ATIVIDADE ANALGÉSICA DAS INTERLEUCINAS 4, 13 E 10 (IL … · 3 [DEUS] "Passei tanto tempo te...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA

DEPTO. DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA CURSO DE PÓS GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

ATIVIDADE ANALGÉSICA DAS INTERLEUCINAS 4, 13 E 10 (IL-4, IL-13 E

IL-10) NA DOR INFLAMATÓRIA EXPERIMENTAL: Papel de células residentes e citocinas

MARIANA LIMA VALE

Dissertação apresentada ao Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito

parcial para a obtenção do título de Mestre em Farmacologia.

Orientador: Prof. Dr. RONALDO DE ALBUQUERQUE RIBEIRO

FORTALEZA 2000

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Dedico este trabalho aos meus pais que sempre me deram a coisa mais importante na minha vida: o amor. Sem o carinho e o incentivo deles nada disso seria possivel.

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[DEUS] "Passei tanto tempo te procurando, não sabia onde estavas. Olhava o infinito, não te via e pensava comigo mesmo: "Será que Tu existes?" Não me encontrava na busca e prosseguia. Tentava te encontrar nas religiões e nos templos. E Tu não estavas. Te busquei através de sacerdotes e pastores e não Te encontrei. Senti-me só e desesperado. Te descri. Na descrença Te ofendi. Na ofensa, tropecei e caí. Na queda, senti-me fraco. Na fraqueza, pedi socorro. No socorro, encontrei amigos. Nos amigos encontrei carinho. No carinho, vi nascer o amor. Com o amor vi um mundo novo. No mundo novo, resolvi doar. Doando, recebi. Recebendo, me senti feliz. Feliz, encontrei a paz. E com paz, foi que Te enxerguei, pois dentro de mim Tu estavas. E sem Te procurar... foi que Te encontrei." -- Anônimo

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Agradecimentos

"O homem só envelhece quando nele os lamentos substituem os sonhos." -- John Barreymore.

Ao Prof. Ronaldo, por ter me orientado e incentivado e a realizar este trabalho e

principalmente pelo exemplo que dá a todos os seus orientandos de competência e

amor ao que faz.

Ao Prof. Fernando de Queirós Cunha pela co-orientação e amizade. Mesmo

estando longe sempre pude contar com a sua presteza e delicadeza em todas as horas,

além de gentilmente ceder as citocinas utilizadas nesse trabalho.

À prof. Gerly Anne por sua paciência e dedicação por nós sempre requisitadas.

Ao prof. Airton por suas idéias e ensinamentos no decorrer de nossa convivência

e deste trabalho.

Às estudantes de iniciação científica: Jaciara e Camila pela grandiosa ajuda

nesse trabalho.

Aos colegas do laboratório que me proporcionaram um ambiente alegre e

descontraido para trabalhar, Milena, Ana Maria, Carlos, Mirna, Renata, Vilma, Veruska,

Nilane, Sabrina, Breno, André, Gurgel, Moisés, Pedro Adriano, Ana Regina.

À nossa técnica de laboratório, Vandinha, tão competente e sempre pronta a nos

ajudar.

5

Ao Sílvio pela ajuda com o computador

Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia: Sílvia, Marta,

Joana, Sobrinho, Aroldo, Rose, Paulo, pela disposição em sempre me atender a aos

funcionários do Labioratório de Inflamação e Dor de Ribeirão Preto, pelo carinho e

disposicão em me ajudar durante o meu estágio lá.

À Dra. Atemisia pela atenção a mim concedida nas solicitações de animais no

biotério.

Ao CNPq pelo apoio financeiro concedido

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ABREVIATURAS UTILIZADAS NESTE TRABALHO

AAc ácido acético

AMP adenosina monofosfato

AMPc adenosina monofosfato cíclico

ATP adenosina trifos0fato

BK bradicinina

BK1 receptor do tipo B1 da bradicinina

BK2 receptor do tipo B1 da bradicinina

C grupo controle

Ca++ íon de cálcio

Cg Carragenina

C5a Quinto componente do sistema complemento ativado

COX cicloxigenase

COX-1 cicloxigenase constitutiva

COX-2 cicloxigenase induzida

D1 receptor do tipo D1 da dopamina

Db-GMPc dibutiril guanosina monofosfato cíclico

EPM erro padrão da média

g grama

G-CSF Fator estimulador de colônia de granulócitos

GM-CSF Fator estimulados de coloônia de granulócitos e macrófagos

GMP-c Guanosina monofosfato cíclico

H1 Receptor da histamina tipo H1

H2 Receptor da histamina tipo H2

7

HOE-140 ([D-Arg1, Thi6, (1,2,3,4-tetrahydroisoquilonin-2-yl-arbonyl)8,

((3as,7as)-octahydroindol-2yl-carbonyl)9]bradykinin

IFN interferon

IFN-α interferon-alfa

IFN-γ interferon-gama

IgE anticorpo IgE

IL-1 Interleucina-1

IL-1ra antagonistas do receptor para IL-1

IL-2 Interleucina-2

IL-3 Interleucina-3

IL-4 Interleucina-4

IL-6 Interleucina-6

IL-8 Interleucina-8

IL-10 Interleucina-10

IL-13 Interleucina-13

ILO iloprost

Kda Quilodalton (s)

kg Kilograma (s)

l Litro

L-NAME L-NG-nitro arginine methyl ester ,

LPS Lipopolissacarídeo de bactéria

LTB4 Leucotrieno B4

LTC4 Leucotrieno C4

MCAF fator ativador e quimiotáxico para monócito,

MHC Complexo de histocompatibilidade maior

8

mg miligrama (s)

min minuto (s)

ml mililitro

mm milimetros

MNF Fator nociceptivo secretado por macrófagos

Nº Número

ng Nanograma (s)

NO óxido nítrico

NOS enzima óxido nítrico sintase

NOSi enzima óxido nítrico sintase induzida

NOSc enzima óxido nítrico sintase constitutiva

PBS Solução salina tamponada

PGI2 Prostaciclina

PGE2 Prostaglandina E2

Pkc Proteína-quinase-C

PM peso molecular

r recombinante

Rhu Recombinante humana

RNA Ácido ribonucleico

RNAm Ácido ribonucleico mensageiro

RPMI Meio de cultura RPMI

S Salina

s.c. Subcutâneo

Th2 linfócitos T helper 2

Tg Tioglicolato

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TGF Fator transformador de crescimento

TNF Fator de necrose tumoral

UI Unidade (s) internacional (is)

v/v volume por volume

Zym Zymosan

α alfa

β beta

γ Gama

μg Micrograma

μl Microlitro

ºC Graus Célsius

< menor

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LISTA DE FIGURAS E ILUSTRAÇÕES

ILUSTRAÇÃO 1. A redução da população de células residentes diminui a atividade

nociceptiva do zymosan (ZYM) e do ácido acético (AAc) mas não a do iloptrost

(ILO)................................................................................................14

ILUSTRAÇÀO 2. O pretratamento com tioglicolato aumenta a atividade nociceptiva do

zymosan (ZYM) e do ácido acético (AAc) mas não a do iloptrost

(ILO)...................................................................................................................14

ILUSTRAÇÃO 3. O pré-tratamento crônico com 48/80 diminui a atividade nociceptiva do

zymosan (Zym) e do ácido acético (AAc), mas não a do iloptrost

(ILO)...................................................................................................................17

ILUSTRAÇÃO 4. Metodologia do teste de contorções abdominais..................41

ILUSTRAÇÃO 5. Metodologia do teste de incapacitação articular...................43

ILUSTRAÇÃO 6. Metodologia do teste da placa quente..................................44

ILUSTRAÇÃO 7. Metodologia do influxo de leucócitos para a cavidade

articular..............................................................................................................45

ILUSTRAÇÃO 8. Metodologia da obtenção do sobrenadante de macrófagos estimulados

in vivo com zymosan.....................................................................46

11

FIGURA 1. Curva dose-resposta da atividade nociceptiva do ácido acético e zymosan no

modelo de contorções abdominais. ..............................................53

FIGURA 2. Efeito antinociceptivo da interleucina-4 (IL-4) nas contorções abdominais

induzidas por ácido acético ou zymosan. ......................................54


induzidas por ácido acético ou zymosan. ......................................56


induzidas por ácido acético ou zymosan........................................57

FIGURA 5. Efeito antinociceptivo da interleucina-4 (IL-4) sobre a incapacitação articular

induzida por zymosan..........................................................................59

FIGURA 6. Efeito antinociceptivo da interleucina-10 (IL-10) sobre a incapacitação

articular induzida por zymosan...................................................60

FIGURA 7. Efeito antinociceptivo da interleucina-13 (IL-13) sobre a incapacitação

articular induzida por zymosan...................................................62

FIGURA 8. Efeito da interleucina-4 (IL-4) sobre o influxo de células na cavidade articular

induzido por zymosan..........................................................................63

12

FIGURA 9. Efeito da interleucina-10 (IL-10) sobre o influxo de células na cavidade

articular induzido por zymosan...........................................................65

FIGURA 10. Efeito da interleucina-13 (IL-13) sobre o influxo de células na cavidade

articular induzido por zymosan...........................................................66

FIGURA 11. Efeito da interleucina-4 (IL-4) sobre o tempo de reação no teste da placa

quente. ....................................................................................................68


quente.................................................................................................69


quente.................................................................................................71

FIGURA 14. Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva da interleucina-4 (IL-4)

nas contorções abdominais induzidas por ácido acético.

...........................................................................................................................72

FIGURA 15. Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva da interleucina-10 (IL-

10) nas contorções abdominais induzidas por ácido acético.

...........................................................................................................................74

13

FIGURA 16. Efeito da naloxona na atividade antinociceptiva da interleucina-13 (IL-13)

nas contorções abdominais induzidas por ácido acético.

...........................................................................................................................75

FIGURA 17. Efeito da interleucina-4 (IL-4) na liberação de fator de necrose tumoral - α

(TNF-α) e interleucina-1beta (IL-1β) por macrófagos peritoneais induzidos por

zymosan......................................................................................78

FIGURA 18. Efeito da interleucina-10 (IL-10) na liberação do fator de necrose tumoral –

alfa (TNF-α) e da interleucina-1 beta (IL-1β) por macrófagos peritoneais induzidos por

zymosan....................................................................79

14

RESUMO

Atividade analgésica das interleucinas 4, 13 e 10 (IL-4, IL-13 e IL-10) na dor inflamatória experimental: papel de células residentes e citocinas. Mariana Lima Vale, Dissertação apresentada ao Departamento de fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Farmacologia. Orientador: Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro, Fortaleza, 2000.

Já está estabelecido que a liberação de produtos da cicloxigenase e aminas simpatomiméticas, mediadores finais da dor inflamatória é precedido pela geração, por células residentes, de uma cascata de citocinas. Recentemente dados do nosso laboratório demonstraram que no modelo de contorções abdominais (CA) a ativação dessa cascata é dependente também da presença de células residentes como macrófagos e mastócitos. Dados da literatura apontam algumas citocinas capazes de modular negativamente a função dessas células: IL-4,. IL-10, IL-13, IL-6, TGF-β e IFN-α. Com base nesses dados, o objetivo do presente trabalho foi estudar uma possível atividade analgésica de três citocinas: IL-4, IL-13 e IL-10. Para tanto injetou-se, via ip, IL-4 (1–5ng/animal), IL-13 (0.4-2.5ng/animal) ou IL-10 (0.4-10ng/animal) 30 min antes da administração de zymosan (Zym) ou ácido acético (AAc) para o teste de CA. IL-4 (2.5 e 5ng/animal), IL-13 (1 e 2.5ng/animal) ou IL-10 (2 e 10ng/animal) foi injetada, ip, 30 min antes do Zym (1 mg/animal; intra-articular) e logo após foi medida a incapacitação articular (IA) até a 4ª hora e na 6ª hora foi feita a contagem de leucócitos no fluido articular. As interleucinas estudadas também foram administradas (30 min antes) na dose que melhor inibiu as CA no teste da placa quente (PQ) e em camundongos que haviam recebido ou não a naloxona previamente ao estímulo (AAc) no teste de CA. IL-4 (5 ng/animal) ou IL-10 (10 ng/animal) foi injetada ip 30 min antes do Zym (ip) e após 15 min os animais foram sacrificados e o exsudato peritoneal foi colhido e posto em cultura para a dosagem de IL-1β e TNF-α no sobrenadante. No presente trabalho ficou demonstrado que as interleucinas-4, 13 e 10 são analgésicas tanto no modelo de CA induzidas por AAc (58.7, 89.2, 52% de inibição, efeito máximo, respectivamente, p<0.05) ou Zym (62.6, 61.7, 74.4% de inibição, efeito máximo, respectivamente, p<0.05) como também no modelo de IA induzido por Zym (49.2, 56.6, 69,9% de inibição, efeito máximo, respectivamente, p<0.05). As citocinas estudadas foram capazes de inibir o influxo de leucócitos para a cavidade articular (53.8, 92.1 e 62%, respectivamente - p<0,05). Foi demonstrado que o efeito analgésico parece ser de domínio periférico visto que nenhuma das citocinas modificou o tempo de reação na PQ, teste algesimétrico sensível apenas para drogas que exercem efeito central. Também foi demonstrado que a atividade analgésica das interleucinas testadas não depende da liberação de opióides endógenos, visto que o pré-tratamento com naloxona não foi capaz de reverter a atividade analgésica de nenhuma das interleucinas no modelo de CA. Contudo essa atividade analgésica parece depender da inibição da liberação de citocinas por células residentes visto que IL-4 e IL-10 foram capazes de diminuir a liberação de TNF-α (42 e 41.2% de inibição respectivamente - p<0.05) e IL-1β (61.9 e 80.9% de inibição respectivamente - p<0,05) por macrófagos peritoneais residentes.

15

ABSTRACT

Analgesic activity of interleukines 4, 13 and 10 (IL-4, IL-13 and IL-10) in experimental inflammatory pain: role of resident cells and cytokines – MARIANA LIMA VALE. Dissertation submitted as partial fulfillment of requirement to degree of Master’s in Phrmacology to the graduation Pharmacology course of the Ceará Federal University. Professor: Ronaldo de Albuquerque Ribeiro.

The release of cyclo-oxigenase products and sympathomimetics amines, the final mediators of inflammatory pain, is preceded by the generation of cytokines by resident cells. In recent years a number of cytokines such as IL-4, IL-10, IL-13, IL-6, TGF-β e IFN-α have been described to inhibit the production of TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-8 (cytokines regarded as pró-inflammatory) and possibly to exert their modulatory effect on macrophages and mast cells. Since it is known the capacity of those cytokines to inhibit the production of pro-inflammatory cytokines and the pivotal role of resident cells in the development of inflammatory pain we have decided to test the possibility of IL-4, IL-13 and IL-10 to modulate inflammatory pain. In short, IL-4 (1 – 5ng/animal), IL-13 (0.4 - 2.5ng/animal) or IL-10 (0.4 - 10ng/animal) was given 30 min before acetic acid (AAc) or zymosan (Zym) administration in the writhing model. IL-4 (2.5 e 5 ng/animal), IL-13 (1 e 2.5 ng/animal) or IL-10 (2 e 10 ng/animal) were injected, ip, 30 min before Zym (1 mg/animal; intra-articular) in the rat knee joint incapacitation test up to the 4th hour (the number of leukocytes was determined in the articular exsudate 6 hours later). Doses of those cytokines that exerted maximum effect in the writhing test were also injected 30 min before the hot plate test. These same doses were injected ip before naloxone administration in the AAc-induced writhing model in mice. TNF-α and IL-1β were determined in the supernatant of a macrophage culture which were collected from peritoneal fluid of mice treated with Zym and pre-treated with the cytokines under test. Our results show that interleukins 4, 13 and 10 inhibit writhing response in mice induced by AAc or Zym up to 58.7, 89.2 and 52%, and up to 62.6, 61.7 and 74.4%, respectively (p<0.05). Similar results were observed in the rat knee joint incapacitation test induced by Zym: 49.2, 56.6, 69,9% of inhibition (p<0.05). The same interleukins were able to inhibit Zym-induced leukocyte influx into articular cavity (53.8, 92.1 e 62% of inhibition, respectively - p<0,05). The analgesic activity of IL-4, IL-13 and IL-10 seems to be peripheral, since these cytokines presented no effect in the reaction time of the animals on hot plate test. This antinociceptive effect seems to have no relation with endogen opioid release since naloxone (opioid receptor antagonist) had no effect in reverting the antinociceptive effect of cytokines in the AAc-induced writhing in mice. However, IL-4 and IL-10 inhibit the release of TNF-α (42 e 41.2%, respectively - p<0.05) and of IL-1β (61.9 e 80.9%, respectively - p<0,05) by macrophages stimulated in vivo by Zym, indicating that their antinociceptive activities may be due to the inhibition of those cytokines release by resident cells.

16

ÍNDICE

LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................................

RESUMO.............................................................................................................................

ABSTRACT..........................................................................................................................

I. INTRODUÇÃO...............................................................................................................

1. Dor inflamatória...................................................................................................

1.1. Aspectos gerais.........................................................................................

1.2. Mediadores da dor inflamatória.................................................................

1.2.1. Mediadores hiperalgésicos...................................................................

1.2.2. Mediadores que ativam diretamente o nociceptor................................

1.3. Citocinas e dor inflamatória.......................................................................

1.4. Células residentes e dor inflamtória...........................................................

1.4.1. Macrófagos...........................................................................................

1.4.2. Mastócitos............................................................................................

1.5. Controle periférico da dor inflamatória.......................................................

2. Citocinas que modulam negativamente a resposta inflamatória..........................

2.1. Interleucina-4............................................................................................

2.2. Interleucina-13...........................................................................................

2.3. Interleucina-10...........................................................................................

3. Justificativas e objetivos.......................................................................................

II. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................

