Aula 2 - Metodos Diagnosticos Em Parasitologia

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Métodos diagnósticos em parasitologia
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    03-Jul-2015
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Mtodos diagnsticos em parasitologia

Exame parasitolgico de fezes (EPF)y Grande importncia para o diagnstico de parasitoses

intestinais, causadas por helmintos e protozorios y EPF no o nome de uma tcnica, e sim do pedido para a realizao de um exame de fezes em busca de parasitos y Grande desafio do diagnstico na parasitologia a baixa sensibilidade das tcnicas quando no realizadas corretamente y Falta de conhecimento sobre a coleta da amostra, os fundamentos de conservao e da execuo do mtodo, levam frequentemente a resultados falso-negativos!!!

Exame parasitolgico de fezes (EPF)y Outro erro y y y y

indicao de anti-helmnticos sem solicitar EPF para verificar a real necessidade O profissional responsvel por escolher a tcnica deve ter claramente delimitado o objetivo do exame Pacientes assintomticos tcnica capaz de detectar o maior nmero possvel de espcies Existem tcnicas preferenciais para a busca de determinadas estruturas fundamental que o mdico indique a suspeita clnica e, se possvel, a tcnica desejada

Exame parasitolgico de fezes (EPF)y Tem como objetivo diagnosticar os parasitos

intestinais, por meio da pesquisa das diferentes formas parasitrias que so eliminadas nas fezes. y O exame macroscpico permite a verificao da consistncia das fezes, do odor, da presena de elementos anormais, como muco ou sangue, e de vermes adultos ou partes deles. y O exame microscpico permite a visualizao dos ovos ou larvas de helmintos, cistos, trofozotos ou oocistos de protozorios. Pode ser quantitativo ou qualitativo.

Exame parasitolgico de fezes (EPF)y A grande maioria dos mtodos apenas QUALITATIVO

= apenas indica a presena do parasita ou no y Existem mtodos QUANTITATIVOS (Kato-Katz) = se faz a contagem dos ovos nas fezes, permitindo, assim, avaliar a intensidade do parasitismo.y Mtodos QUALI

rotina y Mtodos QUANTI pouco utilizados, pois a dose dos medicamentos antiparasitria no leva em conta a carga parasitria e sim o peso corporal do paciente. Estudos epidemiolgicos e/ou controle de cura

Coleta da amostray Deve ser colhida sem contato com o vaso sanitrio y Utilizar recipientes limpos, isentos de gua (pode conter

microorganismos de vida livre), urina (destri a mobilidade e os trofozoitas) ou outro material que possa contaminar pinico fim de no contaminar laboratrio

y Jornais e outros tipos de papis tambm devem ser evitados a

y Transferir a amostra para o frasco coletor cedido pelo

Coleta da amostray Identificar o frasco com letra legvel, indicando nome

do paciente, data e hora da coleta lpis (no borrar com o conservante) y Tempo de entrega do material depende da suspeita clnica

Fezes diarreicas Giardia 30 min estrongiloidase com exame de larvas vivas imediatamente aps a emisso das fezes

y De preferncia coleta pela manh no laboratrio

ou enviada rapidamente y Caso no seja possvel enviar imediatamente o material ser necessrio conservar o material

Conservantesy MIF (mercrio, iodo e formol) mais y y y

y

popular Formol 10% - proibio do mercrio Formol tamponado SAF (acetado de sdio, cido actico glacial, formol e gua destilada) bom para trofozotos em fezes diarreicas Embrulhar em papel e armazenar na geladeira (5-10C) ou isopor com gelo at 48hs

Semanas

Conservantesy Colocar o conservante, a amostra, homogeneizar

bem e colocar mais conservante

y Quando so feitas vrias coletas em dias alternados,

elas podem ser misturadas no mesmo recipiente

Cuidados fundamentaisy Usar luvas y Trabalhar com calma, identificando corretamente y Usar material descartvel

evita falso-positivos

Escolha do mtodoy No existe um mtodo capaz de diagnosticar, ao mesmo tempo, todas as

formas parasitrias.

y Alguns mtodos so mais gerais, permitindo o diagnstico de vrios

parasitos intestinais, outros so mtodos especficos, indicados para um parasito em especial.

y Mtodos gerais

mtodo de Hoffman, Pons e Janer e o os mtodos de centrifugao (MIFC, Ritchie e Coprotest). feito por um dos mtodos gerais, acima citados.

y Na maioria dos pedidos de EPF, a suspeita clnica no relatada, e o exame

y Quando solicitada a pesquisa de um parasito que exige a execuo de um

mtodo especfico mtodo especfico e mtodo geral devem ser executados o EPF ficar mais completo, pois ser feita a pesquisa dos vrios parasitos intestinais e no apenas daquele solicitado.

