ATIVIDADE REDOX-PROTETORA DA Passiflora cincinnata Mast ... · lipoperoxidação plasmática...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

CLÉSIO ANDRADE LIMA

ATIVIDADE REDOX-PROTETORA DA Passiflora

cincinnata Mast SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO

INDUZIDO PELO EXERCÍCIO FÍSICO

ARACAJU

2011





ARACAJU

2011

Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde. Orientador: Prof. Dr. Charles dos Santos Estevam





Aprovada em ____/___/____

__________________________________________________________

Orientador: Prof. Dr. Charles dos Santos Estevam

Universidade Federal de Sergipe – Orientador

_________________________________________________________

1º Examinador: Prof. Dr. Amaro Mendonça Cavalcante

Universidade Federal de Alagoas – UFAL

__________________________________________________________

2º Examinador: Profª. Dr. Brancilene Silva Araujo

Universidade Federal de Sergipe – DFS/UFS

Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.

Aos meus avós paterno, Manoel Lima e Venina

Nunes Lima, e avô materno, Marcolino Pereira de

Andrade, grandes avós cujos exemplos de vida,

dignidade, honradez, amor e carinho sempre me

inspiraram e iluminaram meu caminho (in

memoriam).

Dedico

"A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original."

Albert Einstein

AGRADECIMENTOS

À Deus e aos meus pais pela vida e dignidade.

Ao prof. Dr. Charles dos Santos Estevam pelo ensinamento, compreensão, incentivo

e paciência durante toda a orientação.

A todos os professores do núcleo de pós-graduação em medicina da UFS que

contribuíram para essa nova etapa de minha vida.

A profª Dr. Brancilene pela enorme contribuição com está dissertação (co-

orientação). Kkkkk

A todos os estudantes que compõem o laboratório de bioquímica e química de

produtos naturais pela enorme força e ajuda prestada, direta ou indiretamente, na

construção desta obra.

Aos amigos (Vitor, André e Jymmys) pela enorme contribuição com a construção

desta dissertação.

A Iara Samir, que sem entender como, fez enorme diferença para elaboração desta

obra.

A todos, o meu muito obrigado!!!

RESUMO

Nos últimos anos, têm aumentado o interesse em avaliar o efeito de constituintes

fitoquímicos presentes em alimentos e chás de ervas na atenuação do estresse

oxidativo associado ao exercício físico de alta intensidade. Nesse contexto, o chá das

folhas de plantas do gênero Passiflora pode inibir o dano celular causado pelo

estresse oxidativo devido à presença de componentes fenólicos. No presente estudo,

o perfil fitoquímico do extrato etanólico das folhas de P. cincinnata Mast foi

investigado através de reações colorimétricas ou de precipitação, enquanto o teor de

fenóis totais foi quantificado usando o método de Folin-Ciocalteu. Para estudar o

efeito agudo e crônico do extrato sobre o estresse oxidativo, ratos Wistar (250-300g)

foram divididos aleatoriamente em grupos (n=8 e n=6, respectivamente) que foram

tratados com o extrato (200 mg.kg-1) e submetidos ou não a exercícios físicos de alta

intensidade. Os níveis de marcadores do estresse oxidativo foram analisados. Devido

ao elevador teor fenólico (430,63 ± 46,71 µg GAEq.g-1 extrato), foi constatada

atividade seqüestradora dos radicais DPPH● e ABTS●+ acima de 97%. O extrato

inibiu, também, valores elevados da lipoperoxidação in vitro induzida por AAPH

(acima 95 %), FeSO4 (até 40,82 %) e H2O2 (até 62,50 %), sugerindo o ação ativo

contra radicais peroxil e hidroxil. A administração aguda do extrato protegeu ratos da

lipoperoxidação plasmática (70,41%), hepática (64,1%) e cardíaca (20,0%), além de

proteger a oxidação protéica (94,08%) hepática. Os níveis de sulfidrila plasmático

(264,32%), hepático (261,86%) e cardíaco (478,8%) foram elevados. Constatamos,

também, que o treinamento físico utilizado foi capaz de aumentar à oxidação lipídica

no aparelho urinário (201 %), tecido sanguíneo (123 %) e hepática (161 %), além de

oxidação a proteínas cardíaca (226 %) os animais exercitados (GT) em comparação

ao controle sedentário (GC) . Em contrapartida, o tratamento com o extrato, após 8

semanas de tratamento, foi capaz de prevenir a lipoperoxidação de estruturas do

aparelho urinário (50,96%), sanguínea (39,91%), hepático (83,64%) e cardíaca

(15,82%), bem como, lesões oxidativas a proteínas hepáticas (9,62%) induzidas pelo

exercício físico. Desta forma, os resultados sugerem que o consumo diário do extrato

etanólico da P. cincinnata pode trazer benefícios à saúde.

Palavras-Chave: Passiflora cincinnata Mast, atividade antioxidante, atividade

redox-protetora, exercício físico.

ABSTRACT

The interest in evaluating the effect of the phytochemical constituents in food and

herb teas in attenuating the oxidative stress associated with high intensity physical

exercise has increased in the last years. In this context, leaf tea of plants of the

Passiflora genus can inhibit the cell damage because of the oxidative stress due to

the presence of phenolic compounds. In the present study, the phytochemical profile

was investigated by colorimetric or precipitation methods, while the total phenol

content was quantified by the Folin-Ciocalteu method. To study the acute and

chronic effect of the extract on the oxidative stress, Wistar rats (250-300 g) were

divided randomly into groups (n=8 and n=6, respectively) that were treated with the

extract and were submitted or not to high intensity physical exercises. The oxidative

stress marker levels were analyzed. Because of the high content of phenolic

constituents (430.63 ± 46.71 µg EAG.g-1 extract), it was verified a scavenger activity

of the free radicals DPPH● and ABTS●+ up of 97%. The extract inhibited also levels

of lipid peroxidation induced by AAPH (above 95 %),

FeSO4 (up 40.82%) and H2O2 (up62.50%), suggesting the the extract is active against

peroxil and hydroxyl radical. The acute administration of the extract protected rats

from lipoperoxidation with reductions in levels in plasmatic (70.41%), hepatic

(64.1%) and cardiac (20.0 %) samples, and protected liver against protein oxidation

(94.08%). Sulfhydryl levels in plasmatic (264.32%), hepatic (261.86%) and cardiac

(478.8%) tissues were high. The research showed that physical

training used was able to increase lipid oxidation in the urinary tract (201%), blood

tissue (123%) and liver (161%), and the protein oxidation rate (226%)

rats exercised compared to sedentary control group.

In contrast, treatment with the extract , after 8 weeks of treating the rats submitted to

high intensity physical exercises with the extract, there was a chronic prevention of

the lipoperoxidation in structures of the urinary (50.96%), plasmatic (39.91%),

hepatic (83.64%) and cardiac (15.82%) tissues, as well as, oxidative lesion of hepatic

proteins (9.62%). Therefore, these results suggest benefits of P. cincinnata leaf

ethanol extract to health.

Keywords: Passiflora cincinnata Mast, antioxidant activity, redox-protective

activity, physical exercises.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Doenças associadas as EROs ..................................................................... 8

Figura 2: Representação metabólica da geração de EROs no organismo.................. 9

Figura 3: Conceito de estress oxidativo baseado no desequilíbrio entre as ações

pró-oxidante e antioxidante.................... .................................................................... 14

Figura 4: Reações de oxidação da 2’-desoxiguanosina (dGuo) com radical hidroxila

(•OH), elétron livre (-e-) e oxigênio singlete (1O2), na geração de 8-oxo-7,8-diidro-

2’-deoxiguanosina (8-oxodGuo).................... ............................................................ 18

Figura 5: Determinação quantitativa do teor de fenóis totais do extrato etanólico e

frações da P. cincinnata Mast .................................................................................... 45

Figura 6: Efeito do extrato de P. cincinnata Mast na formação de TBARs induzido

por AAPH.................... .............................................................................................. 48


por FeSO4.................... .............................................................................................. 48


por H2O2.................... ................................................................................................ 49

Figura 9: Efeito redox agudo do extrato de P. cincinnata Mast na redução da

lipoperoxidação em ratos.................... ....................................................................... 50

Figura 10: Efeito redox agudo do extrato de P. cincinnata Mast na redução da

oxidação de proteínas em ratos .................................................................................. 50

Figura 11: Efeito redox agudo do extrato de P. cincinnata Mast no conteúdo de

grupamentos sulfidrilas totas em amostra de ratos .................................................... 51

Figura 12: Efeito do extrato de P. cincinnata Mast sobre os níveis de TBARs em

amostras sanguínea, urinária, hepática e cardíaca de ratos ........................................ 52

Figura 13: Efeito do extrato de P. cincinnata Mast sobre os níveis de derivados

carbonil em amostras hepática e cardíaca de ratos..................................................... 53

Figura 14: Efeito do extrato de P. cincinnata Mast sobre os níveis de derivados

sulfidrila em amostras hepática e cardíaca de ratos ................................................... 54

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Espécies reativas de oxigênio e sua meia-vida .......................................... 5

Tabela 2: Detecção colorimétrica de antocianidinas, antocianinas e flavonóides ... 36

Tabela 3: Detecção colorimétrica de leucoantocianinas,catequinas e flavononas ... 36

Tabela 4: Protocolo de exercício físico para indução de estresse oxidativo ............ 42

Tabela 5: Atividade antioxidante do extrato etanólico e fração acetato de etíla de P.

cincinnata Mast determinada através da redução do radical livre DPPH• ................. 46

Tabela 6: Atividade antioxidante do extrato etanólico de P. cincinnata Mast

determinada através da redução do radical livre ABTS•+ .......................................... 47

LISTA DE FORMULAS, ABREVIATURA E SIGLAS

AA – Atividade antioxidante

AAPH - dihidrocloreto de 2,2’azobis-2-amidopropano

ABTS – Radical 2,2'-azinobis-3-etilbenzotiazolino-6-sulfonato

AG – Ácido gálico

AMP – Monofosfato de adenosina

ATP – Trifosfato de adenosina

BHT – Hidroxitolueno butilado

Ca2+ - íon cálcio

CAT – enzima catalase

CE50 – Concentração eficiente em 50%

DNA – Adenina dinucleotídeo

DNPH – Ácido dinitrofenilhidrazina

DPPH - Radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazina

DTNB – Ácido 2-nitrobenzóico 5,5-ditio-bis

EA - Exercício aeróbio

EAG – equivalente de ácido gálico

EO – Estresse Oxidativo

EROs – espécies reativas de oxigênio

ExEt – Extrato etanólico bruto de P. cincinnata Mast

FActE – Fração acetate de etila

FADH - Flavina adenina dinucleotídeo (forma reduzida)

FCl – Fração clorofórmica

FeCl3 – Cloreto férrico

FeSO4 – Sulfato ferroso

FHMoH – Fração hidrometanólica

FT – Fenóis totais

GPx – Glutationa peroxidase

Gr – glutationa redutase

GSH – Glutationa reduzida

GSSG – Glutationa oxidada

H- - íon hidrogênio

H2O2 – Peróxido de hidrogênio

H2SO4 – Ácido sulfúrico

HCl – Ácido clorídrico

HOCl – Ácido hipocloroso

IAA – Índice de atividade antioxidante

KCl – Cloreto de potássio

L• – Ácido graxo livre

LOO• – Radical peroxil

MDA - Malonaldeído

MeOH – Metanol

NADPH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (Forma reduzida)

NaOH – Hidróxido de sódio

NO• – Radical oxido nítrico

O2 – Oxigênio molecular 1O2 – Oxigênio singlet

O2• – Radical superóxido

OH• – Radical hidroxila

ONOO• – Radical peróxido nítrico

OOH• – Radical hidroperóxido

PMSF – Floreto de Fenilmetilsulfonila

RL – Radial livre

RO• – Radial alcoxila

ROO• – Radical peroxila

SDS – Sulfato dodecil de sódio

SH – Grupos sulfidrilas

SOD – Enzima superóxido dismutase

TBA – Ácido tiobarbitúrico

TBARs – Espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico

TCA – Ácido tricloracético

VO2máx – Volume máximo de oxigênio

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 3 2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 5

2.1 Radicais Livres ................................................................................................... 5 2.1.1 Espécies reativas de oxigênio...................................................................... 7 2.1.2 Mecanismos de geração de EROs no organismo ........................................ 8 2.1.3 Produção de EROs no exercício físico ...................................................... 10

2.2 O Sistema de Defesa Antioxidante .................................................................. 11 2.2.1 Defesa antioxidante no exercício agudo ................................................... 12 2.2.2 Adaptações antioxidantes ao treinamento físico ....................................... 13

2.3 O Estresse Oxidativo ........................................................................................ 13 2.3.1 Lipoperoxidação ........................................................................................ 15 2.3.2 Oxidação de proteínas ............................................................................... 16 2.3.3 Oxidação de ácidos nucléicos ................................................................... 17

2.4 Exercício Físico e Estresse Oxidativo .............................................................. 18 2.4.1. Estresse oxidativo no músculo esquelética .............................................. 19 2.4.2. Estresse oxidativo no coração .................................................................. 21 2.4.3. Estresse oxidativo no fígado .................................................................... 22 2.4.4. Estresse oxidativo no sangue ................................................................... 23 2.4.4.1. Estresse oxidativo e eritrócitos ....................................................... 23 2.4.4.2. Estresse oxidativo e sistema imune ................................................. 24 2.4.4.3. Estresse oxidativo e plasma ............................................................ 25 2.4.4.4. Estresse oxidativo e lipoproteínas .................................................. 26 2.4.5. Estresse Oxidativo e DNA ....................................................................... 28

2.5 Exercício Físico, Estresse Oxidativo e Suplementação Antioxidante ............. 28 2.6 Passiflora cincinnata Mast................................................................................ 30

3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 33 3.1 Geral ..................................................................................................................... 33 3.2 Específicos ........................................................................................................... 33 4. METODOLOGIA .................................................................................................. 34

4.1 Coleta e Identificação do Material Vegetal ...................................................... 34 4.2 Preparação e Fracionamento do Extrato Etanólico Bruto ................................ 34 4.3 Ensaios Químicos ............................................................................................. 35

4.3.1 Triagem fitoquímica .................................................................................. 35 4.3.1.1 Teste para fenóis e taninos ............................................................... 35 4.3.1.2 Teste para antocianinas, antocianidinas e flavonóides ................... 35 4.3.1.4 Teste para flavonóis, flavononas, flavononóis e xantonas ............... 36 4.3.1.5 Teste para esteróides e triterpenóides (Liebermann-Buchard) ....... 36 4.3.1.6 Teste para saponinas ....................................................................... 37 4.3.1.7 Teste para alcalóides ....................................................................... 37 4.3.2 Quantificação de fenóis totais (FT) ........................................................... 38 4.3.3 Avaliação da atividade antioxidante (AA) ................................................ 38 4.3.3.1 Capacidade seqüestradora do radical DPPH• ................................ 38 4.3.3.2 Capacidade seqüestradora do radical ABTS•+ ................................ 40 4.3.4 Avaliação da atividade redox (in vitro) ..................................................... 40

4.4 Ensaios Biológicos ........................................................................................... 41 4.4.1 Animais ..................................................................................................... 41

4.4.2 Delineamento experimental ...................................................................... 41 4.4.3 Preparo do material biológico ................................................................... 42 4.4.4 Determinação de lipoperoxidação ............................................................. 43 4.4.5 Determinação de proteína carbonilada ...................................................... 43 4.4.6 Determinação de sulfidrilas totais (tióis) .................................................. 44

4.5 Análise Estatística ............................................................................................ 44 5. RESULTADOS ...................................................................................................... 45

5.1 Triagem Fitoquímica ........................................................................................ 45 5.2 Fenóis Totais .................................................................................................... 45 5.3 Atividade Antioxidante (in vitro) ..................................................................... 46

5.3.1 Atividade sequestradora do radical DPPH• ............................................... 46 5.3.1 Atividade sequestradora do radical ABTS•+ ............................................. 47

5.4 Atividade Redox (in vitro) ............................................................................... 47 5.5 Atividade Redox-Protetora Após Tratamento Agudo (in vivo) ....................... 49 5.6 Atividade Redox-Protetora Após Tratamento Crônica (in vivo) ..................... 51

7. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 54 8. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 59 REFERENCIAS ......................................................................................................... 61

3

1. INTRODUÇÃO

É consenso na literatura que a prática regular de exercício físico é uma importante

ferramenta na manutenção da saúde e prevenção de diversas doenças como as

cardiovasculares, diabetes e hipertensão. Por conta disso, nas últimas décadas tornou-se

crescente o número de adesões a programas de exercício físico pela população em geral.

Paralelamente, novas evidências no campo da atividade física e desporto vem

surgindo, principalmente, quanto ao exercício de alta intensidade, o qual está associado à

elevada produção de radicais livres (RL) e consequentes danos celulares. Isso porque, durante

o exercício, há um aumento no consumo de oxigênio pelo organismo, bem como, um aumento

na captação desse oxigênio pelo tecido muscular, o qual favorece o aumento de espécies

reativas de oxigênio (EROs) mitocondrial, danos oxidativos e alterações da função celular.

Além disso, foi evidenciado, também, que a deficiência de alguns nutrientes associado ao

esforço físico de alta intensidade contribui para a depleção do sistema de defesa antioxidante

e redução da capacidade do organismo em remover EROs e prevenir lesões.

Por conta disso, novas estratégias têm alterado o foco de diversos estudos no campo

do exercício físico e da saúde, uma delas é a utilização de constituintes fitoquímicos

específicos, presentes em alimentos e chás de ervas, na atenuação do estresse oxidativo

associado ao esforço físico, principalmente, os constituintes polifenólicos. Neste sentido,

estudos têm demonstrado que o consumo de chás rico em polifenóis protege rins e fígado de

ratos contra o estresse oxidativo induzido pelo exercício. Não obstante, foi observado em

seres humanos, que a ingestão aguda ou regular de alimentos ricos em polifenóis pode reduzir

os danos oxidativos em resposta ao esforço. Desta forma, o consumo de produtos naturais

ricos nestes constituintes pode representar uma potencial ferramenta na prevenção de

possíveis danos celulares provocado pelo aumento de EROs e estresse oxidativo (EO) em

resposta ao esforço físico.

