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i
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DE PROCEDIMENTOS
DE EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM PLANTAS
MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS E QUANTIFICAÇÃO
DE METAIS ASSOCIADOS A ESSAS PROTEÍNAS
Orientada: Cristiana Schmidt de Magalhães Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda
CAMPINAS – SP OUTUBRO DE 2008
ii
v
Dedico esta Tese de Doutorado ao meu
marido Maurício, ao meu filho João Pedro e
meus pais Hélio e Ulda por todo amor e
apoio durante mais esta etapa da minha
vida.
vii
“Àquele que foi manifestado na carne,
foi justificado em espírito, contemplado
por anjos, pregado entre os gentios, crido
no mundo, recebido na glória.”
(I Carta de Paulo a Timóteo 3:16).
ix
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual de Campinas, em especial ao Departamento de
Química Analítica, pela oportunidade oferecida para a realização deste trabalho.
À Universidade Federal de Alfenas, UNIFAL-MG, e ao Departamento de
Ciências Exatas pelo incentivo, suporte e apoio durante os anos de afastamento da
docência.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e
ao Programa de Qualificação Institucional (PQI) pela concessão de bolsa de estudo e
auxílio financeiro.
Ao professor Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda, pela orientação, apoio e amizade
durante esses anos.
Ao professor Dr. Pedro Orival Luccas, pela amizade e valiosos conselhos.
À professora Dra. Maria Elisa Pereira Bastos de Siqueira, por coordenar o
Programa de Qualificação Institucional (PQI) e pela amizade.
À professora Dra. Helenice Aparecida de Carvalho do Departamento de
Farmácia da UNIFAL-MG por disponibilizar o seu laboratório e equipamentos para a
realização das medidas de Kjeldhal.
Ao Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) pelo suporte dado para a
execução dos experimentos na linha de fluorescência de raios-X, em especial ao Dr.
Carlos A. Pérez.
À todos amigos do Grupo de Espectrometria, Preparo de Amostras e
Mecanização (GEPAM): Adílson, Aline Lopes, Alessandra, Ana Christi, Eduardo,
Eraldo, Herbert e Marcelo pelo agradável convívio, meu muito obrigado.
Aos colegas e ex-alunos do laboratório Aline Klassen, Américo, André, Araceli,
César, Edenir, Fabíola, Geraldo, Jerusa, Joselito, Luciana, Marcel e Madson, pela
amizade.
Aos funcionários do Instituto de Química, especialmente a Sílvia, Rodrigo e Bel,
por sempre atenderem prontamente meus pedidos.
x
Aos meus pais, por sempre me acolherem com tanto amor e carinho em
Campinas.
Aos meus irmãos da Igreja Batista Ágape, pelas orações, pela amizade e
carinho em todos os momentos.
Ao meu marido, Maurício, por tanta compreensão nas minhas ausências,
apoio, amor e cuidado comigo nestes anos.
Ao meu filhinho, João Pedro, pela alegria que sempre me proporciona.
Enfim, a todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste
trabalho.
Muito Obrigada!
xi
SÚMULA CURRICULAR
1. DADOS PESSOAIS
Nome: Cristiana Schmidt de Magalhães Data de Nascimento: 16 de Abril de 1967 Naturalidade: São Paulo - SP Filiação: Hélio Schmidt e Ulda de Souza Moraes Schmidt Endereço eletrônico: [email protected]
2. FORMAÇÃO ACADÊMICA
2003 – 2008 Doutorado em Ciências
Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP Título: Avaliação comparativa de procedimentos de extração de proteínas em plantas medicinais e fitoterápicos e quantificação de metais associados a essas proteínas.
1991 – 1994 Mestrado em Física
Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP Título: Fotoluminescência estacionária em Carbeto de Silício amorfo hidrogenado. 1987 – 1991 Graduação em Física
Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP 3. PRODUÇÃO CIENTÍFICA
Artigos publicados, aceitos e submetidos
• Magalhães, C. S., Arruda, M. A. Z., Sample preparation for metalloprotein analysis: A case study using horse chestnuts, Talanta, 71(2007)1958. • Garcia, J. S., Magalhães, C. S., Arruda, M. A. Z., Trends in metal-binding and metalloprotein analysis, Talanta, 69(2006)1. • Figueiredo, E. C., Souza, L. R., Magalhães, C. S. Wisniewski, C., Luccas, P. O., A home-made autosampler/injector commutator for flow injection analysis, Journal of Automated Methods & Management in Chemistry, 2006(2006)1. � Magalhães, C. S., Perez, C. A., Arruda, M. A. Z., Qualitative Evaluation of Metal Presence in Phytomedicine Proteins Through X-Ray Fluorescence, Activity Report, 2005. • D´andréa, E. D., Magalhães, C. S., Luccas, P. O., Semaan, F. S., Artérias e veias simuladas no laboratório, Ciência Hoje, 36(2005) 72. • Rodrigues, J. L., Magalhães, C. S., Luccas, P. O., Flow injection
xii
spectrophotometric determination of Al in hemodialysis solutions, Journal of Pharmaceutical and Biomedical analysis, 36(2005)1119. • Moreira, L. N., Magalhães, C. S., Luccas, P. O., Emprego de sistema e análise em fluxo contínuo com biossensor potenciométrico para determinação de adrenalina em medicamentos, Infarma, 16(2005)59. • Louzada, E. S., Luccas, P. O., Magalhães, C. S., Construção e caracterização de um biossensor potenciométrico para determinação de pirogalol, Analytica, 2(2004)52. • Semaan, F. S., Vieira, A. L. N., Magalhães, C. S., Luccas, P. O., Construção de eletrodo tubular de cobre revestido íon seletivo a cloreto para uso em sistema de análise em fluxo contínuo, Revista da Escola de Farmácia e Odontologia de Alfenas, 23(2002). • Magalhães, C. S., Bittencourt, C., Alvarez, F., Photoluminescence, Disorder and Localization in Hydrogenated Amorphous Silicon Carbon Alloys, Brazilian Journal of Physics, 24(1994)416. • Magalhães, C. S., Bittencourt, C., Alvarez, F., Photoluminescence Studies on Silicon Carbon Alloys, Journal of Non-Crystalline Solids, 1027(1993)164. • Magalhães, C. S., Alvarez, F., Properties of Amorphous Silicon-Carbon Alloys with Very Low Densities of States, Journal of Physics Condensed Matter, 5(1993). • Novellino, R. A., Vazquezlópes, C., Bernussi, A. A., Schmidt, C., Cerdeira, F., Motisuke, P., Pollak, F. H., Ploog, K., On the origin of Franz-Keldysh oscillations in AlGaAs/GaAs modulation-doped heterojuctions, Journal of Applied Physics, 70(1991)5570.
Capítulo de Livro
• Magalhães, C. S., Garcia, J. S., Lopes, A. S., Figueiredo, E. C., Arruda, M. A. Z., Strategies for sample preparation focusing biomolecules determination/characterization, In: Marco Aurélio Zezzi Arruda (Ed.) Trends in Sample Preparation, 1st ed., Nova Science, New York, 2006.
Principais trabalhos apresentados em eventos
• Magalhães, C. S., Arruda, M A. Z., Identificação e Quantificação de Metais em Proteínas de Folha de Sene (Cássia Angustifólia vahl). XLVI Congresso Brasileiro de Química – ABQ, 2006, Salvador. • Magalhães, C. S., Arruda, M. A. Z., Evaluation of Protein Extraction Procedures from Phytomedicines and their Separation by SDS-PAGE, apresentação oral. 7th International Symposium on Advances in Extraction Technologies, 2005, Campinas. • Magalhães, C. S., Pérez, C. A., Arruda, M. A. Z., Metalômica Quali e Quantitativa de Proteínas de Castanha da Índia in natura, apresentação oral. 13o. Encontro Nacional de Química Analítica, 2005, Niterói. • Magalhães, C. S., Arruda, M A Z., Evaluation of protein extraction procedures in phytotherapic medicines. Trends in Sample Preparation 2004, 2004, Seggau –
xiii
Castle/ Styria, Austria. • Magalhães, C. S., Luccas, P. O., Arruda, M. A. Z., Determination of Pb, Cd and Cu in Phytotherapics by ETAAS and TS-FF-AAS after Microwave-Assisted Digestion. 8th Rio Symposium on Atomic Spectrometry, 2004, Paraty, RJ. • Magalhães, C. S., Perez, C. A., Arruda, M. A. Z., Avaliação Qualitativa da presença de Metais em Proteínas de Fitoterápicos por Fluorescência de Raios-X. XIV Reunião anual de Usuários do LNLS, 2004, Campinas. • Magalhães, C. S., Bittencourt, C., Alvarez, F., Estudo do comprimento de Localização em a-SiC:H e a-Si:H através da fotoluminescência dependente da temperatura, apresentação oral. Oficina de Propriedades de Materiais de Camada Fina para Aplicações Fotovoltáicas, Microeletrônicas e Recobrimentos, apresentação oral. 1994, Campinas. • Magalhães, C. S., Bittencourt, C., Alvarez, F., Photoluminescence Studies on Silicon Carbon Alloys, apresentação oral. XV International Conference on Amorphous Semiconductors: Science and Technology, 1993, Cambridge. • Magalhães, C. S., Bittencourt, C., Alvarez, F., Photoluminescence, Disorder and Localization in Hydrogenated Amorphous Silicon Carbon Alloys, apresentação oral. 6th Brazilian School of Semiconductor Physics, 1993, São Carlos. • Magalhães, C. S., Alvarez, F., Properties of Amorphous Silicon-Carbon Alloys with Very Low Densities of States, apresentação oral. SLAFS-7-70, Simposio Latinoamericano de Fisica de Superficies, 1992, Bariloche.
Total de trabalhos em eventos internacionais: 7 Total de trabalhos em eventos nacionais:41 Participações em eventos científicos: 23
• HISTÓRICO PROFISSIONAL • Professor Assistente, Dedicação Exclusiva
- Universidade Federal de Alfenas – UNIFAL-MG Disciplina de Física
Período: 1999 – atualmente
• Pesquisa e Desenvolvimento - Fundação Centro Tecnológico para Informática – CTI Projeto: Pesquisa e Desenvolvimento de TFT´s – Transistores de Filmes Finos – através de Pulverização Catódica “Sputtering”
Período: 1994 – 1995
xv
RESUMO
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DE PROCEDIMENTOS DE EXTRAÇÃO DE
PROTEÍNAS EM PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS E QUANTIFICAÇÃO
DE METAIS ASSOCIADOS A ESSAS PROTEÍNAS
Autora: Cristiana Schmidt de Magalhães
Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda
Este trabalho de Tese apresenta os resultados da avaliação de onze
procedimentos de extração de proteínas nas plantas medicinais ginkgo biloba (Ginkgo
biloba L.) e castanha da Índia (Aesculus hippocastanum) e no fitoterápico Espirulina
(Spirulina maxima). Os procedimentos variaram desde a simples agitação até àqueles
onde se somavam várias etapas, tais como agitação, maceração, sonicação e
centrifugação. A avaliação foi feita em termos da comparação da concentração de
proteínas totais extraídas por meio de cada procedimento, utilizando-se o método de
Bradford e de Kjeldhal. Os procedimentos contendo mais etapas se mostraram mais
eficientes na extração de proteínas. Também foi feito o mapa protéico da castanha da
Índia (Aesculus hippocastanum) e avaliada a influência dos procedimentos de
extração de proteínas no perfil protéico da referida amostra. Para isso foi feita a
separação das proteínas presentes nos extratos protéicos utilizando-se eletroforese
SDS-PAGE. Esta separação (para as proteínas desnaturadas e sob condição não-
redutora) permitiu identificar, em termos de massa molar, quais proteínas compunham
os extratos protéicos, onde se verificou uma banda mais expressiva (MM = 33,2 ± 0,9
kDa), independentemente do procedimento de extração usado, fato que foi
relacionado à mobilidade da proteína. Quando a separação ocorria sob condições
redutoras, a banda mais expressiva apresentava MM = 23,5 ± 0,5 kDa. Com a
finalidade de se fazer uma investigação mais detalhada, as proteínas da castanha da
Índia que foram extraídas pelo procedimento de maceração e centrifugação, foram
também separadas por eletroforese bidimensional, na qual houve o desdobramento
xvi
da banda mais expressiva em pelo menos nove bandas protéicas. Estas bandas
foram decompostas tripticamente e foram analisadas por espectrometria de massas,
com a obtenção de várias seqüências peptídicas que se repetiam em várias bandas
diferentes. Estes resultados sugerem que estas proteínas se tratam de isoformas.
Finalmente, foi proposta a identificação de quais íons metálicos estariam ligados às
proteínas, o que foi possível por meio do mapeamento das bandas protéicas
utilizando-se a fluorescência de raios-X com radiação Síncrotron. Foram identificados
4 íons metálicos, os quais foram investigados quantitativamente. As bandas
separadas por SDS-PAGE e por 2D-PAGE foram decompostas por radiação
microonda e a determinação das concentrações dos íons metálicos foi obtida por
ETAAS e FAAS. Para as bandas separadas por 2D-PAGE observou-se uma
interessante distribuição não homogênea dos íons metálicos, sugerindo que algumas
se trataram de metaloproteínas, enquanto outras não. Assim, estas proteínas podem
ser de origem citosólica e de armazenamento, e que, embora sejam apenas
coadjuvantes na ação medicinal da castanha, participariam ativamente nos processos
germinativos e metabólicos da planta.
xvii
ABSTRACT
COMPARATIVE EVALUATION OF PROTEIN EXTRACTION PROCEDURES IN
MEDICINAL PLANTS AND PHYTOMEDICINES AND QUANTIFICATION OF
ASSOCIATED METALS TO THESE PROTEINS
Author: Cristiana Schmidt de Magalhães
Adviser: Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda
This work presents the evaluation of eleven protein extraction procedures using
ginkgo biloba (Ginkgo biloba L.), horse chestnut (Aesculus hippocastanum) medicinal
plants, and also using the phytomedicine Spirulina (Spirulina maxima). The
procedures varied since the agitation only until the addition of several steps, such as
agitation, maceration, sonication, and centrifugation. This evaluation was made by
comparing the total extracted proteins through Bradford and Kjeldhal methods. The
more efficient protein extraction procedures were those whose steps were added. The
influence of protein extraction procedures was also evaluated in the protein map of
horse chestnut (Aesculus hippocastanum). The proteins present in extracts were
separated by SDS-PAGE. This separation (for denatured and non-reduced proteins)
allowed identifying the more expressive protein band (MM = 33.2 ± 0.9 kDa)
independently of the used procedure. When the separation was carried out under
reduced and denatured conditions, the more expressive protein band had MM = 23.5
± 0.5 kDa. This difference in MM was attributed to protein mobility. The horse chestnut
proteins extracted by maceration and centrifugation were also separated by two-
dimensional electrophoresis in order to obtain a more detailed protein profile. Through
this separation, the more expressive band was folded in, at least, nine protein bands.
These bands were triptically decomposed and analysed by mass spectrometry.
Several peptide sequences that repeated in different protein bands were obtained.
These results suggested to deal of isoforms. Finally, the identification of metallic ions
bonded to proteins, using Sincrotron radiation- X-ray fluorescence was also proposed.
xviii
Four metallic ions were identified, which were quantitaively investigated. The protein
bands separated by SDS-PAGE and by 2D-PAGE were decomposed using
microwave radiation, and metallic ion concentrations were determined by ETAAS and
FAAS techniques. For 2D-PAGE bands an interesting non-homogeneous metallic ion
distribution was observed, suggesting that some proteins can be metalloproteins or
metal-binding proteins. Therefore, these studied proteins probably present a citosolic
origin and storing function. However, they may be coadjuvants at medicinal action,
and much probably participate in germinating and metabolic processes.
xix
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E ACRÔNIMOS...................................... xxv
LISTA DE QUADROS.......................................................................... xxix
LISTA DE TABELAS............................................................................ xxx
LISTA DE FIGURAS............................................................................ xxxii
INTRODUÇÃO .................................................................................... 01
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................... 02
Capítulo 1 - Preparo de Amostras e Procedimentos de Extração de Proteínas de Plantas Medicinais e Fitoterápicos.............................
05
1. OBJETIVOS..................................................................................... 07
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................ 07
2.1 Procedimentos de extração de proteínas.................................. 07
2.1.1 Rompimento celular.................................................................... 08
2.1.2 Inativação ou remoção de interferentes...................................... 10
2.1.3 Solubilização de proteínas.......................................................... 12
2.2 Plantas medicinais e fitoterápicos ............................................. 14
2.2.1 Plantas medicinais, fitoterápicos e fitofármacos–Definições ..... 15
2.2.2 Plantas medicinais, fitoterápicos e fitofármacos -Perspectivas.........................................................................................
15
2.2.3 Espirulina, Ginkgo biloba e Castanha da Índia............................ 16
2.3 Determinação de proteínas totais.............................................. 21
xx
2.3.1 Método de Bradford..................................................................... 22
2.3.2 Método de Kjeldahl...................................................................... 23
3. PARTE EXPERIMENTAL................................................................ 24
3.1 Equipamentos e acessórios....................................................... 24
3.2 Reagentes e soluções................................................................. 25
3.3 Preparo das amostras................................................................ 26
3.4 Extração das proteínas................................................................ 27
3.5 Determinação da concentração de proteínas totais............... 30
3.5.1 Método de Bradford..................................................................... 30
3.5.2 Método de Kjeldahl...................................................................... 30
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES..................................................... 31
5. CONCLUSÕES PARCIAIS.............................................................. 38
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................ 39
Capítulo 2 – Mapa Protéico da Castanha da Índia............................... 47
1. OBJETIVOS..................................................................................... 49
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................ 49
2.1 Proteínas – Aspectos gerais....................................................... 49
2.1.1 Proteínas em plantas................................................................... 50
2.2 Eletroforese................................................................................... 52
xxi
2.2.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida em uma dimensão (1D PAGE) ................................................................................................
54
2.2.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida em duas dimensões (2D PAGE) ..................................................................................................
55
2.3 Espectrometria de massas.......................................................... 56
2.3.1 Digestão tríptica ......................................................................... 56
2.3.2 MALDI-TOF-MS .......................................................................... 57
2.3.3 Espectros de massas.................................................................. 58
3. PARTE EXPERIMENTAL................................................................ 60
3.1 Equipamentos e acessórios....................................................... 60
3.2 Reagentes e soluções.................................................................. 60
3.3 Separação eletroforética em uma dimensão (SDS-PAGE)..................................................................................................
62
3.3.1 Preparo das amostras para a separação eletroforética baseada em SDS-PAGE .....................................................................
62
3.3.2 Separação de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)..................................................................
63
3.4 Separação eletroforética em duas dimensões (2D-PAGE)..................................................................................................
64
3.4.1 Otimização da metodologia para a separação por 2D-PAGE...................................................................................................
64
3.4.2 Separação bidimensional de proteínas por eletroforese com focalização isoelétrica e em gel de poliacrilamida (2D-PAGE)..................................................................................................
65
3.5 MALDI-TOF-MS............................................................................. 66
3.5.1 Digestão tríptica dos spots de proteínas..................................... 66
3.5.2 Caracterização de proteínas por MALDI-QTOF-MS................... 66
xxii
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................... 68
4.1 Géis SDS-PAGE............................................................................ 68
4.1.1 Determinação de massa molar e de massa de proteína por densidade óptica..................................................................................
69
4.2 Géis 2D-PAGE............................................................................... 73
4.3 MALDI-TOF-MS............................................................................. 77
5. CONCLUSÃO PARCIAL................................................................. 87
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................ 88
Capítulo 3 - Determinação e Quantificação de Metais Associados às Proteínas..............................................................................................
91
1. OBJETIVOS..................................................................................... 93
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................ 93
2.1 Metaloproteínas e proteínas de metal ligante............................ 93
2.2 Fluorescência de raios-X por radiação síncrotron (SRXRF)...............................................................................................
95
3. PARTE EXPERIMENTAL................................................................ 97
3.1 Equipamentos e acessórios........................................................ 97
3.2 Reagentes e soluções.................................................................. 98
3.3 Mapeamento dos metais ligados às proteínas nas bandas por fluorescência de raios-X por radiação síncrotron (SRXRF)...............................................................................................
99
3.4 Decomposição ácida sob radiação microonda......................... 100
3.5 Determinação de metais por ETAAS e FAAS nas bandas SDS-PAGE e 2D-PAGE.......................................................................
101
xxiii
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................... 102
4.1 Avaliação qualitativa dos metais ligados às proteínas nas bandas por SRXRF.............................................................................
102
4.2 Avaliação quantitativa dos metais ligados às proteínas nas bandas separadas por SDS-PAGE e 2D-PAGE utilizando as técnicas ETAAS e FAAS....................................................................
104
5. CONCLUSÃO PARCIAL.................................................................. 111
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................ 112
CONCLUSÕES FINAIS E PERSPECTIVAS ...................................... 115
Apêndice 1........................................................................................... 117
Apêndice 2.......................................................................................... 119
Apêndice 3........................................................................................... 121
Apêndice 4........................................................................................... 123
Apêndice 5........................................................................................... 133
xxv
LISTA DE ABREVIATURAS E ACRÔNIMOS
1D Uma Dimensão
1D - PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida em uma dimensão (do
inglês, One Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
2D Duas Dimensões
2D-PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida em duas dimensões (do inglês, Two Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
AAS Espectrometria de Absorção Atômica (do inglês, Atomic Absorption Spectrometry)
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATP Adenosina Tri-Fosfato (do inglês, Adenosine Tri-Phosphate)
BCA Ácido Bicinchonínico
BPFC Boas Práticas de Fabricação e Controle
CE Eletroforese Capilar (do inglês, Cappilary Electrophoresis)
Da Dalton (1 Da = 1,661x10-24 g)
Electrospray-MS do inglês, Electrospray Ionization Mass Spectrometry
ESI Ionização por Eletro Spray (do inglês, Electro Spray
Ionization)
ETAAS Espectrometria de Absorção Atômica com Atomização Eletrotérmica (do inglês, Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry)
FAAS Espectrometria de Absorção Atômica com Chama (do inglês, Flame Atomic Absortion Spectrometry)
g Gravidades
GeV Gigaeletronvolts
xxvi
HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (do inglês, High Performance Liquid Chromatography)
HPGe Detector de Alta Pureza de Ge (do inglês, High Purity Ge
Detector)
ICP-MS Espectrometria de Massas com Fonte de Plasma Acoplado Indutivamente (do inglês, Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry)
IEF Focalização Isoelétrica (do inglês, Isoelectric Focussing)
K Lisina
LC Cromatografia Líquida (do inglês, Liquid Chromatography)
LC-MS Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas (do inglês, Liquid Chromatography – Mass Spectrometry)
LD Limite de Detecção
LDI+ Modo íon positivo
LQ Limite de Quantificação
LNLS Laboratório Nacional de Luz Síncroton
MALDI Dessorção/Ionização de Matriz Assistida por Laser (do inglês, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization)
MALDI-TOF-MS Espectrometria de Massas por tempo de Vôo acoplada à Ionização dessortiva de Matriz assistida por Laser (do inglês, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry)
MCP do inglês, Microchannel Plate
MM Massa Molar
MG Minas Gerais
MS Espectrometria de Massas (do inglês, Mass Spectrometry)
MSDB Banco de Dados (do inglês, Mass Spectrometry Data Bank)
MTs Metalotioneínas
ng Nanogramas (1x10-9 g)
xxvii
OMS Organização Mundial de Saúde
P Prolina
pg Picogramas (1x10-12 g)
PAF Fator Ativador de Plaquetas
PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (do inglês, Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
P prolina
pI Ponto Isoelétrico
ppm partes por milhão
PTM Proteínas modificadas pós translacionalmente (do inglês, Post Translationally Modified Proteins)
QTOF-MS Espectrometria de Massas assistida por Quadrupolo com Tempo de Vôo (do inglês, Quadrupole Time-Of-Flight Mass Spectrometry)
REBLAS Rede Brasileira de Laboratórios em Saúde
R Arginina
R2 Coeficientes de correlações lineares
SDS-PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida com Dodecil Sulfato de Sódio (do inglês, Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
SPE Extração por Fase Sólida (do inglês, Solid Phase Extraction)
spot Banda 2D de proteínas
SR Radiação Síncrotron (do inglês, Sincrotron Radiation)
SRXRF Fluorescência de Raios-X por Radiação Síncrotron (do inglês,
Sincrotron Radiation X-Ray Fluorescence)
TOF Tempo de Vôo (do inglês, Time Of Flight)
Unifal-MG Universidade Federal de Alfenas
UV Ultra Violeta
xxviii
UV/Vis Ultra Violeta/ Visível
XRF Fluorescência de Raios-X (do inglês, X-Ray Fluorescence)
W Watts
xxix
LISTA DE QUADROS
Quadro 1.1 Procedimentos de extração de proteínas para as diferentes amostras......................................................................................
