avaliação da atividade citotóxica e antimalárica de análogos da ...
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Universidade Federal de Ouro Preto
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas
Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
Atividade Citotóxica de Fungos Endofíticos Associados à Clusia
arrudae Planchon & Triana (Clusiaceae)
Antonio Cesar Corrêa Silva Filho
Ouro Preto
Abril de 2013
Universidade Federal de Ouro Preto
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas
Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
Atividade Citotóxica de Fungos Endofíticos Associados à Clusia arrudae
Planchon & Triana (Clusiaceae)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Biotecnologia da Universidade
Federal de Ouro Preto, como requisito parcial
à obtenção do título de Mestre em
Biotecnologia.
Orientador: Dr Luiz Henrique Rosa
Co-orientador: Dra. Luciana Maria Silva
Ouro Preto
Abril de 2013
iii
“Todo o futuro da nossa espécie, todo o governo das
sociedades, toda a prosperidade moral e material das nações
dependem da ciência, como a vida do homem depende do ar.
Ora, a ciência é toda observação, toda exatidão, toda verificação
experimental. Perceber os fenômenos, discernir as relações,
comparar as analogias e as dessemelhanças, classificar as
realidades, e induzir as leis, eis a ciência; eis, portanto, o alvo que
a educação deve ter em mira. Espertar na inteligência nascente
as faculdades cujo concurso se requer nesses processos de
descobrir e assimilar a verdade”.
Rui Barbosa
iv
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a DEUS por ter me capacitado e me abençoado. Livrando-me de todo
mal nestas idas e vindas entre as cidades. Obrigado Senhor, Tu és fiel!
Aos meus orientadores, Dr. Luiz Henrique Rosa e Dra. Luciana Maria pela
oportunidade, paciência, confiança, ensinamentos, cobranças, correções, suporte e
incentivos. Obrigado pelos momentos agradáveis e de boa convivência. Sinto muito
honrado em fazer parte da equipe de vocês;
A minha família por sempre me apoiar e incentivar sempre. Obrigado pela paciência,
preocupação e orações. Todas as formas de carinhos foram de grande ajuda. Essa vitória
também é de vocês;
A minha avó Cezaria (minha primeira professora de biologia) e a Dindinha pelo intenso
amor e carinho. Obrigado por tudo, amo vocês!
Ao meu Pai pelo incentivo, orgulho e conselhos;
Lucas e Mariana pela convivência diária, companheirismo e orgulho;
A minha querida princesa Nana, pelo amor, cumplicidade e confiança. Obrigado por me
ajudar a vencer mais uma etapa da minha vida. Te amo! Estamos juntos, mais que perto;
Aos amigos do laboratório de Biologia Celular pelo constante incentivo, conselhos e
momentos de descontração: Aline, Camila, Heloísa, Juliana, Mariana Pedrosa, Milene,
Pedro, Rita, Vinicius;
A Josiane e Letícia pelos ensinamentos em Biologia Molecular de “última hora”;
A Flávia pela amizade, carinho, atenção e presteza;
v
Ao Quarteto Fantástico: Aristeu, Fábio e Mariana Lazarotti. Simplesmente fantástico;
Aqui tem pé e raiz;
Ao professor Carlos Rosa e toda a equipe do Laboratório de Ecologia e Biotecnologia
de Leveduras. Obrigado pelo apoio e ensinamentos técnicos;
A Laura minha “irmã cientifica” por passar pelos mesmos “problemas” que eu;
A Iara pela enorme ajuda na reta final. Além dos conselhos e aprendizados;
A Mirna pela coleta e pelos momentos de descontração ao lado do fluxo;
A República Viracopos pelo acolhimento e momentos de alegria em Ouro Preto;
Aos companheiros de mestrado em Biotecnologia e Ciências Biológicas;
A CAPES, FAPEMIG, CNPQ, UFOP, UFMG e FUNED pela estrutura e apoio
financeiro.
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Hipótese do antagonismo balanceado entre fungos endofíticos e suas plantas
hospedeiras (Schulz & Boyle 2005)....................................................................página 18
Figura 2. Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados
para 2012 por sexo, exceto pele não melanoma (INCA, 2012)..........................página 20
Figura 3. Estrutura química da campotecina (KHARWAR et. al., 2011)..........página 24
Figura 4. Estrutura química da vincristina (KHARWAR et. al., 2011)..............página
24
Figura 5. Estrutura química do paclitaxel (KHARWAR et. al., 2011)...............página 25
Figura 6. Estrutura química da podofilotoxina (KHARWAR et. al., 2011).......página 25
Figura 7- Imagens de Clusia arrudae Planchon & Triana. A e B vista geral da planta
mostrando copas e ramificações. C e D - Detalhes dos galhos com frutos imaturos.
..............................................................................................................................página 27
Figura 8. Placa inoculada com fragmentos de caule (A) e folha (B) oriundos da mesma
planta depois de três dias de incubação...............................................................página 30
Figura 9. Fotomicrografia das linhagens celulares testadas nos ensaios de viabilidade
celular...................................................................................................................página 31
Figura 11. Ensaio de viabilidade para a linhagem HUTU utilizando extratos de fungos
endofíticos nas concentrações de 30, 60, 120 e 240μg/mL após 24h de exposição. Este
extrato atingiu CI55 para265,386 µg/mL (A) e para 259,68 µg/mL (B)............página 44
Figura 12. Gráficos de frequência confeccionados a partir do software SPSS versão 19.
Relação dos números de fungo isolados e sua frequência por planta (A). Frequência do
tipo de morfotipos isolados (B). Números de isolados de planta e sua frequência(C).
Frequência dos números de isolados por planta (D). Frequência de números de isolados
vii
no caule(E). Frequência de isolados na folha(F). Software SPSS 19.0 (IBM).
....................................................................................................................página 49
Figura 13. Dendrograma confeccionado a partir do software SPSS 19.0 considerando
os 41 extratos usados nos ensaios de viabilidade celular. Extrato com ação antitumoral,
para a linhagem RKO (seta vermelha), para HUTU (setas verdes). Com ação tóxica para
WI26VA4 (setas azuis). Extrato com ação tóxica e antitumoral para HUTU e WI26VA4
(seta preta)..........................................................................................................página 50
Figura 14. Fotomicrografia de fluorescência da linhagem HUTU exposta a 240 µg/mL
de extratos de fungos endofíticos associados à Clusia arrudae.........................página 61
Figura 15. Fotomicrografia de fluorescência da linhagem RKO exposta a 240 µg/mL de
extratos de fungos endofíticos associados à Clusia arrudae.............................página 63
Figura 16. Fotomicrografia de fluorescência da linhagem HUTU exposta a 240µg/mL
de extratos de fungos endofíticos associados à Clusia arrudae usando o kit de
viabilidade LIVE/DEAD....................................................................................página 67
Figura 17. Fotomicrografia de fluorescência da linhagem HUTU exposta a 240 µg/mL
de extratos de fungos endofíticos associados à Clusia arrudae usando o kit de
viabilidade LIVE/DEAD.....................................................................................página 69
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Ensaio de viabilidade do extrato 5460 frente todas células testadas, HUTU,
RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de
exposição. A linha sombreada mostra a concentração do extrato que tem o perfil tóxico
para a linhagem testada.
..............................................................................................................................página 37
Tabela 2. Ensaio de viabilidade do extrato 5478 frente todas células testadas, HUTU,
RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de
exposição. A linha sombreada mostra a concentração do extrato que tem o perfil tóxico
para a linhagem testada.
..............................................................................................................................página 38
Tabela 3. Ensaio de viabilidade do extrato 5502 frente todas células testadas, HUTU,
RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de
exposição. As linhas sombreadas mostram a concentração do extrato que tem o perfil
tóxico para a linhagens testadas.
..............................................................................................................................página 38
Tabela 4. Ensaio de viabilidade do extrato 5533 frente todas células testadas, HUTU,
RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de
exposição. A linha sombreada mostra a concentração do extrato que tem o perfil tóxico
para a linhagem testada. .....................................................................................página 39
Tabela 5. Ensaio de viabilidade do extrato 5467 frente todas células testadas, HUTU,
RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de
exposição. A linha sombreada mostra a concentração do extrato que tem o perfil tóxico
para a linhagem testada.................................................................................................. 39
Tabela 6. Ensaio de viabilidade do extrato 5485 frente todas células testadas, HUTU,
RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de
exposição. A linha sombreada mostra a concentração do extrato que tem o perfil tóxico
para a linhagem testada................................................................................................... 40
ix
Tabela 7. Ensaio de viabilidade do extrato 5498 frente todas células testadas, HUTU,
RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de
exposição. A linha sombreada mostra a concentração do extrato que tem o perfil tóxico
para a linhagem testada................................................................................................... 40
Tabela 8. Ensaio de viabilidade do extrato 5500 frente todas células testadas, HUTU,
RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de
exposição. A linha sombreada mostra a concentração do extrato que tem o perfil tóxico
para a linhagem testada. ..................................................................................................41
Tabela 9. Relação dos extratos com atividade citotóxica e relação a sua concentração
inibitória a 50% (CI50)..................................................................................página 40
Tabela 10. Relação dos isolados de Clusia arrudae testados, em relação ao órgão de
origem, morfotipo isolado, número de fungos por planta, número de fungos por folha,
números de fungos por caule e número de morfotipos por planta. Software SPSS 19.0
(IBM) ..................................................................................................................página 50
Tabela 11. Cinco melhores sequências alinhadas no BLAST de fungos endofíticos
bioativos de Clusia arrudae, com substrato e origem de cada sequência.............página 51
Tabela 12. Extratos testados que apresentaram toxicidade acima de 50%. As linhas
sombreadas representam os extratos mais promissores................................................64
x
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
%: por cento
ATCC: American Type Culture Collection
BDA: Ágar dextrose batata
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool
cm: centímetro
CTAB: Brometo de cetil trimetilamonio
DMSO: Dimetilsulfóxido
DNA: Ácido desoxirribonucléico
dNTP: Desoxirribonucleotídeos fosfatados
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético
FUNED Fundação Ezequiel Dias
GPS: Global Positioning System
h: Hora
H2O: água
ITS: Região transcrita interna
m: metro
M: molar
MgSO4: Sulfato de magnésio
min: Minuto
mL: Mililitro
mm: Milímetro
mM: Milimolar
NaCl: Cloreto de sódio
xi
NCBI: National Center for Biotechnology Information
nm: Nanômetro
ºC: graus Celsius
OMS: Organização Mundial de Saúde
p/v: peso por volume
PCR: Reação em cadeia da polimerase
PEG: polietilenoglicol
pH: potencial hidrogeniônico
pmol: Pico mol
Q.S.P.: Quantidade suficiente para
r.p.m: Rotações por minuto
rDNA: DNA ribossomal
RNA: Ácido ribonucléico
rpm: Rotações por minuto
s: Segundo
TBE: Tris borato
U: Unidade
UFMG: Universidade Federal de Minas Gerais
UFMGCB: Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de Minas
Gerais.
UFOP: Universidade Federal de Ouro Preto
V: Volts
μg/mL: micrograma/mililitro
μg: Micrograma
μl: Microlitro
xii
RESUMO
Os fungos são organismos capazes de sobreviver isoladamente ou em relações
simbióticas com outros organismos. Nos tecidos vegetais os fungos colonizam espaços
intracelulares de plantas sem causar dano aparente ao seu hospedeiro, os quais são
chamados de endofíticos e por colonizar estes espaços e apresentar constante interação
com seu hospedeiro, estes fungos são capazes de produzir diferentes metabólitos
bioativos. O câncer, ainda hoje, é uma doença que acomete milhares de pessoas ao redor
do mundo. A busca por novos compostos com atividade antitumoral, principalmente
oriundos direta ou indiretamente de vegetais, são importantes para obtenção de
tratamentos mais eficazes e com menos efeitos colaterais. Neste estudo, 30 exemplares
de Clusia arrudae Planchon & Triana tiveram suas folhas e caules coletados e
inoculados em placas de Petri contendo meio Agar Dextrosado Batata (BDA) para
isolamento dos seus fungos endofíticos associados. Um total de 100 isolados de fungos,
agrupados em 21 morfotipos, foram obtidos; destes 63 do caule e 37 das folhas. Os
fungos obtidos foram submetidos à extração etanólica de seus metabólitos, os quais
foram avaliados quanto à capacidade de inibir as linhagens tumorais humanas HUTU
(HTB-40) e RKO (CRL-2579), bem como uma linhagem humana normal WI26VA4
(CCL-951). As linhagens celulares foram expostas aos extratos dos 41 fungos
endofíticos nas concentrações de 240, 120, 60 e 30 µg/mL (p/v) e tiveram sua
morfologia analisada por microscopia utilizando sondas fluorescentes para identificação
do núcleo, citoesqueleto e viabilidade celular. Os ensaios de citotoxicidade,
considerando a Concentração Inibitória (CI50), demonstraram que oito extratos
apresentaram atividade sobre as linhagens celulares analisadas; ao ampliar a linha de
corte para CI55, quatro extratos apresentaram tendência à toxicidade. Os fungos
produtores de extratos bioativos foram identificados por meio do sequenciamento da
região ITS do rDNA gene. Os extratos dos fungos Pleosporales sp. UFMGCB 5502,
Pleosporales sp. UFMGCB 5467, Pleosporales sp. UFMGCB 5485, Xylaria sp.