Dentre os diversos gêneros de plantas ricas nestes compostos, podemos destacar o

gênero Passiflora, o qual apresenta propriedade farmacológica e medicinal comprovada,

principalmente, em relação às substâncias fenólicas, as quais estão relacionadas à prevenção e

a terapia de diversas doenças associadas ao aumento de RL e espécies oxi-redutoras. As

catequínas, por exemplo, grupos de polifenóis presentes em espécies do gênero passiflora,

consistem em eficientes antioxidantes naturais que diminuem a lipoperóxidação renal em

4

ratos sedentários após sessão aguda de exercício aeróbico. No entanto, não há, ainda, relatos

na literatura quanto aos efeitos redox protetores das diversas espécies do gênero passiflora,

como por exemplo, a P. cincinnata Mast, a qual é bastante consumida por diferentes

comunidades do semi-árido nordestino do Brasil.

A Passiflora cincinnta Mast (Passifloraceae), conhecida popularmente como

“maracujá-do-mato” e típica de regiões semi-áridas, é bastante encontrada no nordeste

brasileiro, principalmente, nos Estados da Bahia, Alagoas, Pernambuco e Sergipe, a qual é

comumente utilizada como planta ornamental e medicinal. O chá de suas folhas é

rotineiramente utilizado na medicina popular como ansiolítico, hipoglicemiante, hipotensor e

antioxidante.

Foi comprovado recentemente, em ensaios in vitro, que esta espécie possui potencial

antioxidante e baixa toxidade biológica. No entanto, investigações in vivo são necessárias para

justificar o uso popular e conduzir novas pesquisas na descoberta do(s) constituinte(s)

ativo(s), o qual, num futuro bem próximo, poderá ser utilizado como suplemento nutricional

por atletas e praticantes de atividades físicas amadores ou profissionais, objetivando

minimizar os efeitos redox de agentes radicalares ao organismo, durante e após o exercício,

bem como, obter maior usufruto dos benefícios desta prática à saúde.

Assim sendo, a investigação do potencial antioxidante e redox protetor das diversas

espécies do gênero passiflora, em especial a P. cincinnata Mast, é de suma importância, tanto

do ponto de vista cientifico, por ser capaz de prevenir lesões oxidativas em órgãos e tecidos

induzido por EROs, bem como econômico, tornando-se uma nova opção de renda para os

pequenos agricultores do semi-árido nordestino, uma vez que se trata de uma espécie

adaptada às condições locais de cultivo e nativa da região. A qual poderá ser comercializada

para chás, na forma de saquês, na fabricação de doces e geléias, bem como, servir de matéria

prima à indústria farmacêutica para formulação de medicamentos e suplementos nutricionais.

5

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Radicais Livres

O termo radical livre é definido como qualquer átomo, grupo de átomo ou

molécula que possui em sua estrutura elétrons desemparelhado, e, são capazes de existir de

maneira independente (livre) (SIGNORINI & SIGNORINI, 1995). Eles possuem tempo de

vida muito curto, na ordem de milésimos de segundo, o qual está associado a sua reatividade

(Tabela 1) (BACURAU & ROSA, 2004).

Tabela 1: Epécies reativas de oxigênio e sua meia-vida.

Espécies Reativas de Oxigênio e Nitrogênio Meia-Vida (segundos)

OH•

OOH•

RO•

ROO•

ONOO•

H2O2

O2•

1O2

NO•

HOCl

Radical hidroxila

Radical hidroperóxido

Radical alcoxila

Radical peroxila

Radical peroxinitrico

Peróxido de hidrogênio

Radical superóxido

Oxigênio singleto

Radical oxido nítrico

Ácido hipocloroso

10-9

10-8

10-6

7

0,05 - 1

Variável

Variável

10-5

1 - 10

Variável

obs: R é um radical lipídico, por exemplo, o linoleato

Fonte: VANNUCCHI et al. (1998).

Conforme Koury & Donangelo (2003) os RL, elementos químicos instáveis,

tendem a ligar seus elétrons desemparelhados a outros elementos e estruturas celulares

próximas, podendo, com isso, ceder um elétron (radical redutor) ou captar um elétron (radical

oxidante). Como consequência dessa ação redox, a homeostase celular pode ser alterada e,

com isso, o funcionamento celular e tecidual normal ser modificado (SEN, 2001; VANCINI

et al., 2005).

Para Signorini & Signorini (1995), Ferreira & Matsubara (1997), Olszewer

(2001), Lancha Jr., (2004), o radical OH• é o mais reativo que existe no organismo. Porém, se

tratando de importância biológica, tanto ele quanto o O2• são importantes, uma vez que os

6

mesmos podem ser formados tanto no metabolismo normal, quanto no processo exacerbado

de redução do O2 molecular no interior das mitocôndrias, ou mesmo, através da

metabolização de bases purínicas pelo ciclo de Lowenstein, e ainda, através da redução do

peróxido de hidrogênio (H2O2) pelo ânion O2•, pelo Fe2+ e Cu+ através de reções de Fenton e

Haber-Weiss, como mostrado abaixo (LOWENSTEIN, 1990; BENZI, 1993; YU, 1994).

Fe+2 + H2O2 → Fe+3 + OH• + OH- → Reação de Fenton

O2•- + H2O2 → O2 + H2O + OH•

→ Reação de Haber-Weiss

Cu+ + H2O2 → Cu+2 + •OH + OH–

O O2• é formado no organismo através da redução monovalente do O2 molecular, o

qual adquire um único elétron (RODRIGUES, 2005). Conforme o mesmo autor, o principal

local de formação desse radical no organismo é a cadeia transportadora de elétrons, cuja

produção pode ser aumentada à medida que se aumenta a concentração do O2 no mesmo. Não

obstante, o mesmo autor referencia ainda que, mesmo sendo menos reativo que outros

radicais, há muitos alvos sensíveis a ele que a outras espécies radiculares. Além disso, esta

espécie radicalar é uma das principais fontes geradores de hidroxila radicalar (OH•), a qual é

responsável pela maioria dos danos oxidativos induzidos por RL no organismo, podendo

atacar todos os tipos de biomoléculas, originando reações em cadeia e induzindo, assim,

alterações redox ao sistema biológico, como peroxidação lipídica e oxidação de proteínas

(POLLACK & LEEUWNBURGH, 1999; CLARKSON & THOMPSON, 2000; EVANS,

2000).

Entretanto, o termo RL é muito amplo para designar todas as espécies radicalares

produzidas no organismo, haja vista que, há espécies que não apresentam elétrons

desemparelhados, porém, mesmo assim, apresenta potencial reatividade biológica como, por

exemplo, o oxigênio singlet (1O2), o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o ácido hipocloroso

(HOCl), os quais são estáveis (FERREIRA & MATSUBARA, 1997). Neste sentido, passa a

ser apropriado designar essas espécies químicas reativas de acordo com seu elemento químico

de formação: espécies reativas de oxigênio ou EROs (oriunda do metabolismo do oxigênio) e

espécies reativas de nitrogênio ou ERNs (oriunda do metabolismo do nitrogênio), sendo que

esta ultima não será abordada neste trabalho (LI Jr., 1999; BACURAU & ROSA, 2004).

7

2.1.1 Espécies reativas de oxigênio

Por definição, podemos conceituar que as EROs são RL que, mesmo não

apresentando elétrons desemparelhados, são oriundos do metabolismo do oxigênio e

apresentam potencial reatividade biológica (RODRIGUES, 2005).

Apesar do O2 ser imprescindível à vida, ele pode apresentar uma elevada toxidade

para o organismo (YU & CHUNG, 2006). Por exemplo, a cadeia transportadora de elétrons é

responsável por mais de 90% do consumo de O2 total do organismo. Nela o oxigênio é o

aceptor final de elétrons do NADH e do FADH2 que são derivados da oxidação de fontes

energéticas (carboidratos e lipídios, por exemplo). Nesta via, o O2 é fundamental para geração

de energia (ATP). Porém, neste processo de redução do oxigênio e geração de energia,

oxidases dão origem a EROs, tais O2•, H2O2 e/ou OH• (RODRIGUES, 2005).

Neste sentido, à medida que o organismo necessita de maior aporte energético

e/ou maior concentração de O2, como no exercício físico, por exemplo, há inevitavelmente

uma maior produção de EROs pelo mesmo, uma vez que cerca de 2 a 5% do O2 consumido

pode resultar na geração dessas espécies reativas (RODRIGUES, 2005).

Todavia, apesar da reatividade das EROs e da capacidade das mesmas de poderem

desencadear ações deletérias ao reagir com proteínas, lipídios, carboidratos e ácidos nucléicos

(DNA e RNA), as mesmas, em baixas concentrações exercem importantes papeis fisiológicos

em reações redox essenciais à vida, como aumento da permeabilidade ao Ca2+, aumento da

força de contratilidade muscular, regulação da expressão gênica, regulação metabólica,

regulação do fluxo sanguíneo, destruição de microorganismos por fagócitos, síntese de

mediadores inflamatórios e detoxificação tecidual. Contudo, em excesso, se tornam

prejudiciais, podendo ocasionar ações deletérias ao mesmo, como redução da força de

contratilidade muscular, aceleração dos processos de fadiga e contribuição no aumento das

lesões musculares devido a oxidações das biomoléculas (lipídios, proteínas, DNA e RNA),

cujo resultado altera o metabolismo e o funcionamento normal da célula (CHOW, 1979;

FERREIRA & MATSUBARA, 1997, HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999; LEITE &

SARNI, 2003; SILVEIRA, 2004).

Conforme Ferreira & Matsubara (1997), Leite & Sarni (2003) e Schneider &

Oliveira (2004), já são mais de 50 patologias associadas às ações deletérias das EROs (Figura

1), tais como enfisema pulmonar, displasia bronco-pulmonar, pneumoconiose, asma,

síndrome de angústia respiratória do adulto (SARA), artrite reumatóide, lesão de retina,

mutações, mal de Alzheimer e Parkinson, envelhecimento, aterosclerose e câncer, sendo as

8

duas ultimas, as principais causas de óbito da sociedade moderna. Desta forma, conhecer o

mecanismo de como essas substâncias são geradas é de fundamental importância.

Figura 1: Doenças associadas as EROs

2.1.2 Mecanismos de geração de EROs no organismo

Conforme Olszewer (2001), quando o oxigênio ingressa no organismo, este tenderá a

se transformar numa ERO. De acordo com Vancini et al. (2005); Souza, Fernandes & Cyrino

(2006); Gandra, Macedo & Alves (2006), há dois fatores primordiais para geração de EROs

no organismo: um é endógeno e outro exógeno. Contudo, ambos podem atuar de três

maneiras distintas: a) através da clivagem homolítica de uma ligação covalente entre duas

moléculas; b) perda de um elétron; ou c) adição de um elétron à molécula (CHEESEMAN &

SLATER, 1996).

É descrito na literatura que as EROs podem ser geradas endogenamente em seis

locais metabólicos distinto (Yu, 1994; Morrisey & O’ Brien, 1998; Silveira, 2004). a) na

cadeia transportadora de elétrons mitocondrial, devido ao extravasamento de elétrons (íons H-

), principalmente, no complexo I e a coenzima Q, promovendo a redução univalente do

oxigênio molecular; b) nos peroxissomos que contém acetil-coA oxidase, dopamina β-

9

hidroxilase e urato oxidase; c) no sistema enzimático citocromo P-450 durante a defesa contra

xenobióticos; d) nas células do sistema imunológico como monócitos e fagócitos; e) Pela

enzima xantina oxidase, durante um episódio isquemico, cuja molécula de AMP (monofosfato

de adenosina) é continuamente degradada a hipoxantina, podendo, em seguida, ser convertida

para xantina e ácido úrico pela xantina oxidase, que usa o oxigênio como aceptor final de

elétrons, podendo, dessa maneira, formar o radical O2•; f) através da peroxidação lipídica,

onde há a formação de radical de ácido graxo livre (L•), o qual reage facilmente com O2

formando o radical peroxil (LOO•), que age oxidando outras moléculas numa reação em

cadeia até que o mesmo venha a reagir com outra EROs ou com um agente antioxidante, o

qual possa o estabilizar (Figura 2).

Quanto ao fator exógeno, este contribui para o aumento de EROs através da elevada

ingestão de metais de transição como ferro e cobre na alimentação (reações de Fenton e

Haber-Weiss), bem como de gorduras saturadas, além da exposição à radiação, ao fumo, a

antibióticos, ao álcool, a poluição e a prática de exercício físico de alta intensidade (YU,

1994; OLSZEWER, 2001; CHIHUAILAF, CONTRERAS & WITTWER, 2002).

Figura 2: Representação metabólica da geração de EROs no organismo. Fonte: GASTELL & ALEJO (2000).

10

2.1.3 Produção de EROs no exercício físico

Durante o exercício há um aumento acentuado na produção de EROs, principalmente

durante os exercício aeróbicos de alta intensidade, afinal a ventilação pulmonar triplica nestes

exercício, ocorrendo, paralelamente, um aumento no consumo de oxigênio pelo mesmo de 10

a 20 vezes comparado ao repouso, bem como, aumento na captação desse oxigênio de 100 a

200 vezes pelo tecido muscular, o qual favorece o aumento de EROs mitocôndrial durante o

processo de produção de energia (ATP), danos oxidativos e alterações da função celular

(BACURAU & ROSA, 2004).

Paralelamente, além do aumento de O2, outros processos também contribuem para o

aumento de EROs durante o exercício, tais como aumento de catecolaminas, produção de

ácido láctico, elevação da taxa de auto-oxidação de hemoglobina e aumento da temperatura

corporal (BACURAU & ROSA, 2004).

Não obstante, durante e, principalmente, após o exercício, um outro fenômeno

denominado de isquemia-reperfusão contribui significativamente para o aumento de EROs no

organismo, devido à hipóxia e à reoxigenação temporária que ocorrem no músculo exercitado,

em função das contrações e relaxamentos estabelecidos ciclicamente. (SCHNEIDER &

OLIVEIRA, 2004; FINAUD et al., 2006; CRUZAT et al., 2007). Durante a contração, a

compressão vascular estabelece um quadro de isquemia e, portanto, de hipóxia; no

relaxamento ocorre a reperfusão e, consequentemente, a reoxigenação (SCHNEIDER &

OLIVEIRA, 2004). Uma vez que durante o exercício a circulação sanguínea é desviada para

os músculos em atividade, outros tecidos também podem sofrer hipóxia temporária

(CRUZAT et al., 2007). Como consequência, esses tecidos recebem uma grande

quantidade de oxigênio após o exercício, favorecendo a geração de EROs (SCHNEIDER &

OLIVEIRA, 2004; FINAUD et al., 2006; CRUZAT et al., 2007). No processo de

isquemia/reperfusão, o aumento EROs durante e após o exercício é favorecido pelo

catabolismo das purinas. Tendo em vista que, a conversão da enzima xantina-desidrogenase à

sua forma oxidada (xantina-oxidase), mediante proteases intracelulares ativadas por Ca2+,

favorece o aumento de EROs. Durante a hipóxia, o ATP é degradado até hipoxantina, que se

acumula nos tecidos. Como resultado, há falência da homeostase celular, permitindo o influxo

de Ca2+ para as células, o que ativa proteases intracelulares a converterem a enzima xantina

desidrogenase em xantina oxidase. Na reperfusão a xantina oxidase utiliza O2 para promover

a conversão de hipoxantina em xantina e posteriormente em ácido úrico, ocorrendo redução

univalente do oxigênio molecular e consequente geração de H2O2 e HO• (JI, 1999; CAMPOS

11

& YOSHIDA, 2004; FINAUD et al., 2006; CRUZAT et al., 2007; FERREIRA et al.,

2007).

Em contrapartida, com o intuito de manter a integridade celular contra os ataques

redox das diversas espécies radicalares, os organismos aeróbicos (a exemplo do ser humano)

no transcurso de sua evolução desenvolveram um sofisticado e eficiente sistema de defesa,

denominado antioxidante (PÔRTO, 2001).

2.2 O Sistema de Defesa Antioxidante

Conforme Signorini & Signorini (1995) o sistema antioxidante é a principal defesa

orgânica contra a ação das EROs, o qual pode ser enzimático ou não enzimático. O primeiro

inclui as enzimas catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx),

Glutationa redutase (GR) e Glutationa reduzida (GSH), que são produzidas pelo próprio

organismo (agentes endógenos) e que estão presentes em maior quantidade no fígado, cérebro

e músculos, principalmente, nos músculos com predomínio oxidativo, ou seja, aqueles que

apresentam uma maior concentração de fibras do tipo I.

O segundo tipo inclui compostos não enzimáticos produzidos pelo próprio organismo

(endógeno) como bilirrubina, ceruloplasmina, hormônios sexuais, melantonina, coenzima Q,

ácido úrico, além de compostos exógenos, que são ingeridos através da dieta ou

suplementação alimentar, como ácido ascórbico (vitamina C), α-tocoferol (vitamina E), β-

caroteno (o precursor de vitamina A) e grupos fenólicos de plantas tais como flavonóides

(SIGNORINI & SIGNORINI, 1995; SCHNEIDER & OLIVEIRA, 2004).

Conforme Ferreira & Matsubara (1997), a ação dos antioxidantes no organismo pode

ocorrer de duas maneiras distintas: a primeira como detoxificadora, atuando antes que ocorra

lesão às estruturas biológicas, sendo constituída pela GSH, SOD, GPx e vitamina E. A

segunda linha tem a função de reparar a lesão ocorrida, e é constituída pela vitamina C, GR e

GPx, entre outras. Entretanto, apenas a vitamina E é considerada um antioxidante estrutural

de membrana, não estando presente no meio intracelular.

