MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL SAÚDE PÚBLICA

ANA CARLA PEIXOTO GUISSONI

ATIVIDADE LARVICIDA DE ANACARDIUM OCCIDENTALE COMO ALTERNATIVA DE CONTROLE PARA AEDES AEGYPTI

E SUA TOXICIDADE EM ANIMAIS DE LABORATÓRIO

Orientadora: Profª. Drª. Heloisa Helena Garcia da Silva

Goiânia-GO, 2011

i

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

ANA CARLA PEIXOTO GUISSONI

ATIVIDADE LARVICIDA DE ANACARDIUM OCCIDENTALE COMO ALTERNATIVA DE CONTROLE PARA AEDES AEGYPTI

E SUA TOXICIDADE EM ANIMAIS DE LABORATÓRIO

Orientadora: Profª. Drª. Heloisa Helena Garcia da Silva

Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade Federal de Goiás como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre, na área de concentração de Parasitologia.

Goiânia-GO, 2011

ii

Dedico este trabalho a meus

pais,

Carlos Alberto Guissoni e

Antônia Modesto Peixoto

Guissoni.

iii

Agradecimentos

Agradeço primeiramente a Deus, Pai-Criador, por mais uma conquista,

pela oportunidade da vida e do aprendizado. Que eu possa utilizar os

conhecimentos adquiridos à luz de Sua sabedoria;

Aos meus pais e minhas irmãs, que mesmo à distância não deixaram de

me apoiar e de acreditar em mim. Saibam que a saudade nos momentos de

maiores dificuldades, somente valorizou ainda mais essa minha conquista;

Ao Gustavo, pela compreensão, apoio, encorajamento nas horas de

dúvida e pelo amor que tem por mim;

A Dra. Heloisa Helena Garcia da Silva, Professora Adjunto do

Departamento de Microbiologia, Imunologia, Patologia e Parasitologia

(DMIPP), do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP), da

Universidade Federal de Goiás (UFG), pela orientação, dedicação,

ensinamentos e apoio imprescindíveis neste trabalho;

Ao Dr. Ionizete Garcia da Silva, professor Titular do Departamento de

Microbiologia, Imunologia, Patologia e Parasitologia (DMIPP), do Instituto

de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP), da Universidade Federal de

Goiás (UFG), pelo apoio e sugestões;

Ao IPSTP e ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e

Saúde Pública da UFG pela oportunidade;

iv

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior,

CAPES, pelo apoio financeiro concedido;

A Carmeci Natalina Elias, Técnica de Laboratório da Secretaria de

Estado da Saúde de Goiás/ Fundação Nacional de Saúde-GO e aos amigos

Edson de Castro, Girlene Sena de Assis e Taísia Izabel Vieira, do

Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos, do IPTSP/UFG, pelo apoio

técnico e amizade durante o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Dr. Jayrson Araújo de Oliveira, Professor Adjunto do

Departamento de Morfologia, do Instituto de Ciências Biológicas da UFG,

pela ajuda na formatação final deste trabalho;

Aos amigos do Laboratório de PD&I de Produtos Fitoterápicos, da

Faculdade de Farmácia.

v

Sumário

Lista de Abreviações e Símbolos ....................................................................Vii

Lista de Figuras.................................................................................................iX

Lista de Tabelas................................................................................................X

Resumo.............................................................................................................Xi

Abstract.............................................................................................................Xiii

1. Introdução................................................................................................. 15

1.1 Dengue......................................................................................................15

1.2 Aedes aegypti............................................................................................19

1.3 Controle e Resistência do Vetor................................................................ 22

1.4 Inseticidas Alternativos.............................................................................. 25

1.5 Inseticidas Botânicos................................................................................. 27

1.6 Bioprospecção........................................................................................... 28

1.7 Anacardium occidentale.............................................................................30

1.8 Toxicidade Aguda em Animais de Laboratório.......................................... 32

2. Objetivos.................................................................................................... 33

2.1 Geral.......................................................................................................... 33

2.2 Específicos................................................................................................ 33

3. Material e Métodos.................................................................................... 34

3.1 Obtenção do Material Botânico................................................................. 34

3.2 Obtenção do Líquido da Castanha de Caju............................................... 34

3.3 Fracionamento do Líquido da Castanha de Caju ..................................... 35

3.4 Obtenção das Larvas..................................................................................36

3.5 Bioensaios Larvicidas em Laboratório....................................................... 37

3.6 Efeito Residual do Líquido da Castanha de Caju...................................... 38

vi

3.7 Ensaio de toxicidade aguda do Líquido da Castanha de Caju, segundo as diretrizes da OECD 2001.......................................................................... 39

3.7.1 Descrição dos Animais........................................................................... 39

3.7.2 Alojamento e Manejo dos Animais......................................................... 40

3.7.3 Descrição do Protocolo Experimental.................................................... 40

4. Resultados e Discussão......................................................................... 40

5. Referências Bibliográficas...................................................................... 42

Artigo I - Submetido á Revista da Sociedade Brasileira de Medicida Tropical

Atividade larvicida de Anacardium occidentale como alternativa ao controle de

Aedes aegypti e sua toxicidade em Rattus novergicus .................................. 57

RESUMO......................................................................................................... 56

ABSTRACT...................................................................................................... 57

INTRODUÇÃO................................................................................................. 57

MÉTODOS....................................................................................................... 58

RESULTADOS................................................................................................. 61

DISCUSSÃO.................................................................................................... 63

AGRADECIMENTOS....................................................................................... 65

REFERÊNCIAS................................................................................................ 66

vii

Lista de abreviações e símbolos

AO Anacardium occidentale

ANOVA Análise de Variância

Bti

BC

BHC

Bacillus thuringiensis var israelensis

Biotério Central

Benzeno-Hexa-Clorado

°C Graus Celsius

CDC Centers for Disease Control and Prevention

CL Concentração letal

CL50 Concentração letal que mata 50% das larvas

CL90

CNSL

Concentração letal que mata 90% das larvas

Cashew nut shell liquid

DMSO Dimetilsulfóxido

DEN V 1 Dengue vírus 1

DEN V 2 Dengue vírus 2

DEN V 3 Dengue vírus 3

DEN V 4

FF

Dengue vírus 4

Faculdade de Farmácia

FHD Febre hemorrágica do dengue

FUNASA Fundação Nacional de Saúde

g gramas

viii

h

Hj

IPTSP

Horas

Hormônio juvenil

Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

L

LCC

Litros

Líquido da Castanha do Caju

MS

NEPET

OECD

Ministério da Saúde

Núcleo de Estudos e Pesquisas Tóxico-Farmacológicas

Organization for Economic Co-operation and Development

OMS Organização Mundial de Saúde

OPAS

PNCD

Organização Pan-Americana da Saúde

Plano Nacional de Controle da Dengue

SVS

UBV

UFG

Secretaria de Vigilância em Saúde

Ultra baixo volume

Universidade Federal de Goiás

WHO World Health Organization

ix

Lista de figuras

Figuras da Apresentação

Figura 1: Ciclo Biológico do Aedes aegypti Imagens da criação cíclica mantida no Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos, do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás .......................... 21

Figura 2: Caju, castanha de caju e líquido da castanha de caju (Fonte: Mazzetto et al. 2009)........................................................................................ 31

Figura 3: Exsicata autenticada mantida no Herbário da Unidade de Conservação da Universidade Federal de Goiás ............................................ 34

Figura 4: Aspecto do Líquido da Castanha de Caju, obtido em estufa de ventilação forçada ............................................................................................ 35

Figura 5: Organograma do fracionamento do Líquido da castanha de Caju .......................................................................................................................... 35

Figura 6: Fracionamento do Líquido da Castanha de Caju em coluna cromatográfica, segundo a técnica de gradiente de polaridade. ...................... 36

Figura 7: Organograma dos bioensaios em laboratório ................................... 38

Figura do Artigo I

Figura 1 – Efeito residual da solução do líquido da castanha de Anacardium

occidentale, a 200ppm, sobre larvas de Aedes aegypti .................................. 63

x

Lista de Tabelas

Tabela da Apresentação

Tabela I: Incidência de dengue, em Goiás, no período de 2000 a 2010 ...........19

Tabela do Artigo I

Tabela I: Atividade larvicida, em laboratório, do líquido e das frações de Anacardium

occidentale sobre larvas de 3º estádio de Aedes aegypti ........................................ 62

xi

Resumo

Mosquitos hematófagos, vetores de doenças, representam uma grande

ameaça à saúde pública global. O mosquito Aedes aegypti (Diptera, Culicidae)

é o principal vetor dos quatro sorotipos do vírus da dengue e da febre amarela

urbana. A dengue é uma doença humana viral que está, gradualmente,

tornando-se endêmica na América Central e em vários países sul-americanos.

