AULA PRÁTICA 04

PROPRIEDADES FÍSICAS E QUÍMICAS DAS PROTEÍNAS 02

I.Objetivos

Analisar o efeito do aumento da temperatura na solubilidade de proteínas;

Observar o efeito de agentes alcalóides, metais pesados e de solvente orgânico na solubilidade de proteínas;

Relacionar as observações práticas com a teoria de propriedades gerais, estrutura e isolamento de proteínas.

II. Introdução

Um processo para caracterizar as proteínas é a solubilidade em determinados solventes e/ou sob determinadas condições. A solubilidade é o resultado de um balanço entre as diferentes interações energéticas que ocorrem inter e intramolecular, via os grupos dos resíduos de aminoácidos (proteína:proteína) e entre a proteína e o solvente (proteína:solvente). Além disso, a presença de grupos carregados positivo ou negativamente de alguns resíduos de aminoácidos favorece a interação entre proteínas e íons presentes na solução. De uma maneira geral, qualquer fator que interfere na estabilidade e equilíbrio desse conjunto de interações provoca uma alteração na solubilidade de proteínas. Assim sendo, a precipitação de proteínas ocorre quando as interações intermoleculares proteína:proteína se tornam mais fortes do que as interações proteína:solvente. Desta forma, a solubilidade de uma proteína (assim como sua estrutura tridimensional) é dependente da concentração e natureza dos sais, polaridade do solvente, pH e temperatura.

As proteínas possuem uma estrutura tridimensional bem definida que está relacionada com suas propriedades físicas e biológicas. A desnaturação pode ser definida como a modificação na estrutura tridimensional nativa de uma proteína com conseqüente alteração de suas propriedades funcionais. A desnaturação é caracterizada por diminuição da solubilidade, perda da atividade biológica, aumento da reatividade dos grupos da cadeia polipeptídica, etc. A desnaturação envolve alterações nas estruturas quaternária, terciária e secundária das proteínas, mas não da estrutura primária. São vários os agentes desnaturastes de proteínas como, por exemplo, calor, ácidos, álcalis, solventes orgânicos, soluções concentradas de uréia e guanidina, sais de metais pesados, detergentes, etc.

As reações de precipitação, além de serem utilizadas para caracterizar a presença de proteínas em solução, também são úteis para proceder a desproteinização de soluções biológicas para análise de componentes não protéicos. Neste caso específico, a remoção de proteínas contaminantes é freqüentemente acompanhada por métodos drásticos de precipitação que acarretam em simultânea desnaturação protéica (agentes desnaturantes). Por outro lado, existem condições que

promovem precipitação de proteínas sem, contudo causar desnaturação. Estas condições são preferencialmente usadas em protocolos de purificação de proteínas que visam à manutenção da atividade biológica da proteína purificada.

As proteínas demonstram uma enorme variabilidade na solubilidade em função da concentração e natureza dos sais. Estes efeitos, freqüentemente complexos, podem envolver interações específicas entre grupos de aminoácidos carregados e íons em solução ou, particularmente, concentrações altas de sais podem refletir mudanças nas propriedades do solvente.

“Salting in”O efeito “salting in”: pode ser definido como sendo a propriedade

de certos sais em aumentar a solubilidade de uma proteína. Esta propriedade é freqüentemente relacionada com a capacidade de certos sais, como por exemplo: NaCl, em aumentar a força iônica da solução, o que leva a uma maior interação eletrostática entre os íons salinos e os grupos carregados da proteína. Cada um dos grupos iônicos da molécula protéica fica protegido por uma camada de íons salinos de carga oposta, impedindo interações mútuas entre as moléculas protéicas.

“Salting out”O efeito “salting out”: embora o aumento da concentração da

maioria dos sais inorgânicos resulte em aumento na solubilidade das proteínas, existem alguns poucos exemplos, tais como (NH4)2SO4 e Na2SO4, que causam um efeito inverso. Nestes casos, em altas concentrações, esses sais provocam uma diminuição significativa na solubilidade das proteínas. Esse efeito oposto é denominado “salting out” e ocorre com sais que efetivamente competem com a proteína pelas moléculas disponíveis de água, abaixando o grau de solvatação das proteínas.

Neste caso, as moléculas das proteínas tendem a se associarem entre elas porque em altas concentrações de sais as interações proteína:proteína se tornam energeticamente mais favoráveis do que as interações proteína:solvente. De uma maneira geral, íons que diminuem a solubilidade de proteínas estabilizam a estrutura nativa de tal forma que as proteínas que precipitam pela adição de sais não são desnaturadas.

III. Materiais e reagentes

Tubos de ensaioBeckerPipetas graduadasPipetas PasteurManta de aquecimentoSolução de ovoalbumina 10%Ácido tricloroacético (TCA 10%)NaCl 0,1MSolução saturada de sulfato de amônioÁlcool etílico absoluto

Acetato de chumbo 10%Água destilada

IV. Procedimentos experimentais

a) Desnaturação pelo calor:

1. Bater uma clara de ovo por alguns minutos. Juntar água suficiente para duplicar o volume obtido.

2. Filtrar a mistura obtida e guardar em geladeira.

Tubos 1Soluções 1,0 mL clara de

ovo(albumina)Banho Maria fervente 3

min

Observe, anote os resultados e explique.

Anotações:

b) Desnaturação por reagentes dos alcalóides:

1. Enumere 2 tubos de ensaios. 2. Ao tubo 1, adicione 1,0 mL de H2O e acrescente 1,0 mL de TCA 10%.3. Ao tubo 2, adicione 1,0 mL de clara de ovo e acrescente 1,0 mL de TCA

10%.

Tubos 1 2Soluções 1,0 mL de

H2O1,0 mL de clara de ovo

a 10%TCA 10% 1,0 mL 1,0 mL

Observe, anote os resultados e explique.

Anotações:

c) Desnaturação por metais pesados

1. Ao tubo 1, adicione 1,0 mL de H2O e 5 gotas de acetato de chumbo 10%

2. Ao tubo 2 adicione 1,0 mL de clara de ovo e acrescente 5 gotas de acetato de chumbo 10%

Tubos 1 2Soluções 1,0 mL de

H2O1,0 mL de clara de ovo

a 10%Acetato de

chumbo5 gotas 5 gotas

Observe, anote os resultados e explique.

Anotações:

d) Desnaturação por solventes orgânicos

3. Enumere 2 tubos de ensaios. 4. Ao tubo 1, adicione 1,0 mL de H2O e 3,0 mL de etanol.5. Ao tubo 2, adicione 1,0 mL de clara de ovo e acrescente 3,0 mL de

etanol 10%.

Tubos 1 2Soluções 1,0 mL de

H2O1,0 mL de clara de ovo

a 10%Etanol 3,0 mL 3,0 mL

Observe, anote os resultados e explique.

Anotações:

Questões1. Qual o papel do aumento da temperatura na desnaturação das proteínas?

2. O que ocorre quando TCA , acetato de chumbo e etanol são adicionados à solução

de clara de ovo?

3. Qual o efeito do NaCl sobre a solubilidade de proteínas?

4. Quais os níveis de organização que compõe a estrutura protéica e as forças que as

estabilizam?

5. Como podemos definir desnaturação? Quais os níveis de organização que afetam a

desnaturação? A desnaturação é sempre irreversível?