Aula de Bioprocessos
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Estgios no processo produtivo
Aula 2 - Profa Dra Ilana L. B. C. Camargo Cincias Fsicas e Biomoleculares
IFSC - USP
1- Os trs estgios do bioprocesso
2- Biorreatores
3- Upstream
3.1 Escolha do Biocatalisador
3.2 Obteno do Biocatalisador
3.3 Conservao do Biocatalisador
Estgios no processo produtivo
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1. Os trs Estgios do bioprocesso
Biotecnologia do bioprocesso tem trs estgios:
Processo Upstream
Biorreatores e biorreao
Processo Downstream
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Upstream
Biorreao /Biorreator
Downstream
Bioprocesso aplicao industrial de reaes ou vias biolgicas
mediadas por clulas vivas inteiras de animais, plantas,
microrganismos ou enzimas sobre condies controladas para a
biotransformao de matrias primas em produtos
Bioprocesso tambm pode ocorrer sem resultar em um
produto direto biorremediao, desintoxicao de resduos
ou de efluentes com ou sem subproduto ou derivados
Produto alimento, medicamento ou composto industrial
Escala laboratorial Escala industrial
Estgios do processo produtivo
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2. Biorreatores
Biorreator ou fermentador
Biorreatores, reatores
bioqumicos, reatores biolgicos
so os reatores qumicos nos
quais ocorrem uma srie de
reaes qumicas catalisadas por
biocatalisadores
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Biorreator de 90L
Biorreator de bancada
http://www.faperj.br/boletim_interna.phtml?obj_id=3930
Biorreator ou fermentador
http://en.wikipedia.org/wiki/Bioreactor
3- Processo Upstream
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Processo Upstream
Escolha do biocatalisador
Preparo da matria prima ou substrato a ser processado
Preparao de meio e sua esterilizao
Alimentao do biorreator
Regulao de temperatura, pH e presso
Inoculao da cultura no meio assepticamente
Biorreao
Caractersticas gerais desejveis de microrganismos para aplicao industrial:
1. Apresentar elevada eficincia na converso do substrato
em produto;
2. Permitir o acmulo do produto no meio, de forma a se ter
elevada concentrao do produto no caldo fermentado;
3. No produzir substncias incompatveis com o produto;
4. Apresentar constncia quanto ao comportamento
fisiolgico;
5. No ser patognico
6. No exigir condies de processo muito complexas;
7. No exigir meios de cultura dispendiosos;
8. Permitir a rpida liberao do produto para o meio.
Processo Upstream
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1 - Apresentar elevada eficincia na converso do substrato em
produto;
Matrias-primas incidem pesadamente no custo do produto final
(38 a 73% do custo total de produo)
C6H12O6 2 C2H5OH + 2CO2
1 g glicose 0,511g de etanol
S. cerevisiae rendimento de 90% da reao de fermentao anaerbia
Destilao - perda
Quando o produto produzido em menor quantidade em relao ao acar
consumido (enzimas ou antibitico) o custo com a recuperao do
produtos so mais onerosas
Processo Upstream
2 - Permitir o acmulo do produto no meio, de forma a se ter elevada concentrao do produto no caldo fermentado; Sem sofrer inibio mais acentuada em virtude deste acmulo 3 -No produzir substncias incompatveis com o produto; Sem produzir proteases extracelulares Linhagens que crescem relativamente menos, ou que acumulem menos compostos intermedirios incrementam a sntese do produto
Processo Upstream
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3 -No produzir substncias incompatveis com o produto;
Exemplo: Aspergillus produz glicoamilase glicoamilase Amido Glicose Vrias aplicaes (xaropes de glicose na indstria de alimentos)
Alguns microrganismos tambm sintetizam transglicosidase que polimeriza a glicose novamente, porm de uma forma que
no so mais hidrolisadas pela glicoamilase
Processo Upstream
Caracterstica importante: Estabilidade fisiolgica da linhagem
No basta uma linhagem hiperprodutora de uma substncia,
mas que se conhea as tcnicas mais adequadas para sua
conservao e, mais ainda, que ela se mantenha como excelente
produtora da substncia de interesse ao longo de todas as
etapas envolvidas desde sua proliferao no laboratrio,
germinadores e biorreator principal
Processo Upstream
4. Apresentar constncia quanto ao comportamento fisiolgico
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Para a clula h sempre a tendncia de otimizar o crescimento,
em detrimento da sntese do produto, motivo pelo qual no
basta verificar se a clula cresce, mas se ela continua a
acumular o produto de maneira eficaz!!