No momento não existem medicamentos antivirais específicos para seu

tratamento e nenhuma vacina está disponível para prevenção. A única medida

disponível para interromper a transmissão é o controle do vetor. Este é feito

através da eliminação dos criadouros potenciais, aplicação de larvicidas em

coleções de água e, para os adultos, aplicações espaciais de inseticidas. No

entanto, a crescente resistência das populações de Ae. aegypti aos atuais

inseticidas tem dificultado um eficiente controle. Além disso, outros problemas

graves surgiram por seu uso contínuo, tais como a toxicidade ambiental e

humana. Isto, consequentemente, aumentou a demanda pelo desenvolvimento

de métodos alternativos para o controle do mosquito, que sejam menos

agresivos para os humanos e outros seres vivos. Assim, os compostos

derivados de plantas têm surgido como bons candidatos, não só como

ferramentas eficazes no controle do vetor, mas também como agentes

ambientalmente seguros. Após a coleta e aquecimento dos frutos de

Anacardium occidentale L. a 40° C, obteve-se um líquido, conhecido como

Líquido da Castanha do Caju (LCC), que depois de testado quanto à sua

atividade larvicida em laboratório, foi fracionado em coluna de sílica gel. O

fracionamento deu origem a oito frações, as quais foram codificadas como AO1

xii

a AO8. Neste trabalho, o LCC, e suas frações foram avaliados quanto a sua

atividade biológica em larvas de 3° estádio de Ae. aegypti Foi avaliado também

o efeito residual do LCC e sua toxicidade em animais de laboratório (Rattus

novergicos). Para o LCC foram encontradas CL50 e CL90 de 6,55 e 10,98 ppm,

respectivamente. Já as frações ativas, AO2 e AO3, apresentaram CL50 e CL90 de

3,18 e 7,80 ppm, e 3,57 e 10,47ppm, respectivamente. O LCC apresentou

efeito residual até o 6º dia e mostrou ser atóxico após tratamento subagudo via

oral em ratos.

Palavras chaves: Aedes aegypti, Dengue, Anacardium occidentale

xiii

Abstract

Feeding mosquitoes and disease vectors have been considered a major threat

to global public health. The mosquito Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) is the

main vector of the four serotypes of dengue and urban yellow fever. Dengue is

a viral human disease that is gradually becoming endemic in Central America

and several South American countries. Nowadays, there is no specific antiviral

drug for treatment and no vaccine available for prevention. The only available

measure to interrupt transmission is vector control, which is done when

potential breeding are eliminated with larvicides application in water recipients,

and, in case of adult vectors, with insecticides dispersion though the air.

However, the increasing resistance of populations of Ae. aegypti to current

insecticides has made effective control hard to achieve. Besides, other serious

problems have arisen because of their continued use, such as environmental

and human toxicity, which, consequently, have encouraged the development of

alternative mosquito control methods, less aggressive to humans and other

living beings. Thus, compounds derived from plants have been considered good

choice to be used as effective tools in controlling the vector, also as

environmentally safe agents. After collecting and heating Anacardium

occidentale L. fruits 40 ° C, the liquid obtained was tested to confirm its

larvicidal activity. Then, it was fractionated by silica gel column. The

fractionation resulted in eight fractions, which were coded as AO1 to AO8. In this

paper, the Cashew Nut Shell Liquid (CNSL) and its fractions were evaluated for

their biological activity in third instars’ larvae of Ae. aegypti. The residual effect

of CNSL and its toxicity in laboratory animals (Rattus novergicos) were

xiv

evaluated. Considering the CNSL, LC50 and LC90 of 6.55 and 10.98 ppm,

respectively, were found in the laboratory. The active fractions, AO2 and AO3,

presented LC50 and LC90 of 3.18 and of 7.80 ppm, and 3.57 and 10.47 ppm,

respectively. The CNSL had residual effects until the 6th day and was shown to

be nontoxic after oral subacute treatment in rats.

Key words: Aedes aegypti, Dengue, Anacardium occidentale

15

1. Introdução

1.1 Dengue

A dengue é uma doença febril aguda, causada por um arbovírus da

família Flaviviridae, pertencente ao gênero Flavivirus. Na etiologia da dengue

estão envolvidos quatro sorotipos virais, denominados DENV-1, 2, 3 e 4

(Figueiredo 2000), transmitidos por meio da picada de fêmeas do gênero

Aedes, infectadas, sendo o Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) (Linnaeus,1762)

seu principal vetor (Tauil 2001, Braga & Valle 2007).

As manifestações clínicas da dengue são descritas como uma síndrome

viral, inespecífica e benigna, ou um quadro grave e fatal de doença

hemorrágica. Os fatores de risco para casos graves são a cepa do sorotipo do

vírus infectante, o estado imunitário e genético do paciente, a concomitância

com outras doenças e a infecção prévia por outro sorotipo viral da doença

(Tauil 2001). A transmissão ocorre preferencialmente na zona urbana,

ambiente no qual se encontram todos os fatores fundamentais para sua

ocorrência: o homem, vírus, vetor e principalmente as condições políticas,

econômicas e culturais que formam a estrutura que permite o estabelecimento

da cadeia de transmissão (Hino et al. 2010).

Os primeiros relatos da dengue, na literatura, são de 1779 e 1780, com

ocorrência simultânea de surtos na Ásia, na África e na América do Norte (CDC

2008), mostrando a ampla distribuição do vírus e vetor, nos trópicos, há mais

de 200 anos (Gubler 1998, Pérez et al. 1998, Guzmán & Kourí 2001, Twiddy et

al. 2003, CDC 2008). Atualmente, a dengue é endêmica em mais de 100

países, e a Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que 3,5 bilhões de

16

pessoas no mundo vivem atualmente em áreas com o Aedes aegypti (MS

2002).

A disseminação da doença pelo mundo se deu, principalmente, por meio

da navegação e do comércio, e foi responsável por epidemias devastadoras

em cidades portuárias (Gubler & Kuno 1997) uma vez que o mosquito Ae.

aegypti se disseminava através das embarcações.

No Brasil, os primeiros relatos da dengue, com base em evidências

epidemiológicas, datam do século XIX com surtos nos Estados do Rio de

Janeiro, Bahia, Pernambuco e outras localidades no norte do país (Mariano

1917). Em 1981, ocorreu a primeira epidemia documentada clínica e

laboratorialmente, em Boa Vista, Roraima. Tratou-se de uma epidemia com

caráter local, causada pelos sorotipos DENV-1 e DENV-4, atingindo cerca de

11.000 pessoas (Osanai et al. 1983).

Em 1986 ocorreu a introdução do DENV-1 no Rio de Janeiro, com cerca

de 95.000 casos notificados (Schatzmayr et al. 1986; Figueiredo 1996). O país

se viu diante de uma nova situação epidemiológica, uma vez que o Rio de

Janeiro era um grande centro urbano, com fluxo intenso de pessoas e uma

cidade portuária. Esses fatores, associados ao deficitário programa de controle

do vetor, contribuíram para a disseminação da dengue para outros Estados

(Maciel et al. 2008). No mesmo ano foram registradas epidemias nos estados

de Alagoas e Ceará (Vasconcelos et al. 1995). Até 1989, surtos epidêmicos

causados pelo DENV-1 foram registrados em São Paulo, Minas Gerais, Bahia e

Pernambuco (Marzochi 1994, Nogueira et al. 1995).

Em 1990, o DENV-2 foi isolado em Niterói, RJ (Nogueira et al. 1990), e a

circulação simultânea do DENV-1 e DENV-2 resultou no aparecimento dos

17

primeiros casos de febre hemorrágica da dengue (FHD) no Brasil, com 1.316

notificações, 462 casos confirmados e 8 óbitos (Teixeira et al. 1999, Siqueira -

Júnior et al. 2004).

Casos de FHD, ocasionados por DENV-2, também ocorreram durante a

epidemia no Ceará, em 1994, com 14 óbitos registrados (Nogueira et al. 1999).

Naquele ano os sorotipos DENV-1 e DENV-2 já estavam presentes em 20 dos

27 estados do país (Santos 2003). Em 1998, 2.675 dos 5.507 municípios do

Brasil, já tinham o sorotipo DENV-1 em seus territórios e o Ae. aegypti, único

transmissor comprovado da dengue no Brasil, tinha sido detectado em 2.910

municípios (Teixeira et al. 2002). Em 1998, foi detectado o DENV-3, pela

primeira vez, em um caso isolado na cidade de Limeira, São Paulo (Rocco et

al. 2001). Nos anos de 2000 e 2001 foi detectado em Nova Iguaçu-RJ e em

Roraima, respectivamente.