1. Animais.................................................................................................................

2. Aparelhos e instrumentos laboratoriais...............................................................

17

3. Drogas, soluções, corantes, citocinas e antisoros................................................

4. Testes nociceptivos.............................................................................................

5. Influxo de leucócitos.............................................................................................

6. Obtenção do sobrenadante de cultura de macrófago..........................................

7. Dosagem de TNF-α e IL-1β em sobrenadante de cultura de macrófagos............

8. Efeito antinociceptivo das interleucinas – 4, 10 e 13 sobre as contorções

abdominais induzidas por ácido acético e zymosan........................................

9. Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva das interleucinas- 4, 10 e

13

10. Efeito antinociceptivo das interleucinas – 4, 10 e 13 sobre a incapacitação

articular induzida por zymosan.......................................................................

11. Efeito das interleucinas –4, 10 e 13 no teste da placa quente........................

12. Efeito das interleucinas –4, 10 e 13 no influxo de leucócitos para a cavidade

articular.............................................................................................................

13. Efeito das interleucinas –4 e 10 na liberação do fator de necrose tumoral

(TNF-α) e de interleucina-1 β (IL-1β) por macrófagos peritoneais de

camundongos estimulados in vivo por

zymosan.....................................................

14. Análise estatística............................................................................................

III- RESULTADOS..............................................................................................................

1. Atividade nociceptiva do ácido acético e do zymosan no modelo de contorções

abdominais..........................................................................................................

2. Bloqueio da atividade nociceptiva do acido acético e zymosan por interleucina-

4 no modelo de contorções abdominais..............................................................

18


13 no modelo de contorções abdominais....................................................


10 no modelo de contorções abdominais.....................................................

5. Efeito da injeção intraperitoneal de interleucina-4 sobre a atividade nociceptiva

do zymosan no modelo de incapacitação articular em joelho de rato...............

6. Efeito da injeção intraperitoneal de interleucina-13 sobre a atividade

nociceptiva do zymosan no modelo de incapacitação articular em joelho de

rato.

7. Efeito da injeção intraperitoneal de interleucina-10 sobre a atividade

nociceptiva do zymosan no modelo de incapacitação articular em joelho de

rato.

8. Efeito da interleucina-4 sobre o influxo de leucócitos na cavidade articular

induzido por zymosan....................................................................................





11. Efeito da interleucina-4 sobre o tempo de reação no teste da placa

quente.................

12. Efeito da interleucina-13 sobre o tempo de reação no teste da placa quente.....

13. Efeito da interleucina-10 sobre o tempo de reação no teste da placa quente.

14. Efeito do pré-tratamento com naloxona na antinocicepção obtida pela injeção

prévia de IL-4 nas contorções abdominais induzidas por ácido acético..........

19

15. Efeito do pré-tratamento com naloxona na antinocicepção obtida pela injeção

prévia de interleucina-13 nas contorções abdominais induzidas por ácido

acético.

16. Efeito do pretratamento com naloxona na antinocicepção obtida pela injeção

prévia de interleucina-10 nas contorções abdominais induzidas por ácido

acético.

17. Efeito da interleucina-4 na liberação de TNF-α e IL-1β por macrófagos

peritoneais residentes estimulados in vivo com zymosan..................................

18. Efeito da interleucina-10 na liberação de TNF-α e IL-1β por macrófagos

peritoneais residentes estimulados in vivo com zymosan...........................

IV. DISCUSSÃO...................................................................................................................

V. CONCLUSÃO..................................................................................................................

VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................

20

I. Introdução

21

1. DOR INFLAMATÓTRIA

1.1. Aspectos gerais

A dor nos estados inflamatórios está geralmente associada à presença de

mediadores químicos que são liberados por células não neuronais no local da injúria.

Dependendo da natureza do mediador este poderá apenas sensibilizar, isto é, diminuir o

limiar de ativação do nociceptor, ativar o receptor ou então ambas as coisas. A

sensibilização do nociceptor vem sendo denominada clinicamente como hiperalgesia,

caracterizada pelo abaixamento do limiar a estímulos térmicos, mecânicos ou químicos

na área inflamada. Os receptores descritos geralmente associados à essa sensação de

dor são os polimoidais de alto limiar conectados a fibras C pouco mielinizadas. No

entanto, mais recentemente, foi descrito na literatura a descoberta de receptores que

não podem ser ativados em situações normais, mas apenas em estados inflamatórios.

São pequenas fibras aferentes primárias, não mielinizadas, que não respondem a

estímulos térmicos nem a mecânicos de alta intensidade mas possuem sensibilidade

química, o que os torna responsivos quando uma reação inflamatória acontece. Esses

receptores já receberam denominações como “nociceptores dormentes” ou “aferentes

silenciosos”. Já foi caracterizada a sua presença em várias espécies incluindo rato, gato,

cão e macaco (MCMAHON & KOLTZENBURG, 1990, SHAIBLE E SCHMIDT, 1984;

1985; KOLTZENBURG E MCMAHON, 1986; GRIGG et al., 1986; HANDWERKER et al,

1989; DAVIS et al., 1989). Alguns estão situados em sítios viscerais e em articulações e

podem ser ativados pelos metabólitos da cicloxigenase e aminas simpatomiméticas

para um estado de hiperalgesia. (FERREIRA, 1993).

1.2. Mediadores da dor inflamatória

22

Durante o processo inflamatório várias etapas parecem estar associadas à ação

de substâncias endógenas que modificam fisiológica e bioquimicamente a estrutura do

local afetado. Essas substâncias químicas, geralmente chamadas de mediadores, são

inicialmente liberadas no local da injúria por uma reação de alarme, onde macrófagos

parecem ter um papel crucial (FERREIRA, 1980). Estas células sinalizam a presença de

material estranho ou a injúria através da liberação de mediadores clássicos da

inflamação e/ou de citocinas. Esses mediadores e citocinas recrutam células migrantes

como leucócitos polimorfonucleares, macrófagos, eosinófilos e/ou linfócitos que

possuem um papel amplificador no desenvolvimento da resposta inflamatória. A ação

de mediadores e citocinas em receptores específicos sinalizam a resposta tecidual, os

mecanismos de defesa, e produzem os sintomas da inflamação do qual a dor tem seu

papel particular (FERREIRA, 1993).

Os mediadores associados á dor no processo inflamatório podem ser

classificados em dois tipos: (1) aqueles que causam a sensibilização do nociceptor

(hiperalgésicos) e (2) aqueles que causam a sua ativação direta, provocando a dor

declarada em humanos, ou o comportamento característico em animais experimentais.

1.2.1. Mediadores hiperalgésicos

Os mecanismos associados à hiperalgesia inflamatória vem sendo estudados e

há evidências de que mediadores capazes de aumentar a concentração intracelular de

adenosina monofosfato cíclico (AMPc) e do íon cálcio (Ca++) estão associados com a

sensibilização dos nociceptores. Foi demonstrado que, a administração de dibutiryl

23

AMPc (um análogo de AMPc capaz de atravessar a membrana plasmática) ou Ca++

causa hiperalgesia em pata de rato (FERREIRA & NAKAMURA, 1979a). A mesma

evidência foi suportada por outros autores em outros modelos (FOLLENFANT et al.,

1990; TAIWO et al., 1989). Prostaglandinas e aminas simpatomiméticas (dopamina ou

noradrenalina) são mediadores conhecidos por estimular a síntese de AMPc neuronal e

já foram comprovados como substâncias que causam sensibilização de nociceptores

(WIESENFELD-HALLIN e HALLIN, 1984). Em 1972 FERREIRA demostrou que a injeção

de prostaglandina causa hiperalgesia e que drogas inibidoras da cicloxigenase inibem

esse efeito hiperalgésico. Da mesma maneira, foi demostrado que a injeção de

agonistas adrenérgicos (dopamina, adrenalina, isoprenalina) causava hiperalgesia em

pata de rato e que o pré-tratamento com bloqueadores adrenérgicos foi capaz de inibir

essa hiperalgesia como também aquela induzida por carragenina. Isso comprovou que

além de um componente eicosanoide, há um componente simpático participando da

sensibilização do nociceptor durante o processo inflamatório, provavelmente mediado

pelo receptor D1 da dopamina. No entanto o tipo de receptor envolvido pode variar de

acordo com o modelo experimental e com o tipo de animal utilizado (NAKAMURA &

FERREIRA, 1987). A importância dos dois tipos de mediadores na dor inflamatória foi

suportada por outros autores em outros modelos experimentais como o de contorções

abdominais induzidas por ácido acético e zymosan (DUARTE et al., 1988; Thomazzi,

1996). Em adição, mediadores capazes de estimular a síntese de prostaglandinas ou de

aminas simpatomiméticas são também ditos hiperalgésicos como é o caso de citocinas

como IL-1, TNF-α e IL-8. E ainda, mediadores que estimulam a síntese dessas citocinas

hiperalgésicas como é o caso da bradicinina, também podem entrar nessa mesma

classificação.

24

No entanto, há um outro sistema que parece participar da regulação dos

receptores da dor durante a inflamação, dessa vez aumentando o limiar de

excitabilidade dos nociceptores. O bloqueio direto da hiperalgesia, já instalada, induzida

por prostaglandina E2 (PGE2) foi observado após a administração local de dibutiril

guanosina monofosfato cíclico (Db-GMPc) (FERREIRA & NAKAMURA., 1979b) ou de

substâncias que estimulam a guanilato cilclase neuronal como por exemplo carbacol e

geradores de óxido nítrico (DUARTE et al., 1992). Parece que a regulação funcional de

nociceptores depende do equilíbrio entre as concentrações de AMPc e GMPc.

1.2.2. Mediadores que ativam diretamente o nociceptor

Dentre os mediadores capazes de ativar diretamente o nociceptor, a bradicinina

merece um papel de destaque. A injeção subcutânea de bradicinina, em humanos, vem

sendo há muito tempo associada à manifestação de dor (ARMSTRONG et al., 1953;

SICUTERI et al.; 1965; FERREIRA et al., 1972). Mas também já foi demostrado que

bradicinina em, alguns modelos experimentais, causa um posterior efeito hiperalgésico

demorado. Sugeriu-se que esse efeito hiperalgésico era mediado pela liberação de

prostanoides, pois foi inibido pela administração de indometacina (inibidor da

cicloxigenase), contudo, tal efeito não estava associado à dor declarada (TAIWO &

LEVINE, 1988; STERANKA et al., 1987; 1988).

Como já foi visto, a bradicinina parece ter um duplo papel na modulação da dor,

pois foi descrita como substância capaz de ativar diretamente o nociceptor e como um

mediador hiperalgésico. Isso pode ser explicado pela sua ligação a diferentes tipos de

receptores. Já foram descritos até 4 tipos de receptores para a bradicinina (Bk1 - Bk4)

mas dois deles, Bk1 e Bk2 , merecem destaque na modulação da dor inflamatória. O

25

receptor Bk2 foi associado com a ativação direta de fibras aferentes finas que foram

descritas como condutoras de estímulos da nocicepção (STERANKA e BURCH, 1991;

FARMER e BURCH, 1992). Entretanto, em um estudo mais recente, esse receptor foi

associado também à sensibilização do nociceptor, mediada pela liberação de uma

cascata de citocinas que irão estimular a liberação de produtos da cicloxigenase e de

aminas simpatomiméticas (FERREIRA et al., 1993), tema que será abordado

posteriormente. Então o receptor Bk2 já foi associado com nocicepção e com

hiperalgesia. Através do receptor Bk1 foi demonstrado a participação da bradicinina na

ativação direta do nociceptor. O antagonista para esse receptor da bradicinina foi capaz

de inibir a fase imediata do teste da formalina em camundongos (SHIBATA et al., 1989;

CORREA E CALIXTO, 1993). Mais recentemente (1997), TONUSSI e FERREIRA,

usando antagonistas específicos para cada tipo de receptor, demonstraram, no modelo

de incapacitação articular em ratos, que bradicinina induzia a sensibilização do

nociceptor através dos receptores Bk2 e que a ativação do nociceptor se devia à sua

ação em receptores Bk1.

Histamina, um mediador inflamatório conhecido, parece também estar associado

à resposta dolorosa. Encontra-se principalmente estocada em grânulos no interior de

mastócitos e é um dos principais mediadores da resposta alérgica. É liberada também

durante a reposta inflamatória e parece participar da dor inflamatória por ativar

diretamente o nociceptor. Entretanto, sua liberação está associada principalmente com

a sensação de prurido (FERREIRA et al., 1990). Além da histamina e da bradicinina

outros mediadores parecem também participar da ativação das terminações nociceptivas

durante a inflamação dentre eles: serotonina, substância P, adenosina trifosfato (ATP) e

prótons (RANG et al., 1991).

26

Em muitos caso a ativação do receptor por esses mediadores, para manifestação

de dor, só é possível mediante a sensibilização prévia por mediadores hiperalgésicos.

Dentre esses mediadores hiperalgésicos as citocinas merecem destaque.

1.3. Citocinas e dor inflamatória

Citocinas são polipeptídeos simples, ou glicopeptídeos, de peso molecular menor

ou igual a 80 kDa, com propriedades pleiotrópicas e regulatórias. São produzidas e

secretadas por diversos tipos célulares em resposta a uma infinidade de estímulos, para

agir em receptores específicos presentes em células alvo. Como são substâncias com

diversas funções regulatórias, tais moléculas não são produzidas de maneira contínua.

A sua produção é induzida ou suprimida por estímulos aos quais o organismo precisa

responder. Os vários tipos de citocinas incluem as interleucinas (IL), os fatores de

necrose tumoral (TNF), os interferons (IFN), os fatores estimulante de colônia da medula

óssea e uma variedade de outros fatores de crescimento (fatores de crescimento

derivados de fibroblastos , da epiderme e das plaquetas) (HOPKINS, 1990).

Alguns estudos tem demonstrado que citocinas podem influenciar a direção de

uma resposta imune por mecanismos parácrinos, endócrinos e autócrinos. A capacidade

que possuem de exercer efeito local, regional e sistêmico é um ponto importante da

biologia dessas substâncias, pois demonstra o papel fisiopatológico desses

mediadores na doença. A elevação da temperatura, indução de sono e supressão do

apetite são todas manifestações sistêmicas de doença, porém, isso pode representar

apenas alterações dos níveis de citocinas que normalmente controlam a nossa fisiologia

circadiana. Um aumento dos níveis de citocinas que estão associadas com a inflamação,

pode concomitantemente ativar células inflamatórias e alterar a fisiologia normal. Ambos

27

os eventos podem ser importantes no combate à doença através dos mecanismos de

defesa. Em adição, os efeitos sistêmicos associados com inflamação severa podem ser

exercidos pela produção exagerada de citocinas e pela manutenção dessa produção

pelas próprias citocinas (KUNKEL et al., 1991).

Uma citocina tende a ter múltiplas células alvo e múltiplas funções, no entanto,

citocinas diferentes podem ter ações similares. A exposição de células a duas ou mais

citocinas diferentes pode levar a respostas qualitativamente diferentes. Além disso uma

citocina pode aumentar (ou diminuir) a produção de outra citocina (ou dela mesma) ou a

expressão de receptores para outra citocina e assim resultar em ações indiretas. Um

exemplo disso seria a demonstração da ação mitogênica da IL-1 em timócitos murinos,

uma das primeiras descobertas nesse sentido. Essa ação mitogênica envolve a

estimulacão da produção de IL-2 por IL-1, sendo IL-2 a verdadeira molécula efetora

responsável pela estimulação da proliferação de timócitos (SMITH et al., 1980). Esse

efeito estimulatório de IL-1 na produção de IL-2 e o papel dessa interação na

proliferação de células T, tornou-se um paradigma para as ações de muitas outras

citocinas. Após isto, descobriu-se que IL-1 também é capaz de estimular a produção de

IL-6 (CONTENT et al., 1985), GM-CSF (ZUCALI et al., 1986), IL-8 (MATSUSHIMA et al.,

1989), e o fator ativador e quimiotáxico para monócito, MCAF (LARSEN et al., 1989) em

vários tipos celulares. Todas essas citocinas são também induzidas por TNF o que está

em consonância com as inúmeras similaridades vistas entre as ações de IL-1 e TNF (LE

E VILCEK, 1987, NETA et al., 1992). Em monócitos tanto TNF como IL-1 agem como

agentes estimulatórios com resposta individual, e em adição, eles estimulam a produção

um do outro, o que amplifica a resposta individual de ambos (NETA et al., 1992).

