2. Distribution of daily dietary intake before and during pregnancy and

variation according to genotypes of the FTO-rs9939609, MC4R-rs17782313, LEP-

rs7799039 and LEPR-rs1137101 genes polymorphisms, considering the dominant

genetic model for all genes

Tabela 2. Distribuição da ingestão dietética diária antes e durante a gestação e a

variação de acordo com os genótipos dos genes FTO-rs9939609, MC4R-rs17782313,

LEP-rs7799039 e LEPR-rs1137101, considerando o modelo genético dominante

para todos os genes......................................................................................................... 131

Table 3. Linear regression models between FTO-rs9939609, MC4R-rs17782313,

LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 gene polymorphisms and daily dietary intake

before and during pregnancy, considering the dominant genetic model for all genes

Tabela 3. Modelos de regressão linear entre os polimorfismos dos genes LEP-

rs9939609, MC4R-rs17782313, LEP-rs7799039 e LEPR-rs1137101 e a ingestão

dietética diária durante os períodos pré-gestacional e gestacional, considerando o

modelo genético dominante para todos os genes........................................................... 133

Table 4. Longitudinal analysis between FTO, MC4R, LEP and LEPR gene

polymorphisms and daily dietary intake, according to genotypes

Tabela 4. Análise longitudinal entre os polimorfismos dos genes FTO, MC4R, LEP

e LEPR e o consumo dietético diário, de acordo com os genótipos.............................. 134

Supplementary Table 1. Genotype distribution and allele frequencies of the FTO-

rs9939609, MC4R-rs17782313, LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 gene

polymorphisms

Tabela suplementar 1. Distribuição dos genótipos e da frequência alélica dos

polimorfismos dos genes FTO-rs9939609, MC4R-rs17782313, LEP-rs7799039 e

LEPR-rs1137101............................................................................................................ 135

xix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura simplificada dos elementos do material genético humano............. 38

Figura 2. Polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP).............................................. 39

Figura 3. Localização cromossômica do gene FTO...................................................... 42

Figura 4. Localização cromossômica do gene MC4R................................................... 43

Figura 5. Localização cromossômica do gene LEP....................................................... 43

Figura 6. Localização cromossômica do gene LEPR.................................................... 44

Figura 7. Coleta de dados em cada ponto de acompanhamento do estudo.................... 57

Figura 8. Fluxograma do tamanho amostral dos artigos apresentados na tese.............. 66

ARTIGO 1

Figure 1. Flowchart illustrating the recruitment and selection of the study

population

Figura 1. Fluxograma do recrutamento e da seleção da população estudada................ 87

Supplementary Figure 1. Trajectory of body weight during pregnancy by FTO

(rs9939609) polymorphism

Figura suplementar 1. Trajetória do peso corporal durante a gestação de acordo

com o polimorfismo FTO (rs9939609)........................................................................... 93

ARTIGO 2

Figure 1. Flowchart illustrating the recruitment and selection of the study

population

Figura 1. Fluxograma do recrutamento e da seleção da amostra estudada.................... 108

ARTIGO 3

Figure 1. Flowchart illustrating the recruitment and selection of the study sample

Figura 1. Fluxograma do recrutamento e da seleção da amostra do estudo.................. 129

xx

LISTA DE APÊNDICES

Apêndice A. Do-files das análises estatísticas do artigo 1....................................... 154

Apêndice B. Do-files das análises estatísticas do artigo 2........................................ 159

Apêndice C. Do-files das análises estatísticas do artigo 3........................................ 166

xxi

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1. Aprovação do Comitê de Ética....................................................................... 175

Anexo 2. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido................................................ 176

Anexo 3. Protocolo de extração do DNA....................................................................... 178

Anexo 4. Publicação do Artigo 1 no periódico Nutrition............................................... 179

xxii

LISTA DE ANEXOS ONLINE

Anexo online 1. Questionário de Frequência Alimentar (QFA) do primeiro trimestre

gestacional...................................................................................................................... 182

Anexo online 2. Questionário Geral-1do primeiro trimestre gestacional...................... 182

Anexo online 3. Questionário Geral-2 do segundo trimestre gestacional...................... 182

Anexo online 4. Questionário Geral-3 do terceiro trimestre gestacional....................... 182

Anexo online 5. Questionário de Frequência Alimentar (QFA) do terceiro trimestre

gestacional...................................................................................................................... 182

Anexo online 6. Questionário Geral-4 do pós-parto...................................................... 182

xxiii

LISTA DE ABREVIATURAS

ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas

ADP/BodPod Pletismografia por deslocamento do ar

AIC Akaike Information Criterion

ANOVA Análise de variância

BIA Bioimpedância elétrica

BIC Bayesian Information Criterion

BMI Body Mass Index

CEP Comitê de Ética em Pesquisa

CFM Conselho Federal de Medicina

CHO Carboidratos

CI Confidence Intervals

CMS Centro Municipal de Saúde

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

CNS Conselho Nacional de Saúde

CONEP Comissão Nacional de Ética em Pesquisa

DAFEE Laboratório de Desenvolvimento de Alimentos para Fins Especiais e

Educacionais

DC Dobras Cutâneas

DCNT Doenças Crônicas não Transmissíveis

DEXA Densitometria com emissão de raio X de dupla energia

DUM Data da Última Menstruação

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

FAPERJ Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro

FAO Organização para a Alimentação e Agricultura das Nações Unidas

FFQ Food Frequency Questionnaire

FTO Massa de gordura e obesidade associadas - Fat mass and obesity associated

GHO Global Health Observatory

GPG Ganho de Peso Gestacional

GW Gestational Weeks

GWG Gestational Weight Gain

HB Heitor Beltrão

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

xxiv

IC 95% Intervalo de Confiança de 95%

IMC Índice de Massa Corporal

INJC Instituto de Nutrição Josué de Castro

IOM Institute of Medicine

IPUB Instituto de Psiquiatria da Universidade Federal do Rio de Janeiro

IQR Inter Quartile Range

LEP Leptina

LEPR Receptor da Leptina

LIP Lipídeos

LME Longitudinal Mixed Effects

LTPA Leisure-Time Physical Activity

MC4R Receptor da Melanocortina-4 - Melanocortin-4 receptor

NCBI National Center for Biotechnology

NCDs Non-Communicable Chronic Diseases

OMS Organização Mundial da Saúde

PAFL Prática de Atividade Física de Lazer

PC Perímetro da Cintura

PET Tomografia por Emissão de Pósitrons

POF Pesquisa de Orçamentos Familiares

PRT Proteínas

QFA Questionário de Frequência Alimentar

RM Ressonância Magnética

RR Relative Risks

SD Standard Deviations

SG Semanas de Gestação

SMS Secretaria Municipal de Saúde

STATA Stata Data Analysis and Statistical Software

TACO Tabela Brasileira de Composição de Alimentos

TC Tomografia Computadorizada

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

UERJ Universidade do Estado do Rio de Janeiro

UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro

USDA United States Department of Agriculture

xxv

DENOMINAÇÕES E CONCEITOS BÁSICOS DE GENÉTICA

Alelo Qualquer uma das formas alternativas de um gene especifico que esta

localizado no mesmo locus em um cromossomo homólogo, sendo

responsáveis por variações em uma característica geneticamente

hereditária.

Cromossomo Estrutura constituída por DNA. É a forma de armazenamento do DNA.

DNA Corresponde ao material hereditário (ácido desoxirribonucleico) que

contém dentro de sua estrutura a informação genética necessária para

especificar todos os aspectos da embriogênese, desenvolvimento,

crescimento, metabolismo e reprodução.

Expressividade Corresponde ao grau em que um genótipo particular é expresso no

fenótipo.

Fenótipo São as características observáveis de um indivíduo, por exemplo cor

dos olhos ou presença de uma doença particular.

Gene Corresponde a uma região de DNA cromossômico ou unidade de

informação genética que contém instruções específicas para a síntese

de proteínas.

Gene dominante São genes que se manifestam tanto em homozigose, quanto em

heterozigose.

Gene recessivo São genes que só se manifestam quando estão em homozigose.

Genoma Conjunto completo do DNA de um organismo, incluindo todos os seus

genes.

GWAS Estudos de associação ampla do genoma nos quais SNPs são testados

em amostras individuais de DNA para observar suas associações com

doenças.

Genotipagem Processo de determinação do genótipo ou conteúdo genômico

utilizando o DNA, mediante procedimento de laboratório.

xxvi

Genótipo Constituição genética do indivíduo.

Herança simples ou

mendeliana

Corresponde à passagem de genes de uma geração para outra.

Herança

monogênica

Refere-se ao tipo de herança em que uma característica é determinada

pela expressão de um único gene ou alelo, não por vários genes como

na herança poligênica.

Hereditariedade Transmissão de características dos pais para seus filhos por meio do

material genético

Heterozigoto Significa que os alelos presentes em um lócus genético são diferentes.

Exemplo: Aa.

Homozigoto Significa que os alelos presentes em um lócus genético são idênticos.

Exemplo: AA ou aa.

Lócus Posição (local) ocupado pelo gene no cromossomo. “Loci” é o plural

de lócus.

Penetrância A proporção de indivíduos com um genótipo específico que manifesta

esse genótipo ao nível do fenótipo.

Seleção natural Resultado das interações entre variações genéticas em uma população

e o ambiente.

SNP Corresponde alteração de uma única base na sequência do DNA

(Polimorfismo de nucleotídeo único).

Variação genética Alteração genética dentro de uma população.

APRESENTAÇÃO

27

APRESENTAÇÃO

Esta tese de doutorado apresenta resultados de um estudo realizado com mulheres

gestantes provenientes do projeto intitulado ‘Saúde mental e estado nutricional na gestação e

no pós-parto: estudo prospectivo com ensaio clínico randomizado aninhado’. Este projeto foi

desenvolvido no Centro Municipal de Saúde Heitor Beltrão (CMS HB), da Secretaria

Municipal de Saúde (SMS) do Rio de Janeiro. O recrutamento das mulheres ocorreu durante o

período de novembro de 2009 a outubro de 2011, sendo a coleta de dados finalizada em junho

de 2012. O estudo foi realizado por pesquisadores do Observatório de Epidemiologia

Nutricional do Instituto de Nutrição Josué de Castro (INJC) e contou com a parceria do

Instituto de Psiquiatria da Universidade Federal do Rio de Janeiro (IPUB - UFRJ). A pesquisa

foi financiada pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e

pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

A presente tese intitulada ‘Associação entre os polimorfismos nos genes relacionados

à obesidade e às mudanças de peso corporal e consumo alimentar de gestantes’ foi

desenvolvida com a finalidade de investigar se os polimorfismos de genes relacionados à

obesidade estão associados com mudanças no peso corporal e no consumo alimentar de

gestantes. Este documento está estruturado nas seguintes seções: introdução, na qual é

realizada abordagem geral sobre a temática que envolve esta tese; referencial teórico, no qual

é traçada uma estruturação conceitual sobre os principais pilares da tese para o entendimento

do estudo; justificativa; hipóteses; objetivos; métodos; resultados; conclusões, considerações

finais; referências bibliográficas, apêndices e anexos.

A seção de resultados/discussão é composta por três manuscritos científicos. O

primeiro artigo foi publicado na revista Nutrition e intitulado ‘Association of the FTO

(rs9939609) and MC4R (rs17782313) gene polymorphisms with maternal body weight during

pregnancy’. O segundo artigo foi aceito para publicação na revista Nutrition Research e

intitula-se ‘Leptin (rs7799039) and leptin receptor (rs1137101) gene polymorphisms and

body weight changes and leptin concentrations throughout pregnancy’. O terceiro manuscrito

foi submetido à British Journal of Nutrition para publicação e intitula-se ‘Associations

between obesity candidate gene polymorphisms (FTO, MC4R, LEP and LEPR) and dietary

intake in pregnant women’.

A seção considerações finais é fundamentada nos principais resultados dos três

manuscritos realizados. As referências da tese obedecem a norma NB-66 da Associação

APRESENTAÇÃO

28

Brasileira de Normas Técnicas (ABNT), enquanto as referências dos artigos atendem aos

requisitos técnicos das revistas.

INTRODUÇÃO

29

1 INTRODUÇÃO

A prevalência do excesso de peso tem aumentado nas últimas décadas de forma

constante em todos os grupos etários e sociais, configurando-se na atualidade como um dos

problemas prioritários de saúde pública (WHO, 2014). Consequentemente, a proporção de

mulheres com excesso de peso em idade reprodutiva tem aumentado em diversas partes do

mundo (Ng et al., 2014; Gilmore, Klempel-Donchenko e Redman, 2015), inclusive no Brasil

(IBGE, 2010, 2015; Brasil, 2017). A obesidade está associada ao risco concomitante ou

aumentado de quase todas as doenças crônicas não transmissíveis (DCNT), incluindo diabetes

tipo 2, alguns tipos de câncer, dislipidemia, doenças cardiovasculares e osteoartrite (Hruby e

Hu, 2015). A obesidade também desempenha papel significativo nos transtornos reprodutivos

em mulheres como distúrbios menstruais, infertilidade, dificuldades na reprodução assistida e

aborto espontâneo (Dağ e Dilbaz, 2015)

O período gestacional é caracterizado por adaptações fisiológicas para suprir as

demandas da gestação e da lactação, e o estado nutricional pré-gestacional materno constitui

um dos principais determinantes para o ganho de peso durante este período (Institute of

Medicine, 2009). O ganho de peso gestacional (GPG) excessivo está associado a mudanças de

peso no pós-parto, ou seja, quanto maior o ganho de peso neste período, maior será a retenção

de peso no pós-parto (Siega-Riz et al., 2009). A compreensão dessas associações é complexa,

pois o excesso de peso adquirido em uma gestação pode ter um efeito cumulativo em longo

prazo sobre o ganho de peso em gestações subsequentes (Gilmore, Klempel-Donchenko e

Redman, 2015), ampliando a trajetória de ganho de peso e contribuindo para o

desenvolvimento ou agravamento da epidemia da obesidade em mulheres (Nehring et al.,

2011; Mannan, Doi e Mamun, 2013; Rong et al., 2015).

A obesidade materna é um fator de risco bem estabelecido para resultados obstétricos

e neonatais adversos, incluindo aumento do risco de diabetes gestacional, parto por cesariana,

pré-eclâmpsia, complicações no nascimento e macrossomia (Ovesen, Rasmussen e Kesmodel,

2011; Shin e Song, 2015; Marchi et al., 2015). Além disso, evidências sugerem que a

obesidade materna e o GPG excessivo também possuem influência adversa em longo prazo

sobre a saúde do filho, por meio do processo de programação metabólica (Cnattingius et al.,

2012; Gomes et al., 2015; Lawrence et al., 2014). Tais constatações traduzem-se em alerta

crescente de impacto social e econômico para o sistema de saúde pública (Morgan et al.,

INTRODUÇÃO

30

2014), o que salienta a relevância de maiores investigações sobre as possíveis causas do

excesso de peso materno.

A teoria convencional sustenta que a obesidade é o resultado de um desequilíbrio de

longo prazo entre a ingestão e o gasto energético, que favorece o balanço energético positivo

(Agurs-Collins e Bouchard, 2008). Tradicionalmente, esse desequilíbrio ocorre devido à

ingestão de alimentos e bebidas de alta densidade energética, geralmente de baixo custo,

combinado com estilo de vida sedentário (Hill, Wyatt e Peters, 2012; Hall et al., 2012). No

entanto, a fisiopatologia da obesidade é complexa e as causas do balanço de energia positivo

envolvem uma interação complexa entre fatores ambientais, socioeconômicos e genéticos,

tornando a gestão e a prevenção da obesidade desafiadoras (Choquet e Meyre, 2011b; Hurt et

al., 2011; Hruby e Hu, 2015).

Os estudos genéticos têm contribuído significativamente para a compreensão da

fisiologia da regulação da massa corporal, por meio de modelos animais e da investigação dos

fatores genéticos relacionados às formas raras e comuns de obesidade humana. Desde o

mapeamento do genoma humano (1990 – 2003), vários polimorfismos de nucleotídeo único

(SNPs) de genes com potencial de associação com o excesso de peso têm sido identificados, a

exemplo do FTO (massa de gordura e obesidade associadas), MC4R (receptor da

melanocortina-4), LEP (leptina) e LEPR (receptor da leptina). Estes genes têm sido

frequentemente estudados em decorrência de estarem envolvidos em vias centrais ou

periféricas de controle da ingestão e gasto energético (Sonestedt et al., 2009; Stutzmann et al.,

2009; Boumaiza et al., 2012). Nesse sentido, é concebível que estas variantes genéticas

também possam estar associadas ao peso pré-gestacional e as mudanças de peso corporal

materno durante a gestação e no pós-parto, bem como aos componentes da ingestão alimentar.

Contudo, ainda são escassos os estudos que abordam os efeitos da genética sobre esses

desfechos.

REFERENCIAL TEÓRICO

31

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 EPIDEMIOLOGIA DO EXCESSO DE PESO

A natureza global da epidemia de obesidade foi formalmente reconhecida pela

Organização Mundial de Saúde (OMS) em 1997 (WHO, 2000) e, desde então, sua prevalência

ascendente vem sendo observada em todo mundo (Ng et al., 2014). Um dos aspectos mais

preocupantes da epidemia de obesidade é que a prevalência também tem aumentado

rapidamente entre crianças e adolescentes (WHO, 2014; Lobstein et al., 2015). Em 2014, a

OMS estimou que mais de 1,9 bilhões de pessoas com idade ≥ 18 anos apresentavam índice

de massa corporal [IMC = peso (kg)/estatura (m2)] ≥ 25,0 kg/m2 (excesso de peso),

correspondendo a 39% da população adulta no mundo, destes 13% apresentavam IMC ≥ 30,0

kg/m2 (obesidade) (WHO, 2016). A região das Américas foi a que apresentou a maior

prevalência de excesso de peso (61%, destes 27% de obesidade) e a região sudeste da Ásia a

mais baixa (22%, destes 5% de obesidade) (WHO, 2014). Resultados de estudos

populacionais no Brasil confirmam as altas prevalências de excesso de peso e obesidade na

população adulta (Quadro 1).

Quadro 1. Panorama dos estudos populacionais brasileiros sobre prevalências do excesso de

peso e obesidade em indivíduos adultos.

Pesquisas Ano de

realização

Faixa etária

(anos) Excesso de peso

(% IMC ≥25,0 kg/m2)

Obesidade (% IMC ≥30,0 kg/m2)

POF (IBGE, 2010) 2008-2009 ≥ 20 49,0 14,8

PNS (IBGE, 2015) 2013 ≥ 18 56,9 20,8

VIGITEL (Brasil, 2017) 2016 ≥ 18 53,8 18,9

Abreviaturas:

POF = Pesquisa de Orçamentos Familiares

PNS = Pesquisa Nacional de Saúde

VIGITEL = Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico

As mulheres tendem a apresentar prevalência de obesidade superior à observada nos

homens. De acordo com as estimativas da OMS em 2014, 40% das mulheres e 38% dos

homens apresentavam excesso de peso, destes 15% das mulheres e 11% dos homens eram

obesos (WHO, 2014). De acordo com dados epidemiológicos de 186 países, o IMC médio em

homens aumentou de 21,7 kg/m² em 1975 para 24,2 kg/m² em 2014, e em mulheres de 22,1

kg/m² em 1975 para 24,4 kg/m² em 2014. A prevalência de obesidade aumentou de 3,2% em


32

1975 para 10,8% em 2014 nos homens e de 6,4% a 14,9% em mulheres (NCD Risk Factor

Collaboration, 2016).

Dados de 2014 do Global Health Observatory (GHO) para o Brasil sugerem que as

prevalências de excesso de peso e obesidade para homens e mulheres (≥ 18 anos) eram de

55,2% e 53,0%; 17,1% e 24,0%, respectivamente (GHO-WHO, 2014). Dados de pesquisas

populacionais realizadas no Brasil também demonstram esta tendência (Quadro 2). Dados do

Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) indicam que nos 34 anos decorridos de

1974-1975 a 2008-2009, a prevalência de excesso de peso em adultos aumenta em quase três

vezes no sexo masculino (de 18,5% para 50,1%) e em quase duas vezes no sexo feminino (de

28,7% para 48,0%). No mesmo período, a prevalência de obesidade aumenta em mais de

quatro vezes para homens (de 2,8% para 12,5%) e em mais de duas vezes para mulheres (de

8,0% para 16,9%) (IBGE, 2010).

Quadro 2. Panorama dos estudos populacionais brasileiros sobre prevalências do excesso de

peso e obesidade em indivíduos adultos, de acordo com o sexo.

Pesquisas Ano de

realização

Faixa etária

(anos)

Excesso de peso (% IMC ≥25,0 kg/m2)

Obesidade (% IMC ≥30,0 kg/m2)

Homens Mulheres Homens Mulheres

PNDS (Brasil, 2009) 2006 15-49 - 43,1 - 16,1

POF (IBGE, 2010) 2008-2009 ≥ 20 50,1 48,0 12,5 16,9

PNS (IBGE, 2015) 2013 ≥ 18 55,6 58,2 16,8 24,4

VIGITEL (Brasil, 2017) 2016 ≥ 18 57,7 50,5 18,1 19,6

Abreviaturas:

PNDS = Pesquisa Nacional de Demografia e Saúde da Criança e da Mulher

POF = Pesquisa de Orçamentos Familiares

PNS = Pesquisa Nacional de Saúde

VIGITEL = Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico

Foi observado na maioria dos países desenvolvidos que a taxa de aumento do IMC

desde 2000 foi mais lenta do que nas décadas anteriores (Ng et al., 2014). No entanto, como a

taxa de aumento do IMC foi acelerada em países não desenvolvidos, o aumento global do

IMC não diminuiu (NCD Risk Factor Collaboration, 2016). Por outro lado, Hurt et al. (2011)

consideram que a população atingiu um ponto de saturação e que a parcela ainda não afetada

pode ser considerada como não suscetível à obesidade, dando falsa impressão da estabilidade

da prevalência de obesidade na população.

Em decorrência da relevância econômica e dos problemas de saúde pública derivados

do aumento do IMC na população, em 2013, a OMS incluiu a temática adiposidade entre os


33

objetivos do Plano Global de enfrentamento das DCNT até o ano de 2025. A meta em relação

à obesidade é conter o aumento da prevalência para corresponder às taxas de 2010 (WHO,

2014). Contudo, esta meta não será alcançada caso as tendências de aumento da prevalência

do excesso de peso observadas pós-2000 sejam mantidas (NCD Risk Factor Collaboration,

2016).

2.2 AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO CORPORAL

2.2.1 Avaliação da composição corporal na população geral

A obesidade pode ser definida de uma maneira simplificada como o acúmulo

excessivo de gordura corporal, sob a forma de tecido adiposo, sendo conseqüência de balanço

energético positivo, capaz de acarretar prejuízos à saúde dos indivíduos (WHO, 2000). A

obesidade possui etiologia complexa e multifatorial, envolvendo a interação de fatores sociais,

comportamentais, culturais, fisiológicos, metabólicos e genéticos (Agurs-Collins e Bouchard,

2008; Hurt et al., 2011; Bray et al., 2016). Mais recentemente, a alteração induzida por

epigenética na expressão genética emergiu como uma forma alternativa na qual os

componentes ambientais podem influenciar o fenótipo da obesidade (Fleisch, Wright e

Baccarelli, 2012).

Do ponto de vista da composição corporal, a obesidade é caracterizada pela elevada

quantidade de massa gorda (Caballero, 2007; Flegal et al., 2009; WHO, 2014). Por

conseguinte, medições acuradas da adiposidade são importantes para permitir diagnóstico e

tratamento apropriados da obesidade (Madden e Smith, 2014).

As técnicas in vivo não medem a composição corporal diretamente, apenas predizem

medidas das propriedades do corpo (Wells e Fewtrell, 2006). Os métodos indiretos são

baseados em suposições quanto à densidade de tecidos corporais, concentrações de água e

eletrólitos e/ou inter-relações biológicas entre os componentes do corpo e os tecidos corporais

(Wells e Fewtrell, 2006; Duren et al., 2008), não existindo um método universalmente

recomendado para a avaliação da composição corporal. Estes métodos variam de acordo com

suas bases físicas, custo, acurácia e praticidade, e apresentam vantagens e desvantagens

(Duren et al., 2008).

Os métodos indiretos baseados em imagem, particularmente tomografia

computadorizada (TC), ressonância magnética (RM) e densitometria com emissão de raio X

de dupla energia (DEXA), são considerados tecnologias de referência padrão-ouro para a


34

análise da composição corporal (Prado e Heymsfield, 2014). Porém, constituem tecnologias

de alto custo e exigem pessoal qualificado para sua utilização, inviabilizando uso em estudos

populacionais e ou em atendimentos coletivos em redes de saúde pública (Cornier et al.,

2011; Seabolt, Welch e Silver, 2015).

O método duplamente indireto da bioimpedância elétrica (BIA) é considerado

acessível financeiramente, comparado aos métodos de imagem (Kyle et al., 2004a; Hurst et

al., 2015). Contudo, a utilização deste método pode resultar em estimativas imprecisas nas

situações em que o balanço hidroeletrolítico está alterado e em mulheres obesas (Bosaeus et

al., 2014).

O método antropométrico, que também corresponde a um método duplamente indireto

de avaliação da composição corporal, tem sido o mais utilizado para fins epidemiológicos e

prática clínica por ser considerado mais prático e menos oneroso (Lee et al., 2014; Bray et al.,

2016). Entre as diversas técnicas antropométricas para estimar a gordura corporal, destacam-

se as medidas de espessura de dobras cutâneas (DC), perímetro da cintura (PC) e medidas de

dimensão corporal, como peso e estatura para o cálculo do IMC.

O IMC é o parâmetro mais utilizado para estimar a composição corporal por ser

considerado não invasivo, relativamente simples e de baixo custo (Romero-Corral et al.,

2008; Okorodudu et al., 2010; Gómez-Ambrosi et al., 2012; Arroyo-Johnson e Mincey,

2016). Este índice é classificado pela OMS em seis categorias para indivíduos adultos, com

base nas tendências gerais da relação entre o IMC e DCNT ou taxas de mortalidade (WHO,

2000): <18,5 kg/m2 = baixo peso; 18,5 – 24,9 kg/m2 = peso normal; 25,0 – 29,9 kg/m2 =

sobrepeso; 30,0 – 34,9 kg/m2 = obesidade grau I; 35,0 – 39,9 kg/m2 = obesidade grau II e ≥ 40

kg/m2 = obesidade grau III.

Geralmente as pessoas com pesos corporais elevados apresentam maiores quantidades

de gordura corporal (Duren et al., 2008). Contudo, o IMC não é capaz de atender aos fatores

de variação na composição corporal (idade, sexo e etnia) (Hunma et al., 2016; Hung et al.,

2017) e de fornecer informações sobre quantidade e distribuição da gordura corporal

(Romero-Corral et al., 2008; Flegal et al., 2009; Okorodudu et al., 2010; Lee et al., 2014;

Ablove et al., 2015). Neste sentido, a inclusão de outras medidas antropométricas tais como o

PC e o espessamento de DC, em conjunto com o IMC, seria desejável e adequado para

identificar os indivíduos com risco aumentado de desenvolver obesidade e doenças associadas

(Bhurosy e Jeewon, 2013; Lee et al., 2014).


35

As consequências para a saúde associadas à obesidade dependem não só da quantidade

de gordura em excesso, mas também da sua distribuição corporal que pode variar

consideravelmente, inclusive entre indivíduos obesos (Klein et al., 2007). A adiposidade

visceral (intra-abdominal) é considerada a medida mais crítica para a avaliação do risco à

saúde, independente da gordura corporal total (Caballero, 2007; Lee et al., 2014).

2.2.2 Avaliação da composição corporal em gestantes

A massa corporal na maioria dos indivíduos é mantido relativamente estável por

interações complexas entre os reguladores de curto e longo prazo do balanço energético,

mesmo considerando as flutuações diárias na ingestão e no gasto de energia (Augustine,

Ladyman e Grattan, 2008). Em contrapartida, a gestação é caracterizada por um período

heterogêneo no ciclo de vida das mulheres, na qual adaptações fisiológicas, metabólicas e

nutricionais são fundamentais para a saúde materna, o desenvolvimento fetal, o parto e a

lactação (Augustine, Ladyman e Grattan, 2008; Yogev e Catalano, 2009), resultando em

mudanças na composição corporal materna (Catalano e deMouzon, 2015). Além disso, o

aumento no tecido adiposo materno é também uma importante resposta adaptativa à gestação

(Straughen, Trudeau e Misra, 2013).

A utilização de métodos baseados em imagens é limitada em gestantes em decorrência

da exposição a radiações ionizantes (TC e DEXA) ou dispendiosos para serem aplicados em

estudos populacionais (Straughen, Trudeau e Misra, 2013; Van der Wijden et al., 2013;

Marshall et al., 2016). O método da pletismografia por deslocamento do ar (ADP/BodPod),

fundamentado na densidade corporal para calcular a proporção da gordura corporal, tem sido

limitado devido à incapacidade de avaliar a densidade corporal das gestantes independentes

do feto e dos tecidos de suporte, além de sofrer influência da densidade e da composição do

tecido livre de gordura ao longo da gestação (Widen e Gallagher, 2014). A inviabilidade de

separação dos tecidos materno/fetal e a hidratação do tecido livre de gordura também

interferem na validade e na interpretação dos resultados da composição corporal obtidos pelo

método da BIA (Kyle et al., 2004b; Straughen, Trudeau e Misra, 2013; Widen e Gallagher,

2014).

O método antropométrico é o mais utilizado para estimar a composição corporal

materna durante a gestação. Medidas de DC e do perímetro do braço têm sido utilizadas para

esta finalidade (Van der Wijden et al., 2013; Dodd et al., 2015). Contudo, estimativas de

alterações na gordura corporal durante a gestação derivadas de DC são propensas a erro de


36

medição, especialmente devido à dificuldade de obter medidas válidas e confiáveis em

decorrência da presença de edemas e da variabilidade do grau de hidratação (Widen e

Gallagher, 2014). O IMC se correlaciona significativamente com o percentual de gordura

corporal no início da gestação, porém, esta correlação se enfraquece no final da gestação em

consequência da contribuição do teor de água corporal total no GPG (Sewell et al., 2007).

Portanto, o IMC pode ser considerado um indicador limitado da variação de tecido adiposo

materno ao longo da gestação (Dodd et al., 2015; Marshall et al., 2016).

O GPG excessivo tem sido associado ao maior acúmulo de tecido adiposo materno

(Berggren et al., 2016). Contudo, o GPG é uma medida complexa, que reflete a combinação

de acúmulo de gordura materna, a expansão do volume plasmático relacionado à gestação, o

edema periférico, a massa placentária, a massa fetal e o volume de líquido amniótico (Institute

of Medicine, 2009; Widen e Gallagher, 2014). Pode, portanto, também não ser considerado o

melhor indicador que reflete o diagnóstico da adiposidade materna (Van der Wijden et al.,

2013).

De forma geral, a obtenção de estimativas da composição corporal materna durante a

gestação ainda são propensas a erros (Widen e Gallagher, 2014). Atualmente, o Ministério

da Saúde Brasileiro adota recomendações de ganho total de peso, segundo estado nutricional

inicial da gestante (Institute of Medicine, 2009), e classifica o estado nutricional de acordo

com categorias de IMC por semana gestacional (Atalah Samur et al., 1997).

2.3 PRINCIPAIS FATORES CONDICIONANTES DA OBESIDADE

A obesidade é uma das DCNT mais relevantes na saúde pública devido a sua

associação com doenças cardiovasculares (Bastien et al., 2014), diabetes (Abdullah et al.,

2010) e câncer (Renehan et al., 2008), bem como pela sua associação com altas taxas de

mortalidade por todas as causas (Flegal et al., 2013).

Além de promover os agravos à saúde, a obesidade também impacta em

consequências econômicas relativas ao custo financeiro destinado aos cuidados com a saúde

(consultas, internações, medicamentos, etc.) e a perda de produtividade (Finkelstein et al.,

2010; Malik, Willett e Hu, 2013). Somam-se, ainda, prejuízos psicossociais relacionados à

questão da discriminação a indivíduos sob essa condição patológica (Preiss, Brennan e

Clarke, 2013).


37

O fenômeno da globalização tem contribuído sobremaneira para as modificações no

estilo de vida da população, com impacto sobre a incidência da obesidade e de suas

comorbidades associadas em vários países (Caballero, 2007; Malik, Willett e Hu, 2013). A

prevalência da obesidade nos países em desenvolvimento estava associada inicialmente ao

maior status socioeconômico, porém, com a acessibilidade aos alimentos densos em energia,

esta epidemia se espalhou para os grupos socioeconômicos menos privilegiados (Canoy e

Buchan, 2007). O consumo frequente de alimentos e bebidas com grande densidade

energética - frequentemente servidos em grandes porções - e o estilo de vida sedentário

favorecem o balanço energético positivo, contribuindo para o acúmulo de tecido corporal

gorduroso (Malik, Willett e Hu, 2013; Popkin e Hawkes, 2016). Todavia, observa-se grande

variabilidade na suscetibilidade ao desenvolvimento da obesidade, detectada entre os

indivíduos expostos aos mesmos fatores de risco ambiental, o que sugere que as diferenças

genéticas também atuam neste processo de expressividade do fenótipo da obesidade

(Bouchard, 2007; Herrera, Keildson e Lindgren, 2011; Hurt et al., 2011).

A multicausalidade da obesidade implica que nenhum dos fatores isolados podem,

decisivamente, explicar o aumento da incidência de obesidade (Hurt et al., 2011). Porém,

levando em consideração que o aumento da prevalência da obesidade ocorreu em um curto

período de tempo, os fatores ambientais e comportamentais do estilo de vida provavelmente

contribuem significativamente para a epidemia global desta doença (Agurs-Collins e

Bouchard, 2008).

As intervenções para o tratamento da obesidade variam de modificações no estilo de

vida, que envolvem a educação alimentar e o aumento do gasto energético por meio da prática

de atividade física, a opções de farmacoterapia e intervenções cirúrgicas (Wyatt, 2013).

Provavelmente, o conhecimento das bases genéticas em conjunto com as influências

ambientais que levam à obesidade poderá permitir identificar populações vulneráveis e

intervir de modo a controlar esta epidemia em gerações futuras.

2.4 INFORMAÇÕES BÁSICAS SOBRE GENÉTICA HUMANA

2.4.1 Estrutura do material genético humano

O material genético em humanos está presente em cada célula do corpo, na sua

maioria no núcleo de células, sendo constituído por 46 cromossomos dispostos em 23 pares.

Desses 23 pares, 22 são iguais nos homens e mulheres e são chamados autossômicos,


38

numerados do maior ao menor. O par remanescente compreende os cromossomos sexuais:

dois cromossomos X em mulheres e um cromossomo X e outro Y em homens (Nussbaum,

McInnes e Willard, 2015).

Cada cromossomo é composto de ácido desoxirribonucleico (DNA) o qual tem uma

estrutura linear e é essencialmente uma sequência de pares de bases complementares, os quais

estão ligados entre si por limites químicos. As quatro bases de DNA são as moléculas:

Adenina, Guanina, Citosina e Timina, abreviadas por A, G, C e T, respectivamente. Cada uma

dessas bases pode formar um par complementar com uma e somente uma outra base. Assim,

podem ocorrer quatro diferentes pares de bases complementares: A-T, G-C, T-A e C-G (a

ordem das bases não importa) (Nussbaum, McInnes e Willard, 2015). Uma representação

simplificada da estrutura do material genético é mostrada na Figura 1.

Figura 1. Estrutura simplificada dos elementos do material genético humano. Fonte: figura adaptada do site www.cincinnatichildrens.org

2.4.2 Variação genética

A sequência genética no mesmo cromossomo é aproximadamente 99,5% idêntica para

todos os indivíduos da população (Shaw, 2013). No entanto, é precisamente a pequena fração

de sequência de DNA diferente entre os indivíduos que é responsável pela variabilidade

geneticamente determinada entre os seres humanos (Nussbaum, McInnes e Willard, 2015).

A variação genética ocorre em diferentes escalas e refere-se tanto à diferença entre as

populações de uma espécie quanto à diferença entre os indivíduos de uma população,

tornando cada indivíduo único em suas características fenotípicas (Kassem, Girolami e

Sanoudou, 2012). Esta variação depende, entre outros fatores, da natureza e da quantidade de

mutações gênicas de uma população e da frequência dos alelos que influenciam uma

característica em uma determinada população(Klaauw, van der e Farooqi, 2015).


39

2.4.3 Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs)

Os SNPs (do inglês single nucleotide polymorphisms) correspondem a alteração de

uma única base na sequência do DNA (A,C,G, ou T) em um determinado local cromossômico

(lócus) (Karki et al., 2015; Nussbaum, McInnes e Willard, 2015) (Figura 2). Os SNPs

representam 90% dos polimorfismos genéticos (Shawky, 2014). Os SNPs são o tipo mais

comum de variação genética em seres humanos e ocorrem em média uma vez em cada 100-

300 pares de bases (Goldstein e Cavalleri, 2005; Ke, Taylor e Cardon, 2008).

Figura 2. Polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP). Neste exemplo há uma substituição de um T (Timina) por um G (Guanina) que causa a mudança de um A

(Adenina) por um C (Citosina) na fita complementar do DNA

Fonte: Figura adaptada de Nussbaum et al. (2015) (Nussbaum, McInnes e Willard, 2015).

Os SNPs possuem tipicamente dois alelos. A frequência de um SNP é dada em termos

da frequência do alelo menor (frequência do alelo menos comum). Por exemplo, um SNP

com uma frequência do alelo menor (T) de 0,40 implica que 40% de uma população tem o

alelo T versus o alelo maior (o alelo principal), que se encontra em 60% da população (Bush

e Moore, 2012). Neste contexto, a denominação de SNP frequentemente se restringe a aqueles

polimorfismos em que a frequência do alelo menor aparece em ao menos 1% da população

(Liao e Lee, 2010; Shaw, 2013).

