Terapia gênica Terapia gênicaAmanda Valle Pinhatti

Porto Alegre, outubro de 2012.

Farmacoterapia

Fase Biofarmacêutica:

-Formulação farmacêutica:

• Princípio ativo

• Adjuvantes: diluentes, agentes estabilizantes, conservantes, flavorizantes

-Formas farmacêuticas: comprimidos, cápsulas, drágea, injetáveis, pomadas, loções,cremes.

Farmacologia

Farmacocinética e FarmacodinâmicaRelação dose administrada X efeitos no organismo

Novo fármaco

•Propriedades físico -químicas

•Propriedades farmacológicas:

-Mecanismo de ação-Atividades metabólitos-Velocidade de absorção-Padrão de distribuição-Velocidade de eliminação/excreção-Local de ação-Duração ação-Degradação metabólica-Concentração mínima para o efeito-Concentração mínima de toxicidade

janela terapêutica

• Séc. XIX- início genética- Mendel

• 1953- estrutura do DNA – Watson e Crick

• 1979 -DNA recombinante

• 2003- sequenciamento do genoma-Collins. E Craig Venter

Visão biomolecular

Visão biomolecular

• Trilhões de células individuais no corpo humano

• Cada célula produz proteínas específicas para uma determinada parte do corpo: hepatócitos, hemácias, neurônios, etc

• A informação de qual proteína produzir é passada através

dos genes ~ 35.000 genes no Homo sapiens sapiens

Visão biomolecular

Como o DNA transmite informações?

Os genes influenciam praticamente todas as doenças humanas, seja pela codificação de proteínas anormais diretamente responsáveis pela doença, seja por determinar suscetibilidade a agentes ambientais que a induzem.

Farmacogenética

Área especial da genética-bioquímica que avalia a variabilidade na resposta a drogas, decorrente da variabilidade de um gene

Curvas dos níveis plasmáticos de nortriptilina para indivíduos com diferentes números de cópias funcionais do gene CYP2D6

Farmacogenética

A terapia gênica se baseia na introdução ou modificação de genes com o uso das tecnologias de DNA recombinante a fim de conferir uma nova função ou melhorar os efeitos de um gene anormal

Terapia gênica

TERAPIA GÊNICA

Terapia gênica X Farmacoterapia

Terapia Gênica Farmacoterapia Gene de interesse Pró-droga

Proteína expressa Droga

Elementos presentes nos plasmídeos (promotores e sítios de poliadenilação)

Excipientes

Vetor de transferência

Formulação farmacêutica

Sequência promotora do gene que regula a taxa da transcrição

Biodiponibilidade

Funções do Gene Introduzido

• Corrigir uma mutação de perda de função;

• Substituir ou inativar um alelo dominante

cujo produto anormal causa a doença;

• Degradação um mRNA mutante (e.i.

usando RNAi);

• Introdução de genes cujo produto tenha

ação farmacológica

Como se isolam genes de interesse?

TERAPIA GÊNICA

Representam, teoricamente, todo o material genético de um organismo clonado em um vetor – Genômica = clonada

diretamente do genoma

– cDNA = feita a partir de mRNA

Bibliotecas de DNA

Biblioteca Genômica

• Extração do DNA genômico;

• Clivagem com enzimas de restrição;

• Ligação dos fragmentos nos vetores;

• Transformação celular;

• Replicação do vetor

Bibliotecas de cDNA

Seleção do gene

É um fragmento de DNA de tamanho variado que é usado em amostras de DNA para detectar a presença de

sequências de nucleotídeos que são complementares a sequencia da sonda, emitindo fluorescência

TERAPIA GÊNICA

Vetores

A base da terapia gênica consiste na introdução de genes em células. Porém, a entrada de DNA puro através da membrana plasmática de células eucarióticas é extremamente rara.

Por conseguinte, há necessidade de um carreador que facilite a entrada do DNA nas células vivas. Esse veículo é denominado “vetor”.

Vetores• 3 classes principais:

vetor viral

vetor nanoestruturado

vetor plasmidial

Vetores virais

Vetores não virais• Plasmídeos

Vetores não virais

• Vetores nanoestruturados: polímeros e vesículas de lipídeos

Vetores Avanços: incorporação de polímeros, anticorpos, substratos

enzimáticos e ácidos nucléicos aprimoramento direcionamento e eficiência

TERAPIA GÊNICA

Porém, ele pode ficar comprometido pela presença de ...