A participação dessas citocinas na dor inflamatória foi estudada e observou-se a

sua importância na hiperalgesia inflamatória. Como já foi dito, a hiperalgesia parece ser

28

causada pela ação de mediadores liberados por duas vias distintas: a hiperalgesia

causada por eicosanoides e a hiperalgesia causada por simpatomiméticos. Após essas

confirmações, foi demonstrado que a liberação de produtos da cicloxigenase e de

aminas simpatomiméticas é subsequente à liberação IL-1β (FERREIRA et al., 1988) e de

IL-8 (CUNHA et al., 1991) respectivamente, o que foi evidenciado no modelo de

hiperalgesia mecânica em pata de rato (Randall-Selitto modificado por FERREIRA et al.,

1978). Nesses estudos, a hiperalgesia induzida por IL-1β foi bloqueada por indometacina

(inibidor da ciloxigenase), mas não por drogas simpatolíticas (propanolol, atenolol ou

guanetidina), enquanto que a hiperalgesia induzida por IL-8 foi bloqueada pelo pré-

tratamento com simpatolíticos mas não por indometacina. Ademais, a hiperalgesia

induzida por carragenina foi parcialmente bloqueada por ambos os tipos de drogas

(CUNHA et al., 1991). Sabendo da capacidade de várias citocinas em induzir a sua

própria produção e a produção de outras citocinas como: TNF-α que induz a produção

de IL-1 (DINARELLO et al., 1986), IL-1 que induz a produção de IL-1 (DINARELLO et al.,

1987), IL-6 (VAN DAMME et al., 1987), e IL-8 (STREITER et al., 1989), esses mesmos

autores (CUNHA e colaboradores), em 1992a, demostraram um papel central para o

TNF-α na modulação da hiperalgesia induzida por carragenina no mesmo modelo

experimental. Foi proposto que TNF-α ativa uma cascata de liberação de citocinas. A

indução da liberação de IL-8 por TNF-α leva à hiperalgesia mediada por

simpatomiméticos, e a indução de IL-1β e IL-6 por TNF-α leva à hiperalgesia mediada

por produtos da cicloxigenase. Isso foi confirmado pelo fato de que a injeção de TNF-α

mimetizou a capacidade da carragenina em induzir a produção de IL-1β, IL-6 e IL-8 e

também pelo fato de que uma única injeção com o anticorpo anti-TNF-α foi capaz de

abolir esse efeito da carragenina (CUNHA et al., 1992a). As mesmas evidências foram

29

demonstradas no modelo de contorções abdominais (DUARTE et al., 1988; Thomazzi,

1996).

Mais tarde, ficou-se sabendo que a cascata de citocinas promovida por TNF-α na

hiperalgesia inflamatória, em alguns casos, era subsequente à ação da bradicinina,

dependendo da intensidade e do tipo de estímulo. Isto foi demonstrado por FERREIRA e

colaboradores (1993) em experimentos onde o pre-tratamento de animais com HOE-

140, um antagonista seletivo para o receptor Bk2 da bradicinina, foi efetivo em bloquear

hiperalgesia induzida por carragenina, mas não foi capaz de bloquear a hiperalgesia

induzida por TNF-α. Além disso, ao se pré- tratar os animais com um antisoro específico

para TNF-α (anti-TNF-α) a hiperalgesia induzida por bradicinina ficou bastante reduzida,

sugerindo que bradicinina estaria induzindo a liberação de TNF-α. Em adição, a

hiperalgesia induzida por altas doses de LPS não foi inibida por HOE-140, propondo que

se o estímulo hiperalgésico é de magnitude suficiente, a cascata de citocinas pode ser

acionada independentemente da estimulação do receptor Bk2 (FERREIRA et al, 1993).

Bradicinina pode não só iniciar a cascata de mediadores mas também contribuir para a

manutenção dessa cascata e da injúria através dos receptores Bk1, receptores que são

ativados por IL-1β mas não por TNF-α, demonstrado em modelos de hiperalgesia

térmica e mecânica (PERKINS & KELLY, 1993; DAVIS & PERKINS, 1994). Foi proposto,

então, que receptores Bk2 participariam da fase inicial da resposta dolorosa inflamatória

e Bk1 manteria o estado doloroso (DRAY & PERKINS, 1993). No modelo de contorções

abdominais também foi demostrado o papel inicial da bradicinina, a qual mesmo em

doses altas não foi capaz de induzir resposta nociceptiva, porém, a administração prévia

de HOE-140 diminui as contorções induzidas pela associação de TNF-α, IL-1 e IL-8

(THOMAZZI, 1996).

30

Outro mecanismo importante no extenso mundo de ações das citocinas é a

modulação da expressão de seus receptores. Um dos modelos mais estudados envolve

a indução, por IL-1, da expressão do receptor de alta afinidade por IL-2 em células T

(KAYE et al., 1984; LOWENTHAL et al., 1986). Outas citocinas como TNF e IL-6 (NOMA

et al., 1987; LOWENTHAL et al., 1989) também podem alterar a expressão do receptor

para IL-2, mas não tão eficientemente quanto IL-1.

Há também relatos não tão numerosos quanto ao das ações estimulatórias mas

evidências crescentes de que algumas citocinas também tem ações inibitórias sobre a

produção de outras citocinas. Esse assunto será abordado em detalhes adiante.

1.4. Células residentes e dor infamatória

1.4.1. Macrófagos

Mácrófagos tradicionalmente são associados com inflamação crônica. Na

verdade, são residentes nos tecidos e constituem as células de alarme do organismo

(FERREIRA et al.,1980). São hábeis em reconhecer o não próprio e com isso promover

a sinalização do processo inflamatório. Eles fazem isso através da liberação de

mediadores como prostaglandinas ou através da liberação de citocinas, substâncias que

agem tanto no local como sistemicamente. São células altamente secretórias. Seus

produtos, ao todo, mais de 100 descritos, incluem enzimas, inibidores enzimáticos,

proteínas do sistema complemento, proteínas regulatórias tipo IL-1, IL-8, IL-6, fator

transformador de crescimento-β (TGF-β), além dos derivados do ácido araquidônico

(TAKAEMURA & WERB, 1984; NATHAN, 1987; ADAMS & HAMILTON, 1988). A maioria

dessas moléculas são importantes na reação inflamatória, sendo que, a secreção de

31

muitas delas depende do estado metabólico do macrófago o que por sua vez depende

da interação do mesmo com seu microambiente (NATHAN , 1987).

Já foi descrito que macrófagos estimulados com lipopolissacarídeo derivado de E.

Coli (LPS) liberam, em cultura, um fator com um PM maior que 10 kDa que quando

injetado intraperitonealmente, em camundongos, é capaz de induzir contorções

abdominais. Essa substância, liberada por monocamadas de macrófagos, foi

denominada fator nociceptivo derivado de macrófago (MNF) (CAMPOS et al., 1988).

Posteriormente a esses achados, foi demonstrado que o MNF não é um produto da

cicloxigenase, visto que inibidores dessa enzima, como indometacina ou paracetamol,

não afetam a sua liberação. Foi sugerido então, que o MNF é um composto proteico, e

que sua atividade é devido à presença de citocinas como IL-1, IL-8 e TNF-α (THOMAZZI

et al., 1997), já descritas como componentes do sobrenadante de macrófagos

estimulados com LPS usado na preparação desse fator (RIBEIRO et al., 1993; 1995).

Em adição, a indução de contorções abdominais por MNF foi inibido pelo pré-tratamento

dos animais com indometacina, paracetamol, guanetidina e atenolol, indicando que a

sua atividade nociceptiva resulta da inducão da liberação de produtos da cicloxigenase e

de simpatomiméticos pelas citocinas supracitadas (THOMAZZI et al., 1997).

A importância da presença de células residentes, como macrófagos, no local da

injúria para a sinalização dos eventos da resposta inflamatória já foi descrita. Alguns

achados nesse sentido demonstram que a intensidade de neutrófilos que migram para a

cavidade peritoneal de animais estímulados com carragenina, zymosan e LPS

(estímulos exógenos) ou com IL-1 e TNF-α (estímulos endógenos) é proporcional ao

número de macrófagos residentes presente nessa cavidade (FACCIOLLI et al., 1990;

CUNHA & FERREIRA, 1986; DE SOUZA & FERREIRA, 1985; SOUZA et al, 1988). Na

dor inflamatória a presença dessas células parece ser crucial da mesma forma. O nosso

32

laboratório tem demonstrado, nos últimos anos, a importância de macrófagos residentes

na nocicepção induzida por estímulos como ácido acético e zymosan no modelo de

contorções abdominais. Alguns resultados, com a nossa participação inclusive,

demonstram que a depleção de células residentes da cavidade peritoneal, por lavagem

prévia, diminui significativamente a atividade nociceptiva do ácido acético e do zymosan

(ver ilustração 1) mas não a do iloprost (análogo estável da PGI2). Quando aumentamos

a população de macrófagos, através do pré-tratamento dos animais com tioglicolato (ver

ilustração 2), aumentam-se também o número de contorções induzidas por esses

estímulos (THOMAZZI, 1996, RIBEIRO et al, 2000a).

A B C D

C L0

20

40

60 12

11*

AAc

Núm

. de

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5

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10*

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10

20

306 4

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Núm

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es

ILUSTRAÇÃO 1. A redução da poulação de células residentes diminui a atividade nociceptiva do zymosan (ZYM) e do ácido acético (AAc) mas não a do iloptrost (ILO). Painel A: número de células residentes peritoneais em

animais controles sham (C) e em animais submetidos à lavagem da cavidade peritoneal (L). Painel B, C e D: número

de contorções abdominais induzidas por iloprost (ILO, 1 μg/cavidade), zymosan (ZYM 1 mg/cavidade) ou ácido acético

(AAc, 0.6%) respectivamente, em animais sham (C) e em animais submetidos á lavagem da cavidade peritoneal (L). O

número de contorções foi contado em uma periodo de 30 minutos após a injeção do estímulo e os resultados são

expressos como média + EPM do número de animais por grupo indicado no topo de cada coluna. *p<0.05 (RIBEIRO et

al., 2000a).

33

A B C D

C Tg0

20

40

9

8*

AAc

Núm

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cont

orçõ

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0

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0

20

40

12

8*

ZYM

Núm

ero

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s

ILUSTRAÇÃO 2. O pretratamento com tioglicolato aumenta a atividade nociceptiva do zymosan (ZYM) e do ácido acético (AAc) mas não a do iloptrost (ILO). Painel A: número de células residentes peritoneais em animais

pré-tratados com salina (C) e em animais pré-tratados com tioglicolato (Tg). Painel B, C e D: número de contorções

abdominais induzidas por iloprost (1 μg/cavidade), zymosan (1 mg/cavidade) ou ácido acético (0.6%) respectivamente,

em animais pré-tratados com salina (C) e em pré-tratados com tioglicolato (Tg). O número de contorções foi contado

em uma periodo de 30 minutos após a injeção do estímulo e os resultados são expressos como média + EPM do

número de animais por grupo indicado no topo de cada coluna. *p<0.05 (RIBEIRO et al., 2000a).

Além disso, como já foi descrito na literatura, macrófagos estimulados com LPS

liberam várias citocinas dentre elas IL-1, IL-8 e TNF-α, as quais promovem hiperalgesia

(CUNHA et al., 1991; CUNHA et al.,1992a). Essas citocinas, quando injetadas juntas,

induzem contorções abdominais em camundongos, enquanto que o pré-tratamento com

antisoros específicos contra essas citocinas bloqueia a atividade nociceptiva desses dois

estímulos no modelo de contorções abdominais em camundongos (RIBEIRO et al.,,

2000a).

1.4.2. Mastócitos

Os mastócitos são células capazes de secretar e produzir mediadores que podem

modificar eventos vasculares e celulares. Exercem um importante papel não só em

34

reações alérgicas mas também em inúmeros processos inflamatórios. Frente a um

estímulo inflamatório, mastócitos liberam mediadores (i) alguns pré- formados,

estocados em grânulos, como: histamina, serotonina, proteases, heparina e TNF

liberados imediatamente na presença do estímulo; (ii) outros sintetizados apartir do

metabolismo de lipídeos da membrana (prostaglandinas, leucotrienos e fator de ativação

plaquetária) que são liberados em poucos minutos; (iii) e também são capazes de

produzir citocinas dentre elas: IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8 e TNF. Além disso são

capazes de liberar óxido nítrico (MANNAIONI et al, 1991; BISSONNETTE et al, 1991;

SALVEMINI et al, 1990; MASINI et al, 1991).

A produção de citocinas por mastócitos não é uma mera resposta aguda à

ativação celular mediada por IgE, ela persiste por várias horas após a ativação por uma

variedade de estímulos incluíndo produtos bacterianos e prostanóides. A produção de

algumas citocinas por mastócitos não está necessariamente associada à liberação de

mediadores pré-formados, e pode ser um importante componente na patogênese de

doenças inflamatórias como a asma e artrite reumatóide (MARSHALL et al., 1996).

Mastócitos também devem contribuir para a migação de neutrófilos, pois

camundongos WBB6F1-W/Wv (W/Wv) deficientes de mastócitos mostraram uma

significante redução da migração de neutrófilos, que se segue à injeção de zymosan,

quando comparados com controles apropriados (cepa WWB6F1-+/+) (RAO et al, 1994).

Além disso, a migração de neutrófilos induzida por IL-8 ou leucotrieno B4 (LTB4)

depende do número da população de mastócitos residentes presentes no sítio do

estímulo (RIBEIRO et al., 1991; RIBEIRO et al., 1997).

Mastócitos são uma parte constitutiva do eixo neuroimmune e já foi mostrado,

através de microscopia eletrônica, que essas células estão intimamente associadas com

fibras contendo neuropeptídeos como substância P e o peptídeo relacionado ao gene da

35

calcitonina (CGRP) (STEAD et al., 1989) conhecido por estar envolvido na fisiopatologia

da dor (MAYER et al., 1994) via regulação da secreção de mediadores por mastócitos

humanos (LOWMAN et al., 1988).

Mastócitos residentes da cavidade peritoneal parecem importantes no

desenvolvimento da resposta dolorosa. Dados recentes do nosso laboratório, com a

nossa participação, mostram que a depleção de mastócitos peritoneais de camundongos

pelo pré-tratamento com o composto 48/80 diminui significantemente a atividade

nociceptiva do ácido acético e do zymosan no modelo de contorções abdominais

(RIBEIRO et al., 2000a).

A B C D

C 48/800

10

20

6

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C 48/80

0

5

10

1512

12*

ZYM

Núm

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cont

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es

ILUSTRAÇÃO 3. O pré-tratamento crônico com o composto 48/80 diminui a atividade nociceptiva do zymosan (ZYM) e do ácido acético (AAc), mas não a do iloprost (ILO). Painel A: número de mastócitos

peritoneais em animais controles pré-tratados com salina (C) e em animais submetidos ao pré-tratamento com o

composto 48/80 (48/80). Painel B, C e D: número de contorções abdominais induzidas por iloprost (1 μg/cavidade),

zymosan (1 mg/cavidade) ou ácido acético (0.6%) respectivamente, em animais controles pré-tratados com salina

(C e em animais submetidos ao pré-tratamento com 48/80 (48/80). O número de contorções foi contado em uma

periodo de 30 minutos após a injeção do estímulo e os resultados são expressos como média + EPM do número

de animais por grupo indicado no topo de cada coluna. *p<0.05 (RIBEIRO et al., 2000a).

36

1.5. Controle periférico da dor inflamatória

Em 1993, Ferreira fez uma classificação do controle terapêutico periférico da dor

inflamatória. Tomando como base as diferentes propriedades farmacológicas dos

mediadores da dor tipo a capacidade de ativação direta do nociceptor e a sensibilização,

os agentes inibidores da resposta dolorosa foram classificados como: (1) inibidores da

ativação direta do nociceptor (2) agentes que previnem o desenvolvimento da

hiperalgesia e (3) agentes que inibem a hiperalgesia já instalada.

1. Inibidores da ativação direta do nociceptor. Esse primeiro grupo de substâncias

agem impedindo a ativação direta do nociceptor por antagonismo direto no receptor ou

pelo bloqueio do estímulo excitatório. Os agentes antihistamínicos, por exemplo, estão

nesse grupo por antagonizar os efeitos da histamina nos receptores H1 que estão

associados geralmente com uma classe especial nociceptores que manifestam a

sensação de prurido (FERREIRA, 1972) e nos receptores H2 por bloquear a produção de

ácido, eliminando assim a estimulação química dos nociceptores associados com a

úlcera gástrica e a sensação de queimação. Bloqueadores do sistema simpático também

podem ser encaixados nesse grupo. Já está descrito que o bloqueio regional com

antagonistas α-adrenérgicos como a fentolamina é efetivo em aliviar a dor declarada em

humanos (CODERRE et al., 1984). Assim como os anestésicos locais também estão

incluídos nesse grupo por serem capazes de bloquear o estímulo excitatório.

2. Agentes capazes de prevenir o desenvolvimento da hiperalgesia. Nesse

segundo grupo podemos citar as drogas bloqueadoras da cicloxigenase (COX). A

descoberta nos primeiros anos da década de 70 de que a aspirina e drogas relacionadas

37

eram analgésicas e antiinflamatórias por inibir a síntese de prostaglandinas, abriu

inúmeros campos de pesquisa nessa área (Vane, 1971). Por muitos anos se pensou que

a enzima responsável pela síntese de prostaglandina, COX, era expressa

constitutivamente em todos os tecidos e que a sua sensibilidade variada aos

antiinflamatórios não esteroidais (AINES) assim como suas ações variadas nos

diferentes órgãos era devido à isoformas da enzima. No entanto, em 1991, Needleman e

seu grupo descreveram que lipopolissacarídeo bacteriano era capaz de aumentar a

síntese de prostaglandinas em monócitos humanos in vitro (FU et al., 1990) e em

macrófagos murinos peritoneais in vivo (MASFERRE et al., 1990). O aumento de

prostaglandinas foi inibido pela dexametazona e foi associado com a síntese de uma

nova proteína para COX. Mais ou menos um ano depois, uma forma induzida de COX foi

identificada como isoforma distinta. Foi denominada de COX-2 e codificada por um gene

diferente da enzima constitutiva (COX-1) (XIE et al., 1991; O’BANION et al., 1991;

KUJUBU et al., 1992; SIROIS et al., 1992).