Para efeitos de estudos genéticos, os SNPs são tipicamente utilizados como

marcadores de uma região genômica, com a grande maioria deles apresentando impacto

mínimo em sistemas biológicos (Bush e Moore, 2012). Em geral, os SNPs ocorrem com

menos frequência nas regiões de codificação (denominadas de éxons) do genoma do que nas

regiões não codificantes (denominadas de íntrons), logo SNP não ocorre aleatoriamente no

gene (Kim e Misra, 2007; Liao e Lee, 2010; Shaw, 2013). Os SNPs em regiões não


40

codificantes, embora não alterem proteínas codificadas, servem como importantes marcadores

genéticos ou físicos para estudos de genômica comparativa ou evolutiva, pois afetam a

expressão de genes que podem causar doenças (Shawky, 2014). Os SNPs, quando presentes

nas regiões de codificação, podem causar alterações na estrutura das proteínas e, portanto,

promover o desenvolvimento de doença (Kim e Misra, 2007).

Ao longo dos últimos anos, milhões de polimorfismos em genes humanos foram

validados no SNP database (dbSNP – banco de dados incorporado ao National Center for

Biotechnology - NCBI). Atualmente, o banco conta com 325.658.303 SNPs descritos para o

Homo sapiens, sendo 135.967.291 validados (dbSNP build 150 – fevereiro/2017). Cada SNP

depositado no dbSNP tem um registro particular indicado como #rs (refSNP) seguido de um

número definido pela ordem de depósito no banco. Estes avanços na descoberta de um

número expressivo de SNPs contribuíram para considerável aumento do número de

publicações científicas, na tentativa de associar estes polimorfismos a doenças ou à

suscetibilidade a estas (Ke, Taylor e Cardon, 2008; Albuquerque, Manco e Nóbrega, 2016).

Se um SNP aumenta a suscetibilidade a uma doença específica de interesse, devemos

notar que sua presença é mais comum entre os indivíduos afetados por esta condição do que

entre os indivíduos não afetados. Assim, por meio da genotipagem de grande número de

indivíduos, as ferramentas de genética populacional são capazes de destacar a base genética

de doenças poligênicas como a obesidade comum (Kim e Misra, 2007; Albuquerque, Manco e

Nóbrega, 2016). Porém, as bases genéticas das doenças geralmente são complexas pela

interação entre vários genes e o ambiente.

2.5 SNPs EM GENES CANDIDATOS À OBESIDADE

Os genes com função biológica conhecida que regulam direta ou indiretamente os

processos de desenvolvimento das características investigadas são conhecidos como genes

candidatos (Farooqi e O’Rahilly, 2007; Zhu e Zhao, 2007).

O objetivo central da genética humana é identificar fatores de risco genéticos para

doenças comuns e complexas. Existem diversas tecnologias, diferentes desenhos de estudos e

ferramentas analíticas para identificar fatores de risco genéticos. Estudos de análise de ligação

(Genome-Wide Linkage Studies – GWLS) e, mais recentemente, estudos de associação ampla

do genoma (Genome Wide Association Studies - GWAS) têm sido as principais ferramentas


41

para identificar variantes para doenças mendelianas e complexas, respectivamente (Londin et

al., 2013).

Os GWLS avaliam marcadores amplamente espaçados em todo o genoma para

determinar se eles são herdados juntamente com a doença em famílias com numerosos

indivíduos afetados (Ott, Wang e Leal, 2015). Este tipo de análise é utilizada na identificação

de mutações causadoras de doença monogênica (mendeliana) para estudar a transmissão de

um segmento cromossômico de uma geração para a outra em uma genealogia (Londin et al.,

2013).

A abordagem GWAS tem conduzido, desde 2005, à descoberta e avanço nos insights

sobre os determinantes genéticos da obesidade comum (Singh, Kumar e Mahalingam, 2017).

Os GWAS medem e analisam variações de sequência de DNA de todo o genoma humano

para identificar fatores de risco genéticos para doenças que são comuns na população (Bush e

Moore, 2012). O objetivo final do GWAS é identificar associação entre uma variável genética

e uma condição especificada, bem como identificar os fundamentos biológicos da

susceptibilidade à doença para desenvolver novas estratégias de prevenção e tratamento. A

variação genética mais comumente estudada é o SNP (Ott, Wang e Leal, 2015).

A obesidade tem uma expressão fenotípica heterogênea e os mecanismos moleculares

envolvidos na sua origem parecem ser muitos e diversos. A obesidade monogênica não

sindrômica refere-se a um único transtorno genético que leva a uma forma altamente

penetrante da doença (Bell, Walley e Froguel, 2005; Choquet e Meyre, 2011a; Waalen, 2014),

promovendo acúmulo excessivo de gordura corporal independentemente de interações com

outros genes ou fatores ambientais (González Jiménez et al., 2012). Este tipo de obesidade é

raro, afetando aproximadamente 5% da população, grave e geralmente de início precoce

(Farooqi e O’Rahilly, 2005).

Ao contrário da obesidade monogênica, a obesidade poligênica é causada por

alterações de múltiplos genes que interagem com os fatores ambientais e conferem diferentes

graus de suscetibilidade à obesidade (Albuquerque et al., 2015). O estudo da obesidade

poligênica é mais complexo do que a obesidade monogênica e configura-se como a hipótese

mais aceita para as formas comuns de obesidade (Singh, Kumar e Mahalingam, 2017).

Entre os vários genes estudados em associação com a obesidade, destacam-se os genes

FTO (massa de gordura e obesidade associadas; rs9939609), MC4R (melanocortina-4

receptor; rs17782313), LEP (leptina; rs7799039) e LEPR (receptor da leptina; rs1137101),


42

conhecidos por codificar proteínas envolvidas na regulação do balanço energético. É

concebível que essas variantes genéticas envolvidas na susceptibilidade da obesidade possam

desempenhar papel importante na regulação do peso e do consumo alimentar durante a

gestação. Contudo, são escassos ou inexistentes os estudos que abordam os efeitos da genética

sobre os desfechos gestacionais, principalmente sobre as mudanças relacionadas ao peso

(peso pré-gestacional, GPG e retenção de peso) e ao consumo alimentar materno.

2.5.1 FTO (fat mass and obesity associated gene de - massa de gordura e obesidade associadas)

Entre vários genes estudados para obesidade, destaca-se o FTO, que é um gene

relacionado à massa gorda e ao aumento do IMC. O FTO foi o primeiro gene de

suscetibilidade à obesidade identificado em 2007 por meio de GWAS (Frayling et al., 2007) e

tem sido constantemente associado a desfechos relacionados à obesidade poligênica em várias

populações (Dina et al., 2007; Scuteri et al., 2007; Rodríguez-López et al., 2010; Herrera,

Keildson e Lindgren, 2011; Vasan et al., 2012; Singh, Kumar e Mahalingam, 2017).

O gene FTO está localizado na região cromossômica 16q12.2, e seu tamanho é de

1.334 pares de bases (Figura 3). Entre os diversos polimorfismos deste gene, a variante

rs9939609, localizada no intron, tem sido amplamente investigada e corresponde a

substituição da base Timina por Adenina (TA). O alelo-A desta variante está diretamente

relacionado a um maior acúmulo de gordura corporal, de modo que os adultos homozigotos

para o alelo de risco (AA) têm peso 2-3 kg maior e chance 1,67 vez maior de desenvolver

obesidade, em comparação com indivíduos sem o alelo de risco (Frayling et al., 2007).

Figura 3. Localização cromossômica do gene FTO Fonte: http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=FTO

Supõe-se que, devido a sua alta expressão no hipotálamo, região que está diretamente

ligada ao controle do apetite e ao metabolismo energético, sua ação ocorre pela estimulação

dessa região cerebral para poupar os estoques de gordura corporal (Dina et al., 2007). Este

efeito pode ocorrer a partir da diminuição da saciedade e/ou do aumento da capacidade de

captação de gordura pelos adipócitos (Frayling et al., 2007). Entretanto, seu mecanismo de

ação ainda não foi esclarecido (Waalen, 2014).

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=FTO


43

2.5.2 MC4R (melanocortina-4 receptor - receptor da melanocortina-4)

As mutações MC4R representam a forma mais comum de obesidade monogênica

humana, afetando 0,2-5,8% dos indivíduos com obesidade grave precoce (Farooqi et al.,

2003; Hinney et al., 2006). Além disso, o GWAS forneceu evidências convincentes de que

também a variação comum no MC4R contribui para a susceptibilidade da obesidade na

população, e ele foi o segundo gene identificado de susceptibilidade à obesidade poligênica

(Loos et al., 2008). Este gene está localizado no cromossomo 18q21.32 e seu tamanho

corresponde a 1.666 pares de bases (Figura 4).

Figura 4. Localização cromossômica do gene MC4R Fonte: http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=MC4r

A variante rs17782313 do gene MC4R corresponde a substituição da Timina por

Citosina (TC). Esta variante apresenta papel importante no controle do apetite e na

homeostase energética e, consequentemente, é de grande relevância para o fenótipo de

excesso de peso corporal (Farooqi et al., 2003; Obregón et al., 2016). Neste sentido, o

polimorfismo rs17782313 (MC4R) tem sido fortemente associado com a obesidade e o maior

IMC em adultos e crianças (Loos et al., 2008; Beckers et al., 2011).

2.5.3 LEP e LEPR (leptin and leptin receptor - leptina e seu receptor)

Os polimorfismos dos genes da leptina (LEP) e do seu receptor (LEPR) estão

relacionados à via biológica para a regulação da ingestão alimentar e do gasto energético, com

provável associação com a obesidade e suas complicações (Guizar-Mendoza et al., 2005;

Khosropour, Shojaee e Lotfi, 2016).

O polimorfismo no gene da LEP codifica a proteína leptina, que é um dos importantes

sinais periféricos na regulação do peso corporal. Este gene está localizado no cromossomo

7q32.1 e seu tamanho corresponde a 16.428 pares de bases (Figura 5).

Figura 5. Localização cromossômica do gene LEP Fonte: http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=lep

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=MC4r

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=lep


44

A variante LEP-rs7799039 corresponde à transição Guanina para Adenina (GA) na

região promotora do gene (Boumaiza et al., 2012), sendo o alelo-A associado com o aumento

da produção e secreção de leptina (Constantin et al., 2010; Sahin et al., 2013) e com o IMC

(Hinuy et al., 2008; Dasgupta et al., 2015).

A leptina exerce sua ação biológica por meio da ligação e ativação da forma longa dos

receptores de leptina (LEPR), que é expresso extensivamente em muitas regiões cerebrais

(Gautron e Elmquist, 2011). O gene LEPR está localizado no cromossomo 1p31.3 e seu

tamanho corresponde a 220.908 pares de bases (Figura 6).

Figura 6. Localização cromossômica do gene LEPR Fonte: http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=lepr

Dentre os SNPs descritos no gene LEPR, o rs1137101 corresponde a uma substituição

de uma base Adenina por uma Guanina (AG) (Liu et al., 2015). Alguns estudos

encontraram correlação entre a obesidade e o SNP do gene LEPR (Yiannakouris et al., 2001;

Hastuti et al., 2016).

2.6 DETERMINANTES DO GANHO DE PESO MATERNO

2.6.1 IMC pré-gestacional

A maioria das evidências para os riscos associados à obesidade materna baseia-se no

IMC do início da gestação, devido a dificuldades na obtenção acurada do IMC pré-gestacional

(Heslehurst, 2011). O IMC elevado, antes ou no início da gestação, está associado ao risco de

complicações durante a gestação e no período pós-parto, tais como pré-eclâmpsia, diabetes

gestacional, hipertensão, parto por cesariana, hemorragia pós-parto (Gaillard et al., 2013; Li et

al., 2013); e também com desfechos neonatais adversos que incluem anormalidades de

crescimento fetal: macrossomia (Gaudet et al., 2014; Poorolajal e Jenabi, 2016), aumento do

número de abortos (Bodnar et al., 2015) e defeito no tubo neural (Rasmussen et al., 2008). Em

geral, as correlações entre IMC pré-gestacional elevado e desfechos fetais adversos parecem

ser mais consistentes e mais fortes do que para o GPG excessivo (Nohr et al., 2008; Gaillard

et al., 2013), especialmente em relação ao grau de adiposidade ao nascer (Sewell et al., 2006).

De acordo com Villamor e Cnattingius (2006), um aumento modesto do peso entre

gestações dentro da categoria de IMC saudável, ou suficiente para passar da categoria

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=lepr


45

saudável para excesso de peso, seria suficiente para aumentar o risco médio de resultados

adversos graves em gestação subsequente (Villamor e Cnattingius, 2006). Estudo

retrospectivo de coorte envolvendo 121.049 mulheres no Missouri, Estados Unidos,

demonstrou que mulheres que iniciaram a primeira gestação com excesso de peso

aumentaram as probabilidades de apresentar recém-nascido grande para idade gestacional,

pré-eclâmpsia, parto por cesariana e óbitos neonatais em uma segunda gestação em 54%,

156%, 85% e 37%, respectivamente (Tabet et al., 2015).

O IMC pré-gestacional também se caracteriza por ser um dos principais determinantes

para o GPG. As recomendações das agências reguladoras, como o Institute of Medicine (IOM)

dos Estados Unidos, são de que as mulheres com sobrepeso e obesidade ganhem menos peso

durante a gestação do que aquelas com peso normal ou baixo peso (Institute of Medicine,

2009). Assim, é imprescindível avaliar o estado nutricional no início da gestação para

determinar a recomendação adequada de ganho de peso e realizar orientação nutricional

apropriada para cada caso.

2.6.2 Ganho de peso gestacional

O GPG adequado é necessário para um resultado favorável da gestação. Entretanto, os

componentes específicos do ganho de peso possuem estimativas imprecisas e variáveis entre

as mulheres (Poston, Harthoorn e Van Der Beek, 2011; Gilmore, Klempel-Donchenko e

Redman, 2015). Os componentes maternos contribuem com aproximadamente 65% e os

produtos de concepção contribuem com os 35% restantes (Institute of Medicine, 2009). O

GPG total é composto pela água corporal, proteína (massa livre de gordura) e gordura (massa

gorda) do feto, bem como pela placenta, útero, líquido amniótico, expansão do volume de

sangue materno, glândulas mamárias e tecido adiposo materno (Gilmore, Klempel-

Donchenko e Redman, 2015). O padrão de GPG é relativamente pequeno no 1º trimestre,

havendo um ganho mais acentuado no 2º trimestre em relação ao 3º trimestre (Institute of

Medicine, 2009).

Em resposta à crescente evidência que o GPG excessivo e a retenção de peso no pós-

parto predispõem tanto as mães quanto seus filhos a DCNT, o IOM revisou suas

recomendações de 1990 e lançou novas recomendações do ganho de peso em 2009 (Institute

of Medicine, 2009). Contudo, não existe consenso quanto ao que constitui o GPG ideal

(Ohadike et al., 2016). Atualmente, as recomendações estabelecidas pelo IOM são as mais

aceitas e têm sido utilizadas como referência em muitos estudos. De acordo com esta


46

recomendação, as gestantes são inicialmente classificadas segundo o IMC pré-gestacional

para, posteriormente, determinar a faixa de adequação do GPG (Institute of Medicine, 2009).

Estas recomendações também são adotadas em vários países, inclusive no Brasil (Ministério

da Saúde, 2006), e encontram-se detalhadas no Quadro 3.

Mais recentemente, o Consórcio Internacional de Crescimento Fetal e Neonatal para o

século 21 (Intergrowth-21st) publicou padrões de GPG segundo a idade gestacional, para

mulheres saudáveis, usando dados de populações diversas (Brasil, China, Índia, Itália, Kênia,

Oman, Reino Unido e Estados Unidos), que podem ser usados para orientar recomendações

sobre o GPG adequado em todo o mundo (Ismail et al., 2016).

Quadro 3. Recomendações e classificação do ganho de peso gestacional, de acordo com IMC

materno pré-gestacional.

Estado nutricional pré-

gestacional (IMC, kg/m2) Recomendação de ganho de peso durante a gestação (kg)

Total de ganho de peso Ganho de peso médio por semana no

2° e 3° trimestre

Baixo peso (< 18,5) 12,5 – 18,0 0,51

Peso adequado (18,5 – 24,9) 11,5 – 16,0 0,42

Sobrepeso (25,0 – 29.9) 7,0 – 11,5 0,28

Obesidade (≥ 30,0) 5,0 – 9,0 0,22

Classificação do ganho de peso gestacional total (kg)

Insuficiente Adequado Excessivo

Baixo peso (< 18,5) < 12.5 12.5 – 18,0 > 18,0

Peso adequado (18,5 – 24,9) < 11,5 11,5 – 16,0 > 16,0

Sobrepeso (25,0 – 29.9) < 7,0 7,0 – 11,5 > 11,5

Obesidade (≥ 30,0) < 5,0 5,0 – 9,0 > 9,0 Fonte: Institute of Medicine (2009)

Embora a obesidade materna seja, por si só, um fator de risco significativo para

desfechos maternos e neonatais adversos, os riscos da maioria destas complicações são

amplificados pelo GPG excessivo, incluindo diabetes gestacional, pré-eclâmpsia, recém-

nascidos grandes para sua idade gestacional, parto por cesariana, retenção de peso pós-parto e

obesidade infantil (Institute of Medicine, 2009; Drehmer et al., 2013; Gaillard et al., 2013;

Lau et al., 2014).

As mulheres tendem a ganhar mais peso entre as gestações em vez de reduzir (Poston

et al., 2016). Linearmente, o GPG está associado com mudanças de peso no pós-parto, ou

seja, quanto maior o GPG, maior a retenção de peso no pós-parto (Nohr et al., 2008),

especialmente entre as mulheres obesas (Institute of Medicine, 2009). O GPG excessivo


47

nestas mulheres está associado principalmente com excesso de tecido adiposo e não ao tecido

magro (Berggren et al., 2016). O excesso de peso pré-gestacional e o GPG excessivo pode ter

efeito cumulativo em longo prazo sobre o ganho de peso em gestações subsequentes (Yogev e

Catalano, 2009; Siega-Riz et al., 2009), ampliando a trajetória de ganho de peso e

contribuindo para o desenvolvimento ou agravamento da epidemia da obesidade em mulheres.

Evidências sugerem que a obesidade materna e o GPG excessivo não estão associados

apenas a resultados adversos da gestação, mas também têm influência transgeracional sobre

os resultados de saúde relacionados à obesidade infantil e adulta (Rooney, Mathiason e

Schauberger, 2011; Cnattingius et al., 2012; Lawrence et al., 2014).

A obesidade pré-gestacional materna e o GPG excessivo são fatores de risco

modificáveis comuns e importantes para os desfechos materno e fetais. As mulheres também

estão ficando grávidas em uma idade mais avançada e com um número crescente de

condições médicas crônicas, como hipertensão e diabetes (Catalano e deMouzon, 2015).

Logo, estratégias preventivas centradas na melhoria da saúde materna no período pré-

gestacional e gestacional podem melhorar os resultados de saúde em curto e longo prazos

(Gaillard et al., 2016). De acordo com o IOM, as mulheres identificadas com excesso de peso

devem ser consideradas gestantes de risco e devem receber atenção diferenciada, ou seja, uma

avaliação clínica e laboratorial específica, assim como serem referenciadas para avaliação

especializada por um nutricionista (Institute of Medicine, 2009).

2.6.3 Retenção de peso pós-parto

A retenção do peso ganho durante a gestação é altamente variável, podendo

representar fator determinante da obesidade em mulheres, e está associada a uma complexa

rede de inter-relações incluindo o GPG excessivo, o estado nutricional pré-gestacional, a

amamentação, a raça, a idade, a paridade, o estado civil, a prática de atividade física e o

consumo alimentar (Lacerda e Leal, 2004; Endres et al., 2015).

As recomendações atuais orientam que as mulheres iniciem a gestação com o peso

adequado e sigam as recomendações do IOM para o GPG. No entanto, muitas mulheres

acumulam excesso de peso adquirido durante a gestação, aumentado o risco para o sobrepeso

e a obesidade nas gestações posteriores e ao longo da vida. É possível que essas mulheres

tenham mudanças sutis nos mecanismos reguladores do apetite, diferenças na resistência à

insulina ou diferenças na taxa metabólica basal que as tornem suscetíveis ao GPG excessivo, e


48

essas alterações persistem ao longo do tempo promovendo maior adiposidade materna

(McClure et al., 2013; Endres et al., 2015).

Os dados de estudos epidemiológicos sugerem que o mecanismo que liga o GPG

excessivo à adiposidade a curto, médio e a longo prazos está associado à retenção de peso no

pós-parto. Em estudo realizado nos Estado Unidos, aproximadamente 75% das mulheres eram

mais pesadas em relação ao seu peso pré-gestacional (47,4% das mulheres apresentaram mais

que 4,5 kg e 24,2% mais que 9 kg) um ano após o parto (Endres et al., 2015). Outro estudo

realizado no mesmo país mostrou que o GPG excessivo não estava associado

significativamente apenas ao peso materno aos 8 anos pós-parto, mas especificamente com à

gordura abdominal (McClure et al., 2013).

Em um estudo brasileiro, mulheres com GPG excessivo retiveram significativamente

mais peso aos 9 meses pós-parto, comparadas com aquelas com GPG adequado ou

insuficiente (Kac et al., 2004). Em um estudo realizado na capital da Suécia observou-se que

a retenção de peso um ano pós-parto foi um importante determinante do sobrepeso 15 anos

depois (Linné et al., 2004). Em um estudo realizado na Austrália, demonstrou-se que as

mulheres que ganharam peso gestacional acima das recomendações do IOM tiveram um risco

aumentado duas vezes de sobrepeso e quase 5 vezes de obesidade 21 anos após a gestação,

comparando com as mulheres com ganho de peso adequado (Mamun et al., 2010).

De acordo com os estudos apresentados, o GPG pode ser considerado o preditor mais

importante para a retenção de peso pós-parto. A estratégia de monitoramento do ganho de

peso ao longo da gestação é essencial para reduzir o risco de obesidade materna e prevenir

desfechos obstétricos adversos.

2.6.4 Leptina

Ambientes obesogênicos e o comportamento humano têm potencial para contribuir

para o aumento agudo na prevalência de sobrepeso e obesidade na população. No entanto, não

se deve omitir a biologia desta discussão. Vários outros fatores biológicos correlatos comuns

do ganho de peso ou da obesidade incluem os mecanismos de ação da leptina e outros

hormônios, e a regulação do apetite e saciedade (Agurs-Collins e Bouchard, 2008).

A leptina é um hormônio que desempenha papel importante em vários processos

fisiológicos, incluindo a regulação da função endócrina, função imunológica, inflamação,

reprodução e angiogênese (Miehle, Stepan e Fasshauer, 2012). Este hormônio se destaca pela


49

atividade de regulação da ingestão alimentar e o controle do gasto energético por meio da

ação de receptores da leptina localizados no hipotálamo, que detecta e integra esses sinais

promovendo a manutenção da homeostase energética e do peso corporal (Gautron e Elmquist,

2011) (Zhou e Rui, 2013).

Esta adipocina é produzida e secretada predominantemente por adipócitos no tecido

adiposo branco (Castellano Filho et al., 2013), mas também pode ser sintetizada pela placenta

durante a gestação (Maymó et al., 2011). A leptina tem como particularidade ser secretada de

forma pulsátil, exibindo um ritmo circadiano com os níveis mais baixos no meio da tarde e os

níveis mais altos à meia-noite (Park e Ahima, 2015).

Os indivíduos obesos geralmente exibem altos níveis de expressão de leptina no tecido

adiposo e apresentam níveis elevados de leptina circulante, e estes níveis elevados não

conseguem reduzir o excesso de adiposidade, indicando resistência à leptina (Minocci et al.,

2000; Zhou e Rui, 2013; Park e Ahima, 2015; Khosropour, Shojaee e Lotfi, 2016). A gordura

subcutânea produz mais leptina do que a gordura visceral, o que pode, em parte, contribuir

para níveis mais elevados de leptina nas mulheres em comparação com os homens (Minocci

et al., 2000).

Durante a gestação as concentrações plasmáticas de leptina materna estão

significativamente mais elevadas, em comparação a mulheres não gestantes, e não é

acompanhado pelo efeito central clássico na regulação da ingestão alimentar. Uma possível

função do aumento dos níveis de leptina materna é intensificar a mobilização das reservas de

gordura materna para incrementar a disponibilidade e apoiar a transferência transplacentária

de nutrientes (Hauguel-de Mouzon, Lepercq e Catalano, 2006). Porém, o exato papel da

hiperleptinemia temporária durante a gestação ainda não está completamente esclarecido

(Augustine, Ladyman e Grattan, 2008).

O aumento da concentração de leptina materna precede o aumento fisiológico do IMC

materno e declina rapidamente após o parto, sugerindo que a placenta contribui

substancialmente para elevar a concentração da leptina materna, e não apenas o tecido

adiposo materno (Hauguel-de Mouzon, Lepercq e Catalano, 2006).

As concentrações elevadas de leptina materna têm sido associadas ao IMC materno e

tendem a aumentar progressivamente ao longo da gestação (Misra e Trudeau, 2011;

Castellano Filho et al., 2013; Franco-Sena et al., 2015). Embora as mulheres obesas

apresentem maiores concentrações de leptina no início da gestação, elas apresentam menor


50

taxa de aumento de leptina ao longo da gestação em comparação com as mulheres sem

excesso de peso, provavelmente devido ao seu menor GPG (Misra e Trudeau, 2011;

Castellano Filho et al., 2013).

2.6.5 Consumo alimentar

A alimentação desempenha papel primordial durante todo o ciclo de vida dos

indivíduos, uma vez que nutrientes e energia são essenciais para a manutenção do organismo.

O estado nutricional materno adequado antes e durante a gestação é importante para o

crescimento e desenvolvimento do feto (Thompson et al., 2010). Idealmente, as mulheres em

idade fértil deveriam consumir uma variedade de alimentos saudáveis para manter uma

nutrição adequada e continuar com estes hábitos durante a gestação (Kaiser e Allen, 2008;

Ramakrishnan et al., 2012; Nnam, 2015).

Resultados adequados da gestação dependem da ingestão de nutrientes suficientes para

atender aos requisitos maternos e fetais. As necessidades nutricionais maternas de energia e

proteína encontram-se aumentadas durante a gestação para garantir o crescimento e o

desenvolvimento fetal adequados; o desenvolvimento da placenta e dos tecidos maternos; o

suprimento das maiores demandas metabólicas e a manutenção do peso materno e da prática

de atividade física (Nnam, 2015). As recomendações alimentares e nutricionais variam de

acordo com as diferenças individuais relacionadas ao estado nutricional materno, à faixa

etária e ao estado de saúde da mulher (Kaiser e Allen, 2008).

A energia é o principal determinante no ganho de peso gestacional. Evidência

disponível sugere que a eficiência do metabolismo energético pode aumentar durante a

gestação, mas os mecanismos envolvidos não são bem compreendidos (Abu-Saad e Fraser,

2010). A recomendação adicional de energia estabelecida em 1989 pelo Food and Nutrition

Board/National Research Council (FNB/NRC), para as mulheres que iniciam a gestação com

um peso saudável, corresponde a 300 kcal/dia a partir do 2º trimestre de gestação (National

Research Council, 1989). Em 2004, o custo energético total da gestação de mulheres

saudáveis indicado por especialistas da Food and Agriculture Organization of the United

Nations (FAO) e da OMS (FAO/WHO/UNU) foi de aproximadamente 77.000 kcal, associado

a estimativa de ganho de peso gestacional total entre 10 a 14 kg com média de 12 kg e recém-

nascidos 3,3 kg e menores índices de complicações materno-fetais. A recomendação deste

grupo corresponde a um adicional de 85 kcal no primeiro trimestre, 285 kcal no segundo

trimestre e 475 kcal no terceiro trimestre (FAO/WHO, 2004). O IOM recomenda um


51

adicional 340 kcal no segundo trimestre e 452 kcal no terceiro trimestre (Institute of

Medicine, 2009).

De acordo com a American Dietetic Association, a maioria das mulheres gestantes

precisa de 2.200 a 2.900 kcal/dia (Kaiser e Allen, 2008). As recomendações nutricionais na

obesidade gestacional não são totalmente claras. A ingestão excessiva de energia durante a

gestação pode ser tão prejudicial quanto a sua deficiência, especialmente em mulheres com

sobrepeso e as obesas (Marangoni et al., 2016). De acordo com o IOM dos Estados Unidos, a

distribuição do aporte de energia dos macronutrientes na dieta pode variar entre 10-35% de

proteína, 20-35% de lipídios e 46-65% de carboidratos (Institute of Medicine, 2009).

Entre os macronutrientes, geralmente a recomendação de ingestão de proteína requer

mais atenção durante a gestação. A demanda proteica aumenta progressivamente para

sustentar a síntese proteica, a fim de fornecer suporte nutricional para deposição e

manutenção dos tecidos maternos e o crescimento fetal, especialmente durante o terceiro

trimestre (Abu-Saad e Fraser, 2010). Estas adaptações são complexas e mudam gradualmente

ao longo da gestação. O National Research Council (1989) recomenda um adicional de 10

g/dia de proteína ao longo da gestação. Em 2007, o comitê FAO/WHO/UNU revisou a

recomendação de 1985 e estimou as necessidades proteicas adicionais de 1g, 9g e 31g/dia no

1º, 2º, 3º trimestres, respectivamente (WHO, 2007).

A qualidade das gorduras na alimentação das gestantes é mais importante do que a sua

quantidade total. Alguns ácidos graxos poli-insaturados (ácidos graxos ômega-6 e omega-3)

são essenciais para o desenvolvimento humano e a saúde, mas não podem ser sintetizados

pelo corpo humano, por isso devem ser obtidos por meio da alimentação. Durante a gestação,

a alimentação e as reservas corporais de ácidos graxos poliinsaturados essenciais são

fundamentais para atender às necessidades materna e fetal (Abu-Saad e Fraser, 2010;

Marangoni et al., 2016).

O consumo de um quantitativo maior de alimentos para satisfazer as necessidades

energéticas, aliado ao aumento da absorção e eficiência da utilização de nutrientes que

normalmente ocorre na gestação, geralmente são suficientes para satisfazer as necessidades da

maioria dos nutrientes específicos. No entanto, a ingestão inadequada de micronutrientes é

prejudicial durante as fases de desenvolvimento e crescimento do feto. Neste sentido, a

suplementação de vitaminas e minerais pode ser apropriada em algumas situações, até mesmo

antes da concepção (Kaiser e Allen, 2008; Nnam, 2015).


52

A ingestão alimentar habitual materna é um dos determinantes do ganho de peso na

gestação, e está associado direta ou indiretamente ao desenvolvimento de complicações

durante a gestação. Estudos associam o maior consumo de alimentos não saudáveis no

período gestacional, como alimentos processados e ultraprocessados, com o aumento do

ganho de peso gestacional (Uusitalo et al., 2009) e a elevação da retenção de peso pós-parto

(Martins e Benicio, 2011).

A identificação de padrões alimentares tornou-se recentemente uma ferramenta útil em

estudos epidemiológicos que procuram explorar a relação entre exposições dietéticas e

desfechos relacionados ao estado de saúde (Thompson et al., 2010; Grieger, Grzeskowiak e

Clifton, 2014). Neste contexto, os estudos sugerem que os padrões alimentares caracterizados

por alta concentração de alimentos ricos em gorduras saturadas, açúcar refinado ou sódio

estão associados aos desfechos adversos da gestação, quando comparados aos padrões

alimentares caracterizados por uma variedade de frutas, vegetais e grãos integrais (Zhang et

al., 2006; Brantsæter et al., 2009; Stuebe, Oken e Gillman, 2009; Ramakrishnan et al., 2012;

Grieger, Grzeskowiak e Clifton, 2014; Englund-Ögge et al., 2014).

Considerando que a gestação é um período em que as mulheres são mais propensas a

mudar seu padrão de ingestão de alimentos devido à preocupação com a saúde da criança, a

identificação e a compreensão dos fatores alimentares, juntamente com outros fatores que

influenciam o ganho de peso gestacional, pode contribuir para formulação de estratégias de

promoção de hábitos alimentares saudáveis antes e durante a gestação com o objetivo de

reduzir o risco de resultados adversos da gestação (Grieger, Grzeskowiak e Clifton, 2014).

JUSTIFICATIVA

53

3 JUSTIFICATIVA

A crescente prevalência da obesidade é bastante preocupante, pois está relacionada ao

aumento do risco de doenças crônicas, como doenças cardíacas, hipertensão arterial,

dislipidemias, diabetes, entre outras. A complexidade clínico-epidemiológica que envolve a

temática da obesidade está fortemente associada aos fatores ambientais, especialmente aos

hábitos alimentares e ao estilo de vida sedentário, aliados a fatores genéticos. A variação

interindividual da obesidade e fenótipos relacionados têm origem em múltiplos determinantes

genéticos, desta forma, a ciência tem avançado na identificação de genes específicos que

possam estar associados à obesidade. Contudo, estudos de associação entre os polimorfismos

nos genes relacionados à obesidade e às mudanças de peso corporal e consumo alimentar de

gestantes ainda são escassos ou inexistentes.

A interação entre genes e ambiente é importante no desenvolvimento da obesidade e

pode apresentar importantes implicações em nível de saúde pública. A expectativa dos

estudos genéticos é que os genes envolvidos na regulação da adiposidade corporal possam

potencialmente responder a intervenções ambientais, alterando sua expressão. Assim,

marcadores genéticos poderão auxiliar na identificação de indivíduos com maior chance de se

beneficiar de intervenções sobre seu estilo de vida (hábitos dietéticos e prática de atividade

física), direcionando a abordagem terapêutica para indivíduos de risco e minimizando os

impactos negativos à saúde.

Considerando o aumento progressivo da prevalência do sobrepeso e da obesidade em

mulheres em idade fértil e a relevância epidemiológica das consequências da obesidade

materna e do GPG excessivo, bem como o ciclo transgeracional de obesidade, investigações

de fatores genéticos associados aos fenótipos da obesidade materna contribuem com avanços

em direção a uma compreensão mais abrangente sobre a temática, podendo direcionar novas

estratégias de prevenção da obesidade materna. Dessa forma, os resultados obtidos nesta tese

de doutorado poderão contribuir para o direcionamento de novas evidências científicas que

subsidiem políticas públicas de controle e prevenção dos desfechos relacionados ao excesso

de peso materno.

HIPÓTESES

54

4 HIPÓTESES

As hipóteses relacionadas aos estudos desta tese de doutorado são:

Hipótese 1

Mulheres que apresentam algum dos polimorfismos nos genes estudados (FTO-rs9939609;

MC4R-rs17782313; LEP-rs7799039 e LEPR-rs1137101) são mais suscetíveis ao excesso de

peso pré-gestacional e ao ganho de peso gestacional excessivo.

Hipótese 2

Mulheres portadoras dos polimorfismos nos genes LEP-rs7799039 e LEPR-rs1137101

apresentam maiores concentrações plasmáticas de leptina ao longo da gestação.

Hipótese 3

Mulheres que apresentam algum dos polimorfismos nos genes isolados estudados (FTO-

rs9939609; MC4R-rs17782313; LEP-rs7799039 e LEPR-rs1137101) apresentam maior

ingestão energética total, bem como maiores percentuais de energia derivados dos lipídios,

carboidratos e de alimentos ultraprocessados.

OBJETIVOS

55

5 OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL

Estudar a associação entre os polimorfismos em genes relacionados à obesidade (FTO-

rs9939609, MC4R-rs17782313, LEP-rs7799039 e LEPR-rs1137101) e as mudanças de peso

corporal e consumo alimentar em gestantes.

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

5.2.1 Artigo 1

(i) Avaliar a associação entre os SNPs dos genes FTO e MC4R e o peso pré-gestacional e as

mudanças do peso corporal materno durante a gestação e no pós-parto.

5.2.2 Artigo 2

(ii) Investigar se os SNPs dos genes da LEP e LEPR influenciam no peso pré-gestacional, no

ganho de peso gestacional e nas concentrações plasmáticas de lep tina ao longo da

gestação.

5.2.3 Artigo 3

(iii) Investigar a associação dos SNPs dos genes do FTO, MC4R, LEP e LEPR com a ingestão

energética total e o percentual de energia derivados de macronutrientes e alimentos

ultraprocessados durante os períodos pré-gestacional e gestacional.

MÉTODOS

56

6 MÉTODOS

6.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO

O conjunto de dados utilizados nesta tese advém de um estudo de coorte prospectiva

(projeto matriz) realizado no CMS HB, localizado no bairro da Tijuca no município do Rio de

Janeiro, durante o período de novembro de 2009 a outubro de 2011. A execução do projeto

correspondeu a coleta de dados em quatro períodos do seguimento: ≤ 13 semanas de gestação

(SG) = 10 trimestre, 20 - 26 SG = 20 trimestre e 30 - 36 SG = 30 trimestre, e no pós-parto

imediato (30 a 45 dias), conforme detalhamento na Figura 7.

6.2 ASPECTOS ÉTICOS

O projeto de pesquisa que deu origem ao estudo da presente tese foi aprovado pelo

Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Secretaria Municipal de Saúde e Defesa Civil do

município do Rio de Janeiro (Anexo 1) e pelo CEP do Hospital Maternidade Escola da UFRJ

(Processo n° 0023.0.361.000-08). A participação das mulheres na pesquisa esteve

condicionada à assinatura de duas vias do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

(TCLE) (Anexo 2), que foi obtida de forma livre e espontânea, após terem sido feitos todos os

esclarecimentos pertinentes ao estudo. A constituição do biorrepositório foi devidamente

aprovada (registro número 16647) pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP).

6.3 CRITÉRIOS DE ELEGIBILIDADE

Os critérios de elegibilidade foram estabelecidos atendendo as exigências do projeto

matriz. Deste modo, foram recrutadas mulheres que atenderam aos seguintes critérios de

elegibilidade: (i) ter no máximo 13 SG; (ii) estar entre 20 e 40 anos de idade; (iii) estar livre

de doenças infecto-parasitárias e DCNT, exceto obesidade; (iv) realizar o acompanhamento

pré-natal no local de estudo.