Escolha do mtodoy Execuo de vrios mtodos com cada amostra fecal

um mtodo geral um especfico para larvas de helmintos um especfico para cistos de protozorios.

y Procedimento invivel - quantidade insuficiente de

y y y y

fezes, ou pelo elevado nmero de exames a serem realizados por dia Interao mdico-laboratrio contribuiria para que o EPF fosse o mais exato possvel. Automao ainda no uma realidade na parasitologia Testes imunolgicos Testes moleculares

Escolha do mtodoy Imunoenzimticos - EIA ou ELISA Entamoeba histolytica/ dispar Giardia lamblia Cryptosporidium y Imunofluorescentes-IFAs Cyclospora Isospora y PCR deteco e subtipagem Cryptosporidium

Escolha do mtodoy A fim de obter mais qualidade no EFP, devemos

sempre ter em mente que y 1. algumas espcies de parasitos s so evidenciadas por tcnicas especiais; y 2. um exame isolado, onde o resultado negativo, no deve ser conclusivo, sendo recomendvel a sua repetio com outra amostra; y 3. a produo de cistos, ovos ou larvas no uniforme ao longo do dia ou do ciclo do parasito.

Mtodosy Exame de fezes direto a fresco y Tcnicas de concentrao - Muitas vezes o nmero de formas

parasitrias eliminadas com as fezes pequeno, havendo necessidade de recorrer a processos de enriquecimento para concentr-las.Espontnea ou por centrifugao Flutuao ou sedimentao

y Tcnicas para buscas de larvas y Existem diversas tcnicas semelhantes, baseadas no mesmo

fundamento, com nome diferente y Um mtodo ser mais ou menos utilizado na rotina do EPF, quando, alm de permitir o diagnstico de vrios parasitos intestinais, tambm de fcil execuo e pouco dispendioso.

Helmintos - Formas evolutivas eliminadas via analy OVOS

y LARVAS

Ascaris lumbricoides Trichuris trichiura Enterobius vermicularis Ancylostoma duodenale Necator americanus Taenia solium Taenia saginata Hymenolepis nana Schistosoma mansoni

Strongyloides stercoralis

y VERMES ADULTOS

Ascaris lumbricoides Taenia sp. (proglotes) Enterobius vermicularis

Protozorios - Formas evolutivas eliminadas via analy CISTOS/TROFOZOTOS Giardia lamblia Entamoeba histolytica/E. dispar Entamoeba coli Endolimax nana Iodamoeba btschlii Chilomastix mesnili Blastocystis hominis (apenas cisto)

Mtodo diretoy Procedimento simples y Permite visualizar trofozotos vivos y Obtida diretamente da amostra fecal, sem

conservante, pouco material (falso-negativo) mais

y Mtodos de concentrao so melhores

amostra, maior sensibilidade

Mtodo diretoy Recolhe-se uma poro bem pequena (cabea do y y y y

palito de fsforo) e coloca-se sobre a lmina Adiciona-se salina Homogeiniza Coloca lamnula Anlise em microscpio em 10 e 40X

Processos de concentraoy Sedimentao espontnea: mtodo de Hoffman, Pons e Janer, tambm

conhecido como mtodo de Lutz. Permite o encontro de ovos e larvas de helmintos e de cistos de protozorios;

y Sedimentao por centrifugao: mtodo de Blagg (tambm conhecido por

mtodo de MIFC), mtodo de Ritchie, Coprotest. Usados para a pesquisa de ovos e larvas de helmintos, cistos e alguns oocistos de protozorios;

y Flutuao espontnea: mtodo de Willis. Indicado para a pesquisa de ovos

leves (principalmente ancilostomdeos);

y Centrfugo-flutuao: o teste de Faust. Usado para a pesquisa de cistos e

alguns oocistos de protozorios, permitindo, tambm, o encontro de ovos leves.

y Concentrao de larvas de helmintos por migrao ativa, devido ao

hidrotropismo e termotropismo positivos: mtodo de Baermann-Moraes e mtodo de Rugai. Indicados para a pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis.