Para Yu (1994), os antioxidantes enzimáticos não agem separadamente, elas agem

em conjunto e são responsáveis pela eliminação do O2•-, H2O2, OH• e outros hidroperóxidos

que podem oxidar as estruturas celulares no meio intra e extracelulares. A SOD, por exemplo,

age transformando dois ânions radicais superóxidos em um peróxido de hidrogênio (reação

1). A CAT possui a capacidade de transformar o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio

12

(reação 2), porém, sua localização está nos peroxissomas, tendo, por isto, sua ação diminuída

em órgãos como coração, pulmão e cérebro, os quais possuem pouco peroxissomas. Nestes

órgãos a ação antioxidante ocorre, prioritariamente, pela GPx (reação 3), localizada no citosol

e na matriz mitocondrial. Sua ação ocorre através da redução do peróxido de hidrogênio ou

hidropeptídeos orgânicos através da utilização da GSH, substrato da GPx, transferindo dois

hidrogênios dos grupamentos sulfidrílas para os peróxidos, convertendo-os em álcool e/ou

água, resultando em glutationa dissulfeto (GSSG).

SOD + O2• + 2H+

→ SOD + H2O2 (1)

2H2O2 + CAT → O2 + 2H2O (2)

H2O2 ou RO2H + GPx + GSH → GSSG + H2O ou ROH (3)

Desta forma, o sistema antioxidante é responsável pela manutenção do equilíbrio

redox celular, uma vez que são capazes de reduzir a formação e os efeitos indesejáveis das

EROs (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999).

2.2.1 Defesa antioxidante no exercício agudo

Segundo Mcardle et al. (1998), não há possibilidade de se parar a produção de EROs

no organismo, principalmente, durante a prática de atividade física. Cuja é possível identificar

um aumento acentuado na produção de EROs e, consequentemente, maior requerimento dos

mecanismos de defesa antioxidante.

Durante o exercício agudo foi comprovado haver aumento na atividade enzimática,

principalmente, naquelas que constituem o escalão de defesa primária (CAT, SOD e GPx),

tanto em animais, quanto em humanos (ISIDÓRIO, 2007). Em contrapartida, até o momento,

não foi comprovado que estas mesmas enzimas mantêm-se capazes de sustentar o estado

redox até o fim do exercício, devido, principalmente, o aumento exacerbado na síntese de

EROs pelo mesmo, bem como, o tempo é reduzido para promover adaptações a nível

quantitativo durante o exercício (COSTA, 2010).

Di Meo et al. (1996), descreve que a capacidade antioxidante dos diversos tecidos e

órgãos mostram-se diferentes durante o exercício. Sendo o fígado, órgão de elevado teor

metabólico, aquele que exibe maior capacidade antioxidante, seguido por sangue, coração e

músculo. No entanto, mesmo sendo comprovado que o treinamento físico melhora a

13

capacidade antioxidante dos diversos tecidos supracitados, o músculo esquelético é aquele

que adquire maior adaptação a produção de espécies radicalares impostas pelo exercício,

principalmente, a nível de enzima antioxidante (AGUILAR-SILVA et al., 2002).

2.2.2 Adaptações antioxidantes ao treinamento físico

Quando o exercício promove uma depleção dos estoques antioxidantes não-

enzimáticos, tais como as vitaminas A, E, C e glutationa, e, caso a ingestão destes não esteja

em equilíbrio com a demanda, como conseqüência biológica preventiva, o organismo, a longo

prazo, cria mecanismos de ativação adaptativos e aumenta a taxa de síntese das enzimas

antioxidantes para compensar o estresse oxidativo intenso (ISIDÓRIO, 2007).

Cada enzima apresenta uma forma diferente de adaptação ao estresse oxidativo,

dependendo do modelo específico de síntese de cada enzima e das taxas de EROs produzidas.

A SOD, por exemplo, apresenta alta atividade em todos os tecidos e tipos de fibras

musculares, onde a remoção de superóxido não é fator limitante. Enquanto, a GPx, que

degrada os produtos finais das EROs (H2O2 e peróxidos orgânicos), tem atividade baixa e

apresenta grande adaptação ao treinamento, em comparação a SOD e CAT.

As adaptações antioxidantes são fortemente influenciadas por uma série de fatores

fisiológicos e ambientais, tais como sexo, idade, dieta e medicação. Conforme Oliveira

(2010), em estudo como animais, ratas têm demonstrado menor grau de lesão oxidativa

muscular induzida pelo exercício e adaptações de enzimas antioxidantes ao treinamento que

ratos, possivelmente devido ao efeito antioxidante do estrógeno. Bem como, animais e seres

humanos idosos, geralmente apresentam menor grau de adaptação de enzimas antioxidantes

que indivíduos jovens submetidos à mesma carga de trabalho. A razão para esta diferença é

complexa e pode está relacionada a alterações intrínsecas no sistema de defesa antioxidante,

assim como na transdução de sinais, a qual em animais velhos tornam-se falhas.

2.3 O Estresse Oxidativo

Há situações em que o sistema de defesa não consegue proteger as estruturas

biológicas da ação das EROs (Figura 3). Quando o organismo excede o nível de esforço físico

ao qual está adaptado, há um maior na produção de EROs e maior depleção do sistema de

14

defesa antioxidante, o qual não consegue manter o balanço redox adequado dessas espécies

reativas no organismo (SIGNORINI & SIGNORINI, 1995). Quando isso ocorre, o organismo

fica em condições de excesso de agentes oxidantes e deficiência de antioxidante, esse

desequilíbrio redox implica em perda de funções celulares vitais e instauração de um quadro

ou condição orgânica prejudicial para o organismo denominado de estresse oxidativo (EO)

(FERREIRA & MATSUBARA, 1997).

Figura 3: Conceito de estress oxidativo baseado no desequilíbrio entre as ações pró-oxidante e antioxidante. Fonte: Ferreira, Ferreira & Duarte (2007)

Hábitos de vida inapropriados, tais como o consumo de álcool, fumo, dieta

inadequada e prática de exercício de alta intensidade, assim como, condições ambientais

impróprias como a exposição à radiação UV, a poluição, a umidade e temperatura elevada,

bem como, estado psicológico que provoque estresse emocional e o envelhecimento, são

fatores que estão diretamente relacionados com o EO (LIU et al.,2000; MCARDLE et al.,

2001; VANCINI et al., 2005).

Urso & Clarkson (2003) e Mota et al., (2004) relataram que uma situação de EO

representa uma incapacidade do organismo de impedir os efeitos deletérios das EROs as

diversas biomoléculas, a qual pode ocorrer através da lipoperoxidação, oxidação de proteínas

e oxidação de ácidos nucléicos (NOHL et al., 2005).

15

2.3.1 Lipoperoxidação

De acordo com Sen (2001) e Rodrigues (2005), a lipoperoxidação é um fenômeno

que ocorre quando uma ERO reage com um ácido graxo (ácido linoléico, por exemplo) dando

origem a outras espécies radicalares. Embora os ácidos graxos saturados possam reagir com o

oxigênio, à susceptibilidade de lipídeos à oxidação é maior em ácidos graxos com

insaturações. Ácidos graxos contendo uma ou mais duplas ligações são especialmente

sensíveis, pois o ataque do oxigênio ocorre principalmente nas posições adjacentes às duplas

ligações (NAWAR, 1998). Este mecanismo pode ser descrito em três etapas distintas:

iniciação, propagação e terminação (SEN, 2001; RODRIGUES, 2005).

Na Iniciação, radicais alquil, alcoxil, hidroxil, peróxidos e hidroperóxido (X•), por

exemplo, reagem com um átomo de hidrogênio de um grupo metileno (-CH2-) da cadeia

lateral de um ácido graxo poliinsaturado, deixando um radical centrado no carbono, uma vez

que os hidrogênios desse grupo metileno são bastante reativos, podendo ser removidos seja na

forma de íons H+ ou na forma de hidrogênio radical (H•) devido à proximidade com as duplas

ligações (reação 1).

X• + L-CH → L-C• + H2O (1)

O radical carbono centrado (L-C•), recém formado, reage muito rapidamente com o

oxigênio molecular formando radical peróxil (L-C-O-O•). Esses radicais são altamente

reativos e capazes de remover átomos de hidrogênio de outros ácidos graxos insaturados,

formando hidroperóxido e outros radicais lipídicos. Os novos radicais reagem com o oxigênio

e ocorre uma propagação desta reação (reação 2).

L-C• + O2 → L-C-O-O• (2)

Devido à ressonância na estabilização de radicais, pode haver, também, uma

mudança na posição de duplas ligações resultando na formação de hidroperóxidos isômeros

contendo dienos conjugados. Hidroperóxidos são produtos primários de autoxidação

relativamente instáveis, que participam de numerosas reações de degradação e interação

resultando em um grande número de compostos de diferentes pesos moleculares, limiares de

percepção de flavor e importância biológica (NAWAR, 1996).

16

O término da lipoperóxidação (reação 3) ocorre quando os radicais reagem entre si

formando um produto não radicalar. As reações também podem terminar quando um dos

radicais reage com um antioxidante, removendo um hidrogênio e formando um radical inerte

do antioxidante (RODRIGUES, 2005).

L-C• + L-C• → L-C-C-L (3)

Segundo Sen (2001), quando EROs são produzidas, elas podem ser transportadas

pelo sangue para alvos distantes, podendo iniciar diversas lesões oxidativas. Caso não haja

interrupção, as reações em cadeia podem gerar danos extensivo à lipídios de membrana.

Como consequência, as membranas sofrerão alterações em sua permeabilidade,

comprometendo, com isso, toda a integridade e funcionalidade celular (SELMAN et al.,

2002). Para Chang et al. (2006), o principal antioxidante responsável pela prevenção da

lipoperoxidação é a vitamina E, que devido sua liposolubilidade, consegue neutralizar

diretamente os radicais ROO•.

Conforme Halliwell & Gutteridge (1999) há vários métodos para se determinar a

lipoperóxidação. Contudo, o teste de substâncias reativa ao ácido tiobarbitúrico (TBARs) é o

mais amplamente utilizado como biomarcador da lipoperoxidação em sistemas biológicos:

sangue, urina e órgãos (YAGI, 1976; OHKAWA et al., 1979; LAPENNA et al., 2001).

Durante a lipoperóxidação hidrocarbonetos voláteis (etano e pentano), aldeídos saturados e

insaturados, cetonas, entre outros produtos são produzidos, dentre estes o malondialdeído

(MDA), por exemplo, o qual é um aldeído saturado que reage prontamente com o ácido

tiobarbitúrico (TBA), formando um complexo colorido que pode ser quantificado

espectrofotometricamente (YAGI, 1976; OHKAWA et al., 1979; HALLIWELL &

GUTTERIDGE, 1999; LAPENNA et al., 2001).

2.3.2 Oxidação de proteínas

Devido sua complexa estrutura e aos grupos funcionais oxidáveis dos aminoácidos,

as proteínas também são alvo fáceis das EROs (FRIGUET, 2006). Assim, durante a oxidação

protéica pode acontecer uma série de modificações químicas nas proteínas, que podem

produzir alterações das estruturas das mesmas, inativando-as e provocando danos nas

atividades biológicas a elas associadas (DALLE-DONNE et al., 2003). Dentre as principais

17

modificações químicas ocasionadas pelas EROs podemos destacar a hidroxilação de

aminoácidos aromáticos, oxidação de aminoácidos que possuem enxofre (cisteína),

peroxidação de aminoácidos alifáticos e formação de grupos carbonilas. Todas estas

alterações estão associadas à perda ou mudanças nas funções biológicas das mesmas

(STADMAN & LEVINE, 2000).

Conforme Linton et al. (2001), os mecanismos para a lesão oxidativa das proteínas

podem ocorre através da formação de EROs em local específico através da ativação redox de

metais de transição que não estão ligados fortemente à proteína ou através de EROs não

dependentes de metais. Neste caso, o dano pode ocorrer diretamente nos aminoácidos por

excisão ou por quebra da ligação peptídica.

Quando uma proteína ou aminoácido é oxidado, subprodutos carbonílicos são

gerados, os quais servem como indicadores de lesão oxidativa e podem ser quantificados

espectrofotometricamente através de reações específicas com o reagente 2,4-dinitrofenil

hidrazina (DNPH) (REZNICK & PACKER, 1994).

2.3.3 Oxidação de ácidos nucléicos

Um terceiro alvo do EO são os ácidos nucléicos (DNA e RNA). Segundo Remmen et

al. (2003), uma situação de EO pode induzir uma lesão oxidativa significativa ao DNA

através de modificações de suas bases purínicas e formação de produtos finais deletérios,

sendo o HO• o principal responsável por essas lesões. As quais são favorecidas pela intensa

força negativa dos grupamentos fosfato do DNA, capazes de ligar-se com metais de carga

positiva. Entre estes, estão o ferro e o cobre, desencadeadores de reações de Fenton e Haber-

Weiss.

São identificadas atualmente mais de cem alterações químicas EROs-dependente

sobre ácidos nucléicos, as quais são capazes de comprometer todo o seu desempenho

fisiológico (RIEGEL, 2005). Ainda, conforme o autor, a maioria destas lesões afeta,

principalmente, o DNA mitocondrial, uma vez que é na mitocôndria que mais se forma EROs.

E, entre todas as alterações, a mais comum é a conversão de 2’-deoxoguanosina em 8-oxi-2’-

deoxoguanosina (oxo8dG) (Figura 4), a qual é utilizado comumente como marcador de lesão

oxidativa de DNA, podendo ser quantificado espectrofotometricamente ou por cromatografia

de massa (CADENAS et al., 1997; HERRERO & BARJA, 1998).

18

Figura 4: Reações de oxidação da 2’-desoxiguanosina (dGuo) com radical hidroxila (•OH), elétron livre (-e-) e oxigênio singlete (1O2), na geração de 8-oxo-7,8-diidro-2’-deoxiguanosina (8-oxodGuo). Fonte: BERRA, MENCK & DI MASCIO (2006).

2.4 Exercício Físico e Estresse Oxidativo

Foi constatado na década de 70, pela primeira vez, que as EROs são geradas em

quantidades acima do normal em tecidos e órgãos de animais e humanos durante o exercício

físico. Assim, há aumento de lesões oxidativas a lipídios no corpo sob condição de esforço

físico intenso. Não obstante, no inicio da década de 80, foi comprovado haver formação de

EROs no músculo esquelético e fígado de animais, acima das condições fisiológicas, durante

exercícios intensos. Da mesma forma, em humanos, no final da década de 90, também foi

constatado aumento de oxi-radicais no plasma após exercício físico intenso (PEREIRA &

SOUZA JR., 2008). Fatos estes, que levantaram reflexões sobre até que ponto a prática de

exercício físico promove, apenas, benefícios à saúde.

Sabemos que uma baixa produção de EROs pelo organismo é muito importante,

principalmente, porque eles são necessários para a atividade contrátil normal do músculo

esquelético e, também, por ter efeitos considerados positivos sobre o sistema imune

(CRUZAT et al., 2007; LECARPENTIER, 2007). Contudo, os exercícios físicos intensos e

prolongados têm sido associados com o aumento da geração de EROs (MASTALOUDIS et

19

al., 2004; TRABER, 2006). E este aumento pode causar dano oxidativo ao DNA, na

musculatura esquelética e nos tecidos, o que pode desencadear envelhecimento prematuro e

graves lesões oxidativa com consequente processo inflamatório, fatos que implicam em

prejuízo no desempenho físico e à saúde do atleta (JI & LEICHTWEIS, 1997; SUREDA et

al., 2005; FINAUD et al., 2006; TRABER, 2006; CRUZAT et al., 2007; FERREIRA et al.,

2007; LECARPENTIER, 2007; RADAK et al., 2007; VALKO et al., 2007). Não obstante,

o treinamento físico, exercitado em níveis moderados, é um bom indutor de adaptações do

sistema de defesa antioxidante enzimático (JI & LEICHTWEIS, 1997; VILLA-

CABALLERO et al., 2000; BELVIRANLI & GÖKBEL, 2006; CRUZAT et al., 2007;

FERREIRA et al., 2007; JUDGE & LEEUWENBURGH, 2007; RADAK et al., 2007; JI et

al., 2008). Haja vista que, foi demonstrado um aumento na capacidade antioxidante

enzimática no tecido cardíaco, hepático e pulmonar de ratos após período de treinamento fisco

moderado (FERREIRA et al., 2007).

Embora o treinamento físico induza adaptações benéficas, a realização de exercícios

intensos e/ou prolongados, acima da intensidade habitual de esforço ou com frequência de

treinamento muito elevada, ele suplanta a capacidade do sistema antioxidante endógeno e

geralmente resulta em lesão oxidativa. Esta sobrecarga oxidativa, apesar de se fazer sentir

mais intensamente nos músculos esqueléticos, tem sido relatada, também, em muitos outros

órgãos e sistemas corporais responsáveis pela regulação e manutenção da homeostase

(CRUZAT et al.,2007; FERREIRA et al., 2007; KIM et al., 2007; LECARPENTIER, 2007),

incluindo coração (FERREIRA et al.,2007), fígado (NAGEL et al., 1990; DE PAZ et al.,

1995; FERREIRA et al., 2007; KIM et al., 2007), rins e pulmões (FERREIRA et al., 2007),

eritrócitos (SCHMIDT et al., 1988; SUREDA et al., 2005; YUSOF et al., 2007), sistemas

imune (JI, 1999; MOOREN et al., 2002; SUREDA et al., 2005; BELVIRANLI & GÖKBEL,

2006; CRUZAT et al., 2007; KIM et al., 2007) e ósteo-articular (FERREIRA et al., 2007;

KIM et al., 2007). De fato, as acentuadas alterações hormonais, assim como, as alterações

térmicas, associadas ao exercício intenso e exaustivo far-se-ão sentir, de forma mais ou menos

intensa, na maior parte das células corporais (FERREIRA et al., 2007).