Do total das 299 mulheres que inicialmente aceitaram participar do estudo, 40 não

atenderam aos seguintes critérios de elegibilidade: 12 mulheres confirmaram diagnóstico de

doenças infecto-parasitárias; 2 mulheres confirmaram diagnóstico de DCNT; 16 mulheres

estavam com mais de 13 SG no baseline; 10 mulheres abandonaram o acompanhamento do

pré-natal na unidade de saúde. Desta forma, 259 mulheres atenderam aos requisitos de

elegibilidade do estudo.

MÉTODOS

57

Figura 7. Coleta de dados em cada ponto de acompanhamento do estudo Abreviaturas: QFA = Questionário de frequência alimentar; SNPs = Polimorfismos de nucleotídeo único

20 Trimestre

(20 - 26 semanas)

PERÍODO GESTACIONAL

10 Trimestre

(5 -13 semanas)

30 Trimestre

(30 - 36 semanas)

PRIMEIRA ENTREVISTA

- Coleta de sangue

(SNPs e Leptina)

- Antropometria

(Estatura e Massa corporal)

- QFA

(Consumo alimentar pré-

gestacional)

SEGUNDA ENTREVISTA

- Questionário Geral-1

(Dados demográficos,

socioeconômicos,

obstétricos e de estilo de

vida)

- Coleta de sangue

(Leptina)

- Antropometria

(Massa corporal)



socioeconômicos,


vida)

PRIMEIRA ENTREVISTA

- Coleta de sangue

(Leptina)

- Antropometria

(Massa corporal)



socioeconômicos,


vida)

SEGUNDA ENTREVISTA

- QFA

(Consumo alimentar

gestacional)

PÓS-PARTO

30 - 45 dias



socioeconômicos,


vida)

- Antropometria

(Massa corporal)

CA

PTA

ÇÃ

O D

AS

GES

TAN

TES

MÉTODOS

58

6.4 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO

Os critérios gerais de exclusão do presente estudo corresponderam a: (i) mulheres que

abortaram durante o acompanhamento do estudo (n = 25); (ii) mulheres que apresentaram

gestação gemelar (n = 4); (iii) mulheres que tiveram bebês natimortos (n = 5). Assim, a

amostra inicial do estudo resultou em 225 mulheres.

6.5 CAPTAÇÃO DAS PARTICIPANTES DO ESTUDO

A captação das mulheres para o estudo aconteceu durante o período de novembro de

2009 a outubro de 2011. A captação/recrutamento das mulheres na unidade de estudo ocorreu

mediante abordagem às gestantes que compareceram pela primeira vez à consulta de pré-natal

e às mulheres que obtiveram resultado positivo no teste imunológico de gravidez realizado na

unidade. Visando subsidiar análises sobre potenciais vieses de seleção, as mulheres elegíveis

inicialmente responderam a um questionário contendo as seguintes questões: data da última

menstruação, idade, escolaridade, peso pré-gestacional, número de filhos prévios,

informações sobre DCNT, doenças infecciosas, local da residência e local no qual seria

realizado o pré-natal. Aquelas que se enquadravam nos critérios de elegibilidade, previamente

estabelecidos na linha de base do estudo foram convidadas a participar do projeto. Do total de

322 mulheres convidadas a participar do estudo, 299 (92,7%) concordaram e tiveram a

primeira entrevista agendada, após assinatura do TCLE.

6.6 CAPACITAÇÃO DA EQUIPE E CONTROLE DE QUALIDADE DOS DADOS

A coleta de dados foi realizada por equipe composta por alunos de graduação e pós-

graduação do Observatório de Epidemiologia Nutricional do INJC-UFRJ. A equipe foi

devidamente capacitada, mediante treinamento prático na unidade do estudo durante o

período de agosto a outubro de 2009. A entrada de novos entrevistadores na equipe foi

condicionada a realização de novos treinamentos. Estratégias de controle da qualidade e

consistência das informações foram adotadas mediante a elaboração de manuais e protocolos

para a coleta dos dados.

Foi realizado um estudo piloto no CMS HB, no período de setembro a outubro de

2009, com o objetivo de testar os instrumentos elaborados para a coleta de dados, propor e

executar modificações nos questionários e aperfeiçoar as técnicas de aferição e logística.

MÉTODOS

59

Após a realização das entrevistas para a coleta de dados, os questionários eram

imediatamente revisados pelos entrevistadores e posteriormente por um revisor, visando

minimizar erros de preenchimento.

6.7 PROCEDIMENTOS PARA COLETA DE DADOS

A coleta de dados de campo ocorreu entre novembro de 2009 e junho de 2012. Os

dados foram coletados mediante agendamentos prévios com a gestante. Para minimizar as

perdas de seguimento, as participantes foram contatadas por telefone no dia anterior às

entrevistas para confirmação do agendamento e para lembrá-las, quando necessário, das

recomendações de jejum de 12 horas, em caso de coleta de sangue. A remarcação da

entrevista também foi realizada por telefone para as gestantes que não puderam comparecer

no dia em que estavam agendadas. Na impossibilidade do contato telefônico, cartas foram

enviadas com a mesma finalidade.

Em casos nos quais a gestante não compareceu a consulta do pré-natal próxima à data

provável do parto, foram realizados contatos telefônicos para saber se o parto já havia

ocorrido e, em caso positivo, para agendar a entrevista do pós-parto.

6.8 LOGÍSTICA DA COLETA DE DADOS

No primeiro trimestre gestacional foram realizadas duas entrevistas. Na primeira

entrevista foi aplicado um questionário semiquantitativo de frequência alimentar (QFA) para

coletar informações sobre consumo alimentar referente ao período pré-gestacional (Anexo

online 1). Também foram realizadas as medidas de massa corporal e de estatura e coleta de

amostras de sangue. Na segunda entrevista foi aplicado o Questionário Geral-1 (Anexo online

2) para obtenção dos dados demográficos, socioeconômicos, obstétricos e de estilo de vida.

No segundo trimestre gestacional foi aplicado o Questionário Geral-2 (Anexo online

3) e realizadas a aferição da massa corporal e nova coleta de amostra de sangue.

No último trimestre da gestação foram realizadas duas entrevistas. Na primeira foi

aplicado o Questionário Geral-3 (Anexo online 4), novamente aferida a massa corporal das

gestantes e realizada nova coleta de amostra de sangue. Na segunda entrevista foi aplicado o

QFA para obter dados de consumo alimentar referente ao período gestacional (Anexo online

5).

MÉTODOS

60

A última coleta de dados ocorreu aproximadamente de quatro a seis semanas após o

parto. Neste momento foi aplicado o Questionário Geral-4 do pós-parto (Anexo online 6) e

realizada aferição da massa corporal das mulheres.

6.9 VARIÁVEIS DO ESTUDO

A seleção das variáveis para compor os modelos finais das regressões pontuais e

longitudinais se deu com base na plausibilidade biológica da associação e nos valores de p

≤0,20 na análise bivariada para cada uma das variáveis, conforme detalhado em cada artigo.

No Quadro 4 são apresentadas as variáveis dependentes e independentes, de acordo

com as análises das associações dos polimorfismos com os desfechos dos Artigos (A1, A2 e

A3). A descrição das variáveis encontra-se a seguir.

Quadro 4. Classificação das variáveis do estudo, de acordo com os artigos da tese.

Variáveis do estudo Tipo da variável

Covariáveis Dependente Independente

Idade materna A1 – A2 – A3

Escolaridade materna A1 – A2

Cor da pele referida pela mulher A1 – A2 – A3

PAFL A1 – A2

Sexo da criança A1

Paridade A1 – A2 – A3

Idade gestacional A1 – A2 – A3

Hábito de fumar A1 – A2

Renda familiar per capita A3

Ingestão energética no 10 trimestre A2

IMC pré-gestacional A1 – A2 A1 – A3

GPG no 10, 20 e 30 trimestres (g/SG) A1

GPG total (kg) A1 A1

GPG insuficiente A1 – A2

GPG excessivo A1 – A2

Retenção de peso pós-parto (g/SG) A1

IMC pós-parto (kg/m2) A1

Peso materno (kg) A1 – A2 A2

Leptina plasmática no 10, 20 e 30 trimestres (ng/dL) A2 A2

Leptina plasmática ao longo da gestação A2

Ingestão energética total (kcal/dia) A3

% de energia dos CHO A3

% de energia das PTN A3

% de energia dos LIP A3

% de energia dos alimentos ultraprocessados A3

SNP no gene FTO A1 – A3

SNP no gene MC4R A1 – A3

SNP no gene LEP A2 – A3

SNP no gene LEPR A2 – A3 Abreviaturas: A1 = Artigo 1; A2 = Artigo 2; A3 = Artigo 3; PAFL = prática de atividade física de lazer antes da gestação;

IMC = índice de massa corporal; GPG = ganho de peso gestacional; SG = semana gestacional; CHO = carboidratos; PTN =

proteínas; LIP = lipídios; SNP = polimorfismo de único nucleotídeo; FTO = massa de gordura e obesidade associadas; MC4R

= melanocortina-4 receptor; LEP = leptina; LEPR = receptor da leptina.

MÉTODOS

61

6.9.1 Informações demográficas, socioeconômicas, obstétricas e de estilo de vida

As informações demográficas, socioeconômicas, obstétricas e de estilo de vida foram

coletadas por meio de questionário geral estruturado respondido pelas participantes a cada

trimestre da gestação e no pós-parto (Anexos online 2-4 e 6). As entrevistas foram realizadas

presencialmente em local reservado (sala) na unidade de estudo.

As variáveis relacionadas a este tópico e avaliadas no presente estudo foram: idade

(anos), escolaridade (anos), paridade (número de filhos), idade gestacional (em semanas) sexo

da criança, tabagismo durante a gestação (nunca fumou, fumante atual ou ex-fumante), prática

de atividade física de lazer antes da gestação (sim ou não), cor da pele referida pelas mulheres

(branca, parda/mulata/morena/cabocla) e renda per capita familiar.

A idade gestacional foi avaliada em semanas e calculada a partir dos dados obtidos na

primeira ultrassonografia (USG) realizada antes de 24 SG (Butt et al., 2014). Na ausência de

informação sobre a semana gestacional pela USG, foi utilizada a data da última menstruação

(DUM) para estimar a SG (n = 2).

6.9.2 Medidas antropométricas

A avaliação antropométrica foi realizada pela obtenção das medidas de massa corporal

e estatura materna, de acordo com as técnicas de Lohman et al. (1988). A estatura foi medida

apenas na primeira entrevista (≤ 13 SG), enquanto a massa corporal foi aferida nos três

trimestres da gestação e no pós-parto.

A aferição da massa corporal foi realizada em balança plataforma eletrônica com

display digital (Filizola, São Paulo, Brasil), com precisão de 100 g e capacidade máxima de

150 kg. Devido à precisão da balança digital, a medição foi realizada apenas uma única vez

em cada procedimento. Posteriormente, foi obtido a última medida de massa corporal materna

registrada em prontuário médico durante a última consulta ao pré-natal. Também foi

registrado a informação do peso pré-gestacional relatado pela gestante na primeira entrevista

(baseline), quando era do seu conhecimento.

A estatura foi medida em duplicata utilizando estadiômetro portátil (Seca, Hamburgo,

Alemanha), com escala de medição de 0,5 cm. No caso de a diferença entre as medidas ser

maior que 0,5 cm, uma terceira medida foi aferida e a média das duas medidas mais próximas

foi utilizada nas análises.

MÉTODOS

62

O IMC pré-gestacional foi obtido pela razão do peso pré-gestacional informado pela

gestante na primeira entrevista e o quadrado da estatura aferida no baseline [peso (kg)/estatura

(m2)]. O IMC pós-parto também foi calculado, considerando a massa corporal aferida neste

período. A classificação do estado nutricional das mulheres obedeceu ao recomendado pela

OMS (WHO, 2000): <18,5 kg/m2 = baixo peso; 18,5 – 24,9 kg/m2 = peso normal; 25,0 – 29,9

kg/m2 = sobrepeso; ≥30,0 kg/m2 = obesidade.

O GPG total foi obtido pela diferença entre o último peso registrado em prontuário

durante a última consulta ao pré-natal e o peso pré-gestacional informado pela gestante. As

mulheres foram classificadas de acordo com as categorias de GPG (insuficiente, adequado e

excessivo) com base nas recomendações do IOM descritas no Quadro 3. O GPG por

trimestre da gestação também foi calculado e dividido pela SG correspondente.

A retenção de peso pós-parto foi calculada pela diferença entre o peso aferido no pós-

parto e o peso pré-gestacional informado pela gestante no baseline.

6.9.3 Consumo alimentar

As informações referentes ao consumo alimentar foram coletadas no baseline e no

terceiro trimestre (30 – 36 SG). A primeira avaliação referiu-se ao consumo alimentar da

mulher nos seis meses anteriores à concepção e a segunda correspondeu aos últimos seis

meses anteriores à última entrevista.

Para obtenção dos dados de consumo alimentar foi utilizado um QFA desenvolvido

para a população adulta do Rio de Janeiro e validado utilizando o recordatório de 24 horas. Os

coeficientes de correlação na validação para energia, carboidrato, proteína e gordura foram

0,44, 0,34, 0,44, e 0,41 respectivamente (Sichieri e Everhart, 1998).

Este instrumento foi utilizado para o presente estudo (Anexos online 1 e 5). O QFA

foi composto por 82 itens alimentares, incluindo bebidas não alcoólicas e alcoólicas, e 8

opções de respostas de frequência de consumo. As respostas de frequências de consumo

apresentadas pelo instrumento foram posteriormente convertidas em frequências diárias de

consumo da seguinte forma: >3 vezes/dia=4; 2 a 3 vezes/dia=2,5; 1 vez/dia=1; 5 a 6

vezes/semana=0,79; 2 a 4 vezes/semana=0,43; 1 vez/semana=0,14; 1 a 3 vezes/mês=0,07 e

nunca ou quase nunca=0. As porções em medidas caseiras dos alimentos referidos no QFA

foram quantificadas em gramas (g) e/ou mililitros (mL), mediante a utilização de tabela para

avaliação de consumo alimentar em medidas caseiras (Pinheiro et al., 2004).

MÉTODOS

63

Em seguida, as medidas quantificadas foram multiplicadas pelas frequências diárias de

consumo de cada alimento para calcular o consumo diário de cada alimento. A Tabela

Brasileira de Composição de Alimentos (TACO) (NEPA-UNICAMP, 2011) foi utilizada

como base de dados principal para estimar o valor energético total dos alimentos consumidos

no artigo 2. Itens alimentares não encontrados na TACO foram adicionados da tabela

americana United States Department of Agriculture (USDA, 2011).

No artigo 3 desta tese foi investigado o percentual de energia dos alimentos

ultraprocessados. Estes alimentos foram classificados de acordo com as diretrizes do Guia

Alimentar para População Brasileira (Ministério da Saúde, 2014), que considera os alimentos

ultraprocessados como formulações industriais que são total ou predominantemente

preparadas a partir de substâncias que são extraídas de alimentos (por exemplo, óleos,

gorduras, açúcar, proteínas e amido), derivados de constituintes alimentares (por exemplo,

gorduras hidrogenadas e amido modificado) ou sintetizados em laboratório a partir de

substratos alimentares ou outras fontes orgânicas (por exemplo, corantes, aromatizantes,

intensificadores de sabor e vários aditivos que são utilizados para dar aos produtos

propriedades sensoriais atraentes). Também foi considerada a classificação NOVA, que agrupa

os alimentos segundo a extensão e o propósito do processamento a que são submetidos

(Monteiro et al., 2017). O Quadro 5 apresenta os produtos alimentares que representaram o

grupo de alimentos ultraprocessados neste estudo

Quadro 5. Produtos alimentares que representaram o grupo de alimentos ultraprocessados.

Grupo de alimentos Produtos alimentares

Pães Pão/pão francês/pão de forma.

Massas Miojo/macarrão; lasanha/nhoque/ravióli.

Bolos e biscoitos Bolo; biscoito recheado; biscoito doce/Maizena®/Maria®; biscoito

salgado/cream cracker.

Fast food Pizza; batata frita, chips/palha; hambúrguer.

Snacks Salgados (risoli, coxinha, pastel, kibe); salgadinhos tipo Cheetos®, Fofura®,

Torcida®.

Gorduras Margarina; maionese.

Derivados do leite Iogurte; requeijão cremoso.

Embutidos Salsicha/salsichão/linguiça; frios (mortadela, presunto, apresuntado, salame).

Doces Sorvete; balas; Chocolate em pó/Nescau®; chocolate barra/ bombom; doce à base

de leite (pudim, doce leite).

Refrigerantes Refrigerantes à base de cola (Coca-Cola®, Pepsi®) e outros refrigerantes

(guaraná, Fanta®, Guaravita®).

Bebida alcoólica destilada Vodka.

Para os propósitos do artigo 3, os macronutrientes (lipídios, proteínas e carboidratos) e

o consumo de bebidas alcoólicas (gramas/dia) foram calculados somando dados para o

respectivo macronutriente/álcool em todos os itens alimentares. Estes valores foram então

MÉTODOS

64

convertidos em energia multiplicando a quantidade total (g) de macronutrientes/álcool pelo

número de kcalorias por grama (1 g de lipídio = 9 kcalorias, 1 g de proteína ou carboidrato =

4 kcalorias e 1 g de etanol = 7 kcalorias). As percentagens de energia derivadas das ingestões

de lipídeos, carboidratos e proteínas foram calculadas dividindo o valor energético do

macronutriente especifico pela soma de energia de todos os componentes (isto é, carboidratos,

proteínas, gorduras e álcool) e depois multiplicando por 100. A percentagem diária de energia

de alimentos ultraprocessados foi calculada dividindo a energia diária desses alimentos pela

energia total consumida (kcal) e depois multiplicando por 100.

6.9.4 Dados bioquímicos e genéticos

A coleta de amostra de sangue foi realizada por punção venosa periférica, utilizando

materiais descartáveis. A coleta foi realizada por profissional da área de enfermagem no

laboratório do CMS HB (local do estudo). Após a coleta, as amostras de sangue foram

manipuladas e acondicionadas de acordo com os protocolos de realizações dos exames

laboratoriais.

6.9.4.1 Concentração plasmática de leptina

Foram realizadas coletas de sangue venoso periférico nas participantes do estudo nos

três trimestres de acompanhamento, após jejum de 12 horas. O sangue coletado foi

imediatamente centrifugado e as alíquotas de soro armazenadas a -80oC em frasco para

criogenia contendo gás nitrogênio, até serem transportadas para o Laboratório de

Desenvolvimento de Alimentos para Fins Especiais e Educacionais (DAFEE) do INJC da

UFRJ, no qual as amostras foram armazenadas e analisadas posteriormente. A concentração

plasmática da leptina foi realizada pelo método Enzyme-linked Immunosorbent Assay

(ELISA), utilizando-se kits comerciais (Millipore, St. Charles, USA) com sensibilidade de 0,5

ng/mL.

6.9.4.2 Polimorfismos genéticos (FTO, MC4R, LEP e LEPR)

Foi realizada uma coleta de sangue no primeiro trimestre da gestação de

aproximadamente 5 mL, para determinação dos polimorfismos genéticos. O sangue foi

coletado em tubos estéreis e armazenado em ultra freezer (-80ºC) para posterior análise. A

primeira etapa da análise foi realizada no Laboratório de Metabolismo Macromolecular

Firmino Torres de Castro, do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da UFRJ, e consistiu

MÉTODOS

65

na extração total do DNA genômico a partir de leucócitos provenientes de sangue periférico

venoso pelo método do fenol clorofórmio, de acordo com protocolo em anexo (Anexo 3).

A segunda etapa foi realizada no Laboratório de Bioquímica Nutricional do INJC da

UFRJ e consistiu na amplificação do fragmento de DNA extraído para avaliação dos

polimorfismos estudados por discriminação alélica (TaqMan® Genotyping Master Mix assay,

Life Technologies – detalhe do produto no link abaixo), adotando-se a técnica da reação em

cadeia do DNA polimerase (PCR) em tempo real (StepOnePlus, Life Technologies, Guilford,

CT, USA). A acurácia dos dados obtidos foi avaliada pela análise em duplicata de 10% da

amostra, com obtenção de 99% de concordância.

Link do produto: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/TaqMan_SNP_Genotyping_Assays_man.pdf

6.10 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Foi construído banco de dados no software Stata Data Analysis and Statistical

Software (STATA), versão 12.0. Os dados foram digitados em duplicata e analisados quanto à

consistência, antes de proceder à etapa de análise. Os do-files detalhados sobre as análises

estatísticas dos dados apresentados nas tabelas principais dos artigos apresentados encontram-

se nos Apêndices A-C. Foram considerados estatisticamente significativos valores de p <

0,05.

Na Figura 8 encontra-se o detalhamento do tamanho da amostra analisado, de acordo

com os artigos apresentados nesta tese.

Abaixo serão descritas as análises estatísticas realizadas neste estudo e, em seguida,

serão apresentados nos Quadros 6A-C as análises estatísticas específicas dos Artigos desta

tese.

https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/TaqMan_SNP_Genotyping_Assays_man.pdf

MÉTODOS

66

Figura 8. Fluxograma do tamanho amostral dos artigos apresentados na tese. Abreviaturas: DCNT = Doenças crônicas não transmissíveis.

Gestantes convidadas a participar do estudo: N=322

Gestantes que concordaram participar do estudo: N = 299 (92.7%)

Mulheres elegíveis a participarem do estudo: N = 269

Amostra inicial do estudo após os critérios de elegibilidade e exclusão: N = 235

N = 211 Gestantes

Artigo 1: N = 136Não soube informar peso pré-gestacional (n=8); Não genotipagem (n=67)

Artigo 2: N = 147Glicose plasmática ≥ 126 mg/dL (n=2);Não genotipagem (n=62)

Artigo 3: N = 149Não genotipagem (n=62

sem dados do baseline (n=5)

perdas de seguimento (n=9)

abandonaram o pré-natal na unidade de estudo (n=10)

34 gestantes excluídas: Aborto (n=25); Gestação gemelar (n=4); Natimortos (n=5).

30 gestantes não atenderam aos critérios de eligibilidade:

Confirmação do diagnóstico de doenças infecciosas (n=10) e parasitárias (n=2); DCNT (n=2); >13 semanas gestacional no baseline (n=16).

MÉTODOS

67

6.10.1 Análise descritiva

Foram realizadas análises descritivas com o objetivo de verificar as características da

amostra do estudo. Procedimentos clássicos como cálculo de médias e intervalos de confiança

de 95% (IC 95%) ou desvio padrão (DP); medianas e intervalo interquartil (IQR) foram

realizados para as variáveis contínuas simétricas e assimétricas, respectivamente. Para as

variáveis categóricas foram apresentadas as medidas de frequência e proporção. Para testar

diferenças entre estratos foram utilizados os testes t de Student ou análise de variância

(ANOVA) para as variáveis simétricas e Mann–Whitney U test ou Kruskal-Wallis para as

variáveis assimétricas. Testes do chi-quadrado ou teste exato de Fisher foram utilizados para

as variáveis categóricas. A normalidade foi testada por meio da construção de histogramas e,

adicionalmente, pelo teste de Shapiro-Wilk.

6.10.2 Análise gráfica

Gráficos foram construídos a partir de análises de regressão longitudinal de efeitos

mistos com o objetivo de representar visualmente a evolução do peso materno ao longo da

gestação, de acordo com os genótipos do gene FTO-rs9939609.

6.10.3 Analise de regressão linear múltipla:

Modelos ajustados de regressão linear múltipla foram utilizados com o objetivo de

verificar a existência de associação entre as variáveis dependentes do artigo 1 (GPG e

retenção de peso pós-parto), artigo 2 (concentração plasmática de leptina por trimestre

gestacional) e artigo 3 (ingestão energética diária, percentual de energia dos macronutrientes e

dos alimentos ultraprocessados) e os polimorfismos estudados.

6.10.4 Análise de regressão de Poisson

Foi utilizada a regressão de Poisson com variância robusta para estimar os riscos

relativos (RR) e IC 95%. Esta regressão foi utilizada para estimar a associação entre os

polimorfismos estudados e as categorias de IMC pré-gestacional (< 25 e ≥ 25 kg/m2) (Artigos

1 e 2) e IMC pós-parto (< 25 e ≥ 25 kg/m2) (Artigo 1). Foi considerado o IMC ≥ 25,0 kg/m2

como categoria de excesso de peso.

Esta análise também foi utilizada para avaliar as associações entre os polimorfismos e

as categorias de GPG (insuficiente e excessivo) (Artigos 1 e 2).

MÉTODOS

68

6.10.5 Análise de regressão longitudinal de efeitos mistos

Modelos de regressão longitudinal de efeitos mistos (LME – longitudinal mixed

effects) foram empregados para avaliar se houve alteração significativa nos desfechos ao

longo da gestação, comparando entre os genótipos dos polimorfismos. As variáveis de

desfechos utilizadas nesta análise foram o peso materno (Artigos 1 e 2), concentrações de

leptina plasmática (Artigo 2), ingestão de energia total e percentual de energia dos

macronutrientes e do grupo de alimentos ultraprocessados (Artigo 3). Esses modelos de

regressão consideram a dependência entre as observações de um mesmo indivíduo e a semana

gestacional exata da análise, não agrupando as mulheres apenas por trimestre gestacional. O

modelo LME acomoda covariáveis tempo-dependentes e tempo-independentes e possibilita

analisar dados com medidas repetidas não equidistantes.

Nos modelos de regressão de LME dos Artigos 1 e 2 foi utilizada a idade gestacional

linear e quadrática (variáveis referentes ao tempo), pois as mudanças longitudinais de peso

corporal e concentração plasmática da leptina ao longo da gestação se assemelham a uma

parábola. Para o Artigo 3 foi considerada apenas a idade gestacional linear. A idade

gestacional foi analisada como variável de efeito aleatório no modelo para permitir variações

individuais no peso, nas concentrações de leptina e na ingestão de energia ao longo do tempo,

enquanto os polimorfismos e as demais variáveis foram analisados como efeitos fixos,

permitindo assim verificar o efeito da variação comum entre as mulheres.

As análises de regressão de LME do Artigo 3 foram realizadas com dados de consumo

alimentar nos dois períodos de acompanhamento (pré-gestacional e gestacional).

MÉTODOS

69

Quadro 6A. Quadro demonstrativo das técnicas de análise estatística do Artigo 1

OBJETIVO ANÁLISE ESTATÍSTICA VARIÁVEIS DEPENDENTES VARIÁVEIS DE CONTROLE

Avaliar a associação entre SNPs (FTO e

MC4R) e GPG.

Regressão linear múltipla GPG por trimestre de gestação

GPG total

Modelo 1 = sexo da criança, PAFL, idade materna,

cor da pele, paridade e idade gestacional.

Modelo 2 = Modelo 1 + IMC pré-gestacional.

Avaliar a associação entre SNPs (FTO e

MC4R) e retenção de peso pós-parto.

Regressão linear múltipla Retenção de peso pós-parto por

semana pós-parto


cor da pele e paridade.

Modelo 2 = Modelo 1 + GPG total.

Avaliar o risco relativo de excesso de peso pré-

gestacional (IMC ≥ 25,0 kg/m2), de acordo com

SNPs dos genes FTO e MC4R.

Regressão de Poisson Excesso de peso pré-gestacional Modelo 1 = PAFL, idade materna, cor da pele,

escolaridade materna, paridade e hábito de fumar.

Modelo 2 = Modelo 1 + estatura materna.

Avaliar o risco relativo de GPG insuficiente e

GPG em excesso, de acordo com SNPs dos

genes FTO e MC4R.

Regressão de Poisson GPG insuficiente

GPG em excesso


cor da pele, paridade.


Avaliar o risco relativo de excesso de peso pós-

parto (IMC ≥ 25,0 kg/m2), de acordo com SNPs

dos genes FTO e MC4R.

Regressão de Poisson Excesso de peso pós-parto Modelo 1 = PAFL, idade materna, cor da pele,

escolaridade materna, paridade e hábito de fumar.


Avaliar a trajetória do peso materno ao longo

do período da gestação, de acordo com SNPs

dos genes FTO e MC4R.

Regressão longitudinal de efeitos

mistos (LME)

Peso materno ao longodo período

da gestação

Obs.: Idade gestacional foi utilizada como variável

de efeito aleatório em todos os modelos.

Variáveis fixas:

Modelo 1 = SG e SG2.

Modelo 2 = Modelo 1 + sexo da criança,

escolaridade materna, PAFL, idade materna, cor da

pele, paridade, hábito de fumar e estatura materna.

Modelo 3 = Modelo 2 - estatura materna + IMC

pré-gestacional. Abreviaturas: SG = semana gestacional; SNP = polimorfismo de único nucleotídeo; FTO = massa de gordura e obesidade associadas; MC4R = melanocortina-4 receptor; PAFL = prática de

atividade física de lazer antes da gestação; GPG = ganho de peso gestacional; IMC = índice de massa corporal.

Notas:

Variáveis categóricas: sexo da criança; PAFL (sim ou não); cor da pele (branca e não branca); hábito de fumar (nunca fumou e fumante + ex-fumante); paridade (0, 1 e ≥ 2).

MÉTODOS

70

Quadro 6B. Quadro demonstrativo das técnicas de análise estatística do Artigo 2


Avaliar a associação entre SNPs (LEP e LEPR)

e concentrações plasmáticas de leptina.

Rregressão linear múltipla Leptina no 10 trimestre

Leptina no 20 trimestre

Leptina no 30 trimestre

PAFL, SG, idade materna, cor da pele, hábito de

fumar e peso corporal materno no trimestre.

Avaliar o risco relativo de excesso de peso pré-

gestacional (IMC ≥ 25,0 kg/m2), de acordo com

SNPs dos genes LEP e LEPR.

Regressão de Poisson Excesso de peso pré-gestacional PAFL, idade materna, cor da pele, paridade, hábito

de fumar, ingestão energética pré-gestacional e

escolaridade materna.

Avaliar o risco relativo de GPG insuficiente e

GPG em excesso, de acordo com SNPs dos

genes LEP e LEPR.

Regressão de Poisson GPG insuficiente

GPG em excesso

PAFL, SG do parto, idade materna, cor da pele,

paridade, hábito de fumar, leptina do primeiro

trimestre e IMC pré-gestacional.

Avaliar a trajetória do peso materno ao longo

do período da gestação, de acordo com SNPs

dos genes LEP e LEPR.


mistos (LME)

Peso materno ao longo do

período da gestação

Obs.: idade gestacional foi utilizada como variável

de efeito aleatório no modelo.

Variáveis fixas:

SG, SG2, PAFL, idade materna, cor da pele, hábito

de fumar, paridade, escolaridade materna e estatura

materna.

Avaliar a trajetória da concentração plasmática

de leptina ao longo do período da gestação, de

acordo com SNPs dos genes LEP e LEPR.


mistos (LME)

Concentração plasmática de

leptina ao longo do período da

gestação

Obs.: idade gestacional foi utilizada como variável

de efeito aleatório no modelo.

Variáveis fixas:

SG, SG2, PAFL, idade materna, cor da pele, hábito

de fumar e peso materno ao longo da gestação.

Abreviaturas: SG = semana gestacional; SNP = polimorfismo de único nucleotídeo; LEP = leptina; LEPR = receptor da leptina; PAFL = prática de atividade física de lazer;

GPG = ganho de peso gestacional; IMC = índice de massa corporal.

Notas:

Variáveis categóricas: PAFL (sim ou não); cor da pele (branca e não branca); hábito de fumar (nunca fumou e fumante + ex-fumante); paridade (0 e ≥ 1).

MÉTODOS

71

Quadro 6C – Quadro demonstrativo das técnicas de análise estatística do Artigo 3


Avaliar a associação entre SNPs (FTO, MC4R,

LEP e LEPR) e ingestão energética (kcal/dia)

durante os períodos pré-gestacional e

gestacional.

Regressão linear múltipla Ingestão energética total:

Pré-gestacional e gestacional

Modelo ajustado

idade materna, cor da pele, paridade, SG do 10

trimestre, renda per capita, IMC pré-gestacional.


LEP e LEPR) e % energético dos

macronutrientes durante os períodos pré-

gestacional e gestacional.

Regressão linear múltipla % de energia CHO

% de energia PRO

% de energia LIP

Pré-gestacional e gestacional

Modelo ajustado

idade materna, cor da pele, paridade, SG do 10



LEP e LEPR) e % energético dos alimentos

ultraprocessados durante os períodos pré-


Rregressão linear múltipla % de energia dos alimentos

ultraprocessados

Pré-gestacional e gestacional:

Modelo ajustado

idade materna, cor da pele, paridade, SG 10


Avaliar a trajetória da ingestão energética

materno ao longo do período da gestação, de

acordo com SNPs dos genes FTO, MC4R, LEP

e LEPR.


mistos (LME) * Considerando as gestantes com QFA nos 2 pontos.

Ingestão energética total ao longo

do período da gestação

Obs.: Idade gestacional foi utilizada como

variável de efeito aleatório no modelo.

Variáveis fixas:

SG, idade materna, cor da pele, paridade, renda

per capita, IMC pré-gestacional.

Avaliar a trajetória do % energético dos

macronutrientes ao longo do período da

gestação, de acordo com SNP dos genes FTO,

MC4R, LEP e LEPR.


mistos (LME) * Considerando as gestantes com QFA

nos 2 pontos.

% de energia CHO ao longo da

gestação

% de energia PRO ao longo da

gestação

% de energia LIP ao longo da

gestação

Obs.: SG (idade gestacional) foi utilizada como


Variáveis fixas:


per capita, IMC pré-gestacional.

Avaliar a trajetória do % energético dos

alimentos ultraprocessados ao longo do período

da gestação, de acordo com SNP dos genes

FTO, MC4R, LEP e LEPR.


mistos (LME) * Considerando as gestantes com QFA

nos 2 pontos.

% de energia dos alimentos

ultraprocessados ao longo da

gestação.

Obs.: SG (idade gestacional) foi utilizada como


Variáveis fixas:


per capita, IMC pré-gestacional. Abreviaturas: CHO = carboidratos; PRO = proteínas; LIP = lipídeos; SG = semana gestacional; SNP = polimorfismo de único nucleotídeo; FTO = massa de gordura e obesidade associadas;

MC4R = melanocortina-4 receptor; LEP = leptina; LEPR = receptor da leptina; IMC = índice de massa corporal; PAFL = prática de atividade física de lazer.

Notas:

Variáveis categóricas: PAFL (sim ou não); cor da pele (branca e não branca); hábito de fumar (nunca fumou e fumante + ex-fumante); paridade (0 e ≥ 1).

RESULTADOS

72

7. RESULTADOS

A seção de resultados foi dividida em três artigos elaborados para a tese de doutorado,

sendo o primeiro publicado, o segundo aceito para publicação e o terceiro submetido para

publicação.

7.1 Artigo 1

Association of the FTO (rs9939609) and MC4R (rs17782313) gene polymorphisms with

maternal body weight during pregnancy.

Associação dos polimorfismos dos genes FTO (rs9939609) e MC4R (rs17782313) com o

peso corporal materno durante a gestação.

7.2 Artigo 2

Leptin (rs7799039) and leptin receptor (rs1137101) gene polymorphisms and body weight

changes and leptin concentrations throughout pregnancy.

Polimorfismos nos genes da leptina (rs7799039) e do receptor da leptina (rs1137101) e

mudanças do peso corporal e das concentrações de leptina ao longo da gestação.

7.3 Artigo 3

Associations between obesity candidate gene polymorphisms (FTO, MC4R, LEP and LEPR)

and dietary intake in pregnancy women.

Associações entre polimorfismos nos genes candidatos à obesidade (FTO, MC4R, LEP e

LEPR) e ingestão dietética em mulheres gestantes.

RESULTADOS (Artigo 1)

73

7.1 ARTIGO 1.

ASSOCIATION OF THE FTO (RS9939609) AND MC4R (RS17782313) GENE

POLYMORPHISMS WITH MATERNAL BODY WEIGHT DURING PREGNANCY (Anexo 4)

Publicado no periódico Nutrition em 2016 (v. 32, n. 11, p. 1223-1230, 2016)

Abstract

Objective: Fat mass and obesity (FTO) and melanocortin 4 receptor (MC4R) genes have been

consistently associated with the risk of obesity, but few studies have examined the association

of the obesity-risk alleles with gestational outcomes. Our aim was to evaluate the association

between single-nucleotide polymorphisms (SNPs) of the FTO (rs9939609) and MC4R

(rs17782313) genes with changes in maternal body weight during pregnancy.

Methods: A sample of 136 pregnant women were followed in a prospective cohort at 5-13,

20-26 and 30-36 gestational weeks and 30-45 days postpartum. SNPs were analyzed by real-

time PCR. Associations between polymorphisms and the outcomes were investigated through

longitudinal linear mixed-effects models, multiple linear regression models and Poisson

regression models.

Results: A SNP in the FTO (rs9939609) gene but not in the MC4R (rs17782313) gene was

significantly associated with pre-pregnancy BMI ≥ 25 kg/m2 (RRFTO=2.1; 95%CI 1.4 to 3.1).

Neither SNP was statistically associated with excessive gestational weight gain (GWG) and

postpartum weight retention (PPWR). For FTO (rs9939609) gene, women with the AA

genotype were heavier in the body weight trajectory of pregnancy, but not when their weight

had been adjusted for pre-pregnancy BMI (βFTO=0.5 kg; 95%CI -1.9 to 3.0). These women

started pregnancy heavier but gained less weight (FTO*gestational age=-0.1; 95%CI: -0.2 to

0.03) when compared to those with at least one T allele.

Conclusions: The FTO (rs9939609) AA genotype is positively associated with pre-pregnancy

excessive weight. We found no evidence of a significant effect of the MC4R (rs17782313) or

the FTO (rs9939609) gene polymorphisms on the GWG and PPWR.

Keywords: pregnancy, weight gain, weight retention, polymorphism, cohort study.


74

Introduction

Pregnancy is a complex process in women lifecycle, in which several metabolic

adaptations happen to support fetal development, delivery and lactation. Excessive gestational

weight gain (GWG) is associated with increased risks of pregnancy-induced hypertension,

caesarean delivery and a large-for-gestational age infant [1, 2]. It is also the primary factor

contributing to increased postpartum weight retention [3, 4] and may contribute to the

epidemic of obesity among women of childbearing age [5, 6].