O ano de 2001 foi marcado pela mais grave epidemia de dengue já

ocorrida no Brasil após a dispersão do DENV-3, com mais de 794.000 casos

notificados (SVS/MS 2003), dos quais 288.245 no Rio de Janeiro (Nogueira et

al. 2001, Maciel et al. 2008). Esse quadro de risco elevado de epidemias e de

aumento nos casos de FHD levou o Ministério da Saúde (MS) a elaborar o

Programa Nacional de Controle da Dengue (PNCD) (Funasa 2002).

Já no ano de 2003, os três sorotipos virais (DENV-1,2 e 3) circularam

concomitantemente em 22 unidades federadas, sendo o DENV-3 o sorotipo

prevalente na maioria dos estados. Foram notificados 324.512 casos de

dengue, 618 de FHD e 33 óbitos, representando uma taxa de letalidade de

5,3% (SVS/MS 2003). Em 2007, foram notificados no país 85.018 casos de

dengue, sendo a maioria em Mato Grosso do Sul - 40.187 (50,4%); Mato

18

Grosso - 5.764 (7,2%); Rio de Janeiro - 4.196 (5,2%); Paraná - 3.815 (4,7%);

Minas Gerais - 3.704 (4,6%) e São Paulo - 2.908 casos (3,6%). Em 2008 foram

registrados, de janeiro a março, 120.413 casos de dengue clássica, 647 casos

de FHD e a ocorrência de 48 óbitos (MS 2008).

No Brasil, os casos notificados de dengue e de FHD predominam em

adultos jovens, e desde 2006, verifica-se, cada vez mais, um aumento do

número de casos em crianças (Teixeira et al. 2008), o que é um alerta para o

risco de mudanças no perfil de dengue no Brasil, semelhante ao padrão

asiático, onde a FHD foi uma doença que acomete crianças, sendo uma das

principais causas de hospitalização infantil (Halstead 2006).

A situação epidemiológica da dengue em Goiás vem se agravando desde

a introdução do DENV-1, em 1994. Estudando a incidência de dengue em

Goiás, de 2001 a 2005, Souza et al. (2010) observaram maior incidência nos

meses chuvosos, quando aumentam, tanto a densidade como a longevidade

do vetor. Hoje circulam no estado três sorotipos DENV-1, 2, 3; e a grande

maioria dos casos é registrada na região metropolitana de Goiânia.

Em Goiás ocorre a grande epidemia em 2002 (Tabela I), provavelmente

devido à entrada do sorotipo DENV-3 com mais de 80% dos casos na região

metropolitana de Goiânia (Souza et al. 2010). No ano de 2005, outra importante

epidemia aconteceu, com um aumento de casos de 307% em relação ao ano

anterior. Até outubro de 2010 registrou-se um aumento de 85% dos casos em

relação ao total de casos de 2009 (Tabela I).

19

Tabela I: Incidência de dengue, em Goiás, no período de 2000 a 2010.

ANO CASOS

NOTIFICADOS

ÓBITOS POR DENGUE HEMORRÁGICA

(FHD)

ÓBITOS POR DENGUE COM COMPLICAÇÕES

TOTAL DE ÓBITOS

2000 2.769 1 4 5

2001 13.612 2 2 4

2002 28.373 2 4 6

2003 12.977 4 4 8

2004 8.973 0 0 0

2005 23.412 6 5 11

2006 30.386 7 17 24

2007 15.698 11 13 24

2008 46.269 15 30 45

2009 44.083 20 27 47

2010* 98.724 26 39 65

*Dados parciais, referentes a 39ª semana de 2010 (até dia 02/10/2010).(Fonte: Secretaria da Saúde do Estado de Goiás)

1.2 Aedes aegypti

O principal vetor da dengue, o Ae. aegypti, é um mosquito de origem

africana, encontrado principalmente em países de clima tropical e subtropical

(Mackenzie et al. 2004). Foi reconhecido como vetor da febre amarela em 1881

(Rodriguez & Finlay 1971) e em 1906 foram publicadas as primeiras evidências

de que a espécie era também o vetor da dengue (CDC 1979). Atualmente é o

principal vetor da febre amarela urbana e dos quatro sorotipos do vírus dengue,

em mais de 100 paises (Foley et al. 2007).

É um mosquito sinantrópico, altamente antropofílico e possui atividade

hematofágica diurna (Gubler 2002, Tauil 2002). Machos e fêmeas alimentam-

20

se de seiva, entretanto, a fêmea necessita de repastos sanguíneos para a

maturação de ovos, sendo apenas as fêmeas hematófagas (Consoli & Oliveira

1998). Uma vez infectada a fêmea do Ae. aegypti, permanece assim por toda a

sua vida. A fêmea realiza múltiplos repastos antes de completar seu ciclo

gonotrófico, contribuindo para o maior potencial de disseminação da virose

(Donalísio & Glasser 2002). Platt et al. (1997) mediram o tempo médio de

repasto de fêmeas infectadas comparadas com não infectadas e notaram uma

maior duração da refeição em mosquitos infectados, fato que aumenta a sua

capacidade vetorial, como transmissor da dengue, pois induz a fêmea à

procura de hospedeiros seqüenciais.

O Ae. aegypti tem desenvolvimento holometabólico, com as fases de ovo,

larva, pupa e adulto (Figura 1). Os ovos medem aproximadamente 1mm de

comprimento e têm uma alta capacidade de entrar em quiescência e resistir à

dessecação. Este fato foi observado por Silva & Silva (1999) demonstrando

que em condições de laboratório os ovos permanecem viáveis até 492 dias

eclodindo mais tarde quando em contato com a água.

A larva apresenta um sifão respiratório no último segmento abdominal,

ficando posicionada perpendicularmente à água, movimenta-se ativamente e

alimenta-se constantemente. Passa por quatro estádios larvais e após um

período de 2 dias transforma em pupa. Esta não se alimenta e permanece

nessa fase de um a três dias, após o qual emerge o adulto.

21

Figura 1: Ciclo Biológico do Aedes aegypti. Imagens da criação cíclica mantida no Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos, IPTSP/UFG.

Os primeiros registros da presença do Ae.aegypti em terras brasileiras

datam de 1898 (Franco 1969). Diante de grandes campanhas contra esse

vetor, ele foi considerado erradicado no território nacional nos anos de 1958 e

1973. Falhas na vigilância entomológica propiciaram sua reintrodução em

1976, e dez anos após, a estratégia de erradicação foi substituída pelo controle

(Teixeira & Barreto 1996). Em Goiás foi introduzido em 1987; três anos após

era notificada sua presença em Goiânia (Silva et al.1990) e em 12 meses já

estava presente em todos os bairros (Silva et al. 1991).

A complexidade do mundo moderno, com o crescimento da indústria de

embalagens descartáveis e a expansão desorganizada dos centros urbanos,

22

gera grande acúmulo de lixo inorgânico que serve como criadouro, dificultando

o controle do Ae. aegypti (Funasa 2002). Apesar de ter preferência por

recipientes contendo água relativamente limpa, já se observam indícios de

adaptação desse mosquito a ambientes poluídos (Clements 1999, Silva et al.

1999b).

1.3 Controle e Resistência de Aedes aegypti

O controle da dengue vem tendo insucesso em quase todo o mundo,

devido a não disponibilidade de vacinas (Guzman 1988) e inexistência de

drogas antivirais capazes de reduzir a viremia. Assim, os programas de

controle baseiam-se em medidas direcionadas para a eliminação do principal

vetor, o Ae. aegypti. A estratégia mais adotada nas ações de controle é o uso

de inseticidas químicos para adultos e larvas. A maior problemática nesta

prática é o surgimento da resistência aos produtos utilizados o que favorece o

crescimento das populações de mosquitos, resultando no aumento da doença

(Luna et al. 2004).

O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por longos

períodos foi um dos mais importantes avanços no controle de insetos no século

XX. O primeiro inseticida de efeito prolongado, ou propriedade residual, foi o

dicloro-difenil-tricloroetano (DDT), um organoclorado desenvolvido durante a

Segunda Guerra Mundial, que, quando aplicado em paredes e tetos de casas,

permanecia ativo contra os insetos por vários meses (Rozendaal 1997).

As propriedades inseticidas do DDT foram descobertas pelo

entomologista suíço Paul Muller, premiado com o Prêmio Nobel de Medicina,

no controle dos vetores de malária, febre amarela e muitas outras doenças

23

(Ware 2000, Solomons & Fryhle 2008). Embora o modo de ação do inseticida

nunca tenha sido claramente estabelecido, sabe-se que ele atua no canal de

sódio, provavelmente mantendo-o aberto e destruindo o equilíbrio de íons sódio

e potássio dos axônios, impedindo, assim, a transmissão normal de impulsos

nervosos em insetos e mamíferos. Seu efeito é inversamente proporcional à

temperatura: quanto mais baixa a temperatura, mais tóxico é o DDT para os

insetos (Ware 2000, Braga & Valle 2007).