2.4.1. Estresse oxidativo no músculo esquelética

No músculo esquelético, apesar da mitocôndria constituir a principal fonte e,

simultaneamente, o principal alvo de EROs, a atividade das enzimas xantina oxidase e

20

fosfolipase A2, a desaminação das catecolaminas e a infiltração de leucócitos pós-exercício,

juntamente com a oxidação da mioglobina por RL ou por sua auto-oxidação, contribuem

fortemente como fontes adicionais de EROs, consequentemente, lesões oxidativas e

estresse oxidativo (FINAUD et al., 2006; FERREIRA et al., 2007).

Lesões no tecido muscular induzidas pelo exercício podem ser decorrentes de vários

fatores: ruptura de tecidos conectivos ligados a miofibrilas adjacentes, da própria célula

muscular, da lâmina basal adjacente à membrana plasmática, da membrana plasmática da

célula muscular, do sarcômero, do retículo sarcoplasmático, ou ainda de uma combinação

desses componentes (CRUZAT et al., 2007).

Para comprovação de lesões musculares induzidas pelo exercício várias técnicas

podem ser utilizadas, desde a avaliação direta, através de técnicas histológicas ou microscopia

eletrônica, às avaliações indiretamente, através da determinação do efluxo de enzimas

citosólicas específicas para a circulação sanguínea (CRUZAT et al., 2007; FOSCHINI et al.,

2007), podendo variar desde uma lesão ultra-estrutural de fibras musculares até traumas

envolvendo a completa ruptura do músculo. As características morfológicas e ultra-

estruturais da lesão induzida pelo exercício estão bem documentadas em modelos animais e

humanos (ARMSTRONG et al., 1983; GIBALA et al., 1995; MORGAN & ALLEN, 1999;

PROSKE & MORGAN, 2001; STUPKA et al., 2001; MAGAUDDA et al., 2004).

Em humanos, por razões éticas e logísticas, as evidências de estresse e lesão

oxidativa induzidos pelo exercício têm sido essencialmente estudadas em nível sanguíneo,

quer no plasma, quer nas células circulantes (FERREIRA et al., 2007). Neste contexto, o

aumento da concentração de proteínas citosólicas na circulação após o exercício reflete a

lesão muscular. As proteínas avaliadas frequentemente são a creatina quinase (CPK), a lactato

desidrogenase (LDH), a transaminase glutâmico-oxalacética (TGO, também chamada de

aspartato aminotransferase ou AST) e a mioglobina, que, normalmente, são incapazes de

atravessar a membrana plasmática. A presença dessas proteínas na circulação sanguínea

reflete significativa alteração na estrutura e permeabilidade da membrana miofibrilar

(CRUZAT et al., 2007; APPLE et al., 1988; AGARWAL & ANKRA- BADU, 1999;

BARBOSA et al., 2003; LAC & MASO, 2004; GASPER & GILCHRIST 2005;

FOSCHINI et al., 2007). Dentre elas, a CPK é frequentemente descrita como principal

marcador indireto de dano muscular, sobretudo após o exercício de força ou outros exercícios

que exijam ações predominantemente excêntricas (BARBOSA et al., 2003; FOSCHINI et al.,

2007).

21

2.4.2. Estresse oxidativo no coração

Semelhante ao que foi descrito para o músculo esquelético, hoje é unanimemente

aceito que o exercício, sobretudo de alta intensidade, promove, também, elevação do estresse

oxidativo no coração, induzindo um aumento em marcadores de lesão oxidativa (FERREIRA

et al., 2007). O miocárdio parece ser particularmente susceptível a todas as situações que

promovam uma elevação do seu metabolismo, nas quais se incluem o exercício físico, uma

vez que a sua capacidade metabólica oxidativa é muito elevada devido à abundância de

mitocôndrias (FERREIRA et al., 2007; JUDGE & LEEUWENBURGH, 2007). O

estresse oxidativo aumentado neste órgão durante o exercício é resultado de aumentos

dramático no consumo de oxigênio (JUDGE & LEEUWENBURGH, 2007). Nestas

condições, a reação da CPK é importante para a rápida ressíntese de ATP a partir de creatina

fosfato e ADP, uma vez que o coração aumenta seu trabalho (PUTNEY et al., 1984;

NASCIMBEN et al., 1996; FOSCHINI et al., 2007). Considerando que CPK é uma enzima

citosólica, níveis séricos aumentados dessa enzima após exercício podem ser também

indicativos de lesão oxidativa no miocárdio.

Várias evidências sugerem que o estresse oxidativo desempenha um papel

importante na patogênese de doenças cardiovasculares (WATTANAPITAYAKUL &

BAUER, 2001; MOLAVI & MEHTA, 2004; ABRAMSON et al., 2005; BELARDINELLI,

2007; KASAP et al., 2007). A presença de níveis plasmáticos elevados de alguns marcadores

de estado inflamatório, como a proteína C-reativa (PCR) é um fator preditivo de risco de

síndrome coronariana aguda, infarto do miocárdio, doença arterial periférica oclusiva e morte

cardíaca súbita, tanto em indivíduos sadios, como em pacientes com doença aterosclerótica

estabelecida (MITKA, 2004; DUMMER et al., 2007). Níveis séricos aumentados da

enzima TGO foram usados na diagnose de infarto agudo do miocárdio desde 1954. Essa

transaminase é encontrada no citoplasma e nas mitocôndrias de muitas células, principalmente

do fígado, coração, músculos esqueléticos, rins, pâncreas e hemácias (DEWAR et al., 1958).

Apesar dos marcadores citados não serem específicos para verificar lesões no miocárdio,

aumentos nos níveis plasmáticos de PCR e TGO após exercício também podem ser

indicativos de lesão oxidativa no miocárdio.

22

2.4.3. Estresse oxidativo no fígado

É descrito na literatura que exercício físico, igualmente ao que ocorre em outros

órgãos, induz a formação de EROs e danos oxidativos no fígado, tais como a lipoperoxidação

e oxidação a proteínas (NAGEL et al., 1990; WITT et al., 1992; DE PAZ et al., 1995;

FERREIRA et al., 2007; KIM et al., 2007). A quantidade de dano depende da intensidade

do exercício e do estado de treinamento (WITT et al., 1992). O fígado apresenta elevada

taxa metabólica, a qual está naturalmente associada com o alto fluxo de oxigênio. Entretanto,

este fluxo diminui significativamente durante o exercício, devendo ser similar ao fenômeno

de isquemia/reperfusão (RADAK et al., 2008). Diferentemente do músculo esquelético, o

fígado contém altos níveis de xantina desidrogenase, a qual, durante o exercício, é convertida

em xantina oxidase, que por sua vez contribui como fonte adicional de ERO e,

consequentemente, com danos oxidativos (FERREIRA et al., 2007; RADAK et al., 2008).

Enquanto um único turno de exercício intenso estimula adaptações no sistema antioxidante do

músculo esquelético (JI & FU, 1992; ALESSIO et al., 2002; CRUZAT et al. 2007;

FERREIRA et al., 2007; RADAK et al. 2007), o mesmo não ocorre com o fígado, que fica

oxidativamente estressado (JI & FU, 1992; RADAK et al. 2007). Todavia, semelhantemente

ao músculo esquelético, tem sido demonstrado em animais que o treinamento físico pode

promove melhorias na capacidade antioxidante do fígado (WATARU et al., 2003;

FERREIRA et al., 2007). Em ratos, como resultado de adaptação induzida pelo treinamento

físico, foi evidenciado aumento no conteúdo de algumas enzimas antioxidantes com reduzida

produção de EROs (WATARU et al., 2003; RADAK et al., 2008).

A lesão hepática pode ser evidenciada pelo efluxo de algumas enzimas citosólicas

para a circulação sanguínea, particularmente a TGO e a TGP (transaminase glutâmico-

pirúvica), também chamada de ALT (alanina aminotransferase); esta última é encontrada em

altas concentrações apenas no fígado (BRUCE et al., 1958; DEWAR et al., 1958;

ALMERSJÖ et al., 1968; CHALIFOUX & LAGACÉ, 1969). Consequentemente, níveis

séricos aumentados dessas enzimas após exercício servem como indicativos de lesão

oxidativa neste órgão.

23

2.4.4. Estresse oxidativo no sangue

2.4.4.1. Estresse oxidativo e eritrócitos

Tem sido sugerido que exercícios intensos de longa duração e treinamentos

exaustivos podem, também, comprometer nossa capacidade de detoxificar EROs dentro das

células sanguíneas e os eritrócitos parecem ser bastante vulneráveis aos danos oxidativos

(PETIBOIS & DÉLÉRIS, 2005; SUREDA et al., 2005). Isto decorre devido sua capacidade

biossintética ser muito limitada (ausência de núcleo), mecanismo de reparo pobre (SANTOS-

SILVA et al., 2001; CAZZOLA et al., 2003; SUREDA et al., 2005), presença de grandes

quantidades de tióis (R-SH) e ácidos graxos poliinsaturados (AGPI) na sua membrana,

alta concentração interna de oxigênio e hemoglobina, fontes potenciais de processos

oxidativos (FERREIRA & MATSUBARA, 1997; CAZZOLA et al., 2003; FEKSA et al.,

2008).

Apesar de possuírem um elaborado sistema de defesa antioxidante que inclui as

enzimas CAT, SOD e GPx, se a eficiência deste sistema for superada pela magnitude dos

processos oxidativos, ocorrerá EO, o qual resultará em hemólise (FERREIRA &

MATSUBARA, 1997; FEKSA et al., 2008). Neste caso, a hemoglobina extracelular se torna

tóxica devido à natureza oxidativa dos íons ferro contidos no grupo heme, os quais participam

da reação de Fenton para produzir EROs, que causam injúria celular (STERN, 1985;

JOSEPHY et al., 1997).

Durante o EO as alterações mais comuns são a peroxidação dos lipídeos e das

proteínas de membrana, o que pode desestabilizar o citoesqueleto e comprometer a

sobrevivência da célula (PETIBOIS & DÉLÉRIS, 2005; SUREDA et al., 2005; YUSOF et

al., 2007). Adicionalmente, os eritrócitos também estão altamente expostos ao estresse

mecânico, assim como a mudanças de pH citosólico e extracelular (PETIBOIS & DÉLÉRIS,

2005).

As EROs podem alterar as propriedades químicas e físicas da membrana eritrocitária

por modificar a composição, o empacotamento e a distribuição de seus lipídeos, o que conduz

a uma alteração estrutural com redução de sua fluidez. Isto pode modificar a atividade de

diversas proteínas de membrana e acelerar a senescência do eritrócito, ou mesmo, provocar

sua remoção prematura da circulação (CAZZOLA et al., 2003; PETIBOIS & DÉLÉRIS,

2005). Os agentes oxidantes podem converter os grupamentos tióis em componentes

24

dissulfeto (GSSG), levando à desnaturação das proteínas da membrana. Neste processo, pode

ocorrer lesão intracelular com oxidação da hemoglobina (Hb) e ocorrendo precipitação da

metahemoglobina (meta-Hb), com isso, formação de corpos de inclusão eritrocitários

denominados corpúsculos de Heinz (FERREIRA & MATSUBARA, 1997; FEKSA et al.,

2008). No corpo humano, 3% do total de hemoglobina (cerca de 750 g) são transformados por

auto-oxidação. Essa reação, que produz meta-Hb e O2•, pode aumentar com o exercício

(BELVIRANLI & GÖKBEL, 2006; FINAUD et al., 2006). Os produtos da peroxidação dos

componentes lipídicos da membrana eritrocitária, também, podem induzir o EO intracelular.

A associação dos fenômenos de oxidação dos grupamentos SH, formação de corpúsculos de

Heinz e lipoperoxidação poderão promover a lesão da membrana do glóbulo vermelho

(FERREIRA & MATSUBARA, 1997; FEKSA et al., 2008).

Durante exercícios ou treinamento físico exaustivos pode ocorrer a destruição de

eritrócitos, não só pelos motivos anteriormente mencionados, mas também em decorrência da

redução do volume do plasma. O deslocamento de água para fora do espaço vascular pode

atuar como estresse químico, uma vez que a perda de água pelo sangue conduz à desidratação

do eritrócito, geralmente como consequência da perda de potássio. A desidratação dos

eritrócitos também é influenciada pelo fenômeno de isquemia/reperfusão. No entanto, em

resposta ao estresse químico, o organismo libera renina, aldosterona e vasopressina (hormônio

antidiurético ou ADH) e o resultado final é um aumento no volume plasmático (CARLSON &

MAWDSLEY, 1986; EICHNER, 2002; PETIBOIS & DÉLÉRIS, 2005). A consequência

imediata é a então chamada “anemia do esporte”, caracterizada por valores reduzidos de

eritrócitos, hemoglobina e hematócrito e alteração do volume celular médio (VCM)

(CARLSON & MAWDSLEY, 1986; EICHNER, 1992; EICHNER, 1996; EICHNER, 1998;

FALLON et al., 1999; VILARDI et al., 2001; EICHNER, 2002).

2.4.4.2. Estresse oxidativo e sistema imune

Além de aumentar o consumo de oxigênio e induzir o EO como resultado da

produção aumentada de EROs, a atividade física exaustiva pode iniciar reações que se

assemelham à fase aguda da resposta imune à infecção, induzindo liberação de proteínas de

fase aguda e mudanças na contagem das células imunes (SANTOS-SILVA et al., 2001;

MOOREN et al., 2002; CAZZOLA et al. 2003; PETIBOIS & DÉLÉRIS, 2004; PETIBOIS

& DÉLÉRIS, 2005; SUREDA et al., 2005; YUSOF et al., 2007). Enquanto os neutrófilos

25

aumentam após exercício exaustivo, a contagem de linfócitos diminui rapidamente, podendo

esta alteração permanecer por diversas horas após o exercício. O treinamento moderado

aumenta a função imune, mas o exercício exaustivo causar perturbações no sistema imune e

depressão imunológica, aumentando o risco de infecções nas vias respiratórias superiores em

decorrência da redução da função antiviral dos macrófagos alveolares nos pulmões (WOODS

et al., 2000; PEIJIE et al., 2003; MOOREN et al., 2002; SUREDA et al., 2005).

Após o exercício exaustivo, inicialmente os neutrófilos e posteriormente os

monócitos e os linfócitos são recrutados para o local de inflamação, onde produzem EROs e

enzimas proteolíticas.

A infiltração de neutrófilos é estimulada por fatores quimiotáticos, incluindo

prostaglandinas, fator de necrose tumoral (TNF)-Į, interleucinas IL-1 e IL-6. Essas duas

últimas citocinas são conhecidas por aumentar em resposta ao exercício. A IL-6 atua como

mediador primário da reação de fase aguda, estimulando a produção hepática de proteínas de

fase aguda, como PCR e inibidores de proteases. Também restringe a extensão da resposta

inflamatória por ativar a síntese de citocinas antiinflamatórias e estimular a glândula hipófise

a liberar o hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), que promove o aumento da liberação do

hormônio cortisol pelo córtex adrenal (CRUZAT et al., 2007).

As alterações hormonais que acompanham o exercício e a geração de EROs podem

inibir a proliferação de linfócitos, enquanto o dano oxidativo pode ativar processos

apoptóticos nestas células (SUREDA et al., 2005). Diferentes estudos sugerem que os

processos apoptóticos ativados nos linfócitos após exercício intenso contribuem para a

regulação da resposta imune (MOOREN et al., 2002; SUREDA et al., 2005) e parecem

estar relacionados ao status do treinamento e à intensidade do exercício (PETERS et al.,

2006).

2.4.4.3. Estresse oxidativo e plasma

O aumento do metabolismo imposto pelo exercício promove acréscimo na produção

de EROs, o que pode induzir dano oxidativo nos eritrócitos e no plasma, frações mais

suscetíveis à peroxidação lipídica (SUREDA et al., 2005).

Em humanos, a maioria dos estudos realizados para investigar a peroxidação lipídica

plasmática tem examinado a presença de peróxidos lipídicos ou de bioprodutos da

peroxidação lipídica, tais como dieno conjugados, hidrocarbonetos lipídicos (hidrocarbonetos

26

alifáticos e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos–HPAs). Destes, o mais comum é a

quantificação de dieno conjulgados como, por exemplo, o malonaldeído ou MDA, através do

teste de TBARs, cujos resultados são expressos geralmente em milimols (mmol) ou nanomol

(nmol) de equivalentes de MDA (CLARKSON & THOMPSON, 2000). Alterações nas

concentrações plasmáticas das vitaminas C e E e de glutationa oxidada (GSSG) têm sido

também usadas para indicar aumento das reações oxidativas. Pensa-se que essas vitaminas

antioxidantes podem ser mobilizadas dos tecidos para combater o EO em outra parte do

corpo. O efluxo de GSSH para o plasma e a redução de grupamentos sulfídrilas totais é

considerado, atualmente, indicativos de EO, uma vez que a glutationa reduzida (GSH) é

oxidada a GSSG nas células em resposta ao aumento de EROs (CLARKSON &

THOMPSON, 2000).

Após o exercício exaustivo, também ocorrem alterações nas concentrações séricas de

ferro e ferritina, na capacidade total de ligação do ferro e na saturação de transferrina. Apesar

de tais alterações serem similares àquelas encontradas na anemia crônica, apenas refletem a

resposta de fase aguda (FALLON et al., 1999).

Durante o exercício intenso, grande quantidade de ácido lático pode ser produzido

pelo músculo esquelético e liberada na circulação sanguínea para posterior remoção pelos

tecidos periféricos. Os exercícios lactacidêmicos, ou seja, com intensidade de esforço acima

da qual o lactato passa a se acumular na corrente sanguínea (limiar anaeróbio - LAN), têm

também uma influência direta no nível da lipoperoxição plasmática, por inibir o sistema de

defesa antioxidante dos eritrócitos (RIBEIRO et al., 2004; PETIBOIS & DÉLÉRIS, 2005;

MANCHADO et al., 2006).