An individual’s susceptibility to obesity is thought to result from a combination of

their genetics, behavior and environment [7, 8]. Genetic factors play an important role in the

development of obesity. Up to date, several single nucleotide polymorphisms (SNPs) of

obesogenic genes associated with the increased risk of overweight or obesity and with

behavioral risk factors have been published [8, 9]. In particular, the variant rs9939609 T/A of

the fat mass and obesity-associated protein (FTO) gene, located in the intron 1 on

chromosome 16q12.2 [10], and the variant rs17782313 T/C of the melanocortin-4 receptor

(MC4R) gene, mapped 188 kb downstream of the gene and encoded by a single exon gene on

chromosome 18q22 [11], have been well documented as major contributors to obesity

populations [10, 12-15].

Given the relevance of maternal and fetal fat to overall GWG, it is conceivable that

genetic variants that are known to be associated with adiposity might be associated with

GWG [16]. To the best of our knowledge, few studies were able to investigate the

longitudinal association between polymorphism (FTO and MC4R) and the body weight

throughout pregnancy. The results are still inconclusive [16-18], requiring more research for

elucidating the role of these genetic markers on pregnancy body weight change. Thus, the aim

of the present study was to examine the association of the FTO (rs9939609) and MC4R

(rs17782313) gene polymorphisms with changes in maternal body weight during pregnancy.

Methods

Study design

We analyzed data of a prospective cohort of pregnant women who received prenatal

care at public health center in the city of Rio de Janeiro, Brazil, from November 2009 to

October 2011. Data were collected at three time points during the pregnancy: 5th to 13th (first


75

trimester), 20th to 26th (second trimester) and 30th to 36th (third trimester) gestational weeks

and in early postpartum (30 to 45 days).

Pregnant women were enrolled in the cohort if they were between their 5th and 13th weeks of

gestation, between 20 and 40 years of age, without any history of infectious or chronic

diseases (except obesity) and had the intention to attend the prenatal care in the selected

public health center.

Figure 1 shows the flow the recruitment and selection of the participants from the

current study. At enrollment, 299 women were interviewed, and only those meeting the

eligibility criteria were included in the baseline sample and follow-up. Women were excluded

for the following reasons: confirmed pre-gestational infection diagnosis or non-communicable

diseases (n=14), > 13 gestational weeks at enrollment (n=16), or abandoned prenatal care at

the public health center (n=10). We further excluded from the analysis pregnant women who

suffered stillbirths (n=5) or miscarriages (n=25); had twin pregnancies (n=4); did not attend

the baseline visit (n=5); were missing self-reported pre-pregnancy weight (n=8); and were lost

to follow-up (n=9). We also excluded data from 67 participants because we did not have

genotype SNPs. After these exclusions data from 136 participants were available for analysis.

In general, no differences were observed in relation to the anthropometric and

socioeconomic variables when we compared women who were lost to genotyping with those

who had data; although, the women included in this study were younger and presented a

lower frequency of pre-pregnancy LTPA than those without genetic information

(Supplementary Table 1). However, the analyses of outcomes of interest were adjusted for

these variables.

Anthropometric measurements

At enrollment, the women were asked to record their pre-pregnancy weight. Their

weights (kg) were measured during pregnancy and postpartum using a digital scale (Filizzola

PL 150, Filizzola Ltda, Brazil). We also obtained the weight recorded in the last visit of

prenatal care (36th to 42th week). Height (cm) was measured only in the first trimester using a

portable stadiometer (Seca Ltda, Hamburg, Germany).

Pre-pregnancy body mass index (BMI) [weight (kg)/height2 (m)] was calculated using

the self-reported pre-pregnancy weight, and the postpartum BMI, by using the weight

measured in the early postpartum.


76

Total GWG (kg) was estimated using the difference between the last weight measured

prior to delivery and the self-reported pre-pregnancy weight. Maternal weight gains up to the

first, second and third trimesters were calculated and divided by the weeks of gestation. In

addition, women were classified according to categories of GWG (insufficient, normal and

excessive) based on the Institute of Medicine (IOM) recommendations [19].

Postpartum weight retention (PPWR) was calculated by the difference between the

early postpartum weight and the self-reported pre-pregnancy weight.

The gestational age (weeks) was estimated based on the first ultrasound performed

prior to the 24th week of gestation. For those without an ultrasound or when the first

ultrasound was performed after the 24th week of gestation, the gestational age was calculated

based on the reported date of the last menstrual period (n=2).

Covariates

Structured interviews were conducted to obtain the following maternal data: maternal

age at baseline (years), self-reported skin color (white/black or mixed), living with partner

(yes/no), education (years of schooling), self-reported pre-pregnancy leisure-time physical

activity (LTPA) (no/yes), smoking habit (non-smoking, former smoker and current smokes),

parity (number of deliveries) and the sex of the child. The total energy intake (kcal/d) was

assessed with a validated food frequency questionnaire (FFQ) [20], which was administered

in the first and third trimesters of the pregnancy.

Genotyping

At baseline visit, blood samples (5 ml) were collected, processed and stored at -80º C

until polymorphisms analysis. DNA was extracted by phenol-chloroform method. SNP

rs17782313 and rs9939609 of the MC4R and FTO genes, respectively, were analyzed by Real

Time PCR amplification (StepOnePlus™, Life Technologies) using an allelic discrimination

assay (TaqMan® Genotyping Master Mix assay, Life Technologies). Duplicates were

performed in 10% of sample with ≥ 99% agreement rates.

Statistical analyses

The continuous variables in asymmetric distributions were expressed as the medians

and interquartile range (IQR), whereas the measurement data in symmetric distributions were


77

presented as the means and standard deviations (SD) and absolute and relative frequencies to

describe categorical ones.

We employed additive and recessive models for the FTO (rs9939609) gene because

previous studies had demonstrated that one risk allele has little or no effect and two are

required to cross the threshold [10] [12]. We employed only the dominant model for the

MC4R (rs17782313) gene because the number of minor allele homozygotes was small in our

sample (n=4). The participants were further classified into two groups to investigate the

combined effect of MC4R (rs17782313) and FTO (rs9939609): (1) those with at least one risk

allele of each polymorphism or (2) those carrying only one risk allele from one of the

polymorphisms or none of the risk alleles.

Multiple linear regression models were performed to examine the associations

between the changes in maternal body weight, assessed as GWG and PPWR and the maternal

genotypes. In addition, Poisson’s regression with robust variance was used to address the

association between genotypes and GWG categories according to IOM [19] and also with pre-

pregnancy BMI classified into two categories (<25 or ≥25 kg/m²), allowing an estimation of

the relative risks (RR) and it’s 95% confidence interval (95% CI).

Longitudinal linear mixed-effects (LME) models were performed to test the

association between the polymorphisms and weight trajectories during pregnancy. These

models do not assume linear weight gain over the period of gestation but allow for the

gradient of weight across pregnancy. LME models account for random variation among

individuals and between individuals [21], which allows for the estimation of subject-specific

means. These models also account for unbalanced data due to measurements at irregular time

points of observation. Gestational age (weeks) was included in all models both as random and

fixed effects to adjust for variations in weight over time. The FTO/MC4R polymorphisms and

all other covariates were analyzed as fixed-effects. The quadratic gestational age term was

included in all models to adjust for the longitudinal changes in weight during pregnancy that

resemble a parabola. We also tested the interaction term between genotypes and gestational

age to evaluate whether the association between weight and genotypes differed between the

gestational weeks. The dependencies in the data were handled with an unstructured

covariance matrix.

The multivariable analyses were adjusted for potential confounders. Covariates were

chosen as potential confounding factors based on the biological plausibility of the association

and their p-values in the bivariate analysis with each of the outcome variables. All covariates


78

that presented a p-value ≤0.20 in the bivariate analysis were selected to compose the final

model of each outcome variable in the regression analyses. Because the association between

pre-pregnancy BMI and gestational weight gain is nonlinear, both linear and quadratic terms

were included in the models.

Different models were constructed for each outcome and we used the restricted log-

likelihood and Akaike’s information criterion as global fit criteria to select the best model. A

significance level at 5% was considered in all the analysis. Statistical analyses were

performed using STATA software (version 12.0, College Station, Texas, USA).

Ethical procedures

The study protocol was approved by the Ethics Committee of the Municipality

Secretary of Health of Rio de Janeiro City (Protocol number: 0139.0.314.000-09). All

subjects enrolled in this study gave written informed consent for their participation after an

explanation of the study.

Results

The median age of participants was 27 (IQR: 22 to 31) years old, and 73.5% women

reported as having black or mixed skin color (Table 1).

The genotype frequencies were TT=33.8%, AT=49.3% and AA=16.9% for the FTO

(rs9939609) and TT=64.0%, CT=33.1% and CC=2.9% for the MC4R (rs17782313). These

frequencies were in Hardy–Weinberg equilibrium for both SNPs.

The AA genotype of the FTO (rs9939609) gene, for the additive and recessive models,

was significantly associated with higher pre-pregnancy mean weights (p=0.01; p<0.01,

respectively) and BMI (p<0.01) and with higher gestational body weight at the first (p=0.02;

p=0.01, respectively) and the second (p=0.05; p=0.02, respectively) trimesters in comparison

to the other genotypes, but not with maternal height. Women having the polymorphic MC4R

(rs17782313) genotype did not show any statistically significant difference for pre-pregnancy

weight, BMI or maternal height (Table 1).

Women with the AA genotype of the FTO (rs9939609) gene presented a higher risk of

pre-pregnancy excessive weight compared to those with AT/TT genotypes (RR=2.1; 95%CI

1.4 to 3.1), even after adjustment for maternal pre-pregnancy LTPA, age, skin color,

education, parity, smoking and height (Table 2).


79

The risk alleles of both polymorphisms were no longer statistically associated with

GWG after adjusting for pre-pregnancy BMI. In our adjusted models, neither the FTO

(rs9939609) (RR=0.9; 95%CI 0.5 to 1.6) nor the MC4R (rs17782313) (RR=1.1; 95%CI 0.7 to

1.7) risk alleles were associated with a higher risk of excessive GWG according to IOM

guidelines (Table 2). Similar results were found for the combined effect of the MC4R

(rs17782313) and FTO (rs9939609) (Supplementary Table 2).

We did not find a significant association between these SNPs and the PPWR (Tables 1

and 2). Women with the AA genotype were at a higher risk of postpartum overweight than

the TT/AT carriers (RR=1.7; 95%CI 1.3 to 2.3); however, this result lost significance after

adjustment for the pre-pregnancy BMI (RR=1.0; 95%CI 0.8 to 1.2) (Table 2).

Homozygous women for the A allele of the FTO (rs9939609) gene were

approximately 9 kg heavier during pregnancy, compared to those with the TT/AT alleles in

our adjusted models for gestational age, education, smoking, skin color, sex of the child, age,

pre-pregnancy LTPA, parity and height. The result lost significance after adjustment for the

pre-pregnancy BMI (βFTO=0.5 kg; 95%CI -1.9 to 3.0) (Table 3). Women with the AA

genotype of the FTO (rs9939609) gene presented a lower rate of change of weight trajectories

during pregnancy (βFTO*time =-0.1; 95%CI -0.2 to -0.03), compared to those with the TT/AT

(Supplementary Figure 1 and Table 3). We found no association between the

MC4R (rs17782313) polymorphism and weight trajectories during pregnancy in our adjusted

models for gestational age, education, smoking, skin color, sex of the child, age, pre-

pregnancy LTPA, parity and pre-pregnancy BMI (Table 3).

Discussion

This study has three main findings. First, we observed that the FTO (rs9939609)

polymorphism but not the MC4R (rs17782313) polymorphism was positively associated with

pre-pregnancy excessive weight. Secondly, we did not find a significant association between

any of the polymorphisms and GWG or PPWR. Finally, we observed that women who were

homozygous for the FTO (rs9939609) risk allele were heavier when beginning pregnancy but

gained less weight throughout gestation than those with the AT or TT genotypes.

We investigated the FTO SNP rs9939609 and the MC4R SNP rs17782313 in our

study because they have shown to have a strong association with body weight in previous

studies [10, 12-15]. The association of these genes polymorphisms with the obesity phenotype


80

in a multiethnic group such as the Brazilian population has not been previously reported. The

minor allele frequency observed in this study (0.42 and 0.20 for rs9939609 A-allele and

rs17782313 C-allele, respectively) were quite similar to those in the international HapMap

project CEU data (0.45 and 0.26, respectively) and within the range of reported values

in other studies (0.44 and 0.24, respectively) [10, 14].

The mechanisms underlying the physiological relationship between FTO (rs9939609)

and MC4R (rs17782313) and alterations of body weight are yet to be elucidated. It is known

that FTO and MC4R are highly expressed in the hypothalamic region [22, 23], an area that is

known to be involved in the regulation of appetite. Habitual diet is one of the many

environmental factors that potentially contribute to inter-individual differences in body fat

mass. In this study, we did not find significant association between FTO SNP rs9939609 and

MC4R SNP rs17782313 with energy intake, which is in line with the findings of Hasselbalch

et al. [24], but inconsistent with the findings of other studies [25, 26]. The dietary information

collected on our study is based on an extensive self-reported FFQ and several components of

dietary intake were studied.

We identified that pregnant women with the risk alleles (AA) of FTO (rs9939609) had

a higher risk to have pre-pregnancy overweight BMI (RR=2.1 (95%CI 1.4-3.1, p<0.01),

which is consistent with the findings of Lawlor et al. [16] study, where FTO (rs9939609) was

associated with pre-pregnancy BMI. These British pregnant women presented mean

difference per risk allele of 0.40 kg/m2 (95%CI 0.25-0.54). In contrast, Groth et al. [18]

reported that the FTO (rs9939609) risk alleles were not associated with pre-pregnancy BMI in

a study of low-income black pregnant women. Our sample is composed of low-income

women, but the degree of miscegenation in Brazil is very high and the racial/ethnic

composition of this study was based only in self-reported skin color (73.5% black or mixed).

Different populations are exposed to the different environmental and genetic influences that

may interact with genetic variants. On the other hand, our results are consistent with

investigations that have indicated that FTO plays a key role in changes in adiposity-related

phenotypes in populations around the world [12, 13, 27].

In our study, carriers of two copies of the risk allele of FTO (rs9939609) had

significantly higher body weight than the homozygous subjects showing the major allele,

which is in agreement with the results of previous studies [10, 28].

Common variants near MC4R have been reproducibly associated with the fat

mass, weight and risk of obesity [9, 14, 29]. Lawler et al. [16] found no association between


81

MC4R (rs17782313) and pre-pregnancy BMI but found a positive association with the pre-

pregnancy weight (p=0.001). Such association was not observed in our study. Other studies

have also failed to find a significant association [30, 15].

A longitudinal study investigating the life-course effects of variants in the FTO gene

(rs9939609) and near the MC4R gene (rs17782313) demonstrated that the effects strengthen

throughout childhood and peak at age 20 before weakening during adulthood [31]. In our

study, at baseline, the median maternal age was 27 (IQR: 22 to 31) years old. The effects of

the FTO and MC4R genes on pre-pregnancy weight may have occurred due to the effects of

the genes on promoting weight gain during the youngest age and may continue at the same

level throughout life, depending on the effect size of the polymorphism and exposure to an

obesogenic environment [30].

In this study, no association was found between the risk alleles of the FTO/MC4R

genes with GWG by trimester, total GWG and risk of excessive GWG, according to the IOM

categories in our adjusted models. Lawlor et al. [16] indicated that the FTO (rs9939609) and

MC4R (rs17782313) genes were not statistically associated with GWG by the period of

pregnancy and by IOM categories. Stuebe et al. [17] found higher GWG among African

American participants with two MC4R (rs17782313) risk alleles compared with women with

no MC4R (rs17782313) risk alleles but among Caucasian women, MC4R carriage was

inversely associated with weight gain. For FTO (rs9939609) gene, Stuebe et al. [17] reported

that Caucasian women homozygous for the risk allele, so in thin as in obese, gained more

weight than low-risk allele carriers, but among women of average pre-pregnancy BMI, weight

gain was similar in spite of allele carriage; although, they found no association between this

SNP and the greater GWG. GWG includes several other components (i.e. the fetus, amniotic

fluid, and placenta). In addition, during pregnancy, women go through many biological,

hormonal and behavioral changes, which could have the potential to mask smaller genetic

associations and may interact and modify the susceptibility to obesity by the FTO and MC4R

variants, influencing the genetic contributions on GWG [19].

We observed that women with the AA genotype of the FTO (rs9939609) gene had

higher body weight during pregnancy; however, the association was no longer significant

after adjustment for the pre-pregnancy BMI. These women gained less weight compared to

those with the AT/TT genotypes based on the LME models. This discrepancy might reflect

the fact that obese women tend to gain less weight during pregnancy [32]. We also did not


82

find an association between the MC4R (rs17782313) polymorphism and weight trajectories

during pregnancy.

We did not observe an association between the FTO (rs9939609) and MC4R

(rs17782313) polymorphisms on the PPWR at <45 days after adjustment for the pre-

pregnancy BMI, which is in agreement with the study by Lawlor et al. [16], where the PPWR

was calculated at approximately 8 weeks after delivery. The PPWR is presumably due to a

combination of several factors, such as dietary intake, lack of physical activity, lactation,

smoking status, pre-pregnancy BMI, GWG and parity [33] and also genetics [4].

Our study has strengths and limitations. The main strength is the availability of

standardized longitudinal weight measurements across pregnancy, which allowed analysis of

the genetic associations with the changes of body weight over time. In addition, we controlled

our results for important confounding variables, such as gestational age, education, smoking,

skin color, pre-pregnancy LTPA, age and parity. On the other hand, some limitations from our

study must be highlighted. We relied on self-reported pre-pregnancy weight as is the case in

most studies of GWG, and misclassification of GWG may not be ruled out as for women who

inaccurately reported their pre-pregnancy weights. However, previous studies have shown

that self-reported pre-pregnancy weight is a good approximation of the true weight [34, 35].

Another limitation of our study is the small sample size, which resulted in a lower power for

detecting a statistically significant effect of the polymorphism in the weight changes during

pregnancy. Besides that, we were able to find that FTO (rs9939609) polymorphism showed

some association with pre-pregnancy BMI, but not with MC4R (rs17782313) polymorphism.

This could be due to the lower power of the study, or indeed, to a real small effect size in this

relationship. Our results agreed in the direction and significance of the association when

compared to the other two studies on the same topic (Lawlor and Stuebe), that definitely

presented a bigger sample size to detect an effect size for the studied polymorphisms [16, 17].

In conclusion, our study found that the SNP in the FTO gene (rs9939609) but not in

the MC4R gene (rs17782313) was significantly associated with pre-pregnancy excessive

weight. However, these women gained less weight throughout gestation than women with the

AT and TT genotypes, and neither of the polymorphisms were statistically associated with

excessive GWG and PPWR. The characterization of effects of the genetic factor implicated in

weight gain during pregnancy and postpartum may potentially guide targeted intervention for

preventing obesity and the avoidance of adverse pregnancy complications. However, further

replications of association studies with different ethnicities and larger cohorts or cohort


83

consortiums and a sampling strategy that collects additional time points throughout the

pregnancy are necessary to improve our understanding of the specific roles of FTO and MC4R

in gestational weight.


84

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87

Figure 1 - Flowchart illustrating the recruitment and selection of the study population

Pregnant women at enrollment: 299

Folow-up: 259 participants

225 participants

203 participants of the current study

Final sample136 participants included in study with FTO and MC4R data

64 did not have blood samples forgenotyping and 03 had onlygenotiping for one of thepolymorphisms.

Miscarriage [n=25]

Stillbirth [n=05]

Losses to follow-up: only information at baseline [n=09].

Twin pregnancies [n=4]

40 did not meet eligibility criteria: confirmed pre-gestationalinfection diagnosis or noncommunicable diseases [n=14], >13gestational weeks at enrollment [n=16] or abandoned prenatal careat the public health center [n=10].

13 Missing data: did not attendbaseline visit [05], missing self-reported pre-pregnancy weight[n=08].


88

Table 1 - Maternal characteristics according to the FTO (rs9939609) and the MC4R (rs17782313) gene polymorphisms

Characteristic N

Total

FTO (rs9939609)

MC4R (rs17782313)

Recessive model Additive model Dominant model

TT/AT AA p-value TT AT AA p TT CT/CC p-value

Descriptive

Maternal age1, years 136

27 (22 to 31) 27 (23 to 31) 24 (22 to 32) 0.36 27 (23 to 31) 27 (22 to 31) 24 (22 to 32) 0.60 27 (22 to 32) 27 (22 to 31) 0.90

Self-reported skin color2 136

Black or mixed 100 (73.5) 85 (75.2) 15 (65.2) 0.32 32 (69.6) 53 (79.1) 15 (65.2) 0.32 651(70.1) 39 (79.6) 0.23

Education1, years 136 9 (6 to 11) 9 (6 to 11) 9 (7 to 11) 0.96 8.5 (5 to 11) 10 (7 to 11) 9 (7 to 11) 0.12 10 (6 to 11) 9 (6 to 11) 0.73

Living with partner2 136

Yes 111 (81.6) 93 (82.3) 18 (78.3) 0.77 41 (89.1) 52 (77.6) 18 (78.3) 0.26 71 (81.6) 40 (81.6) 0.99

Smoking habit at baseline2 136

Non-smoking 97 (71.3) 80 (70.8) 17 (73.9) 0.76 31 (67.4) 49 (73.1) 17 (73.9) 0.77 61 (70.1) 36 (73.5) 0.68

Pre-pregnancy LTPA2 134

No 108 (80.6) 88 (79.3) 20 (87.0) 0.56 36 (80.0) 52 (78.8) 20 (87.0) 0.69 67 (78.8) 41 (83.7) 0.49

Parity2 136

0 55 (40.4) 45 (39.8) 10 (43.5)

0.38

16 (34.8) 29 (43.3) 10 (43.5)

0.59

39 (44.8) 16 (32.6)

0.18 1 45 (33.1) 40 (35.4) 5 (21.7) 17 (37.0) 23 (34.3) 5 (21.7) 24 (27.6) 21 (42.9)

≥2 36 (26.5) 28 (24.8) 8 (34.8) 13 (28.2) 15 (22.4) 8 (34.8) 24 (27.6) 12 (24.5)

Sex of the child2 134

Male 64 (47.8) 54 (48.2) 10 (45.5) 0.81 18 (40.0) 36 (53.7) 10 (45.4) 0.35 48 (55.8) 16 (33.3) 0.01

Calorie intake1, kcal/d 133 2279.7

(1895.1 to

2641.7)

2251.6 (1905.7 to

2610.7)

2567.5 (1648.5 to

2995.7)

0.51 2397.2

(1897.2 to

2713.8)

2199.1 (1963.8 to

2590.7)

2567.5 (1648.5 to

2995.7)

0.70 2361.8

(1883.1 to

2713.8)

2186.4 (1907.6 to

2609.3)

0.68

Self-reported pre-pregnancy weight3, kg 136 62.7 + 12.9 61.2 + 12.3 70.1 + 13.4 <0.01 61.8 + 11.4 60.7 + 13.0 70.1 + 13.4 0.01 61.5 + 13.0 64.7 + 12.6 0.16

Maternal height3, cm 136 159.5 + 6.5 159.4 + 6.4 160.1 + 6.8 0.62 159.9 + 6.2 159.1 + 6.6 160.1 + 6.8 0.72 158.9 + 5.8 160.7 + 7.5 0.12

Pre-pregnancy BMI3, kg/m2 136 24.6 + 4.5 24.0 + 4.2 27.4 + 5.3 <0.01 24.1 + 4.1b 23.9 + 4.3b 27.4 + 5.3a <0.01 24.3 + 4.9 25.0 + 3.9 0.43

Pregnancy weight in 1st trimester3, kg 136 63.8 + 12.5 62.5 + 12.1 70.2 + 12.8 0.01 62.7 + 11.4b 62.4 + 12.7b 70.2 + 12.8a 0.02 62.8 + 12.5 65.7 + 12.4 0.19

Pregnancy weight in 2nd trimester3, kg 128 68.6 + 12.2 67.4 + 12.0 74.1 + 12.0 0.02 68.4 + 11.6 66.7 + 12.4 74.1 + 12.0 0.05 67.4 + 11.9 70.7 + 12.7 0.14

Pregnancy weight in 3rd trimester 3, kg 135 75.3 + 12.5 74.4 + 12.6 79.7 + 11.0 0.06 75.0 + 11.6 73.9 + 13.3 79.7 + 11.1 0.16 74.4 + 11.9 76.8 + 13.5 0.30

Postpartum weight retention3, kg 122 3.9 + 5.4 4.2 + 5.2 2.4 + 6.3 0.18 3.8 + 5.1 4.4 + 5.4 2.4 + 6.3 0.36 4.3 + 5.4 3.2 + 5.5 0.26

Abbreviations: FTO - fat mass and obesity-associated gene; MC4R - melanocortin-4 receptor gene; LTPA - leisure time physical activity; BMI - body mass index.

Data are presented as: 1median (IQR), p-value refers to Mann-Whitney U test or Kruskal-Wallis; 2absolute frequency (%), p-value refers to Pearson χ2 tests or Fisher's exact test; 3mean + SD, p-value refers to Student's t test or analysis of variance (ANOVA). Different letters in the same row indicate significant differences (Tukey's test p < 0.05).


89

Table 2 - Associations of adiposity risk alleles (FTO and MC4R) with body weight changes before, during pregnancy and early postpartum

FTO recessive model (rs9939609) risk alleles (AA) MC4R dominant model (rs17782313) risk alleles (CT/CC)

Characteristics Crude Adjusted Crude Adjusted

Model 1 Model 2 Model 1 Model 2

β (95% CI) β (95% CI) β (95% CI) β (95% CI) β (95% CI) β (95% CI)

GWG in 1st trimester1, g/wk -163.4 (-345.5 to 18.7) -168.5 (-358.0 to 21.0) -74.4 (-265.6 to 116.8) 10.5 (-131.2 to 152.2) 43.9 (-105.7 to 193.5) 93.7 (-52.3 to 239.6)

GWG in 2nd trimester1, g/wk -94.8 (-196.1 to 6.5) -100.1 (-205.4 to 5.2) -56.8 (-162.1 to 48.5) -2.4 (-82.9 to 78.0) 33.2 (-50.9 to 117.3) 40.2 (-41.4 to 121.7)

GWG in 3rd trimester1, g/wk -85.0 (-184.5 to 14.5) -77.6 (-178.5 to 23.4) -90.9 (-196.3 to 14.6) 25.6 (-53.8 to 104.9) 36.9 (-43.4 to 117.1) 26.0 (-56.2 to 108.2)

Total GWG1, kg -3.6 (-6.2 to -1.1)* -3.4 (-6.1 to -0.7)* -1.9 (-4.5 to 0.7) -0.8 (-2.8 to 1.3) -0.1 (-2.2 to 2.1) 0.3 (-1.7 to 2.4)

PPWR2†, g/wk -505.9 (-1064.4 to 52.6) -474.2 (-1057.5 to 109.0) 131.2 (-166.6 to 428.9) -265.8 (-690.4 to 158.8) -170.4 (-611.0 to 270.2) -80.0 (-298.9 to 138.9)

RR pre-pregnancy BMI3 ‡

overweight (BMI ≥25 kg/m2) 2.2 (1.4 to 3.2)** 2.1 (1.4 to 3.1)** 2.1 (1.4 to 3.1)** 1.0 (0.6 to 1.6) 1.1 (0.7 to 1.7) 1.1 (0.7 to 1.7)

RR total GWG by IOM category4 ‡

insufficienta 0.8 (0.5 to 1.5) 0.8 (0.5 to 1.4) 0.8 (0.4 to 1.5) 0.9 (0.6 to 1.3) 0.9 (0.5 to 1.5) 0.9 (0.5 to 1.4)

excessiveb 1.0 (0.5 to 1.7) 1.0 (0.6 to 1.7) 0.9 (0.5 to 1.6) 1.0 (0.7 to 1.5) 1.1 (0.7 to 1.7) 1.1 (0.7 to 1.7)

RR postpartum BMI5 ‡

overweight (BMI ≥25 kg/m2) 1.7 (1.3 to 2.2)** 1.7 (1.3 to 2.3)** 1.0 (0.8 to 1.2) 1.1 (0.8 to 1.5) 1.2 (0.8 to 1.6) 0.9 (0.7 to 1.2)

Abbreviations: FTO - fat mass and obesity-associated gene; MC4R - melanocortin-4 receptor; GWG - gestational weight gain; CI - confidence interval; RR - relative risk; PPWR - postpartum

weight retention. *p<0.05; **p<0.01 † Calculated as the difference between post- and pre-pregnancy weights and adjusted for weeks since birth. ‡ Note that estimates in this row is relative risk (RR); Wald tests were used to derive the p values. 1Model 1 was adjusted for sex of the child, pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported, parity and gestational age; Model 2= Model 1 plus pre-pregnancy BMI (linear and

quadratic terms). 2Model 1 was adjusted for sex of the child, pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported and parity; Model 2= Model 1 plus total weight gain. 3Model 1 was adjusted for pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported, years of education, parity and smoking maternal status; Model 2= Model 1 plus maternal height. 4Model 1 was adjusted for sex of the child, pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported and parity; Model 2= Model 1 plus pre-pregnancy BMI (linear and quadratic terms). 5Model 1 was adjusted for pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported, years of education, parity and smoking maternal status; Model 2= Model 1 plus pre-pregnancy BMI

(linear and quadratic terms). aPre-pregnancy BMI: 18.5-24.9 kg/m2 (GWG <11.5 kg); 25.0-29.9 kg/m2 (GWG <7.0 kg); ≥ 30.0 kg/m2 (GWG <5.0 kg). bPre-pregnancy BMI: 18.5-24.9 kg/m2 (GWG >16.0 kg); 25.0-29.9 kg/m2 (GWG >11.5 kg); ≥ 30.0 kg/m2 (GWG >9.0 kg).


90

Table 3 - Longitudinal analysis between FTO (rs9939609), MC4R (rs17782313) and trajectory of body weight during pregnancy

Model 11 Model 22 Model 33

β† (95% CI) p‡ β† (95% CI) p‡ β† (95% CI) p‡

Trajectory of maternal weight*

FTO (rs9939609)

TT or AT vs. AA 8.7 (3.2 to 14.2) 0.002 8.7 (3.9 to 13.6) <0.001 0.5 (-1.9 to 3.0) 0.667

Interaction term

FTO#gestational age -0.1 (-0.2 to -0.03) 0.004 -0.1 (-0.2 to -0.03) 0.007 -0.1 (-0.2 to -0.03) 0.007

Likelihood -1885.544 -1791.901 -1703.529

AIC 3789.089 3619.802 3445.057

MC4R (rs17782313)

TT vs. CT or CC 2.7 (-1.5 to 6.9) 0.206 2.7 (-1.0 to 6.4) 0.156 1.7 (-0.2 to 3.6) 0.071

Likelihood -1891.617 -1797.900 -1705.626

AIC 3799.234 3629.801 3447.252

Aggregate score (FTO/MC4R)

TT/TT or A or C vs. A e C 2.3 (-2.2 to 6.9) 0.316 2.2 (-1.8 to 6.2) 0.285 0.4 (-1.6 to 2.5) 0.679

Likelihood -1891.924 -1798.336 -1707.145

AIC 3799.848 3630.673 3450.291 Abbreviations: BMI - body mass index; CI - confidence interval; FTO - fat mass and obesity-associated gene; MC4R - melanocortin-4 receptor; AIC - Akaike’s information criterion. †β = Linear mixed-effect regression coefficient. ‡p-value refers to the maximum likelihood estimator. 1Model 1 was adjusted for gestational age (weeks) and also for quadratic gestational age; 2Model 2 = Model 1 plus years of education, smoking maternal status, self-reported skin color, sex of the child, maternal age, pre-pregnancy LTPA, parity and maternal height; 3Model 3 = Model 2 minus maternal height and plus pre-pregnancy BMI (linear and quadratic terms). * Weight at 0 week gestation (referred to as “self-reported pre-pregnancy weight”) and weight change from 5 to 13 weeks, from 20 to 26 weeks, from 30 to 36 weeks and last weight before to

delivery.


91

Supplementary Table 1 - Descriptive characteristics of the study population, by participation or non-participation in the genetic study

Characteristic Women enrolled in the cohort Participants of the genetic

study

Non-participants of the genetic study

N N N p-value

Descriptive

Maternal age1, years 203 26 (22, 31) 136 27 (22, 31) 67 24 (21, 28) 0.04

Self-reported skin color2 203 136 67

Black or mixed 147 (72.4)

100 (73.5) 47 (70.2) 0.61

Education1, years 203 9 (7, 11) 136 9 (6, 11) 67 9 (7, 11) 0.85

Living with partner2 203 136 67

Yes 162 (79.8)

111 (81.6) 51 (76.1) 0.36

Smoking habit at baseline2 203 136

Non-smoking 150 (73.9)

97 (71.3) 67 53 (79.1) 0.24

Pre-pregnancy LTPA2 199 134 65

No 148 (74.4) 108 (80.6) 40 (61.5) <0.01

Parity2 203 136 67

0 79 (38.9) 55 (40.4) 24 (35.8)

1 76 (37.4) 45 (33.1) 31 (46.3) 0.16

≥2 48 (23.7) 36 (26.5) 12 (17.9)

Sex of the child2 200 134 66

Male 99 (49.5) 64 (47.8) 35 (53.0) 0.48

Calorie intake1, kcal/d 200 2,332.1

(1,889.1, 2,855.5) 133

2,279.7

(1,895.1, 2,641.7) 67

2,435.3

(1,872.4, 3.065.8) 0.19

Self-reported pre-pregnancy weight3, kg 200 62.6 + 12.7 136 62.7 + 12.9 64 62.5 + 12.3 0.92

Maternal height3, cm 203 159.6 + 6.5 136 159.5 + 6.5 67 159.7 + 6.5 0.87

Pre-pregnancy BMI3, kg/m2 200 24.6 + 4.5 136 24.6 + 4.5 64 24.5 + 4.6 0.94

Pregnancy weight in 1st trimester3, kg 203 63.9 + 12.7 136 63.8 + 12.5 67 64.0 + 13.2 0.91

Pregnancy weight in 2nd trimester3, kg 191 69.1 + 12.6 128 68.6 + 12.2 63 70.1 + 13.5 0.42

Pregnancy weight in 3rd trimester 3, kg 200 75.6 + 12.9 135 75.3 + 12.5 65 76.3 + 13.9 0.61

Postpartum weight retention3, kg 185 4.2 + 5.3 122 3.9 + 5.4 63 4.6 + 5.0 0.37 Abbreviations: LTPA refers to leisure time physical activity; BMI refers to Body Mass Index.Data are presented as: 1median (IQR), p-value refers to Mann-Whitney U test; 2absolute frequency

(%), p-value refers to Pearson χ2 tests or Fisher's exact test; 3mean + SD, p-value refers to Student's t test.


92

Supplementary Table 2 - Associations of combined effect of FTO (rs9939609) and MC4R (rs17782313) with body weight changes before,

during pregnancy and immediate postpartum

FTO and MC4R risk alleles (AA or AT and CC or CT)

Characteristics Crude Adjusted

Model 1 Model 2

β (95% CI) β (95% CI) β (95% CI)

GWG in 1st trimester1, g/wk -49.8 (-203.6, 103.9) -31.2 (-190.9, 128.4) 20.9 (-135.7, 177.5)

GWG in 2nd trimester1, g/wk -36.4 (-123.1, 50.3) -2.7 (-92.6, 87.3) 5.8 (-81.3, 92.9)

GWG in 3rd trimester1, g/wk -47.5 (-133.2, 38.2) -19.0 (-104, 67.0) -31.5 (-118.9, 55.9)

Total GWG1, kg -2.3 (-4.5, -0.1)* -1.6 (-3.8, 0.8) -1.1 (-3.3, 1.0)

PPWR2†, g/wk -531.6 (-983.5, -79.7)* -448.1 (-915.0, 18.7) -80.7 (-319.6, 158.2)

RR pre-pregnancy BMI3 ‡

overweight (BMI ≥25 kg/m2) 1.2 (0.8, 2.0) 1.2 (0.8, 1.9) 1.2 (0.8, 1.9)

RR total GWG by IOM category4 ‡

insufficienta 0.7 (0.4, 1.2) 0.7 (0.4, 1.3) 0.7 (0.4, 1.3)

excessiveb 1.1 (0.7, 1.8) 1.3 (0.8, 2.0) 1.2 (0.8, 1.9)

RR postpartum BMI5 ‡

overweight (BMI ≥25 kg/m2) 1.2 (0.9, 1.7) 1.2 (0.9, 1.7) 1.0 (0.7, 1.3) Abbreviations: FTO refers to fat mass and obesity-associated gene; MC4R refers to melanocortin-4 receptor; GWG refers to gestational weight gain; CI refers to confidence interval; RR -

relative risk; PPWR - postpartum weight retention. *p<0.05; **p<0.01 † Calculated as the difference between post- and pre-pregnancy weights and adjusted for weeks since birth. ‡ Note that estimates in this row is relative risk (RR); Wald tests were used to derive the p values. 1Model 1 was adjusted for sex of the child, pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported, parity and gestational age; Model 2= Model 1 plus pre-pregnancy BMI (linear and

quadratic terms). 2Model 1 was adjusted for sex of the child, pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported and parity; Model 2= Model 1 plus total weight gain. 3Model 1 was adjusted for pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported, years of education, parity and smoking maternal status; Model 2= Model 1 plus maternal height. 4Model 1 was adjusted for sex of the child, pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported and parity; Model 2= Model 1 plus pre-pregnancy BMI (linear and quadratic terms). 5Model 1 was adjusted for pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported, years of education, parity and smoking maternal status; Model 2= Model 1 plus pre-pregnancy BMI

(linear and quadratic terms). a Pre-pregnancy BMI: 18.5-24.9 kg/m2 (GWG <11.5 kg); 25.0-29.9 kg/m2 (GWG <7.0 kg); ≥ 30.0 kg/m2 (GWG <5.0 kg). b Pre-pregnancy BMI: 18.5-24.9 kg/m2 (GWG >16.0 kg); 25.0-29.9 kg/m2 (GWG >11.5 kg); ≥30.0 kg/m2 (GWG >9.0 kg).


