ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E ANTI-INFLAMATÓRIA DO ... · RESUMO Renan Guedes de Brito. Avaliação...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

RENAN GUEDES DE BRITO

ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E ANTI-INFLAMATÓRIA DO CITRONELOL EM ROEDORES

ARACAJU-SE 2013

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Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Lucindo José Quintans Júnior

Co-Orientador: Prof. Dr. Waldecy de Lucca Júnior

ARACAJU-SE 2013

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Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.

Aprovada em: _____/_____/_____

_________________________________________________ Orientador: Prof. Dr. Lucindo José Quintans júnior

_________________________________________________ 1º Examinador: Prof. Dr. Emiliano de Oliveira Barreto

_________________________________________________ 2º Examinador: Prof. Dr. Daniel Badauê Passos Júnior

PARECER

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AGRADECIMENTOS

“Agradeça, agradeça, agradeça! Agradeça sempre! Agradeça por tudo que

você tem, por tudo que recebe. Agradeça por tudo que ainda vai receber! Agradeça

até por aquilo que não entende e também não aceita!

Essa é a melhor maneira e também a mais inteligente de ter uma atitude

positiva em relação à vida! O próprio ato de agradecer atrai o melhor para você.

Agradeça pelos fracos, pelos chatos, pelos pobres de espírito. Agradeça

pelos amigos, por aquelas pessoas que te agradam!

Agradeça pelos momentos felizes. Não deixe de manifestar gratidão aos

membros de sua família. Seus pais, seus irmãos são os vínculos mais fortes que

você tem!

O ato de agradecer ajuda o coração! Ajuda a mente a se abrir! Talvez para

sair desse buraco que muitas vezes você se encontra é preciso agradecer.

Experimente agradecer a tudo e a todos! Agora!

Não é possível você passar por essa vida sem ter o hábito de agradecer!

Gratidão continuada, entende isso? Demonstrar pelo seu exemplo, pelos gestos,

pelo afeto, pelo olhar, pelo coração, a gratidão que você tem por ter vindo a esse

mundo!

Você sempre terá algo pelo que agradecer e quando começar a fazer isso,

observe-se! Fique atento e perceba como a vida fica mais gostosa de ser

compartilhada. Assim como é certo que é dando que se recebe, também é verdade

que é agradecendo que se alcança!”

Luiz Carlos Mazzini

Por isso, gostaria de agradecer a meus pais, irmã, tios, prima, orientador, co-

orientador, professores, amigos e a todos aqueles que em algum momento, por

menor que seja, estiveram ao meu lado, apoiando-me e torcendo. Muito obrigado

por existirem em minha vida e por me dar a oportunidade de agradecer todo o

aprendizado humano que venho obtendo através de vocês. A energia que nos une é

inexplicável!!!

Renan Guedes de Brito

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RESUMO

Renan Guedes de Brito. Avaliação da atividade antinociceptiva e anti-inflamatória do citronelol em roedores. Aracaju, Sergipe, 2012.

O Citronelol (CT) é um monoterpeno alcóolico presente no óleo essencial de algumas plantas medicinais, como o Cymbopogon citratus. Alguns efeitos farmacológicos tais como anti-espasmódico e atividade anticonvulsivante já foram descritos, sendo desconhecido seu possível efeito antinociceptivo e anti-inflamatório. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar a possível ação antinociceptiva e anti-inflamatória do CT em roedores. Para tanto, foram utilizados 362 camundongos Swiss machos (25 a 35 g) com 2 a 3 meses. Os animais foram divididos em grupos e foram tratados com CT (25, 50 e 100 mg/kg; i.p.), veículo (solução salina 0,9% + tween 80 0,2%; i.p.) ou droga padrão (i.p.). Para avaliação da atividade antinociceptiva, os animais foram submetidos ao teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético (0,85%), ao teste da formalina (1%) e ao teste da placa quente. Com o intuito de avaliar a ação do CT na nocicepção orofacial, foram realizados os testes de dor orofacial induzida por formalina (2%), capsaicina e glutamato. A coordenação motora dos animais foi avaliada através do teste da coordenação motora (rota rod) e do teste da movimentação espontânea. A atividade anti-inflamatória foi avaliada a partir do modelo de pleurisia induzido por carragenina, realizando-se a contagem de leucócitos totais. Foi quantificado, ainda, através do ensaio imunoenzimático ELISA, o TNF-α e a geração de óxido nítrico por macrófagos. Para determinar a ação central, os animais foram tratados com CT, nas três doses, ou veículo e, noventa minutos após, foram anestesiados, perfundidos, os cérebros extraídos e cortados em criostato. As secções cerebrais foram submetidas ao protocolo de imunofluorescência para proteína Fos. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. As diferenças entre os grupos foram analisadas por meio do teste de variância ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. A administração intraperitoneal de CT produziu uma redução significativa (p < 0,001) das contorções abdominais. Na nocicepção induzida por formalina, o pré-tratamento com CT causou um efeito antinociceptivo significativo (p <0,01) em ambas as fases do teste. No teste da placa quente, o tempo de reação aumentou significativamente em todas as doses de CT (p < 0,05 ou p < 0,001), tendo seu efeito antagonizado pela naloxona. Nos três testes de nocicepção orofacial, o CT produziu uma redução significativa (p < 0,001) no tempo de fricção da região orofacial. Não foram observadas alterações no teste da coordenação motora e no teste da movimentação espontânea. Na avaliação da atividade anti-inflamatória, o tratamento com CT causou uma diminuição significativa (p < 0,01) no número total de leucócitos, diminuindo os níveis de TNF-α (p < 0,05) e de óxido nítrico em macrófagos (p < 0,05). Através da imunofluorescência, observou-se que o CT é capaz de ativar signicativamente (p < 0,05) neurônios do bulbo olfatório, do córtex piriforme, do córtex retroesplenial e da substância cinzenta periaquedutal. Conclui-se, assim, que o CT apresenta ação antinociceptiva e anti-inflamatória, tendo sua ação mediada por mecanismos centrais e periféricos. Descritores: Monoterpenos, Citronelol, Dor, Inflamação, Sistema Nervoso Central.

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ABSTRACT

Renan Guedes de Brito. Evaluation of the antinociceptive and anti-inflamatory activity of citronellol in rodents. Aracaju, Sergipe, 2012.

The Citronellol (CT) is an alcoholic monoterpene present in the essential oil of some medicinal plants such as Cymbopogon citratus. Some pharmacological effects such as the antispasmodic and anticonvulsant activities have been described, however it’s possible antinociceptive and anti-inflammatory effect is unknown. Thus, the objective of this study was to evaluate the possible antinociceptive and anti-inflammatory action of CT in rodents. Therefore, 362 male Swiss mice (25-35 g) with 2 to 3 months were used. The animals were divided into groups and were treated with CT (25, 50 and 100 mg/kg, i.p.), vehicle (saline solution 0.9% + Tween 80 0.2%, i.p.) or standard drug (i.p.). To evaluate the antinociceptive activity, the animals were submitted to the test of abdomnal constrictions induced by acetic acid (0.85%), the formalin test (1%) and hot plate test. In order to evaluate the effect of CT on orofacial nociception, it was conducted the orofacial test induced by formalin (2%), capsaicin and glutamate. Motor coordination was assessed using the motor coordination test (rota rod) and the spontaneous movement test. The anti-inflammatory activity was evaluated based on the model of carrageenan-induced pleurisy, making up the total leucocyte count. It was also quantified, by using ELISA, TNF-α and nitric oxide generation by macrophages. To determine the central action, the animals were treated with CT, in three doses, or vehicle and, after ninety minutes, were anesthetized, perfused, the brains removed and cut in a cryostat. The brain sections were subjected to immunofluorescence protocol for Fos protein. Results are expressed as mean ± SEM Differences between groups were analyzed by using one way ANOVA test, and followed by Tukey test. Values of p < 0.05 were considered statistically significant. Intraperitoneal administration of CT produced a significant decrease (p < 0.001) of the abdominal constrictions induced by acetic acid. In nociception induced by formalin, the pretreatment with CT caused a significant antinociceptive effect (p <0.01) in both phases of the test. In the hot plate test, the reaction time increased significantly at all doses of CT (p < 0.05 or p < 0.001), while its effect was antagonized by naloxone. In the three orofacial nociception tests, the CT produced a significant decrease (p <0.001) in the face-rubbing time of the orofacial region. No changes were observed in the motor coordination and in the spontaneous movement test. In the evaluation of anti-inflammatory activity, treatment with CT gave rise to a significant decrease (p < 0.01) in total number of leukocytes, decreasing (p < 0.05) the levels of TNF-α and nitric oxide in macrophages (p < 0.05). By immunofluorescence, it was found that CT is able to activate signicantly (p < 0.05) neurons of the olfactory bulb, the piriform cortex, the restrosplenial cortex and the periaqueductal gray. So, it can be concluded that CT has antinociceptive and anti-inflammatory activity and its action is mediated by central and peripheral mechanisms.

Key-words: Monoterpenes, Citronellol, Pain, Inflammation, Central Nervous System.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura química dos monoterpenos .......................................................... 6

Figura 2. Estrutura química do citronelol .................................................................... 8

Figura 3. Conexões entre as fibras aferentes primárias e a medula espinhal .......... 13

Figura 4. Anatomia das vias da dor .......................................................................... 14

Figura 5. Via descendente da dor ............................................................................. 15

Figura 6. Via sensitiva principal da face e da boca ................................................... 18

Figura 7. Processo de quimiotaxia realizado pelos leucócitos.................................. 20

Figura 8. Neutrófilos fagocitando Streptococcus, em azul ........................................ 21

Figura 9. Cascata de transcrição do NF- B .............................................................. 23

Figura 10. Resumo esquemático do teste de contorções abdominais induzidas por

ácido acético. ............................................................................................................ 37

Figura 11. Resumo esquemático do teste da formalina ........................................... 38

Figura 12. Resumo esquemático do teste da placa quente ...................................... 39

Figura 13. Resumo esquemático de teste de nocicepção orofacial induzida por

formalina.................................................................................................................... 41

Figura 14. Resumo esquemático do este de nocicepção orofacial induzida por

capsaicina. ................................................................................................................ 42

Figura 15. Resumo esquemático do teste de nocicepção orofacial induzida por

glutamato................................................................................................................... 43

Figura 16. Resumo esquemático do teste da coordenação motora (Rota-rod). ....... 44

Figura 17. Resumo esquemático do teste da movimentação espontânea .............. 45

Figura 18. Resumo esquemático da pleurisia induzida por carragenina. ................. 46

Figura 19. Resumo esquemático da quantificação de leucócitos. ............................ 46

Figura 20. Resumo esquemático da quantificação de TNF-α. .................................. 47

Figura 21. Resumo esquemático da geração de óxido nítrico por macrófagos. ....... 47

Figura 22. Resumo esquemático do processo de perfusão, crioproteção e corte .... 48

Figura 23. Resumo esquemático do protocolo de imunofluorescência para proteína

Fos ............................................................................................................................ 50

Figura 24. Microscópio de fluorescência Olympus IX2-ICB, EUA ............................ 51

Figura 25. Efeito do citronelol (CT) no teste das contorções abdominais induzidas

por ácido acético em camundongos. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/kg) ou

paracetamol (PAR, 100 mg/kg) foram administrados intraperitonealmete 30 min

viii

antes da injeção de ácido acético. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 8, por

grupo). ***p <0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo

teste de Tukey). ......................................................................................................... 53

Figura 26. Efeito do citronelol (CT) na nocicepção induzida por formalina em

camudongos. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/kg) ou Morfina (MOR, 3

mg/kg) foram administrados intraperitonealmente 30 min antes da injeção de

formalina. (A) representa a primeira fase e (B) representa a segunda fase do teste

da formalina. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 6, por grupo). **p <0,01 ou

***p <0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de

Tukey). ...................................................................................................................... 54

Figura 27. Efeitos do CT sobre o teste da nocicepção orofacial induzida por

formalina. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/kg) ou morfina (MOR, 5 mg/kg)

foram administrados intraperitonealmente 30 min antes da injeção de formalina. (A)

primeira fase (0-5 minutos) e (B) segunda fase (15 a 40 minutos). Valores expressos

em média e.p.m. (n = 6, por grupo). ***p < 0,001 quando comparado ao controle

(ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey). ..................................................... 57

Figura 28. Efeitos do CT sobre a nocicepção orofacial induzida por capsaicina.

Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/ kg) ou morfina (MOR, 5 mg/kg) foram

administrados intraperitonealmente 30 min antes da injeção de capsaicina. Valores

expressos em média e.p.m. (n = 6, por grupo). ***p < 0,001 quando comparado ao

controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey)......................................... 58

Figura 29. Efeitos do CT sobre a nocicepção orofacial induzida por glutamato.

Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/ kg) ou morfina (MOR, 5 mg/kg) foram

administrados intraperitonealmente 30 min antes da injeção de capsaicina. Valores

expressos em média e.p.m. (n = 6, por grupo). **p < 0,01 e ***p < 0,001 quando

comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey). ................ 59

Figura 30. Tempo de permanência (s) no rota rod. Veículo (controle), CT (25, 50 e

100 mg/kg) ou Diazepam (DZP; 1,5 mg/kg) foram admnistrados intraperitonealmente

trinta minutos antes do início do teste. A resposta motora foi avaliada por 180 s.

Valores expressos em média e.p.m. (n = 6, por grupo). ***p < 0,001 quando

comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey). ................ 60

Figura 31. Efeito do CT sobre a pleurisia induzida por carragenina. As análises

foram realizadas 4 h após a injecção de carragenina (300 ng/cavidade), avaliando-se

ix

o recrutamento de leucócitos totais (A), neutrófilos (B), células mononucleares (C) e

TNF-α (D). Os dados foram expressos em média ± e.p.m (n = κ/ por grupo). ++p <

0,01 e +++p < 0,001 em comparação ao controle. *p < 0,05, ** p < 0,01 e ***p < 0,001

em comparação ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey). ........ 62

Figura 32. Efeito do CT na geração de nitrito por macrófagos. As células foram

mantidas em meio de cultura (RPMI) ou pré-incubadas com CT por 24 horas, e em

seguida tratado com LPS (1 ng/mL) durante 24 h. Os níveis de nitrito nos

sobrenadantes de cultura foram avaliadas e os resultados foram expressos em

concentração (uM) de nitrito no meio de cultura. Os dados foram expressos em a

média ± e.p.m., sendo os valores obtidos em triplicado. ++p <0,01 em comparação

com o RPMI e *p < 0,05 quando comparado ao controle (veículo)(ANOVA, uma via,

seguido pelo teste de Tukey). ................................................................................... 63

Figura 33. A. Células FOS positivas no bulbo olfatório. Veículo (B; controle) ou CT

nas doses de 25 mg/Kg (C), 50 mg/Kg (D) e 100 mg/kg (E), i.p., foi administrado

noventa minutos antes da perfusão. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 6/por

grupo). **p < 0,01 ou ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA uma via

seguido pelo Teste de Tukey). Aumento: 20x. Escala: 20 m.. ................................ 64

Figura 34. A. Células FOS positivas no córtex piriforme. Veículo (B; controle) ou CT

nas doses de 25 mg/Kg (C), 50 mg/Kg (D) e 100 mg/kg (E), i.p., foi administrado


grupo). **p < 0,01 quando comparado ao controle (ANOVA uma via seguido pelo

Teste de Tukey). Aumento: 20x. Escala: 20 m. ....................................................... 64

Figura 35. A. Células FOS positivas no córtex retroespinal. Veículo (B; controle) ou

CT nas doses de 25mg/Kg (C), 50 mg/Kg (D) e 100 mg/kg (E), i.p., foi administrado


grupo). **p < 0,01 ou ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA uma via

seguido pelo Teste de Tukey). Aumento: 20x. Escala: 20 m.. ................................ 65

Figura 36. A. Células FOS positivas na substância cinzenta periaquedutal. Veículo

(B; controle) ou CT nas doses de 25 mg/Kg (C), 50 mg/Kg (D) e 100 mg/kg (E), i.p.,

foi administrado noventa minutos antes da perfusão. Valores expressos em média ±

e.p.m. (n = 6/por grupo). *p < 0,5 ou ***p < 0,001 quando comparado ao controle

(ANOVA uma via seguido pelo Teste de Tukey). Aumento: 20x. Escala: 20 m.. .... 65

x

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Características físicas das fibras aferentes nociceptivas. ......................... 11

Tabela 2. Efeito antinociceptivo do citronelol (CT) no teste da placa quente em

camudongos. ............................................................................................................. 56

Tabela 3. Efeitos do citronelol (CT) sobre a movimentação espontânea em

camudongos .............................................................................................................. 61

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

5-LOX – lipoxigenase 5;

5HT – serotonina;

AA – ácido araquidônico;

AINS – anti-inflamatórios não esteirodais;

AKT – proteína quinase B;

AMPc – adenosina 4.5-monofosfato cíclico;

AMPA – alfa -amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiónico;

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitário;

AP-1 – proteína ativadora 1;

APTN – núcleo anterior ipsilateral pretectal;

ATM – articulação temporomandibular;

B1 – receptor de bradicinina 1;

B2 – receptor de bradicinina 2;

BSA – soro albumina bovina;

CB1 – receptor canabinóide 1;

CEPA – comitê de ética em pesquisa animal;

COX-1 – ciclooxigenase 1;

COX-2 – ciclooxigenase 2;

CRM1 – receptor para e frio e mentol 1;

CT – Citronelol;

DNA – ácido desoxirribonucléico;

DPOC – doença pulmonar obstrutiva crônica;

ECA – enzima conversora de angiotensinogênio;

EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético;

EMA – European Medicines Agency;

eNOS – óxido nítrico sintase endotelial;

EP1 – receptor de prostaglandina E subtipo 1;




ET1 – receptor de rndotelina isoforma 1;

xii

ET2 – receptor de endotelina isoforma 2;

ET3 – receptor de endotelina isoforma 3;

ETA – receptor de endotelina A;

ETB – receptor de endotelina B;

EUA – Estados Unidos da América;

FDA – Food and Drugs Agency;

FTIs - fatores de transcrição induzíveis;

GABA – ácido alfa-aminobutírico;

GEIs – genes de expressão imediata;

GMPc – guanosina monofosfato cíclico;

H1 – receptor de histamina 1;




HIV – vírus da imunodeficência humana;

IASP – Associação Internacional para o Estudo da Dor;

ICAM-1 – molécula de adesão intercelular 1;

IL-1 – interleucina 1 beta;

IL-2 – interleucina 2;









IL-21R – receptor de interleucina 21;





IL-27R – receptor de interleucina 27;


xiii

IFN- – interferon gama;

IFN-α – interferon alfa;

IFN- – interferon beta;

IgG – imunoglobulina G;

iNOS – óxido nítrico sintase induzível;

nNOS – óxido nítrico sintase constitutiva;

LPS – lipopolissacarídeo;

LTB4 – receptor de leucotrieno B4;

LTC4 – receptor de leucotrieno C4;

LTD4 – receptor de leucotrieno D4;

LTE4 – receptor de leucotrieno E4;

MAPK – proteína cinase ativada por mitógenos;

MCP-1 – proteína quimioatraente a monócitos;

mGLUR – recetores glutamatérgicos metabotrópicos;

MHC – complexo principal de histocompatibilidade;

mRNA – ácido ribonucléico mensageiro;

NF-Κb – fator de transcrição nuclear kappa B;

NK – natural killer;

NMDA - N-metil-D-aspartato;

OMS – Organização Mundial da Saúde;

PAC – potencial de ação composto;

PAG – substância cinzenta periaquedual;

PGD – prostaglandina D;

PGE2 – prostaglandina E2;

