Aula04 tecnicas diagnostico virologia parte 2 final
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VirologiaAno Lectivo 2010/11
Técnicas DiagnósticoVirologia – Parte II
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Detecção do genoma viral
Futuro do diagnóstico de vírus
Necessidade de equipamento e pessoal treinado
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 2
TÉCNICAS
Métodos de Amplificação
Polimerase Chain Reaction (PCR)
Restriction Fragment Lenght Position (RFLP)
Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)
Reverse Transcriptase - Polimerase Chain Reaction (RT- PCR)
Real-Time PCR
Sequenciação
Métodos de Hibridização
Captura Híbrida
Southern Blot
Hibridização em tiras
CHIPS
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 3
Extracção Ácidos Nucleicos
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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ExtracçãoÁcidos Nucleicos Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Líse alcalina;
Neutralização;
Precipitação de Proteínas e detritos celulares;
Purificação Ácidos Nucleicos
Precipitação
Eluição em colunas
5
ExtracçãoÁcidos Nucleicos Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 6
ExtracçãoÁcidos Nucleicos Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 7
ExtracçãoÁcidos Nucleicos Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Add DNase
Add RNase
+ DNase (protein)
+ RNase (protein)
Utilização Nucleases
Remoção DNA
Remoção RNA
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ExtracçãoÁcidos Nucleicos Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Avaliação Ácidos Nucleicos por Espectofotometria UV
Estimar a concentração de DNA e RNA a ~260nm.[dsDNA] ≈ A260 x (50 µg/mL)
[ssRNA] ≈ A260 x (40 µg/mL)
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Técnicas de Amplificação AN
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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PolymeraseChain Reaction Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 11
Amplifica um fragmento de DNA especifico;
Amplificação através de ciclos repetidos que vão permitir obter milhões de
cópias do fragmento pretendido;
Fragmento pretendido está localizado entre duas regiões de DNA de
sequência conhecida;
Região Alvo
5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’
3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’
PolymeraseChain Reaction Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 12
PolymeraseChain Reaction Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
MISTURA DE REACÇÃO:
DNA
Primers: Oligonucleótidos de cadeia simples comsequência complementar às sequências alvo doADN (idealmente 20-24 nucleótidos);
Buffer: Solução tampão para estabilizar a reacção;
Mg2+ (Magnésio): Ajuda na ligação dos nucleótidose estabilidade da Taq;
dNTP’s: Nucleótidos livres (A, T, C, G);
Taq polimerase: Enzima termo-estável (+/-72ºC)que efectua a cópia da sequencia alvo do ADN.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 13
PolymeraseChain Reaction Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
PROCEDIMENTO
1º Passo: Abertura do ADN cadeia dupla (T=95ºC);
2º Passo: Annealing/Ligação dos Primers (Ta~50 a 65ºC);
3º Passo: Activação da Taq polimerase (T~75ºC);
3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’
5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’
ATCCGAT (…) – 5’
5’ – (…) ATGCGTA
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 14
PolymeraseChain Reaction Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
PROCEDIMENTO
4º Passo: Repetição dos passos anteriores por 30-45 ciclos no máximo;
FINAL: Obtenção de 2nºciclos copias do fragmento alvo.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 15
PolymeraseChain Reaction Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Electroforese em Gel de Agarose:
Separa as moléculas (proteínas ou ácidos núcleicos) de acordo com o seupeso molecular;
DNA e RNA possuem carga eléctrica negativa migram para o pólo positivo(quanto mais pequenas mais migram);
Brometo de Etídeo que se vai intercalar na dupla hélice de ADN e possibilitara visualização dos fragmentos quando em exposição a luz UV;
Amostras da PCR carregadas no gel;
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 16
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PolymeraseChain Reaction Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Pólo Positivo (+)
Pólo Negativo (-)
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
PolymeraseChain Reaction
APLICAÇÕES
Detecção de sequências específicas de DNA viral
Detecção AdV em amostras respiratórias
Detecção EBV em biópsias Nasofaringe
Detecção JCV em LCR
...
DESVANTAGENS
Altamente sensível a contaminação com quantidades residuais de DNA.
Falsos positivos e artefactos.
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 18
Restriction Fragment LengthPolymorphism (RFLP)
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 19
Restriction Fragment LengthPolymorphism (RFLP)
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Baseada na técnica da PCR;
Análise de polimorfismos (mutações pontuais funcionais);
Variação no tamanho de fragmentos de DNA provocada pela actividadediferencial de enzimas de restrição (cortam o DNA numa sequência específica)
Presença de polimorfismo Perda ou ganho de local de restrição Variação no tamanho de fragmentos de DNA.
5’ – (…) ACTGA (…) – 3’
3’ – (…) TGACT (…) – 5’
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 20
Restriction Fragment LengthPolymorphism (RFLP)
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 21
Restriction Fragment LengthPolymorphism (RFLP)
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 22
Restriction Fragment LengthPolymorphism (RFLP)
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 23
APLICAÇÕES
Detecção de variantes Virais
Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia
Detecção variantes HPV – Associação com patologias
Detecção variantes EBV – Associação com agressividade
...
DESVANTAGENS
Todas as do PCR
Sensível a contaminação por DNAses
Artefactos
Single Strand ConformationPolymorphism (SSCP)
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 24
Single Strand ConformationPolymorphism (SSCP)
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Baseada na técnica da PCR;
Análise de polimorfismos/mutações;
Diferenças de sequência de um único nucleótido são suficientes para quecadeias simples de DNA adquiram uma conformação tri-dimensionaldiferente;
Gel de Poliacrilamida permite correr as amostras (apenas em cadeiasimples/desnaturadas) em função da sua conformação.