Durante a proliferao da clula h sempre chances de
mutaes naturais!!
Massa pequena de clulas no inculo
Biorreatores de dezenas de milhares de litros 10g de matria seca de clulas/ L
Processo Upstream
5. No ser patognico!!
Sem riscos ambientais, particularmente nas etapas
seguintes ao trmino da fermentao (downstream)
Se manuseasse microrganismos patognicos em reatores de
dezenas de milhares de litros, os cuidados teriam de ser bastante
aumentados, o que incidiria em custos adicionais
So utilizados patgenos para produo de vacinas em reatores de
pequeno porte (poucos milhares de litros), porm confinados em
cmaras asspticas, tomando-se precaues necessrias para a no
contaminao do meio ambiente
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Tcnicos do Instituto Butantan trabalham na rea de fermentao da linha de produo de vacinas
http://planetasustentavel.abril.com.br/album/albumFotos_301191.shtml?foto=3
http://www.leptospirosenobrasil.com.br/index.php
Fort Dodge (Pfizer)
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6. No exigir condies de processo muito complexas
pH e Temperatura: em reatores de grande porte no h controle
preciso, por isso o ideal que o microrganismo tenha uma faixa
de valores timos dessas grandezas e no valores pontuais,
particularmente no que se refere ao acmulo do produto
Processo Upstream
Heterogeneidade ao longo da altura do reator
Reatores de grandes portes (dezenas de milhares de L)
Importante: clulas devem manter seu
desempenho dentro de uma faixa de
valores timos!!
pH e oxignio
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Biotecnologia do bioprocesso
6. No exigir condies de processo muito complexas
Tenso de oxignio: os microrganismos que conseguem manter
um bom desempenho quando cultivados em baixas concentraes
de oxignio so muito interessantes
H maior gasto de energia para
a agitao e aerao do meio!
Processo Upstream
Biotecnologia do bioprocesso
Tenso de oxignio:
Processo Upstream
Microrganismos que crescem de forma aglomerada (forma miceliar, por
exemplo) so evitados, pois a concentrao de oxignio no meio de
cultivo ter de ser mais elevada, a fim de que as clulas mais internas
destes aglomerados tenham acesso a este oxignio, quando
comparadas s clulas que crescem isoladamente
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Biotecnologia do bioprocesso
No conveniente trabalhar com linhagens que excretam uma
quantidade exagerada de protenas para o meio
Gerao de espuma.
Isso torna complexo os processos aerbios
devido necessidade de aerar e agitar o
contedo do biorreator
6. No exigir condies de processo muito complexas
Processo Upstream
Biotecnologia do bioprocesso
7. No exigir meio de cultura dispendioso
1. Ser o mais barato possvel;
2. Atender s necessidades nutricionais do microrganismo;
3. Auxiliar no controle do processo, como o caso de ser
ligeiramente tamponado, o que evita variaes drsticas do
pH, ou evitar uma excessiva formao de espuma;
4. No provocar problemas na recuperao do produto;
5. Os componentes devem permitir algum tempo de
armazenagem, a fim de estarem disponveis o tempo todo;
6. Ter composio razoavelmente fixa;
7. No causar dificuldades no tratamento final do efluente.
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Biotecnologia do bioprocesso
7. No exigir meio de cultura dispendioso
Meios sintticos ou definidos podem ser onerosos, mas tem composio
conhecida e podem ser reproduzidos a qualquer instante.