PGFβα – prostaglandina Fβα;

PGJ2 – prostaglandina J2;

PIγK - fosfatidilinositol 3-quinase gama;

PBS – tampão fosfato salina;

PLAN2 – fosfolipase A2;

RSP – córtex restroesplenial;

RVM – medula rostroventral;

SARA – síndrome da angústia respiratória aguda;

SBCAL – Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório;

SIDA – síndrome da imunodeficiência adquirida;

xiv

SNC – sistema nervoso central;

SNP – sistema nervoso periférico;

TNF-α – fator de necrose tumoral alfa;

TNFR1 – receptor do fator de necrose tumoral 1;

TNFR2 – receptor do fator de necrose tumoral 2;

TRP – receptor de potencial transiente;

TRPA1 – receptor de potencial transiente de cátion 1;

TRPV1 – receptor de potencial transiente vanilóide 1;

TRPV3 – receptor de potencial transiente vanilóide 3;

TXA2 – tramboxano A2;

UFS – Universidade Federal de Sergipe;

VCAM-1 – molécula de adesão vascular da célula 1;

VOCsNa+ - canais operados com voltagem para sódio;

VR1 – receptor vanilóide 1;

xv

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1

2 REVISÃO TEÓRICA................................................................................................. 3

2.1 PLANTAS MEDICINAIS ..................................................................................... 3

2.2 DOR ................................................................................................................. 10

2.3 INFLAMAÇÃO .................................................................................................. 18

2.4 PROTEÍNA FOS .............................................................................................. 33

3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 35

3.1 OBJETIVO GERAL .......................................................................................... 35

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 35

4 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 36

4.1 ANIMAIS .......................................................................................................... 36

4.2 SUBSTÂNCIAS ................................................................................................ 36

4.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA .......................................... 36

4.3.1 Teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético ................... 36

4.3.2 Teste da formalina ..................................................................................... 38

4.3.3 Teste da placa quente ............................................................................... 39

4.4 TESTES OROFACIAIS DE NOCICEPÇÃO ..................................................... 40

4.4.1 Teste de nocicepção orofacial induzida por formalina ............................... 40

4.4.2 Teste de nocicepção orofacial induzida por capsaicina ............................. 41

4.4.3 Teste de nocicepção orofacial induzida por glutamato .............................. 42

4.5 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA ................................................. 43

4.5.1 Teste da coordenação motora (rota-rod) ................................................... 44

4.5.2 Teste da movimentação espontânea ......................................................... 44

4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA ...................................... 45

xvi

4.6.1 Pleurisia induzida por carragenina ............................................................. 45

4.6.2 Quantificação de leucócitos ....................................................................... 46

4.6.3 Quantificação de TNF-α ............................................................................. 46

4.6.4 Geração de óxido nítrico por macrófagos .................................................. 47

4.7 AVALIAÇÃO DA AÇÃO CENTRAL .................................................................. 48

4.7.1 Perfusão, crioproteção e corte dos encéfalos ............................................ 48

4.7.2 Imunofluorescência para Fos ..................................................................... 49

4.7.3 Aquisição das imagens .............................................................................. 50

4.7.4 Análise das imagens .................................................................................. 51

4.8 EUTANÁSIA E DESCARTES DOS ANIMAIS .................................................. 51

4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................. 52

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 53

5.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA .......................................... 53

5.2 TESTES OROFACIAIS DE NOCICEPÇÃO ..................................................... 56

5.3 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA ................................................. 60

5.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA ...................................... 61

5.5 AVALIAÇÃO DA AÇÃO CENTRAL .................................................................. 63

6 CONCLUSÃO ......................................................................................................... 68

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 69

ANEXOS ................................................................................................................... 94

ANEXO 1 – ARTIGO 1: CITRONELLOL, A MONOTERPENE ALCOHOL,

REDUCES NOCICEPTIVE AND INFLAMMATORY ACTIVITIES IN RODENTS ... 95

ANEXO 2 – ARTIGO 2: CITRONELLOL REDUCES OROFACIAL NOCICEPTIVE

BEHAVIOUR IN MICE - EVIDENCE OF INVOLVEMENT OF RETROSPLENIAL

CORTEX AND PERIAQUEDUCTAL GREY AREAS ............................................ 103

ANEXO 3 - PROTOCOLO DE APROVAÇÃO NO COMITÊ DE ÉTICA EM

PESQUISA ANIMAL DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE .................. 110

1

1 INTRODUÇÃO

A dor é definida como uma experiência sensorial e emocional desagradável

associada a dano tecidual real ou potencial (IASP, 2010), sendo reconhecida como

um problema de saúde pública, com importantes consequências físicas e

psicológicas, com alto ônus social e econômico (AZEVEDO et al., 2012). A

prevalência de dor na população adulta varia de 2% a 40%, com uma taxa de

prevalência média de 15% (MANCHIKANTI et al., 2011; HARKER et al., 2012),

ocasionando gastos anuais, apenas nos Estados Unidos (EUA), na ordem de 635

bilhões de dólares (GASKIN; RICHARD, 2012).

O recurso clínico mais eficaz no tratamento da dor é a terapia farmacológica.

Dentre os medicamentos mais utilizados, têm-se os opióides, drogas anti-

inflamatórias não-esteroidais (AINEs), drogas miorelaxantes, analgésicos periféricos

e os antidepressivos (DIONNE, 1997). No entanto, 40 a 60% dos pacientes não

respondem a farmacoterapia, pois alguns tipos de dor podem ser pouco responsivos

a analgésicos comuns (XU et al., 2012; CLAUW; ARNOLD; MCCARBERG, 2011).

Por este motivo, a pesquisa por novas propostas terapêuticas continua sendo uma

constante busca dos pesquisadores em todo o mundo (SRINIVASAN et al., 2001).

A avaliação do potencial terapêutico de plantas medicinais e de seus

constituintes tem sido objeto de incessantes estudos, em que já foram comprovadas

ações farmacológicas de algumas plantas (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998).

Vários registros históricos mostraram a busca, nas plantas medicinais, para a cura

ou alívio de moléstias que têm atingido impiedosamente a humanidade. De modo

particular, aquelas indicadas para o tratamento de doenças com manifestações

neurológicas e distúrbios psiquiátricos têm apresentado interesse (QUINTANS

JÚNIOR et al., 2008), instigando os pesquisadores a estudar os efeitos destas

plantas sobre o Sistema Nervoso Central (SNC), principalmente na tentativa de

descobrir novos compostos (FLORENTINO et al., 2009).

BUTLER (2008) realizou um extenso levantamento sobre os medicamentos

liberados pelo Food and Drug Admnistration (FDA, EUA) na última década e

descreveu que cerca de 40% destes novos fármacos se origina de produtos

naturais. De forma geral, cerca de 25% a 30% de todas as drogas avaliadas como

agentes terapêuticos são derivados de produtos naturais (SOUSA et al., 2008).

2

Dentre os produtos naturais com interesse pela indústria farmacêutica

utilizados no desenvolvimento de novas propostas terapêuticas para o manejo de

condições dolorosas, destacam-se os monoterpenos, que são constituídos por duas

unidades isoprênicas, as quais são formadas por 5 carbonos cada, representando

cerca de 90% dos constituintes dos óleos essenciais (BAKKALI et al., 2008). Aos

monoterpenos estão associadas diversas atividades terapêuticas como efeitos

calmante, antioxidante, anticonvulsivante e analgésico (ZEYTINOGLU; INCESU;

BASER, 2003; DE SOUSA; QUINTANS; DE ALMEIDA, 2007; GUIMARÃES;

QUINTANS; QUINTANS-JÚNIOR, 2012). O Citronelol (CT) é um monoterpeno

presente no óleo essencial de algumas plantas medicinais, como o Cymbopogon

citratus e a Lippia Alba. Alguns efeitos farmacológicos, tais como antibacteriano,

antifúngico, anti-espasmódico e atividade anticonvulsivante já foram descritos para o

citronelol (BASTOS et al., 2010; DE SOUSA et al., 2006).

Baseado na literatura e levando-se em consideração que o uso de produtos

naturais tem um papel importante na saúde mundial, uma vez que alguns dos

medicamentos utilizados no tratamento de diversas doenças são de origem natural e

que estudos científicos voltados à análise da efetividade dessas plantas medicinais

são escassos; e, somando-se ao fato que nos produtos naturais habita a

possibilidade da existência de diferentes compostos químicos que atuam em

conjunto em determinado alvo molecular, o que pode possibilitar a ocorrência de

menores efeitos colaterais ou secundários para o consumidor, tornam-se

necessárias pesquisas voltadas para a descoberta e avaliação de substâncias

naturais com potenciais terapêuticos.

Considerando-se, ainda, que apesar das drogas analgésicas serem a maior

categoria terapêutica, têm-se concentrado esforços na busca de compostos

analgésicos com maior potencial terapêutico, maior seletividade e menores efeitos

colaterais, e que o CT possui efeitos no SNC (DE SOUSA et al., 2006), contudo

desconhecendo-se suas possíveis atividades antinociceptiva e anti-inflamatória,

assim como seus mecanismos de ação central. Desta forma, o presente estudo

buscou, pela primeira vez na literatura, determinar os possíveis efeitos analgésico e

anti-inflamatório do CT, assim como sua ação no SNC, podendo, futuramente, o CT

se tornar uma molécula promissora no desenvolvimento de novas propostas

terapêuticas para o tratamento da dor e de outras nosologias que acometem o

homem.

3

2 REVISÃO TEÓRICA

2.1 PLANTAS MEDICINAIS

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), plantas medicinais são

todas aquelas, silvestres ou cultivadas, empregadas com o intuito de prevenir,

aliviar, curar ou modificar um processo fisiológico normal ou patológico, podendo

também serem utilizadas como fonte de fármacos e de seus precursores. A

divergência entre plantas medicinais e fitoterápicos condiz ao fato dessas atuarem

como prenunciadores dos mesmos na produção de uma formulação específica,

decorrendo na elaboração de produtos medicinais acabados e etiquetados

(CORDEIRO; CHUNG; SACRAMENTO, 2005; VEIGA JUNIOR; PINTO; MACIEL,

2005).

O uso de plantas medicinais tem sido descrito desde os primórdios da

humanidade, sendo que a descoberta de suas diversas utilidades é decorrente de

uma série de conceitos culturais. Muitas comunidades e grupos étnicos possuem o

conhecimento sobre plantas medicinais como o único recurso terapêutico, recurso

este que se mantém em prática até os dias atuais devido às observações populares

sobre o uso e a eficácia de plantas medicinais de todo o mundo, o que valida às

informações terapêuticas acumuladas durante anos (MACEDO; OSHIIWA;

GUARIDO, 2007).

As plantas medicinais são utilizadas tanto pelas comunidades tradicionais, ou

seja, pelos grupos culturalmente diferenciados, a exemplo dos indígenas,

quilombolas, ribeirinhos e ciganos, como por estudiosos, com o objetivo de obtenção

de novos fármacos (COSTA; MAYWORM, 2011). Na atualidade, vários fatores têm

contribuído para o aumento do uso deste recurso, para tanto se destacam o alto

custo dos medicamentos industrializados, o difícil acesso da população à assistência

médica, além da tendência, nos dias atuais, ao uso de produtos de origem natural

(BRASILEIRO et al., 2008).

Várias formas de tratar e curar doenças, tais como a utilização de

medicamentos, resultantes do avanço no meio técnico científico, foram

apresentadas à sociedade ao longo do tempo por meio de campanhas publicitárias

que prometiam curar as mais diversas doenças. No Brasil, apesar do incentivo da

indústria farmacêutica quanto à utilização de medicamentos industrializados, grande

4

parte da população ainda se utiliza de práticas complementares para cuidar da

saúde, como o uso de plantas medicinais (ETHUR et al., 2011).

As plantas medicinais e os fitoterápicos compõem uma fonte de tratamento que

se encontra em expansão por todo o mundo. No ano 2000, estipula-se que os

produtos a base de plantas medicinais movimentaram cerca de 30 bilhões de

dólares (MELO et al., 2007), representando, sem dúvida, um papel essencial na

terapêutica, o que se justifica pelo fato de 25% dos medicamentos prescritos

mundialmente serem de origem vegetal, conforme resultados divulgados pela OMS

(CORDEIRO; CHUNG; SACRAMENTO, 2005). Ainda de acordo com a OMS, 80%

da população mundial fazem uso de medicamentos derivados de plantas medicinais.

Pesquisas, realizadas no Brasil, mostram que 91,9% da população já fez uso de

alguma planta medicinal e cerca de 46% mantêm o cultivo caseiro dessas plantas

(ETHUR et al., 2011).

Entre os anos de 2005 e 2010, a FDA e a European Medicines Agency (EMA)

aprovaram um total de 19 medicamentos baseados em produtos naturais, a exemplo

do Dronabinol (Sativex®), Exenatide (Byetta®) e Romidepsin (Istodax®), indicados no

tratamento álgico, diabético e oncológico, respectivamente. Desses, 7 correspondem

a produtos naturais, 10 são produtos naturais semi-sintéticos e 2 são drogas

derivadas de produtos naturais, o que remete a grande importância dos produtos

naturais diante da farmacêutica mundial (MISHRA; TIWARI, 2011).

No Brasil temos como exemplo recente o anti-inflamatório tópico Acheflan®, do

Laboratório Aché, produto totalmente produzido nacionalmente a partir do óleo

essencial da planta Cordia verbenacea, rico em terpenóides, sendo registrado na

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) em 2004 e lançado no mercado

em 2005, onde, desde então, passou a ser o anti-inflamatório tópico mais prescrito

pela classe médica brasileira, correspondendo a cerca de 44% das prescrições

médicas, deixando claro, assim, a importância dos produtos naturais no mercado

brasileiro (CALIXTO; SIQUEIRA JUNIOR, 2008).

Apesar dos avanços da indústria química, a comercialização de plantas

medicinais ocupa uma importante parcela no mercado mundial, sendo representada

por 14 bilhões de um total estimado de 280 bilhões de dólares (aproximadamente

5% do mercado de produtos farmacêuticos). No Brasil, o valor estimado gasto em

fitoterápicos ainda é relativamente pequeno, cerca de 300 milhões de dólares, o que

5

gira em torno de 4% do mercado farmacêutico, da ordem de 7,4 bilhões de dólares

(CARVALHO et al., 2007).

Apesar do avanço na área científica voltada aos estudos dos fitoterápicos ter

contribuído amplamente para o aumento do uso de plantas medicinais, ainda faltam

inúmeros estudos que comprovem a utilização segura e eficaz de várias plantas

(VIEIRA et al., 2010). O uso das plantas medicinais, o qual se baseia em

conhecimentos populares tradicionais, vinculado à crença de que nada de origem

natural seria capaz de causar reações adversas, contribuíram para o baixo número

de estudos voltados à comprovação da segurança e eficácia das plantas medicinais

(TUROLLA; NASCIMENTO, 2006).

O Brasil é contentor de aproximadamente 55 mil espécies de plantas

superiores, um terço da flora mundial, o que o caracteriza como o país com maior

biodiversidade no planeta. O potencial econômico da flora brasileira, assim como

sua biodiversidade, principalmente no que se refere às plantas medicinais vem sido

descritos desde 1886. Porém, o Brasil ainda possui um baixo percentual em

conhecimento científico das plantas destinadas ao uso medicinal (KLEIN et al.,

2009).

Embora a aplicação de plantas medicinais na terapêutica mundial tenha sofrido

um forte avanço em busca do desenvolvimento de fitoterápicos confiáveis e

eficazes, ainda faltam estudos que comprovem a utilização segura e eficaz de várias

plantas (VIEIRA et al., 2010).

Os óleos essenciais (OEs) são substâncias de natureza volátil, com

composição lipofílica, encontrando-se contidos em vários órgãos das plantas. Esses

óleos constituem-se por substâncias terpênicas e eventualmente por

fenilpropanóides, acrescidos de moléculas menores, como alcoóis, ésteres, aldeídos

e cetonas de cadeias curtas. Os OEs são expelidos pela planta objetivando-se a

defesa ou atração de polinizadores, o que os tornam fontes potenciais de

substâncias biologicamente ativas, principalmente antimicrobianas. A composição

terpênica dos OEs caracteriza-se normalmente pela presença de moléculas de dez a

quinze carbonos, conhecidas como monoterpenos e sesquiterpenos,

respectivamente (OLIVEIRA et al., 2011).

Estudos pré-clínicos têm demonstrado propriedades benéficas dos OEs, tais

como os efeitos anti-inflamatório e antinociceptivo do óleo essencial da Myrcia

pubiflora (ANDRADE et al., 2012), antimicrobiano da Baccharis dracuncucifolia D.C.

6

e da Baccharis uncinella D.C. (FERRONATTO et al., 2007), além do hipotensor,

vasorrelaxante (DE MENEZES et al., 2010), antinociceptivo e anti-inflamatório do

Cymbopogon winterianus (LEITE et al., 2010).

Os monoterpenos (Figura 1) são substâncias isoladas que pertencem ao

grupo dos terpenóides, cuja estrutura corresponde a duas unidades de isopreno

formadas por uma base de 5 carbonos (C5) cada uma, ligadas entre si. Esses

possuem uma ampla variedade em suas estruturas e correspondem a cerca de 90%

da composição do óleo essencial (BAKKALI et al., 2008).

A utilização desses compostos tem sido descrita desde os primórdios do século

XIX, sendo empregados em fragrâncias e aromas. Ultimamente, eles têm sido

Carvacrol p-Cimeno

(-)-Mentol (+)-Mentol (+)-Pulegona (+)-Limoneno

α-Terpineol (-)-Linalol

Mirceno Citronelal cis-Citral trans-Citral

Timoquinona α-Pimeno

Figura 1. Estrutura química dos monoterpenos. Fonte: Adaptado de GUIMARÃES et al., 2012.

7

utilizados na indústria farmacêutica em virtude de seu potencial terapêutico

(GHASEMI et al., 2009), à exemplo do limoneno, utilizado em ensaios clínicos no

tratamento contra o câncer (GOULD, 1997).

Os monoterpenos representam destaque também na economia mundial, onde

se enquadram na categoria de nutracêuticos, os quais corresponderam, nos EUA, a

cerca de 75,5 bilhões de dólares em 2007, obtendo um crescimento para 167

bilhões de dólares em 2010 (BASU; THOMAS; ACHARYA, 2007). Inúmeros

monoterpenos são tidos como fontes de estudos com o intuito de se elucidar suas

ações sobre o organismo, em especial sobre suas propriedades analgésicas

(GUIMARÃES; QUINTANS; QUINTANS-JÚNIOR, 2012).

Estudos demonstram que o carvacrol, um monoterpeno encontrado nos óleos

essenciais dos gêneros Thymus e Origanum, bem como o (+)-pulegona, possuem

como uma de suas atividades a anti-inflamatória (KAWATA; KAMEDA; MIYAZAWA,

2008), que pode estar vinculada à inibição da liberação de prostaglandinas, o que

resulta da inibição da enzima cicloxigenase-2 (COX-2) (HOTTA et al., 2010).

A redução do edema de pata, observada com o uso do citral (QUINTANS-

JÚNIOR; GUIMARÃES; et al., 2011) e do α-pimeno (MARTIN et al., 1993), e a

diminuição da migração leucocitária induzida por carragenina, com o uso do

citronelal (QUINTANS-JÚNIOR; DA ROCHA; et al., 2011), do citral (QUINTANS-

JÚNIOR; GUIMARÃES; et al., 2011) e do limoneno (HIROTA et al., 2010) também

indicam a capacidade anti-inflamatória de alguns monoterpenos.

