CONTROLE MICROBIOLOGICO 80 SEM

Prof. Sebastiao Salazarsalazarjansem@gmail.com

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Controle Microbiolgico de Produtos Farmacuticos e Cosmticos No Estreis

Aspectos GeraisProdutos no estreis so aqueles nos quais se admite conceitualmente a presena de carga microbiana, embora limitada, tendo em vista as caractersticas de sua utilizao;Em condies ordinrias de uso tero contato com reas portadoras de flora microbiana natural, constituda de saprfitas em nmero por vezes elevado;A ateno no controle dos produtos no estreis assegura que a carga microbiana presente no produto, seja no aspecto qualitativo ou quantitativo, no comprometa a sua qualidade final ou a segurana do paciente;

Aspectos GeraisO objetivo imediato comprovar a ausncia de microrganismos patognicos e determinar o nmero de microrganismos viveis, em funo dos tipos de utilizao do produto;

Padres MicrobianosAs primeiras incluses de limites microbianos aplicados a produtos farmacuticos e seus insumos ocorreram de forma vaga, como a recomendao de ausncia de emboloramento;No formulrio Nacional de 1970 e na 18 Edio da Farmacopia, do mesmo ano, a expresso foi modificada para:

Padres MicrobianosDrogas vegetais e animais devero estar, o mximo possvel, isentas de microrganismos, sendo que os patognicos no devero estar presentes; interessante lembrar que o primeiro insumo farmacutico com especificao relativa qualidade microbiolgica foi a gelatina, na USP XII de 1942, com o limite tolerado, em funo de sua origem, de 104 bactrias totais por grama;Esta especificao foi alterada diversas vezes, tendo passado por 5x103/g, na 18 Edio; 104/g, na edio seguinte e, finalmente, 103/g a partir da 20 Edio;

Padres MicrobianosAlm dessa exigncia quantitativa havia outro requisito, isto , ausncia de patgenos especficos numa determinada tomada de ensaio, sendo que este aspecto foi se tornando mais exigente;10 mg ou menos USP XXII;Com a tomada de ensaios de:10 mg USP XVI;10 g ou menos USP XVIII;ALTERADA PARAALTERADA PARA

Padres MicrobianosEm relao aos fitoterpicos, a Portaria n 123 de 19 de outubro de 1994, na Norma Tcnica para Registro de Fitoterpicos, estabelece a seguinte especificao para matrias-primas vegetais:Menos que 104/g de leveduras ou fungos;Menos que 105/g de total de viveis;Menos que 103/g de enterobactrias;Ausncia de Salmonella sp., P. aeruginosa, S. aureus, E. coli e fungos da famlia Aspergillus;

Padres MicrobianosApesar do reconhecimento, h muitos anos, da importncia do controle microbiano de produtos no estreis, a implantao e aceitao dos padres sanitrios tem ocorrido lentamente;Produtos cosmticosQuanto aos produtos cosmticos, a CTFA (Cosmetic Toiletry and Fragrance Assoc.) adotou limites de tolerncia que se tornaram referncia internacional. Estes limites so no mais que 500 microrganismos por grama em produtos para bebs e naqueles utilizados na rea dos olhos e de no mais que 1000 microrganismos por grama para todos os outros, alm de mencionar que nenhum produto deve ter contedo microbiano considerado nocivo para o usurio;

transporte e preparao da amostra para anlise;Mtodos de AnliseEnvolvem tanto os medicamentos no estreis quanto os cosmticos, abrangem trs etapas fundamentais:Amostragem englobando coleta;

Mtodos de AnliseDeterminao numrica ou contagem das formas viveis;

Mtodos de AnliseIsolamento e identificao dos microrganismos indesejveis a serem pesquisados;

A amostragem a ser efetuada para investigao quanto ao atendimento aos padres microbianos deve ser:AmostragemEm se tratando de sacos ou barricas contendo matria-prima no estril na forma pulverizada, dispositivos de amostragem devem permitir a obteno de fraes da parte inferior, mediana e superior de cada um de (raiz de N ou raiz de N + 1) do nmero total dos recipientes;