Para clulas que apresentam bom desempenho em meios desse tipo,
espera-se a ocorrncia de um sistema produtivo muito estvel, alm de
no apresentarem problemas quanto recuperao e purificao do
produto final.
Meios definidos ou sintticos podem ser preferidos se permitirem uma
maior economia nas etapas de recuperao do produto
Processo Upstream
Biotecnologia do bioprocesso
7. No exigir meio de cultura dispendioso
Algumas linhagens precisam de fatores de crescimento como aminocidos ou vitaminas (biotina, timina, riboflavina etc)
Adiciona-se as substncias puras para manter o meio em sua forma
mais definida No entanto... Isso pode se tornar invivel financeiramente quando as instalaes so de grande porte.
Alternativa: adicionar materiais complexos como extrato de levedura (autolisado de levedura), extrato de carne, extrato de malte, peptona (hidrolisado de protenas) etc Problema: substncias caras, composio varivel (ao longo do tempo de armazenagem e na dependncia do fabricante e do lote empregado) oscilao no processo fermentativo!!!
Processo Upstream
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Biotecnologia do bioprocesso
7. No exigir meio de cultura dispendioso
Meios mais complexos e menos caros empregados na maioria dos processos fermentativos em grande escala:
Matrias-primas naturais: caldo de cana-de-acar, melaos, farinhas diversas (farinha de trigo, milho, soja, cevada), gua de macerao de
milho (Corn Steep Liquor) etc
Composio qumica desconhecida
Pode-se conhecer os teores de aucares disponveis, nitrognio, fsforo,
mas no se conhecem os teores dos sais minerais
Sempre so completados com alguns sais (contento nitrognio e fsforo)
Variao conforme: solo, variedade do vegetal, safra, clima, processamento durante colheita e estocagem etc oscilaes no processo fermentativo!!
Processo Upstream
Biotecnologia do bioprocesso
7. No exigir meio de cultura dispendioso
Empresas que produzem antibiticos ou enzimas e que utilizam essas
matrias primas naturais, principalmente a gua de macerao de milho,
devem manter uma planta piloto para o ajuste da composio do meio a
cada novo lote de matria-prima recebida para evitar surpresas nos
biorreatores de grande porte
Por serem as mais baratas so as mais utilizadas
Porm podem causar problemas adicionais na recuperao e purificao
do produto final, bem como problemas nos tratamentos das guas
residurias
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Biotecnologia do bioprocesso
8. Permitir a rpida liberao do produto para o meio
Se o produto liberado no meio, ele poder ser recuperado nas
etapas seguintes de uma forma mais simples, sem a necessidade de
lise celular e outras reaes que elevam o custo
Se algum produto permanecer dentro das clulas ele poder ser
perdido aps a separao das clulas do meio aps a fermentao
Pode haver uma eventual inibio do prprio microrganismo pela
reteno de um dado produto do metabolismo
Reteno de certos produtos nas clulas depende entre outros
fatores de: linhagem empregada, da composio do meio de cultura e
das condies impostas (pH, temperatura, etc)
Processo Upstream
3.2. Obteno de Biocatalisadores
Processo Upstream
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3.2. Obteno de Biocatalisadores
Biocatalisadores que possam ter interesse industrial podem ser
obtidos basicamente das seguintes formas:
Isolamento a partir de recursos naturais
Compra em colees de culturas (ATCC, NCTC...)