A inibição de mediadores inflamatórios, tais como a diminuição na síntese ou

liberação de óxido nítrico, a exemplo do linalol (PEANA; MARZOCCO; et al., 2006),

encontrado no óleo essencial da Salvia sclarea e da Salvia desoleana (PEANA;

RUBATTU; et al., 2006), e do Fator de Necrose Tumoral α (TNF-α), como ocorre

com o carvacrol e com o α-terpineol (DE OLIVEIRA et al., 2012), presente em

diversas espécies do gênero Eucalyptus (DAGNE et al., 2000), remetem a

importância dos monoterpenos quanto à propriedade antinociceptiva (GUIMARÃES

et al., 2012).

Além da atividade periférica, os monoterpenos também têm apresentado

atividade sobre o SNC (GUIMARÃES; QUINTANS; QUINTANS-JÚNIOR, 2012) e

cardiovasculares (SANTOS et al., 2011). Muitos monoterpenos potenciam a

neurotransmissão GABAérgica, o que indica sua potencialidade ansiolítica e/ou

anticonvulsivante (PASSOS et al., 2009), a exemplo do linalol (HOSSAIN et al.,

8

2002). Estudos demonstram que a atividade antinociceptiva do linalol pode estar

vinculada ao envolvimento de vários receptores, tais como, glutamatérgicos

ionotrópicos (BATISTA et al., 2008), adenosinérgicos (PEANA; RUBATTU; et al.,

2006) e opioides (SAKURADA et al., 2011).

A antinocicepção central representa um potencial importante vinculado a esses

compostos. O efeito antinociceptivo do citral recebeu destaque por estar relacionado

à inibição prolongada TRPV1 e TRPV3, seguida pela ativação do Transient receptor

cation channel, subfamily M, member 8 (TRPM8), apresentando destaque ao se

tratar da alodinia, coceira ou outros tipos de dor superficial. Além do agonismo total

dos receptores citados, o citral também pode atuar como agonista parcial do TRPV1,

TRPV3 e TRPA1 (STOTZ et al., 2008).

Estudos demonstram, ainda, a ativação do sistema opioide no mecanismo de

ação dos monoterpenos, como ocorre com o p-cimeno (SANTANA et al., 2011),

mentol (GALEOTTI et al., 2002), timoquinona (ABDEL-FATTAH; MATSUMOTO;

WATANABE, 2000) e citronelal, que também apresenta atividades sedativa e

hipnótica (MELO et al., 2010).

O Citronelol (CT) (Figura 2) é um dos componentes do óleo essencial presente

em várias plantas, a exemplo do Cymbopogon citratus, Cymbopogon winterianus e

Lippia alba, pertencendo à família dos produtos naturais derivados do isopreno C5

(BASTOS et al., 2010). Tal monoperno caracteriza-se quimicamente como uma

substância alcoólica de cadeia acíclica pertencente à composição de diversas

plantas de cadeias aromáticas (DE SOUSA, 2007). Ações antifúngicas, anti-

bacterianas, antiespasmódicas, hipotensora (BASTOS et al., 2010),

anticonvulsivante (DE SOUSA et al., 2006) e acaricida (JEON et al., 2008) já foram

descritas.

8

OH

Figura 2. Estrutura química do citronelol. Adaptado de GUIMARÃES et al, 2012.

9

VIOLLON; CHAUMONT (1994), por meio de estudos utilizando o fungo

Cryptococcus neoformans, espécie oportunista em pacientes com a Síndrome da

Imunodeficiência Adquirida (SIDA), provaram a eficácia do CT em sua ação

antifúngica. Para tanto, utilizaram o fungo extraído do sangue de portadores de

Human Immunodeficiency Virus (HIV) testado pelo método de diluição em ágar

sólido com cloranfenicol 0,005%. O citronelol foi adicionado ao meio antes da

solidificação. A proporção de 10/~1 (105 células/ml) de Cryptococcus neoformans foi

espalhada no ágar e as células foram contadas utilizando-se um hemocitômetro

Thoma. As culturas foram incubadas a 37 ºC por 48 horas e, posteriormente,

observou-se a concentração mínima capaz de inibir o desenvolvimento do fungo.

Propriedades antibacterianas foram observadas para o CT, onde foram

utilizadas culturas de Streptococcus mutans de dois dias de idade inoculadas em

uma combinação de infusão de cérebro e coração juntamente com a substância

teste. As amostras foram incubadas a 37º C por dois dias e posteriormente foi

realizada a contagem de colônias, onde se observou significativa diminuição do

número de colônias (KUBO; MUROI; KUBO, 1993)).

VIOLLON; CHAUMONT (1994) ao administrarem o óleo essencial de hortelã-

pimenta somado a corante em camundongos machos e fêmeas, por via oral, após

jejum de 2 h de água, conseguiram comprovar a atividade antiespasmódica do

citronelol no intestino desses animais ao observarem por meio de uma laparotomia a

taxa de migração do óleo nesse mesmo órgão.

Estudos realizados utilizaram amostras de Dermatophagoides farinae (ácaro da

poeira americano) e Dermatophagoides ptertonyssinus (ácaro da poeira europeu)

dispostas em discos de tecido preto, depositadas em placas de Petri, cobertas por

tampa. Após 24 h, as amostras foram observadas em microscópio binocular (20x) e

os ácaros foram considerados mortos quando incapazes de movimentar o apêndice

após o estímulo com um alfinete. O experimento demonstrou a ação acaricida do CT

quando comparados ao grupo controle (JEON et al., 2008).

Os efeitos cardiovasculares do CT, administrado por via endovenosa, em ratos,

foram observados por meio de hipotensão seguida por episódios de taquicardia.

Essa deriva, de forma provável, da diminuição da resistência vascular periférica

induzida pelo CT, a qual pode ser observada in vitro, para isso foram utilizadas

preparações de anéis isolados da artéria mesentérica superior de ratos (BASTOS et

al., 2010).

10

A atividade anticonvulsivante do CT foi descrita por DE SOUSA et al. (2006),

onde foram realizados os testes de convulsão induzida por pentilenetrazol,

picotroxina ou eletrochoque máximo (130V, 150Hz, por 0,5 s), sendo registrado que

esse monoterpeno produziu uma proteção significativa quando comparado aos

animais do grupo controle, tanto nas convulsões clônicas induzidas por

pentilenetrazol como nas tônico-clônicas induzidas pelo eletrochoque, o que garante

uma maior vantagem ao CT quando comparado à maioria das drogas

anticonvulsivantes. Os autores atribuíram os efeitos anticonvulsivantes ao CT devido

seu possível efeito sobre o sistema GABAérgico através do bloquei parcial de canais

operados por voltagem para sódio (VOCsNa+)(DE SOUSA et al., 2006). As drogas

anticonvulsivantes são de grande relevância no manuseio da dor, uma vez que

apresentam indicações precisas em determinados quadros de dor neuropática,

como a neuralgia essencial do trigêmeo, a neuropatia diabética e a neuralgia pós-

herpética, devido as sua capacidade de prolongar o período refratário efetivo das

fibras nervosas, limitar o disparo de alta frequência e aumentar a inibição sináptica

central (ALVES NETO, 2010).

2.2 DOR

A dor foi definida pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP)

como sendo uma experiência sensorial e emocional associada a dano tecidual real

ou potencial, ou descrita em termos de tal lesão, a qual pode ser classificada em

aguda e crônica (MOSSEY, 2011). A dor aguda é definida como uma dor de curta

duração e auto-limitada, que pode se tornar persistente e intratável se o processo da

doença subjacente ou lesão não for solucionada. Quando persiste por mais de 3

meses, essa dor é classificada como crônica (DUBOIS; GALLAGHER; LIPPE, 2009).

As estimativas da prevalência de dor variam amplamente e normalmente

entre 10% e 30% na população adulta, embora as taxas de prevalência variem de

2% a 55%. Esta variação pode ser reflexo das diferenças entre as populações e de

divergências na definição e classificação de dor presente nos estudos

epidemiológicos (BEKKERING et al., 2011; HARKER et al., 2012). A dor geralmente

é mais comum em grupos etários mais velhos, grupos com menor renda e entre as

mulheres (OHAYON, 2004; DEMYTTENAERE et al., 2006). Estima-se, por exemplo,

que mais de 22% dos americanos com mais de 18 anos apresentam dor na região

orofacial, prevalência esta que se repete em países como a Inglaterra e Alemanha.

11

De forma geral, a dor orofacial possui uma prevalência de 13% a 26% (MIRANDA et

al., 2012; NIXDORF et al., 2012; HARGREAVES, 2011).

Na sequência dos eventos que originam o fenômeno sensitivo doloroso, o

primeiro passo é a transformação dos estímulos ambientais, físicos ou químicos

intensos em potencial de ação, que são transferidos da fibra nervosa do sistema

nervoso periférico (SNP) para o SNC (ALVES NETO, 2010).

Existem três tipos principais de fibras sensoriais no SNP envolvidos na

nocicepção, as fibras A , A e C, as quais possuem propriedades diferentes, o que

lhes permitem transmitir tipos diferentes de informação sensorial. As fibras A são

grandes em diâmetro e altamente mielinizadas, permitindo-lhes, assim, conduzir

rapidamente potenciais de ação, sendo responsáveis por transmitir a informação

tátil. As fibras A são menores em diâmetro e finamente mielinizadas, o que as torna

mais lentas que a fibra A , respondendo tanto a estímulos térmicos quanto a

mecânicos. Já as Fibras C são amielinizadas, tornando-as fibras de condução lenta,

sendo responsáveis por detectar estímulos dolorosos. Conjuntamente, as fibras A e

C são denominadas de nociceptores, respondendo a estímulos nocivos, sejam eles

mecânicos, térmicos ou químicos (Tabela 1) (RAJA; MEYER; CAMPBELL, 1988)

(BASBAUM et al., 2009) (HUCHO; LEVINE, 2007).

Tabela 1. Características físicas das fibras aferentes nociceptivas.

A A C

Diâmetro 6 a 12 mm

(mielinizadas) 1 a 5 mm

(mielinizadas) 0,2 a 1,5 mm

(Não mielinizadas)

Velocidade 35 a 75 m/s 5 a 30 m/s 0,5 a 2 m/s

Função Tato Temperatura e

nocicepção Nocicepção

Adaptado de MARCHAND, 2008.

As percepções moleculares no processo de sensação de calor veio da

clonagem e caracterização funcional do receptor de capsaicina, o componente

majoritário da pimenta vermelha. A capsaicina produz dor em queimação devido a

ativação do receptor VR1, o qual apresenta um limiar de ativação térmica de

aproximadamente 43 °C, estando localizados predominantemente nas fibras C e A, sendo sensível ao calor nocivo. Os receptores VR1 são responsáveis por abrir os

12

canais de cátions permeáveis ao Ca+2 (CATERINA et al., 2000; CATERINA et al.,

1997; DAVIS et al., 2000; CESSELIN et al., 1984).

Os neurônios sensíveis ao frio respondem ao mentol e exibem um limiar de

ativação térmica de 25 °C, sendo ativados pelos receptores de pontecial melastatina

(TRPM-8) e pelos receptores de frio e mentol do tipo I (CMR1), os quais abrem um

canal não seletivo de cátions (COLBURN et al., 2007; DHAKA et al., 2007). Já os

estímulos mecânicos são transmitidos por uma variedade de receptores

mecanossensíveis, dentre eles as fibras C e fibras A, que respondem a estímulos

mecânicos intensos, fibras Aα, que detectam a tensão muscular e a posição da

articulação, e as fibras A , que processam o tato e são ativadas por estímulos

pressóricos fracos (WETZEL et al., 2007).

A quimionocicepção é o processo pelo qual os neurônios aferentes primários

detectam substâncias ambientais irritantes e fatores endógenos produzidos pelo

stress fisiológico. No contexto da dor aguda, os mecanismos quimionociceptivos

desencadeiam respostas aversivas a uma variedade de irritantes ambientais e

endógenos. Nesse casos, os canais TRP também possuem papéis fundamentais.

Os fatores endógenos capazes de ativar os nervos sensitivos são produzidos em

resposta ao dano tecidual ou ao stress fisiológico, incluindo o stress oxidativo. Tais

fatores podem atuar isoladamente, ou em combinação, na sensibilização dos

nociceptores diminuindo o limiar nociceptivo. Assim, a quimionocicepção representa

uma interface importante entre a dor aguda e persistente, especialmente no contexto

da lesão do tecido periférico e, consequente, instalação de um processo

inflamatório, o qual produz uma série de mediadores que ativam diretamente os

canais de Ca+2 e despolarizam os neurônios, desencadeando, assim potenciais de

ação (BASBAUM et al., 2009; PEIER et al., 2002; BANDELL et al., 2004).

A experiência sensorial iniciada na periferia, a nível dos terminais periféricos

de fibras aferentes primárias, as quais respondem a uma série de estímulos,

traduzem essa informação para o corno dorsal da medula, o qual é organizado em

lâminas (D’MELLO; DICKENSON, β00κ). As fibras A e as C fazem conexões

principalmente com as lâminas I e II, com um número menor de conexões com as

lâminas profundas, enquanto que as fibras A inervam predominantemente as

lâminas III e IV, fazendo conexões com lâmina V (Figura 3) (TODD, 2002).

A maioria dos neurônios presentes nas lâminas I, II e III possuem axônios

que permanecem na medula espinhal, realizando localmente conexões com os

13

neurônios de projeção, estes são chamados de interneurônios, os quais podem ser

divididos em duas classes principais: excitatórios (glutamatérgicos) e inibitórios

(GABAérgicos). Entretando, existem sinapses diretas entre as vias aferentes

primária e as células de projeção, as quais utilizam, por exemplo, a substância P

como transmissor (TODD et al., 2002; NAIM et al., 1997).

Figura 3. Conexões entre as fibras aferentes primárias e a medula espinhal. Adaptado de BASBAUM et al., 2009.

O glutamato é um aminoácido excitatório e é o principal neurotransmissor

encontrado ao longo de todo do sistema nervoso, e é, portanto, essencial para a

sinalização de dor em todos os níveis anatômicos. Assim, a grande maioria das

sinapses aferentes primárias presentes nos corno dorsal da medula espinhal,

independentemente de serem de diâmetro pequeno ou grande, utilizam este

transmissor. O glutamato exerce uma influência excitatória em neurônios pós-

sinápticos, levando a despolarização da membrana através de três subclasses de

receptores distintos: α-amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiónico (AMPA), o N-

metil-D-aspartato (NMDA) e a família de receptores metabotrópicos ligados a

proteína G (mGluR) (TÖLLE et al., 1995; VALERIO et al., 1997; D’MELLO;

DICKENSON, 2008).

Uma vez o estímulo nocivo tenha chegado aos neurônios de projeção,

concentrados na lâmina I e espalhados nas lâminas II, III e IV, estes cruzam a linha

14

média e viajam rostralmente na substância branca contralateral, através dos tratos

espinotalâmico e espinorreticular, para realizar aferências no tronco cerebral e em

vários núcleos talâmicos (SPIKE et al., 2003).

Especificamente, vias de projeção do corno dorsal da medula fazem aferência

com a medula rostroventral, com a substância cinzenta periaquedutal, com o núcleo

ventromedial do tálamo, e, finalmente, com os lóbulos frontais dorsolaterais. Outra

via de projeção ascendente ocorre da medula espinhal para o núcleo parabraquial,

e, subsequentemente, para o hipotálamo e para amígdala. Estudos sugerem ainda

que a informação nociceptiva pode ser transmitida do núcleo parabraquial para o

tálamo intralaminar, e de lá para o córtex frontal. Outra via envolve projeções do

núcleo parabraquial para o núcleo central da amígdala e para o prosencéfalo basal

(Figura 4) (DESBOIS; VILLANUEVA, 2001; BESTER et al., 2000; BOURGEAIS;

GAURIAU; BERNARD, 2001; RAINVILLE, 2002).

Figura 4. Anatomia das vias da dor. Adaptado de BASBAUM et al., 2009.

15

Ao nível de tálamo, os neurônios nociceptivos estão localizados em dois

grupos de núcleos: ventrobasal e centromedial. Os núcleos ventrobasal projetam

seus neurônios terciários para o córtex somatossensorial primário e secundário, já

os neurônios dos núcles centromedial projetam-se para as áreas do sistema límbico,

à exemplo do córtex insular e do córtex cingulado. Tais conexões são responsáveis

pelos componentes sensoriais e motivacionais da dor (COGHILL et al., 1994;

MARCHAND, 2008).

A substância cinzenta periaquedutal (PAG), região que circunda o aqueduto

cerebral a nível mesencefálico, é uma área de grande importância no controle da

dor. A PAG recebe sinais do tálamo, hipotálamo, córtex e conexões colaterais do

trato espinotalâmico, excitando os núcleos da medula rostroventral (RVM), a

exemplo dos núcleos da rafe e a formação reticular, que por sua vez projeta-se até o

corno dorsal da medula espinhal modulando a transmissão de mensagens

nociceptivas. Em adição, a PAG, núcleos da medula rostroventral e o corno dorsal

da medula são alvos de axônios ventrolaterais da coluna vertebral, incluindo os

núcleos parabraquial e o locus coeruleus (Figura 5) (STEEDS, 2009; CROFFORD;

CASEY, 1999; CALVINO; GRILO, 2006; PERL, 2011).

Figura 5. Via descendente da dor. Adaptado de CALVINO & GRILO, 2006.

16

Uma série de neurotransmissores, neuromoduladores e receptores estão

envolvidos na modulação da dor, sendo a serotonina, a noradrenalina e os opiáceos

os principais mediadores envolvidos na ativação da via descendente (CROFFORD;

CASEY, 1999; MARKS et al., 2009).

A inibição da dor por vias descendentes ocorre principalmente através de

neurônios serotoninérgicos e noradrenérgicos originados no mesencéfalo e na

substância cinzenta medular. Os neurônios serotoninérgicos estão principalmete no

núcleo magno da rafe, exercendo, através de uma série de receptors 5-HT, um

papel importante na modulação da dor, entretanto seus mecanismos de ação

precisos ainda não estão claros. Já a noradrenalina, através de seu receptor αβ,

possui um papel importante na antinocicepção. Embora a PAG e a RVM não

contenham neurônios noradrenérgicos, ambas as regiões se comunicam com áreas

noradrenérgicos importantes para a modulação da dor, a exemplo do locus ceruleus.

Estes núcleos noradrenérgicos são uma fonte importante de projeções com

eferência direta com a medula espinhal e, provavelmente, podem inibir a resposta

pré e pós-sináptica de neurônios espinhais envolvidos na transmissão da dor

(OSSIPOV; DUSSOR; PORRECA, 2010; RAHMAN et al., 2009; BAJIC; PROUDFIT,

1999; CROFFORD; CASEY, 1999).

O sistema opióide está envolvido tanto no componente ascendente quanto no

descendente da modulação da dor. Na via ascendente, os receptores , e

desempenham um papel fundamental. Já na via descendente, especificamente na

PAG e RVM, os receptores e são os principais responsáveis pela analgesia

decorrente do efeito modulatório exercido pela morfina, pelos opióides endógenos e

demais opióides, os quais estimulam a liberação de noradrenalina e serotonina no

corno dorsal da medula (STAMFORD, 1995).

Recentemente, têm-se comprovado a presença de receptores carnabinóides

CB1 em áreas do cérebro envolvidas na percepção nociceptiva, tal como a PAG e a

medula rostroventrolateral. Tais receptores também estão presentes na substância

gelatinosa, região esta que recebe sinais de neurônios aferentes primários, os quais

estão intimamente relacionados com a modulação nociceptiva. A nível de bulbo e

medula espinhal, os receptores CB1 são principalmente expressos no corno dorsal e

no funículo dorsolateral, estando, o sistema carnabinóide, envolvido na modulação

da dor (KRAFT, 2012; AGARWAL et al., 2007).