2.4.4.4. Estresse oxidativo e lipoproteínas

Existem evidências significativas do envolvimento de EROs na patogênese da

aterosclerose. A modificação oxidativa de lipoproteínas de baixa densidade (LDL)

desempenha um papel fundamental na amplificação da resposta inflamatória, mediando uma

variedade de processos imunes pró-inflamatórios que determinam a progressão da

aterosclerose (MAGNUSSON et al., 1994; STEINBERG, 1997; SANTOS-SILVA et al.,

2001; LIU et al., 2004; LAUFS et al., 2005; KIECHL et al., 2007). As EROs contribuem

para o início e a progressão de lesões ateroscleróticas, ao favorecerem a infiltração e o

acúmulo de lipídios no espaço subendotelial. EROs produzidas por células musculares lisas,

27

endoteliais ou macrófagos podem modificar as LDLs que, quando oxidadas, promovem o

recrutamento de monócitos circulantes, o acúmulo de macrófagos residentes, a fagocitose

acelerada e finalmente a formação de “células espumosas” (constituídas por macrófagos ricos

em lipídeos) e estrias gordurosas, característicos das lesões iniciais (STEINBERG, 1997;

SANTOS-SILVA et al., 2001). Adicionalmente, estudos epidemiológicos sugerem que o

aumento da viscosidade do sangue também está relacionado à aterogênese e ao risco

cardiovascular (SANTOS-SILVA et al., 2001).

Neste contexto, exercícios físicos exaustivos e de alta intensidade podem favorecer a

aterosclerose e o risco cardiovascular (SCHNEIDER & OLIVEIRA, 2004), uma vez que têm

sido associados com o aumento do EO no endotélio vascular (LAUFS et al., 2005; PETIBOIS

& DÉLÉRIS, 2005) e com o aumento da viscosidade do sangue (SANTOS-SILVA et al.,

2001). Apesar de exercícios prolongados estarem associados com uma pequena redução

plasmática de triglicerídeos, que pode refletir o uso de LDL (lipoproteína rica em

triglicerídeos) como combustível ou ser atribuída à redução da secreção hepática dessas

lipoproteínas (Hardman, 1998), a inibição do sistema de defesa antioxidante dos eritrócitos

pelo estresse químico induzido por exercícios de intensidade elevada (lactacidêmico) pode

favorecer a oxidação de LDL e, consequentemente, a aterosclerose (SANTOS-SILVA et al.,

2001; PETIBOIS & DÉLÉRIS, 2005).

Por outro lado, evidências epidemiológicas indicam que a atividade física está

associada com risco reduzido de doença coronariana e mortalidade decorrente de problemas

cardiovasculares na meia idade (WANNAMETHEE & SHAPER, 2001). A atividade física

moderada melhora a função endotelial, a capacidade de exercício e a colateralização da

vascularização em pacientes com doença coronariana e previne a progressão da aterosclerose

da carótida. Entre outros efeitos benéficos, o treinamento físico favorece a redução do peso

(massa) corporal, melhora o humor, a pressão sanguínea e a sensibilidade à insulina

(WANNAMETHEE & SHAPER, 2001; LAUFS et al., 2005). A longo prazo, exercícios

moderados também favorecem o aumento da expressão (upregulation) das enzimas

antioxidantes com consequente redução do EO (LAUFS et al., 2005).

28

2.4.5. Estresse Oxidativo e DNA

Uma vez que o metabolismo celular normal está bem estabelecido como fonte

endógena de EROs e que estas espécies se relacionam com níveis basais de dano no DNA

detectados em tecidos normais (COOKE et al., 2003), o exercício exaustivo pode levar ao

EO, o qual pode ser evidenciado pela detecção de produtos da peroxidação lipídica, oxidação

de proteínas e de bases danificadas do DNA (MOLLER et al., 2001; MASTALOUDIS et al.,

2004). De fato, tem sido mostrado que o exercício exaustivo induz dano no DNA de

leucócitos circulantes (NIES et al., 1996; MASTALOUDIS et al., 2004; DEMIRBAG et al.,

2006) e que pode induzir apoptose através de mecanismos diferentes tais como redução

intracelular dos níveis de glutationa, alteração oxidativas à proteínas mitocondriais ou

danificando diretamente o DNA (MOOREN et al., 2002). Por outro lado, tem sido observado

que a extensão dos danos ao DNA de indivíduos treinados é pequena se comparada à de

indivíduos não-treinados, sugerindo que a adaptação ao treinamento de resistência aeróbica

pode reduzir os efeitos do estresse oxidativo, como danos ao DNA (NIES et al., 1996;

MASTALOUDIS et al., 2004; SCHNEIDER & OLIVEIRA, 2004). Neste contexto, além da

técnica de quantificação de oxo8dG para avaliar danos oxidativos indiretos a ácidos nucléicos,

o teste do cometa passou a ser bastante utilizado para determinar danos oxidativos a DNA

induzidos pelo exercício de forma direta e mais precisa (MASTALOUDIS et al., 2004), uma

vez que detecta quebras de fita simples e de fita dupla, sitios alcali-lábeis, sítios incompletos

de reparo, ligação cruzada de DNA-DNA e de DNA-proteína em células individuais

(MASTALOUDIS et al., 2004; BRENDLER-SCHWAAB et al., 2005).

Em contrapartida, frente a tudo que foi exposto, novas pesquisas vêm propondo,

como forma alternativa, a suplementação de antioxidante na atenuação do estresse oxidativo

induzido pelo exercício (ANDRADE et al., 1998; MCBRIDE et al., 1998; MCBRIDE &

KRAEMER, 1999; REID et al., 1994).

2.5 Exercício Físico, Estresse Oxidativo e Suplementação Antioxidante

Segundo Alessio (1993), Smolka et al. (2000) e Ji (2002), a ação das EROs sobre o

sistema enzimático antioxidante tem relação direta com seu nível de produção. Estudos

mostraram que indivíduos treinados podem apresentar níveis mais elevados de enzimas

antioxidantes, e por isso, demonstrarem uma maior resistência ao EO gerado pelo exercício

29

(SEN, 1995; RADÁK et al., 1999; SMOLKA et al., 2000; JI, 2002). Em contrapartida, outros

autores mostraram que sob situação de exercício de alta intensidade há um efeito inibitório na

atividade de diversas enzimas antioxidantes e, como consequência, aumento de ataque

oxidativo celular (DAVIES et al., 1982; SJÖDIN et al., 1990; JI, FU & MITCHELL, 1992;

SMOLKA et al., 2000).

Paralelamente, alguns autores sugerem que a suplementação ou o consumo diário de

antioxidantes naturais como vitamina E (α-tocoferol), vitamina C, e composto polifenólicos

podem atenuar o estresse oxidativo induzido pelo exercício (SIGNORINI & SIGNORINI,

1995; BACURAU, 2000; SCHNEIDER & OLIVEIRA, 2004).

Conforme Goldfarb et al. (1994) um consumo médio diário de 200 mg de vitamina E

pode ser suficiente para prevenir os danos oxidativos causados pelo exercício e, com isso,

aumentar os benefícios proporcionados pelo exercício físico. Em estudos, os mesmos autores

observaram menores concentrações de hidroperóxidos lipídicos e TBARS no plasma e fibras

musculares de ratos submetidos a exercício intenso suplementados por cinco semanas com

vitamina E (250 UI Vit.E/kg). Metin et al. (2002) também verificaram a redução na

concentração de TBARs em ratos suplementados com vitamina E (30 mg/kg/ dia) e treinados

com natação. Rokitzki et al.(1994) relataram que ciclistas ingerindo 300 mg de vitamina E/dia

durante 20 semanas apresentaram menor concentração de MDA após exercício extenuante,

quando comparados ao grupo controle.

Em estudo mais recente, Goldfarb et al. (2005) ministraram doses de 500 ou 1.000

mg de vitamina C/dia a voluntários durante duas semanas e, ao final do período, foi realizada

uma corrida de 30 minutos a 75% do VO2máx. Após o exercício, o grupo suplementado

apresentou menor quantidade de proteínas carboniladas em relação ao grupo controle;

entretanto, não houve influência da suplementação nas concentrações de TBARS. A vitamina

C é hidrossolúvel e está presente em maior concentração no meio aquoso, por isso torna-se

menos eficiente em neutralizar radicais lipofílicos gerados na membrana lipídica (CRUZAT et

al., 2007).

Em mesma linha de estudo, pesquisas recentes sugerem que o consumo de

constituintes fitoquímicos, a exemplo dos compostos fenólicos, presentes em alimentos e chás

de ervas pode atenuar o estresse oxidativo induzido pelo exercício físico e reduzir os riscos de

desenvolvimento de patologias associadas ao EO como o câncer e as doenças

cardiovasculares (HERTOG et al., 1993; ALESSIO et al., 2002; McKAY et al., 2002;

MANACH et al., 2004; McANULTY et al., 2004; MORILLAS-RUIZ et al., 2005; PANZA

et al., 2008).

30

Estudos in vitro têm demonstrado que os flavonóides são potentes neutralizadores de

diversas espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio (VAN ACKER, 1996; BIXBY et al.,

2005; ODONTUYA et al., 2005). Além disso, os flavonóides podem interferir na ação

oxidante de metais de transição (VAN ACKER, 1996). A inibição da peroxidação de lipídeos

promovida por flavonóides parece estar relacionada à doação de hidrogênio as espécies

radicalares durante a fase de propagação, bem como, a quelação de metais de transição e ao

efeito preservativo da vitamina E e do β-caroteno no organismo (SALAH et al., 1995; RICE-

EVANS et al., 1996; LOTITO & FRAGA, 2000).

Erba et al. (2005) sugerem que o consumo de chás de produtos naturais ricos em

polifenóis melhora o estado antioxidante geral do organismo e protege contra danos

oxidativos em seres humanos. Neste sentido, a Passiflora cincinnata Mast, conhecida

popularmente como maracujá-do-mato, poderá ser uma excelente ferramenta no controle e

atenuação do estresse oxidativo induzido pelo exercício físico, haja vista que é consenso na

literatura que espécies do gênero Passiflora apresentam atividade antioxidante in vitro e in

vivo por serem rica em compostos fenólicos (DHAWAN et al., 2004; RUDNICKI et al.,

2007).

2.6 Passiflora cincinnata Mast

A Passiflora cincinnata Mast pertence à família Passifloraceae, cujo gênero é

originário da America do Sul, conhecido popularmente como maracujá, possuindo mais de

650 espécies e 16 gêneros distribuídos nas regiões tropicais e semitropicais da América,

África tropical e, principalmente, centro-norte do Brasil (VANDERPLANK, 1996; POZZI,

2007). As espécies mais comuns são a P. incarnata, P. alata e P. edulis, as quais apresentam

efeitos ansiolíticos e sedativos confirmados na literatura, além de valor comercial elevado

(DHAWAN et al., 2004).

O nome Passiflora provém do latim passio, passiones: flor da paixão. Já o termo

maracujá é de origem tupi guarani (muruku’ia: comida feita em cuia, uma alusão ao fruto

édulos do vegetal). As suas flores são vistas como as mais belas da flora mundial. É citado na

literatura seu uso contra ansiedade, enxaqueca, insônia e inflamações (CAPASSO & PINTO,

1995; DHAWAN, KUMAR & SHARMA, 2004).

No Brasil, há aproximadamente 130 espécies de plantas nativas do gênero Passiflora,

das quais a P. cincinnata Mast. faz parte (KILLIP, 1938; OLIVEIRA & RUGGIERO, 2005).

31

No entanto, apenas duas delas são largamente comercializadas: P. edulis, usada comumente

para fazer suco, e P. alata, conhecida como “maracujá doce”, sendo esta última a espécie

oficial da Farmacopéia brasileira (I, II e III), a qual possui efeito ansiolítico e depressor do

sistema nervoso central (OGA et al., 1984; PETRY et al., 2001; DE PARIS et al., 2002;

PEREIRA & VILEGAS, 2000).

As folhas do maracujá passaram a ser utilizadas pela medicina clássica em 1867,

sendo empregadas por sua ação calmante em casos de insônia e irritabilidade (FREITAS,

1985). No entanto, para o gênero Passiflora também é reportada ação hipotensora,

antiinflamatória, antiespasmódica, antimicrobiana, antidiabética e antioxidante (MULLER et

al., 2005; EDWIN et al., 2007).

Embora diversos experimentos in vivo tenham sido realizados a fim de precisar o

constituinte farmacológico ativo da Passiflora, não foi possível atribuir todos os seus efeitos a

uma única classe de compostos ou espécie, mas sim a provável ação conjunta de alcalóides e

flavonóides (POZZI, 2007). Conforme Miller et al. (2005), as folhas do gênero Passiflora são

ricas em compostos fenólicos como taninos e flavonóides, principalmente, os flavonóides C-

glicosílados derivados de apigenina e luteolina (vitexina, isovitexina, orientina, isoorientina).

Além de alcalóides, glicosídeos e terpenos (PEREIRA & VILLEGAS, 2000; DHAWAN et

al., 2004).

Quanto a P. cincinnata Mast., esta é nativa de regiões semi-áridas, e é bastante

utilizada pela medicina popular, principalmente, no nordeste brasileiro, nos Estados da

Alagoas, Bahia, Pernambuco e Sergipe (OLIVEIRA & RUGGIERO, 2005), a qual, também,

está passando a ganhar destaque comercial através da utilização de seu fruto no preparo de

geléias, doces e sucos (FEITOZA et al., 2006). Contudo, há uma deficiência muito grande de

estudos para esta espécie, principalmente, quanto as suas propriedades farmacológicas e

medicinais. Apenas David et al., (2007) verificaram o efeito antioxidante da mesma, a qual

apresentou boa atividade seqüestradora para o radical livre DPPH (CE50 22,3 ± 3,5 µg.mL-1

DPPH) em relação a outras espécies do gênero como a P. coerulea L. (245,84 µg.mL-1

DPPH) e P. edulis (113,41 µg mL-1 DPPH) (VICENTINO & MENESES, 2007; JORGE,

2009).

Neste sentido, apesar das propriedades medicinais do maracujá serem reconhecidas

mundialmente, ainda são precárias as informações científicas sobre algumas espécies. Pouco

se sabe, ainda, a respeito da composição química, princípios ativos e efeitos sobre a saúde de

várias espécies do gênero usadas como medicinais, como exemplo, a P.cincinnata.

32

Não obstante, sabemos que a progressiva destruição da flora brasileira representa

grande ameaça a estas espécies nativas, que se quer são conhecidas ou avaliadas em todo seu

potencial biológico, medicinal e químico. Por disso, torna-se urgente o estudo das plantas

conhecidas popularmente como medicinais e utilizadas empiricamente na medicina popular.

Haja vista que, a comprovação científica do efeito benéfico à saúde do consumo destes

produtos, abrirá um grande leque para novos estudos quanto à descoberta de novos

fitoquímicos e medicamentos para prevenção e terapia das diversas doenças associadas às

ações oxi-redotoras dos RL. Bem como, poderá servir como uma nova opção de renda para

pequenos agricultores do semi-árido nordestino, tanto na comercialização de chás, na forma

de saquês, quanto na fabricação de doces e geléias, bem como, na comercialização do vegetal

como matéria prima à indústria farmacêutica para formulação de medicamento. Sendo assim,

tanto a população em geral será beneficiada, direta e indiretamente, quanto à natureza, a qual

terá seu espaço verde aumentando, e a comunidade científica que estará justificando sua

função social, econômica, ambiental e científica perante a sociedade.

33

3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Avaliar a atividade antioxidante e redox-protetora do extrato e frações das folhas de

P. cincinnata Mast. sobre o estresse oxidativo induzido pelo exercício físico em ratos.

3.2 Específicos

� Identificar os grupos fitoquímicos presentes no extrato bruto das folhas P. cincinnata

Mast.;

� Determinar o conteúdo fenólico no extrato e frações das folhas P. cincinnata Mast.;

� Avaliar a atividade seqüestradora dos radicais 2,2-difenil-1-picrilhidrazina (DPPH•) e

2,2'-azinobis-3-etilbenzotiazolino-6-sulfonato (ABTS●+) do extrato e frações das

folhas P. cincinnata Mast.;

� Avaliar a atividade redox-protetora sobre a lipoperoxidação induzida por dihidrocloreto

de 2,2’azobis-2-amidopropano (AAPH); sulfato ferroso (FeSO4) e peróxido de

hidrogênio (H2O2);

� Avaliar a atividade redox-protetora em órgãos e tecidos de ratos após administração

aguda de P. cincinnat Mast;

� Avaliar a atividade redox-protetora da P. cincinnat Mast em órgãos e tecidos de ratos

após dois meses de treinamento físico de alta intensidade;

34

4. METODOLOGIA

4.1 Coleta e Identificação do Material Vegetal

Folhas de P. cincinnata Mast foram coletadas pela manhã, em março de 2008, na

cidade de Moita Bonita, agreste sergipano, Brasil, e levadas para a Universidade Federal de

Sergipe (UFS). Um voucher da espécie foi depositado no Herbário da instituição sob número

ASE 11.112. A identificação Botânica foi realizada pela Drª. Ana Paula do Nascimento Prata

do departamento de Biologia da UFS. As amostras foram submetidas à secagem em estufa

(MARCONI, modelo 037/18) com renovação e circulação de ar a temperatura constante de 40

°C até completa desidratação.

4.2 Preparação e Fracionamento do Extrato Etanólico Bruto

As folhas secas foram reduzidas a pó (293,3 g) utilizando moinho de facas, e em

seguida, submetidas à extração com etanol a 95% durante 5 dias, por maceração exaustiva.

Após este período, o material foi filtrado e concentrado em rota-evaporador sob pressão

reduzida (BUCHI, modelo/461) a uma temperatura de 55 ºC, obtendo-se 103,3 g de extrato

etanólico das folhas de “maracujá-do-mato” (ExEt), rendimento de 35,22%. Parte do ExEt (50

g) foi diluído em uma solução metanol/água (2:3) e submetido à extração líquido-líquido com

clorofórmio e acetato de etila. Obtendo, assim, as frações clorofórmica (FCl), acetato de etila

(FActE) e hidrometanólica (HMoH).