UFMGCB 5500 e Pleosporales sp. UFMGCB 5498. apresentaram toxicidade sobre a
linhagem normal de pulmão WI26VA4. Dos extratos que apresentaram toxicidade,
apenas o extrato do fungo Pleosporales sp. UFMGCB 5502 também apresentou
atividade antitumoral para a HUTU, juntamente com Pleosporales sp. UFMGCB 5478 e
Pleosporales sp. UFMGCB 5533. Para linhagem RKO, somente o extrato do fungo
xiii
Pleosporales sp. UFMGCB5460 exerceu citoxicidade. Considerando o valor de CI55, os
fungos UFMGCB 5534, UFMGCB 5539, UFMGCB 5508 UFMGCB 5489 mostraram
toxicidade para todas as linhagens. Os fungos que causam citoxicidade para a célula
RKO foram predominantemente isolados dos caules e para a célula HUTU das folhas,
independente do morfotipo encontrado. Os fungos obtidos das folhas causaram quebra
do citoesqueleto e as células permaneceram vivas quando analisadas pelo kit de
viabilidade celular. Já os fungos obtidos do caule causaram aglutinação e perda de
adesão celular e indicio de morte. A partir destes resultados podemos concluir que a
comunidade de fungos endofíticos associados a C. arrudae são capazes de produzir
metabólitos com atividade citotóxica em linhagens tumorais humanas in vitro e alguns
extratos também se mostraram tóxicos para células normais.
xiv
ABSTRACT
Fungi are organisms capable of surviving alone or in symbiotic relationships with other
organisms. In plant fungi colonize intracellular spaces of plants tissue without causing
apparent harm to their host, which are called endophytes and colonize these areas and
have constant interaction with its host, these fungi are capable of producing different
bioactive metabolites. Cancer, even today, is a disease that affects thousands of people
around the world. The search for new compounds with antitumor activity, mainly
arising directly or indirectly from plants, are important for obtaining more effective
treatments with fewer side effects. In this study, 30 specimens of Clusia arrudae
Planchon & Triana had their leaves and stems collected and inoculated in Petri dishes
containing Potato Dextrose Agar (PDA) for isolation of endophytic fungi associated
with her. A total of 100 strains of fungi, grouped into morphotypes 21 were obtained; 63
of the stem and leaves 37. The fungi were subjected to ethanol extraction of metabolites,
which were evaluated for their ability to inhibit human tumor cell lines HUTU (HTB-
40) and RKO (CRL-2579), as well as a normal human WI26VA4 line (CCL-951 .) The
cell lines were exposed to extracts of the 41 endophytic fungi at concentrations of 240,
120, 60 and 30 µg / mL (w / v) and their morphology were examined by fluorescent
microscopy using probes for identification of the nucleus, the cytoskeleton and the cell
viability. The cytotoxicity assays, considering the inhibitory concentration (IC50),
showed that eight extracts showed activity against cell lines analyzed, by increasing the
cutting line for CI55, four extracts showed a tendency to toxicity. The fungi that produce
bioactive extracts were identified by sequencing of the ITS region of rDNA gene.
Extracts of the fungus Pleosporales sp. UFMGCB 5502, Pleosporales sp. UFMGCB
5467, Pleosporales sp. UFMGCB 5485, Xylaria sp. UFMGCB 5500 and Pleosporales
sp. UFMGCB 5498. showed toxicity on normal strain WI26VA4 lung. Extracts that
were toxic, only the extract of the fungus Pleosporales sp. UFMGCB 5502 also showed
antitumor activity to the Hutu, along with Pleosporales sp. UFMGCB 5478 and
Pleosporales sp. UFMGCB 5533. For RKO line, only the extract of the fungus
Pleosporales sp. UFMGCB5460 exerted cytotoxicity. Considering the value of CI55,
fungi UFMGCB 5534, UFMGCB 5539, 5508 UFMGCB UFMGCB 5489 showed
toxicity for all strains. The fungi that cause cytotoxic to RKO cells were predominantly
of the isolated stem and leaves the cell Hutu, regardless of morphotype found. The fungi
xv
obtained from the leaves of the cytoskeleton and cause break the cells remained alive
when reviewed by Kit cell viability. Since the fungi obtained from the stem caused
clumping and loss of cell adhesion and hint of death. From these results we conclude
that the community of endophytic fungi associated with C. arrudae are capable of
producing metabolites with cytotoxic activity on human tumor cell lines in vitro and
some extracts were also toxic to normal cells.
16
Sumário
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................... 18
1.1 FUNGOS ENDOFÍTICOS ................................................................................................................... 18 1.2 CÂNCER ........................................................................................................................................ 20 1.3 METABÓLITOS BIOATIVOS PRODUZIDOS POR FUNGOS ................................................................... 22 1.4 FAMÍLIA CLUSIACEAE (LINDL.) .................................................................................................... 26 1.5 O GÊNERO CLUSIA (PLANCHON & TRIANA, 1860) ........................................................................ 27
2 OBJETIVOS.................................................................................................................................... 29
2.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................................................. 29 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................................ 29
3 METODOLOGIA ........................................................................................................................... 30
3.1 COLETA DOS ESPÉCIMES DE CLUSIA ARRUDAE ............................................................................. 30 3.2 ISOLAMENTO DOS FUNGOS ENDOFÍTICOS ...................................................................................... 30 3.3 CULTIVO DOS FUNGOS E PREPARO DOS EXTRATOS ........................................................................ 31 3.4 ENSAIOS BIOLÓGICOS .................................................................................................................... 32
3.4.1 Atividade citotóxica ............................................................................................................ 32 3.4.2 Viabilidade celular ............................................................................................................. 32
3.5 ENSAIO DE FLUORESCÊNCIA .......................................................................................................... 33 3.5.1 Kit Live/Dead ...................................................................................................................... 33 3.5.2 DAPI/Faloidina .................................................................................................................. 33
3.6 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS ........................................................................................................ 34 3.6.1 Extração do DNA total ....................................................................................................... 34 3.6.2 Amplificação utilizando os iniciadores ITS1 e ITS4 ........................................................... 35 3.6.3 Purificação dos amplicons ................................................................................................. 35
3.7 REAÇÕES DE SEQUENCIAMENTO ................................................................................................... 36 3.8 ANÁLISE COMPUTACIONAL DAS SEQUÊNCIAS ............................................................................... 37 3.9 CONSTRUÇÃO DE DENDROGRAMAS E ANÁLISE DE FREQUÊNCIA .................................................... 37
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................... 38
PRODUÇÃO DOS EXTRATOS E ENSAIOS BIOLÓGICOS ................................................................................ 38 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DOS FUNGOS ENDOFÍTICOS QUE APRESENTARAM ATIVIDADE CITOTÓXICA 54 ENSAIOS DE FLUORESCÊNCIA ................................................................................................................. 58
DAPI/Faloidina ................................................................................................................................ 58 Kit Live/Dead .................................................................................................................................... 64
5 CONCLUSÕES ............................................................................................................................... 70
6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... 71
7 ANEXO ............................................................................................................................................ 80
17
7.1 TABELA DE CLASSIFICAÇÃO DOS MORFOTIPOS ISOLADOS DE CLUSIA ARRUDAE ........................... 80 7.2 FOTOS DOS MORFOTIPOS ISOLADOS .............................................................................................. 81 7.3 GRÁFICOS DOS ENSAIOS DE VIABILIDADE DOS ISOLADOS DE CLUSIA ARRUDAE UTILIZANDO TRÊS
LINHAGENS CELULARES. ......................................................................................................................... 88
18
1 INTRODUÇÃO
1.1 Fungos endofíticos
O termo endofítico significa “na planta” (endon Gr, no interior; phyton, planta).
De acordo com SCHULZ & BOYLE (2005), os endofíticos foram mencionados pela
primeira vez por De Bary (1866) como qualquer micro-organismo (fungos, bactérias,
cianobactérias) presentes em tecidos de plantas. Trabalhos com endofíticos demonstram
que estes organismos apresentam interações simbióticas com o hospedeiro, protegendo-
o dos ataques de insetos, micro-organismos patogênicos e herbívoros (AZEVEDO,
1999). De acordo com Strobel & Dayse (2003), os fungos são os micro-organismos
endofíticos isolados com maior frequência.
Fungos endofíticos habitam tecidos vivos de plantas durante todo seu ciclo de
vida ou parte dele sem causar sintoma aparente de doença ao seu hospedeiro (PETRINI,
1991, BACON & WHITE, 2000, SCHULZ & BOYLE, 2005) e pode ser colonizado
qualquer órgão da planta hospedeira. Os fungos endofíticos podem apresentar
estratégias de colonização variando sapróbios, parasitas, mutualistas ou patógenos
latentes (STROBEL & DAISY, 2003; SCHULZ & BOYLE, 2005; PROMPUTTHA et
al., 2007). A colonização de partes aéreas do hospedeiro vegetal é normalmente
confinada a células individuais ou localizada, enquanto em raízes a colonização é
extensa (WILSON, 1995; TAN & ZOU, 2001; SCHULZ & BOYLE, 2005). A o
número de espécies vegetais catalogadas e de aproximadamente 300 mil e propõe-se
que virtualmente cada uma destas espécies podem abrigar complexas comunidades de
fungos endofíticos (SAIKKONEN et.al. 1998; KHARWAR et. al., 2011).
Fungos endofíticos representam um grupo diversificado de micro-organismos
descritos em plantas de diferentes ambientes tais como Antártico (ROSA et al., 2009),
Ártico (FISHER et al., 1995), desertos (BASHYAL et al., 2005), florestas tropicais
(STROBEL, 2002), manguezais, pântanos (LIN et al., 2008) e florestas costeiras
(SURYANARAYANAN et al., 2005), e encontrado em diferentes tipos de vegetais
(STROBEL & DAISY, 2003). A interação de mutualismo ou comensalismo que fungos
endofíticos exercem em seus hospedeiros requer um balanço delicado entre respostas de
defesa da planta e as necessidades do endofítico, sem caracterizar ausência da resposta
de defesa da planta (KOGEL, 2006). Em 2005, Schulz & Boyle propuseram que a
colonização sem sinais de infecção é resultante de uma reação antagônica balanceada,
19
em que ocorre um equilíbrio entre a virulência do fungo endofítico e a resposta de
defesa da planta. Então, a variabilidade da interação depende não só da adaptação do
fungo a um hospedeiro ou órgão em particular e dos estágios de desenvolvimento dos
parceiros, mas também da virulência inata do endofítico e da resposta de defesa do
hospedeiro (Figura 1).
Figura 1. Hipótese do antagonismo balanceado entre fungos endofíticos e suas plantas
hospedeiros (Schulz & Boyle 2005).
Os fungos endofíticos podem ser classificas em dois grupos principais levando
em consideração as diferenças evolutivas, taxonomia, hospedeiro e funções ecológicas.
O grupo dos clavicipitáceos, são geralmente encontrados em algumas espécies de
gramíneas; já o grupo não-clavicipitaceos, encontrados em tecidos de briófitas,
pteridófitas, gimnospermas e angiospermas (RODRIGUEZ et al., 2009). Endofíticos
clavipitáceos pertencem à família Clavicipitaceae (Hypocreales; Ascomycota) e muitas
espécies são conhecidos por produzir moléculas bioativas (principalmente dos gêneros
Cordyceps, Balansia, Epichloe/Neotyphodium, Claviceps e Myriogenospora). Em
contraste, os não-clavicipitáceos representam um grupo que ainda não bem definido
taxonomicamente, onde a maioria das espécies pertencem aos filos Ascomycota e
Basidiomycota. Espécies diferentes desses dois grupos endofíticos têm sido investigadas
20
devido a sua capacidade de produzir distintas moléculas bioativas e espécies associadas
a plantas tropicais têm se mostrado importantes produtores de metabólitos bioativos.
(ROSA et.al., 2011).
1.2 Câncer
O câncer é uma das doenças que mais causam temor na sociedade, um estigma
de mortalidade e dor (De ALMEIDA et al., 2005). Definido como doença multifacetada
desencadeada por vários fatores, resultante de mutações no genoma. Estas estão
associadas ao descontrole de programas essenciais como proliferação, diferenciação e
morte celular (MELO et al, 2003). As causas do câncer podem ser internas ou externas
ao organismo sendo inter-relacionadas e ligadas à capacidade do organismo de se
defender das agressões externas (INCA, 2009). Algumas destas agressões são mutações
genéticas espontâneas ou induzidas por agentes patogênicos como metais, radiações,
radicais livres, inflamações crônicas e xenobióticos (tabaco, álcool, pesticidas, entre
outros) entre outros os quais promovem desordem no ciclo celular, excesso na taxa de
proliferação e deficiência nas taxas de morte celular. Este processo culmina na
formação de agrupamentos de clones de células neoplásicas. (FERRARI & TORRES,
2002).