17

Conforme descrito anteriormente, a dor é uma experiência complexa e

multidimensional, compreendendo dimensões sensitivo-discriminativa, cognitiva,

emocional e motivacional. Tais dimensões apresentam expressão particular na

região orofacial, uma vez que esta região é formada por uma complexa variedade de

tecidos, dentre eles a pele, dentes, língua, músculos da mastigação, a articulação

temporomandibular e glândulas salivares, apresentando significados biológico,

emocional e psicológico especial para cada indivíduo (TAKEMURA et al., 2006).

Os tecidos orofaciais são inervados principalmente pelos três ramos (maxilar,

oftálmico e mandibular) do nervo trigeminal. Assim como em outros tecidos do

corpo, as fibras A e C transmitem sinais nociceptivos da região orofacial para o

SNC. Os principais corpos celulares das fibras aferentes primárias estão localizados

no gânglio trigeminal. Cada um destes neurônios presentes no gânglio trigeminal

possui um axônio que projeta-se para os tecidos periféricos e um outro que projeta-

se centralmente através do tronco cerebral ipsilateral, onde realiza sinapses com os

neurônios de segunda ordem, especialmente no complexo nuclear trigeminal

espinhal, o qual inclui o núcleo trigeminal sensorial e o núcleo trigeminal do trato

espinhal, sendo este dividido em três subnúcleos: oral, interpolar e caudal (SESSLE,

2005; SESSLE, 2000).

Os neurônios do complexo trigeminal projetam-se para diversas áreas do

SNC. Alguns neurônios possuem axônios que não saem do tronco cerebral, a

exemplo dos axônios da substância gelatinosa, que liberam localmente encefalina

ou GABA. Alguns neurônios projetam-se para a formação reticular ou para os

núcleos do nervo craniano motor, e, assim, fornece sinais necessários para as

respostas autonômicas e musculares reflexas. Além disso, muitos neurônios

ascendem diretamente para o tálamo através de vias que envolvem outras

estruturas do tronco cerebral, tais como o núcleo parabraquial e a formação reticular

(Figura 6) (SESSLE, 2005; DUBNER; REN, 2004).

O principal tratamento para a dor é a farmacoterapia. Os analgésicos

amplamente utilizados na clínica são classificados em opióides e não-opióides. Os

analgésicos não-opióides incluem o paracetamol e os anti-inflamatórios não

esteróides (AINEs). Já os opióides, a exemplo da morfina, agem como agonistas nos

receptores opióides (BECKER, 2010).

18

2.3 INFLAMAÇÃO

A inflamação é um processo que ocorre após uma infecção ou injúria tissular,

que é intercedido por uma diversidade de células e mediadores. Desta forma, a

resposta inflamatória pode ser benéfica, atenuando uma infecção, em defesa do

hospedeiro em relação ao organismo invasor e prolonga-se até o retorno da

homeostase. No entanto, esse evento pode cronificar-se, por não destruição do

patógeno ou por falta da homeostasia, levando a lesão de algumas estruturas, em

virtude da leucocitose, fibroplasia, da produção excessiva de citocinas e de outros

Figura 6. Via sensitiva principal da face e da boca. Adaptado de SESSLE, 2005.

19

mediadores desse processo. As manifestações moleculares geram uma

sintomatologia característica, conhecida pelos cinco sinais cardinais da inflamação:

eritema, calor, rubor, dor e a perda da função (MEDZHITOV, 2008).

O processo inflamatório é dividido em agudo e crônico por um critério

temporal e por algumas diferenças nos mediadores inflamatórias presentes em cada

condição. A inflamação aguda é subdividida em três fases: vasodilatação, aumento

da permeabilidade vascular e migração leucocitária, sendo cada uma dessas fases

imprescindíveis para o surgimento da próxima (SCOTT; LAM; FERRELL, 1994).

A vasodilatação é responsável por diminuição da velocidade do fluxo

sanguíneo, o que irá facilitar a migração leucocitária. Desta forma, a vasodilatação

em arteríolas e vênulas promoverá acúmulo de células naquela região, além de

interromper o fluxo laminar no lúmen do vaso, gerando o rubor e calor na região

(NORTHOVER; NORTHOVER, 1969). Consequentemente, os mediadores que são

liberados pelos leucócitos, como histamina, aumentam a permeabilidade dos vasos,

levando a extravasamento de plasma e formação do edema, caracterizando a

segunda fase (BIGNOLD; LYKKE, 1975). Após todas essas condições serem

estabelecidas, há expressão de moléculas de adesão para iniciar a terceira fase da

inflamação aguda, com intensa migração leucocitária, que liberam citocinas,

causando um quadro de dor inflamatória (LEY, 2003; CUNHA et al., 2008). A ação

dos leucócitos na fase inicial da inflamação é primordial para a resolução desse

processo (BUCKLEY et al., 2001).

Para o processo de migração leucocitária é necessário que ocorra redução do

fluxo sanguíneo, com emarginação dos leucócitos, para posterior adesão na parede

do endotélio, processo que é mediado por substâncias que promovem

vasodilatação, inicialmente, e por L-selectina, posteriormente (SMITH et al., 1991;

SPERTINI et al., 1991). Após a adesão, ocorre a migração do leucócito, por

transmigração ou por diapedese, processos dependentes de integrinas (ICAM-1 e

VCAM-1) e do gradiente quimiotático, respectivamente (Figura 7) (SPERTINI et al.,

1991; LUSCINSKAS et al., 1991).

Os leucócitos que migram para o local da inflamação na tentativa de

solucionar o quadro são os neutrófilos, macrófagos, mastócitos, eosinófilos e

monócitos. Os neutrófilos ou células polimorfonucleares (Figura 8) são as primeiras

células a migrar após uma lesão, sendo maioria na região afetada durante as

primeiras 24 horas (SPRINGER, 1994; KAPLANSKI et al., 2003). Estas células, ao

20

chegarem ao sítio inflamatório fagocitam os microrganismos, funcionando como a

primeira linha de defesa no combate a invasores, para tanto se faz necessário à

ação da enzima mieloperoxidase, presente nos grânulos azurófilos destas células,

sendo liberada por vesículas secretoras (FAURSCHOU; BORREGAARD, 2003).

Além disso, os neutrófilos são essenciais na fisiopatogênese da dor inflamatória,

uma vez que se inibindo a quimiotaxia destas células, atenua-se a hipernocicepção

(CUNHA et al., 2008).

Figura 7. Processo de quimiotaxia realizado pelos leucócitos. 1- Emarginação, 2-Rolamento, 3 - Adesão e 4 –Transmigração. Adaptado de ROSSITER; ALON; KUPPER, 1997.

É importante destacar que a migração de neutrófilos (quimiotaxia) é

necessária para a sobrevivência do hospedeiro, no combate a infecções e na

resolução do processo inflamatório (ALVES-FILHO; SPILLER; CUNHA, 2010).

Nesse sentido, os leucócitos são a primeira linha de defesa no combate aos

invasores por meio da fagocitose e da quimiotaxia de mais leucócitos (SEGAL,

1981). O processo de quimiotaxia é mediado por diversos fatores quimiotáticos,

além da função de moléculas de adesão que aumentam a adesão dos leucócitos ao

endotélio, mecanismos indispensáveis para a migração leucocitária e defesa do

organismo (LEY, 2003).

21

Figura 8. Neutrófilos fagocitando Streptococcus, em azul. Imagem obtida de um microscópio eletrônico, Hitachi S4500. Fonte: KOBAYASHI; VOYICH; DELEO, (2003).

Os monócitos ou células mononucleares são precursores de macrófagos, sua

migração é dependente da proteína quimiotática para monócitos-1 (MCP-1), que

promove a expressão de moléculas de adesão seletivas para este tipo celular. A

produção desta proteína é lenta, mas tem duração longa, o que justifica a migração

tardia de macrófagos e sua permanência longa, em oposição ao encontrado nos

neutrófilos (YAMASHIRO; KAMOHARA; YOSHIMURA, 1999).

Os macrófagos são células de defesas que atuam na resposta imune,

possuindo duas ações importantes na gênese do processo inflamatório, a fagocitose

de microrganismos e dos neutrófilos sem função e a produção de mediadores

inflamatórios (RENWICK et al., 2004; CAVAILLON, 1994; NEWMAN; HENSON;

HENSON, 1982), a exemplo do TNF-α, IL-1 , IL-8, IL-10 e IFN- . Além destes, os

macrófagos são responsáveis pela produção de óxido nítrico (GILAD et al., 1996;

HASKÓ et al., 1998).

Já os mastócitos são células do sistema imune sintetizadas por tecidos

hematopoiéticos (RODEWALD et al., 1996; CHEN et al., 2005), possuindo como

principal característica a presença de grânulos, estes ao serem desgranulados

liberam várias mediadores pró-inflamatórios, como histamina, leucotrienos e

citocinas (AMIN, 2012). Vale ressaltar que a função do mastócito como célula de

22

defesa se deve a facilitação da migração para o local da injúria de outras células

como neutrófilos, em virtude da vasodilatação promovida pelos constituintes dos

seus grânulos (THEOHARIDES et al., 2012).

Os eosinófilos estão presentes como marcadores de algumas patologias de

caráter inflamatório, como a inflamação alérgica, assim como os mastócitos. Além

disso, os eosinófilos regulam a desgranulação dos mastócitos, como por exemplo,

na liberação de histamina, sendo um importante alvo na terapêutica de doenças

inflamatórias (GLEICH, 1990; ZHEUTLIN et al., 1984; PILIPONSKY et al., 2001).

Se esses eventos persistirem, ocorre a cronificação do processo inflamatório,

caracterizado por expressão excessiva de fibroblastos e de tecido conjuntivo. Em

virtude disso, a inflamação crônica é caracterizada por fibrose, devido à lesão

tecidual persistente (BUCKLEY et al., 2001). Os fibroblastos induzem a expressão

de NF- B, aumentando a síntese de citocinas inflamatórias, além de ativar a via dos

prostanóides por indução da enzima cicloxigenase-2 (SMITH et al., 1997).

O NF- B é um fator de transcrição que promove a transcrição gênica de

alguns mediadores do processo inflamatório, como: citocinas, quimiocinas e enzimas

(iNOS e COX-2) (BALDWIN, 1996; SEBBAN; COURTOIS, 2006). A ativação desse

fator nuclear ocorre através da ativação de I Bcinase, por meio de algum estímulo

inflamatório, fosforilando I B, promovendo dissociação deste em NF- B. Esta

dissociação, por sua vez, promove ativação da proteína dimérica, induzindo a

translocação gênica, levando a síntese de citocinas pró-inflamatórias. Portanto, NF-

B modula o processo inflamatório a partir da formação de um complexo ativo

regulado por um feedback positivo, com produção de outros mediadores

inflamatórios (Figura 9). Entre esses mediadores, as citocinas apresentam um grupo

diverso, sendo constituídos por citocinas pró-inflamatórias (IL-1 , IL-2, IL-6, IL-8. IL-

12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-27, IL-33, IFN- e TNF-α) e anti-

inflamatória (IL-10) (HANADA; YOSHIMURA, 2002).

A IL-1 é uma das principais citocinas que regulam o processo inflamatório,

sendo caracterizada como pirógeno endógeno, ou seja, uma molécula endógena

que possui participação na gênese da febre. Sua produção ocorre através de um

estímulo bacteriano ou inflamatório, com objetivo de participar na resposta imune do

hospedeiro contra os microorganismos (DINARELLO, 1998). Os mecanismos pelos

quais esta citocina modula o processo inflamatório são a produção de proteínas de

fase aguda, como a proteína C-reativa, aumento da permeabilidade dos vasos,

23

produção de prostaglandinas por indução da enzima COX, indução de moléculas de

adesão na parede dos vasos, facilitando o processo migratório de leucócitos para o

local da lesão (RAMADORI; MEYER ZUM BÜSCHENFELDE, 1989; MOSER et al.,

1989).

Figura 9. Cascata de transcrição do NF- B. Fonteμ BARNES; KARIN, 1997.

A IL-2 promove seus efeitos inflamatórios através do controle da migração de

células T CD4+ (Th1 e Th2), sendo encontrada na pele e nos pulmões (SHARMA et

al., 2012). Já a IL-6 possui efeitos pró e anti-inflamatórios (DINARELLO, 1997),

sendo descrita primeiramente como um modulador da produção de IgG (HIRANO et

al., 1986). Atribui-se a essa citocina uma importante função na fisiopatologia de

algumas doenças, como: artrite, asma, diabetes e inflamação intestinal crônica,

sendo encontrados altos níveis dessa citocina nos pacientes com essas doenças

24

(NEURATH; FINOTTO, 2011; SWAAK et al., 1988; DINARELLO, 1997; DOGAN et

al., 2006; MUDTER; NEURATH, 2007).

A IL-8 é um marcador inflamatório encontrado em algumas doenças como a

doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e a síndrome da angústia respiratória

adulta (SARA) (PESCI et al., 1998), sendo liberada após um estímulo inflamatório,

possuindo como função aumentar a adesão de leucócitos à parede dos vasos,

promovendo a quimiotaxia (CUNHA et al., 1991). Esta citocina também está

relacionada com a migração leucocitária para o local da injúria, sendo mais seletiva

para neutrófilos (SALLUSTO et al., 1999).

IL-10 é liberada por macrófagos, células dendríticas e linfócitos T e B, sendo

considerada a principal citocina anti-inflamatória, modulando desta forma a resposta

inflamatória sistêmica, evitando a cronificação do processo (WILSON et al., 2005;

KOYA et al., 2007). Sua atividade anti-inflamatória é mediada pela inibição da

produção de citocinas inflamatórias e na quimiotaxia de leucócitos, inibindo a

resposta imune excessiva (BONFIELD et al., 1995; FIORENTINO et al., 1991; KEEL

et al., 1997). Entretanto, IL-10 não consegue suprimir o efeito pró-inflamatório de IL-

18, a explicação deste fenômeno provavelmente esteja na diferença do mRNA de IL-

18 em relação as outras citocinas pró-inflamatórias (ZEDIAK; HUNTER, 2003).

Durante a sepse, intensa resposta inflamatória, a IL-10 é produzida por neutrófilos

que são responsáveis pela sobrevivência em animais submetidos a um modelo de

sepse (KASTEN; MUENZER; CALDWELL, 2010; ALVES-FILHO; SPILLER; CUNHA,

2010).

A IL-12 é uma citocina produzida por celulas dendríticas, macrófagos e

células B, tendo como uma das principais funções a participação na produção de

IFN- e TNF-α, através de ativação de células Th1. A sua via de sinalização pode

ser estimulada através da ativação de fagócitos por processos infecciosos ou pela

interação destes com a matriz extracelular durante um processo inflamatório (MA,

2001) (SUGIMOTO et al., 2007; TRINCHIERI, 2003).

A IL-15 é produzida por meio de células apresentadoras de antígeno,

estimulando a produção de células T CD4 e CD8, assim como a IL-2, com a qual

possui estrutura e funções biológicas equivalentes (KANEGANE; TOSATO, 1996).

Além de macrófagos, monócitos e células dendríticas, há participação de mastócitos

na liberação de IL-15, possuindo primordial função no controle a infecções, além da

participação na produção de células NK (ORINSKA et al., 2007; SCHLUNS et al.,

25

2004). A quimiotaxia exercida por essa citocina aumenta a migração de neutrófilos e

células T, elevando a produção de IL-8 (WILKINSON; LIEW, 1995; BADOLATO et

al., 1997). Recentemente, foi demonstrado que outro possível mecanismos de ação

para seu efeito pró-inflamatório seria através da via de sinalização IFN- →

Endotelina → Prostaglandinas, existindo relatos de sua participação na

fisiopatogênse da artrite reumatoide (VERRI et al., 2006; MCINNES; LIEW, 1998).

A IL-17 possui produção atípica, uma vez que é produzida por células Th17,

essas células podem ser classificadas como resposta imune Th1 ou Th2,

dependendo do local onde atua, ou seja, se é intracelular (Th1) ou extracelular

(Th2), sendo constituida por uma família formada por seis componentes (DONG,

2008; KOLLS; LINDÉN, 2004). A modulação da inflamação ocorre por aumento da

produção de IL-8, proteína quimioatraente para monócitos (MCP-1), IL-1, TNF-α e

PGE2 (IWAKURA et al., 2008).

A IL-18, pertence a família da IL-1, foi caracterizada pela produção de IFN-

por células apresentadoras de antígenos, possuindo ação mediada por ativação do

NF- B e de MAPK, regulando, possivelmente, a produção de IL-4 e IL-10

(D’ACQUISTO; MAIONE; PEDERZOLI-RIBEIL, 2010; O’NEILL; GREENE, 1λλκ; XU

et al., 2000). Assim como a IL-12 e IL-15, esta citocina está envolvida na

fisiopatogênese de doenças autoimunes como a artrite reumatoide e o lupus

eritematoso (PLATER-ZYBERK et al., 2001; ROBAK et al., 2002; LEUNG et al.,

2000).

A IL-21, assim como as outras citocinas, é expressa por meio das células

apresentadoras de antígenos, bem como células T, B e NK, o que justifica seu papel

na resposta imune inata e adaptativa (COLLINS; WHITTERS; YOUNG, 2003). Suas

atividades biológicas estão relacionadas com ativação do seu receptor IL-21R,

agindo sinergicamente com IL-15, as quais possuem estruturas químicas

semelhantes, na proliferação de células T (ZENG et al., 2005).

Já a IL-22 é uma citocina com estrutura semelhante a IL-10, sendo sua

produção realizada por células T, NK e mastócitos, promovendo controle das

respostas imunes (ZENEWICZ; FLAVELL, 2008). Como outras citocinas, promove a

liberação de proteínas de fase aguda (AGGARWAL et al., 2001), justificando seu

papel modulatório durante a inflamação. No entanto, é interessante destacar que IL-

22 possui ação protetora nos hepatócitos, possuindo, sinergicamente com a IL-17,

ação antimicrobiana (ZENEWICZ et al., 2007; LIANG et al., 2006).

26

A IL-23, expressa por células apresentadoras de antígenos, é estruturalmente

semelhante com IL-12, possuindo atividades biológicas semelhantes, como a

produção de IFN- . Outra importante função da IL-23 é a manutenção da expressão

de IL-17, possuindo desta forma ação moduladora na resposta imunológica

(LANKFORD; FRUCHT, 2003; BONIFACE et al., 2008).

A IL-25 é produzida por células T e mastócitos, sendo estruturalmente

semelhante a IL-17, no entanto, seus efeitos biológicos são distintos, pois induz a

formação de IL-4 e IL-13. Sua ação inflamatória está relacionada com um processo

alérgico, provavelmente por quimiotaxia de eosinófilos, sendo um modulador da

inflamação alérgica (YOSHIDA; MIYAZAKI; YOSHIYUKI, 2008).

A IL-27, assim como IL-23, é estruturalmente similar a IL-12, sendo outra

citocina moduladora da expressão de IFN- (D’ACQUISTO; MAIONE; PEDERZOLI-

RIBEIL, 2010), possuindo efeito dual na expressão de IFN- , já que, conjuntamente

como as IL-12 e IL-23, podem induzir esta formação ou inibi-la por ativação do

receptor IL-27R. A ação inflamatória de IL-27 se deve ao aumento na expressão de

IL-1 e TNF-α (LAROUSSERIE et al., 2004).