A COX-2 é normalmente indetectável na maioria dos tecidos, no entanto na

presença de um processo inflamatório, pode ser induzida por citocinas inflamatórias

como IL-1β e TNF-α em células residentes e naquelas recrutadas para o foco

inflamatório (SEIBERT et al., 1994; BAKHLE et al, 1996).

O envolvimento da COX-2 na hiperalgesia inflamatória já foi demonstrado por

FERREIRA et al. (1999). Ácido araquidônico, quando injetado em patas de ratos no

modelo modificado do teste de Randall-Sellito (FERREIRA et al., 1978), não é capaz de

provocar hiperalgesia, no entanto potencia a hiperalgesia induzida por IL-1 ou

carragenina (ambos conhecidos por induzir COX-2). Em adição, o ácido araquidônico

não foi efetivo em potenciar a hiperalgesia induzida por IL-8, citocina envolvida na

estimulação da liberação de aminas simpatomiméticas, ou pela administração direta de

38

PGE2 (FERREIRA et al., 1999). Novas drogas vem sendo decobertas seletivas para

COX-2, como o meloxicam dentre outras, e a sua importância está na diminuição dos

efeitos colaterais presentes com as drogas não seletivas.

Outros agentes capazes de prevenir a hiperalgesia são os inibidores da

fosfolipase A2 (glicocorticoides), que além de inibir a liberação de produtos da

cicloxigenase também inibem a expressão de citocinas (SHIMMER e PARKER, 1996;

WAAGE & BAKK, 1988; KERN et al., 1988) dentre estas as hiperalgésicas que já foram

comprovadas participar da dor inflamatória pela estimulação das duas vias de

sensibilização dos nociceptores (eicosanoide e simpática).

Outra forma de evitar a sensibilização do nociceptor seria inibir a produção de

citocinas hiperalgésicas. A exemplo disso podemos citar drogas capazes de inibir a

produção de TNF-α, a citocina de papel central e iniciadora da cascata de citocinas

hiperalgésicas liberadas durante o processo inflamatório. Talidomida, uma droga que era

usada como sedativa, imunossupressora e antiinflamatória, foi proscrita por seus efeitos

teratogênicos. Atualmente vem sendo usada na terapia do eritema nodoso da lepra. Em

um período recente foi descoberto que o mecanismo de ação dessa droga era a inibição

da produção de TNF-α (MOREIRA et al., 1993). Desde então alguns trabalhos vem

demonstrando o potente efeito antiinflamatório da talidomida em modelos experimentais

e em pacientes humanos, pela sua capacidade de inibir a produção de TNF-α. Dados

nossos mostram que talidomida também possui efeito antinociceptivo e

antihiperalgésico. Utilizando o modelo de hiperalgesia Randal-Selitto modificado, foi

demonstrado que talidomida bloqueia a hiperalgesia induzida por carragenina,

bradicinina mas não a por TNF-α e que essa inibição só é conseguida quando a droga é

dada antes do estímulo. No modelo de contorções abdominais a talidomida também

inibiu a nocicepção causada por ácido acético e zymosan (RIBEIRO et al, 2000b).

39

Outra droga, pentoxifilina, um inibidor de fosfodiesterase também foi descrita

como inibidora da síntese de TNF-α in vitro e in vivo (STRIETER et al., 1988; ZENI et al.,

1996). Além de inibir outras citocinas como IL-1, IL-6 e IL-8, pentoxifilina também

aumenta a produção de IL-10 (citocina com propriedades inibitórias sobre macrófagos).

Dados do nosso laboratório não publicados mostram que pentoxifilina também exerce

antinocicepção no modelo de contorção abdominal e de hiperalgesia mecânica em pata

de rato.

A depleção de aminas simpatomiméticas por drogas como guanetidina e o

bloqueio de receptores por antagonistas β-adrenérgicos (atenolol e propanolol) ou

dopaminérgicos (SCH 23390) também previne sensibilização do nociceptor, foi o que

demonstrou NAKAMURA & FERREIRA (1987) no modelo de hiperalgesia no teste de

Randall-Selitto modificado.

3. Agentes que inibem a hiperalgesia já instalada. Uma dúvida fundamental a ser

respondida seria a de que se depois de já instalada a hiperalgesia pode ser inibida.

Quando o nociceptor está estimulado, como acontece durante a hiperalgesia, drogas

tipo aspirina, que previnem o desenvolvimento da hiperalgesia, não promovem analgesia

imediata. Em outras palavras, drogas que só previnem a ação de mediadores que

causam a sensibilização do nociceptor não são efetivas em promover analgesia imediata

quando o estímulo já foi deflagrado. No entanto, a dessensibilzação de nociceptores foi

demostrada quando se estimula a guanilato ciclase neuronal. A descoberta da via L-

arginina/óxido nítrico/GMPc (MURAD, 1986; MURAD et al, 1986; PALMER et al, 1987)

estimulou a invesigação da participação do óxido nítrico na regulação da resposta

dolorosa.

O óxido nítrico (NO), molécula derivada do oxigênio molecular e do nitrogênio do

grupamento guanidino do aminoácido L-argenina, está envolvida em uma variedade de

40

processos fisiológicos e patológicos (MONCADA et al., 1991). A sua formação é

catalisada pela enzima óxido nítrico sintase (NOS), que foi descrita existir sobre a forma

constitutiva (NOSc) e sobre a forma induzida (NOSi) (FUKUTO et al., 1995). A forma

induzida é detectada em células somente após a exposição a agentes inflamatórios

como citocinas e endotoxinas. As atividades tumoricida e microbicida de macrófagos são

dependentes da produção em massa de NO pela NOSi, por essas células. NOSi ainda

contribui para a falência cardiovascular no choque endotoxêmico, assim como para as

lesões dos tecidos em doenças inflamatórias e para o dano neural. (WONG et al., 1996;

WRIGTH et al., 1992).

Há relatos na literatura sugerindo que a inibição de NO causa analgesia. Foi o

que demostrou o trabalho de MOORE e colaboradores (1991). Onde foi observado que o

inibidor da síntese de NO, L-NG-nitro argenine methyl ester (L-NAME), exerce atividade

analgésica tanto em modelos de dor periférica como de dor central. Dados do nosso

laboratório também mostram essa atividade analgésica do L-NAME no modelo de

incapacitação articular em ratos (ROCHA, 1999). A despeito disso, algumas evidências

apontam o NO como um modulador negativo da dor. Já foi demostrado a participação do

NO causando analgesia periférica devido à sua capacidade aumentar dos níveis de

GMPc em neurônio sensoriais primários (DUARTE et al., 1992; FERREIRA et al., 1991).

Recentemente FERREIRA e colaboradores (1999) demostraram que doadores de NO

bloqueiam a hiperalgesia induzida por PGE2 no modelo de Randal-selitto modificado e

que o azul de metileno (inibidor da guanilato ciclase) reverte esse efeito hiperalgésico

mas L-NMMA não. Mostrando que esse efeito antihiperalgésico do NO deve-se a

ativação da guanilato-ciclase. Drogas que estimulam a produção de óxido nítrico

consequentemente também exercem efeito antinociceptivo por estimular a guanilato

ciclase. Foi proposto que opiódes periféricos (FERREIRA et al., 1991) assim como

41

analgésicos conhecidos como dipirona e diclofenaco (LORENZETTI et al., 1996;

DUARTE et al., 1992; TONUSSI & FERREIRA, 1994) causam analgesia por estimular a

via L-arginina/NO/GMPc. Essas propostas foram baseadas nas observações de que o

efeito analgésico desses compostos é bloqueado por L-NMMA (inibidor da síntese de

NO) e azul de metileno (inibidor da guanilato ciclase) e é potenciado por inibidores da

fosfodiesterase do GMPc.

2. CITOCINAS QUE MODULAM NEGATIVAMENTE A RESPOSTA INFLAMATÓRIA Vem tornando-se cada vez mais importante a inibição de citocinas que participam

da resposta inflamatória e da dor inflamatória por estas serem de fundamental

importância para o desenvolvimento de ambas. .Muitos estudos vem utilizando inibidores

como o antagonistas do receptor para IL-1 (IL-1ra) ou proteínas ligantes para TNF ou IL-

1, como os seus receptores solúveis para esse fim. Outros trabalhos utilizando citocinas

que inibem a síntese de TNF e IL-1, dentre outras citocinas pró-inflamatórias, como

também citocinas que promovem a produção de seus inibidores naturais, mostraram que

a resposta inflamatória tem moduladores negativos endógenos, servindo como um freio

para a inflamação. Essas citocinas tem a vantagem de inibir tanto a síntese de IL-1 e

TNF como a de outras citocinas e mediadores. Na lista de citocinas que possuem essas

propriedades inibitórias estão: IL-4,. IL-10, IL-13, IL-6, TGF-β e IFN-α. No presente

trabalho procuramos dar destaque a IL-4, IL-10 e IL-13.

2.1. INTERLEUCINA-4

- Propriedades biológicas

42

IL-4 é uma glicoproteina pleiotrópica constituida de 129 aminoácidos (YOKOTA

et al., 1986) de peso molecular aproximado 20 kDa. Seu receptor é expresso em

pequena quantidade em vários tipos de células: linfócitos B e T, monócitos, granulócitos,

fibroblastos, células epiteliais e endoteliais (CABRILLAT et al., 1987; PARK et al., 1987).

É produzida linfócitos Th2, mastócitos, basófilos células da medula óssea (DE WAAL

MALEFYT et al, 1995 ; PAUL & OHARA, 1987). Dentre suas atividades podemos citar a

proliferação de linfócitos T e natural killer, ativação, diferenciação e proliferação de

linfócitos B, revisto por MIZEL e colaboradores (1989). Além da estimulação da atividade

tumoricida de macrófagos in vitro (CRAWFORD et al, 1987) e in vivo (TEPPER et al,

1989), aumenta a capacidade de fagocitose do parasita Trypanossoma cruzi por essa

célula (WIRTH et al, 1989). IL-4 também inibe células Th1 e diminui hipersensibilidade

tardia em amimais experimentais e em humanos (ROCKEN et al., 1996; ZURAUWSKI et

al, 1994).

- Atividade antiinflamatória

Atualmente muitos estudos vem demonstrando a atividade antiinflamatória dessa

citocina. Em 1990 MCBRIDE e colaboradores demostraram sua atividade inibitória sobre

a produção de TNF, por macrófagos murinos, induzida por LPS e IL-2 in vitro e in vivo.

IL-4 tanto inibe a produção de IL-1 como aumenta a produção de IL-1ra por monócitos

humanos induzidos por LPS (VANNIER et al., 1992) e por neutrófilos (COLOTTA et al.,

1993). IL-4 inibe a produção de mediadores pró-inflamatórios por monócitos (HART et al,

1989; ESSNER et al, 1989; DONNELLY, 1990) assim como também a produção de IL-

1β, TNF-α e PGE2 por macrófagos peritoneais humanos, originados do extravasamento

de monócitos para a cavidade peritoneal (HART et al., 1991), e IL-1β, TNF-α e IL-6 por

43

monócitos humanos (TE VELDE et al., 1990). Confirmando esses achados, um estudo

mais recente demostrou que IL-4 diminuiu a expressão de CD14, um receptor para LPS,

em monócitos humanos (LAUENER et al., 1990). Ainda dentre suas atividades

antiinflamatórias está a inibição da indução de COX2 e NOSi, diminuindo assim a

produção de prostaglandinas e óxido nítrico (SEITZ et al., 1994; ONOE et al., 1996), e a

indução de apoptose em monócitos (MANGAN et al., 1992).

Em 1999, CUNHA e colaboradores demonstraram que IL-4 é capaz de inibir

significativamente a hiperalgesia em pata de rato (Randal-selitto modificado) induzida

por carragenina, bradicinina e TNF-α em contraste ao seu anticorpo monoclonal que

reverteu esse efeito antihiperalgésico. Sugeriu-se que a IL-4 endógena deve estar

agindo como um freio regulador da resposta dolorosa. Mostrou-se então a capacidade

dessa citocina em inibir a dor do tipo inflamatória.

2.2. INTERLEUCINA-10


A interleucina -10 humana consiste de 160 aminoácidos com peso molecular de

39 kDa e em solução está presente como um homodímero. IL-10 murina tem uma

massa molecular de aproximadamente 35 kDa (FIORENTINO et al., 1989). Tanto o

receptor murino como o humano já foram clonados e possuem 75% de homologia a

nível proteico e de DNA. É expresso em vários tipos de células e é consistente com as

repostas dessas células à IL-10.

44

Foi inicialmente descrita como “fator inibidor da síntese de citocinas” por sua

habilidade de suprimir a síntese de citocinas em certos tipos de células T. É

primariamente produzida por monócitos/macrófagos mas linfócitos T CD4+ e CD8+ e

linfócitos B também secretam-a após ativados (YSSEL et al, 1992; FIORENTINO et al,

1989; DE WAAL MALEFYT et al, 1991a e MOORE et al, 1990). A sua secreção por

macrófagos ativados é inibida por ela mesma (DE WAAL MALEFYT et al, 1991a) e é

secretada relativamente tarde em relação a outras citocinas, isso explica porque

macrófagos são capazes de liberar substancialmente muitas outras citocinas antes de

ocorrer a inibição por IL-10.

- Atividade antiinflmatória

IL-10 expressa uma potente atividade antiinflamatória tanto nas funções de

linfócitos como de monócitos (FIORENTINO et al., 1989). IL-10 inibe diretamente a

proliferação de linfócitos T e tem efeito inibitório indireto nos monócitos via a diminuição

da capacidade de apresentação do antígeno e de célula acessória dessas células

(YSSEL et al, 1992; FIORENTINO et al, 1989; DE WAAL MALEFYT et al, 1991a). Em

adição, IL-10 diminui a produção de uma série de citocinas pró-inflamatórias: IL-1β e α ,

IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α, fator de estimulador de colônias de granulócitos-macrófago

(GM-CSF) fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) por monócitos

humanos in vitro (DE WAAL MALEFYT et al, 1991) e por macrófagos (DE WAAL

MALEFYT et al, 1991b; FIORENTINO et al, 1991; OSWALD et al, 1992) além de inibir

outras funções dessas células como a expressão de classe II (DE WAAL MALEFYT et

al, 1991a) e adesão (FIORENTINO et al, 1991). IL-10 protege animais de laboratório

45

contra endotoxemia experimental (MOORE et al., 1993), mas há controvérsias sobre a

sua ação na produção de NO pela NOSi. Alguns estudos mostram um papel inibitório

sobre a NOSi (CUNHA et al., 1992b) e outros demontram um papel amplificador da

geração de NO (CORRADIN et al., 1993)

Recentemente foi sugerido que IL-10 é capaz de reduzir o número de receptores

de superfície para o TNF em monócitos humanos (JOYCE et al, 1994) e de aumentar o

pool de receptores solúveis de macrófagos do fluido sinovial humano. Em 1997, DI

SANTO e colaboradores observaram que a administração sistêmica de IL-10 humana

recombinante inibia a produção de TNF no sistema nervoso central, sugerindo a

capacidade de IL-10 atravessar a barreira hemato-encefálica abrindo um leque de

possibilidades dessa citocina ser usada clinicamente em distúrbios promovidos pelo TNF

no sistema nervoso central.

Em neutrófilos IL-10 é capaz de diminuir a produção de TNF-α, IL-1β e α, IL-8 e

IL-12 (CASSATELLA et al, 1993; KASAMA et al, 1994) assim como seletivamente

diminuir a expressão de COX-2 (HIROAKI et al, 1997) e inibir a degradação de RNAm

para IL-1ra (CASSATELLA et al, 1994; RE et al, 1993). Em mastócitos peritoneais de

ratos é capaz de inibir a produção de IL-6 (MARSHALL et al, 1996).

A importância da IL-10 como um regulador negativo da inflamação está bem

demostrado no estudo com camundongos deficientes de IL-10 cujo crescimento ficou

retardado, houve o desenvolvimento de anemia e de doença inflamatória crônica

resultando na doença inflamatória intestinal (KUHN et al, 1993). Em adição, IL-10 inibe

artrite induzida por colágeno (WALMSLEY et al, 1996; JOOSTEN et al, 1997), enquanto

que a neutralização com anticorpos para IL-10 murina aumenta a severidade da artrite

(KASAMA et al, 1995). IL-10 parece ser secretada por células sinoviais quando postas

em cultura (CUSH et al, 1995; KATSIKIS et al, 1994; ISOMÄKI et al, 1996a) e essa

46

produção endógena parece ser importante por funcionar como uma molécula

antiinflamatória em juntas artríticas. Comprovando isso foi visto que a sua neutralização

com anticorpos anti-IL-10 murina em cultura de células sinoviais aumenta a produção de

citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1β, GM-CSF e IFN-γ (KATSIKIS et al, 1994;

ISOMÄKI et al, 1996a). Além disso os mesmos autores confirmaram que particularmente

a produção de TNF-α é aumentada pelo anticorpo murino anti-IL-10, sugerindo que IL-10

é o maior regulador da produção de TNF-α em juntas artríticas (ISOMÄKI et al, 1996a).