Nas últimas décadas, o câncer ganhou dimensão, um evidente problema de saúde
pública mundial. A Organização Mundial da Saúde (OMS) para o ano de 2030, estima
27 milhões de casos incidentes de câncer, 17 milhões de mortes e 75 milhões de
pessoas vivas, anualmente, com câncer (INCA 2012).No ano de 2012
No Brasil, as estimativas para o ano de 2012 que se aplicam para o ano de 2013
aponta a ocorrência de aproximadamente 518.510 novos casos de câncer, incluindo os
casos de pele não melanoma, corroborando com a magnitude do problema do câncer no
país. Sem considerar casos de câncer da pele não melanoma, estima-se 385 mil novos
casos . Os tipos mais incidentes para o sexo masculino , cânceres de pele não
melanoma, próstata, pulmão, cólon e reto e estômago ; e os cânceres de pele não
melanoma, mama, colo do útero, cólon e reto e glândula tireoide para o sexo feminino.
(INCA, 2012).
21
Estima-se 257.870 novos casos para o sexo masculino e 260.640 para o sexo
feminino. o câncer da pele do tipo não melanoma (134 mil novos casos ) é estimado
como o mais incidente na população brasileira, seguido pelos tumores de próstata (60
mil), mama feminina (53 mil), cólon e reto (30 mil), pulmão (27 mil), estômago (20
mil) e colo do útero (18 mil) (figura 2) (INCA, 2012).
Figura 2. Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados
para 2012 por sexo, exceto pele não melanoma (INCA, 2012).
Os principais tratamentos contra o câncer envolvem cirurgia, quimioterapia e
radioterapia; sendo a cirurgia, , o tratamento inicial e de escolha para vários tipos de
cânceres (JOHNSTON & SPENCER, 2003). Mais recentemente tem-se empregado a
terapia de fotorradiação com derivados hematoporfirínico (HTP) (MACHADO, 2000) e
a imunoterapia (SALMONM, 1998), cujos objetivos são erradicar o câncer,
normalmente por meio da terapia combinada, com associação de mais que um tipo de
tratamento. Na quimioterapia convencional são utilizados fármacos que têm como alvo
diversos processos fisiológicos das células que na maioria dos diferentes tipos de
neoplasias têm elevada taxa de mitose..
Alternativo a este tipo de tratamento busca-se novos metabólitos,
principalmente oriundos direta ou indiretamente de vegetais. Baseados no fato de que
desde a antiguidade o mundo tem feito o uso de plantas medicinais no tratamento de
diversas enfermidades. Estudos mais antigos sobre medicina e plantas medicinais foram
originários da China e Egito (ALZUGARAY & ALZUGARAY, 1983), nestes países
diversas culturas utilizavam as plantas medicinais, sendo esta a principal, ou mesmo a
única matéria prima para elaboração de medicamentos (ODY, 1993). No início do
22
século XX, com a demanda por novas drogas, aumentou o interesse por metabólitos
fitoterápicos uma vez que, os compostos orgânicos sintéticos utilizados nos tratamentos
apresentavam muitos efeitos colaterais e alto custo de produção (VOLAK &
STODOLA, 1990). O número de espécies conhecidas, e utilizadas como medicamentos
é irrisório, , em relação à biodiversidade vegetal e a devastação causada pelo homem,
em especial nos séculos XIX e XX (GOTTLIEB & KAPLAN, 1990).
1.3 Metabólitos bioativos produzidos por fungos
Metabólitos secundários, ou produtos naturais, são substâncias que acredita-se
serem dispensáveis para a sobrevivência e desenvolvimento do organismo e
continuamente, modificam-se e adaptam às continuas alterações exercidas pela pressão
seletiva do ambiente. Durante anos, os produtos naturais são utilizados diretamente
como drogas ou como modelos estruturais para o desenvolvimento de fármacos. De
acordo com BÉRDY (2005) e SURYANARAYANAN e colaboradores . (2009),
existem cerca de 200 mil metabólitos naturais com propriedades bioativas e 52% das
novas substâncias introduzidas no mercado mundial entre os anos de 1981 a 2002 tem
produtos naturais ou seus derivados em sua composição (CHIN et al., 2006).
Além de plantas, os micro-organismos constituem importante fonte de recursos
naturais e produtos bioativos. Cerca de 20 mil metabólitos bioativos de origem
microbiana foram conhecidos até o final de 2002 (BÉRDY, 2005). Os fungos estão
entre os grupos de organismos eucarióticos mais importantes cujos metabólitos são
explorados para aplicações clínicas (SURYANARAYANAN et.al, 2009). Novos
produtos naturais com estruturas químicas variadas foram identificados à partir do
metabolismo dos fungos (GRABLEY E SATTLER, 2003; MITCHELL et al, 2008;
STADLER E KELLER, 2008; SURYANARAYANAN et al, 2009). A heterogeneidade,
modo de absorção de nutrientes e capacidade de explorar uma variedade de substratos e
habitats reflete na capacidade sintética e versátil dos fungos (HYDE, 2005;
SURYANARAYANAN E HAWKSWORTH, 2005). Sabe-se que dos estimados 1,5
milhões de espécies de fungos no mundo (HAWKSWORTH, 2004) apenas 7% destes
foram cultivados e selecionados para a produção de drogas (SURYANARAYANAN
et.al, 2009).
23
Fungos endofíticos estão em constante interação com a sua planta hospedeira e
são tidos como excelentes fontes de produtos naturais bioativos, uma vez que podem
ocupar nichos biológicos únicos e crescem em diversos ecossistemas (SCHULZ et al.,
2002). O interesse por metabólitos bioativos produzidos por fungos endofíticos deve-se
à sua importância médica, industrial e agrícola (CALVO et al., 2002). São
considerados fonte promissora de metabólitos bioativos, haja vista dentre os vinte
medicamentos mais comumente descritos na clínica médica, seis são de origem fúngica
(SCHULZ et al., 2002). Segundo Brizuela e colaboradores (1998), os micro-organismos
(incluindo os fungos) constituem, uma das menos estudadas fontes de produtos naturais,
e que oferecem grandes possibilidades para obtenção de novas estruturas e atividades
biológicas, o que corrobora com a desenvolvimento de pesquisas, que visem obter de
acordo com Strobel e Daisy (2003) novos antibióticos, agentes quimioterápicos e
agroquímicos que sejam altamente eficientes, possuam baixa toxicidade e tenham um
menor impacto ambiental.
Extremamente importante, foi a elucidação de que alguns endofíticos são
capazes de produzir metabólitos sintetizados por suas plantas hospedeiras (STERLE
et.al, 1993)
Muitas espécies de fungos endofíticos são frequentemente isoladas de uma
planta hospedeira, e somente alguns isolados são capazes de produzir altos índices de
moléculas com atividade biológicas (STROBEL, 2003). Gomes (2008) sugere que a
ação de algumas plantas medicinais poderia estar relacionada a sua comunidade
endofítica, sendo o responsável pela resposta o micro-organismo não associado a planta
hospedeira, Identificar organismos responsáveis pela produção de metabólitos
eliminaria etapas de plantio, colheita e extração de plantas raras ou de crescimento
lento. Diminuindo assim o custo da produção e área de plantio já que estes podem ser
obtidos por processos fermentativos (STROBEL, 2002). De acordo com Strobel e
colaboradores (2004), ao selecionar as plantas para o isolamento e identificação dos
micro-organismos endofíticos é necessário observar os seguintes critérios:
1- Planta de ambientes peculiares, especialmente aquelas que apresentam
estratégias de sobrevivência pouco comuns;
24
2- Plantas que apresentam um histórico etnobotânico, ou seja, são
tradicionalmente utilizados como medicamento por tribos, grupos étnicos e pela
população de um modo geral. Estas plantas são escolhidas a partir de relatos da
literatura e por meio do contato direto estabelecido com a população que as
utiliza. Recentemente, tem sido verificadas que muitas propriedades medicinais
que eram atribuídas à produção de substâncias ativas pelas plantas, estão, na
realidade, relacionadas aos endófitos que a colonizam;
3- Plantas endêmicas de determinadas regiões que apresentam longevidade
incomum e que estão localizadas em ambientes ancestrais;
4- Plantas cujo desenvolvimento ocorrem áreas de grande biodiversidade, como
florestas temperadas e tropicais.
Algumas das drogas mais importantes usadas na clínica foram isoladas de
fungos (CRAGG et al., 2005). A descoberta de antibióticos, antimicóticos,
imunossupressores e compostos antitumorais são alguns exemplos de substâncias que
têm sido isoladas de fungos endofíticos (STROBEL et al., 2004). Entre estas, destaque
para substâncias como penicilina, cefalosporina, aminoglisídeos, tetraciclinas,
ciclosporina, FK506 e rampamicina . Também foram isoladas de fungos endofíticos
agentes que diminuem o colesterol, como mevastatina e lovastatina, antiparasitárias e
anti-helmínticas, como a ivermectina.
A partir da descoberta do diterpeno paclitaxel, agente anticâncer, produzido pelo
fungo endofítico Taxomyces andreanae, isolado da planta Taxus brevifolia (STIERLE
et al., 1995) estimulou estudos sobre fungos endofíticos como fontes de moléculas
bioativas. Pesquisadores tem reportado o isolamento de vários outros metabólitos
anticâncer de fungos endofíticos incluindo a Campotecina e análogos (PURI et.al.,
2005; REHMAN et.al., 2009; KUSARI et.al., 2009), vincristina (ZHANG et.al., 2000;
LINGQI et.al., 2000; YANG et.al., 2004) e podofilotoxina (PURI et.al., 2006;
EYBERGER et.al., 2006). Campotecina foi inicialmente isolada da madeira de
Camptotheca acuminata (Nyssaceae) uma planta nativa da China, que apresenta
atividade antitumoral. A Campotecina é um alcalóide pentacíclicos quinolina que inibe
a topoisomerase I (topo I), uma enzima envolvida na replicação do DNA (KHARWAR
et. al., 2011) (Figura 3).
25
Figura 3. Estrutura química da Campotecina (KHARWAR et. al., 2011).
Vincristina (Oncovin), também conhecido como leurocristine, é um alcalóide
isolado originalmente da vinca de Catharanthus roseus, um membro da família
Apocyanaceae. Foi isolado por diferentes pesquisadores no fungo Fusarium oxysporum.
A vincristina (Figura 4) tem ação em vários sistemas celulares, se liga de forma
irreversível a microtúbulos e proteínas do fuso na fase S do ciclo celular, a qual interfere
com a formação do fuso mitótico e consequentemente estabiliza células tumorais na
metáfase (ZHANG et.al., 2000; LINGQI et.al., 2000; YANG et.al., 2004).
Figura 4. Estrutura química da Vincristina (KHARWAR et. al., 2011).
Taxol® é o diterpeno protótipo do taxano, isolado pela primeira vez por Wani et
al. em 1971. da casca do Teixo do Pacífico (Taxus brevifolia). Desenvolvido
comercialmente pela Bristol-Myers Squibb com genérico ‘Paclitaxel’ (Figura 5) e
Taxol® (WALL e WANI, 1995). O Taxol® eficaz contra tumores de ovário, próstata,
mama, pulmão apresenta um único modo de ação: liga-se especificamente a beta-
tubulina, e impede a sua despolimerização durante os processos de divisão celular.
26
Figura 5. Estrutura química do Paclitaxel (KHARWAR et. al., 2011).
Outro exemplo de substância bioativa extraída de plantas e que pode ser obtida
por cultivo de fungos endofíticos é a podofilotoxina (Figura 6), sintetizada por espécies
vegetais do gênero Podophyllum, com atividades antitumoral, antiviral, antibacteriana e
imunoestimulante. É também empregada na síntese de inibidores da topoisomerase.
Recentemente, foi relatado que o fungo endofítico Trametes hirsuta, isolado da espécie
P. hexandrum, também é capaz de sintetizar Podofilotoxina e outras lignanas
biologicamente ativas com propriedades antitumoral e antioxidante (PURI et al., 2006).
Figura 6. Estrutura química da Podofilotoxina (KHARWAR et. al., 2011).
1.4 Família Clusiaceae (Lindl.)
A família Clusiaceae (Lindl.) inclui 50 gêneros e 1200 espécies distribuídas
principalmente nas regiões tropicais do globo. Entretanto, alguns gêneros se
desenvolvem com grande facilidade nas regiões norte de zonas temperadas. Esta família
engloba árvores, arbustos, lianas e ervas de interesse econômico pela produção de frutos
comestíveis, madeiras, derivados químicos de interesse farmacêutico e tintas. A maioria
27
das espécies está distribuída em três gêneros: Hypericum L. (350 spp.), Clusia L. (200
spp.) e Garcinia L. (200 spp.) (JUNIOR et.al., 2005).