O efeito obtido com o DDT trouxe um otimismo exagerado e este

começou a ser empregado de maneira indiscriminada e em doses cada vez

maiores. Em pouco tempo, porém, iniciou-se o declínio dessa fase. Observou-

se que os inseticidas clorados (DDT, BHC) e fosforados (Parathion, Malathion)

causavam efeitos indesejáveis aos ecossistemas e eram altamente tóxicos

para o homem. Além disso, com sua enorme capacidade de adaptação, a

natureza respondia com o surgimento de populações de insetos mais

resistentes. Carson (1962), com seu livro Silent Spring, provocou no homem

uma reflexão e a conscientização de que a natureza é vulnerável à intervenção

humana, levando-o a um maior respeito aos mecanismos naturais de

adaptação.

Os organofosforados, descobertos posteriormente aos organoclorados,

incluem todos os inseticidas que contêm fósforo em sua fórmula estrutural

(Crinnion 2000). Estes foram amplamente utilizados em saúde pública por

apresentarem muitas vantagens sobre os organoclorados. Mas são

substâncias a instáveis quimicamente, o que torna obrigatória a renovação

periódica de sua aplicação. Além disso, são mais tóxicos para os vertebrados

24

que os organoclorados, mesmo em doses relativamente baixas (Ware 2000,

Palchick 1996).

Para o controle das larvas, o temephos (organofosforado) era, até pouco

tempo, o produto exclusivo, e foi usado por mais de 30 anos. É utilizado a

1ppm de princípio ativo, adsorvido em grãos de areia em uma formulação

contendo 1% dessa substância (Lima et al. 2006). Com as epidemias de 1986,

seu uso foi amplamente intensificado.

Para o controle de adultos, tem sido utilizada a aplicação de inseticidas a

ultra-baixo-volume (UBV). Porém, o pequeno impacto desse método na

circulação viral tem levado a uma reavaliação das estratégias de controle

(OPAS 1995). Atualmente é utilizado o inseticida cipermetrina, composto

pertencente ao grupo dos piretróides, na concentração final de 0,3% do

princípio ativo.

Em várias regiões do Brasil como em São Paulo, no Rio de Janeiro,

Espírito Santo, Ceará, Alagoas e Sergipe, Goiás e Paraíba, já se observa um

quadro bastante preocupante de resistência ao temephos (Macoris et al. 2003,

Lima et al. 2003, Braga et al. 2004, Lima et al. 2006, Carvalho & Silva 1999,

Beserra et al. 2007

O aparecimento de resistência é um processo inevitável, resultante do

efeito seletivo de exposição a dosagens que matam os indivíduos suscetíveis,

sobrevivendo os resistentes que transferem essa capacidade a seus

descendentes. Quanto mais o inseticida for utilizado, mais rápido e maior é a

seleção de insetos resistentes na população e, consequentemente, maior o

nível de resistência atingido. A capacidade dos insetos de resistir

concentrações inicialmente letais promove uma redução gradual na eficácia

25

dos inseticidas, até a sua completa ineficiência (OMS 1987). Desta forma, as

atividades de controle têm requerido o uso de novos inseticidas ou a sua

substituição por métodos físicos e agentes biológicos, durante o maior período

possível (OMS 1992).

Os fatores operacionais também desempenham um importante papel na

implantação da resistência. Estes estão relacionados ao uso de inseticidas

(classe, formulação e concentração, método de aplicação, freqüência de

tratamentos) e por isso, podem ser perfeitamente controlados, fato que, na

verdade, não ocorre devido ao uso indiscriminado dos produtos (Cruz 2002,

Carvalho et al. 2004).

A contínua utilização de inseticidas químicos no controle dos insetos

vetores pode causar desequilíbrios ambientais como a eliminação de insetos

benéficos e a contaminação do meio ambiente (solo, água, atmosfera). E

também podem ser responsáveis por intoxicações acidentais em pessoas,

devido à má utilização desses produtos. Assim, todas as substâncias químicas

podem causar efeitos adversos à saúde dependendo da dose e das condições

às quais os indivíduos são expostos a elas (Paumgartten 1993).

Todos esses fatores alertam a comunidade científica para a elaboração

de formas alternativas para o controle dos insetos vetores.

1.4 Inseticidas Alternativos

Além do controle químico, outros produtos, pertencentes aos grupos dos

inseticidas biológicos e dos reguladores de crescimento, vêm sendo utilizados

no controle de vetores, como medidas alternativas.

26

No grupo dos reguladores de crescimento, pode-se citar, além do

methoprene, um dos mais antigos análogos de hormônio juvenil desenvolvidos,

o pyriproxifen, também quimicamente relacionado ao hormônio juvenil natural

(HJ), de grande eficácia (Hoy 1985). Ambos são recomendados pela OMS para

controle de Aedes sp. em água (Mulla et al. 1982, Lourenço-de-Oliveira et al.

2003). Existem outros compostos, os inibidores da síntese de quitina, que,

apesar de não quimicamente relacionados ao HJ, produzem efeitos similares

(Mulligan et al. 1980, Mulla et al. 1982, Scholte et al. 2003). Os mais

conhecidos são o diflubenzuron e o triflumuron, que atuam sobre as larvas

ocasionando sua morte durante a ecdise (Borges et al. 2004, Martins & Silva

2004). A larva não consegue eliminar a cutícula velha porque, aparentemente,

devido à inibição da deposição de quitina, não há rigidez suficiente para isso.

O controle biológico de mosquito utiliza microorganismos capazes de

parasitar ou de ser predador de mosquitos em suas várias fases evolutivas. As

intervenções baseadas na introdução desses organismos ainda são, em

grande parte, experimentais, e as informações referentes a eficácia do controle

biológico são baseadas em resultados de campo em pequena escala (Funasa

2001). Dentre as alternativas disponíveis, o MS vem adotando o uso do

Bacillus thuringiensis israelensis (Bti). O Bti tem elevada propriedade larvicida e

seu mecanismo de atuação baseia-se na produção de endotoxinas protéicas

que, quando ingeridas pelas larvas, provocam sua morte (MS 2010).

Fungos entomopatogênicos são também estudados para controle de

mosquitos. Atividades larvicida e adulticida de Beauveria bassiana e

Metharizium anisopliae em mosquitos já foram descritas em condições de

laboratório (Scholte et al. 2003, Silva et al. 2004a, Silva et al. 2004b, Scholte et

27

al. 2007, Luz et al. 2007, 2008 ). A atividade de fungos varia de acordo com a

espécie e linhagem. Linhagens virulentas que conseguem infectar e eliminar

todos os estágios evolutivos de Ae. aegypti tem potencial para um controle

desse vetor.

1.5 Inseticidas Botânicos

As plantas são fontes naturais de substâncias inseticidas e

antimicrobianas, já que as mesmas são produzidas pelo vegetal em resposta a

um ataque patogênico. Essas substâncias são sintetizadas e degradadas por

inúmeras reações anabólicas e catabólicas, que compõem seu metabolismo.

Os compostos resultantes desse metabolismo são separados em produtos do

metabolismo primário (glicídios e lipídios) que, em geral, são macromoléculas

amplamente produzidas pelos seres vivos (Harbone & Tomas-Barberam 1991),

e os do metabolismo secundário, que são micromoléculas como os

terpenóides, alcalóides, fenóis, glicosídeos etc.

Atualmente, sabe-se que essas substâncias são defesas de natureza

química e que as rotas metabólicas que levam à produção desses compostos

secundários são ativadas durante alguns estágios particulares de crescimento

ou em períodos de estresse (Mann 1987).

A biodiversidade das florestas tropicais serve como foco para a

descoberta de novas plantas medicinais. A interação entre plantas tropicais e

seus predadores naturais pode ser usada como suporte para a descoberta de

substâncias ativas com propriedades inseticidas e seletivas para serem usadas

em futuras formulações de um produto comercial (Braz Fillho 2010). Diversos

28

estudos comprovam a atividade de extratos vegetais e moléculas botânicas

contra diferentes espécies de mosquitos (Guimarães et al. 2001, Macêdo et al.

1997, Nath et al. 2006, Pavela 2008) incluindo Ae. aegypti (Angerilli 1980,

Ciccia et al. 2000, Arruda et al. 2003, Carvalho et al. 2003, Silva et al. 2003,

Silva et al. 2004, Simas et al. 2004, Silva et al. 2007, Geris et al. 2008,

Massebo et al. 2009).