Nos processos contnuos, a segmentao como incio, meio e fim do processo deve estar contemplada na amostragem;AmostragemConsiderando o produto terminado, toma-se via de regra duplicata ou triplicata da amostra, representando incio, meio e fim do processo de enchimento, admitindo que aps o fechamento do material de acondicionamento a introduo de contaminantes no mais existir;O transporte deve ser em condies adequadas de temperatura;

Quantidade a ser analisada:AmostragemNo caso do volume total da amostra ser de 10 g(mL), ou inferior, este total deve ser analisado. A tomada de ensaio pode ser reduzida para 1 g(mL) em amostras de produtos de alto valor agregado;A recomendao das principais farmacopias, para enriquecimento na pesquisa de patognicos , geralmente, de 10 g(mL), alm da contagem total em igual quantidade;

Preparao da amostra:AmostragemA primeira preocupao ao preparar a amostra consiste na verificao da atividade antimicrobiana do produto devido presena de conservantes na frmula;Estes devem ser inativados com substncias adequadas, conforme sua natureza qumica;

Preparao da amostra:AmostragemA adio dos inativantes, previamente esterilizados por algum dos processos eficientes, deve ser previamente validada;Outro cuidado importante, para no impedir o crescimento microbiano, o ajuste do pH do produto diludo para a faixa da neutralidade;

Preparao da amostra:AmostragemA homogeneizao da amostra fundamental no sentido de conduzir a transferncia para etapas subsequentes de forma representativa, ainda que a mesma tenha sido diluda por exemplo em soluo salina peptonada (0,1 %), soluo tamponada (pH 7,0) ou caldo lactose;Algumas formas farmacuticas ou cosmticas podero exigir tratamento especfico, no sentido de permitir o contato ntimo da amostra com o meio diluente:Assim, no caso de produtos em aerossol, em que a tomada de amostra pode considerar o peso da embalagem antes e aps expelir alquotas do produto e propelente, este ser naturalmente eliminado;

Produtos com fase oleosa exigem a adio de agente tensoativo, cuja concentrao deve ser cuidadosamente definida para evitar efeito inibidor sobre possveis microrganismos contaminantes;Preparao da amostra:AmostragemForma de manuseio operacional trabalhosa o sabonete, que exige fragmentao criteriosa, seguida de leve aquecimento, recurso tambm aplicvel no caso de supositrios e pomadas;

Em meio slido, com semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate);Mtodos de Contagem de MicrorganismosEm meio slido, com semeadura da amostra em superfcie;Membrana filtrante;Nmero mais provvel;

O meio de cultura estril fundido e resfriado a 45 48C, em quantidade de cerca de 20 mL, vertido sobre cada uma das placas contendo amostra, realizamos ento a homogeneizao com movimentos em S ou 8 sobre a bancada de trabalho, as quais permanecem at solidificao a temperatura ambiente;Pour Plate:Mtodos de Contagem de MicrorganismosConsiste na transferncia de alquota de 1 a 2 mL da diluio da amostra (de cada diluio a ser considerada) para rplicas de placas de Petri estreis (usualmente de 2 a 3 a cada diluio);

Pour Plate:Mtodos de Contagem de MicrorganismosSegue-se incubao das placas, em estufa, na posio invertida; Aps 2 a 5 dias de incubao a 30 35C, para bactrias e 5 a 7 dias para bolores e leveduras, a 20 25C, as colnias so contadas;

Pour Plate:Mtodos de Contagem de MicrorganismosPara contagem total de bactrias os meios oficialmente recomendados so principalmente gar casena-soja e gar nutriente;Para fungos, gar Sabouraud-dextrose e gar batata;

A escolha do meio de cultura, condies de incubao e clculos para determinao da carga contaminante vivel equivalem ao descrito para a tcnica Pour Plate;Semeadura da amostra em superfcie:Mtodos de Contagem de MicrorganismosO meio de cultura preparado e distribudo previamente em placas de Petri. Empregando-se pipetas estreis, volumes de 0,1 a 0,5 mL de cada diluio considerada so distribudos na superfcie do gel j solidificado, sendo o espalhamento efetuado com movimentos cuidadosos ou com o auxlio de basto de vidro ou ala de Drigalski;Na dependncia da densidade da amostra, haver absoro total pelo meio. As placas invertidas so ento incubadas;