Em contraste à neutralização do anticorpo murino anti-IL-10, a adição de IL-10

recombinante exógena à cultura de células sinoviais, além de prevenir a degradação da

cartilagem articular ainda diminui a produção de IL-1β e TNF-α (KATSIKIS et al, 1994;

ISOMÄKI et al, 1996a; CHOMARAT et al, 1995; VAN ROON et al, 1996).

Como TNF-α é uma citocina bastante atuante no desenvolvimento da dor crônica,

onde há injúria do nervo, é de se acreditar que a inibição dessa citocina possa diminuir a

nocicepção em alguns tipos de modelos de dor neuropática. Foi o que demonstrou

WAGNER et al (1998) quando inibiu a hiperalgesia termal após injúria neural com a

administração de IL-10.

Finalmente, IL-10 também já foi citada como uma citocina moduladora da dor

inflamatória. No modelo de hiperalgesia mecânica em pata de rato (Randall-Selito

modificado) POOL e colaboradores (1995) demonstraram que essa citocina tem

propriedades antinociceptivas pois é capaz de diminuir a hiperalgesia induzida por

carragenina, bradicinina, TNF-α e IL-6, mas não a por IL-8 e PGE2. Isso porque, como já

haviam descrito, a atividade hiperalgésica de carragenina e bradicinina depende da

indução da produção de TNF-α e IL-6 (FERREIRA et al, 1993) que por sua vez

47

dependem da indução da produção de outras citocinas como a IL-1β e IL-8 (CUNHA et

al., , 1992a). Já IL-8 induz à produção de aminas simpaticomiméticas (CUNHA et al,

1991) e PGE2 já é um mediador final da nocicepção inflamatória (FERREIRA, 1972),

eventos que não são inibidos por IL-10. O comportamento de IL-10, nesse modelo,

tornou mais consistente a idéia da cascata de mediadores liberados já proposta por esse

grupo de autores (CUNHA et al, 1991, 1992a; FERREIRA et al, 1993).

2.3. INTERLEUCINA-13


IL-13 é secretada como uma proteína não glicosilada de 132 aminoácidos

(MCKENZIE et al., 1993). O gene da IL-13 possui 30% de homologia com a seqüência

do da IL-4 mas não tem homologia com nenhuma outra citocina conhecida. IL-13 é uma

citocina pleiotrópica descrita recentemente, derivada principalmente de linfócitos T CD4+

e CD8+ (MINTY et al, 1993; de WAAL MALEFYT et al, 1995) é produzida principalmente

por linfócitos Th0, TH1 e Th2 após ativação (DE WAAL MALEFYT et al, 1995).

Tanto IL-13 humana como a murina induz a proliferação de células TF-1

premieloides humanas. IL-13 também induz mudanças na morfologia de monócitos

humanos e no fenótipo tanto de monócitos como de células B humanas, aumentando a

expressão de MHC classe II e induzindo a expressão do receptor de IgE (MCKENZIE et

al., 1993; PUNNONEN et al., 1993). IL-13 é uma citocina homóloga que utiliza alguns

componentes do receptor da IL-4. A despeito disso, não tem nenhum efeito na

diferenciação de células T, mas tem efeitos similares aos da IL-4 em macrófagos e

48

neutrófilos como a diminuição de IL-1β e aumento da IL-1ra, e em neutrófilos aumentam

a expressão do receptor IL-1t2 (COLOTTA et al, 1994), reduz a síntese de outras

citocinas pró-inflamatórias como IL-8 e MIP-1, diminui a expressão de FcγRI (CD64),

FcγRII (CD32) e FcγRIII (CD16) em monócitos levando a uma redução da citotoxicidade

celular dependente de anticorpos (DE WAAL MALEFYT et al., 1993)

- Atividade antiinflamatória

Possui potente atividade antiinflamatória pois, o tratamento de macrófagos

murinos ativados e monócitos humanos com IL-13 recombinante inibiu a produção de

citocinas pró-inflamatórias como: IL-1β, IL-8, IL-6, IL-12p35, IL-12p40, MIP-1, GM-CSF,

IFN-γ e TNF-α além de IL-10 em resposta a IFN-γ e LPS (DE WAAL MALEFYT et al,

1993; DOHERTY et al., 1993; MINTY et al., 1993). Em contraste, aumenta a secreção

de IL-1ra (semelhante à IL-10 e IL-13) (DE WAAL MALEFYT et al, 1993). Além disso

reduz a produção de óxido nítrico e produtos reativos do oxigênio (DE WAAL MALEFYT,

1993).

IL-13 deve exercer um importante papel na regulação resposta inflamatória da

artrite reumatóide, pois está presente em níveis elevados no fluido sinovial (ISOMÄKI et

al, 1996b), e já foi demonstrado que IL-13 exógena diminui a produção de IL-1β e TNF-α

por células mononucleares presentes no fluido sinovial de pacientes com artrite

reumatóide (ISOMÄKI et al, 1996b), assim como a reabsorção óssea in vitro (ONOE et

al, 1996) e a injeção subcutânea de células geneticamente programadas para secretar

IL-13 diminuiu a artrite induzida por colágeno em camundongos (BESSIS et al, 1996).

49

3. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS Em face ao exposto nos itens anteriores , ficou claro que as citocinas por nós

destacadas são moduladoras negativas do processo inflamatório e dentre elas algumas

como IL-4 e IL-10 já foram demostradas serem analgésicas no modelo de hiperalgesia

inflamatória. Contudo, no campo da dor inflamatória o assunto ainda é pouco abordado e

o que já foi demonstrado na hiperalgesia ficou limitado apenas a uma especulação de

como essas citocinas estão agindo, sugerindo que as mesmas talvez estejam inibindo a

liberação de mediadores pró-inflamatórios por células residentes.

No modelo de contorções abdominais é possível demonstrar que essas células

residentes são importantes e que a presença delas é crucial para o desenvolvimento da

dor inflamatória. No intuito de investigar a atividade analgésica não só das citocinas IL-4

e IL-10 como também da IL-13 (citocina ainda não investigada) e como essas citocinas

exercem essa analgesia, resolvemos testar em outros modelos de dor inflamatória que

nos permitissem comprovar o verdadeiro papel dessas citocinas na modulação desse

tipo de dor. Para tanto escolhemos o modelo de contorções abdominais e o teste da

incapacitação articular como modelos de dor periférica e o teste da placa quente para

testar a possibilidade de alguma atividade a nível central

Pesquisamos ainda a possibilidade dessas citocinas estarem inibindo a liberação

de IL-1β e TNF-α por macrófagos peritoneais e por esse mesmo mecanismo estarem

inibindo o número de contorções abdominais.

50

II. Materiais e Métodos

51

1. ANIMAIS

1.1. Camundongos

Foram utilizados camundongos Swiss (Mus muscullus), machos, pesando entre 25 e 30

gramas, provenientes do Biotério Central do Campus do Pici – Universidade Federal do

Ceará e Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia dessa mesma

universidade e do Biotério do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Medicina

de Ribeirão Preto – USP. Os animais foram mantidos em caixas de plástico com livre

acesso a ração e água

1.2. Ratos

Foram utilizados ratos Wistar (Ratus novergicus), machos, pesando entre 180 e 200

gramas, provenientes do Biotério Central do Campus do Pici – Universidade Federal do

Ceará e Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia dessa mesma

universidade.

2. APARELHOS E INTRUMENTOS LABORATORIAIS

Durante o decorrer dos experimentos foram utilizados diversos aparelhos e

instrumentos nominados a seguir:

- Aparelho para medir a incapacitação articular (gentilmente cedido e elaborado

pelo Prof. Marcus R. Vale do Depto. de Fisiologia e Farmacologia- UFC)

- Aparelho utilizado no tese da placa quente (gentilmente cedido pelo Prof.

Vietla S. Rao, Depto. de Fisiologia e farmacologia- UFC)

- Aparelho de ultracentrifugação (Amicon Corporation)

- Autoclave (FABE)

- Balança para pesagem de animais, mod. ID-1500 (FILIZOLA)

52

- Balança analítica mod. AL200 e Ohaus, mod. AS260D (MARTE)

- Beckers (SIMAX)

- Câmara de Neubauer 0.100/0.0025 mm2

- Capela de fluxo laminar, vertical (modelo VLFS-12, Veco do Brasil Ind. Com.

Equip. Ltda, Campinas, SP, Brasil)

- Centrifuga Eppendorf – Mod. 5804R

- Estufa de CO2 para cultura (Nuaire TS Autoflow)

- Funis de vidro grandes

- Material cirúrgico (tesoura, pinça clínica e dente de rato)

- Membranas de ultrafiltração diaflo RYM-10 (Amicon Corporation)

- Microscópio óptico binocular (EMBRAEME)

- Micropipetas automáticas (GILSON)

- Ponteiras para pipetas automáticas - 200 ul e 1 ml (SIGMA)

- Seringas de 5 e 3 ml recicladas por autoclave

- Seringas novas de 1 ml

- Sonicador (Sonics & Materiais Inc. Danbury – Connecticut – USA)

- Tubos Eppendorf -1.5 ml (GIBCO)

- Tubos de ensaio de vidro (PIREX)

- Tubos plástico de 15 ml (FALCON)

3. DROGAS, SOLUÇÕES, CITOCINAS E ANTISOROS

3.1. Drogas

- Zymosan (from Saccharamyces cerevisiae, Sigma Chemical Co., St Louis, USA),

dissolvido em salina.

53

- Indometacina (Merck, Sharp and Dohme-MSD, USA) – dissolvida em solução de

bicarbonato de sódio a 5%.

- Cloridrato de morfina (Dimorf ; Laboratório Cristália-Brasil ) diluída em salina.

- Cloridrato de naloxona (Narcan – Rhodia Farma) diluído em salina.

- Éter Etílico (Syth)

- Heparina (Laboratório Cristália – Brasil)

- Hidrato de Cloral (Reagen)

- avidina-peroxidase (DAKO)

- o-fenilenediamina diidrocloreto (Sigma Chemical Co., St Louis, USA)- disolvido no

tampão substrato descrito no protocolo de ELISA.

3.2. Soluções

- Solução de ácido acético

Ácido Acético Glacial (Reagen), utilizado a 0.6% (v/v; concentração de 629 mg/100 ml),

dissolvido em água deionizada.

- Solução de bicarbonato de sódio

Bicarbonato de sódio (Merck, Sharp and Dohme – MSD, USA) utilizado a 5% (p/v)

dissolvido em água destilada.

- Solução Salina 0.9% estéril (Laboratório Cristália-Brasil)

- Solução de H2SO4 a 1M.

- albumina bovina 1% diluída em tampão de lavagem

- soro normal de carneiro

- Solução de Turk

Ácido acético glacial (Reagen )...........................................................20.0 ml

Violeta de genciana (Reagen)...............................................................2.0 ml

54

Água destilada.................................................................................1000.0 ml

3.3. Tampões utilizados para o ensaio imunoenzimático

- Tampão bicarbonato pH 8.2

NaHCO3 P.A. (Merck, Sharp and Dohme – MSD, USA)........................0,1 M

NaCl. P.A.(Merck, Sharp and Dohme – MSD, USA)...............................0,1 M

- Tampão Substrato pH 5.0

Ácido Cítrico......................................................................................34,7 mM

Na2HPO4.(Merck)..............................................................................66,7 mM

- Substrato

OPD.....................................................................................................0,4 mg

H2O2.....................................................................................................0,4 μl

Tampão substrato q.s.p. ......................................................................1 ml

- Tampão de lavagem PBS-tween 20, 0,1% v/v.

3.4. Meio de Cultura

- RPMI simples :

Meio RPMI 1640 Medium (Sigma, St Louis, USA; lote H0763).............10.4 g

Hepes.(Sigma Chemical Co., USA).......................................................2.38 g

Bicarbonato de sódio (Merk, Sharp and Dohme – MSD, USA).............2.20 g

Água deionizada Milli-Q autoclavada........................................................1 L

- RPMI completo:

Soro fetal bovino...................................................................................10 ml

Gentamicina (Gentamicin sulfate solution; Sigma G-1522)...................500 ul

Penicilina-Streptomicina (Sigma P-3539)..............................................500 ul

55

Meio RPMI simples q.s.p. ....................................................................100 ml

O meio de cultura foi filtrado em filtro Durapore (0.22 umGV) com membranas

estéreis (Millipore) de modo que após preparado o meio estava asséptico e

apirogênico.

3.5. Citocinas e Antisoros

3.5.1. Citocinas

- Interleucina –4 recombinante humana (rhuIL-4): Obtido do National Institute for

Biological Standards and Control (NIBSC), Inglaterra. Código 88/656. Cada

ampola continha 1.000 UI (100 ng).

- Interleucina-10 recombinante humana (rhuIL-10): Obtido do National Institute for


ampola continha 5.000 UI (1 μg).

- Interleucina-13 recombinante humana (rhuIL-13): Obtido do National Institute for


ampola continha 1.000 UI (1 mg).

3.5.2. Anticorpos específicos

- Soro anti-TNF-α (H92 ou XT 22.11). Obtido do National Institute for Biological

Standards and Control (NIBSC), Inglaterra.

- Soro anti-IL-1β (S5/B3) obtido do National Institute for Biological Standards and

Control (NIBSC), Inglaterra.

- anticorpo biotinilado anti-TNF-α (H92)

- anticorpo biotinilado anti-IL-1β (S329/B4)

56

Todas as citocinas e antisoros foram gentilmente cedidas pelo Prof. Fernando de

Queiróz Cunha do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto – USP.

4. TESTES NOCICEPTIVOS

4.1. Teste de contorção abdominal induzido por ácido acético ou zymosan

O modelo utilizado foi descrito anteriormente por COLLIER et al (1968). Foram

utilizados camundongos Swiss machos, pesando entre 25 e 30 g. Os estímulos: ácido

acético (0,6%; 0.01 ml/g de peso) ou zymosan (1 mg/animal) foram injetados por via ip e

a intensidade de nocicepção foi quantificada pelo número total de contorções

abdominais ocorridas nos primeiros 30 min após sua administração. Uma contorção

sendo identificada como a extensão das patas traseiras acompanhada por constricção

do abdomen.

ILUSTRAÇÃO 4

Injeção ip doestímulo:

Zymosan Ácido acético

Pré tratamento (ip): Salina IL-4 IL-10 IL-13

Contagem das contorções abdominais

durante 30 minutos

30’

57

4.2. Teste de incapacitação articular

O modelo foi descrito anteriormente por TONUSSI & FERREIRA (1992),

posteriormente modificado (MAGALHÃES et al, 1997, VIANA et al. 1998) e adaptado

para o nosso laboratório. Ratos Wistar machos, pesando entre 180 a 200 g receberam a

injeção intrarticular, no joelho posterior direito, de zymosan (1 mg/amimal; 50 μl) e foram

postos para deambular forçadamente em um carrosel de piso metálico (cilindro de

alumínio, 30 cm de diâmetro x 50 cm de de largura, coberto por uma tela de alumínio

nas mesmas proporções), giratório, com capacidade para 3 animais. A velocidade

utilizada foi de 3 RPM. As patas traseiras foram calçadas com sapatilhas metálicas,

onde a sapatilha da pata direita é conectada à porta de dados de um microcomputador.

Ao tocar com a sapatilha no piso metálico fecha-se um circuito e ao final de 1 min o

computador registra o tempo de suspensão da pata (TSP), isto é, o tempo que o animal

permaneceu com a pata levantada sem encostar no piso. O TSP é medido antes da

injeção do estímulo (tempo zero) e de hora em hora até a 4ª hora. Calcula-se o Δ TSP

que é a diferença entre medida do TSP de cada hora e a do tempo zero. Dessa forma,

um aumento do Δ TSP indica nocicepção (incapacitação articular), isto é, a incapacidade

do animal deambular normalmente sobre o carrossel. Vale ressaltar, que antes da

realização do ensaio o animais eram treinados, permitindo-se um período de

deambulação e adaptação ao ambiente.

58

ILUSTRAÇÃO 5

(ip)

Pré-tratamento: Salina IL-4

IL-10

IL-13

0 1 h 2 hs3 hs4 hs

30 min

Zymosan (i.a.)

Incapacitação Articular

4.3. Teste da placa quente

Para testar a eficácia contra a nocicepção térmica e de ação central foi utilizado o

método de EDDY & LEIMBACH (1953) com pequenas modificações. Durante o

experimento foi seguido o protocolo ético (NIH Guide for Care and Use of Laboratory

Animals).

Camundongos machos, pesando entre 25 e 30 g, foram postos em uma placa

quente mantida a 55 + 1º C e foram retirados quando observada a reação de saltar ou

lamber as patas traseiras. Foram feitas duas triagens separadas por um intervalo de 30

min, onde a primeira familiarizou o animal com o teste e serviu como uma pré-seleção

59

(aqueles que mostraram um tempo de reação superior a 10 segundos foram

descartados). A segunda serviu como o registro do tempo zero (tempo medido antes da

administração das substâncias a serem testadas). Além do tempo zero os animais foram

ensaiados nos 30, 60 e 90 min após a administração das drogas. 40 segundos foi

considerado o tempo máximo de reação para prevenir danos nas patas dos animais.