29
Quadro 3.1 Exemplos de algumas metaloproteínas....................................... 95
xxx
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1 Concentrações de proteínas totais ± desvio padrão (em mg g-1) nas amostras determinadas pelo método de Bradford (N=3) para os diferentes processos de extração de proteínas....................................32
Tabela 2.1 Massas molares estimadas (em kDa) das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.4...............................................70
Tabela 2.2 Massas estimadas de proteína (em µg) a partir das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.4.......................................71
Tabela 2.3 Massas molares estimadas (em kDa) das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.6...............................................72
Tabela 2.4 Dados estimados dos spots, segundo o programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0..............................................................................75
Tabela 2.5 Valores estimados das massas de proteínas (em µg) em cada spot, com os respectivos valores de porcentagens, segundo o programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0..................................................76
Tabela 2.6 Dados estimados dos spots protéicos do gel 2D-PAGE da Figura 2.8, segundo o programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0................79
Tabela 2.7 Razões m/z e as sequências peptídicas identificadas para as proteínas dos spots B a Q, provenientes dos espectros MS/MS...................................................................................................83
Tabela 3.1 Contagens relativas de metal das emissões Kα de íons metálicos. Os dados da intensidade média (contagens de íons de metal) foram calculados a partir dos três pontos mapeados, bem como foram descontadas as diferenças entre as intensidades das contagens das amostras e dos brancos analíticos......................................................102
Tabela 3.2 Concentrações de metais nas proteínas separadas por SDS-PAGE (média ± desvio padrão, n=3). Cr, Fe e Mn foram determinados por ETAAS e Ca por FAAS.......................................................................105
Tabela 3.3 Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) obtidos experimentalmente nas amostras de bandas protéicas usando as técnicas de ETAAS e FAAS................................................................105
Tabela 3.4 Concentrações de metais nos spots de proteínas do gel 2D-PAGE da castanha da Índia (vide Fig.2.7, Capítulo 2). Cr, Fe e Mn foram determinados por ETAAS e Ca por FAAS (média ± desvio padrão, n=3).....................................................................................................108
xxxi
Tabela 3.5 Estimativa das quantidades de metal nas proteínas identificadas........................................................................................109
Tabela 3.6 Estimativa dos números de moléculas de proteínas e números de átomos de cada metal em cada spot..................................................110
xxxii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 Espirulina (Spirulina máxima)..................................................................17
Figura 1.2 Folhas de Ginkgo biloba. Foto extraída do site: http://www.xs4all.nl/~kwanten/thetree.htm..............................................18
Figura 1.3 Castanha da Índia (Aesculus hippocastanum). Ilustração extraída de http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Illustration_Aesculus_hippocastanum0.jpg.........................................................................................................20
Figura 2.1 Uma proteína típica: Diagrama de ligações peptídicas e N e C terminais..................................................................................................49
Figura 2.2 Anatomia de uma célula de planta. Ilustração adaptada de [5]..............51
Figura 2.3 Ilustração dos processos que ocorrem durante a MALDI. Adaptada de Nyman [16]..............................................................................................58
Figura 2.4 Géis SDS-PAGE obtidos a partir dos extratos brutos, nos quais foram utilizados os procedimentos 1, 2, 4, 5, 8 e 9 e o padrão de proteínas, com suas respectivas massas molares. Géis de poliacrilamida 12,5% (m/v) com dimensões de 100 (altura) x 105 (largura) x 1,0 (espessura) mm..........................................................................................................69
Figura 2.5 Variação das densidades ópticas das bandas dos géis SDS-PAGE do padrão protéico (linha azul) e do extrato bruto obtido a partir do procedimento 5 (em triplicata - linhas verde, preta e vermelha).............70
Figura 2.6 Géis SDS-PAGE obtidos a partir dos extratos brutos diluídos com tampão dissociante, nos quais foram utilizados os procedimentos 1 (sem diluição), 4, 5, 8 e 9 (diluídos com tampão dissociante) e o padrão de proteínas, com suas respectivas massas molares (em kDa). Géis de poliacrilamida 12,5% (m/v) com dimensões de 100 (altura) x 105 (largura) x 1,0 (espessura) mm...............................................................72
Figura 2.7 Gel 2D-PAGE do extrato protéico proveniente do procedimento 5 (amostra manualmente macerada em tampão Tris-HCl 1,0 mol L-1 (pH 6,8), por 15 min). Fita de 13 cm, pH de 3 a 10, padrão de proteínas de MM de 116,0 a 14,4 kDa. Gel com dimensões de 130 x 130 x 1,5 mm. Os spots estão denominados de A a I, da esquerda para direita. No destaque, à direita superior, estão as bandas protéicas em três dimensões...............................................................................................74
Figura 2.8 Gel 2D-PAGE do extrato protéico proveniente do procedimento 5
xxxiii
(amostra manualmente macerada em tampão Tris-HCl 1,0 mol L-1 (pH 6,8), por 15 min). Fita de 13 cm, pH de 3 a 10, padrão de proteínas de massa molar de 116,0 a 14,4 kDa. Gel com dimensões de 130 x 130 x 1,5 mm. Os spots estão destacados em vermelho e denominados de A a Q, da esquerda para direita.....................................................................78
Figura 2.9 Espectros de massas em duplicata para as proteínas dos spots A e H..............................................................................................................80
Figura 2.10 Espectros de massas gerados para os spots protéicos B, C, G, I e N........................................................................................................................81
Figura 3.1 Configuração do sistema utilizado para a aquisição dos dados referentes ao mapeamento de espécies químicas presentes nas bandas de proteínas.................................................................................................99
Figura 3.2 Espectros de raios-X adquiridos na análise por SRXRF: (a) branco analítico (proteína ovalbumina + gel) (—) e proteína de 33,0 kDa extraída por procedimento 1 (—); (b) branco analítico (proteína ovalbumina + gel) (—) e proteína de 33,0 kDa extraída por procedimento 2 (—); (c) branco analítico (proteína ovalbumina + gel) (—) e proteína de 23,5 kDa extraída por procedimento 8 (—) (d) branco analítico (proteína ovalbumina + gel) (—) e proteína de 23,5 kDa extraída por procedimento 9 (—). As contagens relativas das emissões Kα de íons variaram de 0 a 3000......................................................................................................102
Tese de Doutorado Introdução Cristiana S. de Magalhães
1
INTRODUÇÃO
Esta Tese foi preparada em três Capítulos distintos, mas interligados, visando
uma melhor compreensão e clareza do assunto proposto.
É bem conhecido que o preparo de amostras é freqüentemente o passo mais
problemático na seqüência analítica por ser bastante trabalhoso, com etapas
complexas e tediosas, consumir muito tempo, bem como ser o responsável, muitas
vezes, por erros aleatórios e sistemáticos nos resultados finais produzindo
informações (bio)químicas inadequadas [1]. Outro problema a ser considerado
relaciona-se à instabilidade do analito, principalmente quando se trata de análise de
biomoléculas [2]. Assim, é importante que exista um compromisso entre o preparo das
amostras e os procedimentos adequados para a manutenção da integridade dos
analitos [3]. No primeiro Capítulo, foram sugeridos vários procedimentos de preparo
de amostras e de extração de proteínas em algumas plantas medicinais e
fitoterápicos. Estas amostras foram escolhidas pelo grande interesse tanto no aspecto
científico, quanto no aspecto comercial. Para a avaliação comparativa entre os
procedimentos propostos foram utilizados métodos analíticos já bem estabelecidos na
literatura [4 - 6], definindo-se a castanha da Índia como amostra de estudo.
É impossível estudar o comportamento dos sistemas biológicos enfocando
exclusivamente o genoma, pois são as proteínas, e não os genes, que determinam o
fenótipo de um organismo. Por exemplo, em resposta a um estímulo interno ou
externo, a síntese de algumas proteínas pode ser estimulada ou inibida; estas
proteínas podem sofrer modificações pós-transducionais ou podem ser degradadas
ou, ainda, ser realizadas em diferentes locais da célula [7]. A proteômica estuda os
processos biológicos através da análise sistemática das proteínas expressas nas
células ou tecidos, em conseqüência direta das condições externas e do estado do
organismo em um determinado momento. Obter o proteoma de uma célula ou
organismo é como fazer uma “fotografia instantânea” das proteínas expressas
naquele determinado momento. Pode-se afirmar, portanto, que cada genoma,
potencialmente, pode originar um número infinito de proteomas [7, 8].
Tese de Doutorado Introdução Cristiana S. de Magalhães
2
Têm sido realizados esforços e avanços para se entender as metaloproteínas,
principalmente no que concerne à estrutura e funções dos sítios metálicos, bem como
das implicações biológicas das suas interações. O processo analítico para a
identificação e quantificação de uma metaloproteína inclui pelo menos três etapas: (i)
uma etapa seletiva, na qual é necessário que se use uma técnica de separação (tais
como LC, CE, 2DE ou 2D-PAGE) para o isolamento da metaloproteína da matriz; (ii)
uma etapa estrutural, na qual se tem por objetivo uma caracterização mais exata das
biomoléculas em estudo (onde podem ser usadas técnicas como, por exemplo,
MALDI-TOF-MS ou QTOF-MS) e (iii) uma etapa quantitativa, para a quantificação das
espécies metálicas (utilizando-se técnicas como, por exemplo, ICP-MS ou AAS).
As primeiras duas etapas foram exploradas no Capítulo 2 desta Tese, em que
se caracterizaram as proteínas da amostra castanha da Índia por meio de técnicas
analíticas de eletroforese, em uma e duas dimensões, e de MALDI-TOF-MS.
No terceiro Capítulo, objetivou-se a investigação da presença de metais nas
estruturas das proteínas caracterizadas e a influência da preservação dos mesmos,
ao se utilizar os diversos processos de extração de proteínas sugeridos no Capítulo 1.
Foram utilizadas as técnicas SRXRF, para a identificação e AAS, para a quantificação
das espécies metálicas ligadas às proteínas.
Desta maneira, buscou-se interligar as informações obtidas em todos os
Capítulos, fornecendo um panorama do proteoma e do metaloproteoma da amostra
em estudo, enfatizando os cuidados com a manipulação da amostra neste tipo de
estudo.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] Magalhães, C. S., Arruda, M. A. Z., Sample preparation for metalloprotein analysis: A case study using horse chestnuts, Talanta, 71(2007)1958. [2] Magalhães, C. S., Garcia, J. S., Lopes, A. S., Figueiredo, E. C., Arruda, M. A. Z., Strategies for Sample Preparation Focusing on Biomolecules Determination/Characterization, In: Marco Aurélio Zezzi Arruda (Ed.) Trends in Sample Preparation, 1st ed., Nova Science, New York, 2006.
Tese de Doutorado Introdução Cristiana S. de Magalhães
3
[3] Garcia, J. S., Magalhães, C. S., Arruda, M. A. Z., Trends in metal-binding and metalloprotein analysis, Talanta, 69(2006)1. [4] Zaia, D. A. M., Zaia, C. T. B. V., Lichtig, J., Determinação de Proteínas Totais via espectrofotometria: Vantagens e Desvantagens dos Métodos Existentes, Química Nova, 21(1998)787. [5] Bradford, M. M., Rapid And Sensitive Method For Quantitation Of Microgram Quantities Of Protein Utilizing Principle Of Protein-Dye Binding, Anal. Biochem. 72(1976)248. [6] Cecchi, H. M., Fundamentos Teóricos e Práticos em análise de alimentos, Cap. 6, ed. Unicamp, Campinas, 1999, 60. [7] Pereira, A. S., Bicalho, B., Lília, S., De Nucci, G., Desafios da Química analítica frente às necessidades da indústria farmacêutica, Química Nova, 28(2005)S107. [8] Graves, P. R., Haystead, T. A. J., Molecular biologist's guide to proteomics, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66(2002)39.
5
CAPÍTULO 1
Procedimentos de Preparo de Amostras e
de Extração de Proteínas em Plantas
Medicinais e Fitoterápicos
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
7
1. OBJETIVOS
• Propor procedimentos de extração de proteínas para algumas plantas
medicinais e fitoterápicos, levando em conta a dificuldade no preparo deste tipo
de amostra vegetal;
• Avaliar alguns procedimentos de extração de proteínas em termos de eficiência
de extração, através da determinação de proteínas totais utilizando-se os
métodos de Kjeldhal e Bradford;
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Procedimentos de extração de proteínas
Existem vários procedimentos descritos na literatura para a extração de
proteínas. Esses procedimentos estão relacionados com o objetivo da extração, ou
seja, para qual fim a proteína estará sendo extraída, como, por exemplo, para se
medir a sua concentração, ou a atividade enzimática, para separação por técnicas
como eletroforese ou cromatografia, para se estabelecer a seqüência de aminoácidos
ou se determinar a estrutura tridimensional de uma proteína. Entretanto, algumas
recomendações gerais devem ser seguidas. As etapas de extração devem ser as
mais simples possíveis para garantir a reprodutibilidade dos resultados e as
modificações nas estruturas das proteínas devem ser minimizadas para evitar
modificações químicas nas determinações. Os três passos fundamentais no preparo
de amostras de proteínas são rompimento celular, inativação ou remoção de
interferentes e solubilização das proteínas [1 - 5]. Assim, serão descritos, nos
próximos itens, alguns procedimentos comumente utilizados para extração de
proteínas.
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
8
2.1.1 Rompimento celular
O rompimento celular pode ser obtido tanto por procedimentos químicos como
físicos, dependendo da natureza da amostra e do tipo de análise que se deseja
utilizar. As células de microorganismos ou de tecidos de plantas geralmente requerem
condições mais drásticas para a lise celular, devido à robustez da parede celular
deste tipo de amostras. Já amostras mais delicadas, como células de mamíferos ou
organelas celulares (como mitocôndrias) exigem procedimentos mais amenos [6].
Vários procedimentos de lise (destruição celular por rompimento das células
devido à destruição da membrana celular [7]) podem ser utilizados, como, lise
osmótica (quando a célula é suspensa em um meio hipotônico e seu volume sendo
aumentado até ocorrer a lise da membrana [8]), lise por detergentes e lise enzimática
da parede celular. Além desses, também se utilizam a agitação, a maceração a várias
temperaturas (ambiente, a zero grau Celsius ou com nitrogênio líquido). Em amostras
sólidas, geralmente, emprega-se a maceração manual sob nitrogênio líquido para
transformar a amostra em um pó fino. Pode ser usada também a trituração com sonda
de aço, capaz de promover a homogeneização do material, além de cortá-lo em
pequenos pedaços. Para amostras líquidas, utiliza-se ultra-som (ou sonicação) para
homogeneizar o material e romper as células [9], além da centrifugação [10]. As
ondas ultra-sonoras de alta potência (< 1 W a milhares de W cm-2) causam
permanente mudança física e química porque produzem cavitação e microfluidos nos
líquidos, aquecimento e ruptura de sólidos e instabilidade na superfície da interface de
sistemas líquido-líquido e líquido-gás [11]. A propagação das ondas ultra-sonoras no
meio reacional cria uma variação de pressão, a qual é responsável pela cavitação,
que pode ser definida como a formação e implosão de microbolhas de gás no centro
de um líquido. A variação de pressão cria, num ponto do líquido, momentos de
compressão e descompressão alternados. A cavitação acústica envolve três estágios:
formação de núcleos de cavitação, crescimento das bolhas e violentas implosões. No
momento da implosão, há formação de ondas de choque e na fase final esperam-se,
no centro da bolha, temperatura e pressão muito elevadas, da ordem de 10000 K e
1000 atm. Nos sistemas heterogêneos, nas interfaces sólido-líquido, a natureza da
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
9
destruição das bolhas se apresenta diferente. A destruição se faz de forma não
simétrica, dando origem a um jato de líquido dirigido para a superfície sólida. Além
disso, micro-fluxos de líquido são formados devido à absorção de grande quantidade
de energia vibracional dentro de pequeno volume, com pouco ou nenhum
aquecimento associado. Isto favorece o transporte de massa entre a fase líquida e as
superfícies sólidas, contribuindo para a aceleração da velocidade da reação. Assim, a
eficiência da extração de um analito depende das variáveis que influenciam no
processo no processo de cavitação (temperatura, viscosidade, presença de partículas
sólidas, altura da coluna de água, freqüência e posição dos frascos dentro do banho).
Tão logo as condições experimentais estejam otimizadas, o processo de ultra-som é
bastante eficiente para a extração sólido-líquido [11, 12].
Como exemplo de estudo de procedimentos de rompimento celular, Chan et al.
[13] otimizaram as condições de preparo de amostras para análise por eletroforese
em duas dimensões de Prorocentrum triestinum, um dinoflagelado. Eles
reconheceram que o primeiro passo do preparo da amostra era o rompimento celular
para a liberação de todo o conjunto de proteínas do organismo. Na amostra em
estudo, seriam necessários métodos mais vigorosos de rompimento celular, uma vez
que os dinoflagelados são encapsulados por paredes celulares robustas. Para isso,
eles propuseram o uso da sonicação e da agitação vigorosa com o uso de lâminas de
vidro num agitador de vidro. Foi tomada aproximadamente uma massa de 150 mg de
células de P. triestinum, previamente centrifugada e homogeneizada num tampão
Tris-HCl resfriado (4oC), que foi submetida à agitação com as lâminas de vidro ou à
sonicação. Ao se compararem os resultados pelos dois métodos, os autores
obtiveram aumento de 5% quando utilizaram a sonicação na extração de proteínas
por peso úmido de amostra em relação à extração quando utilizaram as lâminas de
vidro. Considerando que os resultados mostraram padrões similares ao se
compararem os géis de eletroforese em duas dimensões, os autores elegeram a
sonicação como o método mais efetivo de rompimento celular para os dinoflagelados.
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
10
2.1.2 Inativação ou remoção de interferentes
Durante ou após o rompimento celular, vários compostos interferentes como
enzimas proteolíticas (proteases), sais, ácidos nucléicos, polissacarídeos, fenóis e/ou
proteínas muito abundantes precisam ser removidos ou inativados. Em material
vegetal podem ser incluídos, também, as ligninas, os pigmentos e os alcalóides.
Desses, os mais importantes interferentes, ou seja, os que mais causam
interferências ou erros nas determinações são os sais e as proteases.
As proteases devem ser inativadas para impedir a degradação das proteínas.
Inibidores de proteases são usualmente adicionados, mas podem modificar as
proteínas, causando erros nas análises [6]. Outras alternativas são levar a amostra ao
ponto de ebulição num tampão com dodecil sulfato de sódio (SDS / sem uréia) ou
inativar as proteases com valores de pH baixo (por exemplo, precipitando com ácido
tricloroacético – TCA). Porém, deve-se levar em conta a dificuldade de se inativar
completamente todas as proteases [14].
A precipitação das proteínas com ácido tricloroacético/acetona (TCA/AC) é
muito útil para minimizar a degradação destas e remover compostos interferentes, tais
como sais ou polifenóis. Entretanto, é importante ressaltar que podem ocorrer perdas
de proteínas devido à precipitação ou re-solubilização incompleta. Além disso, pode-
se obter um conjunto completamente diferente de proteínas extraídas com um tampão
de lise, dependendo se foi utilizada uma etapa prévia de precipitação ou não [15]. A
remoção de sais pode ser obtida pela diálise ou, como já dito acima, pela precipitação
de proteínas com TCA ou solventes orgânicos (por exemplo, acetona a zero grau
Celsius). Outra alternativa seria utilizar kits de limpeza ou a diluição da amostra para
que a concentração de sais fique abaixo do nível crítico (<100 mmol L-1) [16].
Grandes quantidades de lipídeos podem interagir com proteínas da membrana
e consumir detergentes. A remoção de lipídeos pode ser realizada pela extração com
solventes orgânicos (por exemplo, etanol ou acetona a zero grau Celsius). Neste
caso, podem ocorrer perdas significativas de proteínas se estas forem solúveis em
solventes orgânicos ou porque elas nem sempre se re-solubilizam [6].
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
11
Alternativamente, pode ser empregada a centrifugação a alta velocidade [17], seguida
da remoção da camada lipídica.
Polissacarídeos e ácidos nucléicos podem interagir com anfólitos e proteínas.
Além disso, estas macromoléculas podem aumentar a viscosidade das soluções. Um
procedimento comum para remoção é a precipitação das proteínas com acetona ou
TCA/acetona. Outras recomendações para remoção dos ácidos nucléicos é a
digestão com uma mistura de RNAses e DNAses (livres de proteases) ou por
ultracentrifugação e adição de uma poliamina básica [6].
Fenóis estão presentes em materiais vegetais, principalmente em folhas de
plantas e podem interagir com proteínas. Compostos polifenólicos podem ser
removidos pela adição de polivinilpolipirrolidona ou, também, pela precipitação com
TCA e subsequente extração de fenóis com acetona a 0ºC [18 - 20].
Wang et al. [21] propuseram um protocolo para extrair proteínas de tecidos de
plantas recalcitrantes (folhas e frutos). Foram utilizadas amostras de folhas de bambú
(Bambusa vulgaris), de uva (Vitis vinifera), de iris (Iris pseudacorus), de oliva (Olea
europea), de limão (Citrus limonum), de pinheiro (Pinus nigra), de sequóia (Sequoia
sempervirens), de cana de açúcar (Saccharum officinarum) e de tabaco (Nicotiana
tabacum) e frutas maçã, banana, grape, kiwi, azeitona, laranja, pêra e tomate. O
protocolo foi ajustado para processar pequenas quantidades de tecidos, em
microtubos, no intervalo de 1 h, podendo ser expandido para escalas maiores (cerca
de 1 a 5 g de tecido, em tubos de 30 a 50 mL). No protocolo proposto, a amostra era
macerada manualmente em nitrogênio líquido até se obter um pó fino e lavada com
TCA/acetona, metanol e, por fim, com acetona. A amostra era seca à temperatura
ambiente até a remoção de todo resíduo de acetona, para se então proceder a
extração e a precipitação das proteínas e do fenol. Os autores adicionaram entre 0,4
a 0,8 mL da amostra a um tampão contendo SDS e fenol na proporção de 1:1.
Misturaram e deixaram incubar por 5 min, centrifugando logo a seguir a 16000 g por 3
min. Transferiram a parte superior da fase fenólica a um novo microtubo, que continha
solução metanólica de acetato de amônio a 0,1 mol L-1, o qual era armazenado em
refrigerador a –20oC durante toda a noite. A seguir, a amostra era novamente
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
12
submetida à centrifugação, a 16000 g por 5 min (4oC) e então o sobrenadante era
descartado. A pastilha (contendo as proteínas) era lavada com metanol (PA) e
novamente lavada com acetona 80% (v/v). A seguir, a pastilha era seca e utilizada na
análise de proteínas (quantificação, PAGE ou IEF, etc). Os autores afirmaram que
utilizando o protocolo proposto foi possível extrair um número maior de proteínas e
com menos interferentes. Isto foi demonstrado por meio das imagens dos géis
eletroforéticos, tanto em uma como em duas dimensões, onde foi obtido um número
maior de spots de proteínas.
2.1.3. Solubilização de proteínas
Após o rompimento celular e a remoção dos compostos interferentes, os
polipeptídeos devem ser solubilizados e, dependendo da finalidade da análise,
desnaturados e reduzidos para romper as interações intra e inter-moleculares. A
solubilização da amostra é geralmente realizada com um tampão contendo
compostos caotrópicos (uréia ou tiouréia), detergentes não-iônicos ou zwitteriônicos
(por exemplo, Triton X-100), agentes redutores, anfólitos e, dependendo do tipo de
amostra, inibidores de protease. O tampão de solubilização mais popularmente usado
é o de O´Farrell [22], tal qual descrito ou com algumas modificações [22].
Dentre os compostos caotrópicos, a uréia é bastante eficiente na ruptura das
ligações de hidrogênio. Ela desnatura as proteínas pelo rompimento das ligações não-
covalentes e iônicas entre os resíduos de aminoácidos [3], levando ao desdobramento
e desnaturação da proteína. Em contraste, a tiouréia é muito adequada para a quebra
das interações hidrofóbicas, aumentando a solubilização de proteínas de membranas
hidrofóbicas [23, 24]. Atualmente, a solução mais indicada para solubilização de
proteínas hidrofóbicas é um tampão com uma combinação de 5 a 7 mol L-1 de uréia e
2 mol L-1 de tiouréia, com os detergentes apropriados.
Os detergentes são utilizados para impedir as interações hidrofóbicas entre os
domínios de proteínas hidrofóbicas, evitando a perda destas devido à agregação e
precipitação. A solubilização de proteínas em solução contendo o detergente aniônico
SDS, à temperatura de ebulição, tem sido recomendada [25, 26]. Entretanto, a
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
13
concentração crítica para o uso do SDS é abaixo de 0,2% (m/v), tornando, assim,
recomendável a troca desse detergente por outro não-iônico, como NP-40 ou Triton
X-100 (apesar de não serem tão efetivos para a solubilização de proteínas
hidrofóbicas de membrana como o SDS) ou por detergentes zwitteriônicos, como
sulfonato de 3-[(3-cloroamidopropil)dimetilamonio]-1-propano (CHAPS) ou
sulfobetainas (SB 3-10 ou ASB 14) [6]
Os agentes redutores promovem a redução e a prevenção da re-oxidação das
pontes dissulfeto. Eles são necessários na clivagem das pontes intra e
intermoleculares dissulfeto para se obter um desdobramento completo da proteína.
Os redutores mais comumente usados são o 1,4 ditiotreitol (DTT), o ditioeritritol
(DTE) e o 2-mercaptoetanol [27]. Existem outras indicações de redutores como: a
tributilfosfina (TBP) [28] e o tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) [29], mas a escolha do
DTT e DTE é predominante [30].
Chan et al. [13] também testaram várias combinações do uso de uréia e
tiouréia como agentes caotrópicos para a solubilização das proteínas do P. triestinum.
Eles usaram tampões com concentrações de 9,5 mol L-1 de uréia, 8 mol L-1 de uréia e
as combinações de 2 mol L-1 de tiouréia com 5 mol L-1 de uréia e, por último, 2 mol L-1
de tiouréia com 7 mol L-1 de uréia. Também estudaram os efeitos da adição de três
redutores (DTT, TBP e TCEP) nos tampões de re-hidratação (64 mmol L-1 de DTT, 2
mmol L-1 de TBP e 4 mmol L-1 de TCEP) e de equilíbrio, com ou sem o agente
alquilante iodoacetamida (0,26 mol L-1). Eles observaram um aumento no número de
spots nos géis de eletroforese ao se utilizar uréia e um aumento ainda maior ao se
utilizar a combinação de uréia e tiouréia, atribuindo esses aumentos ao efeito de
solubilização da uréia e da tiouréia. Quanto aos agentes redutores, eles observaram
que o gel onde utilizaram o tampão com TCEP apresentou melhor resolução em
comparação com os outros agentes e desaconselharam o uso do tampão com
iodoacetamida na última etapa de equilíbrio, por provocar a perda de proteínas de
baixa massa molar.
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
14
2.2 Plantas medicinais e fitoterápicos
A utilização de plantas com fins medicinais para tratamento, cura e prevenção
de doenças é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade. No
início da década de 90, a Organização Mundial de Saúde (OMS) divulgou que 65 a
80% da população dos países em desenvolvimento dependiam das plantas
medicinais como única forma de acesso aos cuidados básicos de saúde [31].
É cada vez mais freqüente o uso de plantas das medicinas tradicionais hindú e
chinesa, completamente desconhecidas dos povos ocidentais. Estas plantas
comercializadas são apoiadas em propagandas que prometem “benefícios seguros, já
que se trata de fonte natural”. Muitas vezes, entretanto, as supostas propriedades
farmacológicas anunciadas não possuem validade científica, por não terem sido
sequer indicadas no uso tradicional, ou por não terem tido suas ações farmacológicas
comprovadas em testes pré-clínicos ou clínicos [31].
Os fitoterápicos importados de países asiáticos são um grande risco para a
população, uma vez que as formulações são bastante diferentes das preparadas no
ocidente, contendo metais potencialmente tóxicos em concentrações que, muitas
vezes, ultrapassam os valores seguros para o consumo. Na medicina tradicional
indiana a importância de metais como ouro, cobre, estanho, chumbo, mercúrio, ferro,
prata e zinco é enfatizada. Assim, esses metais são utilizados geralmente junto com
extratos de plantas medicinais.
Estudos multidisciplinares envolvendo etnobotânicos, químicos, farmacólogos e
agrônomos (neste caso, no cultivo de ervas medicinais) são necessários para que
sejam ampliados os conhecimentos sobre as plantas medicinais: como agem, quais
são seus efeitos tóxicos e colaterais, como seriam suas interações com os
medicamentos alopatas e quais estratégias mais adequadas para o controle de
qualidade e produção de fitoterápicos, atendendo às novas normas das agências
reguladoras, como as resoluções da Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA).
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
15
No Brasil, resoluções recentes da ANVISA, de 16 de março de 2004 [32], visam
a normatização do registro de medicamentos fitoterápicos. A resolução-RDC número
48 determina que todos os testes referentes ao controle de qualidade de fitoterápicos
devem ser realizados em rede credenciada no sistema REBLAS (Rede Brasileira de
Laboratórios em Saúde) ou por empresas que possuam certificado de BPFC (Boas
Práticas de Fabricação e Controle) [32].