Para melhor delineamento experimental do nosso estudo, conduzimos os

experimentos em duas etapas. A primeira consistindo em ensaios químicos, que buscaram

identificar os constituintes fitoquímicos presentes no extrato e quantificar aqueles que,

segundo a literatura, apresentaram potencial antioxidante. O extrato e/ou frações que

apresentaram maiores quantidades desses constituintes foram testados em ensaios biológicos.

35

4.3 Ensaios Químicos

4.3.1 Triagem fitoquímica

O extrato etanólico foi submetido à prospecção fitoquímica, seguindo metodologia

descrita por Matos (1998). O objetivo foi detectar a ocorrência de diversas classes de

constituintes e, principalmente, as que apresentam atividade antioxidante, conforme a

literatura. Para tanto, sete porções de 3-4 mL do extrato foi dissolvido em etanol e foram

colocados em tubos de ensaio enumerados de 1 a 7. Todos os testes foram realizados em

triplicata.

4.3.1.1 Teste para fenóis e taninos

No tubo de número 1, foram adicionadas três gotas de solução alcoólica de FeCl3 1

mol.L-1 em HCl 60 mmol.L-1. Após agitação, foram observadas quaisquer variações de cor

e/ou formação de precipitado escuro abundante. O resultado foi comparado com um branco,

usando-se água e FeCl3.

A variação da coloração entre azul e vermelho foi indicativa de fenóis. A formação

de um precipitado azul escuro indicou à presença de taninos pirogálicos (taninos

hidrolisáveis) e de cor verde a presença de taninos flobabênicos (taninos condensados ou

catéquicos).

4.3.1.2 Teste para antocianinas, antocianidinas e flavonóides

A porção do extrato nos tubos de número 2 foram acidificadas a pH 3 com HCl 3

mol L-1, enquanto as porções nos tubos 3 e 4 foram alcalinizadas a pH 8,5 e 11 com NaOH 1

mol L-1. As mudanças de coloração foram interpretadas conforme descrito na tabela 2.

4.3.1.3 Teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavononas

A porção do extrato no tubos de número 5 foram acidificadas a pH 3 por adição de

HCl 3 mol.L-1, enquanto o material no tubos 6 foram alcalinizadas a pH 11 com NaOH 1

36

mol.L-1. Os tubos foram aquecidos cuidadosamente, sendo observada qualquer modificação

na coloração por comparação com os tubos correspondentes usados no teste anterior. A

interpretação dos resultados foi feita como mostrado tabela 3.

Tabela 2. Detecção colorimétrica de antocianinas, antocianidinas e flavonóides.

Constituintes Cor

Ácido Ph=3 Alcalino pH=8,5 Alcalino pH=11

Antocianinas e antocianidinas Vermelha Lilás Azul-púrpura

Flavonas, flavonóis e xantonas - - Amarela

Chalconas e auronas Vermelha - Vermelho Púrpuro

Flavononóis - - Vermelho Laranja

Tabela 3. Detecção colorimétrica de leucoantocianidinas, catequinas e flavononas.

Constituintes

Cor

Meio Ácido Meio Alcalino

Leucoantocianidinas Vermelha -

Catequinas (taninos catéquicos) Pardo-amarelada -

Flavononas - Vermelho Laranja

4.3.1.4 Teste para flavonóis, flavononas, flavononóis e xantonas

Nos tubos de número 7 foram adicionados 10 mg de magnésio granulado e 0,5 mL

de HCl concentrado. O término da reação foi indicado pelo fim da efervescência. Os

resultados foram observados por comparação a mudança na cor da mistura da reação nos

tubos 5 e 7. O aparecimento ou intensificação da cor vermelha foi indicativo da presença de

flavonóis, flavanonas, flavanonóis e/ou xantonas, livres ou seus heterosídios.

4.3.1.5 Teste para esteróides e triterpenóides (Liebermann-Buchard)

10 mL do extrato foi adicionado a um becker e deixado secar em banho-maria.

O resíduo seco de cada becker foi extraído três vezes com porções de 1-2 mL de CHCl3.

37

Sendo os extratos colocados em tubos diferentes e colocaram-se algumas gotas de CHCl3. A

solução clorofórmica foi filtrada em um pequeno funil fechado com algodão, coberta com

Na2SO4 anidro, para um tubo de ensaio bem seco. Adicionou-se 1 mL de anidrido acético e

agitou-se suavemente. Adicionaram-se cuidadosamente três gotas de H2SO4 concentrado.

Agitou-se suavemente e observou-se o rápido desenvolvimento de cores. A coloração azul

seguida da verde permanente é um indicativo da presença de esteróides livres. Coloração

parda até vermelha indica triterpenóides pentacíclicos livres.

4.3.1.6 Teste para saponinas

Os resíduos insolúveis em clorofórmio, separados no teste anterior, foram

solubilizou-se em água destilada e filtrado para um tubo de ensaio. O tubo com a solução foi

então fortemente agitado por dois a três minutos e observou a formação da espuma. O

aparecimento de espuma persistente e abundante indica a presença de saponinas.

Para confirmar a presença de saponinas, 2 mL de HCl concentrado foram

adicionados ao conteúdo do tubo de ensaio, que foi deixando por uma hora imerso em banho-

maria. Após período de imersão, o material no tubo foi neutralizando, resfriado e novamente

agitado. A presença de precipitado e a não formação de espuma confirmou a presença de

saponina.

4.3.1.7 Teste para alcalóides

O extrato após ser dissolvido em etanol foi filtrado e posto em um erlermayer. Ao

filtrado foi adicionado uma solução de NH4OH 6 N até atingir pH 11. Posteriormente, para a

extração de bases orgânicas do filtrado foram adicionados três porções sucessivas de 30, 20 e

10 mL de clorofórmio. Utilizando um funil de separação com Na2SO4 anidro a fase aquosa foi

separada para o teste de bases quaternárias, obtendo assim duas soluções, uma delas foi posta

para secar sendo utilizada para o teste em cromatoplaca e a outra adicionada três porções

sucessivas de HCl diluído a 0,1 N para extração das bases orgânicas, a qual foi colocada em

três tubos de ensaios. Nestes foram adicionados, distintamente, três gotas dos reagentes de

precipitação de alcalóides, “Hager”, ”Mayer” e “Dragendorff”. A presença de precipitado

floculoso, pesado em pelo menos dois tubos sugeriu a presença de alcalóides.

38

4.3.2 Quantificação de fenóis totais (FT)

A quantificação espectrofotométrica de compostos fenólicos foi realizada através do

método de Folin-Ciocalteau (SOUSA at al., 2007). ExEt e FActE (10 mg) foram dissolvidos

em metanol, sendo transferidas quantitativamente para um balão volumétrico de 10 mL e o

volume completado com metanol para dar uma solução de concentração final 1 mg.mL-1.

Alíquotas de 0,1 mL desta solução foram transferidas para tubos Falcon e agitadas em

presença de 0,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteau e 6 mL de água destilada por 1 min.

Passado este tempo, 2 mL de Na2CO3 a 20% foram adicionados à mistura e foi então agitada

por 30 s. Por fim, a solução foi acertada com água destilada para um volume final de 10 mL e

deixada por 2 h em ambiente livre de luz. Após este período de repouso, as absorbâncias das

amostras foram medidas a 750 nm utilizando-se cubetas de vidro, tendo como “branco” o

metanol e todos os reagentes, menos o extrato ou frações. O teor de FT foi determinado por

interpolação da média de absorbância de três leituras da amostra contra uma curva de

calibração construída com padrões de ácido gálico (10 a 350 µg.mL-1) e expresso como mg de

equivalentes de ácido gálico (EAG) por g de extrato. A equação da curva de calibração do

ácido gálico foi C = 809,0200A + 5,0827, onde C é a concentração do ácido gálico, A é a

absorbância a 750 nm e o coeficiente de correlação R = 0,999. Todas as análises foram

realizadas em triplicata.

4.3.3 Avaliação da atividade antioxidante (AA)

A avaliação da AA do extrato e fração da P. cincinnata Mast que apresentaram maior

conteúdo fenólico foram realizadas através da capacidade sequetradora dos radicais DPPH• e

ABTS•+.

4.3.3.1 Capacidade seqüestradora do radical DPPH•

A capacidade de sequestrar o radical DPPH• foi determinada conforme metodologia

descrita por Soler-Rivas et al. (2000) e Argolo et al. (2004). Uma alíquota de 50 mL de

solução estoque de DPPH• em metanol na concentração de 40 µg.mL-1 foi preparada e

mantida sob refrigeração e protegida da luz. Em seguida, diluições para dar as concentrações

39

finais de 30, 25, 20, 15, 10, 5 µg.mL-1 da solução estoque de DPPH• foram preparadas. A

curva de calibração foi construída a partir dos valores da absorbância a 515 nm de todas as

soluções medidas em cubetas de vidro com percurso óptico de 1 cm, tendo como “branco” o

metanol. As medidas de absorbância foram efetuadas em triplicata e nos tempo de 1, 5, 10 20,

30, 40, 50 e 60 min. A Equação da curva de calibração do DPPH• foi C = 35,846A – 0,230,

onde C corresponde à concentração de DPPH• no meio, A é a absorbância medida no

comprimento de onda a 515 nm e o coeficiente de correlação R = 0,9997.

Igualmente, soluções do extrato e da fração de passiflora (500 µg.mL-1), bem como

do controle positivo (ácido gálico) em metanol foram diluídas para dar concentrações finais

de 30, 25, 20, 15, 10 e 5 µg.mL-1. As medidas das absorbâncias das misturas reacionais (0,3

mL da amostra ou do controle positivo e 2,7 mL de DPPH•) foram realizadas a 515 nm nos

mesmos tempos da curva de calibração do DPPH•. Misturas de metanol (2,7 mL) e solução

metanólica do extrato (0,3 mL) foram utilizadas como branco.

A partir da equação da curva de calibração e dos valores de absorbância para cada

concentração testada, foram determinados os percentuais de DPPH• remanescentes

(%DPPH•REM), conforme a equação:

%DPPH•REM = [DPPH•]T=t ÷ [DPPH•]T=0 x 100

Onde, [DPPH•]T=t corresponde à concentração de DPPH• no meio, após a reação com

o extrato e [DPPH•]T=0 é a concentração inicial de DPPH•.

Os valores de absorbância em todas as concentrações testadas foram convertidos em

porcentagem de inibição (IP).

A concentração eficiente, quantidade de antioxidante necessária para decrescer a

concentração inicial de DPPH• em 50% (CE50), foi determinada usando o programa Microcal

Origin 7.5, a partir de uma curva exponencial de primeira ordem, obtida plotando no eixos das

abscissa as concentrações da amostra (µg.mL-1) ou do controle positivo e no eixo das

ordenadas, a porcentagem de DPPH• remanescente (% DPPH•REM).

AA foi determinada através do índice de atividade antioxidante (IAA) conforme

Scherer e Godoy (2009) e calculada através da equação abaixo.

IAA = %DPPH• REM (µg.mL-1) ÷ CE50 (µg.mL-1)

40

A atividade antioxidante foi considerada insatisfatória quando o valor do IAA for

inferior a 0,5, moderada quando o IAA estiver entre 0,5 e 1,0, forte quando o IAA estiver

entre 1,0 e 2,0, e muito forte quando o valor do IAA for superior a 2,0.

4.3.3.2 Capacidade seqüestradora do radical ABTS•+

A capacidade de sequestrar o radical ABTS•+ foi avaliada seguindo metodologia

descrita Re et al. (1999). O radical livre ABTS•+ se obtém mediante a reação de ABTS com

persulfeto de potássio.

Soluções estoque de ABTS (7 mM) com persulfeto de potássio (2,45 mM) foram

utilizadas para gerar o radical ABTS•+ por misturas em partes iguais, sendo a mesma

armazenada a temperatura de ±20 ºC num prazo de 12 h ao abrigo da luz. Formado o radical

ABTS•+, este foi diluído misturando 1 mL da solução ABTS•+ com metanol (~35 mL) até a

obtenção de um valor de absorbância de 0,700 (±0,03) unidades a 734 nm, usando o

espectrofotômetro.

Soluções do extrato e fração de Passiflora (500 µg/mL) e do controle positivo (ácido

gálico e hidroxitolueno butilato - BHT) em metanol foram diluídas nas concentrações de 30,

25, 20, 15, 10 e 5 µg.mL-1 . As medidas das absorbâncias das misturas reacionais (0,3 mL das

amostras ou controles positivo e 2,7 mL de ABTS•+) foram realizadas a 734 nm (±25 ºC) no

tempo de 5 minutos. Misturas de metanol (2,7 mL) e solução metanólica do extrato ou fração

(0,3 mL) foram utilizadas como branco.

Os resultados da AA estarão expressos em IAA, calculados como descrito no item

4.3.3.1.

4.3.4 Avaliação da atividade redox (in vitro)

A capacidade do extrato para inibir a lipoperoxidação foi determinada através do

monitoramento da produção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs) em meio

rico em lipídio conforme protocolo descrito por Silva et al. (2007). Para a quantificação de

TBARs foi realizada protocolo de Lapenna et al. (2001).

Em síntese, 1,0 mL de homogenato de gema de ovo (1% m/v) em tampão fosfato 20

mM (pH 7,4), foi sonicado (10 s na potência 4) e, em seguida, homogeneizado com 0,1 mL do

ExEt e controles positivos em diferentes concentrações (5, 50 e 100 µg.mL-1) preparadas

41

imediatamente antes do experimento com metanol. A peroxidação lipídica foi induzida pela

adição de 0,1 mL de solução de AAPH (0,17 M), FeSO4 (0,17 M) e H2O2 (0,4 M) em

momentos distintos. Trolox e ácido gálico foram usados como moléculas antioxidantes de

referência (controle positivo); o controle negativo foi apenas extrato e veículo (água ou

metanol). As reações foram realizadas por 30 min a 37 ºC. Após o resfriamento, as amostras

(0,5 mL) foram centrifugadas com 0,5 mL de ácido tricloroacético (15%) a 1200 g por 10

min. Uma alíquota de 0,5 mL do sobrenadante foi misturada com 0,5 mL de TBA (0,67%) e

aquecida a 95 °C por 60 min. Após o resfriamento, as absorvâncias foram medidas usando

espectrofotômetro a 532 nm. O coeficiente de extinção molar de 1,54 x 10-5 M-1.cm-1 foi

usado no presente estudo e o resultado foi expresso em equivalentes de malondialdeído (Eq

MDA).mL -1 de substrato.

.

4.4 Ensaios Biológicos

4.4.1 Animais

Foram utilizados 40 ratos machos da linhagem Wistar com 3 meses de idade (250-

300 g) obtidos do biotério central da UFS. Os mesmos foram aleatoriamente alojados em

gaiolas apropriadas sob temperatura controlada (22 ± 3 ºC) com ciclo claro escuro de 12 horas

(luzes acesas, 06h00 – 18h00), com livre acesso à alimentação específica para roedores e água

de torneira. Todos os procedimentos descritos no presente trabalho foram aprovados pelo

Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFS (protocolo 58/09).

4.4.2 Delineamento experimental

Os ensaios biológicos foram conduzidos em duas etapas. A primeira teve por

objetivo avaliar a capacidade redox-protetora do ExEt das folhas da P. cincinnata Mast em

condições de tratamento agudo, após uma única administração de 200 mg.Kg-1 do ExEt

(previamente selecionado, após estudo piloto realizado em nosso laboratório, quanto a

redução da lipoperóxidação sanguínea de ratos que ingeriram distintamente 50, 100 e 200

mg.kg-1 do ExEt), sobre parâmetros de estresse oxidativo em ratos sob condições fisiológicas

42

basais. Para tanto, os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos (n=8), GC

(salina, vo) e GP (Passiflora 200 mg.Kg-1, vo), após uma hora à administração do extrato, os

animais foram anestesiados com tiopental sódico (45 mg.Kg-1, ip), e o sangue (5 mL) coletado

por punção cardíaca com seringas heparinizadas. Paralelamente, os órgãos também foram

removidos (fígado e coração) para posteriores análises dos marcadores de estresse oxidativo.

Na segunda etapa dos experimentos, foi avaliada a capacidade redox-protetora do

ExEt das folhas de P. cincinnata Mast em condições de tratamento crônico, consumo diário

de 200 mg.Kg-1 do extrato ao final de 8 semanas, quanto aos parâmetros de estresse oxidativo

induzido por protocolo de exercício físico de alta intensidade. Para tanto, quatro grupos foram

divididos aleatoriamente (n=6): GC (Salina, vo), GP (Extrato, vo), GT (Exercício aeróbico) e

GPT (Extrato (vo) + Exercício aeróbico). Em seguida, foram tratados com 200 mg.kg-1 do

ExEt das folhas de P. cincinnata (GP e GPT) durante 8 semanas, uma vez por dia, 5 vezes por

semana. Paralelamente, os animais (GT e GPT) realizaram exercício físico como descrito por

Smolka et al. (2000) na tabela 4. Ao final do período de treinamento, um dia após a ultima

sessão para evitar o efeito agudo do exercício, os animais foram anestesiados com tiopental

sódico (45 mg.kg-1 de peso, ip) e o sangue coletado (5 mL) por punção cardíaca com seringas

heparinizadas. Paralelamente, urina e órgãos (fígado e coração), também, foram removidos

para análise dos marcadores de estresse oxidativo.

Tabela 4: Protocolo de exercício físico para indução de estresse oxidativo.

Semana Velocidade (m.min-1) Duração (min)

1ª 15 20

2ª 20 30

3ª 22,5 45

4ª 25 60

5ª – 8ª 25 60 *Os animais exercitaram 5 dias por semana.

4.4.3 Preparo do material biológico

Os procedimentos para o preparo do material biológico foram realizados segundo

metodologia descrita por Sant´Anna (2005). O sangue, após a coleta, foi imediatamente

centrifugado a 800 × g por 15 minutos a ± 4º C e o sobrenadante armazenado a ± -70º C.