ILUSTRAÇÃO 6

550C550

C

0’ 30’60’90’

Injeção ip de:

Morfina

IL-4 IL-10

Contagem do tempo de permanência na placa quente

Salina

IL-13

5. INFLUXO DE LEUCÓCITOS

Os animais receberam a injeção intrarticular de zymosan (1 mg/animal) no joelho

posterior direito, após 6 horas foram anetesiados com hidrato de cloral (400 mg/kg; ip) e

sacrificados por decaptação exsanguinação. A pele e os ligamentos articulares do joelho

injetado foram removidos e procedeu-se a lavagem da cavidade articular pela injeção de

400 μl de salina heparinizada (40 UI/ml) através da membrana sinovial recolhendo-se o

60

exsudato articular. As alíquotas foram diluídas em solução de Turk a 10% e os

leucócitos foram contados em câmaras de Neubauer.

ILUSTRAÇÃO 7

6. OBTENÇÃO DO SOBRENADANTE DE CULTURA DE MACRÓFAGO

Os macrófagos foram tratados e estimulados in vivo. Para isso, camundongos

Swiss foram injetados, em grupos de 3 animais, por via ip com salina ou zymosan

(1mg/animal) e após 15 minutos foram sacríficados em câmara de éter. A cavidade

peritoneal foi lavada com 2 ml de meio de cultura (RPMI incompleto) em ambiente

asséptico (Fluxo laminar). Colheu-se o exsudado e este foi centifugado por 5 min a 3000

RPM. O sobrenadante foi desprezado e as células foram ressuspensas em 500 μl de

meio de cultura completo e colocadas em placas de cultura (1 poço por animal). Foram

Pré-tratamento:

Salina IL-4 IL-10 IL-13

Zymosan (i.a)

Sacrifício

Coleta do exsudato

da cavidade articular

30 min

centrifugação

Solução de Turk Turk

Contagem do númerototal de células

Remoção dosobrenadante

61

encubadas por 12 horas em estufa de CO2 a 37º C, numa atmosfera de 5%. Após a

adesão dos macrófagos os sobrenadantes foram colhidos e estocados a –70º C para

posterior análise. Todo o procedimento foi cuidadosamente elaborado de forma

apirogênica. Após o período de incubação foi checada a possibilidade de contaminação

por bactérias, sendo esta descartada.

ILUSTRAÇÃO 8

Injeção (ip) doestímulo:

Zymosan Pré tratamento (ip):

Salina IL-4 IL-10

30 min

Coleta do fluido peritoneal com meio

de cultura

centrifugação

Remoção do sobrenadante

Ressuspensão dascélulas com RPMI

completo Cultura em estufa de CO2

a 37º C por 12 horas

15 min

7. DOSAGEM DE TNF-α e IL-1β EM SOBRENADANTE DE CULTURA DE

MACRÓFAGOS

O sobrenadante estocado foi descongelado para a quantificação de citocinas como TNF-

α e IL-1β. O material foi dosado pelo protocolo de ELISA descrito a seguir:

62

• Incubação com 2 μg/ml de anticorpo anti-TNF-α (H92 ou XT 22.11) ou anti IL-1β

(S5/B3) (anticorpo de captura) diluído em tampão de bicarbonato (pH 8.2) - 100

μl/poço (placa de 96 poços) por 16-24h a 4° C.

• Lavagem da placa (3x) com PBS-tween 20, 0,1% v/v.

• Bloqueio com albumina bovina 1% diluída em tampão de lavagem, 100 μl/poço por 2h

à temperatura ambiente.

• Lavagem da placa (3x)

• Incubação com a curva padrão de TNF-α (5000-4,88 pg/ml) ou IL-1β(2000-1,95 pg/ml)

diluídas em tampão de lavagem e das amostras a serem dosadas (100 μl/poço por

16-24h à 4° C).


• Incubação com anticorpo biotinilado anti-TNF-α (H92) ou anti-IL-1β (S329/B4)

(anticorpo de detecção) diluído 1:1000 em tampão de lavagem contendo 1% de soro

normal de carneiro por 1 h à temperatura ambiente


• Incubação com avidina-peroxidase (DAKO) diluída 1:5000 em tampão de lavagem,

100 μl/poço por 15 min à temperatura ambiente.


• Incubação com o-fenilenediamina diidrocloreto (OPD) em tampão substrato, 100

μl/poço, cobrir a placa e deixar no escuro por 5-20 min à temperatura ambiente.

• A reação foi parada com 150 μl/poço de H2SO4 1M.

• A leitura foi feita em espectrofotômetro a 490 nm.

• Os resultados são expressos em ug/ml como a curva padrão.

63

8. EFEITO ANTINOCICEPTIVO DAS INTERLEUCINAS – 4, 10 E 13 SOBRE AS

CONTORÇÕES ABDOMINAIS INDUZIDAS POR ÁCIDO ACÉTICO E ZYMOSAN.

IL-4 (1 – 5 ng/animal), IL-10 (0.4 – 25ng/animal) ou IL-13 (0.4 – 2.5 ng/ml) foram

injetadas num volume de 250 μl por via ip 30 min antes da injeção também ip do

estímulo ácido acético (0.6%) ou zymosan (1 mg/animal). As contorções abdominais

foram computadas durante 30 min após a administração dos mesmos.

9. EFEITO DA NALOXONA SOBRE A ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DAS

INTERLEUCINAS- 4, 10 E 13.

Camundongos Swiss foram previamente tratados (30 min,; ip) com salina (250

μl), IL-4 (5 ng/animal), IL-10 (10 ng/animal) ou IL-13 (2.5 ng/ml) ou morfina (5 mg/kg; 15

min antes). Alguns grupos além das interleucinas ou da morfina, receberam também,

previamente (15 min) naloxona (2 mg/kg) por via ip. Ácido acético (0.6%) foi

administrado por via ip e logo em seguida as contorções abdominais foram computadas

durante 30 min.

10. EFEITO ANTINOCICEPTIVO DAS INTERLEUCINAS – 4, 10 E 13 SOBRE A

INCAPACITAÇÃO ARTICULAR INDUZIDA POR ZYMOSAN.

IL-4 (1 – 5 ng/animal), IL-10 (0.4 – 25ng/animal) ou IL-13 (0.4 – 2.5 ng/ml) foi

injetada num volume de 500 μl por via ip 30 min antes da injeção intrarticular de

64

zymosan (1 mg/animal; 50 μl). O tempo de suspensão da pata foi medido durante 60

segundos de hora em hora até a 4ª hora após a injeção do estímulo.

11. EFEITO DAS INTERLEUCINAS –4, 10 E 13 NO TESTE DA PLACA QUENTE.

Após a tomada do tempo zero IL-4 (1 – 5 ng/animal), IL-10 (0.4 – 25ng/animal),

IL-13 (0.4 – 2.5 ng/animal), morfina (5 mg/kg) ou indometacina (2 mg/kg) foi injetado (a)

por via ip e 30, 60 e 90 min depois foi registrado o tempo de reação (s) na placa quente

(55 + 1º C).

12. EFEITO DAS INTERLEUCINAS –4, 10 E 13 NO INFLUXO DE LEUCÓCITOS PARA

A CAVIDADE ARTICULAR.

IL-4 (1 – 5 ng/animal), IL-10 (0.4 – 25ng/animal), IL-13 (0.4 – 2.5 ng/animal) ou

salina foram injetadas por via ip 30 min antes da administração intrarticular de zymosan

(1 mg/animal). Após 6 horas da injeção do estímulo os animais foram sacrificados, as

cavidades articulares dos joelhos injetados foram lavadas e o exsudato foi colhido para a

contagem total do número de leucócitos.

65

13. EFEITO DAS INTERLEUCINAS –4 e 10 NA LIBERAÇÃO DO FATOR DE NECROSE

TUMORAL (TNF-α) E DE INTERLEUCINA-1 β (IL-1β) POR MACRÓFAGOS

PERITONEAIS DE CAMUNDONGOS ESTIMULADOS IN VIVO POR ZYMOSAN.

Os camundongos foram pré-tratados com IL-4 (5 ng/animal; ip) ou IL-10 (10

ng/animal; ip) 30 min antes da injeção ip de zymosan (1 mg/animal). 15 min depois, os

animais foram sacrificados e o exudato peritoneal foi colhido e posto em cultura por 12

horas. O sobrenadante foi retirado para a realização da dosagem de TNF-α e IL-1β pelo

protocolo de ELISA descrito anteriormente.

14. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram expressos como média + o erro padrão da média (EPM). As

médias dos vários procedimentos experimentais foram comparadas utilizando a análise

de variância (ANOVA), e a significância entre os grupos estabelecida pelo teste Turkey.

O numero (N) de animais por grupo experimental está descrito nas figuras. A

significância mínima foi aceita ao nível de P<0.05.

66

III. Resultados

67

1. ATIVIDADE NOCICEPTIVA DO ÁCIDO ACÉTICO E DO ZYMOSAN NO MODELO

DE CONTORÇÕES ABDOMINAIS

A injeção intraperitoneal de ácido acético (figura1A) nas doses de 0.15, 0.3 e

0.6% ou de zymosan (figura1B) nas doses de 0.25, 0.5 e 1 mg/animal foi capaz de

induzir contorções abdominais em camundongos de forma dose dependente quando os

animais são observados durante 30 min após a injeção do estímulo. O número de

contorções foi significante para todas as doses de ambos os estímulos, sendo que a

atividade nociceptiva máxima foi alcançada na dose de 0.6% para o ácido acético

(p<0.05) e na dose de 1 mg/animal para o zymosan (p<0.05).

2. BLOQUEIO DA ATIVIDADE NOCICEPTIVA DO ACIDO ACÉTICO E ZYMOSAN

POR INTERLEUCINA-4 NO MODELO DE CONTORÇÕES ABDOMINAIS.

A injeção intraperitoneal de IL-4 nas doses de 1, 2.5 e 5 ng/animal, 30 min antes

do estímulo, foi capaz de reduzir de forma dose-dependente as contorções abdominais

induzidas por ácido acético (0.6%, ip; Figura 2A) ou zymosan (1 mg/animal, ip; Figura

2B) sendo o bloqueio significante apenas nas doses de 2.5 e 5 ng com 49.8% e 58.7%

(p<0.05) de inibição respectivamente para o ácido acético e 36.5% e 62.6% (p<0.05)de

inibição respectivamente para as mesmas doses, quando o estímulo utilizado foi o

zymosan.

68

A

C 0,15 0,3 0,60

15

30

45

60

AAc (%)

6*6

*6

*6

Nº d

e co

ntor

ções

B

C 0,25 0,5 10

5

10

15

Zym (mg/animal)

6

*6

*6

*6

Nº d

e co

ntor

ções

FIGURA 1. Curva dose-resposta da atividade nociceptiva do ácido acético e zymosan no modelo de contorções abdominais. Ácido acético (AAc, 0.15, 0.30 ou

0.6%; Painel A) ou zymosan (Zym 0.25, 0.5 e 1 mg/animal; Painel B) foi administrado por

via ip em camundongos Swiss. Em ambos os paineis C indica o grupo que recebeu

salina. As barras representam as médias + EPM do número total de contorções

ocorridas após 30 min da injeção do estímulo. Os números acima das barra indicam o

número de animais ensaiados de cada grupo. Os asteriscos indicam a diferença

estatística em relação ao grupo que recebeu salina (*p<0.05; Turkey – ANOVA).

69

A

S 1 2.5 50

25

50

75 IL-4 (ng/animal)

10

6

*5 *

8

AAc

Nº d

e co

ntor

ções

B

S 1 2.5 50

5

10

1510

4*5

*9

IL-4 (ng/animal)

Zym

Nº d

e co

ntor

ções

FIGURA 2. Efeito antinociceptivo da interleucina-4 (IL-4) nas contorções abdominais induzidas por ácido acético ou zymosan. Ácido acético (AAc, 0.6%;

Painel A) ou zymosan (Zym, 1 mg/animal; Painel B) foi administrado por via ip em

camundongos Swiss previamente tratados (30 min antes; ip) com salina (controle, S) ou

IL-4 (1, 2.5 e 5 ng/animal) no volume de 250 μl. As barras representam as médias +

EPM do número total de contorções ocorridas após 30 min da injeção do estímulo. Os

números acima das barra indicam o número de animais ensaiados de cada grupo. Os

asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina como

pré-tratamento (*p<0.01 ; Turkey – ANOVA).

70



A injeção intraperitoneal de IL-10 nas doses de 0.4, 2 e 10 ng/animal, 30 min

antes do estímulo, foi capaz de reduzir as contorções abdominais induzidas por ácido

acético (0.6%, ip; Figura 3A) ou por zymosan (1 mg/animal, ip; Figura 3B) sendo o efeito

significante para todas doses, com 31%, 35% e 52% (p<0.05) de inibição

respectivamente para o ácido acético e 42.63%, 47.28% e 74.4% (p<0.05) de inibição

respectivamente quando o estímulo utilizado foi o zymosan.



A injeção intraperitoneal de IL-13 nas doses de 0.4, 1 e 2.5 ng/animal, 30 min

antes do estímulo, foi eficaz em reduzir as contorções abdominais induzidas por ácido

acético (0.6%, ip; Figura 4A) ou por zymosan (1 mg/animal, ip; Figura 4B), de modo

significante com 55.1%, 62.1% e 89.26% (p<0.05) de inibição respectivamente quando

o estímulo utilizado foi o ácido acético ou com 57.7%, 58.7% e 61.7% (p<0.05) de

inibição quando o estímulo foi o zymosan para as três doses, respectivamente.

71

A

B

S 0.4 2 100

20

40

60

AAc

Nº d

e co

ntor

ções

IL-10 (ng/animal)

6

*6

*6

*6

S 0.4 2 100

5




IL-10 (0.4 - 10 ng/animal) no volume de 250 μl. As barras representam as médias + EPM

do número total de contorções ocorridas após 30 min da injeção do estímulo. Os

números indicados acima das barra indicam o número de animais ensaiados de cada

grupo. Os asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu

salina como pré-tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).

10

15

*6 *

6

*6

6

IL-10 (ng/animal)

Zym

Nº d

e co

nto

esrç

õ

72

A

S 0.4 1 2.50

25

50

75 IL-13 (ng/animal) AAc

Nº d

e co

ntor

ções

6

*6 *

6

*5

B

S 0.4 1 2.50

5

10

15

16

*16

*16 *

16

IL-13 (ng/animal)

Zym

Nº d

e co

ntor

ções




IL-13 (0.4, 1 e 2.5 ng/animal) no volume de 250 μl. As barras representam as médias +

EPM do número total de contorções ocorridas após 30 min da injeção do estímulo. Os

números indicados acima das barra indicam o número de animais ensaiados de cada

grupo. Os asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu

salina como pretratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).

73

5. EFEITO DA INJEÇÃO INTRAPERITONEAL DE INTERLEUCINA-4 SOBRE A

ATIVIDADE NOCICEPTIVA DO ZYMOSAN NO MODELO DE INCAPACITAÇÃO

ARTICULAR EM JOELHO DE RATO.

IL-4 foi administrada por via ip nas doses de 1 e 5 ng/animal 30 min antes da

injeção intrarticular de zymosan (1 mg/animal). Na Figura 5 observou-se que IL-4 foi

capaz de inibir a incapacitação articular (Δ tempo de suspensão da pata), de modo

significante, apenas quando dada na dose de 5 ng/animal com 49.2% (p<0.01) de

inibição na 3ª hora (pico de incapacitação).




IL-10 foi administrada por via ip nas doses de 2 e 10 ng/animal 30 min antes da

injeção ia de zymosan (1 mg/animal). Na Figura 6 observou-se que IL-10 foi eficaz em

inibir a incapacitação articular, de modo significante, nas duas doses com 55.7% e

64.8% (p<0.05) de inibição na 3ª hora (pico de incapacitação) e 65.6% e 69.9% (p<0.05)

na 4º hora de incapacitação articular .

74

0 1 2 3 4 50

10

20

30

40

Salina

IL-4 (1 ng/animal)IL-4 (5 ng/animal)

*

Tempo (H)

ΔTe

mpo

de

susp

ensã

oda

pat

a (s

)

FIGURA 5. Efeito antinociceptivo da interleucina-4 (IL-4) sobre a incapacitação articular induzida por zymosan. Zymosan (1 mg/animal) foi administrado por via

intrarticular em joelhos de ratos previamente tratados com salina ou IL-4 (1 e 5

ng/animal) por via ip. Durante 60 segundos, a cada 1 hora, foi analisado o tempo de

suspensão da pata do animal. Os pontos representam a média + EPM do Δ tempo de

suspensão da pata (diferença entre o tempo de medida e o tempo zero), sendo N=6. O

asterisco indica a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina como

pré-tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).

75

0 1 2 3 4 50

10

20

30

40

SalinaIL-10 (2 ng/animal)IL-10 (10 ng/animal)

**

*

*

Tempo (H)

ΔTe

mpo

de

susp

ensã

oda

pat

a (s

)


intrarticular em joelhos de ratos previamente tratados com salina ou IL-10 (2 e 10



suspensão da pata (diferença entre o tempo de medida e o tempo zero), sendo N=6. Os


pre-tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).

76




IL-13 foi administrada por via ip nas doses de 1 e 2.5 ng/animal 30 min antes da

injeção ia de zymosan (1 mg/animal). Na Figura 7 observou-se que IL-13 foi eficaz em

inibir a incapacitação articular, de modo significante, nas duas doses com 68.9% e

62.5% (p<0.05) de inibição na 2ª hora e 56.6% e 53.2% (p<0.05) na 3º hora de

incapacitação articular.

8. EFEITO DA INTERLEUCINA-4 SOBRE O INFLUXO DE LEUCÓCITOS NA

CAVIDADE ARTICULAR INDUZIDO POR ZYMOSAN.