2.2.1 Plantas medicinais, fitoterápicos e fitofármacos - Definições
A OMS define planta medicinal como sendo “todo e qualquer vegetal que
possui, em um ou mais órgãos, substâncias que podem ser utilizadas com fins
terapêuticos ou que sejam precursores de fármacos semi-sintéticos” [33]. A diferença
entre planta medicinal e fitoterápico reside na elaboração da planta para uma
formulação específica, o que caracteriza um fitoterápico. Segundo a Secretaria de
Vigilância Sanitária, em sua portaria número 6 de 31 de janeiro de 1995, fitoterápico é
todo medicamento tecnicamente obtido e elaborado, empregando-se exclusivamente
matérias-primas vegetais, com finalidade profilática, curativa, paliativa ou para fins de
diagnóstico, com benefício para o usuário. É caracterizado pelo conhecimento da
eficácia e dos riscos do seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de
sua qualidade. É o produto final acabado, embalado e rotulado. Na sua preparação
podem ser utilizados adjuvantes farmacêuticos permitidos na legislação vigente. Não
podem estar incluídas substâncias ativas de outras origens, não sendo considerado
produto fitoterápico quaisquer outras substâncias ativas, ainda que de origem vegetal,
isoladas ou mesmo suas misturas. Neste último caso, encontra-se o fitofármaco, que
por definição “é a substância ativa, isolada de matérias-primas vegetais, ou mesmo,
mistura de substâncias ativas de origem vegetal” [32].
2.2.2. Plantas medicinais, fitoterápicos e fitofármacos - Perspectivas
Com o aumento da expectativa de vida, o número de doenças crônicas está
crescendo, e as respostas da medicina convencional não têm sido satisfatórias. Além
disso, muitos pacientes recusam-se a ingerir um número cada vez maior de
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
16
medicamentos sintéticos que geralmente apresentam efeitos colaterais consideráveis
e estão almejando por alternativas menos agressivas. Na Europa, essa tendência em
relação à medicina natural tende a continuar crescendo. Isso se aplica principalmente
ao campo da fitoterapia bem documentada, que tem se tornado cada vez mais aceita
e apreciada, não somente pelos pacientes como também pelos médicos. Na Ásia,
ambos os métodos de terapia, convencional e tradicional, são praticados igualmente,
sendo que nenhuma das duas é classificada como universal. Os fitoterápicos
apresentam diversos efeitos fisiológicos exatamente por conterem maior número de
substâncias, tornando sua pesquisa mais complexa. Relativamente poucas pesquisas
clínicas estão sendo conduzidas com plantas. Os motivos são principalmente
econômicos: as plantas não podem ser patenteadas; portanto, não existem incentivos
para se gastar grandes somas de dinheiro para provar que uma planta é segura e
efetiva, de acordo com os padrões exigidos para aprovação de um novo
medicamento. Apesar dessas dificuldades, são necessárias maiores contribuições
científicas, tanto da Farmacognosia como da Medicina para que a fitoterapia ocupe
definitivamente seu espaço na cura, prevenção e manutenção da saúde [34].
2.2.3. Espirulina, Ginkgo biloba e Castanha da Índia
Para o estudo sistemático dos procedimentos de extração de proteínas foram
escolhidas as amostras de fitoterápicos tradicionais, ou seja, plantas medicinais de
uso alicerçado na tradição popular, sem evidências, conhecidas ou informadas, de
risco à saúde do usuário, cujas eficácias são validadas por meio de levantamentos
etnofarmacológicos, documentações tecnocientíficas ou publicações indexadas [32].
Nestas amostras, as proteínas não são, na maioria das vezes, os princípios ativos,
mas coadjuvantes.
No presente trabalho os fitoterápicos escolhidos como amostras foram:
espirulina (Spirulina maxima), folhas de ginkgo biloba (Ginkgo biloba L.) e castanha
da Índia (Aesculus hippocastanum).
A espirulina, ou alga azul, pertence a um grupo de mais de mil e quinhentas
espécies de plantas aquáticas microscópicas. É uma cianobactéria. As duas espécies
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
17
mais comumente usadas para consumo humano são Spirulina maxima (Figura 1.1) e
Spirulina platensis . Elas são cultivadas em alguns lagos nas Américas Central e do
Sul e na África. Ela é um suplemento alimentar popular no Japão, Israel, França e
também é comercializada nos Estados Unidos [35, 36].
Figura 1.1. Espirulina (Spirulina máxima).
A espirulina é uma fonte rica em proteínas (de 50 a 65% m/m), com todos os
oito aminoácidos que são nutricionalmente requeridos. Entretanto, possui uma baixa
concentração de metionina, em relação aos outros aminoácidos presentes [37, 38].
Ela também possui em sua composição clorofila, carotenóides, minerais, ácido gama-
linoléico e alguns pigmentos específicos. Esses pigmentos, chamados de ficobilinas,
incluem a ficocianina e a aloficocianina. Os pigmentos dão à espirulina a cor de azul
ou verde intenso. As ficobilinas têm estruturas similares aos pigmentos da bile, tais
como a bilirrubina. Na célula da espirulina, as ficobilinas são ligadas às proteínas e o
complexo ficobilina-proteína é chamado ficobiliproteína [39].
Além do uso como suplemento alimentar, estudos preliminares in vitro e in vivo
têm apresentado algumas indicações de efeitos antivirais. Existem também algumas
evidências de que ela pode afetar favoravelmente algumas funções imunoprotetoras e
de que tenha capacidade hepatoprotetora. Além disso, em estudos recentes, existem
possibilidades de inibição de algumas reações alérgicas e efeitos hipocolesterômicos
[40, 41]. Ainda, é utilizada na alimentação de microcrustáceos, moluscos e peixes nos
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
18
primeiros estágios de desenvolvimento e no processo de purificação de águas,
removendo nitratos, fosfatos e outros elementos em grandes quantidades [37].
Com relação ao ginkgo biloba (vide Figura 1.2), tem havido um crescente
interesse pelo seu uso nos últimos anos, tanto no uso popular, quanto em termos
científicos. Uma prova desse crescente interesse é o grande número de citações
(quase 2 milhões) que se pode observar em sites de busca como o Google.
Chamada pelos japoneses pelo carinhoso nome de Yin- Kuo, fruto de prata, o
ginkgo (com nome científico de Ginkgo biloba L.), da família das Ginkgoáceas, é
considerado sagrado pelos budistas, sendo as suas árvores plantadas nas entradas
de todos os templos. Descrita pela primeira vez por volta de 1690 pelo médico alemão
Engelbert Kaelmpter, foi levada para a Europa somente no ano de 1727, sendo
considerada como um fóssil vivo [42].
O ginkgo, que faz parte do milenar arsenal terapêutico chinês, adapta-se muito
bem às características urbanas e ao clima temperado, não sendo exigente com os
solos. Resiste muito bem à poluição pesada, insetos, fungos, bactérias e vírus. As
partes utilizadas são as folhas, frutos e sementes, sendo as folhas a parte mais
comumente empregada [43].
Figura 1.2. Folhas de ginkgo biloba. Foto extraída do site: http://www.xs4all.nl/~kwanten/thetree.htm
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
19
A composição química das folhas de ginkgo é constituída por ácido butanóico,
ácido ginkgólico, ácidos graxos, alcanos, antocianina, asoginkgetina, benzenóides,
bioflavonóides, caferol, carboidratos, carotenóides, catequina, diterpenos
ginkgolídeos, ésteres de ácido cumárico, esteróis, fenilpropanóides, ginol, glicosídeos
flavonóides (principalmente ginkgobilina, quercetina e isoamnetina), kaempferol,
lactona bilobalida, lipídeos, minerais, quercetina, sitosterol e triterpenos. Nos frutos
também são encontrados ácidos ginkgólicos e ginol.
As suas folhas são consideradas adstringentes, antifúngicas, anti-helmínticas,
antiblenorrágicas, antiinflamatórias, antioxidantes, antiplaquetárias, bactericidas,
cardiotônicas, digestivas, estimulantes da circulação periférica, fungicidas,
rejuvenescedoras, revigorantes, tônicas, vasodilatadoras periféricas. Assim, as
indicações são inúmeras, tais como prevenir angiopatias, ansiedade e asma, para o
tratamento de deficiências de audição, inibir o crescimento de bactérias, promover a
sensação de bem-estar geral, bronquite, ajudar a combater câncer, recuperar a
capacidade intelectual, inibir a hiperpermeabilidade mediada pela bradicinina e
histamina (nos vasos capilares), cefaléia, combater a peroxidação lipídica das
membranas, ativar o metabolismo energético e no tratamento profilático do
envelhecimento das células, para o tratamento de irrigação deficiente no cérebro,
isquemia, distúrbios arteriais, má-circulação sangüínea, para melhorar a
concentração, para inibir o crescimento de fungos, furúnculos, prevenir infecções,
inibir o PAF (fator ativador de plaquetas), labirintite, melhorar ou recuperar a perda de
memória de pessoas idosas, em nível cerebral- aumentar o consumo de glicose e
oxigênio, facilitando a síntese de ATP, para combater radicais livres, reduzir vertigens
e zumbidos, entre outras [42].
No que se refere à castanha da Índia (Aesculus hippocastanum, Figura 1.3), a
sua árvore é nativa da Ásia e norte da Grécia. As primeiras indicações de uso datam
de 1565 e muitos anos depois seu uso cresceu por toda Europa. No leste da Europa,
ela foi usada durante muito tempo como alimento para cavalos e gado. A árvore
produz frutos dentro de cápsulas com espinhos, contendo de uma a três grandes
sementes, conhecidas como as castanhas da Índia. Tradicionalmente, várias partes
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
20
aéreas da árvore, incluindo as sementes, as folhas e a casca são usadas em
preparações medicinais [43].
Figura 1.3. Castanha da Índia (Aesculus hippocastanum). Ilustração extraída de
http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Illustration_Aesculus_hippocastanum0.jpg
As sementes têm em sua composição química saponinas, responsáveis pelo
sabor acre e amargo, taninas, d-catecol, pectina, leucoantocianina, potássio, óleos
voláteis, cálcio, fósforo, entre outros. Os princípios ativos mais importantes são os
flavonóides derivados, saponinas triterpênicas (escina, proescina e escigenina) e
aminoácidos (adenina, adenosina, guanina, lisina e triptofano) [44]. Devido à presença
da escina, a castanha é usada para promover a circulação nas veias [45]. A escina
força o tônus normal nas paredes das veias, promovendo o retorno do sangue para o
coração. Portanto, ela é usada para o tratamento de insuficiência venosa crônica e,
numa menor extensão, no tratamento de veias varicosas. Ela também possui
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
21
propriedades anti-inflamatórias e tem sido usada para a redução de edemas após
traumas, particularmente usada após traumas de esportes e cirurgias [45, 46].
2.3 Determinação de proteínas totais
Muitos métodos ao longo dos anos têm sido propostos para a determinação de
proteínas totais, mas não existe uma metodologia considerada de uso universal para
todos os meios [47]. Dentre os métodos espectrofotométricos, os mais utilizados
geralmente, são:
Biureto [48], que se baseia na reação do reativo do biureto, uma mistura de
cobre e hidróxido de sódio com um complexante (tartarato de sódio) que estabiliza o
cobre em solução. O cobre, em meio alcalino, reage com proteínas formando um
complexo quadrado planar com a ligação peptídica; o de Lowry [49], que se baseia
numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico, que sofre uma redução
quando reage com proteínas, na presença do catalisador cobre (II) e produz um
composto com absorção máxima em 750 nm; o de Bradford [50] e de Smith ou BCA
(ácido bicinchonínico, 4,4´-dicarboxi-2,2´-biquinolina) [51], se baseia na reação do
cobre (II) com proteínas, em meio alcalino, produzindo cobre (I) e formando um
complexo com BCA, que absorve fortemente na região de 560 nm; e de
espectrofotometria de absorção no ultravioleta [52]. Além desses, também são muito
utilizados métodos que fazem a determinação de proteínas totais por meio do carbono
total ou do nitrogênio total (método de Kjeldahl) [53]. Cada um deles possui suas
vantagens e limitações e são mais aplicados a tipos de amostras específicas. Outra
consideração que se deve fazer quanto à escolha do método a ser utilizado diz
respeito ao meio em que as proteínas estão e se esse meio pode ser considerado
como um interferente, alterando os resultados finais. A seguir, serão apresentados
dois métodos que foram escolhidos para serem aplicados na determinação de
proteínas totais neste trabalho de Tese.
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
22
2.3.1 Método de Bradford
O método de Bradford, proposto por Marion M. Bradford e publicado em 1976
[50] é considerado, dentre os métodos espectrofotométricos para a determinação de
proteínas totais, como um dos mais sensíveis e rápidos [47]. Ele tem sido utilizado
para a determinação de proteínas totais em diversos meios: plasma ou soro
sanguíneo [54, 55], líquor [56 - 58], saliva humana [59], produtos alimentícios, leite
humano [60, 61], tecidos de plantas [62], suspensões de células [63, 64] e outros.
Este método é baseado na interação entre o corante Coomassie brilliant blue
BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais
básicas ou aromáticas. No pH da reação, a interação entre a proteína de alta massa
molar e o corante BG-250, provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a
forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm [65].
Apesar de suas vantagens, este método apresenta algumas limitações tais
como, a variação da absortividade específica para diferentes proteínas, devido à
baixa solubilidade [66, 67] ou baixa massa molar das mesmas, e fornecimento de
resultados nem sempre reprodutíveis devido ao grau de pureza do corante BG-250,
que varia conforme a procedência. Por isso é recomendável a padronização das
condições de reação para cada lote de corante adquirido.
Para tornar mais uniforme a absortividade específica, algumas alternativas são
sugeridas, tais como aumentar a concentração do corante ou aumentar a
solubilização das proteínas que vão reagir com o corante usando detergentes [68, 69],
hidróxido de sódio [70] ou fenol [71], ou aquecer com uréia e 2-mercaptoetanol [72].
Existem algumas substâncias citadas na literatura que produzem interferências
no método de Bradford. Elas normalmente reagem com as proteínas, impedindo a
reação com o corante BG-250 ou reagem com o corante causando aumento na
absorbância. Os interferentes mais comuns são tolbutamida, uréia, cloreto de sódio
ou potássio, detergentes (Triton X-100, SDS, Tween-20), ciclodextrinas, polifenóis e
polifenóis oxidases, 2-mercaptoetanol mais guanadina, glicerol, lipídeos,
cloropromazina e fluoreto [47]. Os métodos de eliminação destes interferentes variam
conforme o caso, existindo informações disponíveis na literatura.
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
23
2.3.2 Método de Kjeldahl
O método foi proposto por Johan Kjeldahl em 7 de março de 1883 na
Sociedade de Química da Dinamarca [73], quando estudava proteínas em grãos. O
método original sofreu várias modificações, mas continua sendo, ainda, muito
utilizado para a determinação de proteínas totais em alimentos [53]. Além disso, este
método tem sido utilizado como um método padrão de análise de nitrogênio para
água, fertilizantes e combustíveis fósseis [73].
Este método determina nitrogênio orgânico total, isto é, o nitrogênio protéico e
não protéico orgânico. Porém, na maioria dos alimentos, o nitrogênio não protéico
representa muito pouco no total. A razão entre o nitrogênio medido e a proteína
estimada depende do tipo de amostra e de outros fatores. Por exemplo, no trigo esta
razão é afetada pelas condições de crescimento e quantidade e tipo de fertilizante
utilizado. Para converter o nitrogênio medido para proteína, deve-se multiplicar o
conteúdo de nitrogênio por um fator arbitrário, que representa um fator médio para o
material em estudo, que é 5,7 para o trigo, e 6,25 para alimentos em geral [53].
O método de Kjeldahl para determinação de nitrogênio amoniacal é composto
de três passos distintos, que são digestão, destilação e titulação. O propósito da
digestão é quebrar a estrutura ou as ligações químicas de substâncias complexas em
substâncias ou estruturas químicas mais simples. Especificamente, proteínas são
quebradas e convertidas em amônio [73]. Para isso, se aquece a amostra com ácido
sulfúrico para digestão até que o carbono e hidrogênio sejam oxidados. O nitrogênio
da proteína é liberado e transformado em sulfato de amônio.
A destilação envolve a separação do amônio do digerido. Isto é realizado pelo
aumento do pH adicionando-se hidróxido de sódio, possibilitando ocorrer a mudança
do íon NH4+ para amônia (NH3). Aquece-se a solução para a liberação da amônia
dentro de um volume conhecido de uma solução de ácido bórico, formando borato de
amônio.
A determinação da quantidade de nitrogênio no frasco condensado pode ser
realizada de várias maneiras. A mais comum é a titulação com uma solução padrão
de ácido clorídrico na presença de uma mistura de indicadores (verde de bromocresol
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
24
e vermelho de metila) [73]. Existe uma segunda maneira de recolher a amônia, em
solução ácida (H2SO4 padrão) em excesso e depois titular o ácido que não reagiu com
a amônia, com uma solução básica padronizada (NaOH). Esta segunda maneira tem
a desvantagem de necessitar de duas soluções padronizadas e também de fazer a
determinação indiretamente [53].
Algumas modificações foram sugeridas, como a adição de catalisadores. Em
1885, Wilforth [53] sugeriu a adição de óxidos de metais de mercúrio, cobre, ferro, etc.
para acelerar a digestão da amostra. Praticamente todos os metais da tabela
periódica foram testados na digestão da amostra, porém, mercúrio, cobre e selênio
foram os que apresentaram melhores resultados. Atualmente é utilizada uma mistura
dos três catalisadores, pois assim não apresentariam problemas na pequena
concentração em que são utilizados na mistura. Outra modificação foi a adição de
sulfato de potássio, sugerida por Gunning em 1889. A adição deste reagente tinha por
objetivo aumentar a temperatura do ponto de ebulição da mistura na digestão,
acelerando o processo. No entanto, o excesso de sulfato de potássio pode causar
decomposição por excesso de aquecimento, com perda da amônia. Verificou-se que a
temperatura deve ficar entre 370 e 410oC.
No método, a amônia liberada é recolhida em ácido padronizado. Na
modificação, o recolhimento é feito em excesso de ácido bórico. O borato de amônio
formado é que vai ser titulado com um ácido padronizado. Esta modificação é
vantajosa no sentido de que é necessária somente uma solução padronizada. Nem a
quantidade (cerca de 50 mL), nem a concentração (cerca de 4% m/v) de ácido bórico
necessitam ser exatas [53].
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Equipamentos e acessórios
Os seguintes equipamentos e acessórios foram utilizados para o desenvolvimento
desta parte do trabalho:
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
25
• Agitador por efeito vortex, marca Thermolyne, modelo M-37600;
• Balança analítica, marca Mettler, modelo AE200;
• Banho maria, marca Marconi, modelo MA127;
• Centrífuga, marca Nova Técnica, modelo NT 811;
• Cuba de sonicação, marca Ultrasonik, modelo Unique 1400;
• Destilador de Nitrogênio, marca Marconi, modelo MA036;
• Digestor de micro-Kjeldahl, marca Gerhardt, modelo KB40;
• Espectrofotômetro UV/Vis, marca Micronal, modelo B582;
• Estufa Spencer, com ventilação forçada, marca Marconi;
• Membrana para diálise, marca Spectrum Laboratories Inc., modelo MWCO: 6-
8000;
• Ultracentrífuga refrigerada, marca BioAgency, modelo Bio-Spin-R;
• Sistema desionizador Milli-Q, marca Millipore, modelo Quantum TM cartridge;
• Vidrarias apropriadas.
3.2 Reagentes e soluções
Todos os reagentes usados são de grau analítico, sendo as soluções preparadas com
água desionizada. A seguir, são listados todos os reagentes/soluções empregados
nesta parte do trabalho:
• Ácido bórico PA, H3BO3 , MM = 61,83 g mol-1 (Synth);
• Ácido clorídrico 38%, HCl, MM = 36,46 g mol-1 (J. T. Baker);
• Ácido fosfórico 85% (m/m), H3PO4, MM = 98,00 g mol-1 (Merck);
• Ácido sulfúrico 95 – 97% (m/m), H2SO4, MM= 98,02 g mol-1 (Merck);
• Albumina de soro bovino (Merck);
• Azul de Coomassie G-250, C47H50N3NaO7S2, MM = 854,03 g mol-1 (J.T. Baker);
• Etanol 95%, C2H6O, MM = 46,07 g mol-1 (J. T. Baker);
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
26
• Sulfato de potássio, K2SO4, MM = 174,27 g mol-1 (Isofar);
• Sulfato de cobre, CuSO4, MM = 159,63 g mol-1 (Isofar);
• Hidróxido de Sódio, NaOH, MM = 40,00 g mol-1 (Nuclear);
• Vermelho de metila, C15H14N3O2Na, MM = 291,29 g mol-1 (Isofar);
• Verde de bromocresol, C21H14Br4O5S, MM = 698,02 g mol-1 (Vetec);
• O reagente de Bradford consistiu em uma mistura de azul de Coomassie G-250
a 0,01% (m/v), 5% (v/v) de etanol e 10% (v/v) de ácido fosfórico. Após 5 min de
reação, foi determinada a absorbância das amostras em 595 nm, por
espectrofotometria UV/Vis.
• Os indicadores foram preparados numa solução alcoólica de vermelho de
metila a 0,2% (m/v) e de verde de bromocresol a 0,2% (m/v).
3.3 Preparo das amostras
As folhas de ginkgo biloba foram colhidas da árvore plantada no campus da
Universidade Federal de Alfenas – Unifal-MG [Apêndice 1] nos dias 28 de outubro de
2003 e 28 de fevereiro de 2004 (primavera e verão, respectivamente). Foram
escolhidas folhas que apresentavam tamanho e cor de folhas adultas, mas não
aquiescentes. As folhas foram lavadas com água destilada e secas com ventilação
forçada, à 45oC por 12 h, até massa constante. Observou-se uma perda de 65% na
massa das folhas, devido à perda da água.
As amostras de espirulina (em pó) foram gentilmente cedidas pela farmácia de
manipulação Musgo (Alfenas, MG), cuja origem e informações químicas, físico-
químicas e microbiológicas estão disponíveis no laudo do fornecedor da amostra
[Apêndice 2]. Estas amostras não sofreram qualquer tipo de manipulação, uma vez
que já estavam secas e em pó.
As amostras de castanha da Índia (in natura) foram adquiridas no mercado
local (Alfenas, MG) e não se obtiveram informações quanto à origem ou idade das
castanhas, entretanto foram identificadas pelo Prof. Dr. Geraldo Alves da Silva do
Laboratório de Plantas Medicinais e Fitoterápicos da Universidade Federal de Alfenas,
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
27
MG [Apêndice 3]. Estas amostras foram manualmente descascadas, retirando-se a
casca marrom e a película que envolvia as castanhas, picadas e também secas à
45oC em estufa Spencer, com ventilação forçada durante 10 h, até massa constante.
Observou-se nessas amostras uma perda de apenas 3% na massa devido à perda de
água. Portanto, considerou-se esse valor desprezível e assumiu-se que o
procedimento de secagem não seria utilizado para este tipo de amostra.
3.4 Extração das proteínas
Onze procedimentos de extração foram propostos, sempre realizados em
triplicata. Para cada extração foram utilizados 500 mg das amostras (peso seco). Em
seguida, foram adicionados 5 mL de água desionizada ou de tampão composto por
1,0 mol L-1 de Tris-HCl, pH 6,8. Estes meios extratores foram escolhidos por não
apresentarem interferência nas medidas espectrofotométricas para a determinação da
concentração de proteínas (Método de Bradford) [50]. Após a adição dos meios
extratores, as amostras eram processadas, ou seja, eram submetidas aos
procedimentos, conforme descritos no Quadro 1.1.
A estratégia para a escolha dos procedimentos de extração de proteínas
baseou-se inicialmente em procedimentos físicos que favorecessem o rompimento
das membranas celular e das organelas e de outras estruturas das células. Estes
procedimentos variavam desde a simples agitação da amostra no meio extrator, a
simples maceração manual da amostra no mesmo meio, até a combinação de vários
procedimentos aplicados consecutivamente. Também foi proposta a utilização de
procedimentos com diálise, onde além de se provocar a lise osmótica das estruturas
celulares, também se procederia a uma limpeza nos extratos protéicos. Os
procedimentos 1 a 9 foram realizados à temperatura ambiente, enquanto os
procedimentos 10 e 11 foram realizados à 40oC. Nestes últimos, as amostras eram
processadas em banho-maria, com a temperatura controlada.
Após a adição do meio extrator, a amostra era agitada manualmente por cerca
de 5 min. Para a maceração, a amostra, após a pesagem, era colocada em um
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
28
almofariz de porcelana com o meio extrator e era macerada à temperatura ambiente,
ou à 40oC durante 15 min. Para a diálise, a amostra, depois de sofrer agitação ou
maceração, era inserida num envoltório de celofane (Membrana MWCO: 6-8000,
Spectrum Laboratories Inc., EUA), que era amarrado a um bastão de vidro e
colocados dentro de um béquer contendo 2 L de água desionizada à temperatura
ambiente, sob agitação magnética. Procedeu-se a troca de água a cada 6 h,
totalizando em um período de 42 h de diálise.
Para a sonicação, foi inicialmente realizada uma calibração do aparelho de
ultra-som [74]. Para isso, foram escolhidas duas posições na região central da cuba
do equipamento, onde foram colocados dois tubos de ensaio contendo a amostra
espirulina adicionada de água desionizada. Também foram avaliados os tempos de
sonicação das amostras. Assim, as amostras foram sonicadas nas duas posições
escolhidas (em relação ao centro da cuba), durante 5, 10 e 15 min. Com a otimização,
verificou-se que a melhor posição era no centro da cuba e o melhor tempo de
sonicação de 10 min. Desta forma, as amostras após serem agitadas, maceradas ou
dialisadas, eram submetidas à sonicação, à temperatura ambiente ou a 40oC.
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
29
Quadro 1.1: Procedimentos de extração de proteínas para as diferentes amostras.
Procedimento Descrição
1 Amostras* manualmente agitadas em água por cerca de 5 min;
2 Amostras* manualmente agitadas em tampão** por cerca de 5 min;
3 Amostras agitadas e dialisadas em água***, por 42 h;
4 Amostras* manualmente maceradas em água***, em um almofariz, por 15 min;
5 Amostras* manualmente maceradas em tampão**, em um almofariz, por 15 min;
6 Amostras* maceradas e dialisadas em água, por 42 h;
7 Amostras* agitadas em água***, por 5 min, e submetidas à sonicação por 10 min;
8 Amostras* manualmente maceradas em água***, em um almofariz, e sonicadas por 10 min;
9 Amostras* manualmente maceradas em tampão**, em um almofariz, e sonicadas por 10 min;
10 Amostras* preparadas de acordo com procedimento 8, mas à 40oC;
11 Amostras* preparadas de acordo com procedimento 9, mas à 40oC;
* 0,5 g da amostra espirulina ou gingko biloba ou castanha da Índia; ** 5,0 mL de tampão 1,0 mol L-1 de Tris-HCl, pH 6,8; *** 5,0 mL.
Após finalizar cada procedimento, as amostras foram centrifugadas por 5 min à
8500 g e à temperatura ambiente. Apesar da alta porcentagem de gordura presente
na amostra de castanha da Índia (em torno de 5%) [75, 76], não foram adicionados
detergentes na água ou no tampão de Tris-HCl durante as extrações, devido à
possibilidade de interferência nas determinações das proteínas totais [50]. A gordura
foi separada das soluções sobrenadantes durante a centrifugação, sendo removida
manualmente. As soluções sobrenadantes foram consideradas como os extratos
protéicos e foram armazenados em frascos Eppendorf® e congelados à -18oC.