Esta propriedade larvicida tem despertado o interesse da comunidade

científica já que os inseticidas usados em programas do governo no combate a

insetos vetores são tóxicos e poluentes. Grupos diversos de pesquisadores

procuram inseticidas viáveis, seletivos, biodegradáveis e econômicos para

serem usados em programas de controle de insetos com baixo impacto

ambiental, buscando dar maior segurança à população (Guimarães et al. 2001,

Arruda et al. 2003, Silva et al. 2003, Silva et al. 2004, Simas et al. 2004a,

Zanon et al. 2006 Geris et al 2008, Garcez et al. 2009).

1.6 Bioprospecção

A análise de substâncias bioativas em plantas é complexa e trabalhosa,

envolvendo várias etapas e diferentes pesquisadores. Primeiramente faz-se a

coleta para a identificação botânica da espécie. Coletam-se pequenos ramos

com folhas, flores e frutos em vários estágios de desenvolvimento. As amostras

coletadas são prensadas e secas, e encaminhadas para um herbário para

identificação. Após identificação científica, a planta é catalogada, com o nome

científico e família botânica; nome de quem identificou a espécie; número de

29

registro da exsicata; local do herbário; local e data da coleta; nome popular da

planta.

Se houver coletas em locais ou épocas distintas, inicia-se novamente todo

o processo de identificação botânica, porque muitas vezes plantas diferentes

são conhecidas popularmente pelo mesmo nome (Maciel et al. 2002).

Na etapa que determina o estudo fitoquímico, escolhe-se a parte da

planta que será investigada e a quantidade de material que será coletado.

Deve-se coletar entre 3 a 6 kg de material vegetal, buscando com isso, o

isolamento em grandes quantidades de substâncias majoritárias, possibilitando

suas avaliações farmacológicas. As etapas do processamento fitoquímico

variam de acordo com a parte da planta que será trabalhada. Quando se

trabalha com caule ou raízes, geralmente as fases são de secagem, moagem,

percolação e evaporação. Todos os extratos e frações devem ser testados

biologicamente e, os que apresentarem atividade de interesse, devem ser

submetidos aos procedimentos cromatográficos que são os métodos mais

usados atualmente para isolamento e purificação de compostos ativos.

A relativa facilidade de coleta, aliada a condição ambiental favorável para

desenvolvimento sustentável, a biodiversidade estrutural de substâncias

orgânicas naturais e a possibilidade de descoberta de princípios ativos entre os

constituintes químicos permitem diagnosticar e destacar as plantas brasileiras

como a principal fonte renovável para o surgimento e desenvolvimento de

novos fármacos, além de outros produtos que podem ser utilizados para

finalidades sociais adicionais (Braz-Filho 2010).

30

1.7 Anacardium occidentale

O gênero Anacardium possui 11 espécies descritas, sendo seu principal

representante o Anacardium occidentale L. Pertencente à família

Anacardiaceae é uma árvore de aparência exótica, troncos tortuosos, folhas

glabras, flores masculinas e hermafroditas e fruto reniforme. Seu pedúnculo

(caju) superdesenvolvido e muito apreciado pela suculência é frequentemente

confundido com o fruto, quando na verdade se trata do pseudofruto,

cientificamente denominado de pedúnculo floral, com coloração variante entre

o amarelo e o vermelho (Mazzetto et al. 2009).

O cajueiro é descrito como uma ótima fonte medicinal (Shultes & Raffau

1990). É usado em aplicações como analgésico, diurético, líquido para higiene

bucal, tratamento de astenia, problemas respiratórios, gripe, bronquite, tosse,

escorbuto infantil, eczema, infecções genitais, sarna, doenças de pele,

verrugas e feridas. Do cajueiro, praticamente tudo se aproveita. Seu teor de

vitamina C é maior que o da laranja, contém niacina 6 uma das vitaminas do

complexo B, e ferro, sendo seu pedúnculo utilizado na fabricação de sucos,

vinhos, licores, doces e compotas.

Por ser rico em fibras também é muito empregado para aumentar a

movimentação intestinal. As folhas novas, quando cozidas e colocadas sobre

feridas promovem cicatrização. A madeira, muito resistente à água do mar, é

empregada na fabricação do cavername de pequenos barcos, na construção

civil, confecção de cabos de ferramentas e caixotaria (Mazzetto et al. 2009). A

casca do tronco contém uma substância tintorial vermelho-escuro usada no

31

tingimento de tecidos e redes. Após processamento, a amêndoa pode ser

consumida como castanha, torrada, farinha, no preparo de doces, pratos

quentes e é exportada para todo o mundo.

O fruto do cajueiro, popularmente conhecido como castanha de caju, é

um aquênio de comprimento e largura variável, casca coriácea lisa, mesocarpo

alveolado, repleto de um líquido escuro quase preto e inflamável, chamado de

líquido da castanha do caju (LCC) ou cashew nut shell liquid (CNSL) como é

conhecido internacionalmente (Figura 2) (Mazzetto et al. 2009).

Figura 2: Caju, castanha de caju e Líquido da Castanha de Caju (Fonte: Mazzetto et al. 2009).

Para a obtenção do LCC, emprega-se diferentes processos como a

extração a frio, extração por solventes (Kumar et al. 2002, Correia et al. 2006) e

o processo térmico-mecânico, onde o próprio LCC quente é utilizado para

aquecer as castanhas a 190 oC. Quando submetido a altas temperaturas o

ácido anacárdico sofre reação de descarboxilação convertendo-se a cardanol,

produzindo o denominado LCC técnico (Lopes 2005, Rios et al. 2008).

Mazzetto et al. (2009) analisaram tanto o LCC natural quanto o LCC técnico. O

32

natural apresentou maior quantidade de ácido anacárdico, enquanto o LCC

técnico maior percentual de cardanol.

1.8 Toxicidade Aguda de Anacardium occidentale em Rattus novergicus

O uso popular, e mesmo tradicional das plantas como recurso terapêutico,

não são suficientes para validá-las como medicamentos ou inseticidas eficazes

e seguros (Turolla & Nascimento 2006, Agra et al. 2007/2008). Os estudos

toxicológicos têm a finalidade de avaliar a idéia errônea de que produtos

naturais são isentos de efeitos tóxicos ou adversos, e que o uso popular de

plantas serve como validação da eficácia de medicamentos, praguicidas etc

(Lapa 1999, Craveiro et al. 2008)

Os estudos toxicológicos apresentam como principal objetivo a predição

dos possíveis efeitos adversos, que podem se manifestar quando da exposição

humana à determinada substância, seja ela um medicamento, um praguicida,

um agente químico industrial ou outros (Koeter 1993, Stokes 2002, Meyer

2003). Por esta razão, tais estudos são sempre requeridos nos processos

investigativos, desde o desenvolvimento de produtos até seu registro e

comercialização, sendo os modelos animais os mais utilizados para este

propósito (Ecobichon 1997, Stokes 2002, Meyer 2003).

33

2. Objetivos

2.1 Geral

� Buscar alternativas naturais, de baixa toxicidade para vertebrados, sem

impacto ambiental, que possam ser utilizadas no controle de Ae. aegypti.

2.2 Específicos

� Avançar no estudo fitoquímico do líquido obtido da castanha de A.

occidentale

� Apresentar uma nova técnica de extração do líquido da castanha de caju.

� Avaliar a atividade larvicida dos extratos e frações obtidos do LCC, sobre

Ae. aegypti em condições de laboratório.

� Verificar o potencial tóxico do LCC através de testes de toxicidade oral

aguda em ratos.

34

3. Material e Métodos

3.1 Obtenção do Material Botânico

Frutos de A. occidentale, popularmente conhecidos como castanhas de

caju, foram colhidos no setor Pedro Ludovico, em Goiânia-GO, no mês de

outubro de 2008. Uma exsicata (43180) foi autenticada (Figura 3) pelo

Professor José Ângelo Rizzo e depositadas no Herbário da Unidade de

Conservação, Departamento de Botânica da UFG.

Figura 3: Exsicata autenticada mantida no Herbário da Unidade de Conservação da Universidade Federal de Goiás

3.2 Obtenção do Líquido da Castanha de Caju

No Laboratório de Bioatividade de Plantas, do Instituto de Patologia

Tropical e Saúde Pública (IPTSP/UFG), 2 kg de frutos de caju foram colocados

em estufa de ventilação forçada, a 40°C, por 7 dias. Com esse procedimento

35

foram obtidos 600 g de LCC, um líquido viscoso de coloração marrom (Figura

4) e de odor forte (Mazzetto et al. 2009)

Figura 4 – Aspecto do Líquido da Castanha do Caju, obtido em estufa de ventilação forçada

3.3 Fracionamento do Líquido da Castanha de Caju

Inicialmente, 50 g do LCC de A. occidentale foram submetidos a uma

filtração a vácuo, em um funil de placa sinterizada, com diâmetro interno de

9 cm e uma altura de gel de sílica (70-230 mesh) de 15 cm. As frações

foram eluídas seguindo a técnica de gradiente com n-hexano, acetato de

etila e metanol, totalizando oito frações (Figura 6). Estas foram

denominadas AO1 a AO8, conforme Figura 5.