Sedimentao espontnea, Mtodo de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)y Mtodo de concentrao y Cistos, oocistos, ovos ou larvas y Procedimento: Colocar aproximadamente 2g de fezes em um frasco de Borrel (pode ser substitudo por copo plstico descartvel), com cerca de 5mL de gua, e triturar bem com basto de vidro (ou "palito de picol"). Acrescentar mais 20mL de gua. Filtrar a suspenso para um clice cnico de 200 mL de capacidade, por intermdio de tela metlica ou de nilon com cerca de 80 a 100 malhas por cm2, ou gaze cirrgica dobrada em quatro; os detritos retidos so lavados com mais 20mL de gua, agitando-se constantemente com o basto de vidro, devendo o lquido da lavagem ser recolhido no mesmo clice. Completar o volume do clice com gua.

Sedimentao espontnea, Mtodo de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)y Deixar essa suspenso em repouso durante 2 a 24 horas

Sedimentao espontnea, Mtodo de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)y Existem duas tcnicas para se colher o sedimento para

exame:

a. introduzir uma pipeta obliterada pelo dedo indicador at o sedimento contido no fundo do clice, retirar o dedo e deixar subir uma pequena poro do sedimento; recolocar o dedo e retirar a pipeta; b. desprezar o liquido sobrenadante cuidadosamente, homogeneizar o sedimento e colher uma gota do mesmo (esse procedimento melhor, pois a gota colhida mais representativa do sedimento).

y Colocar parte do sedimento numa lmina com uma gota

de lugol e fazer um esfregao. y O uso de lamnulas facultativo. Examinar com as objetivas de 10x e 40x. Deve-se examinar, no mnimo, duas lminas de cada amostra.

Sedimentao espontnea, Mtodo de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)y Mtodo mais utilizado y Barato y Sensvel para cistos de protozorios, ovos e larvas de

helmintos y Desvantagem: demorado y Coprotest formol 10% - facilita o procedimento paciente coleta j com o conservante e homogeiniza por 2 minutos o laboratorista somente continua o procedimento anterior y Paratest formol 5% com sistema de filtragem eficincia reduzida devido a quantidade pequena de amostra

Centrfugo-sedimentao, Mtodo de Ritchie, de Blagg ou formol-tery Baseia-se na sedimentao forada pela centrifugao y Ovos e larvas de helmintos, cistos e alguns oocistos de

protozorios y Procedimento:

Colher as fezes recm-emitidas em liquido conservador de MIF. Homogeneizar bem. Filtrar a suspenso de fezes em gaze dobrada em quatro ou em filtro descartvel, num copo plstico descartvel. Transferir 1 a 2mL do filtrado para um tubo cnico de centrifugao, com capacidade para 15mL Acrescentar 4 a 5mL de ter sulfrico e agitar vigorosamente (importante para desengordurar o material). Centrifugar por um minuto a 1.500rpm. Se formaro 4 camadas no fundo est o sedimento com os parasitos

Centrfugo-sedimentao, Mtodo de Ritchie, de Blagg ou formol-terCom o auxlio de um basto, descolar a camada de detritos da parede do tubo. Inverter o tubo para desprezar o liquido, mantendo-o com a boca voltada para baixo, at limpar a parede do mesmo, utilizando um basto de vidro (ou palito de picol) contendo algodo na extremidade. Inverter o tubo em uma lmina, deixando escoar todo o sedimento. Se a quantidade de sedimento for excessiva, utilizar uma pipeta para colh-lo e preparar as lminas. Colocar uma gota de lugol Cobrir com lamnula e examinar com as objetivas de 10 e 40X em zig-zag

Centrfugo-sedimentao, Mtodo de Ritchie, de Blagg ou formol-tery Mtodo dos mais recomendados y Rpido y Fcil y Sensvel y Desvantagem: necessita de centrfuga

Centrfugo-flutuao ou Mtodo de Fausty Indicado para pesquisa de cistos de protozorios; ovos leves

de helmintos podem ser detectados algumas vezes y Procedimento

Diluir 10g de fezes em 20mL de gua filtrada. Homogeneizar bem. Filtrar atravs de gaze dobrada em quatro, num copo plstico, e transferir para um tubo de centrfuga. Centrifugar por um minuto a 2.500rpm. Desprezar o lquido sobrenadante e ressuspender o sedimento em gua. Repetir as operaes 4 e 5 mais duas ou trs vezes, at que o lquido sobrenadante fique claro.