Manipulaes genticas:
1. Obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais
2. Fuso de protoplastos
3. Obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de
engenharia gentica
Processo Upstream
Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais
Solo gua Plantas
Atividade de grande importncia para obteno de novas
linhagens de interesse industrial como linhagens melhor
produtoras de um dado produto. Alm disso, pode conduzir
descoberta de novos produtos, o que confere a esta
prtica uma relevncia inequestionvel
Muito trabalho experimental Custo relativamente elevado
Biotecnologia do bioprocesso
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Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais
Compra em colees de culturas
Agricultural Research Service Culture Collection - (EUA) American Type Culture Collection (ATCC) - (EUA) http://www.atcc.org/
Coleo de Culturas Tropical (Campinas-SP) http://www.cct.org.br
National Collection of Type Cultures (NCTC) - (Reino Unido) http://www.hpacultures.org.uk/aboutus/nctc.jsp
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Alemanha) Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade - INCQS Lab. de Microrganismos de Referncia - Fundao Oswaldo Cruz - FIOCRUZ
Disponveis em vrios pases Compra bastante vivel Facilidade atravs dos recursos da Internet
Microrganismos produtores de antibiticos, em geral, no esto disponveis em uma coleo de culturas
Oriundos de programas de melhoramento gentico
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Manipulaes genticas
1. Obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais
2. Fuso de protoplastos
3. Obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de
engenharia gentica
Biotecnologia do bioprocesso
Processo Upstream
Obteno de mutantes induzidos por
mtodos convencionais
Proliferao celular mutao natural
Isolados
Potencialidade de produo
- Mutantes naturais muito tempo - Mtodos que foram a mutao: radiaes ultra-violeta, substncias qumicas (nitrosoguanidina) Destri-se a maioria das clulas e recuperam-se as mutadas Verifica-se se a mutao ocorreu na direo desejada
Mutao deleo ou adio de uma ou mais partes qumicas
da molcula do DNA
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Penicillium chrysogenum NRRL 1951 Modificada por mutaes
Produo de penicilina aumentou de 120 UI para 2658 UI (~20x)
Mutao pode levar perda da funo de
caractersticas indesejadas ou aumento da
produo por perda das funes de controle
Raramente leva ao aparecimento de novas
funes ou propriedades
Utilizar em microrganismo com a
caracterstica desejada para melhoramento
Fuso de protoplastos Protoplastos Frgeis sem parede celular Sem capacidade reprodutiva
Sem parede celular, a probabilidade de fuso celular entre diferentes
espcies aumenta
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Protoplasto
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Protoplast_fusion.jpg
Protoplastos de clulas das folhas de petnias
Protoplasto de fuso da clula da folha com a da ptala
Digesto da parede celular
Meio isotnico
Fuso de protoplastos
Muito utilizados com leveduras, fungos filamentosos e plantas
1. Protoplastos so preparados cultivando as clulas em meios
isotnicos enquanto tratam-nas com enzimas;
2. Os protoplastos so regenerados usando estabilizadores osmticos
como a sacarose;
3. Se a fuso ocorre para formar hbridos, os recombinantes desejados
so identificados atravs de meios seletivos;
4. Aps a regenerao da parede celular, o microrganismo pode ser
utilizado para futuros estudos.
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- Fuso pode ser realada usando polietileno glicol e
tratamento das preparaes com irradiao ultravioleta
- Fuso de clulas humanas ou de animais
-Usado para o melhoramento da produo de antibiticos por
combinar mutaes de diferentes linhagens ou at mesmo
espcies
-Facilita a transferncia de DNA recombinante
-Mtodo de associar grupos inteiros de genes entre diferentes
linhagens de macro- e microrganismos
Fuso de protoplastos
Fuso de clulas de mamferos que levam produo de anticorpos monoclonais.
Anticorpos so a principal defesa dos mamferos. Uma clula de linfcito
B produz um nico tipo de anticorpo
A produo de linfcitos B em meios de cultura no teve sucesso pois eles ou morriam ou paravam de produzir anticorpos
1975 Georges Khler e Cesar Milstein
demonstraram a produo de anticorpos monoclonais de um hibridoma (produto de fuso) de Linfcitos B (clulas produtoras de anticorpos) e
clulas tumorais de mieloma
1984 Prmio Nobel
1990s o valor comercial de terapias por anticorpos sozinha valia US$ 6 bilhes!!!
