AULA 10AULA 10

2

OBJETIVOSOBJETIVOS

� Identificação de Novas Moléculas Bioativas

� Integração com o processo de HTS

� Otimização de Moléculas Bioativas� Otimização de Moléculas Bioativas

� Organização de Bases de Dados de Compostos

� Gerenciamento da Informação

3

DESENVOLVIMENTODESCOBERTA(Fases Clínicas I – IV)

Triagens clínicas conduzidas em humanos: avaliação da segurança, impacto no estado da doença, doses, estudos comparativos com outros

Pesquisa Básica (Pré-clínica)

� Identificação do alvo molecular

fármacos, acompanhamento após a comercialização

Fase I: de 20 a 100Fase IV

novas oportunidades para a descoberta de fármacos

� Validação do alvo molecularinformação que suporta o Fase I: de 20 a 100

Pacientes saudáveis paratestes de segurança

Estudos após a comercialização

� Atenção para reações ad e sas inespe adas

ç q penvolvimento do alvo com o

estado de doença e demonstra o seu potencial no processo de

descoberta de fármacos

�

Fase II: centenas de pacientesTestes de segurança e

avaliação do impacto do estado de doença

adversas inesperadas

� Monitoramento de pesquisas de

amostragem e testes

� Identificação de moléculas bioativas

identificação de moléculas que apresentam algumas

�Fase III: milhares de pacientes

Testes de segurança, i t d

g

� Coleta de dados, organização da

informação e inspeção

propriedades desejáveis de um fármaco e outras que precisam ser otimizadas

� Descoberta de NCEs �impacto, dosagem, e estudos comparativos � Submissão dos dados

para aprovação

� revisão da informação

� Descoberta de NCEsestratégias em química medicinal, obtenção de

NCEs, candidatas a novos fármacos Solicitação de IND

�

médica a longo prazoSolicitação de IND

Agência Reguladora

Testes pré-clínicos de eficácia e avaliação de efeitos

adversos a curto prazo

Solicitação de NDAAgência Reguladora

Continuação dos testes pré-clínicos paraavaliação de efeitos adversos a longo prazo

Questões Fundamentais

� Selecionar o alvo apropriado

é� Identificar as moléculas certas

• 1 x 1062-63 moléculas:MM < 500: H C N O P S F Cl BrMM < 500: H, C, N, O, P, S, F, Cl, Br

• ~ 2000 NCEs no mercado farmacêutico• ~ 2000 NCEs no mercado farmacêutico

5

PROCESSO DE PLANEJAMENTO DE FÁRMACOS1. Identificar Moléculas Potentes

2. Selecionar Moléculas Seletivas

Candidatos

SeletividadePotência

Alvo

Identificar novassubstâncias bioativassubstâncias bioativas

Funil do Processo de Descoberta Moderno

Fármaco

Aprovação do FDA

BIOTECNOLOGIA E QUÍMICA MEDICINAL

Expressão e Purificação de Proteínas

Cristalografia de Raios-X

Determinação estrutural

ALVO BIOLÓGICO

ALVO BIOLÓGICO

13

ALVO BIOLÓGICO

15

� O termo ensaio virtual (VS) se refere ao processo de análise( ) pcomputacional em larga escala de grandes bases de dados, com oobjetivo de identificar um pequeno subgrupo de compostos que podemser obtidos comercialmente ou por síntese orgânica para a avaliação inser obtidos comercialmente ou por síntese orgânica para a avaliação invitro da atividade biológica

� As bases de dados podem conter milhares ou até milhões de� As bases de dados podem conter milhares, ou até milhões de compostos comercialmente disponíveis ou acessíveis por síntese orgânica

Aspectos Fundamentais

SBVS é uma estratégia que envolve a LBVS é uma estratégia que envolve aSBVS é uma estratégia que envolve aanálise de grandes bases de dadosvirtuais de compostos através demétodos computacionais com o

LBVS é uma estratégia que envolve aanálise de grandes bases de dadosvirtuais de compostos através demétodos computacionais com o objetivométodos computacionais com o

objetivo de estimar a afinidade deligação de moléculas no sítioativo da proteína alvo.

p jde identificar compostos bioativosestruturalmente similares.

SBVSSBVS(Structure-Based Virtual Screening)

LBVSLBVS(Ligand-Based Virtual Screening)

p

g g

P

O

HOOH

OH

OH

P

O

HO OH

HOO

Seleção do alvo molecularSeleção do alvo molecular Seleção do esqueleto molecularSeleção do esqueleto molecular

Base de dados paraBase de dados paraBase de dados para Base de dados para triagem virtualtriagem virtual

ADME/ToxDrug-likeLead-like

Identificação de compostos comIdentificação de compostos comIdentificação de compostos com Identificação de compostos com propriedades requeridaspropriedades requeridas

Docagem Docagem molecularmolecular

Busca por similaridade, farmacóforos, etcBusca por similaridade, farmacóforos, etc

312

3

Avaliação da Avaliação da atividade biológicaatividade biológica

Compostos líderesCompostos líderes

ENSAIO VIRTUALENSAIO VIRTUAL

Hits

AlvoBiológico

Hits virtuais

Coleções de Compostos

20

� O SBVS, também denominado ensaio virtual em larga escala (do , g (inglês, Virtual High Throughput Screening, VHTS), é usado na triagem biológica in silico de milhares de ligantes com diversidade química imensa contra virtualmente qualquer alvo cuja estruturaimensa contra virtualmente qualquer alvo cuja estrutura tridimensional (3D) seja definida

� A técnica de SBVS é muito útil nas fases iniciais de pesquisa básica� A técnica de SBVS é muito útil nas fases iniciais de pesquisa básica (pré-clinica) do processo de descoberta de novos fármacos, na identificaçãode novas moléculas bioativas

21

� Nos estudos das interações intermoleculares entre ligante e alvo biológico, são utilizados programas de VS que realizam o acoplamento (do inglês, pose) do ligante no sítio ativo da macromolécula, sendo esse processo denominado docagem molecular (do inglês, docking).