36

óleo bruto deAnacardium occidentale

AO50 g

a

AO-10,0803 g

AO-211,7640 g

AO-37,9848 g

AO-41,0040 g

AO-52,3338 g

AO-61,0461 g

AO-70,6251 g

AO-80,9842 g

a) Filtração em funil de placa sinterizada (φ= 9 cm) contendo gel de sílica 70-230 mesh.

Eluente: hexano, acetato de etila e metanol.

Figura 5 – Organograma do fracionamento do líquido da castanha do caju

Figura 6: Fracionamento do Líquido da Castanha do Caju em coluna cromatográfica, seguindo a técnica de gradiente de polaridade.

3.4 Obtenção das larvas

As larvas foram obtidas de uma criação cíclica de Ae. aegypti, mantida no

Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos, IPTSP/UFG, há 10 anos. A

câmara onde se mantém a criação é climatizada a 28 ± 1°C, 80 ± 5% de

umidade relativa e fotofase de 12 h (Silva et al. 1998). As larvas são mantidas

37

em bacias com água da rede pública de abastecimento e alimentadas com

ração para gatos. As fêmeas alimentam-se em camundongos e os machos em

algodão, do tipo o.b. (absorvente interno feminino) embebido em água

açucarada. No interior das gaiolas de criação coloca-se um copo de vidro

âmbar com água e um papel filtro para ovipostura.

3.5 Bioensaios larvicidas em laboratório

Os bioensaios foram realizados utilizando-se larvas de 3° estádio, por

serem as mais tolerantes em relação aos demais estádios (Silva et al. 2003).

O LCC e/ou as frações foram primeiramente pesados e pré-solubilizados

em dimetilsulfóxido (DMSO). A quantidade de solvente utilizada para o preparo

da solução foi previamente determinada por ensaios de tolerância das larvas

ao solvente. Observou-se tolerância até a proporção de 0,8 mL de DMSO para

24,2 mL de água (Figura 7).

Para cada uma das amostras avaliadas preparou-se uma solução-mãe,

acrescentando-se água da rede pública de abastecimento, em um volume

suficiente para obter as concentrações de 100,80,60,40,20,10,5 e 2,5 ppm para

o LCC e as frações. A partir destas soluções uma série de diluições foi

preparada para se obterem concentrações menores.

Os bioensaios foram realizados em copos de poliestireno, descartáveis,

com capacidade para 30 mL. Nestes foram colocados 25 mL de cada uma das

soluções, e, em seguida, 20 larvas de 3° estádio. Todos os bioensaios foram

realizados em triplicata. As leituras da mortalidade foram feitas após 24 h de

exposição das larvas às soluções. Essas foram consideradas mortas quando

38

havia ausência total de movimentos, mesmo quando expostas a um estímulo,

seguido do escurecimento do corpo e cápsula cefálica. Todos os experimentos

foram acompanhados de uma série controle, contendo o mesmo número de

larvas e o mesmo volume de DMSO.

Figura 7: Organograma dos bioensaios em laboratório

Pesagem das amostras

LCC + DMSO = Solução-Mãe

Diluições

100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 2,5 ppm

Copos plásticos + solução teste + larvas de 3°

estádio de Ae. aegypti

Leitura da mortalidade das larvas após 24h

39

3.6 Efeito residual do Líquido da Castanha de Caju em laboratório

Três amostras do LCC foram pesadas e solubilizadas em DMSO,

acrescentando-se um volume de água para se obter a concentração final de

200 ppm. Para realização dos bioensaios foram utilizados recipientes de

poliestireno, com capacidade para 200 mL, sendo três para amostras do

LCC, três para o grupo controle (água e 1% de DMSO) e três para o grupo

controle positivo (temephos a 1 ppm). Em cada recipiente introduzia-se,

diariamente, 20 larvas de 3º estádio. Após 24h, eram retiradas todas as

larvas e contavam-se as larvas mortas, acrescentando em seguida novas

larvas. Este procedimento se repetiu até que a solução de LCC não

apresentasse mais atividade larvicida. Os dados obtidos foram submetidos

à Análise de Variância (ANOVA), visando à comparação da incidência de

mortalidade diária das larvas, sendo considerados significativos valores de

p < 0,05.

3.7 Ensaios de toxicidade aguda do LCC segundo as diretrizes da OECD

2001.

O projeto de pesquisa para avaliar a toxicidade aguda do LCC segundo

as diretrizes da Organization for Ecomonic Co-operation and Development

(OECD) 423, foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa, da Pró-Reitoria

de Pesquisa e Pós-Graduação (PRPPG), da UFG, sendo aprovado segundo o

protocolo de número 292/10.

40

3.7.1 Descrição dos Animais

Foram usados no experimento Rattus novergicus (ratos Wistar), de ambos

os sexos, oriundos do Biotério Central (BC) da UFG. Os animais eram adultos

jovens com 8 a 12 meses de idade e o peso de cada um não excedeu a 20%

da média do grupo, que foi de 300g para machos e 280g para fêmeas.

3.7.2 Alojamento e Manejo dos Animais

Os animais foram mantidos no biotério do Núcleo de Estudos e Pesquisas

Tóxico-Farmacológicas (NEPET) da Faculdade de Farmácia (FF) da UFG.

Foram alimentados com ração balanceada Labina (Purina), além de água

filtrada. O ambiente foi climatizado à temperatura de 22 ± 2°C, umidade relativa

do ar variando de 50 a 70% e fotofase de 12h. Cada grupo de três animais foi

acondicionado em uma caixa de polipropileno forrada com maravalha, sendo

trocada em dias alternados.

Os animais passaram por um período de aclimatação de uma semana

antes do início dos experimentos, foram pesados e identificados.

3.7.3 Descrição do Protocolo Experimental

Para realização do experimento, dois grupos foram formados, sendo três

machos e três fêmeas em cada grupo, conforme recomendado na OECD.

A dose inicial para o teste de toxicidade foi escolhida entre as doses

preconizadas pela OECD 5, 50, 300 e 2000 mg/Kg. Por se tratar de produtos

vegetais originários de uma planta e devido a inexistência de informações de

41

casos de intoxicação por essa planta decidiu-se fazer a triagem com a dose de

2000 mg/kg.

Para a solubilização do LCC foram utilizados 0,4 mL de DMSO e o

volume foi completado com água, tendo-se o cuidado de não exceder o volume

de 1mL/100g de peso corporal. Preparou-se uma solução mãe de 10 mL para

cada grupo. Foram administrados pela via oral 3mL de substância para cada

animal. Paralelamente, realizou-se o teste com o grupo controle usando-se o

mesmo número de animais e a mesma dose. No grupo controle administrou-se

água e DMSO.

Antes da administração do LCC, os ratos foram privados de alimentação

por 12h tendo o suprimento de água á vontade. A alimentação continuou

suspensa por mais 2h após a administração do LCC. As observações foram

feitas em 15 e 30mim, e 1, 2, 3, 4, 6, 12 e 24h após a administração, a partir

daí continuaram, diariamente, até o décimo quarto dia.

Durante esse período de avaliação foram feitas as observações

comportamentais (screening hipocrático: atividade geral, frênito vocal,

irritabilidade, reposta ao toque, resposta ao aperto da cauda, contorção, força

para agarrar, tremores, convulsões, salivação, lacrimejamento, micção,

defecação, piloereção, morte). As intensidades dos eventos foram tabuladas de

zero a quatro, correspondendo, respectivamente, a ausente, pouco, moderado,

intenso (Malone & Robichaud 1962)

No décimo quarto dia os animais foram novamente pesados,

anestesiados com solução de xilasina-cetamina por via intraperitoneal, e

eutanasiados.

42

4. Resultados e discussão

Os resultados deste trabalho são apresentados no artigo 1.