Fuso de protoplastos
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Mudana:
Clulas secretoras de anticorpos
com tempo de vida limitado
Clulas com capacidade contnua de crescimento (imortais) que mantm o
potencial de secretar anticorpos
Fuso de protoplastos
Hibridomas podem ser congelados e re-utilizados mais tarde
Aplicaes do anticorpo monoclonal:
-Diagnstico in vitro em sade humana, plantas e agricultura
animal
-Futuro: terapia com anticorpos para carregar uma droga
citotxica para o stio de clulas cancergenas
-Biotecnologia industrial: usados como ligantes de alta
afinidade para ligar e purificar produtos caros
Fuso de protoplastos
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Diagnstico imunolgico
Aplicaes do anticorpo monoclonal
Obteno de microrganismos recombinantes por
tcnicas de engenharia gentica
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Linhagens instveis limitam o emprego de sistemas de
fermentao mais eficientes, como processos contnuos, pois
poder acontecer, ao longo do tempo, a seleo de clulas que
privilegiem o crescimento em detrimento do acmulo do produto
Linhagens naturais Linhagens mutantes Clulas recombinantes por introduo de plasmdeos podem ser instveis
Obteno de microrganismos recombinantes por
tcnicas de engenharia gentica
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3.3 - Conservao do Biocatalisador
Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no bioprocesso, ela deve ser conservada
Tcnicas de conservao:
1) Transferncia ou sub-cultura peridica em tubos ou placas
de Petri com meio de cultura slido (viabilidade: semanas)
2) Congelamento em freezers -20 C ou -70 C (anos)
3) Ultracongelamento: -196C, N lquido (anos)
4) Liofilizao: desidratao por sublimao da gua,
sob vcuo (anos ou dcadas)
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Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no bioprocesso, elas devem ser conservadas
Walsh G., Pharmaceutical Biotechnology, Willey ed., 2007
... 100
... 100
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Criotubos
Lento
Rpido
Desequilbrio osmtico
Fromao de cristais
intracelulares lise
Congelamento
Bactrias
Clulas de mamferos
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Manual de Criopreservao Nunc
Congelamento rpido minimiza os efeitos de concentrao do soluto pois o gelo forma
uniformemente
Congelamento lento, por outro lado, resulta em grandes perdas de gua da clula e
menos gelo intraceclular, mas aumenta os efeitos da soluo
Congelamento
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Agente de criopreservao
agente qumico que protege as clulas durante o
congelamento. Pode minimizar os efeitos prejudiciais do
aumento da concentrao do soluto e formao de cristal
Congelamento
Mais comuns: Dimetilsulfxido (DMSO) e glicerol (menos txico que DMSO). Escolha depende da clula!! Agentes de criopreservao podem penetrar na clula e causar um congelamento lento intracelular e diminuir os efeitos de soluo. DMSO - Diminui a temperatura de congelamento e permite melhor desitradao da clula antes do congelamento intracelular. DMSO penetra melhor nas clulas e geralmente mais usado para clulas maiores, mais complexas como os protistas.
4 - Produo de etanol
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Upstream
Biorreao /Biorreator
Downstream
Exemplo prtico: Produo de etanol
Upstream
Downstream
Obteno da matria prima; Tratamento/preparo Escolha do microrganismo Preparo do pr-inculo e inculo
Resduos dos gros
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Biotecnologia do bioprocesso
Smith J E, Biotechnology, ed. Cambridge, 2004
Biorreao Biorreatores
Pr-inculo
Inculo
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Biotecnologia do bioprocesso
Prximas aulas!!
- Obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de engenharia gentica
- Biorreatores
- Biorreao
-Processo Downstream
Referncias
Manual de criopreservao Nunc ver site da disciplina
Captulo 3 - Genetics and biotecnology (John Smith Biotechnology)
ver site da disciplina
Prescott, Harley and Klein. 2002 Microbiology, 5th edition, The McGraw-Hill (Chapter 42- Biochemistry - Industrial Microbiology And Biotechnology) ver site da disciplina
Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia
Industrial: Engenharia Bioqumica. Volume 2. Ed Edgard Blcher
LTDA, So Paulo, 2001. Cap. 2.