• Interferentes da estabilidade do sistema terapêuticos• Interferentes na difusão a um tecido,• Proteínas circulantes e de proteínas da matriz extracelular

Uma vez dentro da célula-alvo:

• liberação do sistema no citoplasma,• transporte até o núcleo, • passagem por poros da carioteca ,• dissociação do DNA.

Demais eventos necessários para culminar na expressão da proteína de interesse.

O vetor deve chegar até a célula-alvo!

Transferência gênica

• métodos físicos: o transgene é introduzido de maneira mecânica na células ;

• métodos químicos: o vetor é alguma substância de origem química;

• métodos biológicos: emprego de organismos que naturalmente possuem a capacidade de transferir material genético, como os vírus ou algumas bactérias.

Tipos de Terapia Gênica

• Em células germinativas– Terapia de prevenção

• Introdução de um gene em gameta ou zigoto visando impedir a transmissão de um gene anormal para a geração seguinte

• Proibida em seres humanos

Ex- vivo: requer a retirada de células de um organismo para cultivo e manipulação in vitro, seguidos por subsequente reimplantação destas células no organismo. Seus principais atrativos são a ausência de resposta imunológica ao vetor e a maior eficiência de entrega deste.

In- vivo:• In situ: administração do vetor diretamente no

tecido alvo. De maior interesse clínico embora não seja apropriada para alguns tipos de tecidos

• Sistêmica: maior potencial de uso, embora o direcionamento de genes é insuficiente e alguns vetores são prontamente removidos pelo fígado

• Em células somáticas-Para fins terapêuticos

Tipos de Terapia Gênica

Aplicações da terapia gênica

Guidelines

• Pesquisa deve estar limitada a células somáticas

• O benefício terapêutico deve ser maior do que o risco

• A doença deve estar limitada a um único cromossomo e o gene normal já deve estar clonado e disponível

• Preferencialmente, a terapia deve envolver células que podem ser isoladas, modificadas em cultura, e re-introduzidas no paciente

SCID – ADA deficiency

Ashanti Desilva

1989

2011-12 YNPN Chicago Executive BoardAshanthi DesilvaMPA Student

Câncer

Câncer

Hemofilia

É uma doença monogênica.

O procedimento é o de introduzir o respectivo gene sadio (fator VIII ou fator IX, dependendo do tipo de hemofilia) em células do paciente, para que essas passem a produzir a proteína necessária

Amaurose congênita de Leber

Doenças cardiovasculares

Hepatite C

Doença de Parkinson

Os modelos experimentais pré-clínicos consistem em lesões químicas da substância negra em ratos ou em primatas. Foram testados vários tipos de vetores virais

No mercado...

No mercado...

• Segurança:toxicidaderesposta imuneintegraçãotransformação maligna integração às células germinativasreplicação viral por meio de recombinação

• Eficácia:Captação pela célula-alvoControle da expressão gênica

*A avaliação do sucesso do procedimento envolve a análise da manutenção de expressão do gene nas células transformadas e a correção da doença.

Problemas com a Terapia Gênica:

Ética Ensaios clínicos aprovação

• Embora não exista legislação específica no Brasil

• Comitês de ética locais e nacionais, como a Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (Conep)

• Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CtnBio)

• Aceita somente a terapia gênica em células somáticas/diplóides

• Pesquisadores dos Estados do RJ, SP e RS compõem 10 grupos de terapia gênica experimental strictu sensu.

• Os aspectos abordados incluem o desenvolvimento de vetores e suas aplicações em 5 classes principais de patologias: câncer, doenças hematológicas, doenças monogênicas, doenças degenerativas e doenças infecciosas.

Rede de Terapia Gênica

O Instituto do Milênio Rede de Terapia Gênica (IMRTG)

Rede de Terapia Gênica

UFRJ - Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - RJ UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo - SP USP - Departamento de Microbiologia - SP USP/INCOR - Instituto do Coração - SP INCA - Instituto Nacional do Câncer - RJ UFRGS - Departamento de Genética - RS HCPA - Hospital de Clínicas de Porto Alegre - RS IBU - Instituto Butantan - SP FFFCMPA - Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre - RS IC-FUC - Instituto de Cardiologia do RS - Fundação Universitária de Cardiologia - RS DBCD - Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento - SP FIOCRUZ/IOC - Instituto Oswaldo Cruz - RJ UFRGS - Departamento de Biofísica - RS

No futuro...

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amandapinhatti@gmail.com