93

Supplementary Figure 1 - Trajectory of body weight during pregnancy by FTO (rs9939609)

polymorphism

Note: β (95% CI): -0.1 (-0.2 to -0.03); p=0.007

a) TT or AT genotypes (n=113) and AA genotype (n=23).

b) Fitted values were predicted using a linear mixed-effect (LME) regression model adjusted for

gestational age (linear and quadratic terms), years of education, smoking maternal status, self-reported

skin color, sex of the child, maternal age, self-reported pre-pregnancy leisure-time physical activity,

parity and pre-pregnancy BMI (linear and quadratic terms).

c) Weight at 0 week gestation (referred to as “self-reported pre-pregnancy weight”) and weight change

from 5 to 13 weeks, from 20 to 26 weeks, from 30 to 36 weeks and last weight before to delivery.


94

7.2 ARTIGO 2.

LEPTIN (RS7799039) AND LEPTIN RECEPTOR (RS1137101) GENE POLYMORPHISMS

AND BODY WEIGHT CHANGES AND LEPTIN CONCENTRATIONS THROUGHOUT

PREGNANCY

Aceito para publicação no periódico Nutrition Research em 2017

ABSTRACT

Leptin gene (LEP) and leptin receptor gene (LEPR) polymorphisms have been associated

with body weight and leptin concentration. We hypothesized that LEP-rs7799039 and LEPR-

rs1137101 genes are related to risk of pre-pregnancy overweight/obesity (BMI ≥ 25 kg/m2),

as well as excessive gestational weight gain (GWG) and high concentrations of leptin

throughout pregnancy. We investigated a prospective cohort of 147 Brazilian pregnant

women that was followed through 5-13, 20-26 and 30-36 gestational weeks. Genetic variants

of the LEP and LEPR were analyzed by real-time PCR and leptin by enzyme linked

immunosorbent assay. Maternal body weight and plasma leptin concentrations were measured

throughout pregnancy. Statistical analyses included multiple linear regression, linear mixed-

effects and Poisson regression models. Genotype AA carriers for the LEP-rs7799039 gene

kept lower body weight throughout pregnancy compared to those with GG or GA+GG

carriers ([βAAvsGG= -7.91 kg; 95% CI, -14.21 to -1.61, p=0.01]; [βAAvsGA+GG= -7.66 kg;

95%CI, -14.07 to -1.25, p=0.02]). The A-allele was significantly associated with an increased

risk for excessive GWG ([RRLEP-GAvsGG, 2.16; 95% CI, 1.23 – 3.80]; [RRLEP-AAvsGG,

2.37; 95% CI, 1.04 – 5.39]). Neither LEP-rs7799039 nor LEPR-rs1137101 polymorphisms

were significantly associated with pre-pregnancy overweight/obesity risk and leptin

concentrations throughout pregnancy. In conclusion, our results indicate that women carriers

of AA genotype for LEP-rs7799039 displayed lower body weight throughout pregnancy

compared to those that were GG or GA+GG carriers. LEP-rs7799039 was significantly

associated with an increased risk for excessive GWG, but the results do not support

significant associations of the LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 with pre-pregnancy

overweight/obesity risk and leptin concentrations throughout pregnancy.

Keywords: Polymorphisms, leptin, pregnancy, body weight gain, cohort study


95

1. INTRODUCTION

Obesity is currently considered to be one of the major public health problems

worldwide. Consequently, the number of overweight women is increasing and has already

reached 40% of the overall female population, while 15% were classified as obese in 2014

[1]. Inevitably, the number of women entering pregnancy with obesity is also rising. Higher

maternal body weight before pregnancy and excessive gestational weight gain (GWG) results

in a significant increase in pregnancy adverse outcomes, including preeclampsia, gestational

diabetes mellitus, cesarean delivery, postpartum complications [2] and a greater risk of

maternal mortality [3].

With the rise of obesity prevalence, molecular epidemiology studies have evaluated

the association of different genetic polymorphisms in genes such as FTO, MC4R, PPARG,

ADBR2, INSIG2, with the risk of obesity [4,5]. Several single nucleotide polymorphisms

(SNPs) of adipokine genes, such as leptin (LEP) and leptin receptor (LEPR), are studied

because they interact at the central level, particularly in the hypothalamus. The LEP-

rs7799039 SNP is a G to A transition at nucleotide position -2548 upstream of the ATG start

site in the LEP gene 5′ promoter region [6] and the A-allele has been associated with

increased leptin production and secretion from adipocytes as compared with the G allele [7].

The LEPR-rs1137101 SNP is an A to G transition in codon 223 (CAG to CGG) at position

668 in exon 6, and causes a non-conservative change (glutamine to arginine) [8] and

potentially a disruption in the leptin-signaling pathway, contributing to the impact on body

weight [9].

Leptin has important effects in controlling body weight, metabolism [10] and

reproductive functions [11]. Therefore, it could be anticipated that genetic variations in the

leptin gene can modulate its circulating levels and may affect various pathophysiological

states, one of which is obesity [12]. It is secreted predominantly by adipocytes in white

adipose tissue [13], but during pregnancy leptin is also synthesized by the placenta [14] and

its levels are much higher during pregnancy than that of non-pregnant women [15]. In

pregnant women, studies have demonstrated an association between serum leptin

concentrations and pre-pregnancy body mass index (BMI) [16], and GWG [13], indicating

that mechanisms mediating leptin/leptin receptor synthesis may be sensitive to the fluctuation

of maternal weight as the pregnancy progresses.

Although some studies have demonstrated significant associations between SNPs of

LEP and LEPR genes and body weight [6,17] and leptin concentrations [12,18] in the adult


96

population, little is known about associations of these polymorphisms with pre-pregnancy

weight, GWG and plasma repeated measure leptin concentrations throughout pregnancy. The

hypothesis of the present study is that the SNPs in the LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101

genes are related to the risk of pre-pregnancy overweight/obesity, as well as excessive GWG

and high concentrations of leptin throughout pregnancy. Therefore, the aims of this study

were to (1) assess whether LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 SNPs can influence the pre-

pregnancy body weight and GWG, and further (2) verify whether these SNPs can influence

the leptin concentrations throughout pregnancy in a prospective cohort of Brazilian pregnant

women.

2. METHODS AND MATERIALS

2.1. Research design

We analyzed data from a prospective cohort of pregnant women who received prenatal

care at a public health center in the city of Rio de Janeiro from November 2009 to October

2011. Data were collected over three visits during pregnancy: 5 to 13 (baseline), 20 to 26 and

30 to 36 gestational weeks (GW).

2.2. Subjects

A total of 299 pregnant women were enrolled in the study if they were between 5 and

13 GW, between 20 and 40 years of age, devoid of any history of infectious or non-

communicable chronic diseases (NCDs) (except obesity), and had the intention to attend the

prenatal care in the selected public health center. Following the baseline clinical evaluation,

women were excluded for several reasons. Thus, the baseline sample consisted of 147

pregnant women (143 participants with LEP and LEPR SNPs, two with only LEP and two

with only LEPR SNPs). A subsample of pregnant women participated in a clinical trial nested

within the main cohort with omega-3 supplementation (fish oil) after the second trimester

(n=36). Therefore, we excluded from the analysis the plasma leptin concentration data from

these women in the third trimester. We also excluded these women from the longitudinal and

GWG analysis (Figure 1).


97

The ethics committee of the Municipality Secretary of Health of Rio de Janeiro City

(Protocol number: 0139.0.314.000-09, 13 August 2009) approved the study. Written informed

consent was obtained from the study participants. All ethical procedures of this study

involving human beings followed the Brazilian Resolution 196/96.

2.3. Anthropometric measurements

At enrollment, women self-reported their pre-pregnancy body weight. Maternal body

weight (kg) was measured during pregnancy using a digital scale (Filizzola PL 150, Filizzola

Ltda, Brazil). We also obtained the weight recorded on the medical record at the last visit of

the prenatal care (between 36 to 42 GW). Height (cm) was measured at the baseline visits

using a portable stadiometer (Seca Ltda, Hamburg, Germany) in duplicates according to

standardized procedures [19], and the means of these measures was used. Pre-pregnancy BMI

was calculated using self-reported pre-pregnancy weight (kg) divided by the square of height

(in meters), and classified into two categories: underweight or normal weight (BMI < 25

kg/m2) and overweight/obese (BMI ≥ 25 kg/m2).

GWG (kg) was estimated by using the difference between the weight recorded on the

medical record at the last visit of the prenatal care and the self-reported pre-pregnancy weight.

GWG was classified as insufficient, adequate or excessive according to the Institute of

Medicine of the United States of America (IOM) [3].

2.4. Laboratory assays

At the baseline visit, venous blood samples (5 mL) were collected, processed, and

stored at -800C until polymorphisms analysis were performed. DNA was extracted from

whole blood samples by a proteinase K and phenol-chloroform method. SNPs rs7799039 of

the LEP gene and rs1137101 of the LEPR genes were determined by real-time polymerase

chain reaction amplification method (StepOnePlus, Life Technologies, Guilford, CT, USA)

using an allelic discrimination assays (TaqMan® Genotyping Master Mix assay, Life

Technologies). The accuracy of genotyping was evaluated by performing duplicate analysis of

10% of sample with ≥99% agreement rates.

Maternal venous blood samples (5 ml) were collected in EDTA tubes after a 12-hour

fasting period for all follow-ups. The blood samples were centrifuged (5,000 rpm for 5 min),


98

and the plasma was separated and stored at −800C until analysis. Plasma leptin (ng/dL) levels

were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) using commercial kits

(Millipore, St. Charles, Missouri, USA) with sensitivities of 0.5 ng/dL.

2.5. Covariates

Structured interviews were conducted to obtain the following maternal data: age at

baseline (years), self-reported skin color (white/black or brown), education (years of

schooling), self-reported pre-pregnancy leisure-time physical activity (LTPA) (no/yes),

smoking habit at baseline (nonsmoking, former smoker and current smoker), calorie intake

(kcal/d) and parity (number of deliveries). The total calorie intake (kcal/d) was assessed with

a validated food frequency questionnaire (FFQ) [20], which was administered in the first

trimester of the pregnancy. The gestational age (week) was estimated based on the first

ultrasound performed prior to 24 weeks of gestation, however the reported date of the last

menstrual period was used if the ultrasound was not available (n=2).

2.6. Statistical analysis

Data are reported as means and standard deviation (SD), as medians and interquartile

ranges (IQRs) or as counts and percentages. Due to the positive skew observed in the

distribution of the leptin concentrations, the data was log transformed before statistical

analysis and subsequently back-transformed for easy interpretation of the results as geometric

means and 95% confidence interval (95% CI).

Data were analyzed using STATA statistics software (version 12.0, College Station,

TX, USA) and a significance level at 5% was assumed in all the analysis. Comparisons

between SNPs and maternal characteristics were assessed by Student’s t test or analysis of

variance, Mann–Whitney U test or Kruskal-Wallis and chi-square test or Exact Fisher test,

according to the distribution of the variables. The potential associations between

polymorphisms and plasma leptin concentrations were evaluated using multiple linear

regression analysis adjusted by covariates. Poisson’s regression with robust variance was used

to address the association between genotypes and pre-pregnancy BMI categories (< 25 and ≥

25 kg/m2) and also with GWG categories according to the IOM [3] adjusted by covariates,

allowing an estimation of the relative risks (RR) and 95% CI.


99

Longitudinal linear mixed-effects (LME) models were performed to test the

association between the SNPs and the changes of plasma leptin concentrations and body

weight throughout pregnancy. LME regression coefficients account for the dependency

between observations of the same individual and for the exact gestational age of date

collection, not grouping women by gestational trimesters. Gestational age was included in all

models as both random and fixed effects to adjust for the overall and the individual variations

in leptin concentrations and body weight over time. The LEP/LEPR polymorphisms and all

other covariates were analyzed as fixed-effects only. The quadratic gestational age term was

included in all models to adjust for the longitudinal changes in plasma leptin concentrations

and body weight that resemble a parabola. The dependencies in the data were handled with an

unstructured covariance matrix.

The variables included in the adjusted models were chosen based on the biological

plausibility of the associations with both polymorphisms and outcomes. The pre-pregnancy

BMI models were adjusted for self-reported pre-pregnancy LTPA, maternal age, self-reported

skin color, parity, maternal smoking status, calorie intake in the first trimester and years of

education. The models having GWG as the outcome were adjusted for self-reported pre-

pregnancy LTPA, gestational age at delivery, maternal age, self-reported skin color, parity,

maternal smoking status, first trimester log leptin, and pre-pregnancy BMI. The models

having plasma leptin concentrations as the outcome were adjusted for self-reported pre-

pregnancy LTPA, gestational age, maternal age, self-reported skin color, maternal smoking

status and maternal body weight throughout pregnancy.

3. RESULTS

3.1. Maternal characteristic

The sample consisted of pregnant women with the following medians (IQR): age of 27

years (22-31 years), 9 years of education (7-11 years), 74.8% of women self-reported as

having black or brown (mixed race) skin color and 72.8% reported being nonsmokers at

baseline. There were 34.7% of pregnant women with pre-pregnancy BMI ≥ 25 kg/m2 (21.8%

were overweight [n=32] and 12.9% with obesity [n=19]), and 65.3% with pre-pregnancy BMI

< 25 kg/m2 (3.4% were underweight [n=5] and 61.9% with normal weight [n=91]) (data not

shown). Women who were overweight/obese prior to pregnancy gained less weight than


100

underweight or normal weight women during pregnancy (10.9 ± 7.0 vs. 13.2 ± 5.0; p=0.02)

and were more likely to have gained excessive GWG (p<0.01) when compared to

underweight or normal weight women. We found an increase in the geometric means of leptin

concentration from the first to the second trimester followed by a slight decline in the third

trimester ([15.5; 95% CI = 13.8 – 17.3] [27.4; 95% CI = 24.6 – 30.5] [24.2; 95% CI = 21.4 –

27.4], respectively). Overweight/obese women had higher leptin concentrations in all

gestation trimesters (p<0.01) when compared to underweight or normal weight women (Table

1).

3.2. Genotypes frequencies

The minor allele frequencies for LEP-rs7799039 and for LEPR-rs1137101 genes were

31.4% and 50.3%, respectively. The genotype distributions were in Hardy-Weinberg

equilibrium. We found no significant differences between the distribution of genotypes and

pre-pregnancy BMI categories (< 25 vs. ≥ 25 kg/m2) (Table 2).

3.3. Associations of the LEP and LEPR SNPs with pre-pregnancy body weight and

GWG

Homozygous subjects for the A-allele of the LEP-rs7799039 tended to have lower pre-

pregnancy body weight (AA=59.1 kg, GG=63.7 kg, GA=62.1 kg) when compared with

carriers of the G-allele (GG or GA), although differences were not statistically significant

(p=0.44) (Table 3).

Women who carried the A-allele of the LEP-rs7799039 were at a higher risk for

excessive GWG than the GG carriers ([RRLEP-GAvsGG, 2.16; 95% CI, 1.23 – 3.80];

[RRLEP-AAvsGG, 2.37; 95% CI, 1.04 – 5.39]) according to the adjusted Poisson’s

regression models (Table 4).

Genotype AA carriers for rs7799039 SNP began pregnancy with lower body weight

compared to those GG or GA+GG carriers, and this pattern was maintained throughout

pregnancy ([βAAvsGG = -7.91 kg; 95% CI, -14.21 to -1.61; p=0.01] [βAAvsGA+GG = -7.66

kg; 95%CI, -14.07 to -1.25; p=0.02]) after adjustment for the confounders (Table 5).


101

3.4. Associations of the LEP and LEPR polymorphisms with plasma leptin

concentrations

We did not find significant differences between geometric means of the leptin

concentrations according to the genotypes groups of the LEP-rs7799039 and LEPR-

rs1137101 genes (Table 3). These SNPs were not associated with log-transformed leptin

concentrations throughout pregnancy trimesters in any of the different genetic models tested

(co-dominant, recessive and dominant) (Table 4), or with changes in leptin concentrations

during pregnancy (Table 5).

4. DISCUSSION

In this study, women carriers of the AA genotype for LEP-rs7799039 presented with

lower body weight throughout pregnancy compared to those that were GG or GA+GG

carriers; however, the A-allele was significantly associated with a higher risk for excessive

GWG. We reported a lack of association between the LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101

SNPs with pre-pregnancy overweight/obesity risk and leptin concentrations throughout

pregnancy.

To our knowledge, this is the first study examining the association between LEP-

rs7799039 and LEPR-rs1137101 polymorphisms and GWG and leptin concentration

throughout pregnancy, proving it difficult to compare our data.

Increased maternal body weight before pregnancy and excessive GWG may also be a

primary contributor to the future development of obesity in women [21]. Considering the pre-

pregnancy body weight and BMI, our results are in line with studies that indicate that the SNP

rs7799039 may not be considered a relevant obesity marker for Spanish [22], Romanian [23],

and Malaysian populations [24], but differs from other studies that found an association with

obesity [6,12,17]. Alternatively, we found a significant association for GA or AA genotypes

with a higher risk for excessive GWG when compared to the GG genotype. The associations

of LEP-rs7799039 SNP with obesity in Brazilian subjects have been contentious. Hinuy et al.

reported that women carrying the GG genotype had four times the higher risk of obesity when

compared to the A-allele carriers [25]. However, Duarte et al. [26] in a multiethnic group and

Oliveira et al. [27] in a group of European-Caucasian ethnicity reported a lack of association

between the LEP polymorphism and obesity. The frequency of the LEP-rs7799039 A-allele


102

(0.31) observed in our study was similar to the range of those found in additional studies in

Brazilian population [25–27].

According to four systematic reviews, LEPR-rs1137101 did not show an overall

statistically significant association to obesity-related outcomes (waist circumference or BMI)

in the general population [28–31]. In Brazilian subjects, the LEPR-rs1137101 was associated

with an increased risk for obesity (OR= 2.14; 95%CI: 1.01 to 4.52) in European descent [27]

and nonsmokers Caucasian population [32], and in a multiethnic sample (OR= 1.79; 95%CI:

1.11 to 2.90) [26]. It is worth nothing that these results were performed in both men and

women, and the mean age was higher than in our study with pregnant women. The G allele

frequency of 0.50 for rs1137101 in this study was very similar to 0.45, the overall rate (varied

from 0.32 - 0.58) observed in different Caucasian populations [30]. However, this is a

difference from the study in multiethnic subjects in the same city of our study (varied from

0.39–0.43) [26]. It is important to point out that the racial/ethnic evaluation of this study was

based on a self-reported measure. Independently of how skin color was assessed, the

distribution of frequency of minor alleles was similar between black/brown and white women

(A-allele LEP=0.30 and 0.35; G-allele LEPR=0.51 and 0.49, respectively).

We reported that overweight/obese women had higher leptin concentrations in all

gestation trimesters. In humans, levels of circulating leptin are directly proportional to BMI

and the percentage of body fat [33] and, in general, women show higher leptin concentrations

compared to men [34]. In individuals with normal body weight, leptin acts in the

hypothalamus to decrease appetite and increase energy expenditure, but obese individuals

present high circulating leptin levels, which may reflect either leptin tolerance or leptin

resistance [35].

Our results revealed no significant associations between the LEP-rs7799039 and

LEPR-rs1137101 polymorphisms and leptin concentrations throughout pregnancy. However,

we cannot determine the proportion of placental leptin. There is strong evidence that suggests

that the placenta, rather than the maternal adipose tissue, makes a substantial contribution to

the rise in maternal leptin plasma concentrations [14]. According to placental perfusion

studies, 98.4% of placental leptin is released into the maternal circulation [36]. Placenta and

white adipose tissue express the same gene, except for the presence of a specific upstream

placental enhancer, which suggests that leptin expression is regulated in a tissue-specific

manner [37].


103

The potential effect of the LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 SNP on leptin

expression in adults is controversial. The AA genotype of the LEP-rs7799039 was associated

with increased leptin concentration in obese individuals from a South Indian population when

compared to the wild-type GG genotype [12]. In Brazilian women, the G allele contributed to

increased leptin concentration [25]. However, in a study conducted by Oliveira et al. [27] with

both Brazilian men and women, the rs7799039 SNP was not associated with leptin

concentration, a result similar with the ones observed on the present investigation. The LEPR-

rs1137101 G-allele was associated with leptinemia in Brazil [27], whereas it reported a non-

significant trend toward a higher serum leptin concentration to this allele in Romanian

subjects [23].

It is possible that the discrepant results of the associations between these

polymorphisms, body weight and leptin concentration may be due to a cumulative effect

combining several different factors, which together may have affected the outcomes. These

include a wide difference in the obesogenic environments from where the subjects are

recruited for the study, ethnic diversity, subject’s characteristics, selected set of confounders

and interaction amongst genes.

The main strengths are the availability of standardized longitudinal weight and plasma

leptin concentration measurements in the first, second and third pregnancy trimester, which

allowed analysis of the genetic associations with the changes of body weight and leptin

concentrations over time. In addition, we investigated two polymorphisms in the same group

of subjects and adjusted our results for important confounders. However, our study has some

limitations such as the sample size of our cohort, which may not be sufficient to detect weak

effects of gene variants and diminished the statistical power for some outcomes of the study.

An additional limitation is that we relied on self-reported pre-pregnancy weight, and

misclassification of GWG and pre-pregnancy BMI may not be ruled out for women who

inaccurately reported their pre-pregnancy weights. However, this is the case in most studies of

GWG.

Pregnancy is a complex process during which several metabolic and body adaptations

are required to support the adequate growth and development of the fetus, delivery, lactation

and the requirements to maintain the health of the mother, and these patterns of alterations are

a result of a variety of interactions amongst genes and environmental factors. The hypothesis

of the present study is that the polymorphisms in the LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101

genes are related to pre-pregnancy overweight/obesity risk, as well as excessive GWG and


104

high concentrations of leptin throughout pregnancy. Our results indicate that the LEP-

rs7799039 was significantly associated with a higher risk for excessive GWG, but the results

do not support significant associations of the LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 with pre-

pregnancy overweight/obesity risk and leptin concentrations throughout pregnancy. We solely

confirm the hypothesis that LEP-rs7799039 is associated with GWG. It is recommended to

further evaluate these results in a larger cohort and in other ethnic populations to demonstrate

the validity of our findings.

Acknowledgements

We would like to acknowledge Professor Rosane Silva for her technical support in the

genotyping analysis and allowing us to conduct DNA extraction in the Laboratory of

Macromolecular Metabolism Firmino Torres de Castro, Biophysics Institute, Rio de Janeiro

Federal University (UFRJ). We also thank Professor Maria das Graças Tavares do Carmo for

allowing us to work at the Laboratory of Nutritional Biochemistry of the Nutrition Institute,

UFRJ.

This study was supported by the National Council for Scientific and Technological

Development (CNPq) and the Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support of Rio

de Janeiro State (FAPERJ). The funders had no role in the design, analysis, or writing of this

article and the authors declare that they do not have any conflict of interest.


105

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108

Figure 1 - Flowchart illustrating the recruitment and selection of the study population Note:

NCDs = non-communicable chronic diseases; LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; SNP = single nucleotide

polymorphism

Pregnant women at enrollment: N = 299

Folow-up: N = 259 participants

N = 223 participants

Present study: N = 209

10 and 20 trimesters = 147 women

30 trimester = 111 women

Final sample: N = 147- 143 participants with LEP and LEPR SNPs- 02 participants with only LEP SNP- 02 participants with only LEPR SNP

Women participated in a clinical trial [n=36]

62 did not have blood samplesfor genotyping

Miscarriage [n=25]

Fasting plasma glucose ≥126 mg/dL [n=2]

Stillbirth [n=5]

Losses to follow-up: only information at baseline [n=9]

Twin pregnancies [n=4]

40 did not meet eligibility criteria: confirmedpre-gestational infection diagnosis or NCDs[n=14], >13 gestational weeks at enrollment[n=16] or abandoned prenatal care at the publichealth center [n=10]

Missing data: did not attendbaseline visit [n=5]


109

Table 1. Maternal characteristic of the study population stratifying for pre-pregnancy BMI categories.

Variables Study population

Underweight or normal

weight

(BMI < 25 kg/m2)

Overweight/obese

(BMI ≥ 25kg/m2)

N n n p-value

Maternal age (y) 147 27 (22 - 31) 96 26.5 (21 – 31) 51 27 (24 – 34) 0.101

Self-reported skin color, n (%) 147 96 51

Black or brown (mixed race) 110 (74.8) 74 (77.1) 36 (70.6) 0.392

Education (y) 147 9 (7 – 11) 96 10 (7 – 11) 51 9 (6 – 11) 0.931

Smoking habit at baseline, n (%) 147 96 51

Nonsmoking 107 (72.8) 75 (78.1) 32 (62.8) 0.052

Calorie intake (kcal/d) at first trimester 146 2,299 (1,895– 2,802) 95 2,207 (1,895 – 2,641) 51 2,436 (1,883 – 2,975) 0.281

Pre-pregnancy LTPA, n (%) 146 96 50

No 119 (81.5) 77 (80.2) 42 (84.0) 0.582

Parity, n (%) 147 96 51

0 57 (38.8) 39 (40.6) 18 (35.3) 0.532

≥1 90 (61.2) 57 (59.4) 33 (64.7)

Self-reported pre-pregnancy weight (kg) 147 62.5 ± 13.1 96 55.4 ± 6.2 51 75.9 ± 11.9 <0.013

Total gestational weight gain (kg) 110 12.5 ± 5.9 72 13.2 ± 5.0 38 10.9 ± 7.0 0.053

Adequacy of gestational weight gaina, n (%) 110 72 38

Insufficient 38 (34.5) 29 (40.3) 9 (23.7)

Normal 38 (34.6) 28 (38.9) 10 (26.3) <0.012

Excessive 34 (30.9) 15 (20.8) 19 (50.0)

Leptinb (ng/dL)

First trimester 146 15.5 (13.8 – 17.3) 95 11.9 (10.5 – 13.5) 51 25.1 (21.8 – 28.9) <0.013

Second trimester 141 27.4 (24.6 – 30.5) 91 23.7 (20.7 – 27.2) 50 35.7 (30.5 – 41.8) <0.013

Third trimester 105 24.2 (21.4 – 27.4) 70 20.8 (17.9 – 24.1) 35 32.9 (26.8 – 40.4) <0.013

Abbreviations: LTPA = leisure-time physical activity; BMI = body mass index.

Data are presented as medians (IQRs) or means ± SD (continuous variables) and percentages (categorical variables). p-value refers to 1Mann-Whitney U test; 2Pearson χ2 tests and 3Student's t. aAccording to the Institute of Medicine of the United States of America (IOM - 2009). bLog transformed values were used, but estimates provided in the table were back-transformed and data are presented as geometric means (95% confidence interval).


110

Table 2. Genotype and allele frequencies of the LEP-rs7799039 and of the LEPR-rs1137101

polymorphisms of the study population stratifying for pre-pregnancy BMI categories.

Gene/Genotypes/Allele Study population

Underweight or normal

weight (BMI < 25 kg/m2)

Overweight/obese

(BMI ≥ 25 kg/m2)

N (%) n (%) n (%) p-

value

LEP-rs7799039

GG 69 (47.6) 42 (44.7) 27 (52.9) 0.171

GA 61 (42.1) 39 (42.5) 22 (43.1)

AA 15 (10.3) 13 (13.8) 2 (3.9)

G-allele 199 (68.6) 123 (65.4) 76 (74.5)

A-allele 91 (31.4) 65 (34.6) 26 (25.5) 0.112

p-value (HW) 0.78 0.42 0.33

LEPR-rs1137101

AA 38 (26.2) 26 (27.7) 12 (23.5) 0.762

AG 68 (46.9) 42 (44.7) 26 (51.0)

GG 39 (26.9) 26 (27.6) 13 (25.5)

A-allele 144 (49.7) 94 (50.0.) 50 (49.0)

G-allele 146 (50.3) 94 (50.0) 52 (51.0) 0.872

p-value (HW) 0.46 0.30 0.89 Abbreviations: LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; SNPs = single nucleotide polymorphisms; BMI = body mass index;

HW = Hardy–Weinberg equilibrium.

p-value (HW) refers to Pearson χ2 tests.

Comparison between underweight or normal weight and overweight/obese subjects, p-value refers to 1Fisher's exact test or 2Pearson χ2 tests.


111

Table 3. Distribution of the pre-pregnancy body weight and BMI, total GWG and plasma leptin concentrations according to genotypes of the

LEP-rs7799039 and of the LEPR-rs1137101 genes.

Gene/Genotypes Pre-pregnancy body

weight (kg)

Pre-pregnancy BMI

(kg/m2)

Total GWG (kg)

Leptina (ng/dL) by trimester

First Second Third

n Means ± SD n Means ± SD n Means ± SD n Means (95% CI) n Means (95% CI) n Means (95% CI)

LEP-rs7799039

GG 69 63.7 ± 12.5 69 24.6 ± 4.6 53 12.8 ± 5.5 68 15.2 (13.0 - 17.7) 67 28.5 (24.6 – 33.0) 49 24.7 (20.8 – 29.4)

GA 61 62.1 ± 13.4 61 24.8 ± 4.9 42 11.7 ± 6.5 61 16.2 (13.4 - 19.6) 59 25.6 (21.2 – 30.9) 42 23.1 (18.6 – 28.7)

AA 15 59.1 ± 14.6 15 22.9 ± 4.4 13 13.2 ± 5.8 15 13.8 (10.1 - 18.8) 13 28.8 (21.4 – 38.6) 12 23.7 (17.1 – 32.4)

p-value* (GG vs GA vs AA) 0.44 0.38 0.59 0.67 0.63 0.88

p-value (GA vs GG) 0.48 0.86 0.38 0.58 0.37 0.62

p-value (AA vs GG) 0.21 0.19 0.81 0.59 0.96 0.81

p-value (AA vs GA+GG) 0.28 0.17 0.62 0.49 0.76 0.95

p-value (GA+AA vs GG) 0.31 0.78 0.29 0.76 0.44 0.62

LEPR-rs1137101

AA 38 63.2 ± 13.8 38 24.5 ± 4.9 33 12.1 ± 6.5 38 16.1 (12.6 – 20.6) 37 27.8 (22.5 – 34.3) 32 23.5 (18.2 – 30.2)

AG 68 61.8 ± 11.2 68 24.6 ± 4.3 46 13.2 ± 5.0 67 15.5 (13.4 – 18.00) 65 28.9 (24.8 – 33.6) 45 23.6 (19.9 – 28.0)

GG 39 63.9 ± 15.3 39 24.8 ± 5.1 29 11.7 ± 6.6 39 15.5 (12.3 – 19.6) 37 25.1 (19.6 – 32.1) 26 27.2 (20.4 – 36.3)

p-value (AA vs AG vs GG) 0.72 0.96 0.54 0.96 0.58 0.62

p-value (AG vs AA) 0.59 0.93 0.43 0.77 0.76 0.97

p-value (GG vs AA) 0.82 0.81 0.79 0.82 0.53 0.43

p-value (GG vs AG+AA) 0.52 0.80 0.41 0.91 0.32 0.33

p-value (AG+GG vs AA) 0.82 0.86 0.71 0.76 0.93 0.67

Abbreviations: LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; BMI = body mass index; GWG = gestational weight gain.

Comparison of the groups was performed using analysis of variance or Student's test. aLog transformed values were used for testing differences, but estimates provided in the table were back-transformed and data are presented as geometric means (95% confidence interval).


112

Table 4. Associations of the LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 polymorphisms with pre-pregnancy BMI, GWG and leptin concentrations.

Pre-pregnancy BMIa

(kg/m2) Total GWG by IOM categoryb (log) Leptin by trimesterc

Overweight/obese ( ≥25 ) Insufficient1 Excessive1 First Second Third

RR (95% CI) RR (95% CI) RR (95% CI) β(95% CI) β(95% CI) β(95% CI)

LEP-rs7799039

Co-dominant

(GA vs GG) 1.00 (0.64 – 1.56) 0.56 (0.30 – 1.05) 2.16 (1.23 – 3.80)** 0.046 (-0.029 to 0.122) -0.024 (-0.115 to 0.066) -0.014 (-0.116 to 0.088)

(AA vs GG) 0.36 (0.10 – 1.31) 0.58 (0.22 – 1.53) 2.37 (1.04 – 5.39)* 0.020 (-0.104 to 0.144) 0.066 (-0.086 to 0.217) 0.054 (-0.105 to 0.214)

Recessive

(AA vs GA+GG) 0.37 (0.11 – 1.29) 0.77 (0.30 – 1.96) 1.60 (0.72 – 3.54) 0.005 (-0.113 to 0.123) 0.094 (-0.050 to 0.238) 0.080 (-0.065 to 0.224)

Dominant

(GA+AA vs GG) 0.89 (0.57 – 1.38) 0.59 (0.34 – 1.02) 2.18 (1.27 - 3.71)** 0.041 (-0.031 to 0.114) -0.008 (-0.093 to 0.078) 0.004 (-0.091 to 0.099)

LEPR-rs1137101

Co-dominant

(AG vs AA) 1.28 (0.74 – 2.23) 1.32 (0.80 – 2.18) 1.41 (0.65 – 3.05) -0.001 (-0.083 to 0.081) 0.025 (-0.077 to 0.127) -0.022 (-0.133 to 0.090)

(GG vs AA) 1.15 (0.62 – 2.13) 0.48 (0.18 – 1.24) 1.88 (0.87 – 4.08) -0.030 (-0.136 to 0.076) -0.054 (-0.173 to 0.066) 0.007 (-0.147 to 0.132)

Recessive

(GG vs AG+AA) 0.94 (0.56 – 1.57) 0.41 (0.17 – 1.01) 1.51 (0.94 – 2.41) -0.029 (-0.112 to 0.053) -0.074 (-0.171 to 0.023) 0.018 (-0.094 to 0.131)

Dominant

(AG+GG vs AA) 1.21 (0.72 – 2.01) 0.97 (0.58 – 1.61) 1.63 (0.78 – 3.42) -0.012 (-0.094 to 0.069) 0.001 (-0.096 to 0.097) -0.009 (-0.155 to 0.097) Abbreviations: LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; BMI = body mass index; GWG = gestational weight gain; LTPA = leisure-time physical activity; IOM = Institute of Medicine of the United States of America. Estimates in column RR=relative risk, Wald tests were used to derive the p-values. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01. aModel adjusted for pre-pregnancy LTPA, maternal age, self-reported skin color, parity, maternal smoking status, calorie intake at first trimester and years of education. bModel adjusted for pre-pregnancy LTPA, gestational age at delivery, maternal age, self-reported skin color, parity, maternal smoking status, log leptin first trimester and pre-pregnancy BMI. cModel adjusted for pre-pregnancy LTPA, gestational age, maternal age, self-reported skin color, maternal smoking status and maternal body weight (kg) by trimester. 1According to the Institute of Medicine of the United States of America (IOM – 2009).

Total number of observations LEP-rs7799039: [Pre-pregnancy BMI (GA vs GG, n=124; AA vs GG, n=78; recessive and dominant, n=138)]; [Total GWG by IOM category (GA vs GG, n=62; AA vs GG, n=45;

recessive and dominant, n=70)]; [(log) Leptin by trimester: First (GA vs GG, n=128; AA vs GG, n=82; recessive and dominant, n=143); Second (GA vs GG, n=122; AA vs GG, n=76; recessive and dominant, n=135);

Third (GA vs GG, n=84; AA vs GG, n=57; recessive and dominant, n=96)]. Total number of observations LEPR-rs1137101: [Pre-pregnancy BMI (AG vs AA, n=103; GG vs AA, n=73; recessive and dominant, n=139)]; Total GWG by IOM category (AG vs AA, n=53; GG vs AA, n=42;

recessive and dominant, n=70)]; [(log) Leptin by trimester: First (AG vs AA, n=105; GG vs AA, n=76; recessive and dominant, n=143); Second (AG vs AA, n=99; GG vs AA, n=72; recessive and dominant, n=135);

Third (AG vs AA, n=72; GG vs AA, n=55; recessive and dominant, n=97)].


113

Table 5. Longitudinal analysis between LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 gene polymorphisms and maternal body weight and leptin

concentration throughout pregnancy.

Maternal weight (kg)a,1 (log) Leptinb

β (95% CI) p-value* β(95% CI) p-value

LEP-rs7799039

Co-dominant

(GA vs. GG) 2.20 (-2.52 to 6.93) 0.36 0.008 (-0.062 to 0.077) 0.83

(AA vs. GG) -7.91 (-14.21 to -1.61) 0.01 0.016 (-0.095 to 0.128) 0.77

Recessive

(AA vs. GA+GG) -7.66 (-14.07 to -1.25) 0.02 0.026 (-0.081 to 0.133) 0.64

Dominant

(GA+AA vs. GG) -0.16 (-4.51 to 4.19) 0.94 0.011 (-0.055 to 0.077) 0.74

LEPR-rs1137101

Co-dominant

(AG vs. AA) 2.50 (-2.31 to 7.31) 0.31 0.013 (-0.061 to 0.087) 0.73

(GG vs. AA) 1.53 (-4.21 to 7.27) 0.61 -0.024 (-0.117 to 0.068) 0.61

Recessive

(GG vs. AG+AA) -0.64 (-5.40 to 4.11) 0.79 -0.034 (-0.109 to 0.041) 0.38

Dominant

(AG+GG vs. AA) 1.85 (-2.60 to 6.31) 0.42 0.001 (-0.074 to 0.075) 0.99 Abbreviations: LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; LTPA = leisure-time physical activity. aModel adjusted for gestational age (wk) and quadratic gestational age, pre-pregnancy LTPA, maternal age, self-reported skin color, maternal smoking status, parity, years of education and

maternal height. bModel adjusted for gestational age (wk) and quadratic gestational age, pre-pregnancy LTPA, maternal age, self-reported skin color, maternal smoking status and maternal weight throughout

pregnancy (kg). 1Weight at 0 wk gestation (referred to as self-reported pre-pregnancy weight) and weight change from 5 to 13 wk, from 20 to 26 wk, from 30 to 36 wk, and last weight before to delivery.

β= Linear mixed-effect regression coefficient; p-value refers to the maximum likelihood estimator.