1.5 O gênero Clusia (Planchon & Triana, 1860)
O gênero Clusia Planchon & Triana (1860) ocorre na região neotropical e reúne
cerca de 250 espécies semi-epífitas, trepadeiras, arbustivas e arbóreas (BITTRICH &
AMARAL 1996, 1997), entre as quais 67 ocorrem no Brasil. A espécie escolhida
(Clusia arrudae Planchon & Triana) é endêmica do Brasil e, após pesquisas em
diferentes bancos de dados, não foram encontrados quaisquer relatos quanto sua
atividade biológica antitumoral.. Clusia arrudae é uma planta dióica, de porte arbóreo
com distribuição nas serras de Minas Gerais e Rio de Janeiro sendo comum no campo
rupestre da Serra da Calçada. Suas flores são brancas, com oito pétalas. As flores
femininas possuem estigmas dilatados e amarelos, que podem variar de cinco a oito, em
uma mesma planta. O número de estigmas corresponde sempre ao número de carpelos
no ovário de cada flor. As flores masculinas possuem inúmeras anteras esbranquiçadas,
densamente distribuídas em torno de estigmas não funcionais que, também, variam
entre cinco e oito por flor. Os frutos são deiscentes, esféricos, podendo conter até nove
sementes por lóculo. As sementes, quando maduras, são avermelhadas e medem até 0,7
cm de diâmetro (CARMO & FRANCESCHINELLI, 2002).
Na literatura existem poucos registros de metabólitos com atividade antitumoral
nas espécies de Clusiaceae . Entretanto, após análises experimentais com diferentes
extratos vegetais realizados no Serviço de Biologia Celular da Fundação Ezequiel Dias
(FUNED), extratos originados do caule e da folha de Clusia arrudae foram ativos sobre
linhagens tumorais de origem gastrointestinal: HUTU-80(ATCC # HTB-40):
Adenocarcinoma de duodeno; RKO AS45-1(ATCC # CRL-2579): Carcinoma de colón
humano; MKN-45 (ATCC # 57584): Adenocarcinoma gástrico. Assim, para
caracterização de fungos endofíticos, iniciamos o estudo com Clusia arrudae ,
baseados em ensaios de viabilidade utilizando seu extrato bruto pois já se tem
conhecimento de que alguns micro-organismos endofíticos produzem substâncias
idênticas ou semelhantes às das plantas hospedeiras (TAN & ZOU, 2001).
28
Figura 7- Imagens de Clusiae arrudae (Planchon & Triana). A e B vista geral da planta
mostrando copas e ramificações. C e D - Detalhes dos galhos com frutos imaturos.
29
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Determinar a atividade antitumoral de extratos de fungos endofíticos associados
à Clusia arrudae Planchon & Triana (Clusiaceae) sobre a proliferação celular de
linhagens humanas de tumores gastrointestinais.
2.1 Objetivos específicos
- Coletar amostras de Clusia arrudae para isolamento de sua comunidade de fungos
endofíticos;
- Incluir todos os fungos obtidos na Coleção de Micro-organismos e Células da UFMG
para preservação ex situ da biodiversidade de fungos tropicais;
- Preparar extratos etanólicos de todos os fungos obtidos;
- Depositar os extratos fúngicos e vegetais obtidos em uma extratoteca para estudos de
bioprospecção;
-Realizar ensaio de viabilidade celular utilizando o método de exclusão por MTT nas
linhagens humanas:
HUTU-80 (ATCC # HTB-40): Adenocarcinoma de duodeno;
RKO AS45-1(ATCC # CRL-2579): Carcinoma de colón humano;
WI-26 VA4 (ATCC# CCL-95.1): Fibroblasto de pulmão.
-Realizar análise morfológica das linhagens estudadas após tratamento com os extratos
utilizando sondas fluorescentes que identificam o citoesqueleto;
- Identificar em nível específico os fungos endofíticos bioativos;
30
- Determinar a CI50 para atividade citotóxica dos extratos ativos;
3 METODOLOGIA
3.1 Coleta dos espécimes de Clusia arrudae
As amostras de Clusia arrudae (Planchon & Triana) foram coletadas na Serra da
Moeda, no município de Brumadinho, Minas Gerais (20º05’36”S e 4º59’00”W, a 1.480
m de altitude.). A vegetação predominante no local é campo rupestre sobre solo de
“canga”. A coleta ocorreu em abril 2010 e para o acesso a estas amostras foram
respeitadas as normas de coleta de exemplares vegetais. Folhas e cascas de 30
indivíduos aparentemente saudáveis foram coletadas para o estudo. A localização dos
indivíduos foi determinada por coordenadas geográficas obtidas pelo Global
Positioning System (GPS), e uma exsicata representativa do material vegetal foi
depositada no herbário da UFOP e da EPAMIG. As amostras coletadas foram
armazenadas em sacos plásticos e processadas no mesmo dia. Utilizaram-se três folhas e
três cascas de cada indivíduo, sendo que cinco fragmentos de cada folha e de cada casca
foram plaqueados para isolamento dos fungos endofíticos.
3.2 Isolamento dos fungos endofíticos
Inicialmente ao processo de desinfestação, as folhas e cascas coletadas foram
limpas superficialmente com detergente neutro e enxaguadas abundantemente com água
corrente. Em seguida, com auxílio de tesoura e pinça esterilizada, retiraram-se
fragmentos de aproximadamente cinco mm das folhas e cascas que foram desinfestados
superficialmente com Extran 2%, álcool 70% (1 minuto), hipoclorito de sódio com 2%
de cloro ativo (3 minutos) e água destilada estéril (2 minutos) (COLLADO et al., 1996).
Após este processo de desinfecção superficial, os fragmentos foram transferidos para
placas de Petri contendo Ágar Dextrose Batata (BDA/Difco) suplementado com
200mg/L de cloranfenicol (Sigma/EUA), utilizado para inibir o crescimento de bactérias
epifíticas ou endofíticas contaminantes. Alíquotas da água destilada esterilizada
utilizada no processo de desinfestação também foram plaqueadas como controle para
assegurar que somente os fungos endofíticos foram isolados. As placas foram incubadas
a 25-28ºC por um período de até 60 dias (Figura 8).
31
Figura 8. Placa inoculada com fragmentos de caule (A) e folha (B) oriundos da mesma
planta depois de três dias de incubação.
Os isolados foram transferidos para placas de Petri com BDA para purificação.
Os isolados de fungos endofíticos obtidos foram preservados em glicerol 15% em ultra
freezer a –80ºC e também mantidos por repiques sucessivos em placas de Petri
contendo BDA. Todos os isolados obtidos durante o estudos foram depositados na
Coleção de Micro-organismos e Células da UFMG.
3.3 Cultivo dos fungos e preparo dos extratos
Os fungos filamentosos obtidos foram cultivados em placas de Petri contendo
meio BDA a 28ºC com umidade de 70-80%. Após 15 dias de crescimento, o meio de
cultura com o crescimento micelial foi transferido para tubos cônicos de 50 mL. Para
obtenção dos extratos brutos foram adicionados aos tubos 35 mL de etanol PA (Mark) e
então macerados com auxílio de um bastão de vidro. Os tubos foram incubados a 10ºC e
após 48 horas, o sobrenadante (etanol) de cada tubo foi transferido para frascos de vidro
de 30 mL e para tubos de 1,5 mL. Estes foram secos em centrífuga a vácuo “Speed
Vac” (Savant) com temperatura inferior a 35ºC. Os extratos obtidos foram dissolvidos
em dimetilsufóxido (DMSO) na concentração de 240 µg/mL e mantidos a -80°C até
utilização nos ensaios biológicos.
32
3.4 Ensaios biológicos
3.4.1 Atividade citotóxica
Estes estudos da atividade citotóxica foram realizados no Serviço de Biologia
Celular da Fundação Ezequiel Dias (FUNED). Foram escolhidas duas linhagens de
células provenientes do sistema gastrointestinal estômago para serem testadas: HUTU-
80 ATCC#HTB-40 (adenocarcinoma de duodeno), RKO AS45-1 ATCC #CRL-2579
(carcinoma de colón humano), e linhagem normal de fibroblasto de pulmão WI26VA4
ATCC# CCL951 cultivadas em estufa com atmosfera úmida a 37° com 5% de CO2.
Todas as células foram cultivadas em meio de cultura EMEM suplementado com 10 %
de soro fetal bovino (Figura 9).
Figura 9. Fotomicrografia das linhagens celulares testadas nos ensaios de viabilidade
celular.
3.4.2 Viabilidade celular
A viabilidade celular foi determinada usando o ensaio de MTT (brometo de 3-
[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio). As células foram semeadas na
concentração de 1X105 células/poço em uma placa de 96 poços e colocadas em uma
estufa para crescimento celular, 37ºC com a atmosfera umidificada contendo 5% de
CO2, por 24horas depois da adição do extrato (solubilizado em DMSO na concentração
de 240μg/mL de meio específico de cada linhagem testada e depois uma diluição
seriada para 120μg/mL 60μg/mL e 30μg/mL). Para o ensaio as amostras foram
empregadas em quadruplicatas (100µl por poço). Transcorridos às 24 horas o meio foi
retirado da placa e está lavada com PBS 1X (100 µl/poço). O MTT foi adicionado e
diluído em nove mL de meio EMEM com 1% de soro fetal bovino (SFB). As placas
HUTU RKO WI26VA4
33
foram incubadas por 3horas a 37°C e centrifugadas a 1000rpm por 10 minutos para a
precipitação do formazan. O meio com MTT foi aspirado e adicionado 50µl de DMSO
para solubilização do formazan. Para avaliação da viabilidade celular os resultados
foram obtidos em leitor de microplacas Espectramax M5e (Molecular Devices, USA).
Para todas as amostras a viabilidade e toxicidade foram medidas através das
fórmulas:
𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 =(𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑜𝑠 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜𝑠 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜𝑠)
(𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑜𝑠 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑑𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑣𝑖𝑑𝑎)× 100%
𝑇𝑜𝑥𝑖𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 = 100% − [𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑜 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜(%)]
3.5 Ensaio de fluorescência
Foram realizados ensaios de fluorescência das linhagens celulares controle,
linhagens teste e identificado CI50 e em diferentes intervalos de tempo.
3.5.1 Kit Live/Dead
Em uma placa de 48 poços foi semeado 1,0X 105 células /poço. As placas foram
incubadas em estufa de CO2 a 37°C onde permaneceram por 24 horas. Após período de
incubação os poços foram lavados com sal de Hans. A solução dos poços foi aspirada e
adicionou-se solução Live/Dead (2,0 µM EthD-1 e 1,0 µM Calcein AM). A placa foi
incubada por 30 min. a temperatura ambiente protegido da luz. Após este período a
placa foi centrifugada a 1000 rpm por 5 min. A solução Live/Dead foi aspirada e a
placa lavada com sal de Hans duas vezes. A placa foi centrifugada a 1000 rpm por 5
min. e adicionado PBS 1X para visualização no microscópio Axiovert 200, Zeiss.
3.5.2 DAPI/Faloidina
Em uma placa de seis poços foi adicionado uma lamínula de microscopia onde
as células cresceram. Em cada poço foi semeado 1,0X105 células/poço, a placa foi
incubada em estufa de CO2 a 37°C por 24 horas. Após incubação as células foram
lavadas com sal de Hans. Adicionou-se formaldeído 4% com tempo de contato de 1 h e
as placa lavadas duas vezes com sal de Hans. Foi adicionado PBS Tween 0,1% por 10
min. e após este período a placa foi lavada por três vezes com PBS 1X. Foi adicionado
34
400 µL de Faloidina 488 (Invitrogen # A12379) 1:20 nos poços por 20 min. As
amostras foram lavadas três vezes com PBS 1X e em seguida adicionado 400 µl de
DAPI (Invitrogen # D1306) com tempo de contato de 5 minutos. Após este processo a
placa foi incubada por 1 hora a temperatura ambiente protegida da luz. Decorrido o
tempo de incubação a placa foi lavada por três vezes com PBS 1X. As lamínulas
presentes no fundo dos poços da placa foram retiradas para a confecção de lâminas de
microscopia para visualização no microscópio Axiovert 200, Carl Zeiss.
3.6 Identificação dos fungos
As colônias dos isolados de fungos foram fotografadas (frente e verso) e
agrupadas de acordo com as seguintes características macromorfológicas: cor da colônia
(frente e verso), textura da superfície (frente e verso) e aspecto da borda. Selecionou-se
um isolado de cada morfotipo para identificação molecular por meio do sequenciamento
da região transcrita interna (ITS1-5.8S-ITS2) do gene do DNA ribossomal.