A IL-33 está localizada no núcleo das células, sendo considerada um fator

nuclear com função de transcrição gênica, como o NF- B. No entanto, não está bem

estabelecido como isso ocorre, sendo bem relatada sua função extracelular, como

citocina pró-inflamatória (MOUSSION; ORTEGA; GIRARD, 2008). Sua ação

biológica se deve ao aumento da migração de eosinófilos e macrófagos para o sítio

inflamatório, além de estimular a produção de IL-1 , IL-6 e TNF-α, sendo

encontrados altos níveis de IL-33 em doenças pulmonares inflamatórias (MOULIN et

al., 2007; ZHIGUANG et al., 2010).

Os Interforons (IFNs) são produzido por linfócitos T e por células NK, sendo

mediadores de ambas as respostas imunes, atuando na expressão do MHC,

facilitando a fagocitose, e de moléculas de adesão, facilitando o processo

quimiotático. Esta família possui vários membros, como IFN-α, IFN- e IFN- . O IFN-

é um dos principais membros com atividade pró-inflamatória descrita, atuando na

liberação de outras citocinas, COX-2 e óxido nítrico por macrófagos

(GOTTENBERG; CHIOCCHIA, 2007; BOEHM et al., 1997). Além disso, IFN- é um

marcador de algumas doenças autoimunes, como artrite reumatoide e lúpus

eritematoso (DOLHAIN et al., 1996; PALUCKA et al., 2005).

27

O fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) é uma das principais citocinas que

controlam o processo inflamatório, sendo a primeira a ser liberada após um estímulo

inflamatório, levando a aumento da expressão da COX e PGE2 . Seus efeitos são

mediados por dois receptores: TNFR1 e TNFR2, sendo que o primeiro está

relacionado com apoptose, com a dor neuropática e com a dor inflamatória, e o

segundo com o processo inflamatório (CUNHA et al., 2005; SOMMER; SCHMIDT;

GEORGE, 1998). O TNF-α induz a migração de neutrófilos para o local da injúria por

mecanismos indiretos, como a indução de liberação de fatores quimiotáticos para

neutrófilos por estimulação de macrófagos residentes (FACCIOLI et al., 1990). Além

disso, esta citocina induz a migração de neutrófilos por estimulação da via dos

leucotrienos. No entanto, é estabelecido que o TNF-α está relacionado na

sinalização do óxido nítrico, inibindo indiretamente a expressão de moléculas de

adesão (CANETTI et al., 2001; TAVARES-MURTA; CUNHA; FERREIRA, 1998;

MORELAND et al., 1999).

O óxido nítrico (NO) é um gás que possui conhecida função vasodilatadora,

por relaxamento do músculo liso dos vasos, mediada pelo GMPc. A síntese dessa

molécula ocorre através de três isoformas: eNOS, nNOS e iNOS, que convertem L-

arginina e oxigênio em L-citrulina e NO. As isoformas da óxido nítrico sintase (NOS)

são expressas em diferentes tipos celulares, desempenhando em cada uma função

biológica corresponde a isoforma (IALENTI et al., 1992; PALMER; ASHTON;

MONCADA, 1988; KNOWLES; MONCADA, 1994).

A eNOS constitutiva é expressa nas células endoteliais, sendo responsável

pela vasodilatação promovida pelo endotélio. A nNOS constitutiva é encontrada em

neurônios, uma vez que o NO é considerado como neurotransmissor, participando

de alguns eventos fisiológicos, como tônus vascular, tônus bronquial e na

fisiopatologia da dor. A iNOS induzível é expressa em macrófagos e neutrófilos após

um estímulo inflamatório (MURAD, 1986; MONCADA; PALMER; HIGGS, 1991;

ESPLUGUES, 2002).

As duas formas constitutivas são dependentes de cálcio, sendo ativadas

através da cálcio-calmodulina. A forma induzível não é dependente do cálcio, sendo

expressa de forma contínua após um estímulo inflamatório inicial (IALENTI et al.,

2000). Recentemente, foi demonstrado que a forma nNOS possui outra forma de

gatilho para sua ativação, relacionado com a via do PIγK e AKT, sendo esse efeito

28

relacionado com a analgesia periférica promovida pela morfina (CUNHA et al.,

2010).

O NO possui função dual em alguns processos fisiopatológicos, como a dor e

a inflamação. Alguns estudos demonstram que o NO possui efeitos anti-inflamatório

e pro-inflamatório (CURY et al., 2011; MARCINKIEWICZ; GRABOWSKA; CHAIN,

1995; GIRALDELO et al., 1994).

A propriedade anti-inflamatória é relacionada com a diminuição da

quimiotaxia, sendo desmonstrado que, o tratamento com precursor de NO e um

inibidor da NOS, no teste da pleurisia induzida por carragenina, utilizando ratos

Wistar machos, promoveu redução e aumento do processo quimiotático,

respecticamente (IALENTI et al., 2000). Similarmente a isto, foi descrito que

inibidores da NOS aumentam a migração de neutrófilos no teste da peritonite

induzida por carragenina ou LPS. Estas evidências da quimiotaxia são justificadas

pela diminuição da adesão dos neutrófilos na parede do endotélio por atenuação da

expressão de algumas moléculas de adesão como ICAM-1 (DAL SECCO et al.,

2003; DAL SECCO et al., 2006).

No entanto, apesar dessas descrições sobre a ação anti-inflamatória do NO,

alguns trabalhos demonstram sua propriedade oposta. Foi demonstrado que a

administração de carragenina subcutânea em ratos Sprague-Dawley machos induz a

expressão de iNOS, com aumento da produção do NO no local da inflamação

(OMOTE et al., 2001). Já o tratamento com um inibidor da síntese de NO reduziu a

migração de eosinófilos em um teste de inflamação alérgica em ratos Wistar

machos, sugerindo que o NO aumenta a quimiotaxia de eosinófilos (FERREIRA et

al., 1998). Descreveu-se, ainda, que administração de enterotoxina B promove um

processo inflamatório em camundongos Swiss machos, com aumento da migração

de neutrófilos, da permeabilidade vascular, e ampliação da atividade neutrofílica,

sendo que o tratamento com inibidores da NOS atenuaram estes efeitos (FRANCO-

PENTEADO et al., 2001).Tais evidências são reforçadas pelo fato que o tratamento

com inibidor de NOS diminui a expressão de citocinas pró-inflamatórias, como IL-1 ,

IL-2, IL-6 e IFN- , além de aumentar a expressão de citocinas anti-inflamatórias,

como IL-10, em camundongos Swiss machos, no teste do edema de pata induzido

por carragenina (IANARO et al., 1994).

O tratamento para condições inflamatórias busca atenuar a liberação dos

mediadores inflamatórios que causam a sintomatologia descrita.

29

Consequentemente, foram analisados os mecanismos de ações de algumas drogas

com ação anti-inflamatória, como a aspirina. O mecanismo de ação dessa droga e

de seus derivados sintéticos está na inibição da produção de prostanóides, como as

prostaglandinas, produzida através da via do ácido araquidônico, surgindo os

inibidores da enzima cicloxigenase (MONCADA; FERREIRA; VANE, 1973; VANE;

BOTTING, 1997).

Mediante os efeitos adversos causados por essas drogas, pela importância

fisiológica dos prostanóides, e a descoberta de duas isoformas para essa enzima

(GABRIEL; JAAKKIMAINEN; BOMBARDIER, 1991; HLA; NEILSON, 1992), nasceu

uma nova classe de drogas, os inibidores seletivos para a cicloxigenase-2, enzima

importante na via do ácido araquidônico, que seria a forma induzível, encontrada

apenas em condições patológicas. Diante disso, uma nova abordagem terapêutica

para o tratamento de condições inflamatórias estava surgindo, os inibidores seletivos

da nova isoforma, que deveriam possuir menores efeitos adversos, pela inibição

seletiva da forma induzível (SIMON, 2001). No entanto, foram encontrados alguns

efeitos não esperados para essa nova terapêutica, em virtude da forma considerada

induzível ser expressa constitutivamente em vasos e rins (MAJIMA et al., 2000).

O ácido araquidônico (AA) é formado a partir de uma reação enzimática

mediada pela fosfolipase A2 que degrada os fosfolipídeos de membrana a este

composto. O AA possui importância no processo inflamatório por desencadear a

produção de diversos mediadores inflamatórios, conhecidos como eicosanoides

(BALSINDE; WINSTEAD; DENNIS, 2002).

A liberação destes produtos ocorre por duas vias de produção, intercedidas

por duas enzimas distintas, a enzima ciclooxigenase (COX) e 5-Lipooxigenase (5-

LOX). Ambas atuam na quebra do AA em eicosanoides, sendo este produto dividido

entre os prostanóides (prostaglandinas, protaciclina e tromboxano A2), derivados da

COX, e leucotrienos, derivados da 5-LOX (SMITH, 1989).

A via de sinalização da COX é formada por duas isoformas dessa enzima,

conhecidas como COX-1 ou prostaglandina sintase-1 e COX-2 ou prostaglandina

sintase-2. As duas enzimas levam a produção dos prostanóides, mas por muito

tempo atribui-se como diferença básica entre elas o caráter fisiológico ou constitutivo

para COX-1 e patológico ou induzível para COX-2 (MORITA, 2002).

Desta forma, defendeu-se que a forma constitutiva fosse responsável por

proteção gástrica, renal e por agregação plaquetária, mediante, obviamente, a

30

produção dos prostanóides, sem estar presente no processo inflamatório. Essa

hipótese foi confirmado ao avaliar o mRNA de COX-1 durante um evento

inflamatório, que demonstrou que os níveis permaneceram inalterados a exposição

do estímulo inflamatório (SMITH; DEWITT; GARAVITO, 2000). Os níveis de COX-1

estão elevados no processo de resolução da inflamação, atuando como regulador do

processo inflamatório para que não ocorra cronificação (TAMACHI et al., 2006).

A COX-2 com função induzível estaria presente em quadros inflamatórios,

desagregação plaquetária e em outros eventos patológicos. Diante disso, chegou-se

a conclusão que drogas inibidoras para COX não seletivas possuiriam efeitos

adversos por inibir a forma constitutiva, levando a formulação de inibidores seletivos

da forma tida como induzível (MORITA, 2002). No entanto, os resultados

demonstraram que a COX-2 possui função constitutiva, em vasos e rins, limitando

seu uso terapêutico no tratamento de condições inflamatórias (MAJIMA et al., 2000).

A via da COX leva a produção de alguns prostanóides, sendo os efeitos

mediados por essas enzimas atribuídos a estes produtos. Entre os prostanóides

encontram-se o tromboxano A2 (TXA2), prostaciclina (PGI2), relacionados com o

tônus vascular e com o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, e

prostaglandinas (PGE2, PGFβα,PGD2 e PGJ2) (REILLY; FITZGERALD, 1993). Os

efeitos biológicos atribuídos as prostaglandinas são diversos, já que PGFβα e PGJ2

possuem efeitos anti-inflamatórios, PGD2 promove vasoconstricção e PGE2 possui

efeito vasodilatador e tem participação na fisiopatogênese da febre (KOIZUMI;

NEGISHI; ICHIKAWA, 1992; GILROY et al., 1999; HELLIWELL; ADAMS;

MITCHELL, 2004).

A PGE2 possui quatro receptores: EP1, EP2, EP3 e EP4, todos acoplados a

proteína G, que ao ligar-se desempenha suas funções relacionadas ao processo

inflamatório e a dor (ZEILHOFER, 2007). Há relação, ainda, entre o efeito

inflamatório desencadeado por PGE2 e produção de citocinas pró-inflamatórias, uma

vez que o bloqueio dos receptores citados anteriormente atenuou a liberação dessas

citocinas (STRONG et al., 2000).

A outra via de produção de mediadores inflamatórios a partir do AA é ativada

pela enzima 5-LOX, a qual produz leucotrienos (LTB4, LTC4, LTD4 e LTE4). Assim

como as prostaglandinas, os leucotrienos possuem diversas funções biológicas, pois

LTC4, LTD4 e LTE4 são reguladores do processo inflamatório, e LTB4 possui ação

31

na quimiotaxia de leucócitos para o local do processo inflamatório (BISGAARD,

1984; ASAKO et al., 1992).

Outras substâncias de grande importância no processo inflamatório são a

bradicinina, histamina e a endotelina. A bradicinina é um nonapeptídeo sintetizado

através do cininogênio pela calicreína, sendo inativada pela enzima conversora de

angiotensina (ECA) ou por outras enzimas como as aminopeptidases (STEWART,

2004), possuindo efeito vasodilatador, sendo um mediador inicial importante para o

processo inflamatório, uma vez que a migração de leucócitos e o extravasamento de

plasma são dependentes da velocidade do fluxo sanguíneo (REGOLI; BARABÉ,

1980; DAMAS et al., 1990). Desta forma, a bradicinina é um mediador crucial da

fase inicial do processo inflamatório, sem o qual o desencadeamento deste ocorre

de forma menos acentuada (DAVIS; PERKINS, 1994a; DAVIS; PERKINS, 1994b).

Seus efeitos biológicos ocorrem por ativação dos seus receptores, B1 e B2,

os quais promovem a liberação de outros mediadores inflamatórios como citocinas,

histamina, PGE2 e óxido nítrico (TAYLOR; DEFEUDIS; MOREAU, 1989; MARCEAU

et al., 1999; COUTURE et al., 2001). Há evidências que o B2 seja constitutivo e B1

induzível, devido a falta de expressão desse receptor em tecidos sem processo

patológico. De fato, citocinas como IL-1 e TNF-α induzem a expressão desse tipo

de receptor, além do NF- B (MARCEAU; HESS; BACHVAROV, 1998; BACHVAROV

et al., 1996).

A histamina é uma amina sintetizada através da L-histidina descarboxilase

que atua sobre a histidina, promovendo descarboxilação para a formação de

histamina (COUTURE et al., 2001). Essa amina é armazenada em mastócitos,

principalmente, até a desgranulação deste e posterior liberação por meio de um

estímulo, que pode ser um processo inflamatório, como citocinas pró-inflamatórias.

Além de participar de eventos inflamatórios, a histamina é expressa

constitutivamente nos pulmões (ENDO, 1982).

Suas propriedades biológicas são mediadas pelos receptores: H1, H2, H3 e

H4. A ativação do receptor H1 gera vasodilatação e aumento da permeabilidade

vascular, favorecendo a migração leucocitária para o local da lesão (TOGIAS, 2003).

O H2 é encontrado no estômago e regula secreção gástrica, desta forma, seu

bloqueio inibi o processo inflamatório desencadeado pelo sulco gástrico, além disso

de aumentar a permeabilidade vascular (WHITE, 1990). A ativação de H4 aumenta a

produção de citocinas, a migração leucocitária, sendo outro receptor histaminérgico

32

com ação inflamatória (LING et al., 2004). Diferentemente dos outros receptores, H3

não está relacionado com o processo inflamatório, possuindo ação na liberação de

neutransmissores, como acetilcolina, dopamina e histamina (ARRANG; GARBARG;

SCHWARTZ, 1983; LOVENBERG et al., 1999).

A endotelina é um peptídeo endógeno, com efeito vasoconstritor, sintetizado a

partir das células endoteliais, cérebro e coração, sendo sua ativação realizada por

endopeptidases. Os efeitos biológicos produzidos por ela são mediados por dois

receptores, ETA e ETB, sendo ambos aclopados a proteína G, nas suas isoformas

ET1, ET2 e ET3 (HICKEY et al., 1985; NUNEZ et al., 1990; LEVIN, 1995).

Apesar de possuir essa ação em vasos, a endotelina é um mediador da

inflamação. Esse fato se deve ao estímulo na liberação de IL-6, IL-8 e TNF-α, além

de estar associado com a ativação da via do AA por ativação de PLA2 (MULLOL et

al., 1996; RUETTEN; THIEMERMANN, 1997; ARAMORI; NAKANISHI, 1992). Tais

evidências são reforçadas por esse peptídeo está relacionado com a gênese de

algumas doenças inflamatórias como dor inflamatória, fibrose pulmonar e

cardiomiopatia (HOCHER et al., 2000; YANG et al., 2004).

Por fim, merece destaque o sistema complemento, o qual é responsável pela

defesa do organismo ao combate de microrganismos que levam à injúria tecidual. O

combate ao invasor ocorre por estimulação da defesa do organismo com estímulo

ao desencadeamento de um processo inflamatório, induzindo maior efeito fagocitário

às células de defesa. Este sistema consiste em um grupo de proteínas que são

ativadas a partir de uma cascata, sendo ativado por três vias distinas: clássica, das

lectinas e alternativa, convergindo para a produção das outras proteínas do sistema

e do complexo de ataque à membrana, funcionando como marcador para a

detecção de antígenos (KIRSCHFINK, 1997; MCGEER; KLEGERIS; MCGEER,

2005).

Um dos principais mecanismos pelos quais o complemento promove um

processo inflamatório está relacionado com a quimiotaxia de leucócitos, impedindo o

dano tecidual. Outras evidências sugerem a aumento da permeabilidade vascular e

produção de citocinas como TNF-α e IL-1 . Além do mais, o sistema complemento é

utilizado como alternativa terapêutica para o tratamento de inflamações articulares,

através da utilização de anticorpos (HUGLI, 1986; WANG et al., 1995).

33

2.4 PROTEÍNA FOS

Os genes de expressão imediata (GEIs) pertence a uma classe de genes que

são rapidamente ativados, geralmente na forma transiente, em resposta a uma

cascata de sinalização intracelular, codificando dos fatores de transcrição induzíveis

(FTIs), os quais constituem um grupo de proteínas nucleares que se ligam a sítios

reguladores do DNA, controlando a transcrição de inúmeros genes alvos e efetores,

compreendendo a família de proteínas Fos, Jun e Krox. Vale destacar, que a

indução dos GEIs ocorre na ausência de qualquer síntese proteica e, portanto, não

pode ser bloqueada pelos inibidores de síntese proteica (SNG; TANIURA; YONEDA,

2004).

Os FTIs são proteínas expressadas poucos minutos após uma célula ter sido

submetida a determinados estímulos. Inicialmente, um estímulo humoral ou sináptico

resulta em elevação dos níveis intracelulares de segundos mensageiros, tais como

cálcio, AMPc, GMPc. Em seguida, proteínas quinases citoplasmáticas são ativadas

e/ou translocadas para o núcleo. Essas enzimas catalisam a fosforilação de fatores

de transcrição constitutivos, que, por sua vez, se ligam a seqüências consensuais de

DNA de alta afinidade, na região promotora dos FTIs, e ativam a RNA polimerase II,

levando à transcrição de outras proteínas (PRADO; DEL BEL, 1998).

Existem quatro genes pertencentes a família fos: c-fos, fos-B, fra-1 e fra-2, os

quais codificam quatro proteínas designadas: Fos, Fos-B, Fra-1, Fra-2 (BIAŁY;

KACZMAREK, 1996). O oncogene Fos foi isolado pela primeira vez em 1982 a partir

do vírus FBJ murine osteogenic sarcoma, e, posteriormente, a sua versão celular c-

Fos foi descrita (CURRAN; TEICH, 1982; HERDEGEN et al., 1995) . A proteína Fos

é formada no citoplasma e vai para o núcleo onde tende a formar heterodímeros

(Fos-Jun), sendo classificadas, então, como proteína ativadora 1 (AP-1) e, dessa

maneira, apresenta maior afinidade de ligação ao DNA, provocando a ativação de

seus genes alvos (PRADO; DEL BEL, 1998).

Após a formação do dímero, a AP-1, se ligará a uma seqüência gênica

específica, o sítio AP-1, o qual é essencial para a ativação de vários genes. Ao

interagir com outros fatores de transcrição, o heterodímero da proteína Fos,

simultaneamente, forma uma ligação entre sistemas de segundos mensageiros

independentes. Essa proteína e outros FTIs atuam, portanto, como terceiros

mensageiros nucleares, ligando eventos mediados pelos segundos mensageiros a

34

alterações subsequentes na expressão gênica (HESS; ANGEL; SCHORPP-

KISTNER, 2004).