A Figura 8 mostra que IL-4 administrada ip, 30 min antes do zymosan (1

mg/animal) nas mesmas doses usadas no teste de incapacitação articular (1 e 5

ng/animal) foi capaz de bloquear, de modo significante e dose-dependente, o influxo de

leucócitos para a cavidade articular, medido na 6ª hora após a injeção do estímulo,

quando comparada ao grupo que recebeu salina como pré-tratamento (29% e 53.8% de

inibição respectivamente, p<0.05).

77

0 1 2 3 4 50

10

20

30

40

Salina

IL-13 (2.5 ng/animal)

IL-13 (1 ng/animal)

*

**

*

Tempo (H)

ΔTe

mpo

de

susp

ensã

oda

pat

a (s

)


intrarticular em joelhos de ratos previamente tratados com salina ou IL-13 (1 e 2.5



suspensão da pata (diferença entre o tempo de medida e o tempo zero), sendo N=6. Os


pre-tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).

78

S 1 50.0

2.5

5.0 IL-4 (ng/animal)

6

*6

*6

Zym

Leuc

ócito

s/m

l x 1

03

FIGURA 8. Efeito da interleucina-4 (IL-4) sobre o influxo de leucócitos na cavidade articular induzido por zymosan. Zymosan (Zym, 1 mg/animal) foi administrado por via

intrarticular em joelhos de ratos previamente tratados (30 min) com salina ou IL-4 (1 e 5

ng/animal) por via ip. Após 6 horas da injeção do estímulo foi colhido o exudato articular

e feita a contagem dos leucócitos em câmara de Neubauer. As barras representam as

médias + EPM do número de leucócitos x 103/ml. Os números indicados acima das barra

indicam o número de animais usados de cada grupo. Os asteriscos indicam a diferença

estatística em relação ao grupo que recebeu salina como pré-tratamento (*p<0.05;

Turkey – ANOVA).

79



A figura 9 mostra que IL-10 administrada ip, 30 min antes do zymosan (1

mg/animal) nas mesmas doses usadas no teste de incapacitação articular (2 e 10

ng/animal) foi capaz de bloquear, de modo significante e dose-dependente, o influxo de

leucócitos para a cavidade articular, medido na 6ª hora após a injeção do estímulo,

quando comparada ao grupo que recebeu salina como pré-tratamento (30.69% e 62%

de inibição, respectivamente, com p<0.05).



A figura 10 mostra que IL-13 administrada ip, 30 min antes do zymosan (1

mg/animal) nas mesmas doses usadas no teste de incapacitação articular (1 e 2.5

ng/animal) foi capaz de bloquear, de modo significante, o influxo de leucócitos para a

cavidade articular, medido na 6ª hora após a injeção do estímulo, quando comparada ao

grupo que recebeu salina como pré-tratamento (92.1% e 75.3% de inibição,

respectivamente, com p<0.05).

80

S 2 100

1

2

3

4

5

IL-10 (ng/animal)

*6 *

6

6

Zym

Leuc

ócito

s/m

l x 1

03 FIGURA 9. Efeito da interleucina-10 (IL-10) sobre o influxo de células na cavidade articular induzido por zymosan. Zymosan (Zym, 1 mg/animal) foi administrado por via

intrarticulart em joelhos de ratos previamente tratados (30 min) com salina ou IL-10 (2 e

10 ng/animal) por via ip. Após 6 horas da injeção do estímulo foi colhido o exsudato

articular e feita a contagem dos leucócitos em câmara de Neubauer. As barras

representam as médias + EPM do número de leucócitos x 103/ml. Os números indicados

acima das barra indicam o número de animais usados de cada grupo. Os asteriscos

indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina como pré-

tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).

81

S 1 2.50.0

2.5

5.0

7.5

IL-13 (ng/animal)

*6*

6

6

Zym

Leuc

ócito

s/m

l x 1

03

FIGURA 10. Efeito da interleucina-13 (IL-13) sobre o influxo de células na cavidade articular induzido por zymosan. Zymosan (Zym, 1 mg/animal) foi administrado por via

intarticular em joelhos de ratos previamente tratados (30 min) com salina ou IL-13 (1 e

2.5 ng/animal) por via ip. Após 6 horas da injeção do estímulo foi colhido o exudato

articular e feita a contagem dos leucócitos em câmara de Neubauer. As barras

representam as médias + EPM do número de leucócitos x 103/ml. Os números indicados

acima das barra indicam o número de animais usados de cada grupo. Os asteriscos

indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina como pré-

tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).

82

11. EFEITO DA INTERLEUCINA-4 SOBRE O TEMPO DE REAÇÃO NO TESTE DA

PLACA QUENTE.

IL-4 (5 ng/animal - dose de maior efeito no testes de contorção abdominal e de

incapacitação articular), a exemplo do observado com a indometacina ou salina, quando

dada por via ip, não foi capaz de modificar o tempo de reação dos animais no teste da

placa quente (Figura 11). Efeito este diferente da morfina (5 mg/kg; ip) que foi capaz de

aumentar esse tempo em até 666% (p<0,05; maior efeito).


PLACA QUENTE.

IL-10 (10 ng/animal - dose de maior efeito nos testes de contorção abdominal e

de incapacitação articular), a exemplo do observado com indometacina ou salina,

quando dada por via ip não foi capaz de modificar o tempo de reação dos animais no

teste da placa quente (Figura 12). Efeito este diferente da morfina (5 mg/kg; ip) que foi

capaz de aumentar esse tempo em até 540% (p<0,05; maior efeito).

83

0 30 60 900

10

20

30

40SalinaMorfinaIndometacina

IL-4*

*

*

Tempo (min)

Tem

po d

e re

ação

(s)

FIGURA 11. Efeito da interleucina-4 (IL-4) sobre o tempo de reação no teste da placa quente. Salina, morfina (5 mg/kg), indometacina (2 mg/kg) ou IL-4 (5 ng/animal)

foram administradas por via ip imediatamente após a medição do tempo zero. O tempo

de reação foi medido em intervalos de 30 min até os 90min. Os pontos representam a

média + EPM do tempo de reação em segundos (N=6). Os asteriscos indicam a

diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina (*p<0.05; Turkey –

ANOVA).

84

0 25 50 75 1000

10

20

30

40SalinaMorfinaIndometacinaIL-10

*

**

Tempo (min)

Tem

po d

e re

ação

(s)

FIGURA 12. Efeito da interleucina-10 (IL-10) sobre o tempo de reação no teste da placa quente. Salina, morfina (5 mg/kg), indometacina (2 mg/kg) ou IL-4 (10 ng/animal)

foram administradas por via ip imediatamente após a medição do tempo zero. O tempo

de reação foi medido em intervalos de 30 min até os 90min. Os pontos representam a

média + EPM do tempo de reação em segundos. Os asteriscos indicam a diferença

estatística em relação ao grupo que recebeu salina (*p<0.05; Turkey – ANOVA).

85


PLACA QUENTE.

IL-13 (2.5 ng/animal - dose de maior efeito nos testes de contorção abdominal e

de incapacitação articular), a exemplo do observado com indometacina ou salina,

quando dada por via ip não foi capaz de modificar o tempo de reação dos animais no

teste da placa quente (Figura 13). Efeito este diferente da morfina (5 mg/kg; ip) que foi

capaz de aumentar esse tempo em até 379.5% (p<0,05; maior efeito).

14. EFEITO DO PRÉ-TRATAMENTO COM NALOXONA NA ANTINOCICEPÇÃO

OBTIDA PELA INJEÇÃO PRÉVIA DE IL-4 NAS CONTORÇÕES ABDOMINAIS

INDUZIDAS POR ÁCIDO ACÉTICO.

Naloxona (2 mg/kg,; ip) quando injetada antes da administração de IL-4

(5ng/animal, ip; dose de maior efeito) não foi capaz de reverter o bloqueio das

contorções abdominais induzidas por ácido acético (0.6%, ip) quando comparada ao

grupo pré-tratado somente com IL-4 na mesma dose. No entanto a mesma dose de

naloxona foi capaz de reverter completamente o bloqueio das contorções abdominais

por morfina (5mg/kg), quando este grupo é comparado ao grupo pré-tratado somente

com morfina (Figura 14).

86

0 30 60 900

10

20

30

40

50 SalinaMorfinaIndometacina

IL-13

*

**

Tempo (min)

Tem

po d

e re

ação

(s)

FIGURA 13. Efeito da interleucina-13 (IL-13) sobre o tempo de reação no teste da placa quente. Salina, morfina (5 mg/kg), indometacina (2 mg/kg) ou IL-13 (2.5

ng/animal) foram administradas por via ip imediatamente após a medição do tempo zero.

O tempo de reação foi medido em intervalos de 30 min até os 90min. Os pontos

representam a média + EPM do tempo de reação em segundos, sendo N=6. Os

asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao grupo que recebeu salina

(p<0.05; Turkey – ANOVA).

87

S IL-4 IL-4 Morf Morf0

30

60

90

120

+Nalox

+Nalox

4

*6

*6

*6

5#

AAc

Nº d

e Co

ntor

ções

FIGURA 14. Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva da interleucina-4 (IL-4) nas contorções abdominais induzidas por ácido acético. Ácido acético (AAc,

0.6%) foi administrado por via ip em camundongos Swiss previamente tratados (30 min

antes; ip) com salina (S) ou IL-4 (5 ng/animal) ou morfina (5 mg/kg). Dois grupos além da

IL-4 ou morfina, receberam também, previamente (15 min antes do AAc) naloxona (2

mg/kg) por via ip. As barras representam as médias + EPM do número total de

contorções abdominais ocorridas após 30 min da injeção do estímulo. Os números

indicados acima das barra indicam o número de animais ensaiados de cada grupo. Os


pré-tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA) e o sustenido (#) indica a diferença

estatística entre o grupo da morfina e o grupo que recebeu naloxona previamente à

morfina (#p<0.05; Turkey – ANOVA).

88

15. EFEITO DO PRETRATAMENTO COM NALOXONA NA ANTINOCICEPÇÃO

OBTIDA PELA INJEÇÃO PRÉVIA DE INTERLEUCINA-10 NAS CONTORÇÕES

ABDOMINAIS INDUZIDAS POR ÁCIDO ACÉTICO.

Naloxona (2 mg/kg,; ip) quando injetada antes da administração de IL-10 (10

ng/animal, ip; dose de maior efeito) não foi capaz de reverter o bloqueio das contorções

abdominais induzidas por ácido acético (0.6%, ip) quando comparada ao grupo pré-

tratado somente com IL-10 na mesma dose. Entretanto, a mesma dose de naloxona foi

capaz de reverter completamente o bloqueio das contorções abdominais provocado por

morfina (5mg/kg), quando este grupo é comparado ao grupo pré-tratado somente com

morfina (Figura 15).

16. EFEITO DO PRÉ-TRATAMENTO COM NALOXONA NA ANTINOCICEPÇÃO

OBTIDA PELA INJEÇÃO PRÉVIA DE INTERLEUCINA-13 NAS CONTORÇÕES

ABDOMINAIS INDUZIDAS POR ÁCIDO ACÉTICO.

Naloxona (2 mg/kg,; ip) quando injetada antes da administração de IL-13 (2.5

ng/animal, ip; dose de maior efeito) não foi capaz de reverter bloqueio das contorções

abdominais induzidas por ácido acético (0.6%, ip) quando comparada ao grupo pré-

tratado somente com IL-13 na mesma dose. Contudo, a mesma dose de naloxona foi

capaz de reverter completamente o bloqueio das contorções abdominais provocado por

morfina (5mg/kg), quando este grupo é comparado ao grupo pré-tratado somente com

morfina (Figura 16).

89


25

50

75

+Nalox

+Nalox

6

*6

*6

*6

6#

AAc

Nº d

e Co

ntor

ções

FIGURA 15. Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva da interleucina-10 (IL-10) nas contorções abdominais induzidas por ácido acético. Ácido acético (AAc,


antes; ip) com salina (S) ou IL-10 (10 ng/animal) ou morfina (5 mg/kg). Dois grupos além

da IL-10 ou morfina, receberam também, previamente (15 min antes do AAc) naloxona

(2 mg/kg) por via ip. As barras representam as médias + EPM do número total de





estatística entre o grupo da morfina e o grupo que recebeu naloxona previamente à

morfina (#p<0.05; Turkey – ANOVA).

90


25

50

75

+Nalox

+Nalox

6

*4

*5

*6

4#

AAc

Nº d

e Co

ntor

ções

FIGURA 16. Efeito da naloxona na atividade antinociceptiva da interleucina-13 (IL-13) nas contorções abdominais induzidas por ácido acético. Ácido acético (AAc,


antes; ip) com salina (S) ou IL-13 (2.5 ng/animal) ou morfina (5 mg/kg). Dois grupos além

da IL-13 ou morfina, receberam também, previamente (15 min antes do AAc) naloxona

(2 mg/kg) por via ip. As barras representam as médias + EPM do número total de





estatística em relação ao grupo da morfina (#p<0.05; Turkey – ANOVA).

91

17. EFEITO DA INTERLEUCINA-4 NA LIBERAÇÃO DE TNF-α E IL-1β POR

MACRÓFAGOS PERITONEAIS RESIDENTES ESTIMULADOS in vivo COM

ZYMOSAN.

IL-4 na dose que induziu o maior efeito no bloqueio das contorções abdominais (5

ng/animal) foi capaz de inibir em 42% (p<0.05) a liberação de TNF-α (Figura 17A) e em

61.9% (p<0.05) a liberação de IL-1β (Figura 17B) por macrófagos peritoneais quando

injetada in vivo 30 min antes do estímulo zymosan, na mesma dose capaz de induzir

contorções abdominais (1 mg/animal). A inibição da liberação de IL-1β e TNF-α por IL-4

foi constatada pela dosagem das mesmas nos sobrenadantes de cultura dos

macrófagos obtidos das cavidades previamente tratadas com IL-4 e estimuladas com

zymosan. Para tal utilizou-se imunoensaios específicos paras ambas as citocinas já

descritos anteriormente.

18. EFEITO DA INTERLEUCINA-10 NA LIBERAÇÃO DE TNF-α E IL-1β POR

MACRÓFAGOS PERITONEAIS RESIDENTES ESTIMULADOS in vivo COM

ZYMOSAN.

IL-10 na dose de maior efeito em bloquear contorções abdominais (10 ng/animal)

foi capaz de inibir em 41.2% (p<0.05) a liberação de TNF-α (Figura 18A) e em 80.9%

(p<0.05) a liberação de IL-1β (Figura 18B) por macrófagos quando injetada in vivo 30

min antes do zymosan (na mesma dose capaz de induzir contorções abdominais- 1

mg/animal). A inibição da liberação de IL-1β e TNF-α por IL-10 foi constatada pela

92

dosagem das mesmas nos sobrenadantes de cultura dos macrófagos obtidos das

cavidades previamente tratadas com IL-10 e estimuladas com zymosan. Para tal utilizou-

se imunoensaios específicos paras ambas as citocinas já descritos anteriormente.

93

A B

S IL-40

1

2

*

Zym

TNF-α

(ng/

ml)

S IL-40.0

0.5

1.0

1.5

*

Zym

IL-1β

(ng/

ml)

FIGURA 17. Efeito da interleucina-4 (IL-4) na liberação de fator de necrose tumoral

– alfa (TNF-α) e interleucina-1 beta (IL-1β) por macrófagos peritoneais induzidos

por zymosan. Zymosan (Zym, 1 mg/kg) foi administrado em camundongos Swiss

previamente tratados (30 min) com salina ou IL-4 (5 ng/animal). 15 min após a injeção

do zymosan os macrófagos foram colhidos e postos em meio de cultura onde

permaneceram incubados em estufa de CO2, à 37º C por 12 horas. O sobrenadante foi

colhido e TNF-α (painel A) ou IL-1β (painel B) foram dosados por espectofotometria

(ELISA). As barras representam as médias + EPM da quantidade dosada TNF-α e IL-1β

de três animais por grupo. O asterisco indica a diferença estatística em relação ao grupo

que recebeu salina como pre-tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).

94

A

S IL-100

1

2

*

Zym

TNF-α

(ng/

ml)

B

S IL-100.0

0.5

1.0

1.5

*

Zym

IL-1β

(ng/

ml)

FIGURA 18. Efeito da interleucina-10 (IL-10) na liberação do fator de necrose

tumoral – alfa (TNF-α) e da interleucina-1 beta (IL-1β) por macrófagos peritoneais

induzidos por zymosan. Zymosan (Zym, 1 mg/kg) foi administrado em camundongos

Swiss previamente tratados (30 min) com salina ou IL-10 (10 ng/animal). 15 min após a

injeção do zymosan os macrófagos foram colhidos e postos em meio de cultura onde

permaneceram incubados em estufa de CO2, à 37º C por 12 horas. O sobrenadante foi

colhido e TNF-α (painel A) ou IL-1β (painel B) foram dosados por espectofotometria

(ELISA). As barras representam as médias + EPM da quantidade dosada de TNF-α e IL-

1β de três animais por grupo. O asterisco indica a diferença estatística em relação ao

grupo que recebeu salina como pre-tratamento (*p<0.05; Turkey – ANOVA).

96

IV. Discussão

97

Tem sido reconhecido que estímulos como ácido acético e o zymosan são

capazes de provocar nocicepção em animais experimentais como camundongos e ratos.