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
30
3.5 Determinação da concentração de proteínas totais
3.5.1. Método de Bradford
A determinação da concentração de proteínas totais presentes nos extratos
protéicos das amostras de espirulina, castanha da Índia e gingko biloba foi feita
utilizando o método de Bradford [50], em triplicatas. Para isso, as amostras foram
diluídas a um volume final de 5 mL com tampão Tris-HCl a 1 mol L-1 (pH 6,8) ou com
água desionizada. O fator de diluição para qualquer extrato protéico foi sempre de 10
vezes, ou seja, para cada 500 mg de amostra obteve-se um volume de 5 mL de
extrato protéico.
A concentração protéica total presente nos extratos foi expressa utilizando a
albumina de soro bovino como padrão. Para isso, foi feita a curva analítica de
calibração na faixa de concentração entre 1 a 6 mg L-1, com o mesmo tampão usado
nas diluições das amostras ou com água desionizada.
Para as medidas espectrofotométricas, pipetaram-se, em cubetas de plástico,
100 µL do extrato protéico diluído apropriadamente. Em seguida, foram adicionados
900 µL da solução denominada reagente de Bradford.
3.5.2. Método de Kjeldahl
Foram pesados 100 mg da amostra espirulina (seca) utilizando-se papel
manteiga, que foram transferidos para o tubo de Kjeldahl, sempre em triplicata.
Adicionaram-se ao tubo 600 mg de K2SO4, 300 mg de CuSO4 e 4 a 6 mL de
H2SO4. A seguir foi feita a digestão ácida em bloco digestor, à 350oC, até a amostra
se tornar incolor e o tubo foi adaptado ao aparelho de micro-Kjeldahl, colocando-se o
erlenmeyer (contendo 10 mL da solução de ácido bórico saturada mais indicadores)
na sua posição para receber o destilado. Foi misturada 1 parte da solução de
vermelho de metila com 5 partes de solução de verde de bromocresol.
Adicionaram-se de 15 a 20 mL da solução de NaOH 50% (m/v) lentamente,
recebendo o destilado no erlenmeyer e coletando cerca de 50 mL do destilado. A cor
passou de rosa para azul esverdeada. Titulou-se com a solução fatorada de HCl
0,02mol L-1 até o aparecimento de cor violeta ou rosa.
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
31
Para determinar a quantidade de nitrogênio total na amostra seca e transformar
em porcentagem de proteína utilizou-se a fórmula:
Nitrogênio (%) = V x M x 14 x 100/A,
onde, V é o volume de HCl 0,02 mol L-1 gasto na titulação (volume utilizado na
titulação da amostra menos o volume utilizado na titulação do branco), M é a
concentração molar exata da solução de HCl (0,02 mol L-1) e A é a quantidade da
amostra utilizada (em mg).
Foi demonstrado que o nitrogênio corresponde a 16% da composição das
proteínas [73], para os alimentos em geral. Portanto, dividindo 100 por 16, obtém-se o
fator de conversão de nitrogênio para proteína igual a 6,25. Para a transformação em
porcentagem de proteína, o valor de nitrogênio (%) determinado foi multiplicado por
esse fator.
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Os resultados das concentrações de proteínas totais dos extratos protéicos são
apresentados na Tabela 1.1, sendo que as curvas analíticas obtidas usando o método
de Bradford apresentaram coeficientes de correlações lineares (R2) entre 0,986 e
0,996.
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
32
Tabela 1.1: Concentrações de proteínas totais ± desvio padrão (em mg g-1) nas amostras determinadas pelo método de Bradford (n=3) para os diferentes processos de extração de proteínas.
Procedimento / Amostra
Número Castanha da
Índia (mg g-1)
Espirulina
(mg g-1)
Ginkgo biloba
(mg g-1)
1 Agitação em água 18,1±0,6 99±4 4,3±0,3
2 Agitação em tampão 15,1±0,6 58±4 2,6±0,5
3 Agitação e diálise em água 12,2±0,4 55±2 3,8±0,2
4 Maceração em água 30,4±0,8 133±5 3,6±0,4
5 Maceração em tampão 35,9±0,2 132±4 2,7±0,3
6 Maceração e diálise em água 17,4±0,8 74±5 1,4±0,1
7 Agitação em água e
sonicação
23,1±0,4 66±1 0,79±0,02
8 Maceração em água e
sonicação
33,8±0,9 92±4 4,4±0,6
9 Maceração em tampão e
sonicação
55±1 222±4 2,7±0,2
10 Idem procedimento 8, à 40oC 48±2 125±4 ND
11 Idem procedimento 9, à 40oC 38±2 95±4 ND
ND – não detectado
Estes resultados não forneceram informações sobre o tipo de proteínas
extraídas, isto é, por meio desses resultados não foi possível saber se houve alguma
proteína que foi extraída em maior quantidade do que outra, ou se algumas foram
extraídas ou não dependendo do procedimento utilizado. Nem mesmo foi possível
determinar quais proteínas estavam sendo extraídas, ou se elas estavam intactas (ou
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
33
não) após a extração. Para isso seria necessário se utilizar outros métodos de
caracterização, sendo um assunto a ser abordado no Capítulo 2 dessa Tese, onde
será tratada a caracterização das proteínas. Assim, o que se pode inferir apenas a
respeito das proteínas, é que se tratavam de proteínas hidrossolúveis, devido aos
meios extratores utilizados. Apesar dessas limitações, os resultados apresentados na
Tabela 1.1 foram utilizados para a comparação da eficiência relativa de extração.
Com relação aos meios extratores, estes foram escolhidos por não
apresentarem interferência na determinação de proteínas totais, de acordo com a
literatura [47, 50]. Foi tomado o cuidado de se extrair as proteínas apenas com água
ou com tampão Tris-HCl, sem a adição de qualquer concomitante. Entretanto, não se
pode ignorar que na composição da própria amostra, principalmente após a
maceração e quando existir a liberação de substâncias fenólicas, existam
concomitantes que possam alterar os resultados. Para uma provável minimização
destes concomitantes, deveria se proceder a uma etapa de limpeza, talvez
precipitação e re-solubilização das proteínas num meio sem concomitantes, para
finalmente se realizar a determinação por Bradford.
Por outro lado, sabe-se que a cada etapa adicionada, principalmente de
limpeza, corre-se o risco de perdas de proteínas, ou seja, no resultado final se teria
também uma alteração na concentração de proteínas totais. Finalmente, optou-se por
não adicionar mais nenhum passo ou procedimento de limpeza, mas apenas tomar-se
os cuidados já citados.
Inicialmente pode-se observar, a partir dos resultados da Tabela 1.1, que os
procedimentos mais eficientes para a extração (aqui se utiliza esse termo no sentido
de maior concentração de proteínas extraídas) foram os procedimentos 8 e 9 para
todas as amostras, ou seja, os procedimentos onde se utilizou a maceração manual
seguida de sonicação, para os dois meios extratores. Para a amostra de ginkgo biloba
se alcançou uma concentração de proteínas totais de 4,4 ± 0,6 mg g-1 ao se utilizar o
procedimento 8. Já para as amostras de castanha da Índia e espirulina obtiveram-se
concentrações de proteínas totais de 55 ± 1 e 222 ± 4 mg g-1, respectivamente,
utilizando-se o procedimento 9. Estas concentrações de proteínas representam,
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
34
respectivamente, 0,4%, 5,5% e 22% m/m da composição das amostras de ginkgo,
castanha e espirulina.
Ao se compararem os valores obtidos com a literatura, é possível verificar que
as concentrações obtidas para a castanha da Índia estão em concordância com os
valores publicados (concentrações entre 0,4 e 11,0% m/m) [75 - 77]. Gumilevskaya et
al. [78] observaram que as castanhas da Índia não acumulam grandes quantidades de
proteínas de armazenamento e que a quantidade total de proteínas não excederia
7,5% em peso seco. Portanto, o resultado obtido do procedimento 9 representando
5,5% da concentração de proteínas totais está em concordância com os valores
esperados.
Já para a ginkgo biloba, os máximos valores obtidos (4,4 ± 0,6 mg g-1, que
corresponderiam a 2,2 mg de proteínas em 500 mg de amostra, ou seja, 0,44% m/m)
foram abaixo dos apresentados pela literatura (em torno de 9% m/m) [79], o mesmo
ocorrendo para a espirulina. Para esta última amostra, o máximo valor obtido (222 ± 4
mg g-1, corresponderiam a 111 mg de proteínas em 500 mg de amostra, ou seja,
22,2% m/m) foi menor que o apresentado pelo laudo de análise (61,6% m/m)
[Apêndice 2] e também menor do que os valores apresentados pela literatura (de 55 a
70% m/m) [80].
Devido à discrepância entre os valores obtidos e os apresentados pela
literatura para a concentração de proteínas totais das amostras ginkgo biloba e
espirulina, houve a preocupação em se determinar a concentração de proteínas totais
por meio de outro método, que não fosse espectrofotométrico. Para isso, foi escolhida
a espirulina uma vez que essa amostra possui um laudo de análise, cujas
especificações foram determinadas de acordo com a British Herbal Pharmacopeia
(1996) e a World Health Organization – Geneva (1978). Assim, foi determinada a
concentração de proteínas totais da espirulina por meio do método de Kjeldahl [53],
obtendo-se o valor de 554 ± 5 mg g-1 de proteínas totais. Esse valor corresponde a
55,4% (m/m) da composição da amostra, que comparado ao valor do laudo de análise
(61,6% m/m) se mostrou menos discrepante do que aquele obtido pela análise
espectrofotométrica. Isto nos sugere que, possivelmente, os valores apresentados
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
35
pela literatura sejam obtidos por métodos não espectrofotométricos, como, por
exemplo, o de Kjeldahl.
Diante de resultados tão diferentes obtidos por esses dois métodos, vale a
pena algumas considerações. O método de Kjeldahl é muitas vezes considerado
como um método para validação [81], onde se considera que a contribuição do
nitrogênio não orgânico ou o orgânico proveniente de outras estruturas é desprezível
frente à parcela do nitrogênio orgânico proveniente da composição das proteínas.
Entretanto, na composição da amostra espirulina as proteínas contribuem com 50 a
70% (m/m) da composição e os aminoácidos essenciais livres com 30% (m/m) [43].
Essa contribuição dos aminoácidos essenciais livres é significativa, ou seja,
influenciaria significativamente no resultado da determinação de nitrogênio orgânico
na amostra e, conseqüentemente, no resultado da concentração de proteínas totais
pelo método de Kjeldahl, trazendo dúvida quanto à exatidão dos resultados deste
método.
Por outro lado, o método de Bradford, apesar de suas vantagens, tem se
mostrado altamente dependente do grupo de proteínas que compõem a amostra,
representando o maior problema para o uso indiscriminado deste método [81]. Como
exemplos, Keller e Neville [59] compararam os métodos do biureto, do BCA (ácido
bicinchonínico, 4,4´-dicarboxi-2,2´-biquinolina) [51], de Lowry e de Bradford para a
determinação de proteínas em leite humano. Nestes estudos, o valor para a
concentração de proteínas obtidas pelo método de micro-Kjeldahl foi utilizado como
padrão. Enquanto os resultados fornecidos pelos métodos do biureto, de Lowry e do
BCA superestimaram a concentração de proteínas, o de Bradford subestimou o valor
da concentração de proteínas. Fountoulakis e colaboradores [66] compararam o
método de Bradford, do BCA e de Lowry para um conjunto de proteínas glicosiladas e
não-glicosiladas. Para as proteínas não-glicosiladas os três métodos forneceram
valores consistentes com aqueles obtidos por análise quantitativa de aminoácidos.
Porém, para as proteínas glicosiladas o método de Bradford forneceu valores mais
baixos, enquanto que os de Lowry e do BCA forneceram valores acima do obtido pela
análise de aminoácidos. Quanto à composição da amostra espirulina, conforme já foi
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
36
descrito no item 3.2.3 deste capítulo, existem algumas proteínas que possuem
corantes ligados às suas estruturas. Estas são conhecidas como ficocianinas ou
ficobiliproteínas. Na estrutura de uma ficobiliproteína, o cromóforo linear tetrapirrólico
(bile) se liga covalentemente via uma ou duas ligações tiól-éter aos resíduos de
cisteína de uma apoproteína [82].
É interessante também verificar o mecanismo de interação entre o corante
coomassie e a proteína. Sedmark e Grossberg [83] sugeriram que a ligação do
corante à proteína seria mediada pela interação com grupos amina protonados na
proteína. Além deles, de Moreno et al. [84] demonstraram a importância dos grupos
amina nas proteínas, sugerindo que os grupos sulfônicos no corante formariam um
par iônico com os resíduos de lisina e arginina. Assim, somente as espécies
desprotonadas (ionizadas) do corante coomassie se ligariam à proteína (resíduos
lisina e arginina) [85, 86]. Portanto, pode-se supor que, apesar do coomassie e da bile
se ligar a resíduos diferentes na proteína, a bile provocaria dificuldades ou
impedimento estérico para o coomassie se ligar à proteína, levando a resultados
subestimados fornecidos pelo método de Bradford para a concentração de proteínas
totais para esta amostra. Com isso, entende-se que a amostra espirulina possui um
conjunto de proteínas na sua composição que não é adequado para a determinação
pelo método de Bradford.
Pelos argumentos apresentados acima, escolheu-se para a continuidade do
trabalho da Tese a amostra de castanha da Índia, uma vez que essa apresentou
resultados diretamente concordantes com a literatura, os quais passarão a ser
discutidos.
A partir dos resultados da amostra castanha da Índia na Tabela 1.1 e
considerando o valor máximo obtido para a concentração de proteínas totais
(castanha da Índia: 55 mg g-1, quando o meio extrator era o tampão Tris HCl à 1,0 mol
L-1, pH 6,8) como valor de referência (100%), foram comparados os procedimentos de
extração:
Observaram-se diminuições de 34,7% na quantidade de proteínas extraídas
entre os procedimentos 5 (quando a amostra era macerada no meio extrator) e 9, e
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
37
de 72,5% entre os procedimentos 2 (quando a amostra era agitada no meio extrator)
e 9, ou seja, entende-se que os procedimentos de agitação e maceração não foram
tão eficazes na extração das proteínas.
Quando a água foi utilizada como meio extrator, houve uma diminuição de 10%
na quantidade extraída de proteínas totais entre os procedimentos 4 (quando a
amostra era macerada no meio extrator) e 8, e de 46,4% entre os procedimentos 1
(quando a amostra era agitada no meio extrator) e 8. Assim, verificou-se que quanto
maior o número de passos adicionados aos procedimentos de extração das proteínas,
isto é, a agitação seguida da maceração e sonicação, se aumentava o rompimento
celular liberando mais proteínas das membranas e organelas celulares vegetais e se
aumentava a concentração das proteínas extraídas.
Os menores valores das concentrações de proteínas totais foram obtidos
naqueles procedimentos onde foi utilizada a diálise (o que já se esperava, uma vez
que a diálise pode ser considerada um procedimento bastante ameno comparado aos
outros procedimentos utilizados e levando-se em conta o tipo de amostra bastante
complexa): diminuições de 48,5% entre os procedimentos 6 (quando a amostra era
macerada em água e submetida à diálise) e 8, e de 64% entre os procedimentos 3
(quando a amostra era submetida à diálise em água) e 8. Apesar deste procedimento
“limpar” as amostras, ou seja, partículas e fragmentos de proteínas ou proteínas
menores do que 8 kDa passarem pela membrana, entende-se que as proteínas,
dentro de membranas ou organelas, provavelmente não foram extraídas, ou ainda,
que apenas ao se usar a agitação seguida de diálise as proteínas não tenham sofrido
total desnaturação. Isso poderia dificultar o acesso ou a ligação do corante coomassie
à proteína, justamente pelo enovelamento (estrutura terciária) da proteína.
Portanto, em termos de concentrações de proteínas totais, os procedimentos mais
eficientes foram aqueles onde era utilizada a agitação seguida de maceração,
sonicação e centrifugação, à temperatura ambiente ou à 40oC (procedimentos 8, 9, 10
e 11) e os menos eficientes (sob as condições analisadas) foram aqueles onde a
diálise foi utilizada (procedimentos 3 e 6).
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
38
5. CONCLUSÕES PARCIAIS
Este capítulo confirma a influência do preparo de amostras, tanto dos
procedimentos de extração como dos meios extratores nos resultados de proteínas
totais nas amostras estudadas.
Quanto ao preparo de amostras, foram levantadas informações relevantes
quanto aos procedimentos, reagentes e cuidados a serem tomados a fim de que os
analitos em questão (as proteínas) sejam adequadamente preservados e possam ser
até quantificados. Sob este ponto de vista, onze procedimentos diferentes de extração foram propostos, testados e comparados entre si, em termos da eficiência relativa,
para a extração de proteínas totais.
Verificou-se que nem todos os valores encontrados para a concentração de
proteínas totais pelo método de Bradford eram concordantes com os fornecidos pela
literatura para as amostras estudadas. Assim, conclui-se que o método de Bradford
para determinação de proteínas totais não é o mais adequado para to presente
estudo, especialmente no caso da espirulina. Para esta amostra foi feito um estudo
comparativo dos valores obtidos com este método e o de Kjeldahl, tomado como
padrão. Após várias considerações, entende-se que a diferença de concentração
obtida pelos dois métodos, para esta amostra, pode ser devida a um possível
impedimento estérico provocado pelo corante tetrapirrólico que se liga à cisteína da
cadeia da proteína dificultando a ligação do corante coomassie para a reação de
Bradford e, finalmente, subestimando o valor fornecido por este método para a
concentração de proteínas totais.
A castanha da Índia foi escolhida, dentre os fitoterápicos tradicionais
investigados neste Capítulo, por ter suas proteínas eficientemente extraídas e
apresentar concentrações de proteínas totais dentro do intervalo fornecido pela
literatura.
Dentre os procedimentos sugeridos, observou-se que aqueles onde se
somavam várias etapas, tais como agitação, maceração, sonicação e centrifugação
foram os mais eficientes, em termos de extração de proteínas para a castanha da
Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
39
Índia, tanto à temperatura ambiente, como à 40oC para os meios extratores utilizados.
Acredita-se que a seqüência de etapas no procedimento promove uma maior ruptura
celular ou das estruturas celulares e também a desnaturação das proteínas.
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Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
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Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães
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47
CAPÍTULO 2
Mapa Protéico da Castanha da Índia
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
49
1. OBJETIVOS
• Caracterizar as proteínas da amostra castanha da Índia, cujas extrações já
foram otimizadas no Capítulo anterior, por meio de técnicas analíticas de
eletroforese, em uma e duas dimensões, e de MALDI-QTOF-MS.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Proteínas – Aspectos gerais
Proteínas são polímeros lineares de aminoácidos (macromoléculas) de massa
molar (MM) variando desde centenas até milhares de Daltons (1 Da = 1,661x10-24 g).
Apenas em torno de 20 aminoácidos são encontrados em proteínas de plantas e
animais e estes são combinados em incontáveis maneiras para formar uma grande
variedade de diferentes proteínas.
As moléculas de proteínas consistem de uma “espinha dorsal”, formada por um
grande número de peptídeos, da qual se projetam cadeias laterais de resíduos de
aminoácidos. A natureza destas cadeias laterais de aminoácidos é responsável pelas
diferentes propriedades das proteínas.
Um aminoácido possui um grupo carboxílico e um grupo amino e nas
moléculas de proteínas eles são responsáveis pela formação das ligações peptídicas,
com exceção dos C e N terminais da proteína [4], como mostrado na Figura 2.1.
Figura 2.1. Uma proteína típica: Diagrama de ligações peptídicas e N e C terminais.
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
50
Cada aminoácido tem duas constantes de ionização (expressos como valores
de pKa), os quais representam as constantes de ionização dos grupos 1-amino e 1-
carboxílico do aminoácido livre. Entretanto, alguns têm mais do que dois valores de
pKa, pelo fato de terem outros grupos ionizáveis nas suas cadeias. A carga líquida de
uma molécula de proteína numa solução aquosa depende da constante de ionização
das cadeias laterais dos aminoácidos constituintes e do pH da solução. Para valores
de pH baixos, os grupos carboxílicos não são ionizados e os aminos são protonados,
tendo a proteína uma carga líquida positiva. Para valores de pH altos, os grupos
carboxílicos são ionizados e os aminos não são protonados, tendo a proteína uma
carga líquida negativa. Para valores intermediários de pH somente alguns grupos da
cadeia são protonados, dependendo dos valores de pKa. Existe um pH particular para
cada molécula de proteína no qual esta não tem carga líquida. Isto acontece porque
ela possui um número igual de grupos carregados positiva e negativamente. Este pH
é chamado de ponto isoelétrico da proteína e é designado por pI. O valor de pI é
característico de cada proteína. Para valores menores que o pI a proteína tem carga
líquida positiva, enquanto que para valores maiores que o pI ela terá carga negativa.
Portanto, para um dado valor de pH, proteínas diferentes terão cargas líquidas
diferentes por causa dos seus valores de pI característicos [4].
2.1.1 Proteínas em plantas
As proteínas em plantas se distribuem nas células, que conforme suas
localizações podem ter funções específicas. Por exemplo, numa célula de folha
ocorrerá a fotossíntese e para essa função existirá um maquinário incluindo organelas
e proteínas diferentes de uma célula da raiz da planta. A célula básica de uma planta
partilha de uma estrutura típica de uma célula eucariótica, mas não possui centríolos,
lisossomos, filamentos intermediários, cílios ou flagelos, como as células de animais.
Ela tem, entretanto, uma estrutura especializada, incluindo uma parede celular rígida,
vacúolo central, plasmodesmata e cloroplastos (Figura 2.2) [5].
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
51
Figura 2.2. Anatomia de uma célula de planta. Ilustração adaptada de [5].
As proteínas se distribuem numa célula de planta entre as diversas organelas e
terão funções específicas. Como exemplos, na parede celular pode ser encontrada
uma pequena quantidade de proteínas e parte delas consistem de enzimas, que
iniciam reações de formação, remodelamento ou quebra da estrutura da parede. Já o
cloroplasto possui uma membrana dupla e na camada externa dessa membrana
existem proteínas de transporte de membrana. Uma célula típica de planta poderá ter
até mais do que 20000 espécies diferentes de polipeptídeos, enquanto que em um gel
típico 2D-PAGE poderão se observar uma resolução máxima de 3000 spots protéicos
[6]. Portanto, a análise proteômica de uma espécie é muito difícil de realizar, mesmo
lançando mão dos recursos tecnológicos existentes atualmente. Muitas vezes, até a
análise de órgãos ou tecidos se torna muito complexa, mas é o caminho inicial para
se construir um panorama proteômico de uma dada espécie.
Um estudo realizado por Komatsu et al. [6, 7] em tecidos de arroz, ilustrou a
dificuldade citada acima. Neste estudo, foram observados um total de mais de 10000
spots de proteínas em géis 2D-PAGE. Deste número, foram selecionados 1220 spots
para análise e 358 foram identificados pelas respectivas seqüências. Koller et al. [8]
desenvolveram o mais detalhado estudo do proteoma desta planta, no qual 2582
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
52
proteínas únicas, ou seja, proteínas de tecidos de folhas, raízes ou sementes de arroz
foram identificadas utilizando uma combinação de técnicas como 2D -PAGE e LC-
MS/MS [6, 8].
Em alguns casos, o foco inicial de estudo é um tecido, mas na tentativa de se
reduzir a complexidade dos sistemas, e como análise subseqüente, passa-se ao
estudo de uma organela, de um processo metabólico, de um conjunto ou até mesmo
de apenas uma proteína [6].
Como exemplo de estudo proteômico de uma organela, tem-se o cloroplasto, já
descrito em algumas revisões tais como a de Taylor et al. [9] e de van Wijk [10]. Tanto
a bioquímica quanto o genoma do cloroplasto já são bastante estudados [6] e estima-
se que nesta organela existam de 2100 a 3600 proteínas, sendo que esta organela é
composta de vários compartimentos e cada um possui seu sub-conjunto de proteínas.
Para se estudar cada sub-proteoma é necessário se utilizar diferentes estratégias
experimentais [10].
Também têm sido realizadas análises proteômicas com sementes, várias delas
devido ao interesse comercial, tais como trigo ou soja [6,11]. Como era de se esperar,
foram desenvolvidos estudos com as sementes de Arabidopsis, levando-se em conta
a vantagem de se ter disponível o seu genôma completo. Em um desses estudos [12],
conseguiu-se estabelecer os perfis protéicos dos extratos de proteínas das sementes
em vários estágios de germinação e submetidas a diferentes tratamentos utilizando-
se a 2D-PAGE. Foi possível observar 1300 proteínas de sementes nos géis 2D,
sendo 74 mais abundantes e identificando-se 67 delas por MALDI-TOF MS.
2.2 Eletroforese
Em 1930, Arne Tiselius introduziu a eletroforese [4]. Este é um método de
separação considerado relativamente simples e altamente seletivo [3].
A eletroforese envolve a separação de espécies carregadas eletricamente, sob
a influência de um campo elétrico aplicado. Nas proteínas, as espécies carregadas
podem ser produzidas pelas reações de dissociação de grupos carboxílicos ou
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
53
aminos ou pelo envolvimento das proteínas com um surfactante aniônico, tal como
dodecil sulfato de sódio (SDS). As espécies carregadas eletricamente se movem em
um meio líquido, o qual é suportado por uma substância inerte, onde a velocidade de
migração é um fator importante. O líquido serve como um meio condutor para a
corrente elétrica gerada. Do ponto de vista da eletroforese, as propriedades mais
importantes das proteínas são o tamanho (isto é, seu raio) e a carga. Assim, as
proteínas terão velocidades de migração diferentes, dependendo das condições
eletroforéticas e serão separadas umas das outras por esta técnica [4].
O campo elétrico deve ser mantido constante para manter a amostra em
solução. Aumentos na força iônica levam a aumentos na condutividade com
conseqüentes aumentos de temperatura, que podem produzir aumento nas taxas de
difusão iônica, da mobilidade iônica e diminuição da viscosidade do meio. Em
contraste, um campo elétrico baixo gera uma separação com baixa resolução.
A eletroforese em gel é um poderoso método de separação para proteínas
inseridas em matrizes complexas, por exemplo, cultura de células e tecidos. Um
suporte para matriz muito comum é a poliacrilamida. Ela é obtida por meio da
polimerização da acrilamida monomérica, usando N,N`-metil bisacrilamida e fatores
como tipo de iniciador, concentrações, pureza dos reagentes e temperatura, bem
como a concentração de monômero e a de oxigênio e porosidade devem ser
considerados [13]. A escolha apropriada da concentração de acrilamida é
fundamental para se obter uma boa resolução no gel. Outros fatores como pH e tipo
de tampão também são importantes para a resolução.