Observations LEP-rs7799039:

Maternal weight [GA vs GG: total number of observations (data) = 456; total number of groups (women = 95), and mean of 4.8 observations per group]; [AA vs GG: total number of

observations (data) = 315; total number of groups (women = 66), and mean of 4.8 observations per group]; [Recessive and Dominant: total number of observations (data) = 519; total number of

groups (women = 108), and mean of 4.8 observations per group].

(log) Leptin [AG vs AA: total number of observations (data) = 334; total number of groups (women = 129), and mean of 2.6 observations per group]; [AA vs GG: total number of observations

(data) = 215; total number of groups (women = 83), and mean of 2.6 observations per group]; [Recessive and Dominant: total number of observations (data) = 374; total number of groups

(women = 144), and mean of 2.6 observations per group].

Continued on next page…


114

Table 2 (Continued)

Observations LEPR-rs1137101:

Maternal weight [GA vs GG: total number of observations (data) = 383; total number of groups (women = 80), and mean of 4.8 observations per group]; [GG vs AA: total number of

observations (data) = 297; total number of groups (women = 61), and mean of 4.9 observations per group]; [Recessive and Dominant: total number of observations (data) = 520; total number of

groups (women = 108), and mean of 4.8 observations per group].

(log) Leptin [GA vs GG: total number of observations (data) = 276; total number of groups (women = 106), and mean of 2.6 observations per group]; [GG vs AA: total number of observations

(data) = 203; total number of groups (women = 76), and mean of 2.7 observations per group]; [Recessive and Dominant: total number of observations (data) = 375; total number of groups

(women = 144), and mean of 2.6 observations per group].

The group refers to the number of women with at least one data point in time and observations refers to the total number of data points in time for all women.


115

7.3 ARTIGO 3.

ASSOCIATIONS BETWEEN OBESITY CANDIDATE GENE POLYMORPHISMS (FTO,

MC4R, LEP AND LEPR) AND DIETARY INTAKE IN PREGNANT WOMEN

Submetido ao periódico British Journal of Nutrition em 2017

ABSTRACT

The purpose of this study was to investigate the associations between the obesity candidate

genes (FTO, MC4R, LEP and LEPR) with a focus on the daily total energy intake and

percentage of energy from macronutrients and ultra-processed foods before and during

pregnancy. A sample of 149 pregnant women was followed in a prospective cohort at a Public

Health Center in Rio de Janeiro, Brazil. A food frequency questionnaire was administered at

5-13 weeks of gestation (to assess pre-pregnancy dietary intake) and weeks 30-36 (to assess

dietary intake during pregnancy). Genotyping was performed using real-time polymerase

chain reaction. The means and variations of energy intake and percentage of energy from

macronutrients and ultra-processed foods, according to the genotypes were compared using

ANOVA or Student’s t test. Associations between polymorphisms and the outcomes were

investigated through multiple linear regression and longitudinal linear mixed-effects models.

A-allele of the FTO-rs9939609 was positively associated with the percentage of energy from

carbohydrates (β=2.7; 95% CI 0.5, 4.8; p=0.016) in pre-pregnancy, and with total energy

intake (β=0.054; 95% CI 0.003, 0.106; p=0.039) and mean percentage of energy from ultra-

processed foods (β=6.3; 95% CI 1.4, 11.1; p=0.012) during pregnancy, compared with the TT

genotype. C-allele of the MC4R-rs17782313 was associated with higher percentage of energy

from ultra-processed foods throughout pregnancy, compared with the TT genotype (β=4.2;

95% CI 0.4, 8.0; p=0.030). These findings suggest significant associations between FTO-

rs9939609 and MC4R-rs17782313 genes and the components of dietary intake in pregnant

women.

Keywords: Dietary intake, Pregnant women, Polymorphisms.


116

Introduction

Dietary intake is an important human behavior that is intimately related to health(1).

The availability of low-cost high energy-dense foods, along with decreased physical activity,

are often considered to be the biggest contributors to the rising prevalence of obesity and diet-

related non-communicable diseases (NCDs)(2,3). Maternal obesity is becoming more

prevalent(4) and women are more likely to retain gestational weight with each successive

pregnancy contributing to the development or aggravation of the obesity epidemic(5). Maternal

obesity and excessive gestational weight gain (GWG) are major risk factors for gestational

diabetes, preeclampsia and fetal adiposity(6,7). Consequently, obesity in pregnancy is placing a

considerable burden on healthcare services and resources(8).

Although environmental factors contribute to an important role in the development of

obesity, genetic factors also have a substantial contribution on its etiology(9). Studies of

candidate genes for obesity-susceptibility have allowed the identification of important genes

and single nucleotide polymorphisms (SNPs) involved in the mechanisms of dietary

consumption, such as energy intake, food preferences, and satiety responsiveness(1,10,11). The

rs9939609 SNP of the fat mass and obesity-associated (FTO) gene, along with the rs7799039

SNP of the leptin (LEP) gene and the rs1137101 SNP of the leptin receptor (LEPR) gene has

been associated with high total energy intake(12,13). Further, the rs17782313 SNP of the

melanocortin-4 receptor (MC4R) gene has been associated with food intake and eating

behavior patterns(14,15).

Nutritional demands increase during pregnancy due to the metabolic and physiological

changes(16). Given the potential importance of weight management interventions in

pregnancy, and due to the profound effect that diet can have on weight gain and regulation,

the purpose of this study was to investigate the associations between obesity predisposing

gene SNPs (FTO-rs9939609; MC4R-rs17782313; LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101) and

daily total energy intake, percentage of energy from macronutrients and ultra-processed foods

(i.e., energy-dense foods). We hypothesized that FTO, MC4R, LEP and LEPR gene SNPs

may be related with an increased total energy intake, as well as increased energy from

carbohydrate, fat and ultra-processed foods before and during pregnancy.


117

Methods

Study design and subjects

This study comprised a prospective cohort of pregnant women attending a prenatal

care service offered by a public health center in Rio de Janeiro, Brazil. The enrollment of

women occurred from November 2009 to October 2011, and the follow-up lasted until July

2012.

A total of 322 pregnant women were invited and 299 (92.7%) agreed to participate in

the study. Elegibility criterias were: until 13 weeks of gestation, 20-40 years of age, had no

history of infectious or NCDs (except obesity), and intended to attend prenatal care in the

selected health center. The follow up times occurred at between 5-13 (baseline), 20-26 and

30-36 gestational weeks (GW).

Following recruitment, 79 women were excluded. After exclusions, the baseline total

sample comprised 220 pregnant women. From the baseline to the third-time visit (30-36 GW),

9 follow-up losses occurred. Furthermore, we excluded women who did not have blood

samples for genotyping (n=62). The final sample of the present study was composed of 149

women with genotyping (FTO, n=146; MC4R, n=145; LEP, n=147 and LEPR, n=147)

(Figure 1).

The Rio de Janeiro Municipal Health Secretary Research Ethics Committee approved

the study procedures (reference number: 0139.0.314.000–09). All participants signed a term

of consent freely and spontaneously, detailing all procedures to be carried out, according to

the Brazilian Resolution 466/2012.

Dietary intake assessments

The dietary intake was evaluated utilizing a semi-quantitative food frequency

questionnaire (FFQ), based on a version originally developed and validated for the adult

population of Rio de Janeiro(17). Dietary intake data was collected at two time intervals: a) 5-

13 GW (covering 6 months prior to the first interview, herein called the pre-pregnancy); b) at

30-36 GW (covering the last 6 months prior to the last interview, herein called during

pregnancy). The FFQ was composed of 82 food items with eight frequency options that were


118

transformed into daily frequency, as follows: >3 times/day=4, 2–3 times/day=2.5, 1

time/day=1, 5–6 times/week=0.79, 2–4 times/week=0.43, 1 time/week=0.14, 1–3

times/month=0.07, and never or hardly ever=0. Portion sizes were converted into grams or

milliliters, based on the Brazilian household measures table(18). The daily nutrient amount for

a given food was calculated by multiplying the usual portion size per daily frequency and its

nutrient content, based on data from the Brazilian Table of Food Composition(19) and added

food items from the United States Department of Agriculture National Nutrient Database for

Standard(20).

Macronutrients and alcohol consumptions (grams/day) were calculated by summing

the data for the respective macronutrient/alcohol across food and drinks, respectively. These

values were then converted into energy by multiplying the total grams of the

macronutrient/alcohol by the number of calories per gram.

Ultra-processed foods were classified in accordance with the official Brazilian national

food and nutrition guideline(21) and with the new food classification system, which considers

the extent and the purpose of industrial food processing (22). Ultra-processed foods were

represented in this study by the following food products: sweet or savoury packaged snacks,

French fries, ice-cream, chocolate, candies (confectionery), mass-produced packaged breads

and buns; margarines, mayonnaise, cookies (biscuits), cakes, yoghurts, pre-prepared pies and

pasta and pizza dishes; sausages, burgers, hot dogs, and other reconstituted meat products;

noodles, fried or baked salted pastries, soft drinks and alcoholic beverage (vodka).

DNA isolation and SNP genotyping

Venous blood samples (5 mL) were collected at baseline, processed and stored at -

800C until polymorphism analyses. DNA was isolated from whole blood samples by the

proteinase K and phenol-chloroform technique. Genotyping was performed by real-time

polymerase chain reaction amplification method (StepOnePlus, Life Technologies, Guilford,

CT, USA) using an allelic discrimination assays (TaqMan® Genotyping Master Mix assay,

Life Technologies). The accuracy of genotyping was evaluated by performing a duplicate

analysis of 10% of the sample with ≥ 99% agreement rates.


119

Covariates assessment

A standardized questionnaire was administered at baseline (5-13 GW) to obtain the

following maternal variables: age (years), education (years of schooling), per capita family

income (Real-R$), leisure time physical activity (LTPA) practice before pregnancy (yes/no),

smoking habits (nonsmoking, former smoker and current smoker), alcohol consumption

(no/yes), parity (number of deliveries), and self-reported skin color (white/black/mixed).

Pre-pregnancy body mass index (BMI) was calculated using the self-reported pre-

pregnancy weight at baseline and height measured with a portable stadiometer (Seca, Ltd,

Hamburg, Germany) until 13 weeks of gestation according to standardized procedures(23).

The gestational age was estimated based on the first ultrasound performed prior to 24

weeks of gestation(24), however the reported date of the last menstrual period was used if the

ultrasound data was not available (n=2).

Statistical analyses

The maternal characteristics were described as a number with frequency (%) or

medians with interquartile range (IQR= 25th-75th percentiles) and mean with 95% confidence

interval (CI). Data that were not normally distributed (energy intake and percentage of energy

from protein) were logarithmic-transformed (log10) prior to data analysis and subsequently

back-transformed using the inverse of the natural logarithm function. Comparisons between

genotypes and outcomes were performed using a Student’s t test and analysis of variance

(ANOVA).

The variation (∆) in the total energy intake and the percentage of energy of each

macronutrient, along with ultra-processed foods, between before and during pregnancy by

genotypes was calculated (Delta= variable value during pregnancy - variable value in pre-

pregnancy).

We did not employ a recessive genetic model for analyses because the number of

minor allele homozygotes for all SNPs was small in our sample.

Crude and adjusted linear regression models were performed to assess cross‐sectional

associations between genotype at a candidate SNP and the outcomes. The variables included

in the adjusted models were selected according to the biological plausibility of the association


120

with total energy intake. The following variables attended this condition and were included in

the adjusted models: maternal age, self-reported skin color, parity, gestational age, per capita

income and pre-pregnancy BMI.

We further employed linear mixed-effect (LME) regression models to investigate the

longitudinal associations between polymorphisms and alterations in total energy intake and

the percentage of energy from macronutrients and ultra-processed foods from pre-pregnancy

to pregnancy. The models were adjusted for maternal age, self-reported skin color, parity,

gestational age, per capita income and pre-pregnancy BMI. LME models account for random

variation of intra-individuals and between individuals. Gestational age (in weeks) represents

the time variable in all models and was considered a fixed and random effect. The gene

polymorphisms, and all other covariates, were analyzed as fixed-effect variables.

Dependencies in the data were handled with an unstructured covariance matrix.

Statistical analyses were conducted using STATA (version 12.0, College Station, TX,

USA) software and a significance level at 5% was assumed in all the analysis.

Results

Characteristics of the study sample

The 149 women comprised a median (IQR) age of 27 (22–31) years and 9.0 (7-11)

years of education. There were 34.9% of women with a pre-pregnancy BMI ≥ 25 kg/m2. The

difference of geometric mean of the total energy intake between before and during pregnancy

was not statistically significant (Table 1).

Genotype frequencies

The minor allele frequencies of the FTO-rs9939609, MC4R-rs17782313, LEP-

rs7799039 and LEPR-rs1137101 were 42.0% (A-allele), 19.0% (C-allele), 31.0% (A-allele)

and 50.0% (G-allele), respectively, and the genotype distributions were in accordance with

Hardy-Weinberg equilibrium (p>0.05) (online Supplementary Table S1).


121

Daily total energy intake

Considering women with FFQ data before and during pregnancy, carriers of the A-

allele of FTO presented an increased total energy intake geometric mean during pregnancy

(TT vs. AT+AA = [2091; 95% CI 1904, 2297]; [2353; 95% CI 2202, 2513]; p=0.041,

respectively), and positive variation from pre-pregnancy to pregnancy (TT vs. AT+AA = [-

259.8; 95% CI -494.9, -24.7]; [112.6; 95% CI -68.2, 293.6]; p=0.015, respectively) (Table 2).

During pregnancy, the multivariate linear regression model was statistically significant

following adjustment for the potential confounders (β=0.054; 95% CI 0.003, 0.106; p=0.039)

(Table 3).

Percentage of energy from carbohydrates

The percentage of energy from carbohydrates was higher in A-allele carriers of FTO-

rs9939609 before pregnancy (TT vs. AT+AA = [54.6; 95% CI 52.7, 56.4]; [57.0; 95% CI

55.8, 58.2]; p=0.020, respectively) (Table 2), even after adjustment for confounders (β=2.7;

95% CI 0.5, 4.8; p=0.016) (Table 3).

Percentage of energy from protein

Women who carried A-allele of the LEP-rs7799039 tended to present a higher

percentage of energy from (log) protein (GG vs. GA+AA = [15.4; 95% CI 14.6, 16.2]; [16.6;

95% CI 15.8, 17.4]; p=0.036, respectively) during pregnancy, and presented a positive

variation (GG vs. GA+AA = [-0.5; 95% CI -1.4, 0.4]; [0.8; 95% CI -0.0, 1.6]; p=0.031,

respectively) from pre-pregnancy to pregnancy (Table 2), but lost significance in dominant

genetic model after adjustment for confounders (Table 3).

The A-allele of the FTO-rs9939609 gene was negatively, and significantly, associated

with the percentage of energy from (log) protein before (β = -0.038; 95% CI -0.066, -0.009;

p=0.009) and during pregnancy (β = -0.041; 95% CI -0.074, -0.009; p=0.012) when compared

to the TT carriers in the adjusted model (Table 3), and maintained this pattern throughout

pregnancy (β = -0.026; 95% CI -0.050, -0.002; p=0.037) (Table 4).


122

Percentage of energy from fat

The percentage of energy from fat was reduced from pre-pregnancy to pregnancy.

However, carriers of the A-allele of FTO-rs9939609 tended to reduce less these values (TT

vs. AT+AA = [-3.0; 95% CI -5.0, -0.9]; [-0.7; 95% CI -1.8, 0.3]; p=0.031, respectively)

(Table 2).

Percentage of energy from ultra-processed foods

Women who carried A-allele of the FTO-rs9939609 gene tended to present a higher

percentage of energy from ultra-processed foods (TT vs. AT+AA = [40.6; 95% CI 36.9,

44.3]; [45.6; 95% CI 47.7, 48.5]; p=0.041, respectively) during pregnancy (Table 2), even

after adjustment for confounders (β = 6.3; 95% CI 1.4, 11.1; p=0.012) (Table 3). The

percentage of energy from ultra-processed foods was reduced from pre-pregnancy to

pregnancy. However, carriers of the A-allele of FTO-rs9939609 tended to reduce less these

values (TT vs. AT+AA = [-6.4; 95% CI -10.2, -2.6]; [-1.1; 95% CI -3.9, 1.7]; p=0.026,

respectively) (Table 2).

We found in the adjusted linear mixed-effect models that women carrying the C-allele

of the MC4R-rs17782313 began pregnancy with higher percentage of energy from ultra-

processed foods compared with the TT genotype, and the level remained higher throughout

pregnancy (β=4.2; 95% CI 0.4, 8.0; p=0.030) (Table 4).

Discussion

This study has several main findings. The A-allele of the FTO-rs9939609 was

positively associated with the percentage of energy from carbohydrates before pregnancy, and

was positively associated with total energy intake and with percentage of energy from ultra-

processed foods during pregnancy. Additionally, the FTO risk allele was negatively

associated with the percentage of energy from protein before and during pregnancy and

throughout pregnancy. The C-allele of the MC4R-rs17782313 presented higher percentage of

energy from ultra-processed foods throughout pregnancy.

The minor allele frequency observed in this study for FTO-rs9939609 A-allele (0.42)

and MC4R-rs17782313 C-allele (0.19) were quite similar to the range of reported values in


123

other published studies with Brazilian women (0.40/0.45 for FTO-rs9939609 and 0.23/0.15

for MC4R-rs17782313 C allele)(25).

Many of the genetic variants associated with weight increases are highly expressed in

the hypothalamus, a crucial neural center for energy balance and regulation of food intake(26).

Research involving humans have suggested that the risk allele of FTO-rs9939609 gene may

influence food consumption parameters including total energy intake(27,28), food

preferences(29,27) and appetite regulation(10,30), suggesting that diet may mediate the effect of

the FTO on obesity. However, these associations have not been replicated in other

studies(31,32). We observed that this variant was negatively associated with the percentage of

energy from protein before and during pregnancy. Protein is considered the most satiating

macronutrient(33) thus, it is plausible that the A-allele of the FTO was related to modifications

on food cravings and appetite with increased energy intake from ultra-processed foods.

A study showed that subjects homozygous for FTO-rs9939609 appears to determine

neural responses to circulating concentrations of the hunger hormone ghrelin(34), which may

lead to increased energy intake in those carrying the risk allele. The role of FTO in the

pathogenesis of obesity has additionally been demonstrated in a rodent model, which

indicated that increased expression of FTO leads to increased fat mass and obesity via

hyperphagia(35).

MC4R gene is the most common cause of severe early monogenic obesity(36) and an

important contributor to polygenic obesity in humans(15), however, their expression is

variable, their penetrance incomplete, and both expression and penetrance are age

dependent(37). In addition, the incomplete penetrance and the variable expression of MC4R

mutations suggest an important environmental influence.

The rs17782313 C-allele has been associated with high snack consumption(14) and

with high intakes of total energy and dietary fat in women of European ancestry(38). We

observed that MC4R-rs17782313 genotypes were not associated with daily energy intake and

percentage of energy from macronutrients. This is consistent with the results of a published

study in European adults(32). However, we found that the intake of energy from ultra-

processed foods was significantly increased in subjects with MC4R minor alleles throughout

pregnancy. MC4R-rs17782313 C allele displayed a positive association with ramen and

processed foods including canned tuna, fish cake, ham and cheese when compared to the

rs17782313 T-allele in a study with Korean middle-aged adults(39).


124

The phenotypic features of MC4R deficiency include hyperphagia(15,36) through the

leptin-melanocortin signaling system(40), and the severity of hyperphagia may decline with

age and was greater in homozygous compared to heterozygous cases(36,37). In our study, the

majority of the pregnant women were heterozygous with only four homozygous subjects with

the minor allele.

There are limited studies evaluating the association of LEP-rs7799039 and its receptor

(lEPR-rs1137101) with food intake in the adult population. Research conducted in Brazil on

children (4 years of age) found that G-allele carriers of the LEPR-rs1137101, but not LEP-

rs7799039, had a higher total energy intake(41). In Tunisian adults, subjects with the AA

genotype for LEP-rs7799039 and GG genotype for LEPR-rs1137101 genes had a

significantly higher daily energy intake(13). We did not find an association between these

SNPs and total energy intake.

There is evidence to conclude that obesity candidate gene SNPs may be associated

with dietary intake parameters, and their identification may contribute to prevent future health

problems. However, phenotype intensity is potentially modulated by environmental and

individual characteristics(15), and the genetic contribution to population phenotypic

differentiation is driven by differences in causal allele frequencies, effect sizes, and genetic

architecture(42).

Our study did have limitations and strengths that need to be highlighted. One of the

limitations is the moderate sample size, which resulted in a lower power for detecting a

statistically significant effect of the polymorphisms on the dietary intake parameters. An

additional limitation is that some of the associations may have been attenuated by an

imprecision of dietary intake measurements. The predominant strength refers to the use of a

validated FFQ and trained interviewers to administer the FFQ who followed standardized

procedures. Further, the longitudinal design that allowed analysis of the genetic associations

with phenotypes over time was an additional strength. Moreover, we controlled our results for

important confounders, such as maternal age, self-reported skin color, parity, gestational age,

per capita income and pre-pregnancy BMI.

In conclusion, the A-allele carriers of the FTO-rs9939609 had a higher percentage of

energy from carbohydrates before pregnancy, and had a higher total energy intake and

percentage of energy from ultra-processed foods during pregnancy. The FTO risk allele also

was negatively associated with the percentage of energy from protein before and during

pregnancy and throughout pregnancy, compared with those with the TT-genotype. The C-


125

allele carriers of the MC4R-rs17782313 presented a higher percentage of energy from ultra-

processed foods throughout pregnancy, compared with those with TT-genotype. Future

studies using high-quality dietary data are required to consolidate whether obesity-susceptible

genes are associated with dietary intake to prevent obesity in genetically predisposed

individuals.

Acknowledgments

We would like to acknowledge Professor Rosane Silva for her technical support in the

genotyping analysis and allowing us to conduct DNA extraction in the Laboratory of

Macromolecular Metabolism Firmino Torres de Castro, Biophysics Institute, Rio de Janeiro

Federal University (UFRJ). We also thank Professor Maria das Graças Tavares do Carmo for

allowing us to work at the Laboratory of Nutritional Biochemistry of the Nutrition Institute,

UFRJ.

Financial Support

This study was supported by the Carlos Chagas Filho Research Foundation from the State of

Rio de Janeiro (FAPERJ) (grant numbers E-26/111.400/2010, E-26/110.681/2012; E-

26/112.181/2012; E-26/111.698/2013). The funders had no role in the design, analysis, or

writing of this article and the authors declare that they do not have any conflict of interest.

Conflict of interest

The authors declare no conflict of interest.

Authorship

The authors’ contributions are as follows: M. C. M. performed statistical analysis, participated

in the interpretation of results and writing of the manuscript. J. T., A. A. F. V, D. R. F and E.

L. R. contributed to the discussion and data interpretation. G. K. participated in the designing

the work and reviewed the manuscript.

Supplementary material accompanies this paper.


126

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129

Figure 1 – Flowchart illustrating the recruitment and selection of the study sample

Abbreviations: NCDs = non-communicable chronic diseases; FTO = fat mass and obesity-associated gene;

MC4R = melanocortin-4 receptor gene; LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; SNPs = single nucleotide

polymorphisms.

Pregnant women invited to participate in the study: N=322

Pregnant women who agreed to participate: N = 299 (92.7%)

Folow-up: N = 220 pregnant women

N = 211 pregnant women

N = 149 participants eligible for the final analysis

LEPR polymorphism (n=147)

Dietary data duringpre-pregnancy

(n=145)

Dietary data duringpregnancy (n=139)

LEP polymorphism (n=147)


(n=145)


MC4R polymosphism

(n=145)


(n=143)


FTO polymorphism (n=146)

Dietary data during pre-pregnancy

(n=144)

Dietary data during pregnancy (n=139)

141 women had all the SNPs1 woman had only FTO, MC4R and LEPR SNPs2 women had only FTO, MC4R and LEP SNPs2 women had only FTO, LEP and LEPR SNPs1 woman had only MC4R, LEP and LEPR SNPs1 woman had only LEP and LEPR SNPs1 woman had only LEPR SNP

62 did not have bloodsamples for genotyping

9 Losses to follow-up: 9 only information at baseline

79 Excluded:40 did not meet eligibility criteria [confirmedinfectious (n=10) and parasitic (n=2) diseases orNCDs (n=2), >13 gestational weeks at enrollment(n=16) or abandoned prenatal care at the publichealth center (n=10)]; 4 twin pregnancies; 25miscarriage; 5 stillbirth; 5 missing the baseline data


130

Table 1. Maternal descriptive characteristics and dietary intake of the study sample

Maternal characteristics Value study sample

Sociodemographic and lifestyle (n=149) Median (IQR) n (%)

Age (y) 27 (22 – 31)

Education (y) 9 (7 – 11)

Per-capita family income (R$)a 475.0 (315.0 – 667.0)

Parity (number of parturitions)

0 57 (38.3)

≥1 92 (61.7)

Early pregnancy alcohol consumption

No 121 (81.2)

Yes 28 (18.8)

Early pregnancy smoking habit

Nonsmoking 108 (72.5)

Former smoker 31 (20.8)

Current smoker 10 (6.7)

LTPA before pregnancya

No 119 (81.0)

Yes 28 (19.0)

Self-reported skin color

White 39 (26.2)

Black 35 (23.5)

Brown (mixed race) 75 (50.3)

Pre-pregnancy BMI (kg/m²) status

Underweight (<18.5) 5 (3.4)

Normal weight (18.5 - 24.9) 92 (61.7)

Overweight (25.0 - 29.9) 33 (22.2)

Obesity (≥ 30.0) 19 (12.7)

Daily dietary intake pre-pregnancy (n=147)b mean (95% CI)

Total energy (kcal/day) 2394 (2263, 2524)

% of energy from

Carbohydrates 56.2 (55.2, 57.2)

Protein 16.1 (15.6, 16.6)

Fat 26.7 (25.9, 27.5)

Ultra-processed foods 47.4 (45.4, 49.5)

Daily dietary intake during pregnancy (n=141)c mean (95% CI)

Total energy (kcal/day) 2401 (2275, 2526)

% of energy from

Carbohydrates 58.3 (57.4, 59.2)

Protein 16.4 (15.8, 17.0)

Fat 25.2 (24.4, 25.9)

Ultra-processed foods 44.2 (41.9, 46.4) Abbreviations: R$ = real; LTPA = leisure-time physical activity; BMI = body mass index; IQR = interquartile range; CI =

confidence interval.

Notes: aVariables with missing information: three missing values for per-capita family income and two missing values for leisure

time physical activity. bDifference of the total sample size: one missing for food frequency questionnaire and one exclusion because implausible

total energy intake (>6000 kcal/day). cDifference of the total sample size: seven missing for food frequency questionnaire and one exclusion because implausible

total energy intake (>6000 kcal/day).


131

Table 2. Distribution of daily dietary intake before and during pregnancy and variation according to genotypes of the FTO-rs9939609, MC4R-

rs17782313, LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 gene polymorphisms, considering the dominant genetic model for all genes

Gene Genotypes Pre-pregnancy Pregnancy Delta (∆)†

Mean (95% CI)

p-

value*

Mean (95% CI)

p-

value*

Mean (95% CI)

p-

value*

Total energy (kcal/day)a

FTO TT (n=47) 2311 (2088, 2557) 0.627 2091 (1904, 2297) 0.041 -259.8 (-494.9, -24.7) 0.015

AT+AA (n=90) 2246 (2103, 2399) 2353 (2202, 2513) 112.6 (-68.2, 293.6)

MC4R TT (n=89) 2307 (2158, 2467) 0.593 2342 (2185, 2511) 0.072 39.8 (-146.6, 226.3) 0.193

CT+CC (n=47) 2236 (2028, 2465) 2113 (1943, 2297) -160.1 (-385.8, 65.5)

LEP GG (n=63) 2284 (2101, 2483) 0.897 2384 (2209, 2574) 0.098 75.0 (-164.3, 314.3) 0.281

GA+AA (n=74) 2268 (2106, 2442) 2176 (2014, 2351) -84.8 (-265.0, 95.5)

LEPR AA (n=35) 2214 (1992, 2460) 0.530 2347 (2124, 2593) 0.427 123.5 (-148.5, 395.4) 0.235

AG+GG (n=102) 2303 (2160, 2457) 2232 (2091, 2382) -74.8 (-245.1, 95.5)

% of energy from Carbohydrates

FTO TT (n=47) 54.6 (52.7, 56.4) 0.020 58.3 (56.7, 59.9) 0.970 3.8 (1.4, 6.1) 0.056

AT+AA (n=90) 57.0 (55.8, 58.2) 58.2 (57.2, 59.4) 1.2 (-0.2, 2.7)

MC4R TT (n=89) 56.6 (55.3, 57.9) 0.315 58.2 (57.0, 57.2) 0.509 1.6 (0.0, 3.1) 0.213

CT+CC (n=47) 55.6 (53.9, 57.2) 58.8 (57.2, 60.4) 3.2 (1.1, 5.3)

LEP GG (n=63) 55.6 (54.0, 57.0) 0.302 58.9 (57.7, 60.1) 0.231 3.3 (1.5, 5.2) 0.080

GA+AA (n=74) 56.6 (55.3, 58.0) 57.8 (56.4, 59.2) 1.2 (-0.5, 2.8)

LEPR AA (n=35) 56.8 (54.8, 58.9) 0.497 57.4 (55.6, 59.2) 0.240 0.6 (-2.0, 3.1) 0.157

AG+GG (n=102) 56.1 (55.2, 57.2) 58.6 (57.6, 59.7) 2.6 (1.2, 4.0)

% of energy from Proteina

FTO TT (n=47) 16.5 (15.7, 17.4) 0.225 16.6 (15.7, 17.7) 0.170 0.4 (-0.6, 1.3) 0.704

AT+AA (n=90) 15.8 (15.2, 16.5) 15.8 (15.2, 16.5) 0.1 (-0.7, 0.9)

MC4R TT (n=89) 16.1 (15.6, 16.8) 0.684 16.4 (15.7, 17.1) 0.160 0.4 (-0.4, 1.2) 0.347

CT+CC (n=47) 15.9 (15.0, 16.9) 15.5 (14.6, 16.5) -0.2 (-1.2, 0.8)

LEP GG (n=63) 16.0 (15.2, 16.8) 0.864 15.4 (14.6, 16.2) 0.036 -0.5 (-1.4, 0.4) 0.031

GA+AA (n=74) 16.1 (15.5, 16.7) 16.6 (15.8, 17.4) 0.8 (-0.0, 1.6)

LEPR AA (n=35) 15.6 (14.7, 16.5) 0.280 16.3 (15.1, 17.6) 0.678 1.0 (-0.4, 2.3) 0.158

AG+GG (n=102) 16.2 (15.6, 16.8) 16.0 (15.4, 16.7) -0.0 (-0.7, 0.7)


132

Gene Genotypes Pre-pregnancy Pregnancy Delta (∆)†

Mean (95% CI)

p-

value*

Mean (95% CI)

p-

value*

Mean (95% CI)

p-

value*

% of energy from Fat

FTO TT (n=47) 27.6 (25.9, 29.3) 0.099 24.6 (23.3, 25.9) 0.310 -3.0 (-5.0, -0.9) 0.031

AT+AA (n=90) 26.1 (25.2, 27.0) 25.4 (24.5, 26.3) -0.7 (-1.8, 0.3)

MC4R TT (n=89) 26.0 (25.0, 27.1) 0.085 25.0 (24.1, 25.9) 0.852 -1.0 (-2.3, 0.2) 0.185

CT+CC (n=47) 27.6 (26.1, 29.0) 25.1 (23.9, 26.4) -2.4 (-4.1, -0.8)

LEP GG (n=63) 27.2 (25.8, 28.5) 0.292 25.3 (24.2, 26.3) 0.776 -1.9 (-3.3, -0.5) 0.482

GA+AA (n=74) 26.2 (25.1, 27.4) 25.0 (23.9, 26.1) -1.2 (-2.6, 0.2)

LEPR AA (n=35) 26.8 (25.0, 28.7) 0.762 25.8 (24.4, 27.2) 0.242 -1.0 (-2.9, 0.9) 0.549

AG+GG (n=102) 26.5 (25.6, 27.5) 24.9 (24.0, 25.7) -1.7 (-2.9, 0.5)

% of energy from Ultra-processed foods

FTO TT (n=47) 47.0 (43.6, 50.4) 0.881 40.6 (36.9, 44.3) 0.041 -6.4 (-10.2, -2.6) 0.026

AT+AA (n=90) 46.7 (44.1, 49.3) 45.6 (47.7, 48.5) -1.1 (-3.9, 1.7)

MC4R TT (n=89) 45.5 (42.9, 48.2) 0.091 42.8 (39.8, 45.8) 0.283 -2.7 (-5.7, 0.3) 0.651

CT+CC (n=47) 49.2 (46.0, 52.5) 45.4 (42.0, 48.8) -3.8 (-7.4, -0.2)

LEP GG (n=63) 46.8 (43.8, 49.9) 0.899 44.7 (41.5, 47.9) 0.408 -2.1 (-5.4, 1.2) 0.346

GA+AA (n=74) 47.1 (44.2, 50.0) 42.8 (39.5, 46.1) -4.3 (-7.5, -1.1)

LEPR AA (n=35) 49.4 (45.0, 53.8) 0.176 43.6 (38.7, 48.5) 0.868 -5.8 (-11.1, -0.4) 0.166

AG+GG (n=102) 46.2 (43.9, 48.5) 44.1 (41.4, 46.7) -2.1 (-4.6, 0.4)

Abbreviations: FTO = fat mass and obesity-associated gene; MC4R = melanocortin-4 receptor gene; LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; CI = confidence interval.

Notes: aDuring pre-pregnancy and pregnancy log transformed values were used, but estimates provided in the table were back-transformed and data are presented as geometric mean

(95%CI). †Delta (∆) refers to the difference between values during pregnancy and pre-pregnancy performed with the untransformed variable, to compare differences between groups of

the genotypes. * p-value refers to Student’s t-test with the assumption of dominant genetic model.


133

Table 3. Linear regression models between FTO-rs9939609, MC4R-rs17782313, LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 gene polymorphisms and daily

dietary intake before and during pregnancy, considering the dominant* genetic model for all genes

Outcomes Gene Pre-pregnancy Pregnancy

Crude Adjusted† Crude Adjusted†

β (95% CI) p-

value

β (95% CI) p-

value

β (95% CI)

p-

value

β (95% CI) p-

value

(log)Total energya

(kcal/day)

FTO -0.014 (-0.065, 0.037) 0.598 0.020 (-0.031, 0.071) 0.441 0.055 (0.006, 0.105) 0.028 0.054 (0.003, 0.106) 0.039

MC4R -0.015 (-0.065, 0.034) 0.544 -0.025 (-0.074, 0.024) 0.311 0.046 (-0.088, 0.011) 0.124 -0.040 (-0.091, 0.010) 0.115

LEP 0.002 (-0.046, 0.050) 0.939 0.018 (-0.029, 0.065) 0.447 -0.036 (-0.084, 0.011) 0.131 -0.032 (-0.081, 0.017) 0.202

LEPR -0.004 (-0.057, 0.050) 0.896 -0.009 (-0.060, 0.042) 0.728 -0.018 (-0.072, 0.037) 0.525 -0.021 (-0.078, 0.035) 0.452

% of energy from

Carbohydrates FTO 2.5 (0.4, 4.5) 0.018 2.7 (0.5, 4.8) 0.016 0.1 (-1.8, 1.9) 0.963 0.2 (-1.8, 2.2) 0.830

MC4R -0.4 (-2.5, 1.7) 0.703 -0.25 (-2.4, 1.9) 0.822 0.7 (-1.2, 2.6) 0.451 0.8 (-1.1, 2.8) 0.402

LEP 1.0 (-0.9, 3.0) 0.295 1.19 (-0.9, 3.2) 0.255 -1.1 (-2.9, 0.8) 0.253 -0.6 (-2.5, 1.3) 0.525

LEPR -0.5 (-2.7, 1.7) 0.643 -0.48 (-2.7, 1.8) 0.668 1.3 (-0.8, 3.3) 0.214 1.5 (-0.6, 3.6) 0.169

(log) Proteina FTO -0.019 (-0.047, 0.008) 1.167 -0.038 (-0.066, -0.009) 0.009 -0.024 (-0.057, 0.008) 0.139 -0.041 (-0.074, -0.009) 0.012

MC4R -0.010 (-0.37, 0.018) 0.494 -0.010 (-0.038, 0.018) 0.492 -0.026 (-0.058, 0.006) 0.111 -0.029 (-0.061, 0.003) 0.079

LEP 0.005 (-0.021, 0.032) 0.689 -0.003 (-0.030, 0.024) 0.812 0.030 (-0.001, 0.061) 0.053 0.023 (-0.008, 0.053) 0.146

LEPR 0.022 (-0.006, 0.052) 0.126 0.022 (-0.006, 0.051) 0.125 0.009 (-0.045, 0.026) 0.613 -0.015 (-0.050, 0.020) 0.408

Fat FTO -1.4 (-3.2, 0.3) 0.101 -0.9 (-2.7, 1.0) 0.356 0.8 (-0.7, 2.3) 0.315 1.2 (-0.3, 2.8) 0.122

MC4R 1.2 (-0.5, 2.9) 0.176 0.9 (-0.9, 2.7) 0.331 0.2 (-1.4, 1.7) 0.839 0.1 (-1.4, 1.7) 0.863

LEP -0.9 (-2.6, 0.7) 0.268 -0.7 (-2.4, 1.1) 0.456 -0.2 (-1.7, 1.3) 0.792 -0.4 (-1.9, 1.2) 0.628

LEPR -0.7 (-2.5, 1.2) 0.475 -0.5 (-2.4, 1.3) 0.568 -1.0 (-2.6, 0.7) 0.237 -1.0 (-2.6, 0.8) 0.269

Ultra-processed

foods

FTO -0.8 (-4.3, 4.1) 0.969 2.0 (-2.3, 6.3) 0.366 5.3 (0.5, 10.1) 0.031 6.3 (1.4, 11.1) 0.012

MC4R 3.5 (-0.6, 7.6) 0.098 3.8 (-0.4, 8.0) 0.078 3.0 (-1.8, 7.8) 0.208 3.8 (-0.9, 8.6) 0.114

LEP -0.5 (-4.6, 3.6) 0.823 1.1 (-3.0, 5.3) 0.585 -1.6 (-6.2, 3.0) 0.486 -1.5 (-6.1, 3.1) 0.514

LEPR -4.2 (-8.6, 0.3) 0.065 -3.7 (-8.0, 0.6) 0.095 0.7 (-4.6, 6.0) 0.787 0.7 (-4.6, 6.0) 0.791 Abbreviations: FTO = fat mass and obesity-associated gene; MC4R = melanocortin-4 receptor gene; LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; β = linear regression coefficient; CI = confidence

interval.