Quando injetados na cavidade peritoneal de camundongos induzem um comportamento

característico. Tal comportamento foi descrito como uma constricção em forma de onda,

começando no início do abdome, e indo em direção caudal, algumas vezes

acompanhada da torção do abdome e extensão das patas traseiras. Esta resposta vem

sendo denominada contorções abdominais (COLLIER et al., 1968). Em 1956 VANDE

WENDE & MARCOLIN e em 1957 SIGMUND et al. demonstraram que a injeção de

codeína, procaína ou morfina suprimia esse comportamento de contorção abdominal

induzido pela injeção de ácido acético e concluíram que essa resposta era nociceptiva e

que este seria um bom modelo para testar drogas analgésicas. Posteriormente foi

demonstrado que a injeção de zymosan também era capaz de induzir contorções

abdominais em camundongos (DOHERTY et al, 1985). Há dados na literatura que

indicam a participação de dois componentes na dor inflamatória induzida por ácido

acético ou por zymosan, o componente prostaglandínico e o componente simpático

(DUARTE et al, 1988; THOMAZZI, 1996). A clássica demonstração desses

componentes foi feita pré-tratando-se os animais com inibidores clássicos da

cicloxigenase tipo indometacina ou com agentes simpatolíticos como guanetidina,

reserpina, atenolol ou propanolol, ou ainda com a associação dos inibidores dos dois

sistemas envolvidos (DUARTE et al, 1988; THOMAZZI, 1996)

Sabendo-se disso escolhemos o ácido acético e o zymosan como estímulos

nociceptivos no teste de contorções abdominais. Procurou-se estabelecer a dose de

melhor resposta nociceptiva para esses dois estímulos. Para isso, foi realizada uma

curva dose resposta para o acido acético e outra para o zymosan. As doses eleitas

(0.6% para o ácido acético e 1mg/animal para o zymosan) foram utilizadas em todos os

98

testes de contorções abdominais.

De posse desses achados, investigou-se uma possível atividade analgésica das

interleucinas-4, 10 e 13 utilizando esses dois estímulos no modelo de contorções

abdominais. Como já foi dito, essas citocinas são reconhecidas moduladoras negativas

de alguns eventos da resposta inflamatória por inibir funções de certas células que

participam do processo inflamatório como macrófagos e mastócitos. Também já foi

mencionado na introdução desse trabalho que a atividade nociceptiva do ácido acético e

do zymosan parece depender da presença de tais células (RIBEIRO et al., 2000a). No

presente estudo, foi demonstrado que tanto a IL-4 , IL-10, como a IL-13 possuem

atividade analgésica nesse modelo pois foram capazes de inibir de maneira significativa

(p<0.05) as contorções abdominais induzidas pelo acido acético em 58.7%, 89.26% e

52% respectivamente, na dose de efeito máximo ou as induzidas por zymosan em

62.6%, 61.7% e 74.4%, respectivamente, na dose de maior efeito para cada citocina.

Procuramos reforçar a idéia de que IL-4, IL-10 e IL-13 possuem realmente uma

atividade analgésica periférica utilizando outro modelo de dor inflamatória experimental.

O modelo da incapacitação articular, descrito inicialmente por TONUSSI e FERREIRA

em 1992, é um teste mais objetivo. Esses autores demonstraram que a injeção de

carragenina na articulação de joelho de rato causa uma incapacitação articular dose-

dependente com o pico situado na 3a e 4a horas após a injeção do estímulo e que essa

incapacitação não era devido à formação do edema, visto que dextran, uma potente

substância edematogênica, não foi capaz de causar incapacitação (TONUSSI &

FERREIRA, 1992). O modelo também permite avaliar os mediadores inflamatórios e

algogênicos envolvidos no fenômeno. Neste mesmo estudo, a incapacitação articular

induzida por carragenina foi inibida tanto por bloqueadores da cicloxigenase como por

bloqueadores do sistema simpático, demonstrando que os mediadores que participam

99

do fenômeno são derivados de ambas as classes. Ficou demonstrado que a

incapacitação articular induzida por carragenina é um excelente modelo para testar

drogas analgésicas periféricas. Mais recentemente dados do nosso laboratório

mostraram que zymosan também é capaz de induzir incapacitação articular de maneira

significante e dose-dependente com o pico de incapacitação situando-se também entre a

3a e 4a hora (ROCHA et al., 1999; VIANA et al., 1998). ROCHA e colaboradores foram

mais além e demonstraram que a injeção de zymosan em articulações intactas induz

uma periartrite a qual é responsável pelo fenômeno da incapacitação articular, diferente

de quando o zymosan é injetado diretamente na sinóvia através de uma acesso cirúrgico

o qual não promove incapacitação articular (ROCHA et al., 1999). Esses achados estão

de acordo com a literatura, onde já foi demonstrado que a membrana sinovial possui

poucos nociceptores a maioria deles participam da função vascular autônoma

(HASSELBACHER et al., 1981), ao contrário da inervação da cápsula fibrosa, ligamento

articular e periósteo, estruturas ricamente inervadas por fibras simpáticas e somáticas

(KELLGREN et al., 1950; KENNEDY et al., 1982; GRÖNBLAD et al., 1985). Foi sugerido

que além da presença de mediadores liberados no local, a estrutura periarticular é

importante, tornando o local da injeção do estímulo crucial para o desenvolvimento da

incapacitação. Com base nesses achados escolhemos como estímulo o zymosan na

dose de maior efeito em promover incapacitação articular, (1 mg/animal; ROCHA et al,

1999; VIANA et al, 1998), injetado em articulações intactas, para testar a possível

atividade analgésica das interleucinas-4, 10 e 13 no modelo de dor articular.

Ficou demonstrado, no presente estudo, que tanto IL-4 como IL-10 ou IL-13

exercem uma atividade analgésica nesse modelo já que as mesmas foram capazes de

inibir de modo significante (p<0.05) a incapacitação articular induzida por zymosan com

49.2%, 68.9% e 69.9% de inibição, respectivamente para as doses de maiores efeitos de

100

cada citocina, sendo dose-dependente apenas o efeito da IL-4.

É interessante ressaltar que, o zymosan foi administrado localmente em

articulações intactas, enquanto que o pré-tratamento com as interleucinas foi feito por

via sistêmica (ip), observando-se uma inibição significativa no pico de incapacitação. No

entanto, IL-4 quando administrada localmente na articulação, na mesma dose, também

inibe o fenômeno, mas em uma percentagem inferior quando comparada à

administração sistêmica (dados não apresentados).

Na introdução do presente trabalho, ficou bem claro a importância de células

residentes do local da injúria para a sinalização dos eventos da resposta inflamatória,

assim como da dor inflamatória. A migração de neutrófilos para o foco inflamatório já foi

bem estudada. Nesse sentido, foi demonstrado que ela ocorre proporcionalmente ao

número de células residentes presentes no local da injúria. Como também já foi bem

discutido que as mesmas células participam dos eventos da inflamação através da

liberação de mediadores inflamatórios e provavelmente estas substâncias, dentre elas

os quimiotáxicos, são responsáveis pelo recrutamento de leucócitos para o local da

injúria.

Na artrite induzida por zymosan, foi observado que o estímulo causa intenso

influxo de células para a cavidade articular e que o fenômeno começa na 3ª hora e

atinge o máximo na 6ª hora, após a sua aplicação, com predominância de 80% de

neutrófilos (ROCHA et al, 1999). Também foi constatado, pelos mesmos autores, que

entre o grupo em que foi desenvolvida a periartrite e o grupo em que foi desenvolvido a

sinovite não existiu diferenças no influxo celular e permeabilidade vascular. Em adição,

apesar da presença de significante infiltrado celular na 3ª hora após a aplicação do

estímulo, o influxo só atingiu o pico na 6ª hora, enquanto que a incapacitação articular

atingiu o pico na 3ª e 4ª hora após sua indução. Essa discrepância cinética, além da

101

semelhança do influxo leucocitário entre os grupos de periartrite e sinovite, sugere que a

infiltração de células (neutrófilos) parece não ser relevante para o desenvolvimento da

incapacitação articular mas que esta nocicepção se correlaciona principalmente com a

sensibilização de determinados nociceptores situados nos tecidos periarticular

(periartrite). Isso pode implicar na importância da liberação de mediadores no local da

injeção por células residentes e não por células recrutadas.

Com base nesses dados, procuramos investigar se as interleucinas por nós

testadas, além de inibir a incapacitação articular, também seriam capazes de diminuir o

influxo celular na área de inflamação. Foi constatado que tanto IL-4 como IL-10 ou IL-13

quando administrada 30 min antes do zymosan por via ip, inibiram de modo significante

(p<0.05), em todas as doses, o número de leucócitos presentes no fluido articular com

53.8%, 62% e 92.1% de inibição, respectivamente para as doses de maior efeito de

cada citocina. A lavagem e coleta do fluido sinovial foi feito na 6ª hora (pico do influxo

celular).

Observando-se esses resultados não podemos associar a inibição do influxo de

leucócitos como sendo o responsável pela inibição da incapacitação articular, visto que,

o pico de influxo de leucócitos se encontra na 6ª hora após a injeção do estímulo e não

na terceira hora (pico de incapacitação). No entanto sugerimos que de uma maneira

indireta IL-4, IL-10 e IL-13 estão inibindo a dor articular e ao mesmo tempo o influxo de

leucócitos. Está descrito na literatura que na artrite induzida por zymosan em joelhos de

ratos os níveis de PGE2 no fluido articular encontram-se aumentados em torno da

terceira hora após a injeção do estímulo (GRIFFITHS et al., 1991) horário que coincide

com o nosso pico de incapacitação articular. Zymosan quando injetado em cavidade

peritoneal de camundongos também é capaz de promover um rápido extravasamento de

proteinas do plasma assim como a indução da síntese de PGE2, PGI2 e leucotrienos

102

(DOHERTY et al, 1985, 1987). Podemos sugerir que as citocinas por nós estudadas

foram capazes de inibir o influxo de leucócitos para a cavidade articular por estarem

inibindo a liberação, por células residentes da cavidade articular, de mediadores

quimiotáxicos ou de citocinas pró-inflamatórias que por sua vez iriam recrutar leucócitos

para o local da injeção do estímulo. A inibição da liberação desses mediadores então

causaria a diminuição do número de leucócitos na cavidade articular até a 6ª hora.

Já foi demonstrado que IL-10, quando dada sistemicamente, tem a capacidade de

atravessar a barreira hematoencefálica para agir no sistema nervoso central (DI SANTO

et al., 1997). Resolvemos testar então a possibilidade das citocinas por nós estudadas

estarem inibindo a nocicepção também por um efeito central. Essa hipótese foi

descartada pela incapacidade de IL-4, IL-10 e IL-13 inibirem a nocicepção térmica no

teste da placa quente, teste algesimétrico sensível apenas para drogas que agem a nível

supra espinal, ou seja, que exercem efeito central. Efeito esse diferente da morfina a

qual quando injetada em camundongos tornou-os totalmente irresponsivos ao teste.

A capacidade que algumas citocinas tem de estimular a liberação de peptídeos

opióides endógenos tipo β-endorfinas tem sido aventada na literatura principalmente

para IL-6 (BERTOLUCCI et al., 1996). Também tem sido referido que PGE2 parece

exercer esse mesmo tipo de efeito. Nesse contexto, no presente trabalho, procurou-se

mostrar que a atividade analgésica de IL-4, IL-10 e IL-13 era independente da indução

da liberação de tais substâncias. Foi observado que a antinocicepção conseguida pelo

pré-tratamento com as interleucinas estudadas não foi revertida pela naloxona, um

conhecido antagonista de receptores opióides, na mesma dose em que foi capaz de

reverter o efeito da morfina. O efeito antinociceptivo dessas citocinas portanto não

parece se relacionar com a liberação ou potenciação do efeito de opiódes endógenos.

Ao longo da introdução desse trabalho, foi bem discutido que macrófagos são

103

células hábeis em liberar diversas citocinas pró-inflamatórias como IL-1, TNF e IL-8, as

quais são potentes indutoras de hiperalgesia através da estimulação dos componentes

eicosanoide e simpático da dor inflamatória. Como também já foi demonstrado na

literatura que zymosan, o estímulo por nós utilizado na metodologia de contorções

abdominais, é capaz de induzir a liberação de mediadores inflamatórios dentre eles:

componentes do sistema complemento (PILLEMER AND ECKER, 1941),

prostaglandinas e leucotrienos (BONNEY et al., 1978; SCOTT et al., 1980; HUMES et

al., 1982), fator de ativação plaquetária (ROUBIN et al., 1982), espécies reativas do

oxigênio (NAUSEEF et al., 1983) e enzimas lisossomiais (BONNEY et al., 1978). Em

1985 foi demonstrado que a injeção intraperitoneal de zymosan (1 mg/animal) em

camundongos causou uma notável reação inflamatória consistindo de um rápido

acúmulo de proteínas e o acúmulo de células (macrófagos e mastócitos) em uma fase

mais tardia, indicando a rápida liberação de mediadores capazes de aumentar a

permeabilidade vascular e de mediadores quimiotáxicos. Uma resposta dolorosa

também foi observada (contorções abdominais) além da presença de prostagandina

(PGE2) e leucotrieno (LTC4) no flúido peritoneal (DOHERTY et al., 1985).

A dose de zymosan utilizada por esses autores coincide com a dose mais eficaz,

demonstrada por nós, em induzir contorções abdominais. Nesse sentido investigou-se a

capacidade desse estímulo estar induzindo a liberação de citocinas pró-inflamatórias

como IL-1β e TNF-α por macrófagos residentes e a possibilidade de que as citocinas

por nós estudadas estejam agindo diminuindo essa liberação. Para isso, foi usado a

mesma dose de zymosan utilizada no teste de contorções abdominais e as doses de

maior efeito da IL-4 e da IL-10 em inibir o número de contorções. A indução dos

macrófagos foi feita in vivo assim como o pré-tratamento com as interleucinas-4 e 10. O

sobrenadante de cultura de macrófagos obtidos desses animais foi avaliado quanto à

104

presença de TNF-α e IL-1β e foi observado então que tanto IL-4 quanto IL-10 foram

capazes de inibir, de forma significativa (p<0.05), nessas circunstâncias, a liberação de

TNF-α, com 42% e 41.2% de inibição, respectivamente, e também de IL-1β, com 61.9%

e 80.9% de inibição, respectivamente, por macrófagos estimulados in vivo por zymosan

e pré-tratados também in vivo com IL-10 e IL-4.

É bem sabido que interleucinas como IL-4, IL-10 e IL-13 são liberadas

tardiamente no processo infamatório. A liberação acontece somente após a secreção

das citocinas pró inflamatórias e assim agem como um freio regulador da inflamação. A

capacidade dessas citocinas inibirem a resposta dolorosa também pode ser explicada da

mesma maneira. Com a injeção dos estímulos, ácido acético ou zymosan, há uma

rápida liberação por células residentes de mediadores nociceptivos que dependem da

indução por citocinas pró-inflamatórias promovendo o comportamento de contorções

abdominais. Após um período de 30 a 40 minutos as contorções abdominais começam a

ficar escassas até desaparecerem (dados não apresentados). Isso pode ser explicado

pelo possível papel regulatório das citocinas inibitórias que são liberadas pouco tempo

depois do início da resposta inflamatória, freiando então a resposta dolorosa. Não

procuramos demonstrar que com ácido acético o mesmo ocorre por que já está descrito

na literatura que esse estímulo promove lise celular (DORHERTY et al., 1985)

dificultando a cultura de células e assim a dosagem de citocinas.

Por fim, o presente estudo procurou analisar o papel inibitório das interleucinas 4,

10 e 13 na dor inflamatória. Através de modelos experimentais conseguiu-se demonstrar

que as mesmas inibem a nocicepção de forma periférica e que sua ação analgésica se

deve principalmente a uma ação inibitória sobre células residentes as quais atuam

liberando citocinas hiperalgésicas responsáveis pela indução da nocicepção, à

semelhança do que demonstrou POOLE e cols., em 1995 e CUNHA e cols., em 1999

105

para IL-10 e IL-4, respectivamente. Isso nos permite associar a presença de tais

interleucinas como sendo freios reguladores da resposta nociceptiva durante os eventos

da resposta inflamatória fisiológica.

V. Conclusões

106

CONCLUSÕES

1. As interleucinas 4, 13 e 10 demonstraram ter atividade analgésica no modelo

de contorções abdominais induzidos por ácido acético ou zymosan.

2.As interleucias 4, 10 e 13 demonstraram atividade analgésica também no

modelo de incapacitação articular induzida por zymosan.

3. As mesmas interleucinas inibiram o influxo de leucócitos para a cavidade

articular, mostrando um efeito antiinflamatório.

4. A atividade analgésica das interleucinas estudadas parece se dever a um efeito

periférico, visto que não foram eficazes em inibir a nocicepção térmica induzida no teste

da placa quente, utilizado principalmente para medir a eficácia de substâncias

analgésicas que exercem efeito central.

5. O potencial analgésico das três interleucinas possivelmente não tem relação

com a liberação ou potenciação de opióides endógenos tipo β-endorfinas, visto que a

naloxona (clássico antagonista de receptores opióides) não foi capaz de reverter as suas

ação antinociceptiva.

6. As interleucinas 4 e 10 inibiram a liberação de TNF-α e IL-1β por macrófagos

estimulados in vivo e postos em cultura, sugerindo que a atividade analgésica exercida

por essas citocinas provavelmente se deva a uma ação modulatória sobre a liberação de

mediadores inflamatórios por células residentes presentes no local da injúria.

108

VI. Referências Bibliográficas

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