Centrfugo-flutuao ou Mtodo de Faust

Desprezar a gua sobrenadante e ressuspender o sedimento com uma soluo de sulfato de zinco a 33%, densidade de 1,18g/mL. Centrifugar novamente por um minuto a 2.500rpm. Os cistos e alguns oocistos de protozorios e os ovos leves, presentes na amostra fecal, estaro na pelcula superficial. Recolher a pelcula com ala de platina, colocar numa lmina, acrescentar uma gota de lugol e cobrir com lamnula. Examinar com as objetivas de 10x e 40 x.

y Observao: O material deve ser examinado

imediatamente, pois o contato com a soluo de sulfato de zinco pode deformar as formas parasitrias, especialmente os cistos de protozorios.

Flutuao espontnea ou Mtodo de Willisy Bom para pesquisa de ovos leves como de

ancilostomdeos y Procedimento:

Colocar 10g de fezes em um frasco Borrel (pode ser usado o prprio frasco no qual as fezes foram enviadas). Diluir as mesmas em soluo saturada de acar ou sal (NaCl). Completar o volume at a borda do frasco. Colocar na boca do frasco uma lmina, que dever estar em contato com o lquido. Deixar em repouso por cinco minutos. Findo esse tempo, retirar rapidamente a lmina, voltando a parte molhada para cima. Levar ao microscpio e examinar com objetiva de 1ox e 40x.

Mtodo para demonstrao de larvas de helmintoy Avaliao de larvas de helmintos y Baseado no hidrotropismo e termotropismo das

larvas y Necessidade de fezes frescas e sem uso de conservantes y Importante redobrar os cuidados a fim de evitar contaminao no laboratrio.

Mtodo de Baermann-Moraesy Necessrio ter preparado o aparelho de Baermann suporte de

madeira com orifcios para os funis que sero utilizados y Procedimento

Utilizar 8 a 10g de fezes. Colocar numa gaze dobrada em quatro ou em uma peneira. Colocar o material assim preparado sobre um funil de vidro, contendo um tubo de borracha conectado a extremidade inferior de sua haste. Obliterar o tubo de borracha com uma pina de Hoffhan e adicionar, ao funil, gua aquecida (45C) em quantidade suficiente para entrar em contato com as fezes. Deixar uma hora em repouso. Findo esse tempo, colher 5 a 7mL da gua, em um tubo de centrfuga, abrindose a pina. Centrifugar a 1.000rpm por um minuto. Colher o sedimento, sem desprezar o liquido sobrenadante e examinar ao microscpio (10x). Caso se detecte a presena de larvas, essas devero ser coradas com lugol e observadas com a objetiva de 40x, para identificao

Mtodo de Baermann-Moraes

Mtodo de Rugaiy Retirar a tampa do recipiente que acondiciona as fezes e

y

y y y y y

envolv-lo em uma gaze dobrada em quatro, fazendo uma pequena "trouxa". Colocar o material assim preparado, com a abertura voltada para baixo, num clice de sedimentao, contendo gua aquecida (45C), em quantidade suficiente para entrar em contato com as fezes. Deixar uma hora em repouso. Retirar cuidadosamente a trouxa Colher o sedimento no fundo do clice, com a ajuda de uma pipeta. Examinar no microscpio, com a objetiva de 10x. Corar as larvas com o lugol e observ-las com o maior aumento, para identificao.

Mtodo de Rugai

Mtodo quantitativo Kato-Katzy Preparar uma soluo de verde malaquita (essa soluo tem a

y

y y

y

finalidade de conservar as fezes e clarificar as formas parasitrias), de acordo com a seguinte frmula: Glicerina 100mL, gua destilada 100mL, Verde-malaquita a 3% 1 mL Cortar papel celofane semipermevel em pedaos de 24mm por 30mm e deix-los mergulhados na soluo de verde malaquita por pelo menos 24 horas. Colocar, sobre um papel higinico, uma poro da amostra de fezes frescas sem conservantes. Comprimir as fezes com um pedao de tela meilica (marca IBRAS So Bemardo do Campo - no 120 fios, urdume e trama: 0,091nm) ou similar de nilon. Nesta malha passam ovos de helmintos e detritos menores do que eles. Retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e transferi-las, com o auxlio de um palito, para o orificio (6mm de dimetro) de um carto retangular de plstico, colocado sobre uma lmina de microscopia.