Paralelamente, os órgãos removidos (fígado e coração) foram lavados por 3x em solução de

43

cloreto de potássio (KCl) 1,15%, secos e pesados. Em seguida, homogeneizados onde cada

grama de tecido foi misturada com 5 mL de KCl + 10 µL de Fluoreto de Fenilmetilsulfonila

(PMSF - 100 m.mol-1) + 15 µL de solução Triton a 10%, centrifugada 3000 x g por 10

minutos a ± 4°C e o sobrenadante armazenando a ± -70º C para análises posterior dos

marcadores de estresse oxidativo.

A urina dos animais, coletada após o período de treinamento, recebeu 100 µL de

EDTA e foi armazenada a ± -70º C para análise posterior dos marcadores de estresse

oxidativo.

4.4.4 Determinação de lipoperoxidação

A oxidação de lipídios foi determinada pela medida de substâncias reativas ao ácido

tiobarbitúrico (TBARS) de acordo com método descrito por Lapenna et al. (2001). Alíquotas

de 200 µL das amostras (sangue, urina e órgãos) foram adicionadas a uma mistura formada

por partes iguais de ácido tricloroacético (TCA) 15%, HCl 0,25 N e TBA 0,375%, mais 2,5

mM de hidroxitolueno butilado (BHT), e 40 µL de dodecil de sódio (SDS) a 8,1%, sendo

aquecida por 30 mim à 95ºC em estufa. O pH da mistura foi ajustado para 0,9 com HCl. O

BHT foi usado para prevenir a peroxidação lipídica durante o aquecimento. Em seguida, após

resfriamento à temperatura ambiente e adição de 4 mL de n-butanol, o material foi

centrifugado a 800xg por 15 minutos a ± 4º C e a absorbância do sobrenadante foi medida a

532 nm. O coeficiente de extinção molar utilizado foi 1,54 x 105 M-1 cm-1 e o resultado de

TBARS expresso em nmol Eq MDA.mL-1 de plasma para as amostras de sangue, em nmol Eq

MDA.mL-1 de urina para as amostras de urina ou em nmol Eq MDA.mL-1 soro para os

órgãos.

4.4.5 Determinação de proteína carbonilada

A oxidação de proteínas foi avaliada através da determinação de grupos carbonil de

acordo com a metodologia descrita por Faure & Lafond (1995). Alíquotas de 200 µL das

amostras (fígado e coração) foram misturadas a 800 µL de DNPH (dinitrofenilhidrazina) e

incubadas por uma hora a ± 37 ºC, no escuro, sendo agitado a cada 15 minutos. Em seguida,

1000 µL de TCA 15% foram adicionados às amostras, as quais foram centrifugadas a 1000 x

g por 10 minutos a ± 4º C. Após esse tempo, acrescentou-se ao precipitado 800 µL de TCA

44

15% e agitou-se. O precipitado foi lavado 3x com 800 µL de etanol/acetato de etila (1:1) para

remover o DNPH livre e lipídios contaminantes. O precipitado final foi dissolvido em 400 µL

de Guanidina 6M e incubado por 10 minutos a ± 37°C. O material insolúvel foi removido por

centrifugação adicional a 1000 x g por 5 minutos a ± 4 ºC. O sobrenadante foi recolhido e a

absorbância foi determinada espectrofotometricamente a 380 nm. O coeficiente de extinção

molar utilizado foi de 22 mM-1 cm-1 e o resultado expresso em nmol.mg-1 de tecido.

4.4.6 Determinação de sulfidrilas totais (tióis)

Os grupos sulfidrilas (SH) são estruturas associadas a proteínas e, portanto,

susceptíveis a danos oxidativos. Sua quantificação revela o nível antioxidante do tecido. A

determinação dos grupos sulfidrilas foi realizada conforme metodologia descrita por Faure &

Lafond (1995). Alíquotas de 50 µL de amostra de fígado e/ou coração foram misturadas em 1

mL de tampão Tris-EDTA, pH 8,2. Em seguida, foi realizada a primeira leitura (A) no

espectrofotômetro a 412 nm. Após a leitura, as amostras foram transferidas para tubos de

ensaio e misturadas a 20 µL de DTNB 10 mM diluído em metanol (4 mg.mL-1), ficando em

repouso no escuro. Ao final de 15 minutos, a segunda leitura de absorbância (A2) foi

realizada. A concentração de SH foi calculada conforme equação: (A2 - A1) – B x 1,57 mM x

1000. O resultado expresso em nmol.mg-1 tecido.

4.5 Análise Estatística

Os dados obtidos foram expressos em média ± EPM. Para observar a normalidade

dos dados foi utilizado o teste Shapiro-Wilk através do pacote estatístico XLSTAT-Pro. Para

avaliar a significância das diferenças entre as médias foram utilizados os testes t de Student e

a análise de variância de uma via ou duas vias seguido do pós-teste de Bonferroni ou Tukey,

quando apropriado. Os valores foram considerados estatisticamente significativos quando p <

0,05. Para todos estes procedimentos foi utilizado o programa estatístico GraphPad Prism

versão 5.0 (GraphPad Software, San Diego,CA, E.U.A.). Todos os experimentos avaliados

foram realizados em triplicata.

45

5. RESULTADOS

5.1 Triagem Fitoquímica

A análise fitoquímica do extrato etanólico bruto das folhas de P. cincinnata Mast

mostrou a presença de compostos fenólicos, taninos flababênicos, flavonóides, catequinas,

esteróides, alcalóides e heterosídeos saponínicos.

5.2 Fenóis Totais

No presente estudo, quantificamos altos teores de compostos fenólicos para o extrato

etanólico bruto da P. cincinnata e moderados valores para as frações (Figura 5). O ExEt teve

quantidade fenólica significaticamente (p < 0,05) superior as frações, sendo na ordem de 3x

mais elevado que a fração acetato de etila, 6x que a fração hidrometanólica e 8x que a fração

clorofórmica.

0

100

200

300

400

500Extrato Etanólico

Fração Clórofórmica

Fração Acetato de Etila

Fração Hidrometanólica

a

b,c,d

c,b,d

d,b,c

FT

(mg

EAG

.g-1

da

am

ostr

a)

Figura 5. Determinação quantitativa do teor de fenóis totais do extrato etanólico e frações das folhas de P. cincinnata Mast. Valores com letras diferentes indicam médias com diferença significativa (p < 0,05). As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Tukey.

46

5.3 Atividade Antioxidante (in vitro)

5.3.1 Atividade sequestradora do radical DPPH•

As amostras que apresentaram os maiores teores de FT (ExEt e FActE) foram

utilizadas para a quantificação da atividade seqüestradora do radical DPPH•. Foi constatado

maior percentual de inibição (IP) ao radical DPPH• pelo ExEt em comparação a FActE (p <

0,05), sendo seu valor similar aos controles BHT e AG (p > 0,05). Da mesma forma, quando

foi constatado o consumo do ExtE para reduzir o radical em 50% (CE50), ele foi menor e,

portanto, melhor que a FActE e o controle BHT (p < 0,05), apresentando resposta similar ao

controle AG ( p > 0,05) como podemos observar na tabela 5.

Quanto a determinado do potencial antioxidante através do índice de atividade

antioxidante (IAA), foi observado que o ExEt apresentou maior IAA na redução do radical

DPPH• quanto a FActE e BHT (p > 0,05), e valor similar aquele observado para AG (p > 0,05,

tabela 5), mostrando com isso características semelhantes do ExEt com o controle AG na

interação antioxidante ao radical DPPH•.

Tabela 5. Atividade antioxidante do extrato etanólico e fração Acetato de etila de P. cincinnata Mast determinado através da redução do radical livre DPPH•

IP

(% ± EPM)

CE50

(µg.mL-1 ± EPM) IAA

ExEt

97,01 ± 0,72a

7,26 ± 1,85 a

4,13 ± 0,16 a

FActE 23,69 ± 0,80 b 21,59 ± 0,80 b 0,41 ± 0,01 b

AG 96,24 ± 0,12 c,a 9,33 ± 0,22 c,a 3,21 ± 0,13 c,a

BHT 96,91 ± 0,25 d,a,c 12,33 ± 3,25 d,c 2,43 ± 0,16 d,c

Extrato etanólico bruto (ExEt) e fração acetato de etila (FActE) de folhas de P. cincinnata Mast. Valores com letras diferentes indicam médias com diferença significativa (p < 0,05). Percentual de inibição (IP) das amostras (30 µg/mL) foram calculados no tempo de 60 min. A concentração eficiente em 50% (CE50)

das amostras foram calculadas no tempo de 60 min. O índice de atividade antioxidante (IAA) foi calculado dividindo o valor da concentração final da amostra pelo CE50 no tempo de 60 min e classificado como fraco quando IAA < 0,5, moderado quando IAA > 0,5 < 1, forte quando IAA > 1 < 2 e muito forte quando IAA > 2. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Tukey.

47

5.3.1 Atividade sequestradora do radical ABTS•+

O ExEt apresentou excelente resposta na redução do radical catiônico ABTS•+,

reduzindo o radical de forma quantitativamente superior os controles AG e BHT (p < 0,05).

Porém, o extrato foi menor que os controles devido o mesmo apresentar maior valor de CE50

(p < 0,05). Em contrapartida, o extrato teve forte índice de atividade antioxidante, assim

como, os controles positivos (Tabela 6).

Tabela 6. Atividade antioxidante do extrato etanólico de P. cincinnata Mast determinado através da redução do radical livre ABTS•+

IP

(% ± EPM)

CE50

(µg mL-1 ± EPM) IAA

ExEt

97,05 ± 0,21 a

7,91 ± 0,38 a

3,79 ± 0,78 a

AG 95,89 ± 0,01 b 1,31 ± 0,01 b 11,53 ± 0,03 b

BHT 92,28 ± 0,30 c 2,60 ± 0,06 c 22,90 ± 0,05 c

Extrato etanólico bruto (ExEt) e fração acetato de etila (FActE) de folhas de P. cincinnata Mast. Valores com letras diferentes indicam médias com diferença significativa (p < 0,05). Percentual de inibição (IP) das amostras (30 µg/mL) foram calculados no tempo de 60 min. A concentração eficiente em 50% (CE50)

das amostras foram calculadas no tempo de 60 min. O índice de atividade antioxidante (IAA) foi calculado dividindo o valor da concentração final da amostra pelo CE50 no tempo de 60 min e classificado como fraco quando IAA < 0,5, moderado quando IAA > 0,5 < 1, forte quando IAA > 1 < 2 e muito forte quando IAA > 2.. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Tukey.

5.4 Atividade Redox (in vitro)

A atividade redox in vitro do ExEt foi determinada através da capacidade de inibir a

lipoperoxidação induzida por três agentes químicos AAPH, FeSO4 e H2O2 e quantificada pela

dosagem de TBARs. As diferentes concentrações testadas do ExEt das folhas de P. cincinnata

Mast reduziram os níveis de TBARs nos três indutores testado (p < 0,05) (Figuras 6, 7 e 8). O

ExEt apresentou característica redox semelhante ao controle ácido gálico e trolox em todas as

concentrações testadas quanto à prevenção da lipoperoxidação induzida pelo AAPH (p >

0,05), com valores acima de 95% em todas as concentrações avaliadas (Figura 6).

48

5 50 1000

1

2

3

4

5AAPH

ExEt

Ácido Gálico

Trolox

a a a

b b bc b bc b b

(-)

(+)

(+)

Concentrações(µµµµg.mL -1)

nmol

Eq

MD

A.m

L-1

Figura 6: Efeito do extrato etanólico (ExEt) das folhas de P. cincinnata Mast na formação de TBARS

induzido por AAPH. Valores com letras diferentes indicam médias com diferença significativa (p < 0,05). As

diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas via seguido do pós-teste de Bonferroni.

Quando avaliado o efeito redox do ExEt frente ao indutor FeSO4, ele não apresentou

prevenção significativa (p > 0,05) para a concentração de 5 µg.mL-1, entretanto, nas

concentrações de 50 µg.mL-1 e 100 µg.mL-1, o ExEt reduziu significativamente (p > 0,05) a

lipoperoxidação em 23,47% e 40,82%, respectivamente, revelando uma resposta dose

dependente (Figura 7).

5 50 1000

1

2

3

4FeSO4

ExEt

Ácido Gálico

Trolox

a a aa

b

b

b,a

c c

c

d dd


nmol

Eq

MD

A.m

L-1

(-)

(+)

(+)


induzido por FeSO4. Valores com letras diferentes indicam médias com diferença significativa (p < 0,05). As


49

Observando o comportamento do ExEt mediante a lipoperoxidação induzida pelo

peróxido de hidrogênio (Figura 8), identificamos que o ExEt apresentou efeito redox

preventivo semelhante aos controles ácido gálico e trolox (p > 0,05), com valores de

(45,19%, 61,54% e 62,50%) para as concentrações de 5, 50 e 100 µg.mL-1 ,respectivamente.

5 50 1000.0

0.5

1.0

1.5H2O2

ExEt

Ácido Gálico

Trolox

a aa

bb b

b

bb

c bb


nmol

Eq

MD

A.m

L-1

(-)

(+)

(+)


induzido por H2O2. Valores com letras diferentes indicam médias com diferença significativa (p < 0,05). As


5.5 Atividade Redox-Protetora Após Tratamento Agudo (in vivo)

O efeito redox-protetor do consumo agudo do ExEt de P. cincinnata Mast no

organismo de ratos em condições fisiológicas basais mostrou uma redução significativa (p <

0,05) na lipoperoxidação hepática e sanguínea dos animais tratados com a Passiflora. Bem

como, uma leve tendência, mas não significativo (p > 0,05), na redução da lipoperoxidação no

tecido cardíaco dos mesmos animais (Figura 9).

Da mesma forma, verificamos que o consumo agudo do ExEt das folhas de P.

cincinnata, também, foi capaz de prevenir significativamente (p < 0,05) a oxidação de

proteínas hepáticas. Mas, em contrapartida, não foi capaz de prevenir a oxidação a proteínas

sanguíneas e hepáticas, (Figura 10).

Por outro lado, constatamos que o consumo do ExEt possibilitou o aumento do

conteúdo de tióis sanguíneo, hepático e cardíaco de forma significativa (p < 0,05), sugerindo

um aumento no estado antioxidante para os tecidos avaliados (Figura 11).

50

Sangue Fígado Coração0.0

0.5

1.0

1.5SalinaPassiflora

b

b

Tecidos Analisados

a

a

aa

nmol

Eq

MD

A.m

L-1

Figura 9: Efeito redox da administração aguda do extrato etanólico (ExEt) das folhas de P. cincinnata

Mast na redução da lipoperoxidação em tecidos de ratos. Valores com letras diferentes indicam médias com

diferença significativa (p < 0,05) em relação ao controle salina para cada tecido. As diferenças estatísticas foram

determinadas através do teste t de Student.

Sangue Fígado Coração0

5

10

15

20SalinaExEt

b

Tecidos Analisados

aa

a

aa

Der

ivad

o C

arbo

nil

nm

ol.m

g-1

teci

do


Mast na redução da oxidação a proteínas em ratos. Valores com letras diferentes indicam médias com

diferença significativa (p < 0,05) em relação ao controle salina para cada tecido. As diferenças estatísticas foram

determinadas teste t de Student.

51

Sangue Fígado Coração0

200

400

600SalinaExEt

b

aa

Tecidos Analisados

b

a

b

Der

ivad

os S

ulfid

rilas

nmol

.mg

-1 t

ecid

o


Mast no conteúdo de grupamentos sulfidrilas totais em amostra de ratos. Valores com letras diferentes

indicam médias com diferença significativa (p < 0,05) em relação ao controle salina para cada tecido. As

diferenças estatísticas foram determinadas teste t de Student.

5.6 Atividade Redox-Protetora Após Tratamento Crônica (in vivo)

O protocolo de exercício físico de alta intensidade utilizado no presente estudo

mostrou-se eficiente em induzir o estresse oxidativo nos animais. Constatamos aumento

significativo (p < 0,05) no grupo de animais exercitados (GT) quanto à oxidação lipídica no

aparelho urinário, tecido sanguíneo e hepática na ordem de 201%, 123% e 161%,

respectivamente, em relação ao grupo controle sedentário (GC) (Figuras 12). Bem como,

aumento significativo (p < 0,05) na oxidação a proteínas cardíacas de 226% no (GT) em

relação ao (GC) (Figuras 13). Deixando evidente que esse tipo de treinamento compromete

vários tecidos do corpo, principalmente, constituintes protéicos cardíacos e lipídico hepático,

sanguíneo e urinário.

52

Sangue Urina Fígado Coração0

2

4

6

8

10GCGPGTGPT

a

b

a

ba

b ab

c

c cc,a

b

ab

a,c

Tecidos Analisados

nmol

Eq

MD

A.m

L-1

Figura 12: Efeito do consumo do extrato etanólico (ExEt) das folhas de P. cincinnata Mast sobre os níveis

de TBARS em amostras sanguínea, urinária, hepática e cardíaca de ratos. Grupo controle sedentário (GC),

grupo controle passiflora (GP), grupo controle treinado (GT) e grupo passiflora treinado (GPT). Valores

expressos em média ± EPM. Valores com letras diferentes indicam médias com diferença significativa (p <

0,05). As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de uma via seguido do pós-teste de

Bonferroni.

Fígado Coração0

5

10

15GCGPGTGPT

ab

c c

a

b

cc

Tecidos Analisados

Der

ivad

o C

arbo

nil

nmol

.mg-

1 teci

do


de derivados carbonil em amostras hepática e cardíaca de ratos. Grupo controle sedentário (GC), grupo

controle passiflora (GP), grupo controle treinado (GT) e grupo passiflora treinado (GPT). Valores expressos em

média ± EPM. Valores com letras diferentes indicam médias com diferença significativa (p < 0,05). As

diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Bonferroni.

53

O tratamento crônico com o ExEt das folhas de Passiflora (200 mg.kg-1), preveniu a

lipoperoxidação no tecido sanguíneo, cardíaco e hepático, bem como, no aparelho urinário

dos animais do grupo GP em relação ao GC (p < 0,05). Além disso, constatamos também

redução significativa (p < 0,05) nos níveis de MDA no aparelho urinário, tecido sanguíneo e

hepático dos animais do grupo GPT em relação ao GT (p < 0,05). Quanto à prevenção

oxidativa no músculo cardíaco dos animais do grupo GPT em relação ao grupo GT, este

apresentou leve tendência redutiva, porém não significativa (p > 0,05).