O clculo para determinar o nmero total de contaminantes viveis igual ao descrito anteriormente;Membrana filtrante:Mtodos de Contagem de MicrorganismosAlquotas do produto sob forma lquida ou suas diluies so filtradas atravs de membranas apropriadas (0,45 mm ou 0,20 mm de poro e 47 mm de dimetro, constitudas em derivados celulsicos), seguindo-se a deposio das membranas, na mesma posio, sobre placas contendo meio de cultura;Esta metodologia vantajosa por permitir volumes elevados na amostragem e pela acuidade, apresentando recomendao especial para amostras contendo agentes antimicrobianos;

Nmero mais provvel (NMP):Mtodos de Contagem de MicrorganismosA determinao do NMP de microrganismos se baseia em estimativa fundamentada em probabilidade. Assim, indica o valor dentro de uma faixa que reflete o nmero de microrganismos presente;Embora apresentando impreciso maior que os outros mtodos descritos, ainda recomendado e muito empregado, inclusive como mtodo oficial, no controle microbiolgico de medicamentos, cosmticos, alimentos e guas;

Nmero mais provvel (NMP):Mtodos de Contagem de MicrorganismosUma vantagem de seu emprego consiste em permitir melhor revitalizao dos microrganismos debilitados, em funo do perfeito contato da amostra com o meio de cultura, enquanto o uso do meio slido fundido seria fator adicional de estresse, uma vez que a temperatura do meio, no momento da homogeneizao da amostra no seria favorvel a esses contaminantes;Embora permita avaliao de amostras com nveis elevados de contaminao, sua indicao para situaes nas quais se espera valores baixos de contagem;

Nmero mais provvel (NMP):Mtodos de Contagem de MicrorganismosA metodologia emprega meios lquidos, usando-se diluies seriadas das amostras inoculadas nos mesmos. Exige a disponibilidade de tabelas estatsticas especficas para obteno de resultados a partir das leituras;O nmero de rplicas empregadas a cada diluio pode variar, sendo mais comuns tabelas construdas a partir de 3 ou 5 rplicas. No clculo de contaminantes da amostra deve ser considerado ainda o fator de diluio utilizado;

Procedimentos:Pesquisa de Patognicos EspecficosOs procedimentos bsicos sofrem pequenas distines entre os compndios oficiais de diferentes pases, entretanto os aspectos bsicos so mantidos;Meios de Enriquecimento:As tomadas de ensaio recomendadas so da ordem de 10 g(mL), quantidade que pode ser simultaneamente usada para promover o enriquecimento no seletivo;Para pesquisa de E. coli e Salmonella sp., em 100 mL de caldo lactose e para pesquisa de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, 100 mL de casena-soja;

Pesquisa de Patognicos EspecficosMeios de Enriquecimento:A incubao deve ser a 36 1C, durante 24 a 48 horas;Para Salmonella sp., procede-se tambm ao enriquecimento seletivo, tomando-se volumes de 10 mL da suspenso resultante do enriquecimento no seletivo, para os caldos tetrationato e selenito-cistina, em volumes de 100 mL, ento incubados em estufa, durante 24 horas a 36 1C;Meios de Diferenciao:Aps enriquecimento, alquotas so transferidas, por repique, no geral por estria ou por picada, para meios de cultura para isolamento e de diferenciao;

Pesquisa de Patognicos Especficos

Pesquisa de Patognicos EspecficosMeios de Diferenciao:Staphylococcus aureus;gar Baird-Parker (colnias pretas, halo transparente):De uso especfico para estafilococos coagulase-positivos, este meio contm cloreto de ltio e telurito em concentraes que inibem a flora acompanhante;Simultaneamente, o piruvato e a glicina estimulam seletivamente o crescimento de estafilococos;Devido presena de gema de ovo no meio de cultura, as colnias de estafilococos apresentam halos transparentes originados por liplise ou protelise; o meio de cultura opaco devido lecitina. Adicionalmente, originada a colorao negra devido reduo do telurito;