Géis de poliacrilamida podem ser preparados em bastão ou em placas. No
primeiro caso, o gel é polimerizado dentro de tubos cilíndricos de vidro com cerca de
5 mm de diâmetro interno e de 70 a 100 mm de comprimento. Géis em placa (de
espessura entre 0,5 a 1,5 mm) são geralmente preferidos. Sua principal vantagem é
que várias amostras podem ser separadas ao mesmo tempo e sob condições
idênticas, permitindo uma comparação direta entre as bandas de diferentes amostras,
um tempo menor para a preparação, além da facilidade da dissipação do calor
durante a corrida eletroforética. A eletroforese em gel de poliacrilamida – PAGE tem
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
54
sido utilizada para resolver o problema de resolução na separação de proteínas.
Portanto, um grande número de protocolos para géis e tampões, bem como de
condições de separação têm sido empregado. Somando-se a isso, alguns outros
fatores podem ser considerados para se obter proteínas separadas em zonas
distintas ou bandas. A otimização de condições freqüentemente requer um grande
número de corridas preliminares, que tem por objetivo estudar a influência de cada
fator.
2.2.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida em uma dimensão (1D -
PAGE)
A eletroforese em uma dimensão (1D) em gel de poliacrilamida é relativamente
simples. Estes sistemas, dependendo das condições de extração de proteínas,
podem ser classificados como dissociantes ou não-dissociantes.
Nos sistemas não-dissociantes as proteínas são estudadas na sua forma nativa
ou in natura, de forma que não existam alterações na atividade biológica,
conformação, entre outros. As proteínas in natura são separadas em relação aos
parâmetros de tamanho ou carga se utilizada a eletroforese com focalização
isoelétrica (IEF). Durante a IEF, um gradiente de pH é formado e as espécies
carregadas na amostra (sob o campo elétrico) se movem através do gel, até que
eventualmente alcancem uma posição no gradiente de pH em que a somatória de
suas cargas se torne nula, ou seja, no seu pI. A IEF pode ter alta resolução e é capaz
de separar macromoléculas que difiram no seu pI de até 0,001 unidades de pH.
Em sistemas dissociantes, as proteínas são solubilizadas em um tampão
contendo SDS, o qual é o agente dissociante mais comumente usado. O SDS
circunda uniformemente a proteína, formando uma micela. A interação entre o SDS e
as proteínas produz cargas negativas para todas as proteínas e a magnitude dessas
cargas dependerá da MM das proteínas. Todas as proteínas migrarão em direção ao
eletrodo positivo durante a eletroforese e a separação será baseada apenas na MM
das proteínas.
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
55
As proteínas de menor MM se movem mais rapidamente através do gel do que
as maiores. Este tipo de eletroforese é geralmente conhecido como SDS-PAGE,
devido à combinação do tratamento das proteínas com SDS e a eletroforese em gel
de poliacrilamida (PAGE) [14].
Quando a SDS-PAGE não fornece resolução ótima ou uma determinação exata
da MM, detergentes catiônicos como brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) ou cloreto
de N-cetilpiridínio (CPC) são usados na SDS-PAGE [15].
2.2.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida em duas dimensões (2D
- PAGE)
A maioria das pesquisas em proteomas de plantas utiliza a eletroforese em gel
de poliacrilamida com SDS em duas dimensões (2D - PAGE) para a separação de
proteínas [6].
Na separação por 2D - PAGE, as proteínas são inicialmente separadas por
focalizaçao isoelétrica (IEF), já descrita acima no item 2.2.1. A eletroforese por
focalização isoelétrica (IEF) tem geralmente dois modos de separação. Um deles é o
tradicional sistema baseado no transporte de anfólitos e o segundo é baseado na
preparação de imobilização de gradientes de pH. A maior vantagem do sistema IPG é
a disponibilidade de fitas pré-preparadas, proporcionando uma técnica de 2D mais
fácil de se usar. Por outro lado, o sistema de anfólitos é utilizado principalmente
quando grandes quantidades de proteínas são usadas ou proteínas básicas são
separadas.
Após a corrida, as proteínas contidas nas fitas são desnaturadas e envolvidas
por SDS, adquirindo cargas negativas. A fita é então aplicada em um gel de
poliacrilamida, no qual ocorre a segunda dimensão da separação. Geralmente, a
segunda dimensão separa proteínas baseada nas suas massas molares em géis com
SDS [13].
Um interessante conjunto de fontes e informações sobre a eletroforese 2D
estão disponíveis na Internet. Uma lista atual pode ser obtida no endereço
http://www.lecb.ncifcrf.gov/EP/. Entretanto, uma revisão cuidadosa da Internet revela
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
56
algumas diferenças entre os bancos de dados para a identificação de spots de
proteínas [13].
2.3 Espectrometria de massas
A espectrometria de massas tem se tornado uma ferramenta essencial nas
ciências biológicas modernas, não apenas pela alta sensibilidade, mas, também,
devido ao conteúdo total de informações derivadas dessa técnica [6].
A espectrometria de massas tem sido largamente usada na análise de
proteínas após a introdução do MALDI e da ionização por Eletrospray. Existem muitas
opções para analisadores de massas, sendo as mais comuns o tempo de vôo – TOF
conectado ao MALDI e ao quadrupolo triplo, quadrupolo-TOF ou ao analisador de ion
trap acoplado ao ESI [16].
Na análise proteômica, as proteínas separadas eletroforeticamente podem ser
identificadas por espectrometria de massas pela técnica chamada de “impressão
digital” (fingerprint) de peptídeos ou, após a digestão dos peptídeos in gel, estes são
fragmentados no espectrômetro de massas produzindo seqüências parciais de
aminoácidos. Após isso, são realizadas buscas em bancos de dados usando tanto a
massa molar quanto as informações dessas seqüências.
A seguir, será apresentado o princípio de funcionamento da técnica MALDI-
TOF-MS e fingerprint de peptídeos [16].
2.3.1 Digestão tríptica
A amostra de proteínas, que geralmente foi separada por um processo
eletroforético e está inserida em um gel, é digerida por uma enzima específica, muitas
vezes tripsina, quando são gerados peptídeos com massas molares dentro da faixa
de massas dos espectrômetros [6].
A tripsina cliva as ligações peptídicas de proteínas após os grupos carbonila
dos resíduos de lisina (K) e arginina (R), exceto quando estas ligações são com
prolina (P), ou seja, ligações K-P ou R-P. A tripsina é o reagente mais utilizado nos
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
57
experimentos de seqüenciamento por espectrometria de massas por ter um custo de
produção relativamente baixo, por possuir uma alta atividade proteolítica, por produzir
peptídeos pequenos (na faixa de 600 a 2500 Da) e por ser covalentemente
modificada, de modo a minimizar os processos de autodigestão ou autólise [17].
Quando as proteínas são separadas eletroforeticamente em gel, por técnicas
como SDS-PAGE ou 2D-PAGE, a digestão é feita na proteína ainda contida em uma
banda do gel. Esta proteína encontra-se imobilizada no gel de poliacrilamida por
precipitação, que ocorre durante a etapa de fixação do procedimento de coloração do
gel. Por causa desta imobilização, a proteína não pode difundir do gel durante as
etapas do protocolo de digestão até que ocorra a digestão tríptica, quando os
peptídeos formados poderão se difundir do gel de poliacrilamida devido ao tamanho
pequeno, em relação aos poros do gel de poliacrilamida. O protocolo de digestão
consiste de seis etapas que são: Retirada da banda protéica do gel e lavagem,
secagem das bandas, digestão com tripsina, extração dos peptídeos e lavagem,
captura dos peptídeos em uma coluna C18 e eluição da amostra [17].
Após a eluição dos peptídeos, estes são misturados a uma solução de matriz e
a mistura será depositada numa placa para a análise por massas.
2.3.2 MALDI-TOF-MS
Para a análise por MALDI, a amostra de proteínas, geralmente um spot de
interesse que está inserida em um gel, é digerida por uma enzima específica, muitas
vezes tripsina conforme citado no item 2.3.1, e este conjunto de peptídeos é
misturado a uma solução de matriz. Esta solução de matriz é uma solução ácida
concentrada ou saturada de baixa massa molar e absorvedora de radiação ultra-
violeta (especificamente para o MALDI). Aproximadamente 1 µL desta mistura de
amostra e matriz é colocada sobre a placa de MALDI, e conforme o solvente da
mistura seca, a matriz se cristaliza sendo que as moléculas de peptídeos ficam
incluídas nestes cristais.
Quando o LASER incide sobre os cristais de matriz/amostra, a matriz
absorvedora de UV e que deve estar em excesso em relação à amostra, absorve
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
58
energia e a transfere para a amostra de uma maneira suave, de forma que o processo
de ionização não fragmente os peptídeos. Dessa forma, a energia do LASER produz
uma pluma de matriz que carrega os íons de analito numa forma gasosa [6]. Na
Figura 2.3 é apresentada uma ilustração do princípio mencionado acima.
Figura 2.3. Ilustração dos processos que ocorrem durante a MALDI. Adaptada de Nyman [16].
Os íons de peptídeos são, então, separados pelo analisador de tempo de vôo
(TOF), no qual os íons são acelerados de uma posição inicial e voam através do tubo
TOF. Os íons mais leves (aqueles com menor relação massa/carga) voam mais
rápido através do analisador que os íons mais pesados (com maior relação
massa/carga), de forma que o tempo de vôo para alcançar o detector pode ser usado
para a determinação da relação massa/carga dos íons [6].
2.3.3 Espectros de massas
Para cada pulso de LASER é produzido um espectro de massas que conterá
íons provenientes dos peptídeos da proteína digerida, juntamente com os íons da
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
59
matriz (estes com relação massa/carga abaixo de 500 Da), além de alguns peptídeos
originados da autólise da protease usada para a digestão da proteína-amostra.
O primeiro passo em um experimento de fingerprint de peptídeos é a de-
isotopagem do espectro de massas produzido, que é realizada por um programa de
processamento de dados. A de-isotopagem identificará os picos isótopos, que
causam identificações falsas de proteínas e os removerá. A seguir, é obtida uma lista
de massas dos picos mais intensos dos valores massa/carga que são comparados a
um filtro (outro programa computacional) que reconhecerá e removerá qualquer pico
originado da autólise da protease utilizada para a digestão. A lista de picos é, então,
submetida a um banco de dados, que comparará as massas dos peptídeos do
espectro com aqueles de proteínas teoricamente digeridos e produzirá uma lista de
possíveis combinações (matches) e um mecanismo de pontuações (scores) para a
correta identificação.
Antes da lista de picos ser submetida ao banco de dados, várias informações
relevantes devem ser consideradas e especificadas, tais como a espécie da qual a
proteína é originada, o pI e a massa molar aproximada da proteína, a protease usada
na digestão, quaisquer modificações ocasionadas na proteína e a tolerância de
massa. Destas variáveis, a protease utilizada e a tolerância de massa são as mais
importantes. A protease usada especificará com qual lista de proteínas teóricas
digeridas se fará as comparações dos espectros produzidos. Já a tolerância de
massa, especificará o quão próximo (medida em partes por milhão, ppm) a massa do
peptídeo submetido e a massa do peptídeo teórico poderão estar para o matching.
Uma descrição mais detalhada sobre a interpretação do espectro de massas, bem
como dos vários métodos para se obter maior exatidão de massas para os peptídeos
e identificação de proteínas pode ser obtida na revisão de Newton et al. [6].
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
60
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Equipamentos e acessórios
Os seguintes equipamentos e acessórios foram utilizados para o
desenvolvimento deste Capítulo:
• Agitador por efeito vortex, marca Thermolyne, modelo M-37600;
• Balança analítica, marca Mettler, modelo AE200;
• Centrífuga, marca Nova Técnica, modelo NT 811;
• Cubas para eletroforese do tipo SDS-PAGE, marca Permatron;
• Estufa, marca Quimis;
• Espectrômetro de massas do tipo MALDI-QTOF, marca Waters -Micromass,
modelo PremierTM ;
• Fonte de corrente contínua, marca Pharmacia Biotech, modelo EPS 1001;
• Mesa agitadora, marca Quimis, modelo Q225M;
• Placa aquecedora, marca Quimis;
• Potenciômetro, marca Digimed, modelo DM20;
• Scanner, marca GE Healthcare, modelo ImageScannerTM II;
• Sistema desionizador Milli-Q, marca Millipore, modelo Quantum TM cartridge;
• Sistema para eletroforese 2D-PAGE, marca GE Healthcare, modelo EttanTM
Daltsix;
• Ultracentrífuga refrigerada, marca BioAgency, modelo Bio-Spin-R;
• Vidrarias apropriadas.
3.2 Reagentes e soluções
Todos os reagentes usados foram de grau analítico, sendo as soluções
preparadas com água desionizada. A seguir são listados todos os reagentes/soluções
empregados nesta parte do trabalho
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
61
� 2-Mercaptoetanol, HSCH2CH2OH, MM = 73,18 g mol-1 (J. T. Baker);
� Acetato de amônio, C2H7NO2, MM = 77,08 g mol-1 (Mallinckrodt);
� Acetona P.A., (CH3)2CO, MM = 58,08 g mol-1 (Synth);
� Acetonitrila, C2H3N, MM = 41,05 g mol-1 (Merck);
� Ácido acético glacial, CH3COOH, MM = 60,05 g mol-1 (J. T. Baker);
� Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico, C10H7NO3, MM = 189,16 g mol-1 (Sigma-
Aldrich);
� Ácido clorídrico 37% m/v, HCl, MM = 36,46 g mol-1 (J. T. Baker);
� Ácido fosfórico 85%, H3PO4, MM = 98,00 g mol-1 (Merck);
� Ácido tricloroacético, C2HCl3O2, MM = 163,39 g mol-1 (Synth);
� Ácido trifluoroacético, C2HF3O2, MM = 114,03 g mol-1 (Mallinckrodt);
� Acrilamida, MM = 71,08 g mol-1 (BioAgency);
� Agarose grau biologia molecular (BioAgency);
� Albumina de soro bovino (Merck);
� Anfólitos, pH de 3 a 10 (Amersham Biosciences);
� Azul de bromofenol, C19H9Br4NaO5S, MM = 691,94 g mol-1 (BioAgency);
� Azul de Coomassie G-250, C47H50N3NaO7S2, MM = 854,03 g mol-1 (J.T. Baker);
� Cloreto de potássio, KCl, MM = 74,55 g mol-1 (Merck);
� Ditiotreitol, DTT, (CHOHCH2SH)2, MM = 154,24 g mol-1 (Amersham
Biosciences);
� Dodecil sulfato de sódio, SDS, C12H25NaO4S, MM = 288,28 g mol-1 (Synth);
� Etanol 95%, C2H6O, MM = 46,07 g mol-1 (J. T. Baker);
� Glicerol 87%, HOCH2CH(OH)CH2OH, MM = 92,09 g mol-1 (Amersham
Biosciences);
� Glicina, NH2CH2COOH, MM = 75,07 g mol-1 (Amersham Biosciences);
� Iodoacetamida, C2H4INO, MM = 184,96 g mol-1 (Amersham Biosciences);
� Kit para digestão tríptica dos géis In-Gel DigestZP Kit (Millipore);
� Metanol P.A., CH3OH, MM = 32,04 g mol-1 (Ecibra);
� N,N’-metilenobisacrilamida, C7H10N2O2, MM = 154,17 g mol-1 (Amersham,
Biosciences);
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
62
� N,N’,N,N’-tetrametiletilenodiamina, TEMED, C6H16N2, MM = 116,20 g mol-1 (J.
T. Baker);
� Óleo mineral, (Amersham Biosciences);
� Padrão protéico de massa molar, 116,0–14,4 kDa (MBI, Fermentas);
� Peróxido de hidrogênio, H2O2 30% (m/m) (Merck);
� Polioxietileno(10) isooctilfenil éter, Triton X-100, (J. T. Baker);
� Uréia, NH2CONH2, MM = 60,06 g mol-1 (BioAgency).
3.3 Separação eletroforética em uma dimensão (SDS-PAGE)
3.3.1 Preparo das amostras para a separação eletroforética
baseada em SDS-PAGE
Após a avaliação da concentração de proteínas totais (Capítulo 1), foi escolhida
a amostra castanha da Índia para separação eletroforética. Esta escolha se deveu às
concentrações de proteínas totais determinadas por Bradford no Capítulo anterior
estarem dentro do intervalo apresentado pela literatura. As condições empregadas
para tal separação foram otimizadas após alguns testes.
Para cada canaleta de gel foram utilizadas alíquotas de 20 µL dos extratos
protéicos (o volume máximo para cada canaleta no gel era de 25 µL, sem que
houvesse o transbordamento de extrato para a canaleta vizinha), diluídos (ou não),
aquecidos à 100oC num banho-maria por 10 min para completar o processo de
desnaturação das proteínas. As amostras preparadas foram resfriadas à temperatura
ambiente e inseridas nas canaletas do gel. Nos géis, sempre uma canaleta era
reservada para padrões de proteínas de massas molares conhecidas [18].
Os extratos protéicos obtidos dos procedimentos 1 e 2 (onde a amostra só foi
processada com a agitação manual em água e tampão, respectivamente) não foram
diluídos, uma vez que as concentrações de proteínas totais estavam abaixo do valor
otimizado de 2,2 mg g-1. Aqueles obtidos dos procedimentos 4 e 8 (amostra macerada
em água e macerada em água e sonicada, respectivamente) foram diluídos com água
e aqueles obtidos dos procedimentos 5 e 9 (amostra macerada em tampão e
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
63
macerada em tampão e sonicada, respectivamente) foram diluídos em tampão Tris-
HCl, 1,0 mol L-1, a pH 6,8. Em todos os procedimentos onde houve diluição dos
extratos protéicos, foi mantida a concentração de 2,2 mg g-1 de proteínas (ca. de 4,4
µg de proteína por canaleta). Portanto, os extratos protéicos dos procedimentos 1, 2,
4, 5, 8 e 9 foram separados em condições desnaturantes e não-redutoras. Entretanto,
para efeito de comparações, os extratos provenientes dos procedimentos 4, 5, 8 e 9
(amostra macerada em água ou tampão, respectivamente, e macerada em água ou
tampão e sonicada, respectivamente) foram diluídos com um tampão dissociante,
misturando-se 38 µL de tampão Tris-HCl à 0,5 mol L-1, pH 6,8, 60 µL de SDS 10%
(m/v), 15 µL de 2-mercaptoetanol (conc.), 30 µL de glicerol (conc.) e 158 µL de H2O.
Assim, estes extratos foram separados em condições desnaturantes e redutoras [18].
3.3.2 Separação de proteínas por eletroforese em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE)
Para a separação foi utilizado um gel composto de acrilamida (12,5% m/v) e
N,N´-metil bisacrilamida (0,4% m/v), a pH 8,8, contendo 10% (m/v) de dodecil sulfato
de sódio (SDS), 0,1% (m/v) de N,N´,N,N´-tetrametiletilenodiamina (TEMED) e 10%
(m/v) de persulfato de amônio. Foi usado o tampão Tris-HCl (1,0 mol L-1) para ajuste
de pH. As dimensões do gel foram 10,0 cm (altura) por 10,5 cm (largura) e o tampão
de Tris-glicina (pH 8,3) foi usado nos reservatórios da cuba [14, 19]. As correntes
inicial e final foram 25 e 15 mA, respectivamente, a voltagem foi fixada em 100 V, e o
tempo de corrida aproximado de 3 h.
Após a corrida eletroforética, as bandas protéicas foram coloridas por 2 h com
uma solução 0,15 g de Azul Brilhante de Coomassie G-250, 90 mL de metanol, 30 mL
de ácido acético glacial e 180 mL de água desionizada. A seguir, o gel foi descolorido
por cerca de 10 h na mesma solução, mas sem o Azul Brilhante de Coomassie G-250.
Os géis foram digitalizados por meio do programa Gel-Pro Analyser® 3.1, da
MediaCybernetics Inc. (Silver Spring, EUA) e as massas molares (MM) das proteínas
foram estimadas a partir do padrão de proteínas purificadas que incluía β-
galactosidase (116 kDa), albumina de soro bovino (66,2 kDa), ovalbumina (45,0 kDa),
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
64
lactato desidrogenase (35,0 kDa), endonuclease restrição Bsp98I (25,0 kDa), β-
lactoglobulina (18,4 kDa) e lisozima (14,4 kDa).
3.4 Separação eletroforética em duas dimensões (2D-PAGE)
3.4.1 Otimização da metodologia para a separação por 2D-PAGE
Após a separação das proteínas da amostra castanha da Índia por SDS-PAGE,
foi necessário otimizar as condições de preparo da mesma para a separação
eletroforética bidimensional.
A partir do extrato protéico proveniente do procedimento de extração 5
(amostra manualmente macerada em tampão), cuja razão da escolha será justificada
no Capítulo 3 desta Tese, foi processada uma etapa de limpeza para a eliminação de
possíveis interferentes, tais como sais e polissacarídeos, para a separação 2D. Foram
colocados 350 µL do extrato protéico (equivalente a 1,26 mg de proteínas – vide
Tabela 1.1, Capítulo 1) num tubo de ensaio (em triplicata) onde foram adicionados
1,05 mL da solução de acetona/etanol à 0oC (na proporção 3:1 v/v) em cada tubo e
levados ao freezer (-20oC), por 1 h, para precipitação das proteínas. Logo a seguir, os
tubos foram centrifugados a 1800 g, durante 3 min, e a parte solúvel foi removida.
Foram novamente adicionados em cada tubo 1,05 mL da mistura de acetona/etanol
3:1 (v/v), à 0oC, sendo a amostra agitada levemente para que as proteínas entrassem
em contato com a mistura. Cada tubo foi levado novamente a -20oC, por 1 h,
centrifugado a 1800 g, durante 3 min, descartando-se a parte solúvel. Este
procedimento de limpeza foi repetido por mais duas vezes. A seguir, esperou-se a
mistura acetona/etanol evaporar completamente (à temperatura ambiente) para serem
adicionados, em cada tubo, 300 µL de um tampão de re-suspensão das proteínas,
composto por 8 mol L-1 de uréia, 2% (m/v) de CHAPS, 0,5% (v/v) de anfólitos, 1%
(m/v) de DTT e 0,002% (m/v) de azul de bromofenol. No momento da utilização do
tampão, foram adicionados 2,8 mg de DTT para cada 1 mL do tampão. O processo de
re-solubilização levou cerca de 5 min, à temperatura ambiente, e, logo a seguir, as
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
65
soluções foram centrifugadas a 8500 g, por 2 min, para retirada de possíveis resíduos
sólidos.
3.4.2 Separação bidimensional de proteínas por eletroforese com
focalização isoelétrica e em gel de poliacrilamida (2D-PAGE)
Após os procedimentos de preparo, efetuou-se a separação eletroforética.
Primeiramente, as proteínas foram separadas pelo ponto isoelétrico em fitas de 13
cm, com pH variando entre 3 e 10. Para isso, foram aplicados 300 µL da amostra
numa canaleta do aparato (Reswelling Tray, GE, EUA). Em seguida, as fitas foram
colocadas em contato com as amostras e cobertas com óleo mineral (2,0 mL). A re-
hidratação levou em torno de 12 h, à temperatura ambiente. Após este período, as
fitas foram levadas ao sistema focalizador (Ettan IPGphor, GE, EUA), onde foi
aplicado o seguinte programa: (1) 500 V até 500 Vh, (2) 1000 V até 800 Vh, (3) 10000
V até 11300 Vh e (4) 10000 V até 3000 Vh. No final da execução do programa, a linha
de azul de bromofenol tinha atingido o final da fita. Foram acumulados 19351 Vh no
total de 6 h e 21 min, com corrente final de 50 µA por fita.
Após a focalização, as fitas foram equilibradas, primeiro usando 10 mL da
solução composta por 6 mol L-1 de uréia, 2% (m/v) de SDS, 30% (v/v) de glicerol, 50
mmol L-1 de Tris-HCl a 1,5 mol L-1 (pH = 8,8), 0,002% de azul de bromofenol e 1%
(m/v) de DTT, sob leve agitação por 15 min, e depois usando a mesma solução,
entretanto o DTT foi substituído por 2,5% (m/v) de iodoacetamida, também sob
agitação, durante 15 min.
Para a separação na segunda dimensão, isto é, por massa molar, cada fita foi
cuidadosamente inserida sobre um gel de poliacrilamida a 12,5% (m/v) com
dimensões de 180 x 160 x 1,5 mm, onde também foi inserido um pedaço de papel de
filtro contendo 15 µL do mesmo padrão de proteínas utilizado na eletroforese SDS-
PAGE. A seguir, foi aplicada uma solução aquecida de agarose 0,5% (m/v), para fixar
a fita e o papel com o padrão de proteínas e evitar bolhas entre eles e o gel de
poliacrilamida. A segunda separação foi realizada aplicando-se 90 V e 25 mA, por gel
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
66
e 100 W durante 30 min e 250 V e 25 mA, por gel e 100 W durante aproximadamente
7 h.
Após a separação, cada gel foi lavado com água desionizada e as proteínas
foram fixadas no gel utilizando uma solução contendo ácido acético a 10% (v/v) e
etanol a 40% (v/v) durante 1 h. Após a fixação, cada gel foi lavado durante 10 min por
3 vezes com água desionizada, sob leve agitação, e corado com Azul Brilhante de
Coomassie G-250 coloidal [20] por 48 h. A solução corante foi removida por
sucessivas lavagens com água desionizada até se obter um bom contraste entre os
spots e o gel sem proteínas.
Os géis foram digitalizados por meio do equipamento Image Scanner e as
imagens obtidas foram tratadas pelo programa ImageMaster 2D Platinum (Genebio,
Genebra, Suíça) versão 6.0, que permitiu estimar o número de spots, os valores de pI
e as massas molares das proteínas.
3.5 MALDI-TOF-MS
3.5.1 Digestão tríptica dos spots de proteínas
Todos os spots 2D-PAGE de proteínas escolhidas foram digeridos utilizando-se
o kit para digestão tríptica In-Gel DigestZP Kit (Millipore), que continha uma placa
ZipPlate micro-SPE. Os protocolos de digestão e eluição empregados foram os
recomendados pelo fabricante e a eluição foi realizada à vácuo, utilizando-se uma
bomba de vácuo Multscreen®, do mesmo fabricante.
3.5.2 Caracterização de proteínas por MALDI-QTOF-MS
As amostras, resultantes da digestão tríptica conforme descrito no item 3.5.1,
foram aplicadas em uma microplaca de MALDI, e esta foi deixada à temperatura
ambiente por alguns minutos, de modo que o volume das gotas fosse reduzido por
evaporação. A matriz CHCA (Ácido α-cyano-4-hidróxicinâmico) foi preparada
adicionando-se 10 mg de ácido em uma mistura de água/acetonitrila 1:1 (v/v)
contendo TFA 0,1% (v/v) e, então, 2 µL desta solução foram adicionados a 2 µL
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
67
amostra. A mistura resultante foi aplicada na placa de MALDI e deixou-se secar à
temperatura ambiente. Todas as medidas foram realizadas no espectrômetro de
massas tipo MALDI-QTOF do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron – LNLS.