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Single Strand ConformationPolymorphism (SSCP)
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Single Strand ConformationPolymorphism (SSCP)
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
APLICAÇÕES
Detecção de variantes Virais
Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia
Detecção variantes HPV – Associação com agressividade
...
DESVANTAGENS
Todas as do PCR
Contaminações
Leitura gel poliacrilamida
ReverseTranscriptase PCR Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 28
ReverseTranscriptase PCR Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Baseada na técnica da PCR;
Análise de expressão de mRNA;
Usa a enzima Transcritase Reversa para converter o mRNA em cDNA;
Protocolo PCR para aumentar exponencialmente o número de cópias do mRNA;
Molécula Alvo
mRNA: 5’ – AUGCGUAUCGAUAUCGAUAAGCUA (…) AAAAAAAAA – 3’
TTTTTTTTTT – 5’
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 29
ReverseTranscriptase PCR Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 30
ReverseTranscriptase PCR Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
VANTAGENS
Permite fazer análise quantitativa
da expressão de mRNA.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 31
ReverseTranscriptase PCR Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
APLICAÇÕES
Expressão mRNA viral
Avaliação actividade viral
DESVANTAGENS
Todas as do PCR
Contaminações
RealTime PCR Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 33
RealTime PCR Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
PCR was traditionally limited to end-point analysis using agarose gels
Limitations of end-point PCR:
Poor precision
Low sensitivity
Short dynamic range
Low resolution
Size-based discrimination
Ethidium bromide for staining does not allow for accurate quantitation
Requires post-PCR processing
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 34
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Monitoriza a fluorescência emitida durante a reacção de PCR como um indicador da produções de amplicões em cada ciclo de PCR;
Monitorização em tempo real;
Detecção da amplificação nos estádios precoces da reacção –maior precisão;
Alvo: DNA ou RNA
RealTime PCR Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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RealTime PCR Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
RealTime PCR Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 37
RealTime PCR Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
SYBR Green I Sonda de Hibridação Sonda TaqMan
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 38
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PCR phases in linear view
Cycle #
[DNA]
ExponentialIf 100% efficiency – exact doubling of products. Specific and precise
Linear
High variability. Reaction components are being consumed and PCR products are starting to degrade.
PlateauEnd-point analysis. The reaction has stopped and if left for long –degradation of PCR products.
RealTime PCR Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Exponential
Linear
Plateau
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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RealTime PCR Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Baseline – The baseline phase contains all the amplification that is below the level of detection of the real time instrument.
Threshold – where the threshold and the amplification plot intersect defines CT. Can be set manually/automatically
CT – (cycle threshold) the cycle number where the fluorescence passes the threshold
Rn – (Rn-baseline)
NTC – no template control
DRn is plotted against cycle numbers to produce the amplification curves and gives the CT value.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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CT = threshold cycle
Fracção dos ciclos de PCR a partir da qual édetectado sinal
RealTime PCR Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Quanto maior a quantidade de DNA, menor o valor de Ct
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
RealTime PCR
Aplicações
Quantificação carga viral
Monitorização carga viral
Monitorização terapêutica
VANTAGENS
Amplificação monitorizada em tempo real
Ausência de processamento pós PCR (baixo risco de contaminação)
Requer pouca quantidade de amostra (DNA ou RNA)
Rápido, Específico, sensível e reprodutível
Quantitativo
Barato
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 42
Sequenciação Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 43
Sequenciação Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Usada para determinar a sequência de nucleótidos
Método de sequenciação mais utilizado – método didesoxi
Adição de didesoxinucleótidos que terminam a reacção de polimerização
3’ OH – necessário para adição do nucleótido seguinte
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 44
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Sequenciação Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Sequenciação Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 46
Técnicas de Hibridização
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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Alvo – DNA ou RNA
Utilização de sondas específicas
Possibilidade de diferenciação entre subtipos de vírus
Técnicas
Captura Híbrida
Hibridização em tiras
Southern Blotting
CHIPS
Técnicas de Hibridização
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Captura Híbrida Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 49
Captura Híbrida Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Principio da técnica
Hibridização de Ácidos Nucleicos
Amplificação sinal por Quimioluminescência
Método semiquantitativo
Método
Hibridização amostras positivas com sondas específicas
Complexo Sonda-Amostra é capturado por anticorpos de uma microplaca
Reacção com anticorpo secundário conjudado com FA
Adição de reagente e detecção por quimioluminescência
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 50
Captura Híbrida Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
45 minutesat 65ºC
60 minutesat 65ºC
60 minutesagitação
30 minutes
15 minutes
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 51
Southern Blot Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 52
Southern Blot Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 53
Hibridização em tiras Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 54
55
Hibridização em tiras
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Chips Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 56
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Chips
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Tipagem de vírus:
HPV, HCV, HIV
Tubos ou lâminas com sondasespecíficas para cada subtipo
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Chips
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Biologiareal-time PCR
TécnicasMolecular
Professor Mark Pallen
We ask the lab for a diagnosis,
expecting a yes or no, but often
end up with just a maybe…
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 59
VirologiaAno Lectivo 2010/11
Técnicas DiagnósticoVirologia – Parte II