Notes:

aLog transformed values were used. *Dominant genetic model (FTO = TT vs. AT + AA; MC4R = TT vs. CT + CC; LEP = GG vs. GA + AA; LEPR = AA vs. AG + GG). †Models were adjusted for maternal age, self-reported skin color, parity, gestational age, per capita income and pre-pregnancy body mass index.


134

Table 4. Longitudinal analysis between FTO-rs9939609, MC4R-rs17782313, LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 gene polymorphisms and

daily dietary intake, according to genotypes.

SNPs/

Genotypes

(log) Total energy

(kcal)a, †

% of energy from†

Carbohydrates (log) Proteina Fat Ultra-processed foods

β‡ (95% CI) p-

value

β‡ (95% CI)

p-

value

β‡ (95% CI)

p-

value

β‡ (95% CI)

p-

value

β‡ (95% CI)

p-

value

FTO-rs9939609

AT vs. TT 0.024

(-0.018, 0.065) 0.260

1.4

(-0.2, 2.9) 0.083

-0.022

(-0.048, 0.003) 0.090

-0.2

(-1.5, 1.2) 0.789

2.1

(-1.9, 6.1) 0.311

AT+AA vs. TT 0.031

(-0.008, 0.070) 0.121

1.2

(-0.3, 2.7) 0.112

-0.026

(-0.050, -0.002) 0.037

0.1

(-1.2, 1.3) 0.957

2.6

(-1.2, 6.4) 0.186

MC4R-rs17782313

CT vs. TT -0.032

(-0.073, 0.009) 0.122

-0.1

(-1.6, 1.5) 0.946

-0.013

(-0.038, 0.013) 0.326

0.6

(-0.7, 1.9) 0.348

4.4

(0.5, 8.3) 0.026

CT+CC vs. TT -0.033

(-0.073, 0.006) 0.101

0.1

(-1.5, 1.6) 0.927

-0.017

(-0.042, 0.008) 0.183

0.7

(-0.6, 2.0) 0.300

4.2

(0.4, 8.0) 0.030

LEP-rs7799039

GA vs. GG -0.011

(-0.051, 0.029) 0.581

0.5

(-1.0, 2.0) 0.518

0.008

(-0.017, 0.033) 0.523

-1.0

(-2.4, 0.3) 0.143

-1.7

(-5.5, 2.1) 0.377

GA+AA vs. GG -0.014

(-0.052, 0.024) 0.462

0.1

(-1.4, 1.5) 0.960

0.013

(-0.011, 0.036) 0.287

0.6

(-1.9, 0.7) 0.365

-0.3

(-4.0, 3.3) 0.856

LEPR-rs1137101

AG vs. AA -0.004

(-0.050, 0.042) 0.871

0.8

(-0.9, 2.5) 0.359

0.009

(-0.020, 0.037) 0.554

-1.0

(-2.5, 0.4) 0.167

-2.4

(-6.8, 1.9) 0.280

AG+GG vs. AA -0.006

(-0.048, 0.037) 0.797

0.5

(-1.2, 2.1) 0.582

0.009

(-0.018, 0.036) 0.513

-0.8

(-2.1, 0.6) 0.272

-1.9

(-5.9, 2.2) 0.364

Abbreviations: SNPs = single nucleotide polymorphisms; FTO = fat mass and obesity-associated gene; MC4R = melanocortin-4 receptor gene; LEP = leptin; LEPR = leptin

receptor; CI =confidence interval.

Notes: aLog transformed values were used. †Models were adjusted for gestational age (wk), maternal age, self-reported skin color, parity, per capita income and pre-pregnancy body mass index. ‡β= Linear mixed-effect regression coefficient; p-value refers to the maximum likelihood estimator.


135

Supplementary Table 1. Genotype distribution and allele frequencies of the FTO-rs9939609,

MC4R-rs17782313, LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 gene polymorphisms

SNPs Study sample

n (%) p-value (HW)†

FTO-rs9939609 (n=146)

TT 47 (32.2) 0.518

AT 75 (51.4)

AA 24 (16.4)

T-allele 169 (58.0)

A-allele 123 (42.0)

MC4R-rs17782313 (n=145)

TT 94 (64.8) 0.511

CT 47 (32.4)

CC 4 (2.8)

T-allele 235 (81.0)

C-allele 55 (19.0)

LEP-rs7799039 (n=147)

GG 70 (47.6) 0.816

GA 62 (42.2)

AA 15 (10.2)

G-allele 202 (69.0)

A-allele 92 (31.0)

LEPR-rs1137101 (n=147)

AA 39 (26.5) 0.364

AG 68 (46.3)

GG 40 (27.2)

A-allele 146 (50.0)

G-allele 148 (50.0) Abbreviations: SNPs = single nucleotide polymorphisms; FTO = fat mass and obesity-associated gene; MC4R =

melanocortin-4 receptor gene; LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; HW = Hardy–Weinberg equilibrium.

Note: †Hardy–Weinberg equilibrium test, p-value refers to Pearson χ2 tests.

(FTO = TT, Wild type; AT, heterozygote; and AA, homozygote for risk allele); (MC4R = TT, Wild type; CT,

heterozygote; and CC, homozygote for risk allele); (LEP = GG, Wild type; GA, heterozygote; and AA,

homozygote for risk allele); (LEPR = AA, Wild type; AG, heterozygote; and GG, homozygote for risk allele).

CONCLUSÕES

136

8. CONCLUSÕES

A presente tese apresentou três artigos científicos como principais produtos. As

principais conclusões foram:

Gene FTO (rs9939609)

O SNP do gene do FTO-rs9939609 foi significativamente associado ao o excesso de

peso pré-gestacional; no entanto, mulheres portadoras do genótipo AA ganharam menos peso

ao longo da gestação quando comparadas a mulheres com os genótipos AT e TT. No presente

estudo não foram encontradas associações deste polimorfismo com o GPG e a retenção de

peso pós-parto. Contudo, foram encontradas associações significativas com a percentagem

mais elevada de energia derivada dos carboidratos no período pré-gestacional, e também a

percentagem mais elevada de energia total e a percentagem de energia derivada de alimentos

ultraprocessados durante a gestação. Adicionalmente, este polimorfismo foi associado

negativamente ao percentual de energia proveniente das proteínas nos períodos pré-


Gene MC4R (rs17782313)

O polimorfismo no gene MC4R-rs17782313 (alelo C) não foi associado ao excesso de

peso pré-gestacional, o GPG e a retenção de peso pós-parto. Porém, foi associado à

percentagem mais elevada de energia derivada de alimentos ultraprocessados ao longo do

período gestacional, em comparação com aquelas portadoras do genótipo TT.

Gene LEP (rs7799039)

Este polimorfismo não foi associado estatisticamente ao risco de excesso de peso pré-

gestacional, concentração plasmática de leptina durante a gestação ou com os parâmetros de

consumo alimentar nos períodos pré-gestacional e gestacional. As mulheres portadoras de

genótipo AA do gene LEP-rs7799039 apresentaram menor peso corporal ao longo da

gestação em comparação com as portadoras dos genótipos GG ou GA+GG; mas o alelo A

mostrou-se significativamente associado ao maior risco de GPG excessivo.

CONCLUSÕES

137

LEPR (rs1137101)

Não foi encontrada nenhuma associação estatisticamente significante deste

polimorfismo ao peso pré-gestacional excessivo, GPG excessivo, concentração plasmática de

leptina ao longo da gestação e parâmetros de consumo alimentar antes e durante a gestação.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

138

9. CONSIDERAÇÕES FINAIS

À medida que a prevalência de obesidade continua a aumentar em todo o mundo,

cresce a necessidade de maior compreensão dos mecanismos desta doença para que se possa

promover a sua prevenção, minimizar os impactos à saúde e reduzir a carga econômica. Com

este propósito, pesquisadores estão investigando maneiras pelas quais a genética pode estar

causando impacto nesta epidemia. Alguns avanços foram alcançados, porém ainda existem

lacunas e muitos estudos ainda precisam ser realizados na busca por evidências mais

consistentes. A genética vinculada ao processo gestacional é uma área de relevância a ser

explorada, pois a obesidade materna está relacionada a vários mecanismos de risco de

complicações gestacional para a mãe e o feto. Apesar desta importancia, ainda é escasso ou

inexistente o conhecimento sobre como os genes contribuem para as mudanças de peso ao

longo da gestação.

A presente tese apresentou resultados sobre as associações dos SNPs dos genes

relacionados à obesidade com as mudanças de peso corporal e consumo alimentar em

mulheres gestantes. Os genes FTO-rs9939609, MC4R-rs17782313 e LEPR-rs1137101 são

altamente expressos no cérebro, particularmente no hipotalamo, enfatizando sua importância

nos mecanismos relacionados ao sistema nervoso central para o controle da obesidade. É

reconhecido que o apetite e o comportamento alimentar sofrem influência genética e há

indícios de que o componente genético atue sobre o gasto energético, notadamente sobre a

taxa metabólica basal. Contudo, diversos são os desafios da via biológica da obesidade

comum e muitos questionamentos ainda precisam ser mais bem explorados.

Os fatores relacionados aos padrões alimentares e à prática de atividade física são

considerados fatores ambientais de risco da obesidade. A saúde materna e o consumo

alimentar, antes e durante o período gestacional, são importantes fatores para o

desenvolvimento adequado da gestação. Entre os genes estudados, o FTO-rs9939609 e o

MC4R-rs17782313 foram associados aos parâmetros de consumo alimentar, além de o gene

FTO-rs9939609 também ter sido associado ao excesso do peso pré-gestacional. O gene LEP-

rs7799039 foi associado ao risco de GPG excessivo. Assim, os resultados deste estudo

agregam novos conhecimentos à literatura científica e podem contribuir para o

direcionamento de novas pesquisas sobre evidências genéticas e desfechos gestacionais.

Com o avanço no conhecimento do genoma humano e o desenvolvimento de

tecnologias abrangentes, provavelmente será possível abordar simultaneamente as

CONSIDERAÇÕES FINAIS

139

características genéticas e ambientais e contribuir para o desenvolvimento de medidas que

objetivem a redução da prevalência da obesidade e suas comorbidades. Nesta perspectiva, são

necessários novos estudos longitudinais para avaliar as associações entre os polimorfismos

genéticos e parâmetros relacionados ao peso e ao consumo alimentar antes, durante e após a

gestação.

Os resultados da presente tese são inovadores, pois avaliam a influência genética sobre

as mudanças do peso corporal e do consumo alimentar na gestação com técnicas estatísticas

longitudinais ajustadas para o efeito de outras potenciais variáveis confundidoras. A

compreensão e a interligação dos fatores que exercem influência na gestação e nos seus

desfechos adversos são de suma importância para propor mudanças nos hábitos modificáveis

e estabelecer medidas de prevenção do excesso de peso na gestação.

REFERÊNCIAS DA TESE

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APÊNDICES

153

11. APÊNDICES

APÊNDICE A Do-files Tabelas Artigo 1

154

APÊNDICE A

Do-files Tabelas Artigo 1

****************************************************************************************************

Table 1 Maternal characteristics according to the FTO (rs9939609) and the MC4R (rs17782313) gene polymorphisms

****************************************************************************************************

Amostra Total

tabstat idade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, stat (med p25 p75 n)

tab new_cor_referida_cat if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1

tabstat anos_escolaridade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, stat (med p25 p75 n)

tab new_sitconj_cat if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1

tab new_fumo_cat2 if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1

tab faz_ativ_lazer_antes if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1

tab paridade1 if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1

tab sexo_bebe if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 tabstat kcaltotal1tr if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 & kcaltotal1tr<5000, stat (med p25 p75 n)

sum peso_pre_relatado estaturamedia imcreferido if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1

sum peso_atual if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1



sum retenção_peso_referido if amostra_genetica==7 & trimestre==4 & status_peso_prereferido==1

Recessive model FTO (TT/AT vs AA

tabstat idade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, stat (med p25 p75 n) by (poliFTO_2cat)

ranksum idade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, by (poliFTO_2cat)

tab poliFTO_2cat new_cor_referida_cat if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 tabstat anos_escolaridade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, stat (med p25 p75 n) by (poliFTO_2cat)

ranksum anos_escolaridade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, by (poliFTO_2cat)

tab poliFTO_2cat new_sitconj_cat if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row exact chi2

tab poliFTO_2cat new_fumo_cat2 if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact tab poliFTO_2cat faz_ativ_lazer_antes if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact

tab poliFTO_2cat paridade1 if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact

tab poliFTO_2cat sexo_bebe if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 tabstat kcaltotal1tr if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 & kcaltotal1tr<5000, stat (med p25 p75 n) by (poliFTO_2cat)

ranksum kcaltotal1tr if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 & kcaltotal1tr<5000, by (poliFTO_2cat)

ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(poliFTO_2cat)

ttest estaturamedia if trimestre==1 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(poliFTO_2cat)

ttest imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(poliFTO_2cat)

ttest peso_atual if trimestre==1 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(poliFTO_2cat)



ttest retenção_peso_referido if trimestre==4 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(poliFTO_2cat)

Additive model FTO (TT vs AT vs AA)

tabstat idade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, stat (med p25 p75 n) by (poliFTO)

kwallis idade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, by (poliFTO)

tab poliFTO new_cor_referida_cat if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 tabstat anos_escolaridade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, stat (med p25 p75 n) by (poliFTO)

kwallis anos_escolaridade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, by (poliFTO)

tab poliFTO new_sitconj_cat if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row exact chi2

tab poliFTO new_fumo_cat2 if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact

tab poliFTO faz_ativ_lazer_antes if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact

tab poliFTO paridade1 if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact

tab poliFTO sexo_bebe if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 tabstat kcaltotal1tr if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 & kcaltotal1tr<5000, stat (med p25 p75 n) by (poliFTO)

kwallis kcaltotal1tr if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 & kcaltotal1tr<5000, by (poliFTO)

by poliFTO:sum peso_pre_relatado if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1

anova peso_pre_relatado poliFTO if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1

pwmean peso_pre_relatado, over(poliFTO) effects sort mcompare(tukey)

by poliFTO: sum estaturamedia if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1

anova estaturamedia poliFTO if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1

pwmean estaturamedia, over(poliFTO) effects sort mcompare(tukey)

by poliFTO: sum imcreferido if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1

anova imcreferido poliFTO if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1


155

pwmean imcreferido, over(poliFTO) effects sort mcompare(tukey)

by poliFTO: sum peso_atual if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1

anova peso_atual poliFTO if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1

pwmean peso_atual, over(poliFTO) effects sort mcompare(tukey)







by poliFTO: sum retenção_peso_referido if amostra_genetica==7 & trimestre==4 & status_peso_prereferido==1

anova retenção_peso_referido poliFTO if amostra_genetica==7 & trimestre==4 & status_peso_prereferido==1

pwmean retenção_peso_referido, over(poliFTO) effects sort mcompare(tukey)

Dominant model MC4R (TT vs CT/CC)

tabstat idade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, stat (med p25 p75 n) by (poliMC4R2)

ranksum idade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, by (poliMC4R2)

tab poliMC4R2 new_cor_referida_cat if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 tabstat anos_escolaridade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, stat (med p25 p75 n) by (poliMC4R2)

ranksum anos_escolaridade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, by (poliMC4R2)

tab poliMC4R2 new_sitconj_cat if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row exact chi2

tab poliMC4R2 new_fumo_cat2 if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact

tab poliMC4R2 faz_ativ_lazer_antes if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact

tab poliMC4R2 paridade1 if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact

tab poliMC4R2 sexo_bebe if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 tabstat kcaltotal1tr if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 & kcaltotal1tr<5000, stat (med p25 p75 n) by

(poliMC4R2) ranksum kcaltotal1tr if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 & kcaltotal1tr<5000, by (poliMC4R2)

ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(poliMC4R2)

ttest estaturamedia if trimestre==1 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(poliMC4R2)

ttest imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(poliMC4R2)

ttest peso_atual if trimestre==1 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(poliMC4R2)



ttest retenção_peso_referido if trimestre==4 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(poliMC4R2)

****************************************************************************************************

Table 2 Associations of adiposity risk alleles (FTO and MC4R) with body weight changes before, during pregnancy

and early postpartum

****************************************************************************************************

*******************************************regressão linear múltipla**************************************

FTO - GWG in 1st trimester (g/wk) regress gan_peso_sem_1per i.poliFTO_2cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1

regress gan_peso_sem_1per i.poliFTO_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat sg1seg i.paridade1 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1

regress gan_peso_sem_1per i.poliFTO_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat sg1seg i.paridade1 imcreferido

imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1

FTO - GWG in 2nd trimester (g/wk) regress gan_peso_sem_2per i.poliFTO_2cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress gan_peso_sem_2per i.poliFTO_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 sg2seg if

amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1

regress gan_peso_sem_2per i.poliFTO_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 sg2seg imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1

FTO - GWG in 3rd trimester (g/wk) regress gan_peso_sem_3per i.poliFTO_2cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1

regress gan_peso_sem_3per i.poliFTO_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 sg3seg if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1

regress gan_peso_sem_3per i.poliFTO_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 sg3seg imcreferido


FTO - Total GWG, (kg) regress ganhopesogest_ref i.poliFTO_2cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress ganhopesogest_ref i.poliFTO_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat sg4seg i.paridade1 if

amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1


156

regress ganhopesogest_ref i.poliFTO_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat sg4seg i.paridade1 imcreferido


FTO - PPWR, (g/wk) regress retenção_peso_referido_corr i.poliFTO_2cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1

regress retenção_peso_referido_corr i.poliFTO_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.paridade1 i.new_cor_referida_cat if

amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress retenção_peso_referido_corr i.poliFTO_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.paridade1 i.new_cor_referida_cat

ganhopesogest_ref if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1

MC4R2 - GWG in 1st trimester (g/wk) regress gan_peso_sem_1per i.poliMC4R2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1

regress gan_peso_sem_1per i.poliMC4R2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat sg1seg i.paridade1 if

amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress gan_peso_sem_1per i.poliMC4R2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat sg1seg i.paridade1 imcreferido


MC4R2 - GWG in 2nd trimester (g/wk) regress gan_peso_sem_2per i.poliMC4R2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1

regress gan_peso_sem_2per i.poliMC4R2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 sg2seg if

amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress gan_peso_sem_2per i.poliMC4R2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 sg2seg imcreferido


MC4R2 - GWG in 3rd trimester (g/wk) regress gan_peso_sem_3per i.poliMC4R2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1

regress gan_peso_sem_3per i.poliMC4R2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 sg3seg if

amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress gan_peso_sem_3per i.poliMC4R2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 sg3seg imcreferido


MC4R2 - Total GWG, (kg) regress ganhopesogest_ref i.poliMC4R2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1

regress ganhopesogest_ref i.poliMC4R2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat sg4seg i.paridade1 if

amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress ganhopesogest_ref i.poliMC4R2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat sg4seg i.paridade1 imcreferido


MC4R - PPWR, (g/wk) regress retenção_peso_referido_corr i.poliMC4R2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1

regress retenção_peso_referido_corr i.poliMC4R2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.paridade1 i.new_cor_referida_cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1

regress retenção_peso_referido_corr i.poliMC4R2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.paridade1 i.new_cor_referida_cat

ganhopesogest_ref if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1

**********************************************regressão de Poisson**************************************

FTO - RR pre-pregnancy BMI - overweight (BMI >=25 kg/m2 poisson catimcrefer_new0 i.poliFTO_2cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust)

poisson catimcrefer_new0 i.poliFTO_2cat i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat idade anos_escolaridade i.faz_ativ_lazer_antes

i.paridade1 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson catimcrefer_new0 i.poliFTO_2cat i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat idade anos_escolaridade i.faz_ativ_lazer_antes

i.paridade1 estaturamedia if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust)

FTO - RR total GWG by IOM category - insufficiente poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.poliFTO_2cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust)

poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.poliFTO_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 if

amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.poliFTO_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 imcreferido

imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust)

FTO - RR total GWG by IOM category - excessive poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.poliMC4R2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.poliMC4R2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 if

amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust)

poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.poliMC4R2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust)

FTO - RR postpartum BMI overweight (BMI >=25 kg/m2) poisson new_imc_catposparto0 i.poliFTO_2cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust)

poisson new_imc_catposparto0 i.poliFTO_2cat i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat idade anos_escolaridade i.faz_ativ_lazer_antes

i.paridade1 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust)


157

poisson new_imc_catposparto0 i.poliFTO_2cat i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat idade anos_escolaridade i.faz_ativ_lazer_antes

i.paridade1 imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust)

MC4R - RR pre-pregnancy BMI - overweight (BMI >=25 kg/m2) poisson catimcrefer_new0 i.poliMC4R2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust)

poisson catimcrefer_new0 i.poliMC4R2 i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat idade anos_escolaridade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1

if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson catimcrefer_new0 i.poliMC4R2 i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat idade anos_escolaridade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1

estaturamedia if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust)

MC4R - RR total GWG by IOM category - insufficiente poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.poliMC4R2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust)

poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.poliMC4R2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 if

amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.poliMC4R2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 imcreferido


MC4R - RR total GWG by IOM category - excessive poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.poliMC4R2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust)

poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.poliMC4R2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 if

amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.poliMC4R2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 imcreferido


MC4R - RR postpartum BMI overweight (BMI >=25 kg/m2) poisson new_imc_catposparto0 i.poliMC4R2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust)

poisson new_imc_catposparto0 i.poliMC4R2 i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat idade anos_escolaridade i.faz_ativ_lazer_antes

i.paridade1 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson new_imc_catposparto0 i.poliMC4R2 i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat idade anos_escolaridade i.faz_ativ_lazer_antes

i.paridade1 imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust)

****************************************************************************************************

**Table 3 - Longitudinal analysis between FTO (rs9939609), MC4R (rs17782313) and trajectory of body weight

during pregnancy

****************************************************************************************************

FTO - Trajectory of maternal weight (TT or AT vs. AA) xi: xtmixed peso_atual i.poliFTO_2cat sg_padrao sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1, || id:

sg_padrao, covariance(uns) variance

xi: xtmixed peso_atual i.poliFTO_2cat sg_padrao anos_escolaridade i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat i.sexo_bebe idade i.faz_ativ_lazer_antes estaturamedia i.paridade1 sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1,|| id:


xi: xtmixed peso_atual i.poliFTO_2cat sg_padrao anos_escolaridade i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat i.sexo_bebe idade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 imcreferido imcreferido2 sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 &

status_peso_prereferido==1,|| id: sg_padrao, covariance(uns) variance

FTO - Trajectory of maternal weight (FTO#gestational age) xi: xtmixed peso_atual poliFTO_2cat##c.sg_padrao sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1, || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

xi: xtmixed peso_atual poliFTO_2cat##c.sg_padrao anos_escolaridade i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat i.sexo_bebe idade

i.faz_ativ_lazer_antes estaturamedia i.paridade1 sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1,|| id:


xi: xtmixed peso_atual poliFTO_2cat##c.sg_padrao anos_escolaridade i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat i.sexo_bebe idade

i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 imcreferido imcreferido2 sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1,|| id: sg_padrao, covariance(uns) variance

MC4R - Trajectory of maternal weight (TT vs. CT or CC) xi: xtmixed peso_atual i.poliMC4R2 sg_padrao sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1, || id:


xi: xtmixed peso_atual i.poliMC4R2 sg_padrao anos_escolaridade i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat i.sexo_bebe idade i.faz_ativ_lazer_antes estaturamedia i.paridade1 sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1,|| id:


xi: xtmixed peso_atual i.poliMC4R2 sg_padrao anos_escolaridade i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat i.sexo_bebe idade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 imcreferido imcreferido2 sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 &


Aggregate score (FTO/MC4R)0=(TT/TT) or (AAorAT/TT or CCorCT/TT) 1=(AAorAT/CCorCT) xi: xtmixed peso_atual i.fto2mc4r2mod_news_R sg_padrao sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 &

status_peso_prereferido==1, || id: sg_padrao, covariance(uns) variance


158

xi: xtmixed peso_atual i.fto2mc4r2mod_news_R sg_padrao anos_escolaridade i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat i.sexo_bebe idade

i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 estaturamedia sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1,|| id:

sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed peso_atual i.fto2mc4r2mod_news_R sg_padrao anos_escolaridade i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat i.sexo_bebe idade

i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 imcreferido imcreferido2 sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 &


APÊNDICE B Do-files Tabelas Artigo 2

159

APÊNDICE B

Do-files Tabelas Artigo 2 ****************************************************************************************************

Table 1. Maternal characteristic of the study population stratifying for pre-pregnancy BMI categories.

****************************************************************************************************

Study population tabstat idade if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 , stat (med p25 p75 n) tab new_cor_referida_cat if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1

tabstat anos_escolaridade if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 , stat (med p25 p75 n)

tab new_fumo_cat2 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 tabstat kcaltotal1tr if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 , stat (med p25 p75 n)

tab faz_ativ_lazer_antes if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 tab paridade3 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1

*********************************************

sum peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 sum ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1

tab cat_gan_peso_ref_iom if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1

ci logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 ci logleptina_trial if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1

ci logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1

Underweight or normal weight (BMI < 25 kg/m2) vs Overweight/obese (BMI = >25kg/m2) tabstat idade if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 , stat (med p25 p75 n) by (catimcrefer_new) ranksum idade if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 , by (catimcrefer_new)

tab catimcrefer_new new_cor_referida_cat if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, row chi2 exact

tabstat anos_escolaridade if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 , stat (med p25 p75 n) by (catimcrefer_new) ranksum anos_escolaridade if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 , by (catimcrefer_new)

tab catimcrefer_new new_fumo_cat2 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, row chi2 exact

tabstat kcaltotal1tr if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 , stat (med p25 p75 n) by (catimcrefer_new) ranksum kcaltotal1tr if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 , by (catimcrefer_new)

tab catimcrefer_new faz_ativ_lazer_antes if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, row chi2 exact

tab catimcrefer_new paridade3 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, row chi2 exact *********************************************

ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (catimcrefer_new)

ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, by (catimcrefer_new)

tab catimcrefer_new cat_gan_peso_ref_iom if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, row chi2 exact

ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (catimcrefer_new)

ttest logleptina_trial if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1, by (catimcrefer_new) ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, by (catimcrefer_new)

****************************************************************************************************

Table 2. Genotype and allele frequencies of the LEP-rs7799039 and of the LEPR-rs1137101

polymorphisms of the study population stratifying for pre-pregnancy BMI ****************************************************************************************************

LEP - Study population

tab lep_rs7799039 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 genhwi 69 61 15 , label (GG GA AA)

LEP - Underweight or normal weight (BMI < 25 kg/m2) vs Overweight/obese (BMI = >25kg/m2)

tab catimcrefer_new snplep_rs7799039 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, row chi2 exact genhwi 42 39 13 , label (GG GA AA)

genhwi 27 22 2 , label (GG GA AA)

LEPR - Study population

tab rlep_rs1137101 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1

genhwi 38 68 39, label (AA AG GG) LEPR - Underweight or normal weight (BMI < 25 kg/m2) vs Overweight/obese (BMI = >25kg/m2)

tab catimcrefer_new snprlep_rs1137101 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, row chi2 exact

genhwi 26 42 26 , label (AA AG GG) genhwi 12 26 13 , label (AA AG GG)

****************************************************************************************************

Table 3. Distribution of the pre-pregnancy body weight and BMI, total GWG and plasma leptin concentrations

according to

genotypes of the LEP-rs7799039 and of the LEPR-rs1137101

**************************************************************************************************** LEP - Pre-pregnancy body weight (kg) - (GG vs GA vs AA)

oneway peso_pre_relatado snplep_rs7799039 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate

LEP - Pre-pregnancy body weight (kg) - (GA vs GG)

ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs7799039~=2, by (gen_rs7799039)

LEP - Pre-pregnancy body weight (kg) - (AA vs GG)

ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs7799039~=1, by (gen_rs7799039)


160

LEP - Pre-pregnancy body weight (kg) - (AA vs GA+GG)

ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs7799039)

LEP - Pre-pregnancy body weight (kg) - (GA+AA vs GG)

ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs7799039)

*********************************************

LEP - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (GG vs GA vs AA)

oneway imcreferido snplep_rs7799039 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate

LEP - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (GA vs GG)

ttest imcreferido if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs7799039~=2, by (gen_rs7799039) LEP - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (AA vs GG)

ttest imcreferido if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs7799039~=1, by (gen_rs7799039)

LEP - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (AA vs GA+GG)

ttest imcreferido if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs7799039)

LEP - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (GA+AA vs GG)

ttest imcreferido if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs7799039) *********************************************

LEP - Total GWG (kg) - (GG vs GA vs AA)

oneway ganhopesogest_ref snplep_rs7799039 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate

LEP - Total GWG (kg) - (GA vs GG)

ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs7799039~=2, by (gen_rs7799039)

LEP - Total GWG (kg) - (AA vs GG)

ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs7799039~=1, by (gen_rs7799039)

LEP - Total GWG (kg) - (AA vs GA+GG)

ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs7799039) LEP - Total GWG (kg) - (GA+AA vs GG)

ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs7799039)

********************************************* LEP - Leptina (ng/dL) First trimester - (GG vs GA vs AA)

oneway logleptina_trial snplep_rs7799039 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate

LEP - Leptina (ng/dL) First trimester - (GA vs GG)

ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs7799039~=2, by (gen_rs7799039)

LEP - Leptina (ng/dL) First trimester - (AA vs GG)

ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs7799039~=1, by (gen_rs7799039) LEP - Leptina (ng/dL) First trimester - (AA vs GA+GG)

ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs7799039)

LEP - Leptina (ng/dL) First trimester) - (GA+AA vs GG)

ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs7799039)

********************************************* LEP - Leptina (ng/dL) Second trimester - (GG vs GA vs AA)

oneway logleptina_trial snplep_rs7799039 if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate

LEP - Leptina (ng/dL) Second trimester - (GA vs GG)

ttest logleptina_trial if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs7799039~=2, by (gen_rs7799039)

LEP - Leptina (ng/dL) Second trimester - (AA vs GG)

ttest logleptina_trial if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs7799039~=1, by (gen_rs7799039) LEP - Leptina (ng/dL) Second trimester - (AA vs GA+GG)


LEP - Leptina (ng/dL) Second trimester) - (GA+AA vs GG)

ttest logleptina_trial if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs7799039)

*********************************************

LEP - Leptina (ng/dL) Third trimester - (GG vs GA vs AA)

oneway logleptina_trial snplep_rs7799039 if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, tabulate

LEP - Leptina (ng/dL) Third trimester - (GA vs GG)

ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs7799039~=2 & coorte_ou_ensaio3==1, by (gen_rs7799039)

LEP - Leptina (ng/dL) Third trimester - (AA vs GG)

ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs7799039~=1 & coorte_ou_ensaio3==1, by (gen_rs7799039)

LEP - Leptina (ng/dL) Third trimester - (AA vs GA+GG)

ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, by (re_gen_rs7799039) LEP - Leptina (ng/dL) Third trimester) - (GA+AA vs GG)

ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, by (gen_rs7799039)

********************************************* *********************************************

LEPR - Pre-pregnancy body weight (kg) - (AA vs AG vs GG)

oneway peso_pre_relatado snprlep_rs1137101 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate LEPR - Pre-pregnancy body weight (kg) - (AG vs AA)

ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs1137101~=2, by (gen_rs1137101)

LEPR - Pre-pregnancy body weight (kg) - (GG vs AA)

ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs1137101~=1, by (gen_rs1137101)

LEPR - Pre-pregnancy body weight (kg) - (GG vs AG+AA)

ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs1137101) LEPR - Pre-pregnancy body weight (kg) - (AG+GG vs AA)

ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs1137101)

*********************************************

LEPR - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (AA vs AG vs GG)

oneway imcreferido snprlep_rs1137101 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate


161

LEPR - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (AG vs AA)

ttest imcreferido if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs1137101~=2, by (gen_rs1137101)

LEPR - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (GG vs AA)

ttest imcreferido if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs1137101~=1, by (gen_rs1137101)

LEPR - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (GG vs AG+AA)

ttest imcreferido if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs1137101) LEPR - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (AG+GG vs AA)

ttest imcreferido if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs1137101)

********************************************* LEPR - Total GWG (kg) - (AA vs AG vs GG)

oneway ganhopesogest_ref snprlep_rs1137101 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate

LEPR - Total GWG (kg) - (AG vs AA)

ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs1137101~=2, by (gen_rs1137101)

LEPR - Total GWG (kg) - (GG vs AA)

ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs1137101~=1, by (gen_rs1137101) LEPR - Total GWG (kg) - (GG vs AG+AA)

ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs1137101)

LEPR - Total GWG (kg) - (AG+GG vs AA)

ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs1137101)

*********************************************

LEPR - Leptina (ng/dL) First trimester - (AA vs AG vs GG)

oneway logleptina_trial snprlep_rs1137101 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate

LEPR - Leptina (ng/dL) First trimester - (AG vs AA)

ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs1137101~=2, by (gen_rs1137101) LEPR - Leptina (ng/dL) First trimester - (GG vs AA)

ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs1137101~=1, by (gen_rs1137101)

LEPR - Leptina (ng/dL) First trimester - (GG vs AG+AA)


LEPR - Leptina (ng/dL) First trimester) - (AG+GG vs AA)

ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs1137101) *********************************************

LEPR - Leptina (ng/dL) Second trimester - (AA vs AG vs GG)

oneway logleptina_trial snprlep_rs1137101 if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate LEPR - Leptina (ng/dL) Second trimester - (AG vs AA)


LEPR - Leptina (ng/dL) Second trimester - (GG vs AA)


LEPR - Leptina (ng/dL) Second trimester - (GG vs AG+AA)


LEPR - Leptina (ng/dL) Second trimester) - (AG+GG vs AA)

ttest logleptina_trial if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs1137101) *********************************************

LEPR - Leptina (ng/dL) Third trimester - (AA vs AG vs GG)

oneway logleptina_trial snprlep_rs1137101 if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, tabulate LEPR - Leptina (ng/dL) Third trimester - (AG vs AA)

ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs1137101~=2 & coorte_ou_ensaio3==1, by

(gen_rs1137101) LEPR - Leptina (ng/dL) Third trimester - (GG vs AA)

ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs1137101~=1 & coorte_ou_ensaio3==1, by

(gen_rs1137101) LEPR - Leptina (ng/dL) Third trimester - (GG vs AG+AA)

ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, by (re_gen_rs1137101)

LEPR - Leptina (ng/dL) Third trimester) - (AG+GG vs AA)

ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, by (gen_rs1137101)

****************************************************************************************************

Table 4. Associations of the LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 polymorphisms with pre-pregnancy BMI,

GWG and leptin concentrations. **************************************************************************************************** LEP-rs7799039(GA vs GG)- Pre-pregnancy BMI (kg/m2)- Overweight/obese (>=25)- RR (95% CI)

poisson catimcrefer_new0 i.snplep_rs7799039 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2

anos_escolaridade kcaltotal1tr /// if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs7799039~=2, irr vce(robust)

LEP-rs7799039(AA vs GG)-Pre-pregnancy BMI (kg/m2)- Overweight/obese (>=25)- RR (95% CI)

poisson catimcrefer_new0 i.snplep_rs7799039 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2

anos_escolaridade kcaltotal1tr ///

if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs7799039~=1, irr vce(robust) LEP-rs7799039(AA vs GA+GG)-Pre-pregnancy BMI (kg/m2)- Overweight/obese (>=25)- RR (95% CI)

poisson catimcrefer_new0 i.re_gen_rs7799039 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2

anos_escolaridade kcaltotal1tr /// if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, irr vce(robust)

LEP-rs7799039(GA+AA vs GG)-Pre-pregnancy BMI (kg/m2)- Overweight/obese (>=25)- RR (95% CI)

poisson catimcrefer_new0 i.gen_rs7799039 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 anos_escolaridade kcaltotal1tr ///


162

if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, irr vce(robust)

**********************

LEP-rs7799039(GA vs GG)-Total GWG by IOM category - Insufficient - RR (95% CI)

poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.snplep_rs7799039 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2

logleptina_trial imcreferido sg4seg ///

if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 & snplep_rs7799039~=2, irr vce(robust) LEP-rs7799039(AA vs GG)-Total GWG by IOM category - Insufficient - RR (95% CI)


logleptina_trial imcreferido sg4seg /// if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 & snplep_rs7799039~=1, irr vce(robust)

LEP-rs7799039(AA vs GA+GG)-Total GWG by IOM category - Insufficient - RR (95% CI

poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.re_gen_rs7799039 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg ///

if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, irr vce(robust)

LEP-rs7799039(GA+AA vs GG)-Total GWG by IOM category - Insufficient - RR (95% CI

poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.gen_rs7799039 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2


logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, irr vce(robust)

**********************

LEP-rs7799039(GA vs GG)-Total GWG by IOM category - Excessive - RR (95% CI)

poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.snplep_rs7799039 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg ///

if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 & snplep_rs7799039~=2, irr vce(robust)

LEP-rs7799039(AA vs GG)-Total GWG by IOM category - Excessive - RR (95% CI)



if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 & snplep_rs7799039~=1, irr vce(robust) LEP-rs7799039(AA vs GA+GG)-Total GWG by IOM category - Excessive - RR (95% CI

poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.re_gen_rs7799039 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2

logleptina_trial imcreferido sg4seg /// if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, irr vce(robust)

LEP-rs7799039(GA+AA vs GG)-Total GWG by IOM category - Excessive - RR (95% CI

poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.gen_rs7799039 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg ///

if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, irr vce(robust)