3.6.1 Extração do DNA total
A extração de DNA total foi realizada de acordo com metodologia descrita por
Rosa et al. (2009). Os fungos filamentosos foram crescidos por sete dias em BDA, e
então fragmentos de micélio foram colocados em tubo de 1,5mL acrescidos de 400 μL
de tampão de lise (Tris-HCl – trishidroximetilaminometano 0,05 M, EDTA – ácido
etilenodiamino tetra-acético 0,005 M, NaCl 0,1 M e SDS – sódio dodecil sulfato 1%) e
incubados a – 20ºC por aproximadamente 10 minutos. O micélio foi triturado com
auxílio de um pistilo e foram acrescentados 5 μL de Proteinase K (50 μg/mL). Após
homogeneização, colocou-se o tubo por 30 minutos a 60ºC em banho-maria. Em
seguida, foram adicionados 162 μL de CTAB (Tris 2M, NaCl 8,2%, EDTA 2M e CTAB
0,2%), seguido de homogeneização e incubação por 10 minutos a 65ºC. Posteriormente,
foram acrescentados 570 μL da mistura clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). Após
homogeneização, o tubo foi incubado por 30 minutos em gelo. Em seguida, o conteúdo
foi centrifugado a 13.200 rpm por 10 minutos e o líquido sobrenadante transferido para
um novo tubo de 1,5mL. Ao novo tubo foram acrescentados 10% do volume de uma
solução de acetato de sódio 3M. O tubo foi vertido para homogeneização, incubado a
0ºC por 30 minutos e centrifugado a 13.200 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi
desprezado por inversão e em seguida, adicionados 200 μL de etanol (Merck) 70% p/v e
a suspensão foi gentilmente homogeneizada. A amostra foi centrifugada a 13.200 rpm
35
por 5 minutos e o sobrenadante desprezado por inversão, seguido por homogeneização
com etanol 70% p/v. A amostra foi reservada overnight para secagem e adicinou-se 50
μL de Tris-EDTA (Tris-HCl 0,01 M e EDTA 0,001 M). A amostra foi incubada a 65ºC
por 60 minutos para hidratação do DNA e posteriormente foram armazenados à -20ºC.
3.6.2 Amplificação utilizando os iniciadores ITS1 e ITS4
Os iniciadores ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4
(TCCTCCGCTTATTGATATGC) foram utilizados para amplificação da região
transcrita interna (ITS1-5.8S-ITS2) do gene do rRNA, conforme descrito por White et
al. (1990). A PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) foi realizada com volume final
de 50 μL contendo 5,0 μL de tampão 10X (Fermentas), 3,0 μL de MgCl2 25mM
(Fermentas), 2,0 μL de dNTP 0,05 mM (Invitrogen, EUA), 1,0 μL de cada iniciador
ITS1 e ITS4 10 μmol-1 (Invitrogen, EUA), 0,2 μL de Taq DNA polimerase 1,25U
(Fermentas), de 1,0 a 5,0 μL de DNA, de acordo com a dosagem do DNA total,
podendo variar de 50 a 500 ng/µL; e o volume final completado com água deionizada
autoclavada. As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador PCR
Express (Thermo Hybaid). O programa consistiu de uma desnaturação inicial a 94ºC
por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 1 minuto de desnaturação a 94ºC, 1 minuto de
anelamento a 55ºC e 1 minuto de extensão a 72ºC, e uma extensão final por 5 minutos a
72ºC. Os produtos de amplificação foram aplicados em gel de agarose (Pronadisa,
Espanha) a 1% em tampão TBE 0,5% (54 g de Tris Base, 27,5 g de ácido bórico, 20 mL
de EDTA 0,5 M, pH 8,0) a 120 V para a obtenção de bandas. Os géis foram corados
com solução de Gelred (Biotium, EUA) e visualizados sob luz ultravioleta (UV) por
meio de um sistema de captação de imagem (Vilber Lourmat, França).
3.6.3 Purificação dos amplicons
Os amplicons gerados pela reação de PCR foram purificados mediante técnica
com polietilenoglicol (PEG). Ao produto de PCR foi adicionado o mesmo volume de
solução de polietilonoglicol 20% em NaCl 2,5 M, e deixado em banho-maria a 37ºC por
15 minutos. O tubo foi centrifugado a 13.500 rpm por 15 minutos, o sobrenadante foi
retirado e descartado. Em seguida, foi adicionado 125 μL de etanol 70-80% resfriado a
4ºC. O tubo foi novamente centrifugado a 13.500 rpm por dois minutos e então retirou-
se o etanol. Este passo foi repetido e a amostra novamente centrifugada a 13.200 rpm
36
por um segundo. O tubo foi deixado à temperatura ambiente para evaporação de todo o
excesso de etanol. Foram adicionados 10 μL de água deionizada estéril e o conteúdo do
tubo homogeneizado em vórtex por 15 segundos. Em seguida, o tubo foi incubado em
banho-maria a 37ºC por 40 minutos. O produto obtido foi dosado em NanoDrop ND
1000 (NanoDrop Technologies) com comprimento de onda de 260nm, e então utilizado
nas reações de sequenciamento.
3.7 Reações de sequenciamento
O sequenciamento foi realizado utilizando-se o Kit DYEnamicTM (Amersham
Biosciences, USA) em combinação com o sistema de sequenciamento automatizado
MegaBACETM 1000, no Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular (LBEM
- UFMG). Para as reações de sequenciamento foram utilizados 80-120 ng do DNA
purificado e os reagentes presentes no Kit DYEnamicTM (Amersham Biosciences,
USA). A reação de PCR foi realizada com volume final de 10 μL contendo 4 μL do
pré-mix (presente no kit de sequenciamento), 1 μL do iniciador (5 μmol-1), de 1 a 5 μL
de DNA e o volume final foi completado com água deionizada autoclavada. O programa
consistiu de 36 ciclos de uma desnaturação inicial a 95ºC por 25 segundos, seguido por
15 segundos de anelamento a 50ºC e 3 minutos de extensão a 60ºC. Em seguida, os
produtos da reação foram transferidos para uma placa de sequenciamento de 96 poços e
então precipitados.
Para precipitação das reações de sequenciamento, 1 μL de acetato de amônio 7,5
M foi adicionado em cada poço da placa de 96 poços. A solução de acetato de amônio
foi dispensada na parede lateral dos poços e a placa levemente batida sobre a bancada
para que as gotas do acetato de amônio se misturem à reação. Em seguida foram
adicionados 28 μL de etanol absoluto (Merck). A placa foi submetida à agitação em
vórtex e incubada por 20 minutos à temperatura ambiente, protegida da luz.
Após período de incubação, a placa foi centrifugada por 45 minutos a 4.000 rpm. O
sobrenadante foi descartado virando-se a placa sobre um papel absorvente. Em seguida,
foram adicionados 150 μL de etanol 70% (Merck). A placa foi centrifugada por 15
minutos a 4.000 rpm e o sobrenadante descartado. Para remoção do excesso de etanol, a
placa foi vertida sobre um papel absorvente, e submetida a um pulso em centrífuga a
900 rpm durante 1 segundo. Em seguida, a placa foi mantida em repouso durante 20-40
minutos, protegida da luz, para evaporação do etanol.
37
O DNA das amostras precipitado em cada poço foi então ressuspendido em 10
μL de “tampão de corrida” (presente no kit de sequenciamento). A placa foi submetida à
agitação em vórtex por 2 minutos, centrifugada por 1 segundo a 900 rpm e armazenada
a 4ºC, protegida da luz, até injeção das amostras no sistema automatizado
MegaBACETM 1000.
3.8 Análise computacional das sequências
As sequências de DNA foram comparadas com as sequências de culturas
depositadas no GenBank, utilizando o programa BLASTn (Basic Local Alignment
Serch Tool – versão 2.215 do BLAST 2.0) disponível no portal NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/), desenvolvido pelo National Center For
Biotechnology e disponível no portal NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Os
isolados que apresentaram sequência com identidade ≥ a 98% em relação às sequências
de fungos depositadas no GenBank, foram considerados como pertencentes à mesma
espécie ou gênero. Os que apresentaram sequências com identidade entre 93 e 97%
somente o gênero foi aceito, para sequências com identidade <93% os isolados foram
identificados como espécies desconhecidas ou identificados em família, classe, ordem
(ROSA et al., 2010).
3.9 Construção de dendrogramas e análise de frequência
Para a construção de dendrogramas e análise de frequência de isolados foi
utilizado o software SPSS® versão 19.
38
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Produção dos extratos e ensaios biológicos
Do total de 100 extratos etanólicos obtidos, 41 foram avaliados sendo expostos a
duas linhagens de células provenientes do sistema gastrointestinal, HUTU-80 ATCC #
HTB-40 (adenocarcinoma de duodeno), RKO AS45-1 ATCC #CRL-2579 (carcinoma
de colón humano), e linhagem normal de fibroblasto de pulmão WI26VA4
ATCC#CCL951.
Em uma primeira análise foram considerados citotóxicos extratos que, causaram
às células testadas, viabilidade inferior a 50% e toxicidade superior a 50%. Foram
considerados com ação antitumoral os extratos tóxicos para HUTU e RKO, e para
WI26VA4 estes foram considerados apenas tóxicos. Também foram analisados os
extratos que atingiram o CI55, pois pretendia-se avaliar se outros extratos apresentavam
tendência à toxicidade. Considerando o CI50, para todas as linhagens testadas, apenas o
extrato do isolado UFMGCB 5460 exerceu atividade antitumoral para a linhagem
tumoral RKO (tabela 1).
Tabela 1. Ensaio de viabilidade do extrato 5460 frente todas células testadas, HUTU,
RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de
exposição. A linha sombreada mostra a concentração do extrato que tem o perfil tóxico
para a linhagem testada. UFMGCB* 5460
Concentração do extrato (µg/mL) Linhagem celular Toxicidade (%)
30 HUTU 0
30 RKO 28
30 WI26VA4 4
60 HUTU 0
60 RKO 22
60 WI26VA4 8
120 HUTU 0
120 RKO 18
120 WI26VA4 30
240 HUTU 44
240 RKO 51
240 WI26VA4 34
*UFMGCB = Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de
Minas Gerais.
Para a linhagem tumoral HUTU três extratos apresentaram atividade
antitumoral. UFMGCB 5478 (tabela 2), UFMGCB 5502 (tabela 3) e UFMGCB 5533
(tabela 4). Os isolados UFMGCB 5467 (tabela 5) UFMGCB 5485 (tabela 6), UFMGCB
39
5498 (tabela 7), UFMGCB 5500 (tabela 8) e UFMGCB 5502 (tabela 3) foram tóxicos
para a linhagem normal WI26VA4. Apenas o extrato UFMGCB5502 se mostrou toxico
para duas linhagens celulares distintas, HUTU e WI26VA4.
Tabela 2. Ensaio de viabilidade do extrato 5478 frente todas células testadas, HUTU,
RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de
exposição. A linha sombreada mostra a concentração do extrato que tem o perfil tóxico
para a linhagem testada. UFMGCB* 5478
Concentração do extrato (µg/mL) Linhagem celular Toxicidade (%)
30 HUTU 14
30 RKO 0
30 WI26VA4 0
60 HUTU 27
60 RKO 0
60 WI26VA4 0
120 HUTU 37
120 RKO 0
120 WI26VA4 0
240 HUTU 58
240 RKO 16
240 WI26VA4 0
*UFMGCB = Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de
Minas Gerais.
Tabela 3. Ensaio de viabilidade do extrato 5502 frente todas células testadas, HUTU,
RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de
exposição. As linhas sombreadas mostram a concentração do extrato que tem o perfil
tóxico para a linhagens testadas.
UFMGCB* 5502
Concentração do extrato (µg/mL) Linhagem celular Toxicidade (%)
30 HUTU 10
30 RKO 0
30 WI26VA4 0
60 HUTU 19
60 RKO 0
60 WI26VA4 0
120 HUTU 25
120 RKO 0
120 WI26VA4 28
240 HUTU 52
240 RKO 15
240 WI26VA4 68
*UFMGCB = Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de
Minas Gerais.
40
Tabela 4. Ensaio de viabilidade do extrato 5533 frente todas células testadas, HUTU,
RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de
exposição. A linha sombreada mostra a concentração do extrato que tem o perfil tóxico
para a linhagem testada. UFMGCB* 5533
Concentração do extrato (µg/mL) Linhagem celular Toxicidade (%)
30 HUTU 0
30 RKO 17
30 WI26VA4 4
60 HUTU 16
60 RKO 16
60 WI26VA4 0
120 HUTU 45
120 RKO 17
120 WI26VA4 0
240 HUTU 56
240 RKO 17
240 WI26VA4 24
*UFMGCB = Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de
Minas Gerais.
Tabela 5. Ensaio de viabilidade do extrato 5467 frente todas células testadas, HUTU,
RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de
exposição. A linha sombreada mostra a concentração do extrato que tem o perfil tóxico
para a linhagem testada. UFMGCB* 5467
Concentração do extrato (µg/mL) Linhagem celular Toxicidade (%)
30 HUTU 5
30 RKO 0
30 WI26VA4 0
60 HUTU 3
60 RKO 0
60 WI26VA4 25
120 HUTU 19
120 RKO 0
120 WI26VA4 45
240 HUTU 47
240 RKO 37
240 WI26VA4 82
*UFMGCB = Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de
Minas Gerais.
41
Tabela 6. Ensaio de viabilidade do extrato 5485 frente todas células testadas, HUTU,
RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de
exposição. A linha sombreada mostra a concentração do extrato que tem o perfil tóxico
para a linhagem testada. UFMGCB* 5485
Concentração do extrato (µg/mL) Linhagem celular Toxicidade (%)
30 HUTU 7
30 RKO 0
30 WI26VA4 11
60 HUTU 10
60 RKO 0
60 WI26VA4 14
120 HUTU 15
120 RKO 0
120 WI26VA4 27
240 HUTU 36
240 RKO 10
240 WI26VA4 69
*UFMGCB = Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de
Minas Gerais.