Paralelamente, foi observada uma redução significativa (p < 0,05) na oxidação ao

conteúdo protéico hepático e cardíaco dos animais do GP em relação ao GC. Semelhança não

evidenciada nos demais grupos (figura 13).

O conteúdo de grupamento sulfídrila avaliado no presente estudo indica,

indiretamente, o recrutamento do sistema de defesa antioxidante das glutationas para o tecido

testado. Neste sentido, podemos verificar que o consumo diário de Passiflora não alterou de

forma significativa (p > 0,05) o conteúdo de tióis nos animais do GP em relação ao GC, tanto

no tecido hepático quanto no cardíaco. Em contrapartida, este sistema foi bastante requisitado

nos animais em exercício, sofrendo redução significativa (p < 0,05) no tecido hepático dos

animais do GPT em relação ao GT. Bem como, uma redução não significativa (p > 0,05) de

78% no tecido cardíaco dos animais do GPT em relação ao GT (Figura 14).

Fígado Coração0

10

20

30GCGPGTGPTa

a,c

b

c aa,c

b

c

Tecidos Analisados

Der

ivad

os S

ulfid

rila

nmol

.mg

-1te

sido


de derivados sulfidrilas em amostras hepática e cardíaca de ratos. Grupo controle sedentário (GC), grupo

controle passiflora (GP), grupo controle treinado (GT) e grupo passiflora treinado (GPT). Valores expressos em

média ± EPM. Valores com letras diferentes indicam médias com diferença significativa (p < 0,05). As

diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Bonferroni.

54

7. DISCUSSÃO

No presente estudo verificamos que as classes dos constituintes químicos

encontrados no extrato da P. cincinnata Mast são condizentes com o previamente encontrado

para o gênero Passiflora (PEREIRA & VILLEGAS, 2000; DHAWAN et al., 2004; MULLER

et al., 2005). Estes resultados sugerem que os diferentes usos medicinais dessa espécie podem

ser validados, principalmente, devido à presença dos constituintes fenólicos, cujo consenso na

literatura é de que eles estão associados a diversas propriedades medicinais, dentre elas, as

propriedades antioxidantes (RUDNICKI et al., 2007), prevenindo doenças associadas ao

envelhecimento, além de cardiopatias e câncer (VAN DER SLUIS et al., 1997; RICE-

EVANS, MILLER & PAGANGA, 1997).

Há evidências na literatura sobre a existência de uma associação direta e significativa

entre o teor de compostos fenólicos em extratos e frações e a atividade antioxidante dos

mesmos (HARBONE & WILLIAMS, 2001; MENSOR et al., 2001; RUDNICKI et al., 2007;

OLIVEIRA, 2008). Diante disso, foi constatado que o teor fenólico do ExET está acima

daqueles já encontrados para outras espécies do gênero Passiflora, a exemplo, Passiflora sp

(20,0 ± 2,6 mg Eq ácido gálico.g-1) (KUSKOSKI et al., 2006), a P. edulis (92,5 ± 2,2 mg Eq

ácido tanico.mg-1 extrato) (RUDNICKI et al., 2007) e a P. alata (103,10 ± 10,4 mg Eq àcido

gálico.100g-1) (OLIVEIRA, 2008), as quais tiveram atividade antioxidante abaixo dos valores

encontrados em nosso estudo.

A concentração eficiente de um produto natural (extrato ou fração) em reduzir um

radical livre em 50% (CE50) é uma característica muito importante quanto à capacidade

antioxidante do mesmo. Souza et al. (2007) avaliaram a atividade antioxidante de algumas

plantas medicinais e encontraram valores de CE50 3,8 e 15,3 vezes maior no extrato da casca

de Terminalia brasiliensis e extrato da raiz de Copernicia prunifera, respectivamente, em

relação a P. cincinnata Mast. Da mesma forma, Boscolo et al. (2007) avaliaram o potencial

antioxidante de plantas medicinais da restinga, encontrando valores de CE50 115 vezes maior

que a P. cincinnata Mast. Estes dados corroboram com a hipótese de que a P. cincinnata Mast

tem grande potencial antioxidante em relação a diversas outras espécies de plantas com

propriedade medicinais comprovadas na literatura.

Contudo, segundo Scherer & Godoy (2009), o índice de atividade antioxidante ou

IAA pode representar, com maior exatidão, o potencial antioxidante de um composto sintético

ou produto natural frente a um radical livre que simplesmente o CE50. Haja vista que o IAA

anula os erros na comparação de resultados decorrente da concentração final do radical livre

55

utilizado, uma vez que a formula para o IAA depende da concentração final do radical

utilizado e o CE50 encontrado para no experimento (SCHERER & GODOY, 2009). Assim,

observamos que o ExEt das folhas de P. cincinnata Mast apresentou IAA muito forte

(superior a 3 para o radical ABTS●+ e a 4 para o radical DPPH), o que nos sugere elevado

potencial antioxidante.

Argolo et al. (2004) encontraram valores muito forte IAA ao radical DPPH pelos

extratos etanólico (2,0 ± 0,02) e aquoso (2,15 ± 0,05), fração acetato de etila (2,32 ± 0,01), e

clorofómica (2,43 ± 0,02) em folhas de B. monandra, espécie bastante utilizada no Brasil

como antidiabete. Da mesma forma, Sousa et al. (2007), avaliaram a atividade antioxidantes

de diversas plantas de uso medicinal frente ao radical DPPH e encontraram valores muito

forte de IAA nos extratos etanólicos de T. brasiliensis (3,62 ± 0,08 casca e 2,25 ± 0,19

folhas) e T. fagifolia (2,37 ± 0,07 - folhas), porém, forte IAA nos extratos etanólicos das C.

macrophyllum (1,27 ± 0,05 - folhas) e Q. grandiflora (1,99 ± 0,08 - folhas), além de

moderada atividade para o extrato etanólico da C. prunifera (0,89 ± 0,03 - raiz).

Segundo Oliveira (2008), além do teor fenólico do produto natural, a estrutura

química do componente ativo do mesmo (extrato ou fração) são fatores importantes que

influenciam na eficácia do antioxidante natural frente a diversos RLs. A posição e o número

de hidroxilas presentes na molécula dos polifenóis, principalmente, na posição orto é um fator

relevante para esta atividade. Neste sentido, Masteikova et al. (2008) verificaram que o

extrato etanólico de P. incarnata possui 2,5 e 2,3 mais vezes atividade de seqüestro de radical

DPPH• e ABTS•+, respectivamente, que o extrato aquoso. Isso deve ter ocorrido por causa da

maior presença de compostos fenólicos com orto-dihidroxilação no extrato etanólico em

comparação ao extrato aquoso, bem como, ao maior conteúdo fenólico presente no extrato

etanólico (OLIVEIRA, 2008).

Segundo Lima, Cunha & Estevam (2009), o ExEt da P. cincinnata apresenta uma

cinética de reação muito rápida com estabilização entre 5 a 10 minutos. Essa característica é

especialmente importante quando consideramos que, quanto mais rápida a reação de uma

molécula ou substância antiradicalar a um radical, melhor será sua efetividade antioxidante

em organismos vivos, haja vista que a meia vida de um RL no organismo é muito curta (10-6

segundos) (LIMA, 2008). Por este motivo, e, pelo elevado teor fenólico do ExEt, foi

constatado no presente estudo que uma única dose de 200 mg.kg-1 do ExEt das folhas da P.

cincinnta Mast foi capaz de reduzir significativamente a peroxidação lipídica de tecido

sanguíneo e hepático, bem como, a oxidação de proteínas do tecido hepático de ratos.

56

Fazendo-nos crê, com maior veemência, no potencial efeito redox positivo do ExEt sobre a

prevenção de lesões oxidativas por EROs à estruturas celulares.

Rodrigues et al. (2005), Lima et al. (2005) e Wang et al. (2008) encontraram níveis

de peróxidação lipídica reduzidos em tecido hepático de ratos tratados com amostras de vinho

tinto, infusão aquosa de sálvia (Salvia officinalis) e soja fermentada que apresentam como

principal característica o fato de serem ricos em polifenóis. Lima (2008) descreve que altas

doses de extratos ricos em polifenóis são efetivos na redução da lipoperóxidação e oxidação

de diversos componentes celulares (LIMA, 2008). Porém, o mecanismo pelo qual isso ocorre,

ainda, não está totalmente elucidado, entretanto, especula-se que polifenóis possam atuar

como sequestradores de radicais ou atuarem como moduladores na sinalização da expressão

gênica de diversas enzimas antioxidantes (Middleton et al., 2000).

Neste sentido, o ExEt das folhas da P. cincinnata Mast, em nosso estudo, pode ter

agido como seqüestrador direto de radicais, uma vez que, o conteúdo de tióis, representado

por grupamento sulfidríla, foi aumentado no tecido hepático e cardíaco dos ratos que

ingeriram em caráter agudo 200 mg.kg-1 do mesmo (Figura 7), indicando um menor

recrutamento do sistema de defesa antioxidante dependente de glutationa como GPx e GSH,

uma vez que, acreditamos que não houve tempo hábil para aumento na expressão gênica

destas enzimas durante o experimento (VANNUCCHI et al., 1998; ROVER JR et al., 2001).

Rudnicki et al. (2007) investigaram o efeito da administração oral do extrato

hidroetanólico de P. alata contra danos oxidativos em órgãos de ratos e mostraram que o

extrato reduziu os níveis de lipoperoxidação hepática e cardíaca dos animais tratados. Além

disso, foi constatado aumento na atividade de algumas enzimas antioxidantes como catalase

(CAT) e superóxido dismutase (SOD), mostrando com isso que, os polifenóis do extrato da

Passiflora preservam o conteúdo enzimático antioxidante através de sua ação antioxidante

(MIDDLETON et al., 2000). Dados estes que tornam nossos achados condizentes com a

literatura.

Nossos resultados sobre o consumo crônico do ExEt das folhas de P. cincinnata

Mast, avaliado após 8 semanas, reforça a hipótese de que a Passiflora em estudo, protege o

tecido sanguíneo, aparelho urinário, além do fígado e coração de ratos (GP) contra lesões

oxidativa a estruturas lipídica celulares, bem como, oxidações à estruturas protéicas do fígado

e coração dos mesmos animais. A justificativa é a mesma apresentada anteriormente, após o

consumo de uma única dose do ExEt, cujos animais apresentaram proteção redox nos tecidos

avaliados através do seqüestro direto de RLs, uma vez que, o conteúdo de tióis, grupamento

57

sulfidríla, não sofreu alterações significativas (p > 0,05) no tecido hepático e cardíaco (Figura

10).

O exercício físico é uma fonte potencial para aumentar a produção de Eros no

organismo (ALESSIO et al., 2002). Contudo, é a intensidade da atividade física o fator

determinante para o aumento destas espécies radicalares durante o exercício (MUSARO et al.,

2010). Souza, Oleveira & Pereira (2005) encontraram valores elevados de MDA e proteínas

carboniladas em jogadores de futebol, maratonistas e praticantes de outras modalidades

esportivas após uma sessão de exercício de alta intensidade.

Neste sentido, verificamos em nossos resultados que o protocolo de exercício foi

eficiente em aumento a produção de EROs e danos oxidativos aos tecidos avaliados, como já

relatado anteriormente. Em contrapartida, o ExEt das folhas de Passiflora, quando consumida

antes do exercício físico, foi capaz de prevenir significativamente (p < 0,05) lesões oxidativas

a estruturas lipídicas celulares (lipoperoxidação) no tecido sanguíneo, hepático e aparelho

urinário dos animais (GPT). Porém, não foi capaz de prevenir de forma significativa a

lipoperoxidação cárdica, nem a oxidação de proteínas hepática e cardíaca.

Para tanto, há duas explicações, a primeira é a comprovação da elevada produção de

EROs com o protocolo de exercício utilizado, uma vez que, mesmo com o aumento de

constituintes fenólicos no organismo através do consumo do ExEt, verificamos uma depleção

no teor de tióis totais dos tecidos (Figura 14), mostrando, com isso, um maior nível de

estresse oxidativo e recrutamento do sistema de defesa antioxidante das glutationas.

A segunda explicação está na dosagem do ExEt, a qual pode não ter sido suficiente

para prevenir lesões oxidativas em todos os tecidos de maneira igualitária. Haja vista que os

compostos polifenólicos quando ingeridos, antes de serem secretados na circulação sanguínea,

sofrem metabolização no fígado (MANACH & DONAVAN, 2004). Portanto, esse órgão

pode servir como um depósito de compostos polifenólicos, combatendo os radicais livres de

maneira mais rápida e eficiente que outros órgãos como o coração que receberá quantidade

inferior de constituinte fenólico.

Rudnicki et al. (2007) ainda em seu estudo, verificaram que a dosagem utilizada do

extrato da P. alata não foi capaz de reduzir significativamente os níveis de lipoperóxidativos

e oxidação as proteínas hepática e cardíaca de maneira igualitária. Porém, foi possível

verificar, uma tendência na redução deste parâmetro oxidativo com aumento da dosagem. Isso

sugere que devido ao elevado consumo dos polifenóis no fígado, há uma redução na

biodisponibilidade destes compostos a outros órgãos como coração, mostrando não ser

58

possível a prevenção oxidativa a lipídios e proteínas nos diversos órgãos de maneira

igualitária. Dados que tornam nossos achados condizentes com a literatura.

Buscando entender, em parte, a propriedade redox dos constituintes presentes no

ExEt frente a oxidação lipídica induzida por três geradores químicos de radicais livres, o

mesmo apresenta uma maior afinidade em neutralizar a lipoperoxidação induzida por AAPH e

H2O2 que FeSO4. O AAPH é um indutor químico que apresenta como característica a geração

de radical carbono centrado, o qual reage prontamente com oxigênio para formar o radical

peroxil. H2O2 é uma fonte geradora de radical hidroxila, em quanto o FeSO4 é o promotor das

reações de Fenton e gerador de radical alcoxil, todos responsáveis potencialmente pela cascata

lipoperoxidativa (RUBERTO, 2000).

Segundo Budni et al. (2007), compostos fenólicos presentes em extratos vegetais

apresentam uma relação direta entre o seu o poder redox e a quantidade de grupos hidroxilas

ligadas a ele. Van Acker et al. (1996) demonstraram haver diferença no potencial redox de

compostos fenólicos a depender de sua estrutura química, pois sua propriedade depende do

rearranjo dos grupos funcionais em torno da estrutura nuclear. Fato que justifica a interação

entre os compostos fenólicos e grupos radicalares na prevenção da lipoperoxidação.

Apesar dos achados em nosso estudo serem com extrato hidroetanólico, é possível

fazer equivalências dos mesmos com o consumo de chás de folhas da Passiflora pela

população, haja vista que achados cromatográficos mostraram que há relação entre o conteúdo

de fenóis totais do material seco do extrato aquoso e hidroetanólico que são semelhantes,

sendo, o segundo com maior quantidade de constituintes (DE-PARIS et al., 2002; BIRK et

al., 2005).

59

8. CONCLUSÕES

No presente estudo, a quantidade de fenóis totais, atividade antioxidante e

propriedade redox-protetora da P. cincinnata mast foi investigada. Os achados encontrados

sugerem as seguintes conclusões:

• O ExEt e a FActE apresentaram alto teores de fenóis totais;

• A FActE apresentou fraca capacidade seqüestradora para radical DPPH•;

• O ExEt apresentou forte capacidade seqüestradora para os radicais DPPH• e ABTS●+;

• O ExEt apresentou excelente capacidade redox-protetora para inibir a lipoperoxidação

induzida por AAPH e H2O2 e moderada atividade para o indutor FeSO4;

• O tratamento agudo dos animais com 200 mg.kg-1 de ExEt de P. cincinnata Mast foi

capaz de proteger estruturas do aparelho sanguíneo e hepático contra danos oxidativos

produzidos pelo organismo;

• O tratamento agudo dos animais com 200 mg.kg-1 de ExEt de P. cincinnata Mast foi

capaz de aumentar o conteúdo de grupamento sulfidríla totais (tióis) do tecido

sanguíneo, hepático e cardíaco dos mesmos.

Em adição, os resultados encontrados após o consumo diário de 200 mg.kg-1 do

ExEt, durante dois meses, no modelo de dano oxidativo induzido pelo exercício físico de alta

intensidade sugerem as seguintes conclusões:

• O consumo diário, 200 mg.kg-1 de ExEt de P. cincinnata Mast, durante 2 meses, foi

capaz de prevenir a oxidação lipídica e protéica das estruturas celulares do aparelho

urinário, sanguíneo, bem como, hepática e cardíaca em ratos sobre condições de

estresse fisiológico;

• O consumo diário, 200 mg.kg-1 de ExEt de P. cincinnata Mast, durante 2 meses,

preservou o conteúdo de grupamento sulfidrila no tecido hepática e cardíaco de ratos

sob condições de estresse fisiológico;

• O consumo diário, 200 mg.kg-1 de ExEt de P. cincinnata Mast, antes da prática de

exercício físico de alta intensidade, durante 2 meses, foi capaz de prevenir lesões

oxidativas a componentes lipídicos do tecido sanguíneo e hepático, bem como do

60

aparelho urinário de ratos sob condições de estresse oxidativo induzido pelo exercício

físico;


exercício físico de alta intensidade, durante 2 meses, não foi capaz de prevenir lesões

oxidativas de componentes lipídico cardíaco, bem como de proteínas do tecido

hepático e cardíaco dos ratos sob condições de estresse oxidativo induzido pelo

exercício físico;


exercício físico de alta intensidade, durante 2 meses, não foi suficiente para preservar

o conteúdo de tióis totais hepático e cardíaco dos animais tratados sob condições de

estresse oxidativo induzido pelo exercício físico.

61

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