Os dados de espectrometria de massas foram coletados no modo íon positivo
(LDI+), com uma fonte fixa de íons de nitrogênio, usando os seguintes parâmetros:
taxa de pulso de LASER de 20 Hz; intervalo de massa de 880 a 3000 Da; limite
(threshold) do pico de detecção para MS-MS de 1500,0; limite (threshold) de massa
de 200,0 Da; tempo de varredura (scan) de 2 s; ajuste do multiplicador Np para 0,70;
resolução de 10.000 no modo “V”; limite (threshold) do trigger de 700; limite
(threshold) de sinal de 80 e ajuste do microchannel plate (MCP) para 2.100V.
Cada espectro de massas foi coletado após a varredura (scan) de 2 s e os
espectros foram acumulados durante aproximadamente 2 min. Foi utilizado argônio
como gás para colisão e a energia de colisão ficou entre 34 e 161 eV, dependendo do
tamanho dos íons. O equipamento foi controlado pelo programa MassLynx 4.1 e todos
os espectros de massas foram processados em uma lista de arquivos com a extensão
*.pkl, usando os programas ProteinLynxGlobalServer versão 2.2.5, da Waters
(Manchester, UK) e MASCOT Distiller com o servidor de busca de banco de dados
“in-house” do MASCOT Daemon, da Matrix Science (London, UK).
Para a identificação dos peptídeos, o programa Mascot [21], versão 2.1, foi
utilizado a partir das informações obtidas dos espectros de massas (MS e MS/MS). A
busca neste programa foi realizada usando o banco de dados MSDB, o qual contém
proteínas gerais e com seqüências não-idênticas. A pesquisa foi realizada, utilizando
os seguintes parâmetros: digestão enzimática com tripsina, peptídeos com nenhum
ou um sítio de clivagem pulado, carbamidometilação em cisteína como modificação
fixa e oxidação de metionina como modificação variável.
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
68
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Géis SDS-PAGE
Para explorar o “perfil” protéico dos extratos da castanha da Índia, ou seja,
investigar quais proteínas foram extraídas e se os procedimentos utilizados
influenciaram nestas extrações, foram escolhidos os extratos provenientes dos
procedimentos 1, 2, 4, 5, 8 e 9, descritos no Capítulo 1, Quadro 1.1, para a separação
de proteínas por SDS-PAGE.
Ao se efetuar a corrida eletroforética verificou-se que apenas uma banda
protéica era mais expressiva, independentemente do procedimento utilizado, ou seja,
pelo menos, aparentemente, os procedimentos de extração utilizados não
influenciaram na extração de proteínas. É interessante comentar que, embora tenham
sido obtidas diferentes concentrações de proteínas totais usando diferentes
procedimentos de extração, sempre foi obtida uma banda nos géis com tempo de
migração similar.
Na Figura 2.4 são apresentados os géis SDS-PAGE obtidos a partir dos
extratos brutos nos quais foram utilizados os procedimentos 1, 2, 4, 5, 8 e 9 e o
padrão de proteínas, com as respectivas MM. Os extratos brutos obtidos dos
procedimentos 1 e 2 não foram diluídos, enquanto os extratos brutos dos
procedimentos 4 e 8 foram diluídos com água e os obtidos dos procedimentos 5 e 9
foram diluídos com tampão Tris-HCl 1,0 mol L-1 (pH=6,8). As diluições foram
realizadas de forma a se obter uma quantidade de 4,4 µg de proteínas em cada
canaleta de gel, sendo estas proteínas desnaturadas e sob condição não-redutora.
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
69
Figura 2.4. Géis SDS-PAGE obtidos a partir dos extratos brutos, nos quais foram utilizados os procedimentos 1, 2, 4, 5, 8 e 9 e o padrão de proteínas, com suas respectivas massas molares. Géis de poliacrilamida 12,5% (m/v) com dimensões de 100 (altura) x 105 (largura) x 1,0 (espessura) mm. 4.1.1 Determinação de massa molar e de massa de proteína por
densidade óptica
As massas molares das bandas dos géis foram estimadas a partir da
comparação das massas molares do padrão de proteínas, utilizando-se o programa
Gel-Pro Analyser® 3.1. Na Tabela 2.1 são apresentadas as massas molares
estimadas das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.4, cuja
MM média foi calculada em 33,2 ± 0,9 kDa.
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
70
Tabela 2.1. Massas molares estimadas (em kDa) das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.4.
Procedimento* MM (kDa)
1 31,7
2 33,3
4 34,3
5 33,1
8 33,9
9 32,8
Média 33,2 ±±±± 0,9
MM – Massa Molar (em kDa) das bandas protéicas. * conforme Quadro 1.1, Capítulo 1
Na Figura 2.5 é apresentado, como exemplo, a variação das densidades
ópticas das bandas dos géis SDS-PAGE do padrão protéico (linha azul) e do extrato
bruto obtido a partir do procedimento 5 (em triplicata - linhas verde, preta e vermelha).
A partir dessa Figura pode-se observar nitidamente os picos das bandas protéicas do
padrão e da amostra, em torno de 33 kDa para este extrato. Podem se observar
variações nas densidades ópticas para cada triplicata para os valores abaixo de 33
kDa. Essas variações são devidas a variações na coloração dos géis e a diferenças
na calibração da densidade óptica, provocando estas flutuações.
Figura 2.5. Variação das densidades ópticas das bandas dos géis SDS-PAGE do padrão protéico (linha azul) e do extrato bruto obtido a partir do procedimento 5 (em triplicata - linhas verde, preta e vermelha).
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
71
A massa de proteína em cada banda foi estimada (em triplicata) pelas
diferenças de densidade óptica e por uma curva de calibração dos padrões, usando o
programa Gel-Pro Analyser® 3.1, cujos valores estão apresentados na Tabela 2.2. A
massa média de proteína estimada foi de 4,4 ± 0,6 µg, o que concorda com a
quantidade de proteínas inserida em cada canaleta de gel (item 3.3.1 deste Capítulo).
Tabela 2.2. Massas estimadas de proteína (em µg) a partir das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.4.
Procedimento m (µµµµg)
1 4,0±0,3
2 6,2±0,4
4 4,3±0,3
5 4,7±0,1
8 2,4±0,1
9 4,7±0,1
Média 4,4 ±±±± 0,6
Ao se diluir os extratos brutos com o tampão dissociante, ou seja, as proteínas
estavam desnaturadas e reduzidas, verificou-se, também, que apenas uma banda
protéica era mais expressa nos géis SDS-PAGE. Entretanto, todas apresentaram um
deslocamento na posição nos géis. Este deslocamento pode ser observado na Figura
2.6, onde são apresentados os géis SDS-PAGE para os extratos obtidos dos
procedimentos 1 (sem diluição com tampão dissociante - para comparação com os
outros géis), 4, 5, 8 e 9, cuja MM média das bandas protéicas foi de 23,5 ± 0,5 kDa.
Na Tabela 2.3 são apresentadas as massas molares estimadas, e a média calculada
(23,5 ± 0,5 kDa).
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
72
Figura 2.6. Géis SDS-PAGE obtidos a partir dos extratos brutos diluídos com tampão dissociante, nos quais foram utilizados os procedimentos 1 (sem diluição), 4, 5, 8 e 9 (diluídos com tampão dissociante) e o padrão de proteínas, com suas respectivas massas molares (em kDa). Géis de poliacrilamida 12,5% (m/v) com dimensões de 100 (altura) x 105 (largura) x 1,0 (espessura) mm.
Tabela 2.3. Massas molares estimadas (em kDa) das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.6.
Procedimento MM (kDa)
4 23.5
5 23,2
8 24,3 9 23,2
Média 23,5 ±±±± 0,5
MM – Massa Molar (em kDa) das bandas protéicas. O valor da MM da banda proveniente do procedimento 1 está apresentada na Tabela 2.2.
O deslocamento observado entre as bandas protéicas nos géis cujos extratos
foram diluídos com tampão dissociante e os não diluídos com este tampão pode ser
atribuído à mobilidade das proteínas e é relativamente comum quando estas são
extraídas das plantas [22 - 24].
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
73
Um dos maiores problemas encontrados nas extrações de proteínas e enzimas
de plantas é a presença de compostos fenólicos que podem ser liberados durante a
maceração dos tecidos. Eles são rapidamente oxidados a quinonas por enzimas das
plantas e estas, ou reagem com as proteínas, inativando as enzimas, ou mudam a
mobilidade das moléculas de proteínas. Assim, substâncias que evitem ambas
oxidação e a reação com fenóis/quinonas são fortemente recomendadas a serem
adicionadas quando as amostras são maceradas ou aos meios extratores [25, 26].
Neste contexto, o agente redutor (2-mercaptoetanol) presente no tampão dissociante
possui duas funções: evitar a modificação da estrutura e, por conseguinte, da
mobilidade da proteína no gel (Figura 2.6), ou extrair uma nova proteína com MM
diferente. A mobilidade é função, dentre outras coisas, do tamanho e da conformação
dos íons migratórios, bem como da porosidade do gel. Como não foi alterada a
porosidade do gel, existe a possibilidade da mudança do tamanho ou da conformação
das proteínas pela adição do agente redutor. Desta forma, a massa de 23,5 ± 0,5 kDa
pode ser considerada como a MM da proteína identificada. Gumilevskaya et al. [27]
também encontraram um grupo de polipeptídeos para castanha da Índia de cerca de
24 – 25 kDa, uma massa que é característica de proteínas do citosol. Estas proteínas
também foram classificadas como estáveis ao calor, compreendendo quase 30% do
total de proteínas presentes no citosol. Portanto, estas afirmações estão concordantes
com nossos resultados (Figura 2.6), uma vez que as proteínas apresentaram a MM
nos mesmos intervalos, bem como também foram aquecidas (10 min à 100oC) antes
da separação eletroforética.
4.2 Géis 2D-PAGE
Após a separação das proteínas em uma dimensão, passou-se a etapade
separação em duas dimensões (em termos dos seus valores de pI e MM). Como foi
observado, por meio da eletroforese em uma dimensão, sempre se extraia apenas
uma banda protéica, independentemente do procedimento de extração utilizado.
Assim, foi escolhido fazer a separação eletroforética em duas dimensões com o
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
74
extrato protéico proveniente do procedimento 5 (amostra manualmente macerada em
tampão Tris-HCl 1,0 mol L-1 (pH 6,8), por 15 min). Esta escolha deveu-se a resultados
que serão discutidos no Capítulo 3 desta Tese (item 4.2). Portanto, após realizadas
todas as otimizações no preparo da amostra castanha da Índia e na separação
eletroforética (conforme descrito nos itens 3.4.1 e 3.4.2 deste Capítulo), obtiveram-se
géis 2D-PAGE (n=3), como o apresentado na Figura 2.7.
Figura 2.7. Gel 2D-PAGE do extrato protéico proveniente do procedimento 5 (amostra manualmente macerada em tampão Tris-HCl 1,0 mol L-1 (pH 6,8), por 15 min). Fita de 13 cm, pH de 3 a 10, padrão de proteínas de MM de 116,0 a 14,4 kDa. Gel com dimensões de 130 x 130 x 1,5 mm. Os spots estão denominados de A a I, da esquerda para direita. No destaque, à direita superior, estão as bandas protéicas em três dimensões.
kDa
116,0
66,2
45,0
35,0
25,0
18,4
14,4
B D F H
A C E G I
3,0 10,0 pI
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
75
Neste gel pode-se observar que a banda de MM 23,7 kDa apresentada na
Figura 2.6 (sob condição desnaturante e redutora) se repetiu, mas com o
desdobramento em, pelo menos, 9 spots. Segundo o programa ImageMaster 2D
Platinum, versão 6.0, foi possível estimar os valores de MM de cada spot, (entre 23,4
e 23,7 kDa), seus respectivos valores de pI (entre 5,6 e 7,7), porcentagem de volume
e porcentagem de intensidade. Os dados referentes aos spots (denominados de A a I)
são apresentados na Tabela 2.4.
Tabela 2.4: Dados estimados dos spots, segundo o programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0.
Spot MM (kDa) pI % Volume % Intensidade
A 23,6 5,6 10,3 10,1
B 23,4 5,8 13,6 12,6
C 23,4 6,0 15,8 14,7
D 23,5 6,3 23,3 17,9
E 23,4 6,5 15,6 12,2
F 23,7 6,8 7,4 8,9
G 23,5 7,0 5,1 8,8
H 23,6 7,2 5,6 8,7
I 23,5 7,7 3,3 6,1
A massa de proteína nos spots foi estimada pelas porcentagens de volumes da
Tabela 2.4, fornecidas pelo programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0 e
considerando-se que foi inserido um total de 1,256 mg (levando-se em consideração a
Tabela 1.1, Capítulo 1 e o item 3.4.1 deste Capítulo) de proteínas no gel. Os valores
estimados da massa de proteína de cada spot estão apresentados na Tabela 2.5.
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
76
Tabela 2.5: Valores estimados das massas de proteínas (em µg) em cada spot, com os respectivos valores de porcentagens, segundo o programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0.
Spot m (µµµµg) % Volume
A 129,4±0,5 10,3
B 170,8±0,6 13,6
C 199,4±0,3 15,8
D 292,6±0,6 23,3
E 195,9±0,3 15,6
F 92,4±0,2 7,4
G 64,0±0,1 5,1
H 70,3±0,3 5,6
I 41,4±0,1 3,3
Total 1256±1 100
A consideração de que foi inserido o total de proteínas no gel não leva em
conta as perdas de proteínas durante todo o processo de separação, como, por
exemplo, perdas durante a etapa de limpeza com acetona e metanol, durante a re-
hidratação das fitas, durante o equilíbrio das fitas e na passagem das proteínas das
fitas para o gel SDS-PAGE. De fato, é sabido que todas essas etapas provocam
perdas de proteínas [28]; entretanto, infelizmente, não existe maneira de se
quantificar essas perdas. Portanto, optou-se por fazer essa consideração.
As proteínas separadas (spots) poderiam ser interpretadas como isoformas, ou
seja, proteínas que possuem massas molares similares e valores de pI distintos
devido a pequenas diferenças na cadeia de polipeptídeos, porém, desempenhando a
mesma função, ou PTM´s (do inglês, post translationally modified proteins) [28], que
se apresentam, muitas vezes, como uma seqüência de spots na direção horizontal ou
vertical de um gel 2D-PAGE. Isto nos leva, portanto, à necessidade de análises mais
específicas (como MALDI-TOF-MS, QTOF-MS, dentre outras) para, de fato, as
identificarmos.
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
77
4.3 MALDI-TOF-MS
Para as medidas de MALDI-TOF-MS foi preparado um gel 2D-PAGE, seguindo
o descrito no item 3.5 deste Capítulo, mas com uma concentração maior de proteínas,
ou seja, foram utilizados 0,525 mL de extrato protéico de castanha da Índia –
procedimento 5 (vide Quadro 1.1, Capítulo 1), correspondendo a 1,88 mg de
proteínas (segundo dados da Tabela 1.1, Capítulo 1). Esta concentração maior de
proteínas permitiu que se observassem mais spots protéicos no gel. Na Figura 2.8 é
apresentado o gel utilizado na análise por MALDI, onde pode se distinguir pelo menos
17 spots protéicos, denominados de A a Q. Todos esses spots foram recortados do
gel, sofreram digestão tríptica e foram caracterizados por MALDI, conforme descrito
no item 3.5 deste Capítulo.
Na Tabela 2.6 são apresentados os valores de pI, MM, porcentagem de volume
e porcentagem de intensidade, estimados a partir da imagem do gel da Figura 2.8
utilizando-se o programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0. Nesta Tabela verifica-
se que as posições dos pontos isoelétricos e das massas molares dos spots protéicos
A a I variaram muito pouco em relação aos valores estimados na Tabela 2.4 (quando
se utilizou uma quantidade menor de proteínas), podendo-se considerá-los
concordantes entre as duas Tabelas. Por outro lado, os valores de % de volume e %
de intensidade foram alterados, levando-se em consideração o número maior de
spots (17).
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
78
Figura 2.8. Gel 2D-PAGE do extrato protéico proveniente do procedimento 5 (amostra manualmente macerada em tampão Tris-HCl 1,0 mol L-1 (pH 6,8), por 15 min). Fita de 13 cm, pH de 3 a 10, padrão de proteínas de massa molar de 116,0 a 14,4 kDa. Gel com dimensões de 130 x 130 x 1,5 mm. Os spots estão destacados em vermelho e denominados de A a Q, da esquerda para direita.
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
79
Tabela 2.6: Dados estimados dos spots protéicos do gel 2D-PAGE da Figura 2.8, segundo o programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0.
Spot MM (kDa) pI % Volume % Intensidade
A 24,1 5,5 2,52 2,82
B 23,7 5,7 8,22 7,84
C 23,7 5,9 14,7 8,2
D 23,4 6,2 17,6 9,7
E 23,4 6,5 11,4 8,8
F 23,0 6,7 7,6 6,4
G 23,2 6,9 5,3 6,9
H 22,8 7,2 6,3 6,8
I 22,9 7,3 6,4 6,8
J 22,6 7,9 2,3 3,7
K 22,8 8,0 2,0 3,6
L 22,7 8,2 1,8 3,0
M 22,9 8,4 1,2 2,9
N 22,7 8,6 1,2 4,0
O 22,6 8,7 7,0 9,0
P 22,7 9,0 1,7 3,9
Q 22,7 9,2 2,8 5,8
Os espectros de MALDI-TOF-MS foram realizados em duplicata e,
aparentemente, são idênticos entre si para cada spot. Na Figura 2.9 são
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
80
apresentados alguns espectros dos spots A e H, em duplicata, para exemplificar essa
similaridade.
Spot A-1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am01 1 (0.402) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:3) 1: TOF MS LD+ 1582000.0480
1999.0099
869.47171349.7225
870.4717
1229.64831033.5853
1708.87151613.9279
1483.7258 1952.0316
1711.8284
2001.0205
2015.0414
2017.01073258.4543
2057.0803 2351.26033257.5500
2379.29153260.4104
Spot A-2
Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am02 3 (0.573) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:3) 1: TOF MS LD+ 1892000.0316
1999.0262
869.47171349.7091
1060.0670870.4609
976.46061229.6483
1061.0754
1709.86191613.9279
1482.70371951.0220
1711.8589
2001.0371
2016.0012
2017.0271
3258.55932057.0471 2248.1628
3257.50762352.2788 3260.4734
Spot H-1
Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am15 1 (0.424) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 2602000.0480
1999.0428
1349.7362
869.4717
1033.59701034.5807
1350.7247
1505.83951351.7271
1352.7300
1649.89671708.9020
1709.89251710.8984
2001.0535
2016.0342
2017.0437
3258.53832057.09692274.2041
2248.1628
2360.18583256.5618
2702.36042379.32763124.5640
3260.57893434.6914
Spot H-2
Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am16 2 (0.492) Sm (SG, 2x4.00) 1: TOF MS LD+ 3802000.0480
1999.0428
1349.7362
869.4717
1033.5970
1034.5927
1350.7382
1505.8395
1352.7300
1649.88161708.8868
1952.03161710.9136
2001.0371
2016.0342
2017.06033258.5173
2056.0442 2360.18582058.1001 2702.3408
2380.31623256.5618
3137.49022704.3335
3260.53643434.6050
Figura 2.9. Espectros de massas em duplicata para as proteínas dos spots A e H.
A seguir, são apresentados na Figura 2.10 alguns dos 34 espectros de massas
gerados para os spots protéicos A a Q (todos espectros são apresentados no
Apêndice 4).
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
81
Spot B Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am03 2 (0.503) Sm (SG, 2x4.00) 1: TOF MS LD+ 1862000.0150
1999.0262
857.53781349.7225
1229.64831033.59701115.5988
1613.9279
1351.7271
1667.98461951.0383
1711.9045
2001.0205
2002.0264
2017.01073258.5383
2351.24222018.03702248.1975
3257.4446
2352.27883097.5190
3260.5154
Spot C
Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am06 2 (0.489) Sm (SG, 2x4.00) 1: TOF MS LD+ 3402000.0316
1999.0262
857.5378
1349.7225869.4717
1229.6354870.4717976.4606
1034.5927
1708.87151350.7247
1667.96951710.8679
1711.8740
2001.0371
2016.0342
2334.17212017.0603
2248.19752018.0370
3259.52663257.50762350.1882
3139.53372353.1907
3260.5154
3261.4832
Spot G
Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am13 1 (0.424) Sm (SG, 2x4.00) 1: TOF MS LD+ 3292000.0316
1999.0428
1349.7362
1229.64831033.5970857.5378 1115.5988
1350.7382
1505.8395
1488.8264
1650.8700 1708.88681710.8984
2001.0535
2002.05933258.5173
2017.0769 3257.5291
2334.18972018.0536
2039.08423098.5447
2379.3276
3260.5364
3261.52563434.5620
3274.5415
Spot I
Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am17 2 (0.508) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 3212000.0646
1999.0592
1349.7496
869.48261033.5970 1321.6938
1350.7382
1505.8395
1351.7271
1352.7163
1649.8816
1708.90201709.8925
1710.8984
2001.0535
2016.0508
2379.30962017.07692378.3391
2018.03702248.2151
2039.0842
3258.5383
3256.56182381.34132702.36042382.3303 3097.5396
3260.4944
3261.5886 3434.6270
Spot N
Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am27 2 (0.502) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 2771349.7362
869.4826
877.0623 1033.62071332.7166
2000.06461999.0592
1350.7382
1505.8539
1351.7542
1352.7163
1649.89671650.8998
1951.0547
1709.9227
1806.9985
2001.0701
2016.0508
2379.32762017.07692378.3391
2018.07022247.2017
2019.0304
3258.53832380.3523
3256.58282381.3232
3137.55222702.2837 2809.4473
3259.5476
3260.5999 3433.5691
Figura 2.10. Espectros de massas gerados para os spots protéicos B, C, G, I e N.
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
82
Na inspeção visual dos espectros de massas da Figura 2.10 e Apêndice 4
percebe-se uma certa similaridade entre as estruturas orgânicas, não permitindo
ainda uma afirmação sobre a natureza ou similaridade das proteínas.
Os programas MASCOT Distiller e MASCOT Daemon, da Matrix Science
(London, UK) escolheram os cinco picos de massa/carga mais intensos de cada
espectro MS e excluíram os picos da tripsina e dos isótopos menos abundantes. A
seguir, foram feitas as medidas MS/MS e identificadas as sequências de peptídeos.
As posições dos picos e as sequências peptídicas são apresentadas na Tabela 2.7.
Nesta Tabela são apresentados os dados obtidos tanto para as proteínas nos spots
em duplicata, como, por exemplo, spot B-01 e B-02, como para as proteínas de
diferentes spots. Infelizmente, não foi possível produzir os espectros MS/MS de
algumas proteínas como as dos spots A, J, e L. Apesar disso, pode ser observado
que vários dos picos mais intensos são concordantes para várias proteínas, tais como
os picos de razão m/z 1348,6583; 1707,7960; 1998,0422 e 2013,9718.
Também se observa que algumas sequências peptídicas se repetem para
diferentes proteínas: A sequência EVSFLSYLYTK, com razão m/z de 1348,6915 para
as proteínas dos spots D, E, F, G, H, N e O; a sequência HVRESLPHIDMR, com
razão m/z de 1504,7569 para as proteínas dos spots D, E, G, H, I e O; a sequência
IQPNYLFSRTAIAR, com a razão m/z de 1648,9049 para os spots E, F, H, I, N, O e P;
a sequência QAPAVAPDDTVLAVSELFR, com razão m/z de 1998,0422 para as
proteínas dos spots B, C, D, E, F, G, H e N e a sequência VVYGSTVPVLDGEEFTMR,
com razão m/z de 2013,9718 para as proteínas dos spots B, C, E, F, G, H e I. Esses
resultados sugerem que se trata de isoformas.