Mtodo quantitativo Kato-Katzy Aps encher completamente o orificio, retirar o carto,

cuidadosamente, deixando sobre a lmina de vidro. y Cobrir as fezes com a lamnula de papel celofane embebida na soluo de verde malaquita, inverter a lmina, sobre uma folha de papel absorvente e comprimi-la. y Aguardar uma a duas horas e examinar ao microscpio, contando todos os ovos presentes na preparao. y O nmero de ovos encontrados no esfregao fecal, multiplicado por 23, corresponder ao nmero de ovos por grama de fezes (OPG).

Situao atual do diagnstico parasitolgicoy Mdico s vezes pouco capacitado na indicao do

exame, na orientao coleta de material e na interpretao dos resultados. Pouca confiana no resultado do laboratrio. Tratamento prvio. y Paciente Coleta incorreta, atribui pouca importncia infeco parasitria, questes culturais. Auto-medicao. y Laboratrio exame trabalhoso, pouco padronizado, no automatizado, variabilidade intra e interobservadores, profissional pouco valorizado, qualificao profissional insuficiente, pouco compromisso/envolvimento, sobrecarga, mtodos adaptados (no originais)

Informaes Importantes na Solicitaoy Dados scio-demogrficos (sexo,idade, escolaridade,

ocupao, procedncia) y Indicao clnica: sintomatologia, investigao diagnstica, acompanhamento do tratamento, controle de cura, tratamento prvio ao diagnstico, rotina pr-natal/ pr-operatria.

Questionamentos Importantes na entrega do materialy Ingesto prvia de medicao, compostos qumicos

na semana anterior ao exame y Forma de coleta, tempo de coleta, preservao do material, intercorrncias na coleta.

Sensibilidade X Especificidadey SENSIBILIDADE y Um teste sensvel quando seu resultado positivo em

indivduos doentes. Pouco falso-negativo

y ESPECIFICIDADE y Um teste especfico quando seu resultado negativo em

indivduos no doentes. Pouco falso-positivo

y EPF - BAIXA SENSIBILIDADE (muitos falsos

negativos) e ALTA ESPECIFICIDADE (poucos falsos positivos)

Causas de negatividade no exame parasitolgicoy EVITVEIS PROFISSIONAIS y Treinamento y Escolha do mtodo (sensibilidade) y Inadequao do mtodo y Leitura parcial da lmina y Sobrecarga de trabalho

Causas de negatividade no exame parasitolgicoy INEVITVEIS - BIOLGICAS y A) Protozorios - perodos de negatividade y B) Helmintos infeco unissexual por espcimes machos fmeas sexualmente imaturas aps eliminao do verme adulto carga parasitria leve irregularidade na postura/eliminao

Controle de qualidadey Treinamento dos profissionais y Controle externo de qualidade:

CONTROL- LAB SBPC/ML PNCQ SBAC INTERLABORATORIAIS INTERNACIONAIS: CAP Amostra cega amostra j processada no dia Pool de amostras positivas ( COCOTECA ) Amostras conservadas com parasita nico Lminas com colorao permanente Lminas da rotina.

y Controle interno de qualidade

Laudo finaly Reportar todos os parasitas encontrados

Sempre com os nomes cientficos: grifados, ou em itlico, ou em negrito Colocar o estgio de diagnstico identificado

Exemplo: y Foram encontrados:

Ovos de Hymenolepis nana Ovos de Hymenolepis nana Ovos de Hymenolepis nana Larvas de Strongyloides stercoralis Larvas de Strongyloides stercoralis Larvas de Strongyloides stercoralis

Laudo finaly Para ausncia de parasitos, reportar:

Exemplo y Negativo - No foram visualizadas formas diagnsticas de parasitas Ou y Negativo - No foram visualizadas formas diagnsticas de parasitas, na amostra enviada

Laudo finaly Reportar o(s) mtodo(s) utilizado(s). y Reportar nmero de amostras analisadas:

Ex. resultado positivo ou negativo e na Obs. o n de amostrasy Reportar parasitas que no foram diferenciados

Ex. cistos de Entamoeba histolytica /dispar