A expressão de c-fos é induzível, por exemplo, pelo soro, pelo fator de

crescimento epidérmico, pelos fatores de crescimento, pela radiação ionizante, por

agentes farmacológicos e por stress e citocinas (VAN DAM; CASTELLAZZI, 2001).

Desta forma, a proteína Fos é um marcador útil para o controle das atividades

neuronais nas vias centrais do sistema sensorial, particularmente na via nociceptiva.

A expressão do c-Fos pode ser estavelmente eliciada por vários estímulos nocivos,

tais como os mecânicas, térmicas e químicas. Tal proteína nuclear que pode ser

detectada nos neurônios por técnicas de imunohistoquímica de 20 a 90 minutos

após a ativação neuronal, desaparecendo dentro de 4 a 16 horas após o estímulo

(BURMEISTER; MANGIAMELE; LEBONVILLE, 2008; WILLIAMS; EVAN; HUNT,

1990).

35

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar os possíveis efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório do citronelol em

roedores, assim como o envolvimento de áreas centrais nessa ação.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar o possível potencial antinociceptivo do citronelol (CT);

• Avaliar a ação do CT na nocicepção orofacial;

• Avaliar a possível ação anti-inflamatória do CT;

• Investigar o envolvimento de regiões centrais na possível ação do CT;

• Verificar possíveis alterações motoras induzidas pela administração do CT.

36

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 ANIMAIS

Foram utilizados 362 camundongos Swiss machos (25 a 35 gramas) com 2 a 3

meses provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Sergipe (UFS).

Os animais foram mantidos em ciclo claro escuro de 12:00h/12:00h (claro: 6 às 18

hs; escuro: 18 às 6 hs), à temperatura de 25º ± 1oC, com dieta balanceada com

ração do tipo “pallet” e acesso livre a água. No presente estudo foram respeitados os

princípios éticos estabelecidos pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animal de

Laboratório (SBCAL) e todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo

Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFS (CEPA/UFS: 72/11).

4.2 SUBSTÂNCIAS

-Carragenina, Ácido etilenodiaminatetraacetico (EDTA), lipopolissacarídeo

(LPS), Reagente de Griess, Solução de Türk, Ácido Acético, Tween 80, formalina,

glutamato, capsaicina, glicerol, DABCO, glicina, soro albumina bovina (BSA), triton

X-100 e ((S)-()-B-Citronellol, CT, pureza de 97%) foram obtidos da Sigma (EUA).

Morfina, diazepam, naloxona, indometacina, ketamina, xylasina e paracetamol foram

obtidas da Cristália (Brasil). Kits para ensaio imunoenzimático (ELISA) para

quantificação de TNF-α foi obtido da BD-Bioscience Pharmingen (EUA). Nitrato de

Sódio (NaNO2) foi obtido da Merck (Brasil). O anticorpo primário policlonal produzido

em coelho, específico contra a proteína Fos SC 52 e o anticorpo secundário anti-IgG

de coelho produzido em jumento conjugado com Alexa Fluor 594 foram obtidos da

Santa Cruz Biotechnology (EUA).

4.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA

4.3.1 Teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético

O teste das contorções abdominais é descrito como um modelo de

nocicepção inflamatória visceral e permite avaliar tanto o efeito central quanto o

periférico de substâncias. O ácido acético ativa diretamente o canais de cátion

localizados nas vias aferentes primárias, além de promover a liberação de diversos

37

mediadores do processo inflamatório, a exemplo do TNF-α e da IL-1 , estimulando a

liberação de aspartato e glutamato no fluido cérebro-espinhal (JULIUS; BASBAUM,

2001; KOSTER; ANDERSON; DE BEER, 1959). Após a injecção intraperitoneal de

ácido acético, o camundongo apresenta uma resposta que consiste de uma

constrição da parede abdominal, por vezes acompanhada por rotação do tronco e

extensão dos membros posteriores (HONORE et al., 2002; COLLIER et al., 1968).

Este teste consistiu na injeção de ácido acético 0,85% (0,1 mL/10 g; i.p.),

conforme descrito por KOSTER; ANDERSON; DE BEER, (1959). Para avaliar o

efeito da nocicepção causada pelo ácido acético foi adotado o conceito de que uma

contorção é entendida como a torção do corpo inteiro e/ou o alongamento dos

membros posteriores, com o movimento do abdômen tocando a superfície da mesa.

Após 5 min da administração do ácido, o número de contorções foi contado durante

15 min. Trinta minutos antes da injeção de ácido acético, grupos de oito animais

foram tratados com CT (25, 50 e 100 mg/kg; i.p.), veículo (solução salina 0,9% +

tween 80 0,2%; i.p.) ou paracetamol (100 mg/Kg; i.p.) (Figura 10).

Figura 10. Resumo esquemático do teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Fotos: Renan G. Brito.

γ0’ 15’

Contagem do número de contorções abdominais

Tratamento: Veículo (salina + tween 80 0,2%; i.p.)

CT (25, 50 e 100 mg/Kg; i.p.) Paracetamol (100 mg/Kg; i.p.)

5’

Ácido acético 0,85% (0,1 mL/10 g; i.p.)

38

4.3.2 Teste da formalina

O teste da formalina é um dos testes mais utilizados para avaliação da dor,

sendo mais válido que testes mecânicos e térmicos. A formalina desencadeia uma

resposta precoce e uma resposta tardia. A resposta precoce, ou primeia fase do

teste da formalina, caracteriza-se pelo efeito direto sobre os nociceptores seguido

por uma resposta inflamatória, característica da fase tardia, ou segunda fase do

teste da formalina (ROSLAND et al., 1990; TJØLSEN et al., 1992).

Este teste consistiu na injeção subcutânea de formalina (20 L) a 1% na

superfície plantar da pata posterior direita, conforme descrito por HUNSKAAR;

FASMER; HOLE, 1985. Após a injeção, foi mensurado o tempo em que o animal

permanece lambendo a pata injetada de 0-5 min (primeira fase) e 15-30 min

(segunda fase) após a injeção de formalina. Trinta minutos antes da injeção, grupos

de seis animais foram tratados com CT (25, 50 e 100 mg/kg; i.p.), veículo (solução

salina 0,9% + tween 80 0,2%; i.p.) ou morfina (3 mg/Kg; i.p.) (Figura 11).

Figura 11. Resumo esquemático do teste da formalina. Fotos: Renan G. Brito.

15’ 10’ 5’

Formalina 1% (β0 L; i.pl.)

γ0’


CT (25, 50 e 100 mg/Kg; i.p.) Morfina (3 mg/Kg; i.p.)

Tempo de lambida da pata (s)

39

4.3.3 Teste da placa quente

O teste da placa quente é um modelo comportamental de nocicepção

comumente utilizado na avaliação dos efeitos de drogas analgésicas, geralmente por

alterações no limiar nociceptivo, consistindo na exposição dos animais a um

estimulo térmico nocivo (EDDY; LEIMBACH, 1953). A latência para as respostas

comportamentais incluem salto, retirada da pata e lamber a pata (ESPEJO; MIR,

1993; HUNSKAAR; BERGE; HOLE, 1986).

Nesse experimento, a placa quente foi mantida a uma temperatura de 55 °C ±

1°C. O teste consistiu em colocar o camundongo sobre uma superfície metálica

uniformemente aquecida e observar a latência (em segundos) para ele lamber as

patas traseiras ou saltar, nos tempos de 30, 60, 90 e 120 min após o tratamento.

Para evitar lesão tecidual, foi estabelecido um teto de 30 s. Quando o animal não

apresentou nenhum dos comportamentos acima citados, ele foi removido do

aparelho pelo experimentador (ANKIER, 1974). Trinta minutos antes da exposição

ao estimulo térmico, grupos de dez animais foram tratados com CT (25, 50 e 100

mg/kg; i.p.), veículo (solução salina 0,9% + tween 80 0,2%; i.p.) ou morfina (3 mg/Kg;

i.p.). O efeito do pré-tratamento com naloxona (0,5 mg/kg, i.p.), um antagonista

opióide, na antinocicepção produzida pelo CT (100 mg/kg) e pela morfina (3 mg/kg,

i.p.) também foi determinado (Figura 12).

Figura 12. Resumo esquemático do teste da placa quente. Fotos: Renan G. Brito



Naloxona (0,5 mg/kg; i.p.)

Tempo de permanência na placa quente

γ0’ 60’ 90’ 120’

40

4.4 TESTES OROFACIAIS DE NOCICEPÇÃO

4.4.1 Teste de nocicepção orofacial induzida por formalina

A injecção de formalina no lábio superior induz uma resposta comportamental

caracterizada pela fricção da área perinasal com a pata anterior, e, por vezes ,com a

pata traseira. A nocicepção, no modelo de nocicepção orofacial induzida por

formalina, é resultante da ação inflamatória oriunda da ligação da formalina com as

proteínas teciduais, levando a estimulação direta dos nociceptores, na primeira fase,

e a um processo inflamatório, com consequente sensibilização central, na segunda

fase, de forma análoga ao observado em todos os testes que utilizam a formalina

como algógeno. Entretanto, quando injetada na região orofacial, a formalina excita

os neurônios nociceptivos convergentes do núcleo trigeminal espinhal, o que torna o

teste de nocicepção orofacial induzida por formalina mais específico na análise do

componente central da nocicepção quando comparado, por exemplo, ao teste da

injeção intra-plantar (LUCCARINI et al., 2006; CLAVELOU et al., 1989; ANDERSON;

VAKOULA; VEINOTE, 2003; RABOISSON; DALLEL, 2004).

Esse teste consistiu na injeção subcutânea de formalina β% (β0 L) no lábio

superior de camundongos (CLAVELOU et al., 1989). Inicialmente, cada animal foi

colocado em uma caixa de madeira (30 x 30 x 30 cm) com bases e laterais

espelhadas e frente de vidro, por um período de 15 min para minimizar o estresse ao

novo ambiente. Foi realizada a injeção de formalina e, imediatamente após, o animal

retornou a caixa para o período de observação de 0-5 min (primeira fase) e de 15-30

min (segunda fase). A intensidade da nocicepção foi determinada pela contagem do

tempo (em segundos) que o animal permaneceu friccionando a área injetada com as

patas traseiras e/ou dianteiras. Trinta minutos antes da injeção de formalina, grupos

de seis animais foram tratados com CT (25, 50 e 100 mg/kg; i.p.), veículo (solução

salina 0,9% + tween 80 0,2%; i.p.) ou morfina (5 mg/Kg; i.p.) (Figura 13).

41

4.4.2 Teste de nocicepção orofacial induzida por capsaicina

4.4.2 Teste de nocicepção orofacial induzida por capsaicina

A capsaicina, o componente majoritário da pimenta vermelha, é uma

ferramenta amplamente utilizada no estudos dos mecanismos fisiológicos da dor. O

uso de capsaicina como algógeno químico oferece uma série de vantagens, uma

vez que a capsaicina tem uma ação seletiva nas fibras sensoriais que transmitem as

sensações dolorosas, provocando a vasodilatação reflexa do axônio. Estes efeitos

resultam da ativação do receptor vanilóide 1, um canal iônico presente em neurônios

sensoriais, principalmente na via trigeminal, mais especificamente no gânglio

trigeminal. A injeção de capsaicina é capaz, ainda, de aumentar a excitabilidade dos

neurônios nociceptivos espinhais, sendo amplamente utilizada no estudo pré-clínico

dos mecanismos centrais envolvidos na nocicepção (HOLZER, 1991; PELISSIER;

PAJOT; DALLEL, 2002).

Esse teste consistiu na injeção subcutânea de capsaicina β.5 g (β0ul) no

lábio superior de camundongos (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2010). Inicialmente,

cada animal foi colocado em uma caixa de madeira (30 x 30 x 30 cm) com bases e

laterais espelhadas e frente de vidro, por um período de 15 min para minimizar o

estresse ao novo ambiente. Foi realizada a injeção de capsaicina e, imediatamente

Figura 13. Resumo esquemático de teste de nocicepção orofacial induzida por formalina. Fotos. Renan G. Brito.

15’ 10’ 5’

Formalina 2% (β0 L; s.c.)

γ0’



Tempo de fricção da região orofacial (s)

42

após, o animal retornou a caixa para um período de observação de 42 min. A

intensidade da nocicepção foi determinada pela contagem do tempo (em segundos)

que o animal permaneceu friccionando a área injetada com as patas traseiras e/ou

dianteiras. Trinta minutos antes da injeção de capsaicina, grupos de seis animais


tween 80 0,2%; i.p.) ou morfina (5 mg/Kg; i.p.) (Figura 14).

4.4.3 Teste de nocicepção orofacial induzida por glutamato

O glutamato é um neurotransmissor excitatório com importante papel nos

mecanismos da dor. Níveis de glutamato periféricos estão aumentados na pele ou

tecidos profundos, em resposta à lesão dos tecidos, à estimulação elétrica do nervo

e na inflamação. A administração subcutânea local de glutamato evoca um processo

doloroso ou uma hiperalgesia térmica ou mecânica (GAZERANI et al., 2006; RO,

2003).

Esse teste consistiu na injeção subcutânea de glutamato 25 M (40 ul) no

lábio superior de camundongos (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2010). Inicialmente,

cada animal foi colocado em uma caixa de madeira (30 x 30 x 30 cm) com bases e

Figura 14. Resumo esquemático do teste de nocicepção orofacial induzida por capsaicina. Fotos: Renan G. Brito.

42’ γ0’

Capsaicina β.5 g (20 ul; s.c.)




43

laterais espelhadas e frente de vidro, por um período de 15 min, para minimizar o

estresse ao novo ambiente. Foi realizada a injeção de glutamato e, imediatamente

após, o animal retornou à caixa para um período de observação de 15 min. A

intensidade da nocicepção foi determinada pela contagem do tempo (em segundos)

que o animal permaneceu friccionando a área injetada com as patas traseiras e/ou

dianteiras. Trinta minutos antes da injeção de glutamato, grupos de seis animais


tween 80 0,2%; i.p.) ou morfina (5 mg/Kg; i.p.) (Figura 15).

4.5 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA

Os testes de coordenação motora são métodos utilizados na triagem de

drogas com possível atividade neurotóxica/miorrelaxante. Tais testes são

apropriados para detectar o efeito de relaxamento muscular ou de incoordenação

motora produzido por agentes farmacológicos (PULTRINI; GALINDO; COSTA,

2006).

Figura 15. Resumo esquemático do teste de nocicepção orofacial induzida por glutamato. Fotos: Renan G. Brito.

15’ γ0’

Glutamato β5 M (40 L; s.c.)




44

4.5.1 Teste da coordenação motora (rota-rod)

O teste da coordenação motora usa o aparelho Rota-Rod e detecta a possível

interferência de um fármaco em estudo na coordenação motora de roedores

(DUNHAM; MIYA, 1957). Neste teste, os animais foram selecionados 24 h antes do

experimento, em sessões de 2 min de duração, sendo escolhidos aqueles que

permaneceram na barra giratória por esse período, sendo avaliados nos tempos de

30, 60 e 120 min após o tratamento. Grupos de seis camundongos selecionados

foram colocados no Rota-Rod trinta minutos após tratamentos com CT (25, 50 e 100

mg/Kg; i.p.), diazepam (1,5 mg/Kg; i.p.) ou veículo (solução salina 0,9% + tween 80

0,02%; i.p.). O tempo máximo de permanência permitido dos animais no Rota-Rod

foi de 3 min, sendo avaliado o tempo de permanência na barra giratória, com no

máximo 3 reconduções à barra (Figura 16).

4.5.2 Teste da movimentação espontânea

Grupos de seis camundongos foram tratados com CT (25, 50 e 100 mg/Kg;

i.p.), diazepam (1,5 mg/Kg; i.p.) ou veículo (solução salina 0,9% + tween 80 0,2%;

i.p.). Os animais foram colocados em uma caixa (50 × 50 × 50 cm) dividida em 16

quadrantes e a atividade locomotora espontânea foi avaliado 30, 60 e 90 min,

durante 3 min, após o tratamento, sendo quantificado o número de quadrantes

percorridos pelos animais (ASAKURA et al., 1993) (Figura 17).

Figura 16. Resumo esquemático do teste da coordenação motora (Rota-rod). Fotos: Renan G. Brito.

γ0’ 60’ 90’


CT (25, 50 e 100 mg/Kg; i.p.) Diazepam (1,5 mg/Kg; i.p.)

Tempo de permanência

Seleção dos animais 24 h

45

4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA

4.6.1 Pleurisia induzida por carragenina

A carragenina é um polissacárido obtido a partir de diferentes algas marinhas.

A injecção de carragenina acarreta um processo inflamatório localizado,

sensibilizando os nociceptores aferentes primários. A indução de inflamação com

carragenina é um modelo clássico e tem sido amplamente utilizado para o

desenvolvimento de fármacos anti-inflamatórios (URBAN; GEBHART, 1999;

CHATTOPADHYAY et al., 2012).

A pleurisia foi induzida através de injecção intratorácica de carragenina (300

g; 0,1 mL) diluída em solução salina estéril. Grupos de seis animais foram pré-

tratados com CT (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.), solução salina ou indometacina (10

mg/kg, i.p.) 30 min antes da injecção do agente inflamatório. Quatro horas após a

estimulação, os animais foram eutanasiados em câmara de CO2, as cavidades

pleurais foram abertas e lavadas com 1 mL de solução salina tamponada (PBS; 1x)

contendo EDTA (10 mM) (Figura 18).

Figura 17. Resumo esquemático do teste da movimentação espontânea. Fotos: Renan G. Brito.

γ0’ 60’ 120’


CT (25, 50 e 100 mg/Kg; i.p.) Diazepam (1,5 mg/Kg; i.p.)

Número de quadrantes (3 min)

46

4.6.2 Quantificação de leucócitos

A contagem de leucócitos totais recolhidos no lavado pleural foi realizada em

câmara de Neubauer em microscópio óptico. As amostras foram diluídas (40x) em

solução de Turk. A análise diferencial de leucócitos foi feita com microscópio de luz

com objetiva de imersão em esfregaços citocentrifugados com corante de May-

Grunwald-Giemsa, onde foram contadas 100 células por lâmina (Figura 19).

4.6.3 Quantificação de TNF-α

4.6.3 Quantificação de TNF-α

A quantidade de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) produzido na cavidade

pleural foi avaliado 4 horas após a injecção de carragenina. O lavado pleural

recuperado foi centrifugado a 770 xg durante 10 min. TNF-α foi quantificado no

Ressuspensão e diluição (10 L em 400 L de solução de Turk) do

precipitado.

nº de cél./mL = nº de cél. x fator de diluição x fator de correção da

câmara x vol. de ressuspensão.

Figura 18. Resumo esquemático da pleurisia induzida por carragenina.

Figura 19. Resumo esquemático da quantificação de leucócitos.


CT (25, 50 e 100 mg/Kg; i.p.) Indometacina (10 mg/kg; i.p.)

Carragenina γ00 g (0,1 mL; i.t.)

Eutanásia

Lavagem da pleura: 1 mL de PBS + EDTA

(10 mM)

Coleta e centrifugação do fluito

Câmara de CO2

γ0’ 4 h

47

sobrenadante isento de células através de um ensaio imunoenzimático (ELISA),

seguindo o protocolo do fabricante (BD-Bioscience Pharmingen) (Figura 20).