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
83
Tabela 2.7. Razões m/z e as sequências peptídicas identificadas para as proteínas dos spots B a Q, provenientes dos espectros MS/MS. Amostra pI MM (kDa) Razão m/z Seqüência peptídica
B-01 5,69 23,77 1348,6583 DVTNTRSPSTSGK
1611,8733 KVAWKPVEQQNSAK
1665,8980 LKSSIMTAIMVMVAR
1998,0422 QAPAVAPDDTVLAVSELFR
2013,9718 VVYGSTVPVLDGEEFTMR
B-02 5,69 23,77 1228,5625 FPNWSNDPPR
1348,7252 PLSEIFFQGRR
1707,7960 FLVSGSAMMPTAPDPR
1997,9915 EVVMIAGKGDITVCTSFR
2014,0558 GAGFGIPALVVDGMDVLEVR
C-01 5,93 23,72 1348,7061 SIPLMSQVFPSK
1611,8807 FVIPQGMNLIPIDR
1707,8259 LAPSPMPPMKAPMHR
1998,0422 QAPAVAPDDTVLAVSELFR
2014,0081 EFTQTPLLSTEFTVVMR
C-02 5,93 23,72 1348,7238 SLFEADKLDLAK
1665,8297 ETQKYVFNHTMLR
1707,8805 DHVADVAAGLQRFGPR
1998,0422 QAPAVAPDDTVLAVSELFR
2013,9718 VVYGSTVPVLDGEEFTMR
D-01 6,21 23,44 1504,7344 QPVFQDSPTLAMR
1665,8838 KVTSLHHQAFEIEK
1707,7960 FLVSGSAMMPTAPDPR
1998,0422 QAPAVAPDDTVLAVSELFR
D-02 6,21 23,44 1348,6915 EVSFLSYLYTK
1504,7569 HVRESLPHIDMR
1665,8322 QIYAATQKAETEASR
1707,7960 FLVSGSAMMPTAPDPR
1998,0422 QAPAVAPDDTVLAVSELFR
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
84
E-01 6,52 23,44 1348,6915 EVSFLSYLYTK
1504,8072 QMALFISKDSPLR
1707,7999 VSCDGSGDIPAALGHPR
1998,0422 QAPAVAPDDTVLAVSELFR
2013,9718 VVYGSTVPVLDGEEFTMR
E-02 6,52 23,44 1348,6915 EVSFLSYLYTK
1504,7569 HVRESLPHIDMR
1648,9049 IQPNYLFSRTAIAR
1707,7635 GENGLPGDNGAPGPMGPR
F-01 6,7 23,06 1348,6915 EVSFLSYLYTK
1504,8548 MLAQIASLRLFSR
1648,9049 IQPNYLFSRTAIAR
1998,0422 QAPAVAPDDTVLAVSELFR
2013,9718 VVYGSTVPVLDGEEFTMR
G-01 6,91 23,20 1348,6915 EVSFLSYLYTK
1504,7634 RSDLGGTSPEAFLR
1998,0422 QAPAVAPDDTVLAVSELFR
2013,9718 VVYGSTVPVLDGEEFTMR
3256,5645 TRLIFICNPNNPSGTTITQAQFDNFMEK
G-02 6,91 23,20 1228,5625 FPNWSNDPPR
1348,6915 EVSFLSYLYTK
1504,7569 HVRESLPHIDMR
1998,0422 QAPAVAPDDTVLAVSELFR
2013,9718 VVYGSTVPVLDGEEFTMR
H-01 7,17 22,79 1348,6915 EVSFLSYLYTK
1504,7569 HVRESLPHIDMR
1648,9049 IQPNYLFSRTAIAR
1998,0422 QAPAVAPDDTVLAVSELFR
2013,9718 VVYGSTVPVLDGEEFTMR
H-02 7,17 22,79 1348,6915 EVSFLSYLYTK
1504,7569 HVRESLPHIDMR
1648,9049 IQPNYLFSRTAIAR
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
85
1998,0422 QAPAVAPDDTVLAVSELFR
2013,9718 VVYGSTVPVLDGEEFTMR
I-01 7,32 22,93 1348,7285 LPSISMIRGFGR
1504,7569 HVRESLPHIDMR
1648,9049 IQPNYLFSRTAIAR
1998,1158 VILFCMDAAVLLLLVHR
2013,9718 VVYGSTVPVLDGEEFTMR
I-02 7,32 22,93 1348,6677 SGHFFFNAPLGR
1532,7517 LHGLIASLIPSPR
1998,0422 QAPAVAPDDTVLAVSELFR
2013,9296 DSSFETLTLGDVATITHK
K-01 8,07 22,79 1348,6040 DLSQSASILKK
1504,7287 NEISLTGVGLHTGK
1648,7839 GEIINCSGNTTTNLR
1997,9976 KYFRPLEVDTLLGDPR
2377,2056 ARTPAWPDLGLHGGAAAVTLAPR
M-01 8,35 22,93 1348,6864 LSPLLTRNNNK
1648,8185 RSVSAATPSQLDLPK
1997,9724 ITSFFLQEEGSRVIHR
2013,8857 RGSQLGLTDINLGMAHR
2377,1736 IVEIASAEELYSRPMHPYTR
M-02 8,35 22,93 1348,7115 SLIIAEKPSVGR
1504,7555 SSLLAENQVLMER
1998,0299 TLTPPDTAAVKGAIGTLHR
2014,0135 LMQFFDVLSKYFPAHR
2377,1607 GGKLETLVLSDNFFFGSIPEK
N-01 8,61 22,70 1348,6915 EVSFLSYLYTK
1504,7287 NEISLTGVGLHTGK
1586,7375 STILGIADEKSMAR
1648,8568 YPMPSIPMILASLGK
1997,9241 EVMVSGGRAAGVVLESGER
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
86
N-02 8,61 22,70 1348,7061 SIPLMSQVFPSK
1504,8548 MLAQIASLRLFSR
1586,8879 IISGQETDLSKLGVK
1648,9049 IQPNYLFSRTAIAR
1998,0422 QAPAVAPDDTVLAVSELFR
O-01 8,74 22,60 1348,6915 EVSFLSYLYTK
1504,7569 HVRESLPHIDMR
1586,8879 IISGQETDLSKLGVK
1648,9049 IQPNYLFSRTAIAR
1997,9976 KYFRPLEVDTLLGDPR
O-02 8,74 22,60 1348,6915 EVSFLSYLYTK
1504,7569 HVRESLPHIDMR
1586,8893 QSDLKLFASRPGLR
1648,9049 IQPNYLFSRTAIAR
1997,9224 SPAGAAKPASNVLAPTTGTK
P-01 9,0 22,74 1348,6405 GEEMLSRDLAGR
1504,8184 RGPPPPLMSAPLTR
1586,7988 QLTFGHCLALGGSAR
1648,9049 IQPNYLFSRTAIAR
1998,0299 TLTPPDTAAVKGAIGTLH
Q-01 9,2 22,74 1348,6040 DLSQSASILKK
1504,7643 RTVSLNIHFMCK
1997,9377 QFTAATPVLSDILAVHR
2013,8996 IALIGSGETTPTMVGVHR
2377,1848 HGGQTIGKPLGYLSGSLLIPLP Tolerância para Massa de peptídeos: ± 0,1 Da Tolerância para Massa de fragmentos: ± 0,1 Da
Não foi possível a identificação de nenhuma das proteínas estudadas nas
buscas dos bancos de dados Glycine Max e MSDB, ficando, ainda, a sugestão de que
se faça uma busca por homologia.
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
87
5. CONCLUSÃO PARCIAL
Neste Capítulo foi realizada uma investigação da influência dos procedimentos
de extração de proteínas propostos no Capítulo 1 no proteoma da castanha da Índia.
Apesar dos diferentes procedimentos propostos influenciarem na concentração
de proteínas extraídas verificou-se que na separação eletroforética em uma dimensão
(SDS-PAGE) sempre se identificava apenas uma banda protéica mais intensa de
massa molar aproximadamente 23,5 ± 0,5 kDa, ou seja, ao menos, aparentemente,
os procedimentos de extração propostos no Capítulo anterior não foram decisivos
para a extração de proteínas de MM diferentes. Este valor de MM foi considerado
para as proteínas desnaturadas e sob condição redutora. Quando se separou sob
condições não-redutoras a mesma banda protéica apresentava MM em torno de 33,2
± 0,9 kDa. Este fato interessante observado foi relacionado à mudança na mobilidade
da proteína. A presença de compostos fenólicos liberados durante a maceração pode
mudar a mobilidade das proteínas e produzir resultados incorretos quanto à massa
molar. Dessa maneira, o uso de um agente redutor (como o 2-mercaptoetanol) é
imperativo para evitar tais problemas.
Também foi possível se estimar a massa de proteínas na banda protéica a
partir da densidade óptica e da comparação com o padrão de proteínas utilizado.
Obteve-se um valor em torno de 4,4 ± 0,6 µg de proteínas para cada banda,
concordando com o valor proposto no preparo dos géis.
Ao se realizar a separação eletroforética em duas dimensões foram
identificados pelo menos 9 spots protéicos com valores de MM entre 23,4 e 23,7 kDa,
e de pI entre 5,6 e 7,7, confirmando os resultados obtidos na separação por SDS-
PAGE.
Nas análises por espectrometria de massas, foi possível a inspeção visual da
similaridade dos espectros de massas MS para todos os spots protéicos e mais ainda
nos espectros MS/MS. Foi observado que os cinco picos mais intensos dos espectros
MS coincidiam em posição para vários spots protéicos, e, ao se identificarem as
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
88
sequências peptídicas, estas também coincidiram para vários spots protéicos,
sugerindo que se trata de isoformas.
Não foi possível a identificação das proteínas em bancos de dados ao se
utilizarem as sequências peptídicas, ficando em aberto a possibilidade da busca por
homologia. O que se entende é que se trata de proteínas estáveis ao calor e
provavelmente de origem citosólica.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] Lanças, F. M., Silva, J. C. R., Bicudo, R. C. e Neto, M. B., A química analítica do proteoma, Revista Analytica, Agosto/ Setembro(2003)60. [2] Gao, Y., Chen, C., Chai, Z., Zhao, J., Liu, J., Zhang, P. e Huang, Y., Detection of metalloproteins in human liver cytosol by synchrotron radiation X-ray fluorescence combined with gel filtration chromatography and isoelectric focusing separation, Analyst, 127(2002)1700. [3] Garcia, J. S., Magalhães, C. S. e Arruda, M. A. Z., Trends in metal-binding and metalloprotein analysis, Talanta, 69(2006)1. [4] Melvin, M., Electrophoresis – Analytical Chemistry by Open Learning, 1rst ed., Ed. D. Kealy, John Wiley & Sons, London, 1987, p. 127. [5] Plantcell, disponível no site http://micro.magnet.fsu.edu/cells/plantcell.html , acessado em 19-10-2007. [6] Newton, R. P., Brenton, A. G., Smith, C. J. e Dudley, E., Plant proteome analysis by mass spectrometry: principles, problems, pitfalls and recent developments, Phytochemistry, 65(2004)1449. [7] Komatsu, S., Konishi, H., Shen, S. e Yang, G., Rice proteomics. A step towards functional analysis of the rice genome, Molecular and Cellular Proteomics, 2(2003)2. [8] Koller, A., Wasburn, M. P., Lange, B. M., Andon, N. L., Decieu, C., Haynes, P. A., Hays, L., Schieltz, D., Ulasek, R., Wei, J., Wolters, D. e Yates, J. R., Proteomic survey of metabolic pathways in rice, Proceedings of the national academy of sciences of the united states of america, 99(2002)11969. [9] Taylor, S. W., Fahly, E. e Ghosh, S. S., Global organellar proteomics, Trends in Biotechnology, 21(2003)82.
Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
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Tese de Doutorado Capítulo 2 Cristiana S. de Magalhães
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91
CAPÍTULO 3
Identificação e Quantificação de Metais
Associados às Proteínas
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
93
1. OBJETIVOS
• Verificar a presença de metais nas estruturas das proteínas já separadas,
conforme descrito no Capítulo 2, e a influência da preservação dos mesmos ao
se utilizarem os diversos processos de extração de proteínas sugeridos no
Capítulo 1.
• Identificar os metais ligados às proteínas usando a técnica SRXRF
• Quantificar os metais ligados às proteínas usando a AAS.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Metaloproteínas e proteínas de metal ligante
Mesmo em baixas concentrações, alguns metais exercem um papel importante
na atividade biológicaestando majoritariamente ligados a proteínas específicas ou
enzimas e exercem seus efeitos em centros ativos ou estruturais das proteínas [1].
Metaloproteínas e proteínas de metal ligante (ou metal-binding, em inglês)
representam uma grande porção do número total de proteínas [2]. Tem sido estimado
que 40% de todas as proteínas e enzimas contenham metais nas suas estruturas.
Metaloproteínas e proteínas de metal ligante são responsáveis por muitos processos
metabólicos, tais como a conversão de energia na fotossíntese e respiração, bem
como processos que governam a expressão e regulação genética. Sítios metálicos
nas estruturas de proteínas também comandam outros processos, tais como catálise,
transporte e armazenamento [3, 4]. Uma metaloproteína é formada quando uma
proteína possui o tipo e o número apropriado de ligantes. Ainda, outra característica
importante é a geometria do ligante, pois apenas com a geometria correta os ligantes
poderão envolver e ativar o metal. Proteínas naturais e teoricamente projetadas
demonstraram que uma única modelagem pode ser adaptada para acomodar uma
grande variedade de metais [3]. Peptídeos, fragmentos de proteínas de diferentes
tamanhos contém grupos funcionais nas suas cadeias laterais que podem formar
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
94
ligações coordenativas com metais. Cisteína e metionina ligam metais que
apresentam afinidade com enxofre. Na histidina, os átomos de nitrogênio se tornam
disponíveis para coordenação após a desprotonação induzida [5].
Metaloproteínas são consideradas diferentes de proteínas de metal ligante. As
primeiras são definidas quando o metal liga-se às proteínas com interações de alta
afinidade, os quais não são perdidos durante a manipulação da amostra (por
exemplo, isolamento ou diluição). Já nas outras, as interações metal-proteína
possuem menor afinidade sendo mais facilmente rompidas [6]. As proteínas
interagem fracamente com íons monovalentes, tais como K+ e Na+. Entretanto, íons
como Ca2+ e Mg2+ interagem moderadamente e íons de metais de transição, tais
como Cu2+, Fe2+, Mn2+ e Mo2+, devido às suas conformações (densidade, raio atômico
pequeno e interações via forças eletromagnéticas e eletrostáticas) interagem
fortemente. Estes últimos são encontrados na maioria das metaloproteínas. O Quadro
3.1 apresenta algumas metaloproteínas.
Uma classe de metaloproteínas de grande interesse são as metalotioneínas
(MTs). As MTs de mamíferos apresentam baixa massa molar (em torno 6,8 kDa) e
são caracterizadas pela alta concentração de cisteína (30%). Elas têm afinidade para
a ligação de uma grande variedade de íons metálicos de transição (especialmente
elementos como Cd, Cu e Zn) [9].
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
95
Quadro 3.1 – Exemplos de algumas metaloproteínas [7, 8].
Elemento Proteína
Selênio
Glutationa peroxidase. Uma enzima que catalisa a redução de peróxidos e protege a célula de danos oxidativos.
Crômio Transferrina (proteína do plasma). Transporta Cr(III) através do corpo nas células do sangue.
Cobre
Ceruloplasmina (proteína do soro humano), ascorbato oxidase (plantas e bactérias), plastocianina (plantas superiores e cianobactérias), superóxido dismutase, tirosinase, citocromo oxidase e hemocupreína (animais).
Chumbo
Em torno de 95% do chumbo total no sangue humano é ligado a eritrócitos. Na maioria dos eritrócitos, o chumbo é ligado dentro da célula à hemoglobina. Nos fluidos extracelulares, o chumbo liga-se à albumina e a algumas proteínas de alta massa molar (globulinas).
Zinco Zinco é um constituinte de mais de 200 enzimas e proteínas. Os principais exemplos são insulina e carboxipeptidase A.
Manganês
Este metal é encontrado numa variedade de enzimas tais como piruvato carboxilase e oxalacetato decarboxilase. Este elemento pode ser encontrado em proteínas tais como glutamina sintetase, β-globulina e albumina.
Ferro
Proteínas contendo ferro são classificadas em duas categorias. A primeira é a heme, onde o metal é quelado por porfirina (um ligante solúvel em água). Esta classe é constituída por hemoglobina, mioglobina e citocromos. A segunda é formada por ferro não-heme. Os principais exemplos são transferrina, ferritina, ovotrasferrina, caseína, hemosiderina e albumina.
2.2 Fluorescência de raios-X por radiação síncrotron (SRXRF)
Existem poucos trabalhos publicados na literatura utilizando SRXRF como
técnica de detecção após a separação de proteínas por eletroforese. A radiação
síncrotron como fonte de raios-X possui propriedades superiores como alta
intensidade (de 103 a 106 vezes maior que as fontes convencionais de raios-X), além
de ser altamente colimada e polarizada linearmente no plano elétrico orbital. Esta
técnica tem atraído a atenção para as análises que requerem baixas concentrações.
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
96
Pode ser alcançado um limite de detecção absoluto (LD) da ordem de 10-12 a 10-15 g
g-1 e um LD relativo de µg g-1 [10] e são necessários pequenos volumes ou massas
de amostras. Como esta técnica é considerada não-destrutiva, o preparo das
amostras é geralmente simples e rápido. Além disso, pode-se processar uma análise
multielementar simultânea (desde o Na ao final da tabela periódica). Ela consome
pouco tempo e ainda apresenta a possibilidade de se medir a distribuição dos
elementos tanto na superfície como no volume da amostra [10].
Embora a SRXRF tenha tantos atrativos, às vezes seu custo não é compatível
quando comparado a outras técnicas analíticas, que apresentam a mesma (ou até
melhor) sensibilidade. Entretanto, quando se utiliza uma micro-sonda de radiação
síncrotron esta situação muda por completo, uma vez que a capacidade de medidas
em baixas concentrações de elementos chega à ordem de sub-µg g-1.
Em 2002 Gao et al. [11] propuseram um sistema para separação e detecção de
metaloproteínas no citosol de fígado humano. O procedimento incluiu uma
cromatografia com filtração em gel e separação por focalização isoelétrica de
proteínas, um passo de secagem de gel e uma análise por SRXRF dos elementos nas
bandas de proteínas. Os resultados mostraram a existência de pelo menos 2 bandas
protéicas contendo Zn, 2 contendo Cu e 11 contendo Fe no citosol de fígado humano.
Apesar desses resultados, os autores acreditam que ainda são necessários melhorias
para a determinação quantitativa de elementos em baixa concentração nas bandas
protéicas. Gao et al. [12] também detectaram metaloproteínas no citosol de fígado
humano por SRXRF após a separação por SDS-PAGE. O gel foi seco imediatamente
após a separação eletroforética e as concentrações de metais foram determinadas
em certas regiões do gel por SRXRF. Após esta análise, o gel foi corado e descorado
e mais de 35 bandas protéicas foram visualmente distinguidas. Uma série de
espectros de SRXRF foi coletada ao longo da direção eletroforética. Com esse
procedimento foram distinguidas 6 bandas protéicas que continham Zn e pelo menos
mais 4 que continham Fe e 1 que continha Cu nesta amostra.
Em 2004 Weseloh et al. [13] combinaram as técnicas de SRXRF e SDS-PAGE
para analisar metal-apoazurina (com metais não ligados covalentemente) e
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
97
selenoproteínas em testículos de ratos. A amostra de apoazurina foi incubada em
solução de 2 mmol L-1 de ZnCl2, de forma a trocar o íon de Cu(II) na molécula por íon
de Zn(II) e a amostra de selenoproteína foi também preparada apropriadamente.
Todas as amostras foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para uma
membrana de PVDF (blotting) e coradas com azul de Coomassie. A distribuição de
selenoproteínas foi determinada por SRXRF e comparada a selenoproteínas de
testículos de ratos marcadas com 75Se, que foram preparadas conforme descrito por
Behne et al. [14]. A distribuição de vários elementos ao longo da canaleta de gel foi
determinada na amostra de apoazurina embebida com Zn. Foram encontrados Zn e
Cl nas bandas de proteínas. Para as amostras de selenoproteínas, foi detectado
apenas um pico de selênio por SRXRF e este foi identificado como a seleno-enzima
glutationa hidroperóxido fosfolipídeo, por autoradiografia. Também foram detectados
bromo, cobre, chumbo e zinco ao longo da canaleta de gel, provavelmente por
contaminação. Os autores concluíram que a combinação dos procedimentos
propostos poderia ser aplicada para a identificação de elementos em baixa
concentração em proteínas nas quais o metal ou metalóide estivesse covalentemente
ligado ou na forma de um complexo estável. Para os casos de complexos metal-
proteínas fracamente ligados, existiria o problema da perda de metais, e assim, a
PAGE nativa (com proteínas não desnaturadas) deveria ser empregada.
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Equipamentos e Acessórios
Os seguintes equipamentos e acessórios foram utilizados para o
desenvolvimento deste Capítulo:
• Balança analítica, marca Mettler, modelo AE200;
• Chapa aquecedora, marca Marconi, modelo MA239;
• Destilador sub-ebulição, marca Marconi, modelo MA075;
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
98
• Espectrômetro de absorção atômica com chama, marca Perkin-Elmer, modelo
AAnalyst 300;
• Espectrômetro de absorção atômica com atomização eletrotérmica, marca
Perkin-Elmer, modelo AAnalyst 600, equipado com corretor Zeeman
longitudinal e auto-amostrador modelo AS-800;
• Espectrômetro de Fluorescência de raios-X com radiação síncrotron (disponível
no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron);
• Forno de microondas tipo cavidade, marca Provecto Analítica, modelo DGT
100 Plus;
• Lâmpadas de catodo oco, marca Perkin-Elmer;
• Sistema desionizador Milli-Q, marca Millipore, modelo QuantumTM cartridge;
• Vidrarias apropriadas.
3.2 Reagentes e Soluções
Todos os reagentes usados foram de grau analítico, sendo as soluções
preparadas com água desionizada. Para o preparo das soluções de referência de
várias espécies químicas foi usado ácido nítrico sub-destilado 0,2% (v/v) nas
determinações por ETAAS e 2% (v/v) nas determinações por FAAS. A seguir, são
listados todos os reagentes/soluções empregados nesta parte do trabalho:
• Ácido nítrico sub-destilado, HNO3 (Merck);
• Dihidrogênio fosfato de amônio NH4H2PO4, MM = 115,03 g mol-1 (Ecibra);
• Nitrato de paládio hidratado, Pd(NO3)2H2O, MM = 230,41 g mol-1 (Aldrich);
• Nitrato de magnésio hexahidratado, Mg(NO3)2 6H2O, MM = 256,41 g mol-1 (Merck);
• Peróxido de hidrogênio, H2O2 30% (m/m) (Merck);
• Solução de lantânio 10% (m/v) preparada a partir de La2O3, MM = 325,8 g mol-1
(Sigma), em 30% (v/v) de HCl;
• Soluções de referência de Fe, Mn, Cr e Ca (TecLab).
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
99
3.3 Mapeamento dos metais ligados às proteínas nas bandas por
fluorescência de raios-X por radiação síncrotron (SRXRF)
Para a análise das bandas de proteínas em gel SDS-PAGE proveniente da
castanha da Índia foi utilizada a linha de radiação DB09 do Laboratório Nacional de
Luz Síncrotron (LNLS). O anel de armazenamento de elétrons operava com uma
energia de 1,37 GeV com uma intensidade de 250 mA. Para se utilizar a fonte branca
em dimensões micrométricas, o conjunto de fendas foi ajustado pela micro-sonda de
raios-X da fonte de linha. Um colimador de tântalo de 2 mm de diâmetro foi usado na
entrada do detector. O detector de alta pureza de Ge (HPGe) foi colocado no plano
orbital dos elétrons, perpendicular à fonte incidente, para coletar o sinal XRF da
amostra exposta. As bandas de proteínas foram cortadas do gel e montadas sobre
um porta-amostras que se movia nas direções cartesianas XYZ. A amostra era
ajustada quanto ao posicionamento na fonte de radiação síncrotron (SR), de
dimensões 230 x 220 µm, quando esta era ligada. Na Figura 3.1 é apresentada a
montagem dos instrumentos utilizados nesta identificação.
Figura 3.1. Configuração do sistema utilizado para a aquisição dos dados referentes ao mapeamento de espécies químicas presentes nas bandas de proteínas.
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
100
Cada espectro de raios-X teve a duração de 300 s. As bandas de gel eram
movidas na direção horizontal (ao longo da banda) com 2 mm de intervalo entre cada
ponto mapeado. Ao todo foram mapeados 3 pontos em cada banda. Os espectros
foram processados por meio do programa AXIL. Com este programa, foi feita a
correção das variações de intensidade do fluxo da fonte de SR e as áreas dos picos
das espécies químicas detectadas foram normalizadas pela contagem de Argônio,
que está presente no ar a uma taxa constante (0,934% v/v) [15]. As áreas de pico
normalizadas foram usadas para estimar as contagens relativas dos íons metálicos.
As médias de intensidade dos dados (de todas as espécies químicas) foram
calculadas dos três pontos mapeados, bem como foi feita a diferença entre a
intensidade do sinal das amostras e do branco analítico. O branco analítico
considerado foi a banda de proteína ovalbumina no gel.
3.4 Decomposição ácida sob radiação microonda
Para possibilitar a quantificação de possíveis metais ligados às proteínas nos
extratos protéicos, foram decompostos as bandas de proteínas de gel SDS-PAGE e
os spots dos géis de 2D-PAGE, todos em triplicata. Cada banda de gel foi recortada
cuidadosamente, com o uso de um bisturi, e seca à temperatura de aproximadamente
50oC até massa constante. As amostras foram inseridas nos frascos de Teflon com a
mistura oxidante de 5 mL de HNO3 e 1 mL de H2O2. Foi dado um intervalo de tempo
de espera de 30 min antes do início da decomposição assistida por microonda, e
utilizado o seguinte programa de decomposição: 3 min a 400 W e 6 min a 790 W [16].
Após a decomposição, os frascos foram removidos do forno de microondas e
esperou-se o resfriamento até a temperatura ambiente (cerca de 2 h). Em seguida, os
frascos foram cuidadosamente abertos e as soluções foram transferidas para
béqueres, os quais foram levados à chapa aquecedora (60 – 70oC) para evaporação
do excesso de HNO3 (até quase secura – cerca de 8 h). Finalmente, as amostras
foram filtradas e os volumes finais foram ajustados em balões volumétricos para 5 mL
com a solução de HNO3 sub-destilado 0,2% (v/v). Os brancos analíticos consistiram
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
101
da banda da proteína ovalbumina em gel de SDS-PAGE e 2D-PAGE, submetidos ao
mesmo processo de decomposição descrito, também em triplicata. Este branco
analítico foi escolhido pela similaridade da matriz orgânica do gel para as proteínas e
para a ovalbumina, a qual não é considerada uma metaloproteína, de acordo com
banco de dados de proteínas [17].
3.5 Determinação de metais por ETAAS e FAAS nas bandas SDS-
PAGE e 2D-PAGE
Para a quantificação de metais nas bandas de proteínas provenientes de SDS-
PAGE e 2D-PAGE, após suas decomposições conforme descrito no item 3.4, foram
utilizados os espectrômetros de absorção atômica AAnalyst 600 e AAnalyst 300,
ambos da Perkin-Elmer (Norwalk, EUA). Para determinação de Fe, Cr e Mn foi
empregada a técnica ETAAS e para a determinação de Ca foi empregada a técnica
FAAS.
Foram utilizadas, como fontes primárias de radiação, as lâmpadas de catodo-
oco (Perkin-Elmer) de Cr (λ = 357,9 nm), Fe (λ = 248,3 nm), Mn (λ = 279,5 nm) e Ca
(λ = 422,7 nm). As medidas analíticas foram baseadas nas áreas de pico. As
condições de operação, tanto para ETAAS como para FAAS, foram as recomendadas
pelo fabricante [18].
As soluções-estoque (1000 mg L-1) para Cr, Fe e Mn foram preparadas em
0,2% (v/v) de HNO3, enquanto que para o Ca foi preparada em 2% (v/v) HNO3 com
0,1% (m/v) de La2O3. Modificadores químicos, tais como 0,15% (v/v) Mg(NO3)2 e
0,05% (v/v) Pd + 0,03% (v/v) Mg(NO3)2, foram usados para as determinações de Fe e
Cr, e para Mn, respectivamente.
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
102
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Avaliação qualitativa dos metais ligados às proteínas nas bandas
por SRXRF
Foram avaliados qualitativamente quais metais estariam ligados às proteínas
nas bandas (SDS-PAGE). Para isso foram utilizadas as bandas de proteínas de MM =
23,5 kDa, obtidas dos procedimentos 1, 2, 8 e 9 dos extratos protéicos da castanha
da Índia. Para um melhor acompanhamento desta parte do trabalho é sugerido que se
consulte o Quadro 1.1 do Capítulo 1 desta Tese.
Na Figura 3.2 são exemplificados os espectros de raios-X adquiridos. Pode-se
observar as linhas de emissão do Ca, Cr, Fe e Mn, apesar da intensa radiação de
fundo (entre 5 e 12 keV). Esta radiação de fundo é atribuída ao efeito Compton
provocado pelo fato das proteínas estarem inseridas em um gel de poliacrilamida que
continha elevados teores de água [11, 12, 16].
Por meio das áreas dos picos normalizados dos espectros de SRXRF das
bandas, foi possível identificar e estimar (conforme seção 3.3) as quantidades
relativas de Ca (3,69 keV), Cr (5,41 keV), Mn (5,89 keV), e Fe (6,40 keV) das
emissões Kα, conforme apresentado na Tabela 3.1.
Tabela 3.1: Contagens relativas de metal das emissões Kα de íons metálicos. Os dados da intensidade média (contagens de íons de metal) foram calculados a partir dos três pontos mapeados, bem como foram descontadas as diferenças entre as intensidades das contagens das amostras e dos brancos analíticos.
Procedimento* Ca (x10-3) Cr (x10-4) Mn (x10-4) Fe (x10-3)
1 5,19 6,66 2,22 9,19
2 6,82 -- 9,9 1,07
8 0,15 -- 6,78 3,65
9 1 -- 7,5 0,92
*vide Quadro 1.1, Capítulo 1.
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
103
Figura 3.2. Espectros de raios-X adquiridos na análise por SRXRF: Em todos os espectros são apresentados o branco analítico (proteína ovalbumina + gel) (—): (a) amostra (proteínas de 23,5 kDa extraída por procedimento 1 + gel) (—); (b) amostra (proteínas de 23,5 kDa extraída por procedimento 2 + gel) (—); (c) amostra (proteínas de 23,5 kDa extraída por procedimento 8 + gel) (—) (d) amostra (proteínas de 23,5 kDa extraída por procedimento 9 + gel) (—). As contagens relativas das emissões Kα de íons variaram de 0 a 3000.