Pesquisa de Patognicos EspecficosMeios de Diferenciao:Staphylococcus aureus;gar Vogel-Johnson (colnias pretas, halo amarelo):Trata-se de meio adequado para a investigao de estafilococos manitol-positivos. Considerando a capacidade de reduo do telurito e a fermentao do manitol deste grupo de microrganimos;A concentrao elevada de manitol e a adio de vermelho de fenol como indicador de pH facilitam a visualizao desta caracterstica;Os estafilococos em geral apresentam-se tolerantes frente a concentraes elevadas de sais como cloreto de sdio e cloreto de ltio. Este gar devido presena de cloreto de ltio, inibe o crescimento de microrganismos indesejveis. A produo de cido a partir de manitol responsvel pelo halo amarelo caracterstico;

Caracteriza-se por formulao adequada para a investigao de estafilococos. Devido elevada concentrao salina impede o crescimento da maioria das outras bactrias, exceto alguns microrganismos halfilos. A degradao do manitol a cido comprovada pela viragem do indicador de pH vermelho de fenol;Pesquisa de Patognicos EspecficosMeios de Diferenciao:Staphylococcus aureus;gar Manitol (colnias amarelas, halo amarelo):

Tanto a formao do pigmento verde piocianina como o aspecto fluorescente das colnias luz ultravioleta ocorrem neste meio;Valoriza a deteco do pigmento piocianina, reconhecido pela fluorescncia azul;gar Pseudomonas para Fluorescena(colnias claras e amarelas, com fluorescncia amarela):Pesquisa de Patognicos EspecficosMeios de Diferenciao:Pseudomonas aeruginosa;gar Cetrimida (colnias esverdeadas, com fluorescncia):Emprega brometo de sal de amnio quaternrio de cetiltrimetilamonio (cetrimida) como agente seletivo, com notvel poder inibitrio sobre microrganismos distintos de Pseudomonas aeruginosa;gar Pseudomonas para Piocianina(colnias esverdeadas, com fluorescncia azul):Tambm de composio semelhante, porm facilitando a visualizao da fluorescncia amarelo-esverdeada;

Pesquisa de Patognicos EspecficosMeios de Diferenciao:Escherichia coli;gar Mac Conkey (colnias vermelho-tijolo a prpura, com halo de precipitao de bile):Consiste em meio seletivo para o isolamento de Salmonelas e bactrias coliformes, caracterstica decorrente de seus componentes sais biliares e cristal violeta, que inibem a flora Gram (+);A lactose, tambm presente na composio, tem sua degradao evidenciada devido presena do indicador de pH vermelho neutro;As colnias lactose-negativas so incolores (Salmonella sp.) e as lactose-positivas so vermelho-violeta com halo turvo, devido diminuio do valor de pH e a precipitao dos cidos biliares (Escherichia coli), ou rosadas e mucides (Enterobacter, Klebsiella);

Pesquisa de Patognicos EspecficosMeios de Diferenciao:Escherichia coli;gar Eosina-Azul de Metileno (EMB) (colnias vermelho-escuras, brilho metlico):Usualmente empregado na identificao de Escherichia coli, este meio de cultura apresenta contedo rico em corantes, que inibe os microrganismos Gram (+);Enquanto colnias de Enterobacter aerogenes se apresentam com centro cinzento, aquelas de Escherichia coli, graas sua interao com a eosina e o azul de metileno, apresentam colnias tpicas com brilho metlico esverdeado e centro escuro, inconfundveis;

Pesquisa de Patognicos EspecficosMeios de Diferenciao:Escherichia coli;gar Endo (colnias rosadas a vermelhas, brilho metlico):Meio de cultura para identificao de coliformes fecais, devido ao seu contedo de sulfito sdico e fuccina reprime consideravelmente o crescimento de bactrias Gram (+);Os coliformes que degradam a lactose produzem aldedo e cido. O aldedo, por sua vez, libera fuccina a partir da combinao fuccina-sulfito, conferindo s colnias a colorao vermelha. No caso de Escherichia coli esta reao apresenta tal intensidade que promove a cristalizao da fuccina, o que resulta em colorao das colnias com brilho metlico estvel, com reflexos verdes;