43

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57

Artigo I – submetido a Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical

Atividade larvicida de Anacardium occidentale como alternativa ao controle de Aedes aegypti e sua toxicidade em Rattus novergicus

Larvicidal activity of Anacardium occidentale as an alternative to the control of Aedes aegypti and its toxicity in Rattus novergicus

Ana Carla Peixoto Guissoni¹, Ionizete Garcia da Silva¹,², Regina Geris3, Luiz Carlos Cunha4, Heloisa Helena Garcia da Silva¹,²

¹Curso de Pós-Graduação em Medicina Tropical, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás. Goiânia GO

²Laboratórios de Biologia e Fisiologia de Insetos e de Bioatividade de Plantas, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás. Goiânia, GO

3Laboratório de Biotecnologia – Universidade Federal da Bahia – Salvador – BA

4Núcleo de Estudos e Pesquisas Tóxico-Farmacólogicas da Faculdade de Farmácia-UFG

RESUMO

Introdução: A busca por substitutos para os inseticidas sintéticos tem estimulado

muitos trabalhos científicos, contemplando inclusive a utilização de óleos, extratos ou

constituintes ativos provenientes de plantas. Esta procura pode ser justificada pelo

potencial inseticida associado a fácil degradação destes constituintes, menor toxicidade

ao homem sendo, conseqüentemente, uma alternativa mais segura para o meio

ambiente. Métodos: Após a coleta e aquecimento dos frutos de Anacardium occidentale

L., a 40°C, obteve-se um líquido denominado líquido da castanha de caju (LCC) que,

depois de testado quanto à sua atividade larvicida, foi fracionado em coluna de sílica

gel. O fracionamento deu origem a oito frações, as quais foram codificadas como AO1 a

AO8 e submetidas a ensaios larvicidas. Avaliou-se também o efeito residual do LCC em

recipientes sem renovação de água e sua toxicidade oral aguda em Rattus novergicus.

58

Resultados: O LCC e as frações AO2 e AO3 apresentaram atividade larvicida. As

concentrações letais, CL50 e CL90, do LCC foram, respectivamente, de 6,55 e 10,98 ppm

. Para AO2 e AO3 , as CL50 e CL90 foram de 3,18 e 7,80 ppm, e de 3,57 e 10,47 ppm,

respectivamente. O LCC apresentou efeito residual até o 6º dia. A estimativa da DL50 é

maior que 2000 mg/kg. Conclusões: O LCC e duas frações apresentaram potencial

larvicida sobre larvas de A. aegypti. Após tratamento subagudo via oral em ratos, o LCC

demonstrou ser atóxico.

Palavras-chaves: Anacardium occidentale. Aedes aegypti. Larvicida. toxicidade aguda.

ABSTRACT

Introduction: The search for substitutes for synthetic pesticides has stimulated many

scientific papers, including considering the use of oils, extracts and active constituents

from plants. This demand can be justified by the potential associated with insecticide

easy degradation of these constituents, less toxic to humans and, consequently, a safer

alternative to the environment. Methods: After collecting and heating Anacardium

occidentale L. fruits 40°C, the liquid obtained was tested to confirm its larvicidal

activity. Then, it was fractionated by silica gel column. The fractionation resulted in

eight fractions, which were coded as AO1 to AO8. In this paper, the cashew nut shell

liquid (CNSL) and its fractions were evaluated for their biological activity in third instar

larvae of Aedes aegypti. The residual effect of CNSL, in containers with no water

renewal, and its acute oral toxicity in Rattus novergicus also were evaluated. Results:

The CNSL and the fractions AO2 and AO3 presented larvicidal activity. The lethal

concentration, LC50 and LC90, the CNSL were, respectively, 6.55 and 10.98 ppm. The

active fractions, AO2 and AO3, presented LC50 and LC90 of 3.18 and of 7.80 ppm, and

59

3.57 and 10.47 ppm, respectively. The CNSL had residual effects until the 6th day. The

estimated LD50 is greater than 2000 mg / kg. Conclusions: The LCC and two fractions

showed larvicidal potential against larvae of Aedes aegypti. After subacute treatment in

rats orally, the CNSL has proven to be nontoxic.

Key-words: Anacardium occidentale. Aedes aegypti. Larvicidal. acute toxicity

INTRODUÇÃO

A dengue é causada por um arbovírus da família Flaviviridae, pertencente ao gênero

Flavivirus. É transmitida por meio da picada de fêmeas do gênero Aedes, infectadas,

que ao realizar um repasto sanguíneo pode transmitir qualquer um dos quatro sorotipos

virais (DENV 1, 2, 3 e 4)1, sendo o Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) (Linnaeus,1762)

o principal vetor 2,3. Como ainda não estão disponíveis medicamentos antivirais para

tratamento, nem uma vacina eficaz para uso humano, o controle da dengue se baseia,

principalmente, em aplicações de inseticidas sintéticos ou naturais4, para o controle do

vetor. A crescente resistência das populações de Aedes aegypti aos atuais produtos tem

dificultado o êxito dos programas5.

Compostos derivados de plantas apresentam uma alternativa de controle de vetores,

não só como novos agentes inseticidas, mas também por serem ambientalmente seguros

5. No entanto, para serem registrados como um inseticida, os compostos devem ser

avaliados em relação aos seus efeitos toxicológicos e ecotoxicológicos agudos e

crônicos em condições de laboratório, conforme padronização internacional 6,7.

Anacardium occidentale L. é o nome científico do cajueiro, pertencente a família

Anacardiaceae. Seu pedúnculo ou pseudofruto é muito apreciado pela suculência e

confundido com o fruto. O fruto do cajueiro, popularmente conhecido como castanha de

60

caju, é repleto de um líquido escuro quase preto chamado de líquido da castanha do caju

(LCC) ou cashew nut shell liquid (CNSL) 8. Para a obtenção do LCC, empregam-se

diferentes processos como a extração a frio, extração por solventes9 ou processo

térmico-mecânico, onde o próprio LCC quente é utilizado para aquecer as castanhas a

190 oC. Quando submetido a altas temperaturas o ácido anacárdico sofre reação de

descarboxilação convertendo-se a cardanol, produzindo o denominado LCC técnico10,11.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade larvicida e o efeito residual sobre

larvas de Aedes aegypti e também a toxicidade em animais de laboratório, do líquido da

castanha de Anacardium occidentale.

MÉTODOS

Material botânico

Frutos de Anacardium occidentale foram colhidos no setor Pedro Ludovico, em

Goiânia-GO (Brasil), no mês de outubro de 2008. Uma exsicata (43180) foi autenticada

pelo Professor José Ângelo Rizzo e depositadas no Herbário da Unidade de

Conservação, Departamento de Botânica da Universidade Federal de Goiás (UFG).

Obtenção e Fracionamento do Líquido da Castanha de Anacardium occidentale

No Laboratório de Bioatividade de Plantas do Instituto de Patologia Tropical e

Saúde Pública (IPTSP) da UFG, dois kg de frutos foram colocados em estufa de

ventilação forçada, a 40°C, por 7 dias. Com esse procedimento foram obtidos 600g de

um líquido de coloração marrom e de odor forte, denominado líquido da castanha do

caju (LCC)8. Inicialmente, 50 g do líquido obtido de Anacardium occidentale foram

submetidos a uma filtração a vácuo, em um funil de placa sinterizada, com diâmetro

61

interno de 9 cm e uma altura de gel de sílica (70-230 mesh) de 15 cm. As frações foram

eluídas seguindo a técnica de gradiente com n-hexano, acetato de etila e metanol,

totalizando oito frações. Estas foram denominadas AO1 a AO8 e submetidas aos ensaios

larvicidas.

Bioensaios em Laboratório

Os bioensaios foram realizados utilizando-se larvas de 3° de estádio Aedes aegypti,

por serem as mais tolerantes em relação aos demais estádios12. O líquido e/ou as frações

foram primeiramente pesados e pré-solubilizados em dimetilsulfóxido (DMSO). A

quantidade de solvente utilizada para o preparo da solução foi previamente determinada

por ensaios de tolerância das larvas ao solvente. Neste trabalho usou-se 1% de DMSO.

Para cada uma das amostras a serem testadas preparou-se uma solução-mãe,

acrescentando-se água, num volume suficiente para obter a concentração de 100 para o

líquido e as frações. A partir destas soluções uma série de diluições foi preparada a fim

de se obterem concentrações menores de 80, 60, 40, 20, 10, 5 e 2.5 ppm. Os bioensaios

foram realizados em copos com capacidade para 30 mL. Nestes, foram colocados 25

mL de cada uma das soluções e em seguida 20 larvas de 3° estádio. Todos os bioensaios

foram realizados em triplicata. As leituras da mortalidade foram feitas após 24h de

exposição das larvas às soluções. Todos os experimentos foram acompanhados de uma

série controle, contendo o mesmo número de larvas e o mesmo volume de DMSO e

água destilada. Os dados obtidos da mortalidade x concentração (ppm) foram analisados

pelo programa SAEG (Sistema de Análises Estatísticas), Versão 9.1, em gráfico de

Probit, para determinar as concentrações letais (CL50 e 90) e os respectivos intervalos de

confiança (IC).