Tabela 7. Ensaio de viabilidade do extrato 5498 frente todas células testadas, HUTU,
RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de
exposição. A linha sombreada mostra a concentração do extrato que tem o perfil tóxico
para a linhagem testada. UFMGCB* 5498
Concentração do extrato (µg/mL) Linhagem celular Toxicidade (%)
30 HUTU 0
30 RKO 32
30 WI26VA4 0
60 HUTU 0
60 RKO 31
60 WI26VA4 0
120 HUTU 0
120 RKO 24
120 WI26VA4 0
240 HUTU 30
240 RKO 25
240 WI26VA4 80
*UFMGCB = Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de
Minas Gerais.
42
Tabela 8. Ensaio de viabilidade do extrato 5500 frente todas células testadas, HUTU,
RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de
exposição. A linha sombreada mostra a concentração do extrato que tem o perfil tóxico
para a linhagem testada. UFMGCB* 5500
Concentração do extrato (µg/mL) Linhagem celular Toxicidade (%)
30 HUTU 3
30 RKO 3
30 WI26VA4 46
60 HUTU 9
60 RKO 10
60 WI26VA4 24
120 HUTU 21
120 RKO 15
120 WI26VA4 46
240 HUTU 0
240 RKO 24
240 WI26VA4 51
*UFMGCB = Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de
Minas Gerais.
Dentre os 41 extratos, oito extratos foram tóxicos para as células testadas,
correspondendo a 19,5% dos extratos testados. Apenas o extrato do fungo UFMGCB
5502 foi tóxico para duas linhagens celulares (HUTU E WI26VA4). Vale ressaltar que
os extratos tóxicos para WI26VA4 (exceto o extrato do fungo UFMGCB5502), em
análise prévia, não apresentaram ação antitumoral, pois esta é uma linhagem normal o
que permitiu apenas avaliar a toxicidade dos extratos sobre sistemas normais. Esta
análise é importante, por permitir que droga em estudo tenha sua toxidade declarada in
vitro antes de chegar aos testes com animais. Contudo não se pode descartá-lo como
fonte de metabólitos de interesse em outras enfermidades e também deve-se considerar
que os testes envolvem extratos brutos, que é uma mistura complexa de vários
metabólitos, sendo imprescindível o emprego de etapas de purificação para isolamento
de substâncias como perspectivas de elucidação de novos extratos tóxicos. O extrato do
fungo UFMGCB5502 apresentou ação tóxica e antitumoral, caracterizada pela perda de
viabilidade para linhagem tumoral (HUTU) e para linhagem normal (WI26VA4). Os
extratos dos fungos UFMGCB 5460, UFMGCB 5478, UFMGCB5502 e UFMGCB
5539 apresentou ação exclusivamente antitumoral, tóxico apenas em linhagens
tumorais (HUTU e RKO), caracterizando uma possível fonte de metabólitos com ação
tóxica em tumores. Os valores de CI50 de todos os extratos tóxicos estão representados
na tabela 9.
43
Tabela 9. Relação dos extratos com atividade citotóxica e relação a sua concentração
inibitória a 50% (CI50) Extratos dos fungos
UFMGCB*
Célula testada Equação da reta CI50** (µg/mL)
UFMGCB 5460 RKO y = 0,1112x+24,287 231,23
UFMGCB 5478 HUTU y = 0,1981x+11,852 192,57
UFMGCB 5502 HUTU y = 0,1911x+5,1668 234,61
UFMGCB 5533 HUTU y = 0,2865x-5,1477 192,49
UFMGCB 5467 WI26VA4 y = 0,366x-3,1879 145,32
UFMGCB 5485 WI26VA4 y =0,2884x-2,2503 181,17
UFMGCB 5498 WI26VA4 y = 0,4496x-35,922 191,11
UFMGCB 5500 WI26VA4 y = 0,0664x+34,295 236,52
UFMGCB 5502 WI26VA4 y = 0,389x-29,54 204,47
*UFMGCB = Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de
Minas Gerais.
** CI50= Concentração inibitória em 50%
Ao aumentar a linha de corte para IC55 é possível considerar mais quatro extratos
ativos, e totalizar 12 extratos tóxicos para as três linhagens testadas. Este aumento pode
ser explicado pela proximidade da toxicidade destes extratos e pelo perfil de dose
resposta que estes apresentaram. Para a célula RKO somente o extrato do fungo
UFMGB 5489 (Figura 10) foi tóxico. Para HUTU os extratos dos fungos UFMGCB
5508 (Figura 11 A) e UFMGCB 5534 (Figura 11 B) foram tóxicos. Considerando o IC55
temos para WI26VA4 o extrato do fungo UFMGCB 5510 (Figura 12).
44
Figura 10. Ensaio de viabilidade para a linhagem RKO utilizando extratos de fungos
endofíticos nas concentrações de 30, 60, 120 e 240μg/mL após 24h de exposição. Este
extrato atingiu CI55 de 282,78µg/mL.
Figura 11. Ensaio de viabilidade para a linhagem HUTU utilizando extratos de fungos
endofíticos nas concentrações de 30, 60, 120 e 240μg/mL após 24h de exposição. Este
extrato atingiu CI55 para 237,53 µg/mL (A) e para 259,68 µg/mL (B).
45
Encontramos na literatura diversos trabalhos com produtos naturais empregados
na busca de metabólitos bioativos. A resistência das bactérias às drogas, o
aparecimento de novas doenças virais, os problemas recorrentes de doenças em
pacientes submetidos a transplantes de órgãos e o aumento da incidência de infecções
fúngicas na população demonstram a importância da elucidação de novas drogas
(STROBEL & DAISY, 2003). Além dissosão poucos os trabalhos com fungos
endofíticos que visam exclusivamente produtos com atividade atitumoral.
Em 2010 Rosa e colaboradores realizaram ensaios de bioprospecção utilizando
extratos de fungos endofíticos associados às plantas bioativas brasileiras. Além de
avaliar a atividade leishmanicida e tripanosomicida, estes pesquisadores analisaram a
viabilidade celular utilizando as linhagens celulares UACC-62 (melanoma humano),
MCF-7 (adenocarcinoma de mama) e TK10 (carcinoma renal humano). Dos 121
extratos testados, 17 (14%) inibiram o crescimento celular em 60% para pelo menos
uma linhagem celular testada. Os CI50 variaram de >0,2 a 25 µg/mL.
Semelhante aos nossos resultados, Lu e colaboradores em 2011 identificaram 17
fungos endofíticos associados à planta Actinidia macrosperma com capacidade de
produzir metabólitos antitumorais. Estes autores utilizaram as linhagens celulares
HepG2 (carcinoma hepatocelular), MCF-7 (adenocarcinoma de mama), A549
(adenocarcinoma de pulmão humano), SGC-7901 (câncer gástrico humano), HeLa
(câncer de colo uterino). Entre os 17 fungos endofíticos isolados , 14 (82,4%)
apresentaram atividade positiva (IC50 <100 µg/mL) sendo estes valores semelhantes aos
encontrado no nosso trabalho. A porcentagem de isolados com atividade antitumoral
variou para cada linhagem celular. Aproximadamente 76,5% das culturas de fungos
endofíticos apresentou atividade antitumoral em HepG2, MCF-7, e SGC-7901, e 82,4%
das culturas de fungos endofíticos exibiram atividade antitumoral para as linhagens
A549 e HeLa. Todos estes testes foram feitos com incubação de 24 horas.
Santiago e colaboradores em 2012 testaram a atividade leishmanicida e
tripanosomicida de fungos endofíticos isolados associados as angiospermas antárticas,
Deschampsia antarctica e Colobanthus quitensis. Avaliaram a viabilidade celular
utilizando as linhagens UACC-62, MCF-7 e TK10. De 564 isolados, verificou-se
citoxicidade em seis extratos, quatro para MCF-7, um para TK7 e um para UACC-62.
Os valores de CI foram <82 µg/mL para as linhagens testadas.
46
Para melhor compreensão dos resultados encontrados, o software SPSS 19.0
(Chicago) foi utilizado para análises descritivas, gráficos e agrupamento hierárquico
(dendrograma) considerando todas as variáveis deste trabalho, estão expostos na Tabela
10.
47
Tabela 10. Relação dos isolados de Clusia arrudae testados, em relação ao órgão de origem, morfotipo isolado, número de fungos por planta,
número de fungos por folha, números de fungos por caule e número de morfotipos por planta. Software SPSS 19.0 (IBM)
UFMGCB* PLANTA ORGÃO MORFOTIPO
NÚMEROS DE
FUNGOS POR
PLANTA
NÚMERO DE
FUNGOS POR
FOLHA
NÚMERO DE
FUNGOS POR
CAULE
NÚMERO DE
MORFOTIPOS POR
PLANTA
5443 2 FOLHA 9 4 2 2 3
5449 24 CAULE 1 7 1 6 4
5450 24 CAULE 4 7 1 6 4
5453 4 CAULE 6 1 0 1 1
5455 15 CAULE 4 7 4 3 5
5459 26 FOLHA 4 2 2 0 2
5460 28 CAULE 1 1 0 1 1
5461 13 CAULE 1 3 0 3 2
5465 13 CAULE 1 3 0 3 2
5467 6 CAULE 1 5 1 4 3
5468 24 CAULE 1 7 1 6 4
5469 23 CAULE 1 4 0 4 1
5473 14 CAULE 1 3 0 3 2
5474 22 CAULE 1 3 0 3 3
5476 3 FOLHA 1 9 4 5 3
5478 18 FOLHA 1 4 2 2 3
5480 25 FOLHA 1 2 1 1 1
5484 3 CAULE 1 9 4 5 3
5485 30 CAULE 1 5 5 1 2
5486 10 CAULE 4 6 1 5 2
48
UFMGCB* PLANTA ORGÃO MORFOTIPO
NÚMEROS DE
FUNGOS POR
PLANTA
NÚMERO DE
FUNGOS POR
FOLHA
NÚMERO DE
FUNGOS POR
CAULE
NÚMERO DE
MORFOTIPOS POR
PLANTA
5489 12 CAULE 1 1 0 1 1
5495 2 CAULE 1 4 2 2 3
5498 3 CAULE 1 9 4 5 3
5500 3 CAULE 1 9 4 5 3
5501 24 CAULE 2 7 1 6 4
5502 9 CAULE 1 6 1 5 3
5504 10 CAULE 1 6 1 5 2
5508 10 CAULE 4 6 1 5 2
5510 6 CAULE 1 5 1 4 2
5511 16 FOLHA 4 3 3 0 2
5512 2 FOLHA 6 4 2 2 3
5513 16 FOLHA 4 3 3 0 2
5514 27 FOLHA 4 2 2 0 1
5515 27 FOLHA 4 2 2 0 1
5516 3 FOLHA 1 9 4 5 3
5521 18 FOLHA 18 4 2 2 3
5525 2 CAULE 1 4 2 2 3
5532 6 CAULE 1 5 1 4 2
5533 5 FOLHA 1 4 4 0 3
5534 30 FOLHA 4 5 1 4 2
5539 5 FOLHA 4 4 4 0 3
*UFMGCB = Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de Minas Gerais.
49
Os isolados de Clusia arrudae foram agrupados em 21 morfotipos considerando
cor, aspecto da colônia e textura. Os morfotipos 1 e 4 foram os mais frequentes(Figura
13). Análise somente dos extratos testados nos ensaios de viabilidade, a considerar a
frequência de números de morfotipos por planta (Figura 12), observa-se que o número
médio de morfotipos isolados em cada planta foi de 3 morfotipos e que os fungos do
morfotipo 1 e 4 foram mais presentes nos ensaios de viabilidade (Figura 13B). Na figura
13 C, relacionamos as plantas cujos fungos isolados foram utilizados nos ensaios de
viabilidade, com destaque para as plantas 2, 3 e 24. Não obtivemos fungos endofíticos
em nenhum dos órgãos de coleta oriundo da planta 1. A média de fungos isolados por
planta foi de 4 fungos(Figura 13 D). Considerando ainda o órgão de coleta é possível
verificarmos que foram isolados mais fungos do caule (Figura 13 E) do que de folha
(Figura. 13 F).
Figura 12. Gráfico de frequência pelo número de morfotipos. Observa-se que os
morfotipos 1 e 4 foram mais isolados entre todos (setas). Software SPSS 19.0 (IBM)
Freq
uên
cia
50
Figura 13. Gráficos de frequência. Relação dos números de fungo isolados e sua
frequência por planta (A). Frequência do tipo de morfotipos isolados (B). Números de
isolados de planta e sua frequência(C). Frequência dos números de isolados por planta
(D). Frequência de números de isolados no caule (E). Frequência de isolados na
folha(F). Software SPSS 19.0 (IBM).