4.6.4 Geração de óxido nítrico por macrófagos

Uma suspensão de macrófagos peritoneais (5 x 106 células/100 L) foi

incubada em microplacas de 96 poços com 100 L de CT (1, 10 e 100 g/mL) ou

meio de cultura RPMI-1640, durante 24 horas a 37 °C com 5% CO2. Como controle

positivo utilizou-se 100 L de uma solução de LPS de 1 g/mL. Após incubação,

alíquotas de 100 l de sobrenadantes de cultura foram misturados com 100 l de

reagente de Griess (sulfanilamida 0,1%, N-naftil-etilenodiamina e 0,1% de ácido

fosfórico 3%). Após 10 min, à temperatura ambiente, a absorvância foi lida a 540 nm

em leitor de ELISA. Os dados foram expressos como a concentração ( M) de nitrito

por meio de uma curva padrão conhecida, com concentrações molares de NaNO2

em meio RPMI-1640 (GREEN et al., 1982). Os resultados foram obtidos a partir de

culturas em triplicata (Figura 21).

Coleta do fluido pleural

Centrifugação (770 rpm por 10 min)

Sobrenadante ensaio imunoenzimático

Leitor de elisa

5% CO2

24 h 24 h 37 ºC LPS

(1 g/mL)

Sobrenadante (100 L) +

Reagente de Griess (100 l)

Macrófagos (5 x 106 células/ 100 L)

CT (1, 10 e 100 g/mL) Meio de cultura (RPMI)

Leitor de elisa

Figura 20. Resumo esquemático da quantificação de TNF-α.

Figura 21. Resumo esquemático da geração de óxido nítrico por macrófagos.

48

4.7 AVALIAÇÃO DA AÇÃO CENTRAL

4.7.1 Perfusão, crioproteção e corte dos encéfalos

Grupos de seis animais foram tratados com CT (25, 50 e 100 mg/kg; i.p.),

veículo (solução salina 0,9% + tween 80 0,2%; i.p.). Noventa minutos após o

tratamento, os animais foram anestesiados com cetamina (80 mg/kg; i.p.) e xylazina

(8 mg/kg; i.p.) para perfusão intracárdica, a qual consiste na injeção, no ventrículo

esquerdo, de uma agulha sem bizel conectada a um sistema de perfusão, que tem

por objetivo trocar o tecido sanguíneo por PBS (pH 7,4 ; 10 mM) à temperatura

ambiente, por um período de 5 min a um fluxo de 6 mL/min. Após perfusão por 5

minutos, o PBS foi substituído por uma solução de formalina tamponada 10% (pH

7,4) à temperatura ambiente, por um período de 30 min a um fluxo de 6 ml/min.

Após a perfusão, os animais foram decapitados e os encéfalos extraídos para o

processo de pós-fixação, crioproteção e congelamento. A pós-fixação consistiu em

submergir o encéfalo em formalina tamponada 10% por 2 h. Após o processo de

pós-fixação, o cérebro foi submetido ao processo de crioproteção que consiste em

transferí-lo para uma solução de sacarose 30% em tampão fosfato (pH 7,4), por 48

h. Após a crioproteção, o encéfalo foi congelado à -22 ºC, e posteriormente foram

levados ao criostato (Hestion HC4000) a -23 ºC para obtenção de secções com 20

m montadas em lâminas previamente gelatinizadas (Figura 22).

Figura 22. Resumo esquemático do processo de perfusão, crioproteção e corte. Fotos: Renan G. Brito.

48 h

2 h γ0’


CT (25, 50 e 100 mg/gg; i.p.)

Perfusão intracárdica

Extração do cérebro e pós-fixação

(formalina 10%)

Crioproteção (Sacarose 30%)

Corte (β0 m)

49

4.7.2 Imunofluorescência para Fos

O proto-oncogene, c-fos, codifica uma fosfoproteína nuclear a qual se liga ao

DNA, cuja função precisa ainda é desconhecida. O gene c-fos é expresso

constitutivamente num número limitado de tecidos e células. No entanto, a

expressão rápida e transiente do gene é induzida tanto em animais quanto em

culturas de células. Desta forma, o c-fos interfere nos eventos ocorridos a nível de

membrana, tais como a ligação de um fator de crescimento ao seu respectivo

receptor, para posterior alteração na expressão de genes, tão necessárias para a

progressão do ciclo celular (YANG et al., 1994; GUBITS; HAZELTON; SIMANTOV,

1988).

A proteína Fos é um marcador útil para o controle das atividades neuronais

das vias centrais do sistema sensorial, particularmente na via da dor. A expressão

de c-Fos pode ser estavelmente eliciada por vários estímulos nocivos, tais como

mecânicos, térmicos e químicos. Devido à modulação funcional de diferentes

populações neuronais no SNC, os padrões de expressão de c-Fos podem ser

distinguidos de acordo com diferentes estímulos nocivos (BAI et al., 2002;

MUNGLANI; HUNT, 1995).

Para a realização do protocolo de imunofluorescência para a proteína Fos,

além dos anticorpos primário e secundário, são utilizados três reagentes principais:

glicina, soro albumina bovina (BSA) e triton x-100. A reação de aldeídos, presente

no formaldeído utilizado na fixação e pós-fixação, com componentes do tecido, gera

um aumento da autofluorescência desse tecido. Objetivando a redução dessa

autofluorescência, é utilizada a glicina. Essa redução ocorre porque a glicina

alimenta o tecido com grupos amina (NH2), reduzindo o grupo -CHO a –OH

(DAVIES, 1998).

O anticorpo primário utilizado pode se ligar a sítios teciduais inespecíficos

gamaglobulinas, podendo levar a falsas interpretações. Por isso, faz-se necessário a

utilização de proteínas inertes alheias ao sistema reacional, tais como o BSA, as

quais ao competirem com os sítios de ligação inespecíficos, reduzem a reação

inespecífica, evitando a existência de reações indesejáveis (ABBAS, 2011).

O Triton X-100 é um detergente tensioativo não iônico frequentemente utilizado

em bioquímica, apresentando uma ampla gama de aplicações em sistemas

biológicos. Sua função no protocolo de imunfluorescência é a solubilização da

50

membrana plasmática, faciliando a entrada dos anticorpos nas células (PRETÉ et

al., 2002; PARTEARROYO; URBANEJA; GOÑI, 1992).

Para a execução da imunofluorescência para a proteína Fos, todas as secções

encefálicas foram processadas a temperatura ambiente (22 ºC) e lavadas em PBS

(pH 7,4; 5 x 5 min) após cada etapa de exposição aos reagentes, a qual teve início

com a lavagem em glicina (0,01 M) diluída em PBS, por 10 min, para reduzir a

autofluorescência do tecido. Em seguida, as ligações para gamaglobulina foram

bloqueadas com BSA (2%) em PBS por 30 min. Após a realização dessas etapas

para bloqueio de reações inespecíficas, seguiram-se as incubações com os

anticorpos primários e secundários. As secções encefálicas foram incubadas com o

anticorpo primário policlonal produzido em coelho, específico contra a proteína Fos

(SC 52, Santa Cruz Biotechnologies, USA), diluído 1/2000 em PBS, triton (0,2%) e

BSA (1%), por 16 h. Em seguida, os cortes foram expostos ao segundo anticorpo

(anti-IgG de coelho produzido em jumento e conjugado com Alexa Fluor 594), diluído

1/2000 em PBS, por 2 h. Finalmente, os cortes foram montados em solução de

glicerol (89% glicerol + 1% DABCO + 10% PBS) (Figura 23).

4.7.3 Aquisição das imagens

Todas as regiões encefálicas foram avaliadas e as secções contendo

neurônios marcados positivamente para Fos foram classificadas em regiões de

acordo com o Atlas Paxinos & Watson (1997) e fotografadas, bilateralmente,

Figura 23. Resumo esquemático do protocolo de imunofluorescência para proteína Fos. Fotos: Renan G. Brito.

5 x 5’ 2 h 5 x 5’ 16 h γ0’ 5 x 5’ 10’ 5 x 5’

PBS Glicina (0,01 M)

PBS BSA (2%)

Anticorpo Fos BSA (1%)

Triton (0,2%)

PBS Alexa Flúor

PBS Montagem em lâminas

51

utilizando-se um microscópio de fluorescência (Olympus IX2-ICB; E.U.A.) com

câmera digital (XM-10) (Figura 24).

4.7.4 Análise das imagens

Nas fotomicrografias das regiões encefálicas de cada animal, foi contado o

número de neurônios Fos positivos. Após a contagem dos neurônios, foi calculada

uma média aritmética do número de neurônios marcados em cada região de cada

animal. Dessa forma, cada animal apresentou um valor médio de neurônios

marcados para cada uma das regiões marcadas positivamente para Fos. Em

seguida, foi calculada, novamente, outra média aritmética (média do grupo) a partir

das médias obtidas de cada animal, encontrando-se o valor médio de neurônios Fos

positivos por grupo.

Para análise quantitativa das marcações, foi utilizada uma macro no programa

computacional Image J® (programa computacional disponibilizado gratuitamente

pelo National Institute of Health, EUA - http://rsb.info.nih.gov/nih-image/) que viabiliza

as contagens automáticas do número de neurônios marcados para Fos, utilizando-

se, assim, um controle matemático para evitar o viés.

4.8 EUTANÁSIA E DESCARTES DOS ANIMAIS

Após a eutanásia dos animais, as carcaças foram depositadas em sacos

plásticos apropriados e armazenadas no freezer de coleta de material biológico,

Figura 24. Microscópio de fluorescência Olympus IX2-ICB, EUA. Foto: Renan G. Brito.

52

situado no Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia da UFS, para posterior

recolhimento durante a coleta de lixo hospitalar. Os resíduos perfurocortantes foram

armazenados em caixas adequadas e levados até o Hospital Universitário para

descarte junto ao material hospitalar.

4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram expressos em média ± e.p.m. A normalidade das amostras

foram avaliadas através do teste de Shapiro-Wilk e as diferenças entre os grupos

foram analisadas através do teste de variância ANOVA, uma via, seguido pelo teste

de Tukey, utilizando-se o software Graph Pad Prism 5.0® (San Diego, EUA). Valores

de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

53

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA

A administração intraperitoneal de CT (25, 50 ou 100 mg/kg; i.p.), trinta minutos

antes da injecção do ácido acético, produziu uma diminuição significativa (p <0,001),

das contorções abdominais (Figura 25). O paracetamol (100 mg/kg, i.p.), utilizado

como controle positivo, também produziu uma redução significativa do

comportamento nociceptivo.

0

5

10

15

20

Veículo 25 50 100 100

CT (mg/kg) PAR (mg/kg)

***

*** ******

Nº

de

con

torç

ões

ab

do

min

ais

Figura 25. Efeito do citronelol (CT) no teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético em camundongos. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/kg) ou paracetamol (PAR, 100 mg/kg) foram administrados intraperitonealmete 30 min antes da injeção de ácido acético. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 8, por grupo). ***p <0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).

O teste das contorções abdominais induzida por ácido acético é simples e

sensível para aferição da analgesia induzida tanto por opióides quanto por

analgésicos de ação periférica (HAYES; SHEEHAN; TYERS, 1987). Segundo LE

BARS; GOZARIU; CADDEN, (2001) a nocicepção induzida pela injeção de ácido

acético na cavidade peritoneal produz episódios característicos por movimentos de

alongamento (contorção), sendo a redução do número destes episódios facilmente

quantificável. A diminuição das contorções abdominais observada no presente

estudo pode ser justificada pelo fato do CT participar na inibição da síntese de

54

prostaglandinas, agindo, assim, sobre os mecanismos nociceptivos de

processamento ou de liberação de metabolitos do ácido araquidônico através da

COX e da biossíntese de prostaglandinas (GUIMARÃES et al., 2010).

O efeito de CT na nocicepção induzida por formalina em camudongos. O pré-

tratamento com CT (25, 50 ou 100 mg/kg) por via intraperitoneal, 30 min antes da

injeção formalina, causou um efeito antinociceptivo significativo (p < 0,01 ou p <

0,001) em ambas as fases (Figura 26). A morfina também causou uma ação

antinociceptiva significante em ambas as fases (p <0,001).

Veículo 25 50 100 30

10

20

30

40

50

60

CT (mg/kg)

A

*** ***

***

**

MOR (mg/kg)

Tem

po

de

lam

bid

a (s

)

Vehicle 25 50 100 30

25

50

75

100

125

CT (mg/kg)

B

****** ******

MOR (mg/kg)

Tem

po d

e la

mbi

da (

s)

Figura 26. Efeito do citronelol (CT) na nocicepção induzida por formalina em camudongos. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/kg) ou Morfina (MOR, 3 mg/kg) foram administrados intraperitonealmente 30 min antes da injeção de formalina. (A) representa a primeira fase e (B) representa a segunda fase do teste da formalina. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 6, por grupo). ** p <0,01 ou *** p <0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).

55

O formaldeído diluído (1-8%), administrado por via subcutânea, produz um

comportamento nociceptivo que consiste em uma resposta bifásica: uma resposta

de curta duração designada por fase precoce e uma fase mais longa, causada por

um processo inflamatório, chamada de fase tardia (TJØLSEN et al., 1992; MOGIL,

2009; LUCCARINI et al., 2006). O componente bifásico da nocicepção induzida por

formaldeído reflete diferentes mecanismos subjacentes. A primeira fase parece estar

relacionada à estimulação química direta de terminações nervosas livres

nociceptivas, provavelmente um resultado direto da estimulação na pata, refletindo a

dor centralmente mediada com a liberação de substância P (LE BARS; GOZARIU;

CADDEN, 2001; RABOISSON; DALLEL, 2004), enquanto a segunda fase depende

de uma combinação de entradas contínuas de aferentes nociceptivos, devido à

liberação de aminoácidos excitatórios como, PGE2, óxido nítrico (NO) e de

taquiquininas, cininas, entre outros peptídeos (OKUSE, 2007; CAPUANO et al.,

2009). De acordo MOGIL, (2009) o teste de formalina é conhecido por atuar como

agonista do receptor TRPA1. Além disso, o NMDA contribui para o estímulo químico

persistente durante a fase tardia de sensibilização central dos neurônios do corno

dorsal da medula (HUNTER; SINGH, 1994). A maioria das drogas capazes de

reduzir a excitabilidade de neurônios da medula espinhal, incluindo os opióides,

AINEs e antagonistas do glutamato, também pode reduzir ou mesmo eliminar o

comportamento nociceptivo (HERRERO; LAIRD; LÓPEZ-GARCÍA, 2000), assim

como observado com o CT, o qual reduziu significativamente as duas fases do teste

da formalina.

No teste da placa quente, o tempo de reação aumentou significativamente em

todas as doses de CT (p <0,05 ou p <0,001) quando comparado ao controle.

Resultados semelhantes foram observados para o tratamento com morfina (3 mg/kg,

i.p.). Observou-se, ainda, que a naloxona (NAL, 1,5 mg/kg, i.p.) antagonizou a

resposta antinociceptiva da morfina (MOR) quando comparado com o grupo controle

no teste da placa quente. Da mesma forma, a naloxona antagonizou o efeito da CT

(100 mg/kg) quando comparado com o controle (tabela 2).

Substâncias que produzem um forte efeito de inibição no teste de placa

quente podem inibir a dor induzida centralmente e atuam como analgésicos fortes

(PARKHOUSE, 1979; LE BARS; GOZARIU; CADDEN, 2001). Os resultados

sugerem que o CT, em todas as doses testadas, apresenta um efeito analgésico

central, fato evidenciado pelo aumento no tempo de resposta quando os animais

56

foram submetidos ao estímulo nociceptivo durante o teste. Esta ação analgésica

central foi confirmada através do bloqueio do efeito antinociceptivo do CT pela

naloxona, um antagonista específico dos receptores opióides (MUNDEY et al.,

2000).

Tabela 2. Efeito antinociceptivo do citronelol (CT) no teste da placa quente em camudongos. Tratamento Dose

(mg /kg)

Tempo de reação (s)a

Basal 30 min 60 min 90 min 120 min

Veículo - 10,3 ± 1,6 9,6 ± 1,1 8,1 ± 0,9 7,1 ± 0,3 9,0 ± 1,2

CT 25 8,0 ± 0,8 11,6 ±1,2 13,1 ± 1,7 15,8 ± 3,1b 19,0 ± 3,0b

CT 50 4,8 ± 0,6 15,8 ± 1,5b 17,5 ± 1,8d 17,3 ± 0,9c 19,5 ± 2,3b

CT 100 8,3 ± 0,9 16,0 ± 2,1b 15,3 ± 0,8c 15,6 ± 1,7b 22,0 ± 1,0c

CT + NAL 100 + 0.5 8,5 ± 0,7 8,1 ± 1,0 9,1 ± 1,1 7,5 ± 0,9 9,6 ± 1,3

MOR 3 9,2 ± 1,8 28,9 ± 2,3d 28,3 ± 1,5d 30,0 ± 0,0d 29,3 ± 2,1d

MOR + NAL 3 + 0.5 8,9 ± 2,2 10,3 ± 2,8 9,5 ± 3,7 9,9 ± 3,9 10,4 ± 5,5

n = 10, por grupo; a Valores expressos em media ± e.p.m; bp < 0,05, cp < 0,01 e dp < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).

5.2 TESTES OROFACIAIS DE NOCICEPÇÃO

A administração de CT, nas doses, produziu uma redução significativa (p <

0,001) no tempo de fricção da região orofacial no teste da nocicepção orofacial

induzida por formalina quando comparado ao controle (Figura 27).

Veículo 25 50 100 50

25

50

75

100

CT (mg/kg)

*** ***

***

***

A

MOR (mg/kg)

Fri

cção

da

reg

ião

oro

faci

al (

s)

57

Veículo 25 50 100 50

60

120

180

240

CT (mg/kg)

******

******

B

MOR (mg/kg)

Fri

cção

da

reg

ião

oro

faci

al (

s)

Figura 27. Efeitos do CT sobre o teste da nocicepção orofacial induzida por formalina. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/kg) ou morfina (MOR, 5 mg/kg) foram administrados intraperitonealmente 30 min antes da injeção de formalina. (A) primeira fase (0-5 minutos) e (B) segunda fase (15 a 40 minutos). Valores expressos em média e.p.m. (n = 6, por grupo). ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).

O teste de nocicepção orofacial induzida por formalina representa um modelo

animal de nocicepção cutânea persistente na região trigeminal. Nesse teste a

resposta comportamental expressa pelo animal difere acentuadamente do que é

observado nos ensaios mais comuns, em que a pata traseira é estimulada. As vias

que controlam essas respostas motoras são distintas, o que ajuda a compreender as

diferenças nos processos de informação nociceptiva entre as regiões da coluna

vertebral e do trigêmeo, sendo possível examinar diferentes níveis de integração do

mesmo estímulo nocivo nos sistemas nervosos periférico e central (RABOISSON;

DALLEL, 2004). Desta forma, a inibição do comportamento nociceptivo pelo CT,

observada no presente estudo, torna tal monoterpeno uma substância

possivelmente útil no tratamento de processos nociceptivos na região trigeminal.

O CT, em todas as doses, também reduziu, de forma significativa (p < 0,001),

o tempo de fricção da região orofacial no teste da nocicepção orofacial induzida pela

administração de capsaicina (Figura 28).

58

Veículo 25 50 100 50

50

100

150

200

250

*** ****** ***

CT (mg/kg) MOR (mg/kg)

Fri

cção

da

reg

ião

oro

faci

al (

s)

Figura 28. Efeitos do CT sobre a nocicepção orofacial induzida por capsaicina. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/ kg) ou morfina (MOR, 5 mg/kg) foram administrados intraperitonealmente 30 min antes da injeção de capsaicina. Valores expressos em média e.p.m. (n = 6, por grupo). ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).