********************** LEP-rs7799039(GA vs GG)-(log) Leptin by First trimester

regress logleptina_trial i.snplep_rs7799039 sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==1 & snplep_rs7799039~=2 & comp_dados_geneticos_2==1

LEP-rs7799039(AA vs GG)-(log) Leptin by First trimester

regress logleptina_trial i.snplep_rs7799039 sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==1 & snplep_rs7799039~=1 & comp_dados_geneticos_2==1

LEP-rs7799039(AA vs GA+GG)-(log) Leptin by First trimester

regress logleptina_trial i.re_gen_rs7799039 sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1

LEP-rs7799039(GA+AA vs GG)-(log) Leptin by First trimester

regress logleptina_trial i.gen_rs7799039 sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1

**********************

LEP-rs7799039(GA vs GG)-(log) Leptin by Second trimester

regress logleptina_trial i.snplep_rs7799039 sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if

trimestre==2 & snplep_rs7799039~=2 & comp_dados_geneticos_2==1

LEP-rs7799039(AA vs GG)-(log) Leptin by Second trimester


trimestre==2 & snplep_rs7799039~=1 & comp_dados_geneticos_2==1

LEP-rs7799039(AA vs GA+GG)-(log) Leptin by Second trimester

regress logleptina_trial i.re_gen_rs7799039 sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if

trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1

LEP-rs7799039(GA+AA vs GG)-(log) Leptin by Second trimester

regress logleptina_trial i.gen_rs7799039 sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if


********************** LEP-rs7799039(GA vs GG)-(log) Leptin by Third trimester


trimestre==3 & snplep_rs7799039~=2 & comp_dados_geneticos_2==1 LEP-rs7799039(AA vs GG)-(log) Leptin by Third trimester


trimestre==3 & snplep_rs7799039~=1 & comp_dados_geneticos_2==1 LEP-rs7799039(AA vs GA+GG)-(log) Leptin by Third trimester


trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 LEP-rs7799039(GA+AA vs GG)-(log) Leptin by Third trimester



**********************

**********************


163

LEPR-rs1137101(AG vs AA)- Pre-pregnancy BMI (kg/m2)- Overweight/obese (>=25)- RR (95% CI)

poisson catimcrefer_new0 i.snprlep_rs1137101 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2

anos_escolaridade kcaltotal1tr if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs1137101~=2, irr vce(robust) LEPR-rs1137101(GG vs AA)-Pre-pregnancy BMI (kg/m2)- Overweight/obese (>=25)- RR (95% CI)

poisson catimcrefer_new0 i.snprlep_rs1137101 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2

anos_escolaridade kcaltotal1tr if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs1137101~=1, irr vce(robust) LEPR-rs1137101(GG vs AG+AA)-Pre-pregnancy BMI (kg/m2)- Overweight/obese (>=25)- RR (95% CI)

poisson catimcrefer_new0 i.re_gen_rs1137101 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2

anos_escolaridade kcaltotal1tr if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, irr vce(robust) LEPR-rs1137101(AG+GG vs AA)-Pre-pregnancy BMI (kg/m2)- Overweight/obese (>=25)- RR (95% CI)

poisson catimcrefer_new0 i.gen_rs1137101 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2

anos_escolaridade kcaltotal1tr if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, irr vce(robust) **********************

LEPR-rs1137101(AG vs AA)-Total GWG by IOM category - Insufficient - RR (95% CI)

poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.snprlep_rs1137101 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 & snprlep_rs1137101~=2, irr

vce(robust)

LEPR-rs1137101(GG vs AA)-Total GWG by IOM category - Insufficient - RR (95% CI)

poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.snprlep_rs1137101 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2

logleptina_trial imcreferido sg4seg if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 & snprlep_rs1137101~=1, irr

vce(robust) LEPR-rs1137101(GG vs AG+AA)-Total GWG by IOM category - Insufficient - RR (95% CI)

poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.re_gen_rs1137101 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2

logleptina_trial imcreferido sg4seg if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, irr vce(robust) LEPR-rs1137101(AG+GG vs AA)-Total GWG by IOM category - Insufficient - RR (95% CI)

poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.gen_rs1137101 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2

logleptina_trial imcreferido sg4seg if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, irr vce(robust) **********************

LEPR-rs1137101(AG vs AA)-Total GWG by IOM category - Excessive - RR (95% CI)

poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.snprlep_rs1137101 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 & snprlep_rs1137101~=2, irr

vce(robust)

LEPR-rs1137101(GG vs AA)-Total GWG by IOM category - Excessive - RR (95% CI)

poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.snprlep_rs1137101 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2

logleptina_trial imcreferido sg4seg if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 & snprlep_rs1137101~=1, irr

vce(robust) LEPR-rs1137101(GG vs AG+AA)-Total GWG by IOM category - Excessive - RR (95% CI)

poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.re_gen_rs1137101 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, irr vce(robust)

LEPR-rs1137101(AG+GG vs AA)-Total GWG by IOM category - Excessive - RR (95% CI)

poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.gen_rs1137101 i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, irr vce(robust)

**********************

LEPR-rs1137101(AG vs AA)-(log) Leptin by First trimester

regress logleptina_trial i.snprlep_rs1137101 sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if

trimestre==1 & snprlep_rs1137101~=2 & comp_dados_geneticos_2==1

LEPR-rs1137101(GG vs AA)-(log) Leptin by First trimester



LEPR-rs1137101(GG vs AG+AA)-(log) Leptin by First trimester



LEPR-rs1137101(AG+GG vs AA)-(log) Leptin by First trimester



********************** LEPR-rs1137101(AG vs AA)-(log) Leptin by Second trimester


trimestre==2 & snprlep_rs1137101~=2 & comp_dados_geneticos_2==1 LEPR-rs1137101(GG vs AA)-(log) Leptin by Second trimester


trimestre==2 & snprlep_rs1137101~=1 & comp_dados_geneticos_2==1 LEPR-rs1137101(GG vs AG+AA)-(log) Leptin by Second trimester


trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1 LEPR-rs1137101(AG+GG vs AA)-(log) Leptin by Second trimester


trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1 **********************

LEPR-rs1137101(AG vs AA)-(log) Leptin by Third trimester

regress logleptina_trial i.snprlep_rs1137101 sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==3 & snprlep_rs1137101~=2 & comp_dados_geneticos_2==1

LEPR-rs1137101(GG vs AA)-(log) Leptin by Third trimester



LEPR-rs1137101(GG vs AG+AA)-(log) Leptin by Third trimester


164



LEPR-rs1137101(AG+GG vs AA)-(log) Leptin by Third trimester



****************************************************************************************************

Table 5. Longitudinal analysis between LEP-rs7799039 and LEPR-rs1137101 gene polymorphisms and maternal

body weight and leptin concentration throughout pregnancy **************************************************************************************************** LEP-rs7799039 - (log) Leptin ß(95% CI)

Co-dominant-(GA vs. GG) xi: xtmixed logleptina_trial i.snplep_rs7799039 sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2

peso_atual if trimestre>=1 & trimestre<=3 & snplep_rs7799039~=2 & comp_dados_geneticos_2==1 || id: sg_padrao, covariance(uns)

variance Co-dominant-(AA vs. GG)

xi: xtmixed logleptina_trial i.snplep_rs7799039 sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2

peso_atualif trimestre>=1 & trimestre<=3 & snplep_rs7799039~=1 & comp_dados_geneticos_2==1 || id: sg_padrao, covariance(uns)

variance

Recessive-(AA vs. GA+GG)

xi: xtmixed logleptina_trial i.re_gen_rs7799039 sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre>=1 & trimestre<=3 & comp_dados_geneticos_2==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

Dominant-(GA+AA vs. GG)

********************** LEP-rs7799039 - Maternal weight (kg)ß (95% CI)

Co-dominant-(GA vs. GG)

xi: xtmixed peso_atual i.snplep_rs7799039 sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 i.paridade3 anos_escolaridade estaturamedia if trimestre<=4 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs7799039~=2 &

coorte_ou_ensaio3==1|| id: sg_padrao, covariance(uns) variance

Co-dominant-(AA vs. GG) xi: xtmixed peso_atual i.snplep_rs7799039 sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2

i.paridade3 anos_escolaridade estaturamedia if trimestre<=4 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs7799039~=1 &

coorte_ou_ensaio3==1|| id: sg_padrao, covariance(uns) variance Recessive-(AA vs. GA+GG)

xi: xtmixed peso_atual i.re_gen_rs7799039 sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2

i.paridade3 anos_escolaridade estaturamedia if trimestre<=4 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1|| id: sg_padrao,

covariance(uns) variance

Dominant-(GA+AA vs. GG)

xi: xtmixed peso_atual i.gen_rs7799039 sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 i.paridade3 anos_escolaridade estaturamedia if trimestre<=4 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1|| id: sg_padrao,


********************** **********************

LEPR-rs1137101 - (log) Leptin ß(95% CI)

Co-dominant-(AG vs. AA) xi: xtmixed logleptina_trial i.snprlep_rs1137101 sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat

i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre>=1 & trimestre<=3 & snprlep_rs1137101~=2 & comp_dados_geneticos_2==1 || id: sg_padrao,

covariance(uns) variance Co-dominant-(GG vs. AA)

xi: xtmixed logleptina_trial i.snprlep_rs1137101 sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat

i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre>=1 & trimestre<=3 & snprlep_rs1137101~=1 & comp_dados_geneticos_2==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

Recessive-(GG vs. AG+AA)

xi: xtmixed logleptina_trial i.re_gen_rs1137101 sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre>=1 & trimestre<=3 & comp_dados_geneticos_2==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

Dominant-(AG+GG vs. AA)

xi: xtmixed logleptina_trial i.gen_rs1137101 sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre>=1 & trimestre<=3 & comp_dados_geneticos_2==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

**********************

LEPR-rs1137101 - Maternal weight (kg)ß (95% CI)

Co-dominant-(AG vs. AA)

xi: xtmixed peso_atual i.snprlep_rs1137101 sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2

i.paridade3 anos_escolaridade estaturamedia if trimestre<=4 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs1137101~=2 & coorte_ou_ensaio3==1|| id: sg_padrao, covariance(uns) variance

Co-dominant-(GG vs. AA) xi: xtmixed peso_atual i.snprlep_rs1137101 sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2

i.paridade3 anos_escolaridade estaturamedia if trimestre<=4 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs1137101~=1 &

coorte_ou_ensaio3==1|| id: sg_padrao, covariance(uns) variance Recessive-(GG vs. AG+AA)

xi: xtmixed peso_atual i.re_gen_rs1137101 sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2

i.paridade3 anos_escolaridade estaturamedia if trimestre<=4 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1|| id: sg_padrao, covariance(uns) variance

Dominant-(AG+GG vs. AA)


165

xi: xtmixed peso_atual i.gen_rs1137101 sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2

i.paridade3 anos_escolaridade estaturamedia if trimestre<=4 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1|| id: sg_padrao,


APÊNDICE C Do-files Tabelas Artigo 3

166

APÊNDICE C

Do-files Tabelas Artigo 3

****************************************************************************************************

Table 1 – Maternal descriptive characteristics and dietary intake of the study sample

****************************************************************************************************

Sociodemographic and lifestyle

tabstat idade if trimestre==1 & artigo_3==1 , stat (med p25 p75 n)

tabstat anos_escolaridade if trimestre==1 & artigo_3==1 , stat (med p25 p75 n)

tabstat renda_percapta if trimestre==1 & artigo_3==1 , stat (med p25 p75 n)

tab paridade3 if trimestre==1 & artigo_3==1

tab consome_alcool if trimestre==1 & artigo_3==1

tab new_fumo_cat1 if trimestre==1 & artigo_3==1

tab faz_ativ_lazer_antes if trimestre==1 & artigo_3==1

tab new_cor_referida_cat_3 if trimestre==1 & artigo_3==1

tab catimcrefer if trimestre==1 & artigo_3==1

Daily dietary intake during pre-pregnancy

ci logkcaltotalnutr if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

ci perkcalcarbtotal if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

ci logperkcalprottotal if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

ci perkcalliptotal if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

ci perprocessadkcalnutrt if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

Daily dietary intake during pregnancy

ci logkcaltotalnutr if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

ci perkcalcarbtotal if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

ci logperkcalprottotal if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

ci perkcalliptotal if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

ci perprocessadkcalnutrt if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

****************************************************************************************************

Table 2 - Distribution of daily dietary intake during pre-pregnancy and pregnancy and variation

according to genotypes of the FTO (rs9939609), MC4R (rs17782313), LEP (rs7799039) and LEPR (rs1137101)

genes polymorphisms, considering the dominant genetic model for all genes

****************************************************************************************************

During Pre-pregnancy

**********

FTO ttest logkcaltotalnutr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliFTOdom)

ttest perkcalcarbtotal_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliFTOdom)

ttest logperkcalprottotal if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliFTOdom) ttest perkcalliptotal_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliFTOdom)

ttest perprocessadkcalnutrt_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliFTOdom)

**********

MC4R2 ttest logkcaltotalnutr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliMC4R2)

ttest perkcalcarbtotal_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliMC4R2)

ttest logperkcalprottotal if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliMC4R2) ttest perkcalliptotal_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliMC4R2)

ttest perprocessadkcalnutrt_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliMC4R2)

**********

LEP ttest logkcaltotalnutr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs7799039)

ttest perkcalcarbtotal_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs7799039) ttest logperkcalprottotal if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs7799039)

ttest perkcalliptotal_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs7799039)

ttest perprocessadkcalnutrt_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs7799039)

**********

LEPR ttest logkcaltotalnutr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs1137101) ttest perkcalcarbtotal_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs1137101)

ttest logperkcalprottotal if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs1137101)

ttest perkcalliptotal_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs1137101) ttest perprocessadkcalnutrt_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs1137101)


167

During pregnancy

**********

FTO ttest logkcaltotalnutr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliFTOdom)

ttest perkcalcarbtotal_3TR if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliFTOdom) ttest logperkcalprottotal if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliFTOdom)

ttest perkcalliptotal_3TR if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliFTOdom)

ttest perprocessadkcalnutrt_3TR if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliFTOdom)

**********

MC4R ttest logkcaltotalnutr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliMC4R2)

ttest perkcalcarbtotal_3TR if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliMC4R2) ttest logperkcalprottotal if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliMC4R2)

ttest perkcalliptotal_3TR if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliMC4R2)

ttest perprocessadkcalnutrt_3TR if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliMC4R2)

**********

LEP ttest logkcaltotalnutr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs7799039) ttest perkcalcarbtotal_3TR if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs7799039)

ttest logperkcalprottotal if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs7799039)

ttest perkcalliptotal_3TR if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs7799039) ttest perprocessadkcalnutrt_3TR if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs7799039)

**********

LEPR ttest logkcaltotalnutr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs1137101)

ttest perkcalcarbtotal_3TR if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs1137101)

ttest logperkcalprottotal if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs1137101) ttest perkcalliptotal_3TR if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs1137101)

ttest perprocessadkcalnutrt_3TR if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs1137101)

Delta

**********

FTO ttest difkcaltotalnutr_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (poliFTOdom) ttest difperkcalcarbtotal_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (poliFTOdom)

ttest difperkcalprottotal_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (poliFTOdom)

ttest difperkcalliptotal_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (poliFTOdom) ttest difperprocessadkcalnutrt_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (poliFTOdom)

**********

MC4R2 ttest difkcaltotalnutr_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (poliMC4R2) ttest difperkcalcarbtotal_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (poliMC4R2)

ttest difperkcalprottotal_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (poliMC4R2)

ttest difperkcalliptotal_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (poliMC4R2) ttest difperprocessadkcalnutrt_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (poliMC4R2)

**********

LEP ttest difkcaltotalnutr_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs7799039)

ttest difperkcalcarbtotal_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs7799039)

ttest difperkcalprottotal_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs7799039) ttest difperkcalliptotal_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs7799039)

ttest difperprocessadkcalnutrt_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs7799039)

**********

LEPR ttest difkcaltotalnutr_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs1137101)

ttest difperkcalcarbtotal_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs1137101) ttest difperkcalprottotal_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs1137101)

ttest difperkcalliptotal_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs1137101)

ttest difperprocessadkcalnutrt_3_1TR if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs1137101)

****************************************************************************************************

Table 3 - Linear regression models between FTO (rs9939609), MC4R (rs17782313), LEP (rs7799039) and

LEPR (rs1137101) gene polymorphisms and daily dietary intake during pre-pregnancy and pregnancy,

considering the dominant* genetic model for all genes.

****************************************************************************************************


**********

FTO regress logkcaltotalnutr i.poliFTOdom if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

regress logkcaltotalnutr i.poliFTOdom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3


168

*************************

regress perkcalcarbtotal i.poliFTOdom if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

regress perkcalcarbtotal i.poliFTOdom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

*************************

regress logperkcalprottotal i.poliFTOdom if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress logperkcalprottotal i.poliFTOdom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 &

amostra_genetica_3==3

************************* regress perkcalliptotal i.poliFTOdom if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

regress perkcalliptotal i.poliFTOdom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 &

amostra_genetica_3==3 *************************

regress perprocessadkcalnutrt i.poliFTOdom if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

regress perprocessadkcalnutrt i.poliFTOdom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

**********

MC4R regress logkcaltotalnutr i.poliMC4R2 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress logkcaltotalnutr i.poliMC4R2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 &


************************* regress perkcalcarbtotal i.poliMC4R2 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

regress perkcalcarbtotal i.poliMC4R2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 &


regress logperkcalprottotal i.poliMC4R2 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

regress logperkcalprottotal i.poliMC4R2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

*************************

regress perkcalliptotal i.poliMC4R2 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalliptotal i.poliMC4R2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 &


************************* regress perprocessadkcalnutrt i.poliMC4R2 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

regress perprocessadkcalnutrt i.poliMC4R2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1

& amostra_genetica_3==3

**********

LEP regress logkcaltotalnutr i.gen_rs7799039 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

regress logkcaltotalnutr i.gen_rs7799039 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 &


regress perkcalcarbtotal i.gen_rs7799039 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

regress perkcalcarbtotal i.gen_rs7799039 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

*************************

regress logperkcalprottotal i.gen_rs7799039 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress logperkcalprottotal i.gen_rs7799039 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1


************************* regress perkcalliptotal i.gen_rs7799039 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

regress perkcalliptotal i.gen_rs7799039 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 &


regress perprocessadkcalnutrt i.gen_rs7799039 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

regress perprocessadkcalnutrt i.gen_rs7799039 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

**********

LEPR regress logkcaltotalnutr i.gen_rs1137101 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

regress logkcaltotalnutr i.gen_rs1137101 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

*************************

regress perkcalcarbtotal i.gen_rs1137101 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalcarbtotal i.gen_rs1137101 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 &


************************* regress logperkcalprottotal i.gen_rs1137101 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3

regress logperkcalprottotal i.gen_rs1137101 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1

& amostra_genetica_3==3 *************************


169

regress perkcalliptotal i.gen_rs1137101 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3






**********

FTO regress logkcaltotalnutr i.poliFTOdom if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

regress logkcaltotalnutr i.poliFTOdom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

*************************

regress perkcalcarbtotal i.poliFTOdom if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalcarbtotal i.poliFTOdom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 &


************************* regress logperkcalprottotal i.poliFTOdom if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

regress logperkcalprottotal i.poliFTOdom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 &


regress perkcalliptotal i.poliFTOdom if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

regress perkcalliptotal i.poliFTOdom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

*************************

regress perprocessadkcalnutrt i.poliFTOdom if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perprocessadkcalnutrt i.poliFTOdom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3


**********

MC4R regress logkcaltotalnutr i.poliMC4R2 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

regress logkcaltotalnutr i.poliMC4R2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 &


*************************

regress perkcalcarbtotal i.poliMC4R2 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

regress perkcalcarbtotal i.poliMC4R2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

*************************

regress logperkcalprottotal i.poliMC4R2 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress logperkcalprottotal i.poliMC4R2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 &


************************* regress perkcalliptotal i.poliMC4R2 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

regress perkcalliptotal i.poliMC4R2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 &


regress perprocessadkcalnutrt i.poliMC4R2 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perprocessadkcalnutrt i.poliMC4R2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3


**********

LEP regress logkcaltotalnutr i.gen_rs7799039 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress logkcaltotalnutr i.gen_rs7799039 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 &


************************* regress perkcalcarbtotal i.gen_rs7799039 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

regress perkcalcarbtotal i.gen_rs7799039 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 &


regress logperkcalprottotal i.gen_rs7799039 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress logperkcalprottotal i.gen_rs7799039 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3


************************* regress perkcalliptotal i.gen_rs7799039 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3






170

**********

LEPR regress logkcaltotalnutr i.gen_rs1137101 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

regress logkcaltotalnutr i.gen_rs1137101 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

*************************

regress perkcalcarbtotal i.gen_rs1137101 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalcarbtotal i.gen_rs1137101 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 &


************************* regress logperkcalprottotal i.gen_rs1137101 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

regress logperkcalprottotal i.gen_rs1137101 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3

& amostra_genetica_3==3 *************************

regress perkcalliptotal i.gen_rs1137101 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

regress perkcalliptotal i.gen_rs1137101 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

*************************

regress perprocessadkcalnutrt i.gen_rs1137101 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perprocessadkcalnutrt i.gen_rs1137101 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if

trimestre==3 & amostra_genetica_3==3

****************************************************************************************************

Table 4 - Longitudinal analysis between FTO, MC4R, LEP and LEPR gene polymorphisms and daily dietary

intake, according to genotypes.

****************************************************************************************************

FTO

**********************************************

AT vs. TT

********************************************** xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.poliFTO sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,


xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.poliFTO sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

**********************************************

xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.poliFTO sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.poliFTO sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///

if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance **********************************************

xi: xtmixed logperkcalprottotal i.poliFTO sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,

covariance(uns) variance xi: xtmixed logperkcalprottotal i.poliFTO sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///

if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

********************************************** xi: xtmixed perkcalliptotal i.poliFTO sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,


xi: xtmixed perkcalliptotal i.poliFTO sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

**********************************************

xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.poliFTO sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.poliFTO sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


**********************************************

AT+AA vs. TT

********************************************** xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.poliFTOdom sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,

covariance(uns) variance xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.poliFTOdom sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


********************************************** xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.poliFTOdom sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,


xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.poliFTOdom sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

**********************************************

xi: xtmixed logperkcalprottotal i.poliFTOdom sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,


xi: xtmixed logperkcalprottotal i.poliFTOdom sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


171


**********************************************

xi: xtmixed perkcalliptotal i.poliFTOdom sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

xi: xtmixed perkcalliptotal i.poliFTOdom sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.poliFTOdom sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,

covariance(uns) variance xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.poliFTOdom sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


MC4R **********************************************

CT vs. TT **********************************************

xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.poliMC4R sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,


xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.poliMC4R sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


********************************************** xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.poliMC4R sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,


xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.poliMC4R sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

**********************************************

xi: xtmixed logperkcalprottotal i.poliMC4R sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

xi: xtmixed logperkcalprottotal i.poliMC4R sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


xi: xtmixed perkcalliptotal i.poliMC4R sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,

covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalliptotal i.poliMC4R sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


**********************************************

xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.poliMC4R sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,


xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.poliMC4R sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

**********************************************

CT+CC vs. TT **********************************************

xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.poliMC4R2 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,

covariance(uns) variance xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.poliMC4R2 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


********************************************** xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.poliMC4R2 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,


xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.poliMC4R2 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

**********************************************

xi: xtmixed logperkcalprottotal i.poliMC4R2 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

xi: xtmixed logperkcalprottotal i.poliMC4R2 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


xi: xtmixed perkcalliptotal i.poliMC4R2 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,

covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalliptotal i.poliMC4R2 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


********************************************** xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.poliMC4R2 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,

covariance(uns) variance xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.poliMC4R2 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


LEP **********************************************

GA vs. GG

********************************************** xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.snplep_rs7799039 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,


xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.snplep_rs7799039 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


172


**********************************************

xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.snplep_rs7799039 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.snplep_rs7799039 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta ///


xi: xtmixed logperkcalprottotal i.snplep_rs7799039 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,

covariance(uns) variance xi: xtmixed logperkcalprottotal i.snplep_rs7799039 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


********************************************** xi: xtmixed perkcalliptotal i.snplep_rs7799039 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,


xi: xtmixed perkcalliptotal i.snplep_rs7799039 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

**********************************************

xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.snplep_rs7799039 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id:


xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.snplep_rs7799039 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///

if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************

GA+AA vs. GG

******************************************** xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.gen_rs7799039 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,


xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.gen_rs7799039 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

**********************************************

xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.gen_rs7799039 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.gen_rs7799039 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


xi: xtmixed logperkcalprottotal i.gen_rs7799039 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,

covariance(uns) variance xi: xtmixed logperkcalprottotal i.gen_rs7799039 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


xi: xtmixed perkcalliptotal i.gen_rs7799039 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,

covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalliptotal i.gen_rs7799039 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


********************************************** xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.gen_rs7799039 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,


xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.gen_rs7799039 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

LEPR **********************************************

AG vs. AA **********************************************

xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.snprlep_rs1137101 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,


xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.snprlep_rs1137101 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


********************************************** xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.snprlep_rs1137101 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,


xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.snprlep_rs1137101 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

**********************************************

xi: xtmixed logperkcalprottotal i.snprlep_rs1137101 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

xi: xtmixed logperkcalprottotal i.snprlep_rs1137101 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


xi: xtmixed perkcalliptotal i.snprlep_rs1137101 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,

covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalliptotal i.snprlep_rs1137101 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


**********************************************

xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.snprlep_rs1137101 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id:



173

xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.snprlep_rs1137101 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


********************************************** AG+GG vs. AA

**********************************************

xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.gen_rs1137101 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.gen_rs1137101 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.gen_rs1137101 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,

covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.gen_rs1137101 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


********************************************** xi: xtmixed logperkcalprottotal i.gen_rs1137101 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,


xi: xtmixed logperkcalprottotal i.gen_rs1137101 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


**********************************************

xi: xtmixed perkcalliptotal i.gen_rs1137101 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao, covariance(uns) variance

xi: xtmixed perkcalliptotal i.gen_rs1137101 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.gen_rs1137101 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 || id: sg_padrao,

covariance(uns) variance xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.gen_rs1137101 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido ///


ANEXOS

174

12. ANEXOS

ANEXO 1 Aprovação do Comitê de Ética

175

ANEXO 2 TCLE

176

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA PARTICIPAR DA PESQUISA

“Estado nutricional e saúde mental na gestação e no pós-parto: Estudo prospectivo com ensaio clínico randomizado”

Você está sendo convidada a fazer parte de uma pesquisa que tem por objetivo entender melhor a

relação entre a alimentação e a ocorrência de problemas como a ansiedade e o estresse durante a gestação e após o parto. Neste estudo, também avaliaremos se o ômega-3 (um composto natural presente em vários alimentos, como peixes e alguns vegetais) protege as gestantes de tais problemas.

Você não é obrigada a participar e, mesmo aceitando fazer parte do estudo, poderá desistir e retirar o seu consentimento a qualquer momento. Sua recusa em participar do estudo não trará nenhum prejuízo em sua relação com o pesquisador, com o seu médico ou com a maternidade; ou seja, você poderá seguir normalmente com o seu atendimento nesta unidade de saúde. Como irei participar?

Você fará uma avaliação completa e detalhada sobre sua saúde. No total, você terá 4 consultas com nossa equipe: 4 durante o pré-natal (com até 13 semanas, na 24ª e 34ª semanas) e uma de 30 a 45 dias após o nascimento de seu filho. Todas estas consultas serão preferencialmente marcadas em dias em que você já tenha que vir ao hospital. O tempo aproximado destas consultas é de 30-45 minutos.

Durante as consultas, você irá responder a perguntas e preencher questionários para obtermos informações como: sua identificação (endereço e telefone), dados demográficos (nome, estado civil, idade), situação social e econômica, história obstétrica, uso de álcool, fumo e outras drogas, violência familiar, estresse e ansiedade, atividade física e como você se alimenta. Em todas as 4 consultas iremos também avaliar seu peso e altura e coletar amostras de sangue para avaliarmos o açúcar, gorduras, colesterol e níveis de hormônios.

Além disso, em cada consulta, deixaremos com você dois aparelhos por um período de 24 horas (1 dia): um chamado de “frequencímetro polar” que mede a freqüência cardíaca (batimentos do coração) e o outro “pedômetro” que conta o número de passos que você dará durante este dia. No dia seguinte, um pesquisador do projeto irá até a sua casa recolher esses equipamentos, não sendo necessário, portanto, que você retorne ao hospital apenas para devolvê-los.

A partir da 18ª semana de gestação, um grupo de mulheres que estiverem participando do estudo serão convidadas a integrar uma parte diferente do estudo e serão orientadas a fazer uso de um suplemento na forma de cápsulas, contendo ômega-3. Se você fizer parte deste grupo, você deverá fazer uso de 5-6 cápsulas por dia junto das refeições (almoço), todos os dias até 30 dias após o parto. Você não precisará comprar ou pagar por este suplemento, ou seja, você vai recebê-lo de graça.

É importante você saber que esta suplementação é composta unicamente de óleo de peixes marinhos, porém sem qualquer sabor ou cheiro característico de peixe. Além do óleo, o outro ingrediente presente é uma pequena quantidade de vitamina E. O uso desta suplementação durante a gestação não traz nenhum risco ou efeito colateral para a sua saúde e a do bebê. No entanto, já foram relatados a ocorrência passageira de diarréia, regurgitação e refluxo. Consumir o óleo na forma de cápsula torna apenas mais prático.

ANEXO 2 TCLE

177

Todas as informações que você fornecer serão mantidas em segredo e utilizadas apenas para a pesquisa. Nenhuma outra pessoa ou profissional terá acesso a suas informações, somente os pesquisadores que trabalham para esta pesquisa. Quando divulgarmos os resultados deste trabalho, seu nome em momento algum irá aparecer, bem como qualquer outra informação fornecida, ou resultado de exame de sangue. Portanto, não há riscos em participar desta pesquisa, apenas a necessidade de coletar sangue e o tempo que você irá gastar com as avaliações durante as consultas. Por ocasião da coleta de sangue, você poderá observar a formação pequeno hematoma na região do braço onde ocorreu a picada da agulha. Sempre usaremos materiais descartáveis. Quais as vantagens?

Ao participar deste estudo, você terá a oportunidade de realizar uma avaliação mais completa e detalhada da sua saúde. O acompanhamento de seus hábitos durante a gestação, como o seu ganho de peso e sua alimentação, são medidas importantes para garantir a saúde do seu bebê ao nascer. Este acompanhamento também é importante para que você tenha uma vida mais saudável, prevenindo problemas futuros como a obesidade, ansiedade e depressão. Você terá acesso a todos os seus resultados se assim desejar.

Este termo de consentimento é um documento importante e você irá receber uma cópia na qual consta o telefone e o endereço do pesquisador principal, podendo tirar suas dúvidas sobre o projeto e sua participação, agora ou a qualquer momento. Meu consentimento:

Minha participação é de livre e espontânea vontade, ou seja, não fui pressionada por ninguém para participar desta pesquisa. Tenho liberdade para continuar ou recusar, em qualquer momento, a participar da pesquisa. O meu atendimento e de meu (minha) filho(a), nesta unidade não será, em momento algum, afetado pela minha recusa. Desta forma, concordo em participar deste estudo estando totalmente esclarecida dos objetivos, riscos e benefícios desta pesquisa, uma vez que tive em mãos este documento e a oportunidade de lê-lo antes de assinar. ________________________________ data Nome e assinatura do pesquisador ________________________________ Telefones: ___________________________ Nome do sujeito da pesquisa _______________________________ data Assinatura do sujeito da pesquisa Contato do coordenador da pesquisa: Professor Dr. Gilberto Kac

Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ Telefones: 25626595 / 93152301 E-mail: [email protected]

Juliana dos Santos Vaz Nutricionista, doutoranda UFRJ Telefones: 74221922 E-mail: [email protected]

Secretaria Municipal de Saúde e Defesa Civil / Comitê de Ética em Pesquisa Rua Afonso Cavalcanti, 455 Bloco 1 - Sala 715 Email: [email protected]

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

ANEXO 3 Protocolo de extração do DNA

178

PROTOCOLO EXTRAÇÃO DE DNA COM FENOL-CLOROFÓRMIO

1. Descongelar o sangue a temperatura ambiente.

2. Homogeneizar suavemente.

LISE DE MEMBRANAS CELULAR E NUCLEAR (SDS =solubiliza as membranas

e proteinase K =degrada proteínas)

3. Transferir 2 ml do sangue para um tubo Falcon 15 ml e adicionar igual volume de tampão

K 2X (para ficar com uma concentração final de 1X).

4. Adicionar 100 µl de proteinase K (20 mg/dl) e homogeneizar suavemente.

5. Incubar a 37° C overnight.

6. Observar a aparência do tubo (fácil movimento do conteúdo do tubo).

EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS E OUTROS (fenol = atrai os fragmentos de

proteínas e lipídios).

7. Adicionar 4 ml de fenol-clorofórmio e agitar suavemente por 1 min.

8. Centrifugar a 3.200 rpm por 20 min na centrifuga clínica.

Separação de fases superior (aquosa) e inferior (fenol).

9. Retirar a fase aquosa para outro tubo falcon 15 ml. Passar para o ítem 13.

Se não aparecer uma fase aquosa, transferir todo o volume (8 ml) para um tubo falcon 50

ml e adicionar igual volume (8 ml) de tampão K. Homogeneizar suavemente, transferir

para tubo corex e centrifugar novamente à 10.000 rpm por 5 min.

10. Transferir a fase aquosa para um tubo falcon 50 ml.

11. Adicionar ao tubo corex, 4 ml de tampão K, homogeneizar suavemente e centrifugar a

10.000 rpm por 5 min, para lavar a interface.

12. Retirar novamente a fase aquosa e juntar à outra fase aquosa retirada (volume total ± 20

ml).

13. Colocar igual volume de clorofórmio e agitar suavemente.

14. Centrifugar a 3.200 rpm por 5 min na centrifuga clínica.

15. Retirar a fase aquosa para outro tubo corex (falcon 50 ml (± 10 ml)).

PRECIPITAÇÃO DO DNA

16. Adicionar 200 ul NaCl 4 M para uma concentração final de 0,2 M e homogeneizar

suavemente.

ANEXO 3 Protocolo de extração do DNA

179

17. Adicionar 2 volumes de etanol absoluto e homogeneizar suavemente. Verificar a presença

de fibras (se presente seguir para item 20. Caso não verifique fibra, continuar com itens 18

e 19).

18. Colocar a -20° C por 1 hora, no mínimo.

19. Centrifugar em tubos corex a 10.000 rpm por 15 mim e a 4° C (marcar a posição dos

tubos na centrifuga, para posterior visualização do pellet). Verificar se o sobrenadante

ficou com uma coloração escura e se o pellet está claro.

LAVAGEM DO DNA

20. Desprezar o sobrenadante. Lavar o pellet com etanol 70% e desprezar o sobrenadante,

secar o pellet por inversão em papel toalha e colocar a 55° C por 10 min. O pellet deve

estar aderido à parede do tubo, mas bem espalhado e não concentrado num ponto.

RESSUSPENSÃO DO DNA

21. Ressuspender no máximo com 500 µl de TE-4 do seguinte modo: adicionar 100 µl de TE-

4 em cada tubo corex, lavando bem a parede onde estiver espalhado o pellet. Transferir as

soluções para um tubo 1,5 ml, mas não descartar os tubos corex. Adicionar 100 µl a um

tubo corex e repetir o procedimento anterior, lavando a parede. Transferir o volume para o

outro tubo corex e repetir o procedimento de lavagem. Retirar o volume do lavado e

transferir para o tubo de 1,5 ml, perfazendo o volume total de 500 µl.

22. Ler a DO (após pellet/fibra estar totalmente dissolvido) para quantificar o DNA.

23. Guardar a -20° C.

ANEXO 4 Artigo 1 publicado na Periódico Nutrition

180

ANEXOS ONLINE

181

ANEXOS ONLINE DA TESE

ANEXOS ONLINE

182

Anexo online 1. Questionário de Frequência Alimentar (QFA) do primeiro trimestre

gestacional:

https://drive.google.com/file/d/0ByVGJIL4qFLfWHhSRlRiWUkxdVE/view?usp=sharing

Anexo online 2. Questionário Geral-1do primeiro trimestre gestacional:

https://drive.google.com/file/d/0ByVGJIL4qFLfV2o1QndyTUFFMjA/view?usp=sharing

Anexo online 3. Questionário Geral-2 do segundo trimestre gestacional

https://drive.google.com/file/d/0ByVGJIL4qFLfNTdsYVlEbHREVW8/view?usp=sharing

Anexo online 4. Questionário Geral-3 do terceiro trimestre gestacional

https://drive.google.com/file/d/0ByVGJIL4qFLfcGl4QjNHb20xMUU/view?usp=sharing

Anexo online 5. Questionário de Frequência Alimentar (QFA) do terceiro trimestre

gestacional

https://drive.google.com/file/d/0ByVGJIL4qFLfemlwWHo1OXlSU3M/view?usp=sharing

Anexo online 6. Questionário Geral-4 do pós-parto

https://drive.google.com/file/d/0ByVGJIL4qFLfbGhwSGVfazN6MXc/view?usp=sharing

https://drive.google.com/file/d/0ByVGJIL4qFLfWHhSRlRiWUkxdVE/view?usp=sharing

https://drive.google.com/file/d/0ByVGJIL4qFLfV2o1QndyTUFFMjA/view?usp=sharing

https://drive.google.com/file/d/0ByVGJIL4qFLfNTdsYVlEbHREVW8/view?usp=sharing

https://drive.google.com/file/d/0ByVGJIL4qFLfcGl4QjNHb20xMUU/view?usp=sharing

https://drive.google.com/file/d/0ByVGJIL4qFLfemlwWHo1OXlSU3M/view?usp=sharing

https://drive.google.com/file/d/0ByVGJIL4qFLfbGhwSGVfazN6MXc/view?usp=sharing

ASSOCIAÇÃO ENTRE OS POLIMORFISMOS NOS GENES … · mudanças de peso corporal e consumo alimentar...

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