A partir destas variáveis, fez-se uma análise de cluster hierárquico e um
dendrograma foi confeccionado (Figura 15). Ao analisarmos os agrupamentos gerados
percebe-se que os extratos tóxicos para as células testadas pertencem a grupos distintos
o que permitiu inferir considerações sobre as relações ecológicas entre os fungos e a
toxicidade apresentada. Os extratos tóxicos para WI26VA4 e RKO foram
51
predominantemente de fungos isolados do caule e do morfotipo 1. Estes extratos
diferem quanto a toxicidade para RKO de um fragmento de caule que só teve 1 fungo
isolado, enquanto que para a WI26VA4 o extrato tóxico foi oriundo de fragmentos do
caule onde foram isolados em média 3 morfotipos diferentes, conforme demonstrados
na Tabela 10. Os trabalhos encontrados na literatura, que envolvem o isolamento de
fungos endofíticos não os diferem quanto à origem do órgão coletado e o número de
morfotipos isolados. O que inviabiliza a interpretação de nossos resultados
correlacionados a dados de outros pesquisadores. No dendograma, podemos observar
que o grupo ao qual pertencem os extratos tóxicos para RKO está distante do grupo de
extratos tóxicos para HUTU, de acordo com a semelhança entre os grupos. Análises
estatísticas deverão ser realizados para verificar a significância entre as relações
ecológicas e a toxicidade apresentada pelos extratos.
Neste trabalho obtivemos estes dados uma vez que as relações ecológicas entre
indivíduos poderiam sugerir informações sobre a possibilidade de produção de
metabolitos de inibição por estes fungos. Sendo assim, quando verificamos que a
toxicidade para determinada linhagem tumoral, neste caso RKO ocorreu pelo extrato
que só teve um isolado, propõe-se que este fungo exerça pressão negativa produzindo
metabolitos secundários de inibição, responsáveis pela toxicidade. A síntese de
metabólitos secundários parece garantir ao fungo vantagem em habitats no qual este
necessita competir com outros micro-organismos. O que permite concluir que muitos
desses metabólitos apresentam efeitos tóxicos ou inibitórios em outros organismos. Por
estas propriedades, muito destes tem sido adotados para uso farmacêutico como
antibióticos, agentes hipocolesteromeantes, imunossupressores e inibidores de tumor
(KHALDI et. al., 2010).
Para HUTU os extratos com ação antitumoral foram isolados em sua maioria de
folhas pertencentes também ao morfotipo 1. Neste caso a toxicidade também ocorreu
para extratos que apresentaram menor número de morfotipos isolados, semelhante ao
ocorrido com a RKO, sendo que a principal diferença foi o órgão de coleta.
Estes resultados sugerem que as linhagens tumorais RKO e a HUTU possuem
mecanismos de mortes diferentes, embora sejam oriundas do sistema gastrointestinal e
que os extratos possuem moléculas com ações distintas, tendo em vista que os órgãos de
coleta têm funções diferentes na planta.
52
Estas diferenças de sensibilidade dos tumores às drogas fortalecem a busca por
novos alvos terapêuticos nas terapias de câncer bem como esforços na investigação dos
mecanismos básicos envolvidos na via de sinalização para a morte (apoptose) e para o
crescimento celular.
53
Figura 14. Dendrograma confeccionado a partir do software SPSS 19.0 considerando
os 41 extratos usados nos ensaios de viabilidade celular. Extrato com ação antitumoral,
para a linhagem RKO (seta vermelha), para HUTU (setas verdes). Com ação tóxica para
WI26VA4 (setas azuis). Extrato com ação tóxica e antitumoral para HUTU e WI26VA4
(seta preta).
54
Identificação molecular dos fungos endofíticos que apresentaram atividade citotóxica
A avaliação da diversidade microbiana representa um grande desafio da
microbiologia moderna, devido ao grande número de espécies microbianas já
conhecidas ou que se acredita existir (GAMBOA et al., 2002). Aly e colaboradores
(2011) sugerem que exista um certo grau de variabilidade na composição da
comunidade endofítica de plantas hospedeiras de um táxon, mesmo dentro de um nicho
aparentemente homogêneo, dada à influência fisiológica. As plantas são confrontadas
com diferentes fatores ambientais, devido à sua localização geográfica (ARNOLD
2007). Esta diversidade de fatores externos e internos pode influenciar a riqueza de
espécies de fungos endofíticos residentes (VEGA et al., 2010). Assim, algumas
espécies de plantas superiores podem praticamente hospedar centenas de espécies
de fungos endofíticos em um tipo de tecido, entretanto, a maioria das comunidades são
normalmente dominados por poucas espécies (SIEBER 2007; VEGA et al 2010;
BOTELLA & DIEZ 2011).
A identificação molecular dos fungos endofíticos neste trabalho foi realizada
apenas para os extratos dos isolados que apresentaram toxicidades para as linhagens de
células testadas. Os isolados UFMGCB 5467 e 5478 tiveram o mesmo perfil de
alinhamento quando comparadas com sequências depositadas no GenBank, os quais
apresentaram 100% de identidade com Pleoporales sp. (GU509025). Estes fungos
também apresentaram 99% de identidade para Corynespora sp. (JN198482) e
Pyrenochaeta sp. (JF502447) juntamente com os isolados UFMGCB 5485 e 5533 que
apresentaram 99% de identidade com fungos do gênero Pleosporales sp. (GU595025).
O isolado UFMGCB 5500 apresentou 99% de identidade para fungos do gênero Xylaria
sp. (GU324749) e o isolado UFMGCB 5502 demonstrou alinhamento satisfatório para
qualquer classe taxonômica (Tabela 11).
55
Tabela 11. Cinco melhores sequências alinhadas no BLAST de fungos endofíticos bioativos de Clusia arrudae, com substrato e origem de cada
sequência.
UFMGCB* Descrição dos melhores alinhamentos [no. de
acesso no GenBank]
Identidade (%) Substrato e origem
5467 Pleosporales sp. H4179[GU509025] 100 Endofítico de Coffea arabica, EUA
Pleosporales sp. VegaE3-63 [EU002939] 99 Endofítico de Coffea arabica, EUA
Corynespora sp. Z1 [JN198482] 99 Endofítico de Taxus chinensis var. mairei, China
Pyrenochaeta sp. 1-38 [JF502447] 99 Endofítico de Lindera glauca, China
Pleosporales sp. H4179[GU595025] 99 Endofítico de Rhizophoraceae, China
5478 Pleosporales sp. H4179[GU509025] 100 Endofítico de Coffea arabica, EUA
Pleosporales sp. VegaE3-63 [EU002939] 99 Endofítico de Coffea arabica, EUA
Corynespora sp. Z1 [JN198482] 99 Endofítico de Taxus chinensis var. mairei, China
Pleosporales sp. H4179 [GU595025] 99 Endofítico de Rhizophoraceae, China
Pyrenochaeta sp. 1-38 [JF502447] 99 Endofítico de Lindera glauca, China
5485 Pleosporales sp. H4179 [GU595025] 99 Endofítico de Rhizophoraceae, China
Pleosporales sp. VegaE2-28 [EU002938] 99 Endofítico de Coffea arabica, EUA
Pyrenochaeta sp. 1-38 [JF502447] 98 Endofítico de Lindera glauca, China
Corynespora sp. Z1 [JN198482] 99 Endofítico de Taxus chinensis var. mairei, China
Pleosporales sp. E7410b [HM855221] 90 Endofítico de Calycophyllum spruceanum, Equador
56
5500 Xylaria berteri [GU324749] 99 Madeira, Taiwan
Xylariaceae sp. [HQ117853] 99 Endofítico de Besleria quadrangulata, Equador
Xylariaceae sp. [EU009985] 99 Endofítico de Coffea arabica, EUA
Xylaria sp. [EU009986] 99 Endofítico de Euterpe precatoria, Equador
Xylaria enteroleuca [AM084368] 99 Fungo obtido de paciente com sinusite, Brasil
5502 Uncultured Pezizaceae [FJ788744] 85 Raiz de Corycium Esobanchoides, Inglaterra
Fungal endophyte sp. UFMGCB 1270
[FJ605261]
82 Endofítico da orquídea Octomeria sp., Brasil
Fungal sp. ARIZ AZ0498 [HM123222] 80 Talo do líquen Punctelia hypoleucites, EUA
Uncultured fungus [FM999684] 79 Esporocarpo, EUA
Peziza badioconfusa voucher 11414 [JF908532] 80 Não determinado
5533 Pleosporales sp. H4179 [GU595025] 99 Endofítico de Rhizophoraceae, China
Pleosporales sp. VegaE2-28 [EU002938] 99 Endofítico de Coffea arabica, EUA
Corynespora sp. Z1 [JN198482] 99 Endofítico de Taxus chinensis var. mairei, China
Pyrenochaeta sp. 1-38 [JF502447] 98 Endofítico de Lindera glauca, China
Pleosporales sp. E7410b [HM855221] 90 Endofítico de Calycophyllum spruceanum, Equador
*UFMGCB = Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de Minas Gerais.
57
Pleosporales é a maior ordem da classe dos Dothideomycetes. De acordo com
Kirk e colaboradores (2008) esta classe compreende 23 famílias, 332 gêneros e mais de
4.700 espécies. Membros do gênero Pleosporales podem ser endofíticos ou epifíticos
(HUANG et al. 2008), parasitas de folhas verdes e hastes (SOLOMON et al., 2006) e
liquenícolas (Calatayud et al., 2001).
A família Xylariaceae tem distribuição mundial, ocorrem como os principais
representantes de plantas tropicais investigadas (BAYMAN et al. 1998). Entretanto, as
funções ecológicas desempenhadas por este grupo de fungos ainda não foram até o
momento exploradas em detalhes (DAVIS etal., 2003). Alguns trabalhos demonstraram
que fungos endofíticos da família Xylariacea podem proporcionar efeitos benéficos
para seus hospedeiros in vivo (ARNOLD et al,. 2003). Fungos endofíticos do gênero
Xylaria, Phoma, Hypoxylon e Chalara são fungos representativos de produtores de
alcalóides do grupo das citocalasinas (WAGENAAR et al., 2000). Muito destes
metabólitos possuem atividade antitumoral e devido a sua toxicidade celular não tem
sido empregado em produtos farmacêuticos (STROBEL DAISY, 2003). Strobel e
colaboradores em 2004 descreveram um fungo da família Xylareaceae, a espécie
Muscodor albus como um produtor de uma mistura de compostos orgânicos voláteis
(COV) com efeito tóxico à vários organismos testes incluindo fungos patógenos de
planta, leveduras e bactérias. Em 2010 Silva e colaboradores obtiveram fungos
endofíticos do gênero Xylaria isolados de Piper aduncum. Neste trabalho, foi realizado
fracionamento dos extratos dos fungos do gênero Xylaria em cromatográfico e obtive-se
citocalasinas tóxicas para HeLa (tumor de colo de útero humano) e CHO (ovário de
hamster chinês). Rosa e colaboradores (2010) isolaram os fungos endofítico
UFMCB 899 e UFMGCB 903 que apresentaram 96 e 97% de identidade para Xylaria
sp., respectivamente. O extrato UFMGCB899 exerceu inibição de 43% para UACC-62,
66% para MCF-7 e 84% para a linhagem TR10. O extrato UFMGCB 903 inibiu o
crescimento da linhagem UACC-62 em 73%, MCF-7 em 96% e TR-10 em 94%. Estes
trabalhos demonstram a potencialidade de produção de metabólitos com atividade
antitumoral por endofíticos do gênero Xylaria. No presente trabalho também
identificamos esta atividade, pois este fungo deste gênero mostrou-se tóxico para as
linhagem normal WI26VA4,confirmando sua toxicidade e evidenciando a necessidade
58
de isolamento destes metabólitos para uma possível fonte de moléculas para o
tratamento de tumores com menor efeito colateral em células normais.
Ensaios de fluorescência
DAPI/Faloidina
Foram testadas as linhagens HUTU e RKO após exposição aos extratos fúngicos
utilizando sondas que marcam citoesqueleto de actina e núcleo. Podemos verificar no
controle de vida a morfologia característica da célula testada e sua organização. Não foi
verificado amontoados de células para o ensaio fluorescente como em cultura, as células
crescem em monocamada. Nas figuras que ilustram os ensaios de fluorescência
verificamos o núcleo da célula (azul) e a organização dos filamentos de actina (verde).
Os núcleos das células do controle de vida da HUTU (figuras 18 A e B)
apresentam tamanho em torno de 11µm e dimensões celulares de acordo com a
organização dos filamentos de actina (verde) em torno de 26 µm. Figuras 18 C e D são
da linhagem HUTU após exposição a 240µg/ml do extrato UFMGCB5478, onde
podemos perceber redução do tamanho do citoplasma (16µm) e quebra do citoesqueleto
de actina, sendo este reduzido a pontos fluorescentes evidenciados pelas marcações por
setas na figura. Resultado indica que este extrato provavelmente possui ação de
despolimerização dos filamentos de actina, fenômeno semelhante ao que acontece com
o Paclitaxel, que extraído de um fungo endofítico, age sobre a despolimerização de
microtúbulos, impedindo a divisão celular e por isso tornou-se um poderoso
quimioterápico (WANI et.al., 1971; STROBEL & DAISY 2003; KHARWAR , 2011).