O efeito seletivo destes meios de cultura baseia-se no seu contedo de verde brilhante, inibindo a flora Gram (+) acompanhante. O efeito diferenciador deve-se ao fato de as colnias de microrganismos fortemente redutores apresentarem uma elevada presso de eltrons na parte central, que diminui na periferia;Portanto, no centro destas colnias ocorre reduo a sulfeto de ferro, ocorrendo a colorao negra. Ao redor, apenas possvel a reduo dos ons bismuto a bismuto metlico, acarretando o surgimento de brilho metlico na periferia da colnia;Pesquisa de Patognicos EspecficosMeios de Diferenciao:Salmonella sp.;MEIOS DE ENRIQUECIMENTO SELETIVO Caldo Selenito-Cistina e Caldo Tetrationato;MEIOS DE ISOLAMENTO gar Verde Brilhante (colorao transparente) e gar Sulfito de Bismuto (colnia preta ou esverdeada);

Pesquisa de Patognicos EspecficosMeios de Diferenciao:Salmonella sp.;gar Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD) (coln. Vermelhas, ncleo negro):Devido sua composio, e particularmente graas ao contedo reduzido de desoxicolato, adequado para demonstrar a presena de Salmonella e Shigella;A degradao dos aucares xilose, lactose e sacarose da sua composio a cido promove a viragem do indicador de pH vermelho de fenol a amarelo, indicativo de outras bactrias;O tiossulfato serve como substncia de reao e o sal de Ferro (III) como indicador da formao de sulfeto de hidrognio, visualizado ento nas colnias negras de sulfeto de ferro;

Pesquisa de Patognicos EspecficosMeios de Diferenciao:Salmonella sp.;gar Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD) (coln. Vermelhas, ncleo negro):As bactrias que descarboxilam lisina cadaverina so reconhecidas por promoverem a colorao prpura ao redor das colnias, devido elevao do valor de pH;Vrias destas reaes podem ocorrer simultnea e sucessivamente, permitindo originar matizes de colorao;Tambm, incubaes prolongadas podem promover inverses de viragem do indicador de pH, podendo ser inclusive devido evaporao dos cidos formados;

Pesquisa de Patognicos EspecficosMeios de Diferenciao:Salmonella sp.;gar Trplice Aucar-Ferro (colorao avermelhada na superfcie, amarela no fundo, precipitao de sulfeto de ferro):Possibilita a investigao de Proteus, Hafnia, Providencia e outras bactrias que no fermentam a lactose ou o fazem muito lentamente, mas que fermentam a sacarose de maneira relativamente rpida;A degradao de acar com formao de cido pode ser comprovada pelo indicador vermelho de fenol, que passa para a colorao amarela, e a alcalinizao decorre em cor vermelho-escura (Salmonella sp.). O tiossulfato sofre reduo a sulfeto de hidrognio por alguns microrganismos, o que por reao com sal frrico produz sulfeto de ferro, de cor negra;

Pesquisa de Patognicos EspecficosMeios de Diferenciao:Salmonella sp.;gar Trplice Aucar-Ferro (colorao avermelhada na superfcie, amarela no fundo, precipitao de sulfeto de ferro):O volume de meio de cultura dispensado no tubo e a sua solidificao so de forma a permitir que haja, no mesmo, uma poro inclinada para repique por estria superficial, e uma coluna na parte inferior para repique por picada, em profundidade;

Provas AdicionaisHavendo suspeita de presena destes microrganismos, e coerncia com a caracterstica micromorfolgica, deve ser seguida a pesquisa empregando outras provas bioqumicas e sorolgicas especficas conforme se faa necessrio;Capacidade de fermentao de diferentes acares;Potencial de aproveitamento de sais amoniacais como nica fonte de nitrognio e de citrato como nica fonte de carbono (gar citrato);Formao de acetona (reao positiva de Voges-Proskauer), reao de peroxidase, coagulase e outros;