UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA – UFBAINSTITUTO MULTIDISCIPLINAR DE SAÚDE – IMS

BIOQUÍMICA I

Profa. Ms. Danila Souza Oliveira Coqueiro

Roteiro de Aula Prática: Espectrofotometria

A capacidade que as diversas substâncias químicas têm de absorverem luz em determinados comprimentos de onda pode ser utilizada para a sua determinação quantitativa e qualitativa, uma vez que o espectro de absorção é característico para uma determinada substância e a quantidade de absorção (intensidade) é dependente da concentração do composto.

A determinação da concentração de um soluto em uma solução problema por espectrofotometria envolve a comparação da absorbância da solução problema com a solução de referência, na qual já se conhece a concentração do soluto. Em geral, é utilizada uma solução-padrão com diferentes concentrações (pontos), que tem sua absorbância determinada. Esses pontos são preparados diluindo-se a solução-padrão na proporção necessária para obtenção das concentrações desejadas.

Com os valores de absorbância e de concentração conhecidos, pode-se traçar um gráfico cujo perfil é conhecido como “curva-padrão” ou “curva de calibração”. Nesse gráfico, a reta, que deve passar obrigatoriamente pela origem, indica a proporcionalidade entre o aumento da concentração e da absorbância e a porção linear correspondente ao limite de sensibilidade do método espectrofotométrico para o soluto em questão.

OBJETIVO Determinar o espectro de absorção da solução de alaranjado de metila Caracterizar o comprimento de onda onde ocorre absorção máxima Construir uma curva-padrão para o corante no comprimento de onda () adequado

MATERIAIS E REAGENTESMateriais Reagentes Espectrofotômetro Agitador para tubos Grade com tubos de ensaio (10 ml) Pipeta automática de 1 ml Ponteiras de 1 ml Cubetas de vidro Papel guardanapo macio Frasco para descarte Água destilada Papel toalha

Alaranjado de metila 0,01 mg/ml (diluir 1mg em 100 ml de água)

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL1. Utilizar cubetas padronizadas (absorbâncias próximas no = 450 nm);2. Em uma cubeta, colocar 2 ml de alaranja de metila 0,01 mg/ml;3. Utilizando água destilada como branco, calibrar o espectrofotômetro em T = 100% (Abs = 0);4. Varrer o espectro com a solução conforme esquema abaixo, calibrando o espectrofotômetro com o

branco em cada utilizado:

5. Selecionar o máximo da solução para a

construção da respectiva curva-padrão;6. Utilizando o máximo, construir a curva-padrão para alaranjado de metila a partir do quadro 1.Quadro 1: Dados para construção das curvas-padrão de alaranja de metila

(nm) 430 440 450 460 470 480 490 500 510Abs alaranjado

de metila

Tubo Alaranjado de metila (ml)

Água (ml) Diluição (vezes)

Abs (nm) Concentração (mg/ml)

1 - 2,0 0,000 0,002 0,5 2,03 1,0 1,54 1,5 1,05 2,0 0,56 2,0 - 0,01

7. Com os dados do quadro, calcular quantas vezes cada tubo foi diluído utilizado a fórmula:

Diluição = volume final/volume da solução-mãe

8. Calcular a concentração das soluções de alaranjado de metila diluídas:

[ ]alaranja de metila = [ ] solução mãe/diluição

9. Colocar em gráfico, as leituras de absorbância (A) x concentração (mg/ml);10. Aplicar os dados à regressão linear, encontrando a equação da reta e o coeficiente de regressão linear

(R2)

AVALIAÇÃO

Será avaliada a participação dos alunos nas atividades propostas e a habilidade na elaboração do relatório.

QUESTÕES

1. Porque se utiliza um branco na dosagem espectrofotométrica de uma substância?2. Qual a importância de se utilizar uma curva-padrão quando se deseja quantificar uma determinada

amostra de concentração desconhecida?