O mesmo fenômeno pode ser percebido na Figura 18 E e F, para o extrato
UFMGCB5489, onde o citoesqueleto de actina desta célula também foi desorganizado,
o citoplasma reduzido e dimensões celulares em torno de 13 µm.
O Taxol® é amplamente utilizado na clínica médica, com excelentes resultados
contra tumores, mas um grande obstáculo à sua utilização é sua oferta limitada
(HOLTON et al., 1995a). Vários métodos têm sido desenvolvidos para a produção de
paclitaxel. A síntese química total do fármaco não é considerada economicamente
viável devido ao custo elevado e baixo rendimento. Estes problemas podem ser
59
solucionados através da biopropecção de fungos endófiticos que podem desempenhar
um papel importante na biossíntese do paclitaxel (LI & TAO, 2008).
Os núcleos das células do controle de vida para RKO apresentam tamanho em
torno de 15µm (azul) e dimensões celulares de acordo com sua a organização dos
filamentos de actina (verde) em torno de 29 µm, (Figuras 16A e B). As figuras 16 C e D
são da linhagem RKO após exposição a 240µg/ml do extrato UFMGCB5460, onde
podemos perceber, como ocorreu com as outras linhagens celulares, a redução do
tamanho do citoplasma (14µm) e quebra do citoesqueleto de actina. O mesmo fenômeno
percebemos na Figura E e F, para o extrato UFMGCB5489, onde o citoesqueleto de
actina desta célula também foi desorganizado, com citoplasma reduzido e dimensões
celulares em torno de 20 µm.
60
Figura 15. Fotomicrográfica de fluorescência da linhagem HUTU exposta a 240µg/mL
de extratos de fungos endofíticos associados à Clusia arrudae. As células foram
marcadas com Faloidina (verde) que identifica filamentos do citoesqueleto de actina e
por DAPI (azul) que identifica o núcleo. Na coluna da direita imagem de fluorescência e
na coluna da esquerda, imagens de DIC do mesmo campo visual. A e B- Controle de
vida; C e D- Células expostas ao extrato UFMGCB 5478 e E e F ao extrato UFMGCB
5502, podemos evidenciar, para ambos os extratos, que estes causaram alterações
morfológicas como quebra completa do citoesqueleto de actina reduzindo a marcação a
apenas um ponto de aglomeração citoplasmática (seta); E e F- Células expostas ao
extrato UFMGCB 5502, evidenciando alterações morfológicas de extrato.
61
FALOIDINA/DAPI DIC
UFMGCB 5478
Controle de vida
UFMGCB 5502
UFMGCB 5533
G
E F
H
A B
C D
62
Figura 16. Fotomicrografia de fluorescência da linhagem RKO exposta a 240µg/mL de
extratos de fungos endofíticos associados à Clusia arrudae. As células foram marcadas
com Faloidina (vermelho) que identifica filamentos do citoesqueleto de actina e por
DAPI (azul) que identifica o núcleo. Na coluna da esquerda, imagens de fluorescência e
na coluna da direita, imagens de DIC do mesmo campo visual. A e B- Controle de vida;
C e D- Células expostas ao extrato UFMGCB 5460, evidenciando alterações
morfológicas com perda da adesão celular e desorganização do citoesqueleto de actina;
E e F- Células expostas ao extrato UFMGCB 5489, evidenciando alterações
morfológicas de extrato cuja dose utilizada atingiu CI55.
63
64
Estes resultados para as linhagens HUTU e RKO evidenciam que estes extratos são
fontes promissoras de moléculas bioativas com ação antitumoral por agirem sobre o
citoesqueleto celular, fazendo com que as células percam sua organização, reduzindo as
dimensões citoplasmáticas a metade, e perda da capacidade de adesão levando-as a
morte (tabela 12), além da ausência de toxicidade para as células da linhagem normal
WI24VA4. Fenômeno semelhantemente a ação do Paclitaxel, que causam
despolimerização e agregação dos microtúbulos a partir dos dímeros de tubulina,
resultando na inibição da dinâmica normal de reorganização da rede de microtúbulos
essencial para as funções celulares (KHARWAR et. al., 2011). Os extratos Pleosporales
sp. UFMGCB 5478 e Pleosporales sp. UFMGCB 5502 mostraram capacidade de
quebra do citoesqueleto de actina da linhagem HUTU de maneira mais evidente do que
o extrato Pleosporales sp. UFMGCB 5460 para linhagem RKO. Estes extratos
reduziram a metade o tamanho do citoplasma destas células.
Tabela 12. Extratos testados que apresentaram toxicidade acima de 50%. As linhas
sombreadas representam os extratos mais promissores.
UFMGCB* Identificação Toxicidade
para WI26VA4
Antitumoral Quebra do
citoesqueleto
5460 Pleosporales sp. Não RKO Sim
5467 Pleosporales sp. Sim Não -
5478 Pleosporales sp. Não HUTU Sim
5485 Pleosporales sp. Sim Não -
5498 Pleosporales sp. Sim Não -
5500 Xylaria sp. Sim Não -
5502 Sem identifição Sim HUTU Sim
5533 Pleosporales sp. Não HUTU Não
Kit Live/Dead
Este ensaio também é conhecido como viabilidade celular, marca as células
vivas de verde e as células mortas de vermelho. Este kit é composto pela Calcein AM
que é hidrolisado por esterases a um produto fluorescente verde em células vivas e pelo
Ethidium homodimer-1, um produto fluorescente vermelho que atravessa a membrana
de células mortas e possui afinidade pelo núcleo. Pode-se observar que o extrato
UFMGCB 5533 (Figura 17, E e F) na concentração de 240µg/mL matou algumas
células (setas) e causou perda de adesão celular. Para o extrato de UFMGCB 5533
65
causou uma morte celular mais evidente (setas), sem perda da adesão celular. Para a
linhagem RKO foi testado o extrato UFMGCB 5460 (Figura 18, E e F) onde ficou
evidente a perda de adesão celular, além de provocar morte celular (setas). Analisando
esta microfotografia fica evidenciado que os extratos testados com o Kit de
LIVE/DEAD, têm efeito tóxico para as células, mas não e possível precisar o evento
que causou a morte destas células. O extrato UFMGCB 5533 mostrou ser capaz de
causar perda de adesão celular evidenciado pelo baixo número de células remanescentes
(Figura 21, G).
Estas análises foram apenas qualitativas, pelo inviável estudo detalhado das
populações celulares mortas e vivas, ensaios futuros utilizando este kit deverão ser
realizados associados a tecnologia de citometria de fluxo.
66
Figura 17. Fotomicrografia de fluorescência da linhagem HUTU exposta a 240µg/mL
de extratos de fungos endofíticos associados à Clusia arrudae usando o kit de
viabilidade LIVE/DEAD. Na coluna da esquerda, imagens de fluorescência e na coluna
da direita, imagens de DIC do mesmo campo visual.
67
UFMGCB 5533
Controle de
vida
Controle de
morte
UFMGCB 5478
LIVE/DEAD DIC
A
C
E
B
D
F
G H
68
Figura 18. Fotomicrografia de fluorescência da linhagem HUTU exposta a 240µg/mL
de extratos de fungos endofíticos associados à Clusia arrudae usando o kit de
viabilidade LIVE/DEAD.
69
Controle de vida
Controle de morte
UFMGCB 5460
LIVE/DEAD DIC
A
C
E
B
D
F
70
5 CONCLUSÕES
Clusia arrudae possui fungos endofíticos capazes de produzir extratos com
atividade antitumoral para adenocarcinoma de duodeno (HUTU), carcinoma de
colón humano (RKO) e atividade tóxica para a linhagem normal de fibroblasto
de pulmão (WI26VA4).
Os isolados agrupados no morfotipo 1 foram mais abundante, mas sua ação
tóxica pode estar relacionada ao órgão de coleta, número de morfotipo isolado
por órgão e a sensibilidade da célula testada.
A ação antitumoral dos fungos endofíticos de Clusia arrudae pode estar
relacionada à produção de metabólitos de inibição.
Usando técnicas de fluorescência foi possível observar que os extratos ativos de
Pleosporales sp. UFMGCB 5478 e UFMGCB 5502 mostraram ser capazes de
quebrar citoesqueleto para a linhagem HUTU; o extrato Pleosporales sp.
UFMGCB 5460 também exerceu quebra de citoesqueleto para RKO de maneira
menos evidente. Isso sugere que estes extratos podem apresentar, de maneira
semelhante, o que ocorre no mecanismo de ação do paclitaxel (Taxol®).
Novos ensaios deverão ser realizados para elucidar os mecanismos de morte
celular para as linhagens tumorais e vias de sinalização de genes ligados a
apoptose.
Os resultados obtidos neste trabalho abrem novas perspectivas para estudos mais
detalhados em relação a comunidade de fungos endofíticos associados a C.
arrudae.
71
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80
7 ANEXO
7.1 Tabela de classificação dos morfotipos isolados de Clusia arrudae
Tabela 13.
Morfotipo
Cor principal (frente)
Cor secundaria (frente)
Textura
Aspecto da borda
Cor do verso da cultura
1 Cinza esverdeada --------- Aveludado Rugoso Verde escuro
2 Branco Roxo Cotonoso Liso Branco
3 Laranja --------- Cotonoso Liso Amarelado
4 Branco --------- Cotonoso Liso Esbranquiçado
5 Branco Marrom Cotonoso Liso Amarelado
6 Branco Pontos pretos Aveludado Liso Branco com pontos pretos e laranja
7 Branco Preto (micélio) Cotonoso Liso Laranja com alguns pontos negros
8 Branco Vermelho Cotonoso Liso Vermelho
9 Branco Laranja Cotonoso Liso Laranja
10 Verde --------- Cotonoso Liso Preto
11 Branco Amarelado Cotonoso Rugoso Laranja
12 Branco Laranja Aveludado Liso Laranja
13 Branco Cinza Cotonoso Liso Branco
14 Marrom --------- Aveludado Liso Preto
15 Cinza Branco Aveludado Liso Laranja
16 Branco --------- Aveludado Rugoso Branco
17 Preto --------- Aveludado Liso Preto
18 Cinza --------- Cotonoso Liso Preto e branco
19 Rosa Branco Aveludado Liso Laranja
20 Branco --------- Aveludado Liso Branco
21 Verde --------- Aveludado Liso Preto
81
7.2 Fotos dos morfotipos isolados
Figura 19. Morfotipos isolados de Clusia arrudae. Morfotipos frente e verso.
Morfotipo 1
Morfotipo 2
Morfotipo 3
Frente Verso
Imagem não disponível
82
Figura 20. Morfotipos isolados de Clusia arrudae. Morfotipos frente e verso.
Morfotipo 4
Morfotipo 5
Morfotipo 6
Frente Verso
83
Figura 21. Morfotipos isolados de Clusia arrudae. Morfotipos frente e verso.
L
M
Morfotipo 7
Morfotipo 9
Morfotipo 8
Frente Verso
84
Figura 22. Morfotipos isolados de Clusia arrudae. Morfotipos frente e verso.
Morfotipo 11
Morfotipo 10
Morfotipo
12
Frente Verso
85
Figura 23. Morfotipos isolados de Clusia arrudae. Morfotipos frente e verso.
Morfotipo
13
Morfotipo
14
Morfotipo
15
Frente Verso
86
Figura 24. Morfotipos isolados de Clusia arrudae. Morfotipos frente e verso.
Morfotipo
18
Morfotipo
16
Morfotipo
17
Frente Verso
87
Figura 25. Morfotipos isolados de Clusia arrudae. Morfotipos frente e verso.
Morfotipo
19
Morfotipo
20
Morfotipo
21
Frente Verso
88
7.3 Gráficos dos ensaios de viabilidade dos isolados de Clusia arrudae utilizando três
linhagens celulares.
Figura 23. Ensaio de viabilidade para a célula RKO.
Figura 26. Ensaio de viabilidade para a célula RKO.
89
Figura 27. Ensaio de viabilidade para a célula RKO.
Figura 28. Ensaio de viabilidade para a célula RKO.
90
Figura 29. Ensaio de viabilidade para a célula RKO.
Figura 30. Ensaio de viabilidade para a célula RKO.
91
Figura 31. Ensaio de viabilidade para a célula RKO.
Figura 32.Ensaio de viabilidade para a célula HUTU.
92
Figura 33. Ensaio de viabilidade para a célula HUTU.
Figura 34. Ensaio de viabilidade para a célula HUTU.
93
Figura 35. Ensaio de viabilidade para a célula HUTU.
Figura 36. Ensaio de viabilidade para a célula HUTU.
94
Figura 37 Ensaio de viabilidade para a célula HUTU.
Figura 38 Ensaio de viabilidade para a célula HUTU.
95
Figura 39. Ensaio de viabilidade para a célula WI26VA4.
Figura 40. Ensaio de viabilidade para a célula WI26VA4
96
Figura 41. Ensaio de viabilidade para a célula WI26VA4
Figura 42. Ensaio de viabilidade para a célula WI26VA4
97
Figura 43. Ensaio de viabilidade para a célula WI26VA4
Figura 44. Ensaio de viabilidade para a célula WI26VA4
98
Figura 45. Ensaio de viabilidade para a célula WI26VA4