A capsaicina tem ação seletiva sobre as fibras sensitivas que transmitem

sensações de dor e provocam vasodilatação reflexa do axônio, a qual resulta da

ativação do receptor vanilóide 1, um canal iônico sensível ao calor presente em

neurônios sensoriais de pequeno diâmetro. A injeção de capsaicina também é capaz

de aumentar a excitabilidade dos neurônios nociceptivos trigeminais (PELISSIER;

PAJOT; DALLEL, 2002). Esta inibição observada tanto no teste da capsaicina

quanto no teste da formalina pode ser resultado de uma inibição da substância P ou

do bloqueio do receptor neuroquinina 1 (NK-1) (HOLANDA PINTO et al., 2008), pois

estudos demonstraram que a administração de um antagonista de NK-1 é capaz de

bloquear a segunda fase do teste de formalina (LUCCARINI et al., 2003).

Os resultados do teste de nocicepção orofacial induzida pelo glutamato. O

CT, em todas as doses, promoveu uma redução significativa (p <0,01 ou p <0,001)

do tempo de fricção da região orofacial (Figura 29).

59

Veículo 25 50 100 50

25

50

75

100

CT (mg/kg)

*****

******

MOR (mg/kg)

Fri

cção

da

reg

ião

oro

faci

al (

s)

Figura 29. Efeitos do CT sobre a nocicepção orofacial induzida por glutamato. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/ kg) ou morfina (MOR, 5 mg/kg) foram administrados intraperitonealmente 30 min antes da injeção de capsaicina. Valores expressos em média e.p.m. (n = 6, por grupo). **p < 0,01 e ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).

O glutamato é capaz de ativar os nociceptores aferentes primários após a sua

liberação a partir de tecidos inflamados, uma vez que a administração de cetamina,

um antagonista do receptor NMDA, na articulação temporomandibular (ATM),

provocou uma atenuação significativa da dor induzida por glutamato (HONDA et al.,

2011). Assim, a inibição da nocicepção induzida por glutamato por meio do

tratamento com CT pode estar associada com a sua interação com o sistema

glutamatérgico.

Além disso, como a inibição da excitabilidade neuronal está associada ao

bloqueio dos canais de Na+, DE SOUSA et al. (2006) mostraram que o CT foi capaz

de reduzir a excitabilidade dos nervos isolados através de uma diminuição do

potencial de ação composto (CAP) de amplitude. Vários estudos sugerem que a

avaliação do CAP permite analisar a ação de novas substâncias sobre os canais de

Na+ e sobre a condutância elétrica de fibras mielinizadas (DE SOUSA et al., 2006;

QUINTANS-JÚNIOR et al., 2010). Desta forma, este efeito poderia estar

influenciando a resposta antinociceptiva do CT observada nos modelos

experimentais de nocicepção utilizados neste estudo.

60

5.3 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA

No teste rota rod, os animais tratados com CT não apresentaram qualquer

alteração significativa no desempenho motor nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg

(Figura 30). Entretanto, conforme esperado, o diazepam (DZP), drogra depressora

do SNC, reduziu o tempo em que os animais permaneram no rota rod quando

comparado ao controle.

Veículo 25 50 100 DZP Veículo 25 50 100 DZP Veículo 25 50 100 DZP0

50

100

150

200

CT (mg/kg) CT (mg/kg) CT (mg/kg)

0,5 h 1 h 2 h

******

***

Tem

po (s

) no

Rot

a ro

d

Figura 30. Tempo de permanência (s) no rota rod. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/kg) ou Diazepam (DZP; 1,5 mg/kg) foram admnistrados intraperitonealmente trinta minutos antes do início do teste. A resposta motora foi avaliada por 180 s. Valores expressos em média e.p.m. (n = 6, por grupo). ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).

No teste de movimentação espontânea, os animais tratados com as diferentes

doses de CT não apresentaram redução significativa da locomoção espontânea

(número de cruzamentos) nos tempos de 30, 60 e 120 min após a administração, ao

contrário do DZP, que reduziu significativamente o número de cruzamentos ( p <

0,001) (Tabela 3).

Levando-se em consideração o efeito antinociceptivo do CT observado no

teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético, no teste da formalina,

no teste da placa quente e nos testes de nocicepção orofacial, decidiu-se, também,

examinar os efeitos do CT sobre o desempenho motor no teste do Rota rod, uma

vez que estudos anteriores sugeriram que a depressão do SNC e os efeitos de

relaxamento muscular não específicos podem reduzir a coordenação motora e

61

invalidar os resultados obtidos nos testes comportamentais (LE BARS; GOZARIU;

CADDEN, 2001; RABOISSON; DALLEL, 2004). Desta forma, os resultados do

presente estudo não mostraram qualquer interferência, nas doses testadas, na

coordenação motora dos animais, eliminando-se, assim, a possibilidade da

existência de um efeito de relaxamento muscular inespecífico gerado pelo CT nas

doses utilizadas. Para descartar qualquer possibilidade de interferência do CT sobre

a atividade motora dos animais, consolidando os efeitos nociceptivos, foi avaliado,

ainda, o efeito do CT na movimentação espontânea no campo aberto. Os resultados

mostraram que o CT, mais uma vez, não foi capaz de alterar a coordenação motora

dos animais, nas doses avaliadas. Este resultado confirma que a hipótese da ação

antinociceptiva do CT observada neste estudo não é resultado de uma possível ação

depressora dos centros que coordenam a atividade motora do animal a nível de

SNC.

Tabela 3. Efeitos do citronelol (CT) sobre a movimentação espontânea em camudongos

Tratamento Dose

(mg/kg)

Número de cruzamentosa

γ0’ 60’ 1β0’

Veículo - 47,6 ± 6,4 31,8 ± 1,7 26,0 ± 2,8

CT 25 57,6 ± 5,9 39,3 ± 3,1 29,5 ± 3,9

CT 50 36,1 ± 2,2 27,5 ± 3,6 24,6 ± 4,3

CT 100 40,6 ± 7,6 31,0 ± 2,9 26,3 ± 2,9

DZP 1,5 0,6 ± 0,3*** 0,5 ± 0,2*** 2,6 ± 0,8***

n = 6, por grupo. aValores expressos em media ± e.p.m. ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).

5.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA

A administração de carragenina na cavidade pleural induziu um aumento no

número de leucócitos caracterizado por um aumento no número de neutrófilos 4 h

após a injeção. O tratamento com CT (25, 50 e 100 mg/kg; i.p.) causou uma

diminuição dose dependente significativa no número total de leucócitos quando

administrado 0,5 h antes da carragenina (Figura 31A). Tal redução foi atribuída à

62

inibição do influxo de neutrófilos (Figura 31B). Entratanto, o CT não alterou a

migração mononuclear (Figura 31C). A injecção de carragenina também leva um

aumento substancial na produção de TNF-α no exsudato pleural quando comparado

com o grupo controle (Figura 31D). Uma redução significativa nos níveis de TNF-α

foi observada nos grupos tratados com CT (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) quando

comparado ao controle (Figura 31D).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Citronelol (mg/kg) Indo

Carragenina (300 g/cavidade)

Salina Veículo 25 50 100 10

*****

***

***

++

Leu

cóci

tos

tota

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06

célu

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cavi

dad

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0.0

2.5

5.0

7.5

10.0




+++

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******

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0

1

2

3

4

5




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ula

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06

célu

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cavi

dad

e)

0

100

200




++

**

**

TN

F-

(ng

/mL

)

A B

C D

Figura 31. Efeito do CT sobre a pleurisia induzida por carragenina. As análises foram realizadas 4 h após a injecção de carragenina (300 ng/cavidade), avaliando-se o recrutamento de leucócitos totais (A), neutrófilos (B), células mononucleares (C) e TNF-α (D). Os dados foram expressos em média ± e.p.m (n = 8/ por grupo). ++p < 0,01 e +++p < 0,001 em comparação ao controle. *p < 0,05, ** p < 0,01 e ***p < 0,001 em comparação ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).

Os macrófagos peritoneais estimulados com LPS durante 24 horas liberaram

uma quantidade significativa (p < 0,01) de nitrito quando comparado as células não

estimuladas. O pré-tratamento das células com CT (1 e 100 g/mL) inibiu

significativamente (p < 0,05) a liberação de nitrito (Figura 32).

63

0

5

10

15

20

25

RPMI Veículo 25 50 100

Citronelol (mg/kg)

LPS (1 g/mL)

++

**

Pro

du

çã

o d

e n

itri

to ( M

)

Figura 32. Efeito do CT na geração de nitrito por macrófagos. As células foram mantidas em meio de cultura (RPMI) ou pré-incubadas com CT por 24 horas, e em seguida tratado com LPS (1 ng/mL) durante 24 h. Os níveis de nitrito nos sobrenadantes de cultura foram avaliadas e os resultados foram expressos em concentração (uM) de nitrito no meio de cultura. Os dados foram expressos em a média ± e.p.m., sendo os valores obtidos em triplicado. ++p <0,01 em comparação com o RPMI e *p < 0,05 quando comparado ao controle (veículo)(ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).

A pleurisia induzida por carragenina é um modelo de inflamação aguda em

que o extravasamento de líquidos, a migração leucocitária e os diversos parâmetros

bioquímicos envolvidos na resposta inflamatória, tal como o TNF-α, podem ser

facilmente medidos nos exsudados (MIKAMI; MIYASAKA, 1983; LORAM et al.,

2007). O CT inibiu a migração de neutrófilos induzida por carragenina, podendo, sua

ação, estar associada à inibição da síntese de vários mediadores inflamatórios

envolvidos na migração de células, como TNF-α. Além disso, o CT também reduziu,

nas doses de 25 e 100 mg/kg) os níveis de nitrito, o que pode indicar uma redução

na produção de óxido nítrico (NO), um importante mediador envolvido em condições

dolorosas inflamatórias. Estes resultados corroboram com SU et al. (2010) que

mostraram que o CT inibiu a atividade enzimática da iNOS e foi capaz de reduzir

significativamente a expressão da proteína COX-2 e do mRNA induzidos por LPS.

5.5 AVALIAÇÃO DA AÇÃO CENTRAL

No bulbo olfatório (Figura 33), córtex piriforme (Figura 34), córtex

retroesplenial (Figura 35) e na substância cinzenta periaquedutal (Figura 36), o

64

número médio de neurónios marcados positivamente para proteína Fos aumentoui

significativamente (p < 0,05) noventa minutos após a injeção intraperitoneal de CT

quando comparado ao controle (veículo). No entanto, o CT na dose de 25 mg/kg não

alterou significativamente o número médio de neurônios marcados para proteína Fos

no córtex piriforme quando comparado ao controle.

Veículo 25 50 1000

10

20

30

40

CT (mg/kg)

**

***

***

Cél

ulas

FO

S P

osit

ivas

A

Figura 33. A. Células FOS positivas no bulbo olfatório. Veículo (B; controle) ou CT nas doses de 25 mg/Kg (C), 50 mg/Kg (D) e 100 mg/kg (E), i.p., foi administrado noventa minutos antes da perfusão. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 6/por grupo). **p < 0,01 ou ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA uma via seguido pelo Teste de Tukey). Aumento: 20x. Escala: 20 m.

Figura 34. A. Células FOS positivas no córtex piriforme. Veículo (B; controle) ou CT nas doses de 25 mg/Kg (C), 50 mg/Kg (D) e 100 mg/kg (E), i.p., foi administrado noventa minutos antes da perfusão. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 6/por grupo). **p < 0,01 quando comparado ao controle (ANOVA uma via seguido pelo Teste de Tukey). Aumento: 20x. Escala: 20 m.

Veículo 25 50 1000

10

20

30

CT (mg/kg)

** **

Cél

ulas

FO

S p

osit

ivas

A

65

A ativação de neurônios nociceptivos aferentes primários estimula a

expressão de proteínas codificadas pelos genes de expressão imediata, a exemplo

da proteína Fos, a qual é codificada pelo gene c-Fos. A expressão destas proteínas

Figura 35. A. Células FOS positivas no córtex retroespinal. Veículo (B; controle) ou CT nas doses de 25mg/Kg (C), 50 mg/Kg (D) e 100 mg/kg (E), i.p., foi administrado noventa minutos antes da perfusão. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 6/por grupo). **p < 0,01 ou ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA uma via seguido pelo Teste de Tukey). Aumento: 20x. Escala: 20 m.

Figura 36. A. Células FOS positivas na substância cinzenta periaquedutal. Veículo (B; controle) ou CT nas doses de 25 mg/Kg (C), 50 mg/Kg (D) e 100 mg/kg (E), i.p., foi administrado noventa minutos antes da perfusão. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 6/por grupo). *p < 0,5 ou ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA uma via seguido pelo Teste de Tukey). Aumento: 20x. Escala: 20 m.

Veículo 25 50 1000

10

20

30

CT (mg/kg)

**

******

Cél

ula

s F

OS

po

siti

vas

A

Veículo 25 50 1000

10

20

30

CT (mg/kg)

*

*** ***

Cél

ulas

FO

S p

osit

ivas

A

66

que controlam a transcrição dos genes alvo é desencadeada pela excitação

sináptica das fibras nociceptivas A e C. Desta forma, a proteína Fos é rapidamente

expressa em neurônios centrais após estímulos nocivos, sendo utilizada, através da

realização de técnicas de imunohistoquímica e imunofluorescência, como um

marcador para a visualização das vias e áreas centrais envolvidas na nocicepção

(COGGESHALL, 2005).

No presente estudo, foi realizado o protocolo de imunofluorescência para

proteína Fos objetivando avaliar a ação do CT sobre as regiões centrais envolvidas

na nocicepção, demonstrando-se uma ativação significativa do bulbo olfatório, córtex

piriforme, córtex restroesplenial e da substância cinzenta periaquedutal. O bulbo

olfatório projeta-se para córtex piriforme não apresentando qualquer aparente

organização espacial. As células mitrais e do glomérulo do bulbo olfativo inervam

diversas e grandes regiões do córtex piriforme (LEINWAND; CHALASANI, 2011). O

córtex piriforme também recebe informações da amígdala e hipocampo e projeta

seus axônios para a própria amígdala e para o hipotálamo, áreas relacionadas com

o comportamento agressivo e de acasalamento dos animais (SEMBA, 2000).

O córtex retroesplenial (RSP) se projeta para o núcleo anterior ipsilateral

pretectal (APTN), uma estrutura implicada na antinocicepção, que envolve

resceptores locais muscarínicos, colinérgicos, opióides e serotoninérgicos

(ROSSANEIS; REIS; PRADO, 2011). REIS et al. (2010) demonstraram que a

estimulação elétrica do córtex occipital ou RSP induz antinocicepção em ratos nos

testes de retirada da cauda e da formalina. Esta ação ocorre, provavelmente, devido

à capacidade do RSP ativar o APTN e, consequentemente, estimular a ativação da

via descendente da dor, que descende pelo funículo dorsolateral para inibir os

neurônios da lâmina V (FOSTER et al., 1989; ROBERTS; REES, 1986).

A substância cinzenta periaquedutal (PAG) circunda o aqueduto

mesencefálico e desempenha um papel fundamental na via descedente inibitória da

dor, a qual modula a informação nociceptiva por meio da ativação de vias que atuam

na inibição dos neurônios sensoriais presentes na medula espinhal. Mais

especificamente, a PAG faz conexões com o núcleo magno da rafe, com o

paragigantocelular e com os núcleos da medula rostroventromedial, e em seguida,

projeto-se através do funículo dorsolateral para a medula espinhal (DESANTANA et

al., 2009; GUIMARÃES; PRADO, 1999). Dessa forma, a ativação da PAG exerce

efeito antinociceptivo e inibe as respostas de neurônios espinhais a estímulos

67

nociceptivos centrais e periféricos (ZUBRZYCKA; SZEMRAJ; JANECKA, 2011). A

antinocicepção evocada a partir da PAG é mediada pelos receptores opióides e

pode ser atenuada pela administração simultânea de um antagonista de opióides,

tais como a naloxona (AKIL; MAYER; LIEBESKIND, 1976; JENSEN; YAKSH, 1986).

O efeito antinociceptivo da CT, descrito no presente estudo, é bloqueado pela

administração de naloxona no teste da placa quente, sugerindo-se, assim, que o CT

ativa a via descendente inibitória da dor, fato evidenciado pelo aumento significativo

do número de células Fos positivas observadas na PAG através do protocolo de

imunofluorescência para proteína Fos, sendo tal ativação mediada, provavelmente,

por receptores opióides centrais.

Os canais de sódio voltagem-dependentes são fundamentais na regulação da

excitabilidade dos neurônios e a expressão desses canais pode facilitar a

transmissão nociceptiva, ou seja, a expressão contínua desses canais pode ser um

dos principais contribuintes para a sensibilização de neurônios aferentes primários e,

consequente, geração de dor (SCHUELERT; MCDOUGALL, 2012). Desta forma, o

bloqueio dos canais de sódio pode facilitar a ativação da via descendente inibitória

da dor, através da ativação de receptores opióides presentes na PAG, uma vez

que estudos vêm descrevendo que o efeito antinociceptivo oriundo da ativação dos

receptors opióides pode estar relacionado com a inibição dos canais de sódio (LI;

BACCEI, 2011; KANG et al., 2009). Diante disso, pode-se sugerir que o CT pode

estar facilitando a ativação da via descendente inibitória da dor tanto pelo bloqueio

do canais de sódio, conforme descrito por (DE SOUSA et al., 2006), quanto pela

ativação direta da PAG, conforme descrito no presente estudo.

Sendo assim, a ativação do bulbo olfatório e córtex piriforme indicam que o

CT apresenta alguma influência sobre o comportamento agressivo e de

acasalamento. Já, a ativação do RSP e da PAG sugere o envolvimento do SNC no

efeito antinociceptivo do CT, corroborando os resultados mostrados na primeira fase

do teste de formalina e no teste da placa quente.

68

6 CONCLUSÃO

Os dados apresentados no presente estudo nos permitem sugerir que o

citronelol:

apresenta ação antinociceptiva, sendo capaz de reduzir a nocicepção

orofacial em roedores;

possui ação anti-inflamatória, provalvemente mediada pela inibição de

citocinas pró-inflamatórias, a exemplo do TNF-α;

apresenta ação sobre o SNC, atuando sobre o bulbo olfatório, córtex

piriforme, córtex restroesplenial e a substância cinzenta periaquedutal (PAG),

provavelmente por sinalização opióide, visto que o efeito antinociceptivo do

citronelol foi revertido pela naloxona e que o córtex restroesplenial e o PAG

são estruturas centrais intimamente relacionadas com os mecanismos

modulatórios da dor;

nas doses utilizadas não induz qualquer tipo de incoordenação motora.

Outros estudos são necessários visando elucidar os mecanismos de ação, tanto

centrais quanto periféricos, do citronelol, assim como a ação do citronelol sobre

doenças que apresentam, como característica clínica principal, dor, podendo-se,

assim, entender melhor tal perfil analgésico sugerido para o citronelol.

69

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94

ANEXOS

95

ANEXO 1 – ARTIGO 1: CITRONELLOL, A MONOTERPENE ALCOHOL,

REDUCES NOCICEPTIVE AND INFLAMMATORY ACTIVITIES IN RODENTS

103

ANEXO 2 – ARTIGO 2: CITRONELLOL REDUCES OROFACIAL NOCICEPTIVE

BEHAVIOUR IN MICE - EVIDENCE OF INVOLVEMENT OF RETROSPLENIAL

CORTEX AND PERIAQUEDUCTAL GREY AREAS

110

ANEXO 3 - PROTOCOLO DE APROVAÇÃO NO COMITÊ DE ÉTICA EM

PESQUISA ANIMAL DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

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