62

Efeito Residual do Líquido da Castanha de Caju

Três amostras do LCC foram solubilizadas em DMSO, acrescentando-se um volume

de água para se obter a concentração final de 200 ppm. Foram utilizados recipientes de

poliestireno, com capacidade para 200 mL, sendo três para amostra do LCC, três para o

grupo controle negativo (água e 1 % de DMSO) e três para o grupo controle positivo

(temephos a 1 ppm). Em cada recipiente introduzia-se, diariamente, 20 larvas de 3º

estádio. Após 24h, eram retiradas todas as larvas e contavam-se as larvas mortas,

acrescentando em seguida novas larvas. Este procedimento se repetiu até que a solução

de LCC não apresentasse mais nenhuma atividade larvicida.

Os dados obtidos foram submetidos à Análise de Variância (ANOVA), visando à

comparação da incidência de mortalidade diária das larvas, sendo considerados

significativos, valores de p < 0,05.

Teste de toxicidade oral aguda segundo a Organization for Ecomonic Co-operation

and Development (OECD) 2001

A avaliação de toxicidade aguda foi realizada em Ratus novergicus (ratos Wistar) de

ambos os sexos, oriundos do biotério central da UFG. Os animais eram adultos jovens

com 8 a 12 meses de idade e o peso de cada um não excedeu a 20% da média do grupo,

que foi de 300g para machos e 280g para fêmeas.

Os animais foram mantidos no biotério do Núcleo de Estudos e Pesquisas Toxico-

Farmacológicas (NEPET) da Faculdade de Farmácia da UFG. Foram alimentados com

ração balanceada Labina (Purina), além de água filtrada. O protocolo experimental foi

aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Federal de Goiás

63

(Protocolo n º 292/10), seguindo as diretrizes da OECD 4237. Para realização do

experimento, dois grupos foram formados, com três machos e três fêmeas cada um.

Foram administrados 2000 mg/kg por via oral. Paralelamente, realizou-se o teste com o

grupo controle, usando-se o mesmo número de animais e a mesma dose. No grupo

controle administrou-se DMSO e água. Durante os períodos de observação foram feitas

as observações comportamentais (screening hipocrático: atividade geral, frênito vocal,

irritabilidade, reposta ao toque, resposta ao aperto da cauda, contorção, força para

agarrar, tremores, convulsões, salivação, lacrimejamento, micção, defecação,

piloereção, morte). As intensidades dos eventos foram tabuladas de zero a quatro,

correspondendo, respectivamente, a ausente, pouco, moderado, intenso13. No décimo

quarto dia os animais foram novamente pesados, anestesiados com solução de xilasina-

cetamina por via intraperitoneal e eutanasiados.

RESULTADOS

Utilizando-se como método de obtenção o aquecimento das castanhas a 40°C,

obteve-se, neste trabalho, um rendimento de 30% de LCC. Testado quanto à atividade

larvicida, sobre Ae. Aegypti, em laboratório, foram obtidas as CL50 e CL90 de 6,55 e

10,98 ppm, respectivamente (Tabela 1).

Do fracionamento do LCC foram obtidas 8 frações. AO2 e AO3 foram as frações que

apresentaram maior rendimento 43% e 15,7%, respectivamente e foram as únicas

frações que apresentaram atividade larvicida (Tabela I).

64

Tabela I: Atividade larvicida, em laboratório, do líquido e das frações de Anacardium

occidentale sobre larvas de 3º estádio de Aedes aegypti.

Frações CL50 (IC 95%) ppm CL90 (IC 95%) ppm

LCC 6,55 (6,09 – 6,98) 10,98 (10,04 -12,44)

AO2 3,18 (2,70 – 3,64) 7,80 (6,77 – 9,31)

AO3 3,57(2,99 – 4,13) 10,47(8,71–13,49)

LCC – líquido da castanha do caju; CL - Concentração Letal; IC – Intervalo de Confiança a 95% ppm – partes por milhão; AO - Anacardium occidentale

Os resultados da Tabela I mostram que com a separação cromatográfica foi possível

obter concentrações letais mais baixas em relação ao LCC.

O efeito residual da solução de LCC foi, neste trabalho, aferido através das

percentagens de mortalidade diárias de larvas, após exposição a uma solução a 200ppm.

Estes resultados, até o período máximo de exposição de 15 dias, encontram-se na

Figura 1.

Figura 1 – Efeito residual da solução do líquido da castanha de Anacardium

occidentale, a 200ppm, sobre larvas de Aedes aegypti.

65

O efeito residual da solução do líquido da castanha de Anacardium occidentale, a

200ppm, matou 100% das larvas de 3° estádio de Aedes aegypti, até o sexto dia. Depois

a mortalidade diminuiu para 97% e permaneceu até o oitavo dia, em seguida, a

degradação desse produto cai em curva descendente até não apresentar nenhum efeito

ao 16° dia. A Figura 1 sugere que para fazer o controle desse mosquito as aplicações

desse produto devem ser repetidas semanalmente, período de sua eficácia máxima.

Com relação à toxicidade oral aguda, a dose administrada de 2000 mg/kg, não

causou a morte de nenhum dos animais. As alterações comportamentais que foram

observadas durante os primeiros 10 minutos (força de agarrar e atividade geral

diminuídas) podem ter sido causadas, provavelmente, pelo estresse da administração da

substância.

DISCUSSÃO

Segundo Rios10, o LCC é uma das maiores fontes de lipídeos fenólicos de origem

natural, tendo como componentes majoritários o ácido anacárdico, cardanol, cardol e 2-

metilcardol. Quando submetido a temperaturas em torno de 180°C, o ácido anacárdico

converte-se a cardanol, produzindo o chamado LCC técnico.

A atividade larvicida do LCC técnico, obtido com o aquecimento das castanhas a

190°C, foi avaliada por Lomonaco e cols.14 sobre Aedes aegypti, e a CL50 encontrada

foi de 51,0 ppm, bem superior à encontrada no presente trabalho. Se o aquecimento

converte o ácido anarcárdico a cardanol, e diminui a atividade, podemos supor que este

ácido seja o responsável por uma maior atividade larvicida. O LCC obtido no presente

66

estudo, com aquecimento a 40°C, provavelmente tenha maior concentração de ácido

anacárdico, responsável pela maior atividade.

O fracionamento de extratos vegetais, guiado por bioensaios, é utilizado na tentativa

de se potencializar a atividade biológica e de isolamento do princípio ativo15,16. Porém,

um trabalho testando atividade larvicida de substâncias puras, mostrou que as frações

originadoras dessas, eram mais ativas que a substância pura isolada17. Isto sugere um

efeito sinergista de compostos presentes na fração. Neste trabalho, o fracionamento

originou uma fração mais ativa que o LCC inicial.

Os resultados da atividade larvicida do LCC e das frações, neste trabalho, foram

significativos para o controle de Aedes aegypti, quando comparados a outros trabalhos

pertinentes da literatura, para a mesma espécie de mosquito.

As concentrações letais obtidas com o LCC foram menores do que as encontradas

por Silva e cols.15 para o óleo resina de Copaifera reticulata, de 8,6 e 59,4ppm, para as

CL50 e CL90, respectivamente.

Esses resultados favoráveis estimulam a continuidade do estudo, visando o

isolamento do princípio ativo e principalmente formas que viabilizem o seu uso prático

para o controle de Aedes aegypti.

O efeito residual de um produto, é definido como a sua capacidade de manter

dosagens letais para um organismo alvo por um determinado período de tempo18. Não

foram encontrados na literatura trabalhos que avaliem o efeito residual de uma

substância botânica. Neste trabalho, houve mortalidade de 100% das larvas expostas à

solução-teste do LCC, a 200ppm, por 6 dias. Por se tratar de uma substância de origem

botânica a duração do efeito residual tem valor significativo tanto para o uso como

larvicida quanto pela ausência de impactos ambientais.

67

Apesar do principal larvicida, usado até pouco tempo na quantidade de 1 ppm, em

programas de controle de Aedes aegypti, apresentar um efeito residual mais duradouro

como o encontrado por Pontes e cols 19,seu uso permanente acarreta desenvolvimento

de resistência e possíveis impactos na natureza.

A estimativa da dose letal mediana oral para causar a morte de 50% dos animais (

DL50 ) é maior que 2000 mg/kg. Segundo as diretrizes da OECD 423, este valor permite

classificar o LCC, na classe 5, ou seja, substância de muito baixa toxicidade.

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Ângelo Rizzo pela identificação do material botânico.

CONFLITO DE INTERESSE

Os autores declaram não haver nenhum tipo de conflito de interesse no desenvolvimento do estudo.

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