� Os algoritmos de docagem são complementados por funções de pontuação (do inglês, scoring functions) capazes de predizer a atividade biológica de uma série de ligantes

� Como resultado desse processo, uma coleção privilegiada de p , ç p gmoléculas pode ser selecionada para os ensaios biológicos in

vitro, levando a uma redução significativa do espaço químico-biológico dos ligantes em comparação à base de dados originalbiológico dos ligantes em comparação à base de dados original

AmostragemAmostragemPontuaçãoPontuaçãoClassificaçãoClassificação ComplementaridadeComplementaridade

11°° 22°°Estéreo

66°° Química55°°

33°° 44°°

sítio de ligação

ligante

sítio de ligação

Docagem (acoplamento, “pose”)� referente a mesma molécula� referente a mesma molécula

C1 possui uma orientação melhor que C2Funções de pontuação (afinidade de ligação)� referente a moléculas diferentes

A possui melhor interação com R que C1 Classificação (“ranking”)

25

p ç q 1C1 é melhor do que B

Classificação ( ranking )� referente ao conjunto de moléculasOrdem referente a afinidade de ligação

• O processo de docagem molecular pode ser dividido em p g pduas etapas fundamentais– determinação do modo de ligação– predição da afinidade do ligante pelo sítio de interação

predição da afinidadepredição da afinidade

modo de ligação

Definir o Espaço Químico-Biológico ApropriadoDefinir o Espaço Químico-Biológico ApropriadoO desafio de balancear qualidade e quantidade

o

MoléculaBioativa

ioló

gic

op

aço

bi

Esp

Espaço químico

Integração de métodos computacionais e experimentaisIntegração de métodos computacionais e experimentais

métodosmétodos computacionais

Teste Biológicométodos experimentais

Id tifi ã d M lé l Bi tiIdentificação de Moléculas Bioativas

(i) predizer o modo de ligação das moléculas corretamente, sendo que o acoplamento se refere à orientação e conformação das moléculas no íti ti d tsítio ativo do receptor

(ii) predizer a afinidade relativa de ligação, proporcionando uma classificação ordenada das moléculas candidatas selecionadas da base de dados

(i) Desenvolvimento de um ensaio biológico padrão

(ii) Organização criteriosa de bases de dados de compostos

(iii) A estimativa correta das interações de ligação é fundamental e passa pela capacidade de diferenciar os acoplamentos corretos dos incorretos, e consequentemente, selecionar os ligantes bioativos

(i ) V lid ã(iv) Validação externa

(v) Os compostos priorizados através do VS deverão ser disponíveis fisicamente t i bi ló i i it tid d fi i t l dpara a triagem biológica in vitro, em quantidades suficientes e pureza elevada

� O preparo da estrutura tridimensional do alvo macromolecular éessencial para que o ensaio virtual baseado na estrutura do receptorpossa ser bem sucedido

http://www rcsb org/pdbhttp://www.rcsb.org/pdb

33 34

� O preparo do sítio ativo da estrutura do alvo envolve normalmente as seguintes etapas:

(i) escolha da estrutura cristalográfica de maior resolução, de preferência em complexo com algum ligante bioativocomplexo com algum ligante bioativo

(ii) remoção do ligante do sítio ativo

(iii) avaliação das moléculas de água da estrutura

(iv) adição de átomos de hidrogênio( ) ç g

(v) verificação do estado de protonação e determinação dos tautômeros corretos de alguns resíduos de aminoácidos presentes no sítio ativo da proteína-alvo

35(vi) definição do sítio ativo para o acoplamento dos ligantes

Depois de finalizada as etapas de organização da base de dados e preparoDepois de finalizada as etapas de organização da base de dados e preparoda estrutura do alvo, o VS evolui para o processo de docagem dasmoléculas da base de dados

Algoritmos de docagem têm como finalidade acoplar moléculas pequenasno sítio ativo do alvo molecular

O processo consiste de uma amostragem das coordenadas espaciais dosítio de ligação com o concomitante uso da função de contagem para cadasítio de ligação com o concomitante uso da função de contagem para cadaacoplamento, gerando uma classificação do modo de ligação de cadacomposto

Enquanto que o acoplamento dos ligantes ao alvo refere-se a docagem, a ti ti d fi id d d li ã é h d d t ãestimativa da afinidade de ligação é chamada de pontuação, que por sua

vez, sendo organizada de forma ordenada, dá origem à chamada classificação

Todas as moléculas da base de dados devem ser classificadas a partir do processo de docagem, gerando uma ordem comparativa relativap g , g p

Os programas de docagem são capazes de realizar as duas tarefas, docagem e pontuaçãodocagem e pontuação

A distinção entre as mesmas define os dois principais desafios dos programas de docagem que são:programas de docagem que são:

(i) di f t d l t d lé l j(i) predizer a forma correta de acoplamento de uma molécula, ou seja, a sua orientação e conformação no sítio de ligação do receptor

(ii) predizer a afinidade de ligação dos complexos proteína-ligante, produzindo uma classificação hierárquica dos compostos da base de compostos.compostos.

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Moléculas Bioativas

M lé lMoléculasBioativas

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