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
104
4.2 Avaliação quantitativa dos metais ligados às proteínas nas
bandas separadas por SDS-PAGE e 2D-PAGE utilizando as técnicas
ETAAS e FAAS
Após as identificações das espécies metálicas por SRXRF nas bandas
protéicas de castanha da Índia separadas por SDS-PAGE, bem como no branco
analítico (banda da proteína ovalbumina), as bandas protéicas (em gel) provenientes
dos procedimentos 1, 2, 4, 5, 8 e 9 (verificar os procedimentos no Quadro 1.1,
Capítulo 1) e de ovalbumina (em gel) foram decompostas (como descrito na seção
3.4).
Em concordância com a avaliação qualitativa dos íons metálicos por SRXRF,
Cr, Fe e Mn foram determinados por ETAAS e Ca por FAAS, em triplicata. Na Tabela
3.2 são apresentadas as concentrações de metais. As concentrações dos íons
metálicos tanto para as bandas protéicas da castanha da Índia, quanto para a banda
de ovalbumina, foram obtidas em termos das massas das bandas de gel recortadas.
Portanto, quando se subtraíram os valores de branco (gel + proteína) para cada
determinação, foram obtidas as concentrações de metais nas proteínas em cada
banda de gel.
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
105
Tabela 3.2: Concentrações de metais nas proteínas separadas por SDS-PAGE (média ± desvio padrão, n=3). Cr, Fe e Mn foram determinados por ETAAS e Ca por FAAS.
Procedimento* Ca (mg g-1) Cr (µµµµg g-1) Fe (µµµµg g-1) Mn (µµµµg g-1)
1 12,5±0,5 4,98 ±0,05 35 ±6 2,7 ±0,4
2 9,8 ±0,7 1,6 ±0,7 38 ±2 1,9 ±0,2
4 6,4 ±0,3 4,00 ±0,02 40 ±7 15 ±1
5 11,4 ±0,8 1,5 ±0,4 37 ±7 12 ±2
8 0,74 ±1 < LQ 23 ±9 < LQ
9 < LQ 1,3 ±0,1 38 ±3 1,1 ±0,4
*vide Quadro 1.1, Capítulo 1.
Os limites de detecção e quantificação nas determinações realizadas estão
mostrados na Tabela 3.3.
Tabela 3.3: Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) obtidos experimentalmente nas amostras de bandas protéicas usando as técnicas de ETAAS e FAAS.
Ca Cr Fe Mn
LD 0,05 mg g-1 0,05 µg g-1 1,0 µg g-1 0,06 µg g-1
LQ 0,15 mg g-1 0,16 µg g-1 3,0 µg g-1 0,2 µg g-1
No Capítulo 1 desta Tese se verificou que os procedimentos 8 e 9 eram os que
mais extraíam proteínas da amostra, vide Tabela 1.1. Por essa razão, nesta parte do
trabalho, se escolheu estes procedimentos como base para comparação com outros
procedimentos de extração com relação à concentração de metais ainda presentes
nas proteínas após as extrações.
Dos resultados apresentados na Tabela 3.2 o que se pode observar é que os
procedimentos 8 e 9 não foram favoráveis para a preservação dos metais Ca, Cr e
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
106
Mn. Os procedimentos que utilizaram água como meio extrator (ou seja, os
procedimentos 1 e 4) foram melhores para a preservação do Cr nas proteínas. Já o
Mn, apresentou resultados similares para ambos procedimentos, 4 e 5. É possível
verificar-se que, ao se utilizar o procedimento 8 (sonicação com o meio extrator água),
a concentração de Mn estava abaixo do LQ, enquanto houve um aumento de 5,5
vezes na concentração desse metal ligado às proteínas ao se comparar os
procedimentos 4 e 1. Resultados similares foram observados ao se utilizar o outro
meio extrator (tampão). Enquanto se obteve uma concentração em torno de 1,1 µg g-1
de Mn ligado a proteínas utilizando-se o procedimento 9, conseguiu-se um aumento
de 11 vezes na concentração do metal ao se utilizar o procedimento 5 e um aumento
em torno de 2 vezes ao se utilizar o procedimento 2. Em outras palavras, pode-se
resumir a discussão nos seguintes termos: Nos procedimentos 1 e 2, a ausência da
maceração implica em uma baixa extração de proteínas, inclusive as que possuem
Mn em suas estruturas. Por outro lado, os procedimentos 8 e 9 provocaram a quebra
das ligações Mn-proteínas. Já nos procedimentos 4 e 5, a maceração ajuda a extrair
as proteínas (inclusive as que possuem Mn) e a ausência de sonicação faz com que
não haja perdas do Mn por quebra das ligações Mn-proteínas.
Continuando a comparação entre os procedimentos, as concentrações de Fe
permaneceram aproximadamente constantes (levando em conta os desvios padrões),
independentemente do procedimento de extração utilizado. Isto significa que os íons
ferro são preservados nas proteínas identificadas, o que pode ser um indicativo da
presença de uma metaloproteína com ferro. O Fe é um componente chave das heme-
proteínas (catalase) [19], e como um metal de transição, ele é provavelmente ligado
covalentemente à proteína. Como exemplo, Bagnoli et al. [20] encontraram
isoenzimas catalase de classe I e III e as metaloproteínas Mn- e Fe-superóxido
dismutase nas células zigóticas e somáticas embrionárias da castanha da Índia.
Ao se estudar o Ca, se verifica que este foi completamente perdido da estrutura
da proteína ao se utilizar o procedimento 9 (sonicação em tampão) e obteve-se uma
baixa concentração do metal (em torno de 0,74 mg g-1) ao se utilizar o procedimento 8
(sonicação em água). Ainda é possível observar que, para este metal, tanto o
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
107
procedimento 1 (agitação em água) quanto o procedimento 5 (maceração em tampão)
forneceram resultados similares (dentro do intervalo aceitável do desvio padrão),
indicando que procedimentos mais amenos são melhores para a preservação deste
metal.
É interessante que, apesar dos procedimentos 8 e 9 apresentarem os melhores
resultados para a extração de proteínas totais (vide Tabela 1.1, Capítulo 1), eles
foram os menos eficientes para a preservação dos metais nas estruturas das
proteínas desta amostra. Portanto, embora os procedimentos com sonicação
forneçam melhores resultados para a extração de proteínas totais, eles podem ser
considerados menos favoráveis para a preservação dos metais nas proteínas.
Os melhores resultados foram, então, obtidos com os procedimentos 4 e 5,
onde a maceração contribuiu para extrair proteínas (comparar Tabela 1.1, Capítulo 1
e Tabela 3.2, deste Capítulo), evitando a perda dos metais. O procedimento 5 foi
escolhido para a continuação do trabalho, por apresentar, de forma geral, as maiores
concentrações de metal (Ca, Fe e Mn, este dentro do desvio), ficando apenas o Cr em
menor concentração em relação ao procedimento 4.
Após a obtenção destes resultados, 8 spots, em triplicata, do gel 2D-PAGE
(Figura 2.7, Capítulo 2) do extrato protéico de castanha da Índia, utilizando-se o
procedimento 5, foram decompostos (conforme item 3.4 deste Capítulo) e neles foram
investigados a presença e as concentrações dos metais Cr, Fe, Mn por ETAAS e Ca
por FAAS. Vale explicar aqui que o spot E não foi examinado por dificuldades no
momento de se recortar o gel para a decomposição. Estes resultados estão
apresentados na Tabela 3.4. Para o cálculo das concentrações dos íons metálicos
tanto para os spots da castanha da Índia, quanto para a banda de ovalbumina, foram
consideradas as massas dos spots e das bandas de gel recortados. Portanto, quando
se subtraíram os valores de branco (gel + proteína) para cada determinação, foram
obtidas as concentrações de metais nas proteínas em cada spot de gel.
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
108
Tabela 3.4: Concentrações de metais nos spots de proteínas do gel 2D-PAGE da castanha da Índia (vide Figura 2.7, Capítulo 2). Cr, Fe e Mn foram determinados por ETAAS e Ca por FAAS (média ± desvio padrão, n=3).
Spot* Ca (mg g-1) Cr (µµµµg g-1) Fe (µµµµg g-1) Mn (µµµµg g-1)
A 0,7±0,4 <LQ <LQ <LQ
B <LQ <LQ <LQ <LQ
C 3,2±0,2 <LQ 102±12 1,7±0,9
D 4,3±0,2 53,8±0,8 420±20 16,4±0,2
F 3,9±0,2 8,8±0,2 681±11 6,3±0,2
G 8,1±0,4 <LQ 515±16 7,5±0,2
H 5,2±0,3 <LQ 168±12 5,3±0,5
I 0,16±0,05 <LQ <LQ <LQ
LQ: vide Tabela 3.3.; *vide Figura 2.7, Capítulo 2. É necessário ressaltar aqui que uma comparação entre as concentrações
apresentadas nas Tabelas 3.2 e 3.4 seria errônea. Por exemplo, seria errôneo
comparar as concentrações obtidas para cada metal na banda SDS-PAGE
proveniente do procedimento 5 com a soma das concentrações de todas os spots
(Tabela 3.4). Isto porque os procedimentos envolvidos para a separação SDS-PAGE
e 2D-PAGE são diferentes. A 2D-PAGE compreende muito mais passos, que
implicam em possíveis perdas de proteínas durante os procedimentos (conforme já
comentado no item 3.4, Capítulo 2), além de requerer uma quantidade muito maior de
proteínas para se obter um bom resultado (foi utilizado cerca de 56 vezes mais
proteínas do que na SDS-PAGE). Além disso, por meio da 2D-PAGE, pode-se
observar como os metais se distribuem ao longo dos diferentes spots, indicando uma
condição muito diferente daquela vista na Tabela 3.2.
Dos resultados do item 4.2, Capítulo 2, onde se estimaram as massas de
proteínas presentes nos spots e da Tabela 3.4, foram estimadas as quantidades de
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
109
cada metal presente nas proteínas (ver Tabela 3.5). Por exemplo, a massa estimada
de proteínas do spot A é de 129,4 ± 0,5 µg (Tabela 2.5, Capítulo 2) que multiplicada
pela concentração de Ca (0,7 ± 0,4 mg g-1) dá a quantidade de Ca presente nesta
massa de proteínas (90,6 ± 0,6 ng).
Tabela 3.5: Estimativa das quantidades de metal nas proteínas identificadas.
Spot* Ca (ng) Cr (ng) Fe (ng) Mn (ng)
A 90,6±0,6 <LQ <LQ <LQ
B <LQ <LQ <LQ <LQ
C 638,1±0,3 <LQ 20,34±0,01 0,34±0,01
D 1258,2±0,7 15,74±0,01 122,89±0,02 4,80±0,01
F 360,4±0,3 0,813±0,03 62,92±0,01 0,58±0,02
G 518,4±0,4 <LQ 32,96±0,02 0,48±0,02
H 365,6±0,4 <LQ 11,81±0,01 0,37±0,01
I 6,6±0,1 <LQ <LQ <LQ
LQ, ver Tabela 3.3. *vide Figura 2.7, Capítulo 2.
É interessante notar que a presença dos metais não foi constante para todos
os spots, ou seja, não houve indicação de presença de metais no spot B e nos A e I,
detectou-se apenas o Ca. Por outro lado, determinou-se Cr apenas nos spots D e F,
sendo estes também responsáveis por 74% do Fe e 81,9% do Mn totais
determinados. O Ca foi distribuído principalmente nos spots C, D, F, G e H,
representando 97% do total determinado.
Apesar dos resultados da Tabela 3.5 fornecer as quantidades de cada metal
nas massas de proteínas estimadas nos spots, eles por si só, não trazem muita
informação, uma vez que não se sabe ao certo de quais proteínas se tratam. Então,
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
110
se observarmos esses resultados sob o ponto de vista molecular, ou seja,
convertendo as massas de proteínas (conhecendo-se suas massas molares e que 1
kDa = 1,661 x 10-24 g) para número de mols de moléculas de proteínas, e convertendo
as massas de metais (Tabela 3.5) para número de mols de átomos, teremos uma
idéia de quantos átomos de metal estariam presentes em cada molécula. Esta
estimativa foi originalmente proposta por Garcia [21] e, no Apêndice 5, é apresentado
um exemplo destes cálculos:
Dessa forma, seguindo o raciocínio desenvolvido acima (exemplificado no
Apêndice 5), são apresentados na Tabela 3.6 os números de moléculas e os números
de átomos de cada metal.
Tabela 3.6: Estimativa dos números de moléculas de proteínas e números de átomos de cada metal em cada spot.
Spot nº de moléculas nº de átomos proteínas(1015) Ca (1015) Cr (1013) Fe (1014) Mn (1013)
A 3,30 1,36 (41,2%)*
___ ___ ___
B 4,39 ___ ___ ___ ___
C 5,13 9,59 (187%)*
___ 2,20 (4,29%)*
0,37 (0,07%)*
D 7,49 18,9 (252,3%)*
18,23 (2,4%)*
13,25 (17,7%)*
5,26 (0,7%)*
F 2,35 5,41 (230,2%)*
0,94 (0,4%)*
6,79 (28,9%)*
0,64 (0,27%)*
G 1,64 7,79 (475%)*
___ 3,55 (21,6%)*
0,53 (0,32%)*
H 1,79 5,49 (306,7%)*
___ 1,27 (7,1%)*
0,41 (0,23%)*
I 1,06 0,09 (8,5%)*
___ ___ ___
Massas Atômicas: Ca = 40,078 g; Cr = 51,996 g; Fe = 55,845 g e Mn = 54,938 g. * Os valores entre parênteses são as porcentagens de moléculas de proteínas com átomos da espécie metálica em sua estrutura.
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
111
Destes resultados pode-se ter uma idéia da proporção metal/molécula. Por
exemplo, para a proteína do spot A estimou-se que 41,2% das moléculas contenham
um átomo de Ca. Já para a proteína do spot C estima-se que cada molécula de
proteína tenha 1,87 átomos de Ca. Estes valores são estimados, e, certamente não
haverá 1,87 átomos de Ca, mas sim de 1 a 2 átomos de Ca em cada molécula de
proteína. Seguindo o mesmo raciocínio, as proteínas dos spots D, F e H podem
possuir de 2 a 3 átomos de Ca em cada molécula de proteína e as proteínas do spot
G podem possuir de 4 a 5 átomos de Ca em cada molécula.
Para as outras espécies metálicas as proporções são mais baixas, porém não
menos significativas. Por exemplo, para a proteína do spot D: 2,4%, 17,7% e 0,7%
das moléculas de proteínas (um total de 1,55 x 1015 moléculas) podem conter pelo
menos um átomo de Cr, Fe e Mn nas suas estruturas, respectivamente. Estas
estimativas são aceitáveis, uma vez que uma única metaloproteína ou proteína de
metal ligante pode apresentar vários centros ativos formados por átomos de íons
metálicos diferentes, ou ainda, mais de um átomo de um mesmo elemento químico
[22]. Por exemplo, para a Fe-superóxido dismutase purificada de tomate
(Lycopersicon esculentum) ou mostarda (Brassica campestris) a proporção de mol de
Fe/mol de enzima é de 1 – 2 [23], ou seja, próximo da proporção encontrada.
5. CONCLUSÃO PARCIAL
Neste Capítulo foi realizado um estudo sobre a influência dos procedimentos
de extração de proteínas na especiação de metaloproteínas na amostra castanha da
Índia. Embora o procedimento 9 (onde foram usados o tampão Tris-HCl, maceração e
sonicação) apresente uma alta eficiência em termos de extração de proteínas totais,
ele foi o menos eficiente em termos de preservação da ligação metal-proteína, não
sendo, portanto, recomendado para o estudo de metaloproteínas. Assim, os
procedimentos mais amenos (como 4 ou 5) produziram resultados mais apropriados,
no sentido de preservação da estrutura metal-proteína, assegurando resultados mais
confiáveis em termos de análise quantitativa de metaloproteínas.
Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
112
Foram identificados íons Ca, Fe, Cr e Mn nas bandas protéicas SDS-PAGE,
por meio da técnica SRXRF. A quantificação desses metais por AAS, tanto nas
bandas SDS-PAGE, quanto nas da separação 2D-PAGE, mostrou a concordância
entre a identificação e a quantificação destas espécies. As quantificações de metais
nos spots 2D-PAGE forneceram uma interessante distribuição não homogênea
dessas espécies, ressaltando-se que foi identificado e quantificado Cr apenas em dois
spots (D e F), os quais também são responsáveis por 74% do Fe e 81,9% do Mn
encontrados. Foi possível fazer uma estimativa da quantidade de átomos de metal por
moléculas de proteína e verificou-se que todas as proteínas dos spots estudados,
com exceção da proteína do spot B, têm proporções átomo de metal/molécula de
proteína significativas, indicando que se trata de metaloproteínas ou proteínas de
metal ligante.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Tese de Doutorado Capítulo 3 Cristiana S. de Magalhães
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Tese de Doutorado Conclusões Finais e Perspectivas Cristiana S. de Magalhães
115
CONCLUSÕES FINAIS E PERSPECTIVAS
Este trabalho de Tese apresenta a importância das diferenças no preparo de
amostras de proteínas e análise de metaloproteínas, tanto dos procedimentos de
extração como dos meios extratores, que são importantes para preservar as espécies
nas estruturas das proteínas. No caso das plantas medicinais e fitoterápicos, os
diferentes procedimentos de preparo foram decisivos na extração de proteínas.
A partir deste trabalho fica evidente a necessidade de várias técnicas
multidisciplinares para a caracterização de um sistema complexo, como são,
geralmente, os sistemas biológicos. A castanha da Índia se apresentou como um
ótimo material de estudo, por sua manipulação fácil e seu mapa protéico bastante
simples. Como perspectivas, poder-se-iam sugerir outros procedimentos de extração,
tanto físicos, como a moagem criogênica ou a decomposição por radiação
microondas ou a combinação destes com outros procedimentos, quanto químicos,
como vários outros protocolos de extração ou meios extratores. Também se poderia
continuar a investigação do proteoma da castanha da Índia, com o aumento da
resolução da separação eletroforética (por exemplo, escolhendo-se intervalos de
valores de pI menores) o que nos daria uma informação mais precisa das bandas
protéicas. Uma perspectiva muito interessante seria a identificação das proteínas,
fazendo-se a busca por homologia nos bancos de dados, ou até utilizando-se outras
digestões enzimáticas e fazendo-se o matching para o sequenciamento das proteínas
estudadas. Outra possibilidade seria de se estimular a germinação da castanha da
Índia e estudar as modificações dos panoramas protéicos conforme o
desenvolvimento da germinação, o que se tornaria um desafiador problema de
bioanalítica.
Tese de Doutorado Apêndice 1 Cristiana S. de Magalhães
117
Apêndice 1
Tese de Doutorado Apêndice 2 Cristiana S. de Magalhães
119
Apêndice 2:
Tese de Doutorado Apêndice 3 Cristiana S. de Magalhães
121
Apêndice 3:
Tese de Doutorado Apêndice 4 Cristiana S. de Magalhães
123
Apêndice 4:
Espectros de massas (MS) gerados para os spots protéicos A a Q: Spot A – 1
Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am01 1 (0.402) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:3) 1: TOF MS LD+ 1582000.0480
1999.0099
869.47171349.7225
870.4717
1229.64831033.5853
1708.87151613.9279
1483.7258 1952.0316
1711.8284
2001.0205
2015.0414
2017.01073258.4543
2057.0803 2351.26033257.5500
2379.29153260.4104
Spot A - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am02 3 (0.573) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:3) 1: TOF MS LD+ 1892000.0316
1999.0262
869.47171349.7091
1060.0670870.4609
976.46061229.6483
1061.0754
1709.86191613.9279
1482.70371951.0220
1711.8589
2001.0371
2016.0012
2017.0271
3258.55932057.0471 2248.1628
3257.50762352.2788 3260.4734
Spot B - 1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am03 2 (0.503) Sm (SG, 2x4.00) 1: TOF MS LD+ 1862000.0150
1999.0262
857.53781349.7225
1229.64831033.59701115.5988
1613.9279
1351.7271
1667.98461951.0383
1711.9045
2001.0205
2002.0264
2017.01073258.5383
2351.24222018.03702248.1975
3257.4446
2352.27883097.5190
3260.5154
Spot B - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am04 2 (0.489) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 2932000.0316
1999.0262
857.53781349.7225
869.4717
1229.64831033.5853
1350.72471613.9427
1351.72711666.9763
1951.0220
1711.8740
2001.0371
2016.0178
2017.02713258.5383
2334.15412248.17992018.0204 3257.5500
2352.29693241.50443098.5242
3261.5042
Tese de Doutorado Apêndice 4 Cristiana S. de Magalhães
124
Spot C - 1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am05 2 (0.502) Sm (SG, 2x4.00) 1: TOF MS LD+ 3582000.0316
1999.0262
857.5378
1349.7225869.4717
1229.6483870.47171033.5853
1708.87151350.7111
1666.9763
1482.71791710.8679
1952.01531711.85891712.8502
2001.0371
2016.0342
3258.51732334.15412017.0271
2248.17992018.02043257.55002350.1882
2352.1895 3138.5020
3260.4944
3261.4832
Spot C - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am06 2 (0.489) Sm (SG, 2x4.00) 1: TOF MS LD+ 3402000.0316
1999.0262
857.5378
1349.7225869.4717
1229.6354870.4717976.4606
1034.5927
1708.87151350.7247
1667.96951710.8679
1711.8740
2001.0371
2016.0342
2334.17212017.0603
2248.19752018.0370
3259.52663257.50762350.1882
3139.53372353.1907
3260.5154
3261.4832
Spot D - 1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am07 2 (0.503) Sm (SG, 2x4.00) 1: TOF MS LD+ 3812000.0316
1999.0262
1349.7225
857.5378
1229.64831033.5970
1350.7247
1505.8395
1352.7163
1666.9763
1952.0153
1711.8435
2001.0371
2002.04273258.5173
3257.50762017.04372334.2078
2057.04712138.0952 2350.2595 3098.5447
3260.53643261.5042
3262.5354
Spot D - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am08 2 (0.489) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 6452000.0316
1999.0262
1349.7225
857.5378
869.47171229.6483
1033.59701034.5927
1350.7247
1505.8395
1352.7300
1666.9763
1951.0383
1711.8740
2001.0371
2002.0264
3258.51732017.0271
2334.18972057.04712059.0701
3257.4866
2350.20583098.5037
3260.5154
3261.5676
Tese de Doutorado Apêndice 4 Cristiana S. de Magalhães
125
Spot E - 1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am09 2 (0.503) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 5812000.0316
1999.0262
1349.7225
857.5378
1229.63541033.5970
1350.7247
1505.82511351.7271 1708.8715
1507.8423
1709.8619
1952.0316
1711.8894
2001.0371
2002.04273258.5173
2334.18972017.0271
2248.17992018.0038
3257.5076
2336.1843
3139.51322379.3276
3260.4944
3261.52563262.4934
Spot E - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am10 1 (0.431) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 6411349.7225
857.5378
869.4717
870.4717 1033.5970 1320.6758
1047.4939
1350.72472000.0480
1999.0428
1505.8395
1708.8715
1507.82801951.0383
1711.8589
2001.0371
2016.0342
2334.17212017.02712248.19752018.0204 3259.50562336.1843
3138.5225 3261.5676
Spot F - 1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am11 1 (0.526) Sm (SG, 2x4.00) 1: TOF MS LD+ 1692000.0480
1349.7362
869.4717
1033.59701320.68921034.5927
1999.0428
1350.7382
1649.89671505.8395
1708.8868
1709.8925
1710.8831
1711.8894
2001.0205
2016.0674
2017.07693258.5383
2379.30962038.1191
2273.1497 2702.34082381.3052 3256.4773 3260.5364
Spot F - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am12 3 (0.576) Sm (SG, 2x4.00) 1: TOF MS LD+ 1262000.0480
1349.7225
869.4717
870.4717976.4606 1320.6892
1350.7247
1649.88161505.8395
1352.7163
1708.8868
1709.9076
1710.8525
1793.9564
2001.0371
2016.0178
2017.0603
3258.53832360.20392038.1025
2248.1975 2380.37042702.2261
3256.51983124.5020
3260.53643433.6340
Tese de Doutorado Apêndice 4 Cristiana S. de Magalhães
126
Spot G - 1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am13 1 (0.424) Sm (SG, 2x4.00) 1: TOF MS LD+ 3292000.0316
1999.0428
1349.7362
1229.64831033.5970857.5378 1115.5988
1350.7382
1505.8395
1488.8264
1650.8700 1708.88681710.8984
2001.0535
2002.05933258.5173
2017.0769 3257.5291
2334.18972018.0536
2039.08423098.5447
2379.3276
3260.5364
3261.52563434.5620
3274.5415
Spot G - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am14 2 (0.492) Sm (SG, 2x4.00) 1: TOF MS LD+ 2422000.0480
1999.0428
1349.7225
1229.66131033.6090
976.4606
1350.72471505.8395
1351.7271 1708.9020 1952.0477
1710.8984
2001.0371
2002.02643258.53832017.0271
3257.5076
2334.22532018.0370
2056.07763097.5190
2702.28372381.3594 2804.3127
3260.5574
3262.5144 3433.6340
Spot H - 1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am15 1 (0.424) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 2602000.0480
1999.0428
1349.7362
869.4717
1033.59701034.5807
1350.7247
1505.83951351.7271
1352.7300
1649.89671708.9020
1709.89251710.8984
2001.0535
2016.0342
2017.0437
3258.53832057.09692274.2041
2248.1628
2360.18583256.5618
2702.36042379.32763124.5640
3260.57893434.6914
Spot H - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am16 2 (0.492) Sm (SG, 2x4.00) 1: TOF MS LD+ 3802000.0480
1999.0428
1349.7362
869.4717
1033.5970
1034.5927
1350.7382
1505.8395
1352.7300
1649.88161708.8868
1952.03161710.9136
2001.0371
2016.0342
2017.06033258.5173
2056.0442 2360.18582058.1001 2702.3408
2380.31623256.5618
3137.49022704.3335
3260.53643434.6050
Tese de Doutorado Apêndice 4 Cristiana S. de Magalhães
127
Spot I - 1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am17 2 (0.508) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 3212000.0646
1999.0592
1349.7496
869.48261033.5970 1321.6938
1350.7382
1505.8395
1351.7271
1352.7163
1649.8816
1708.90201709.8925
1710.8984
2001.0535
2016.0508
2379.30962017.07692378.3391
2018.03702248.2151
2039.0842
3258.5383
3256.56182381.34132702.36042382.3303 3097.5396
3260.4944
3261.5886 3434.6270
Spot I - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am18 2 (0.492) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 3672000.0480
1999.0592
1349.7362845.5150 1033.5970
1708.90201533.8416
1351.74071952.0477
1710.8831
2379.32762001.0535
2378.3391
2016.0508
2017.0437
2334.20782018.0536
2056.0942
2380.3342
3258.55932381.3413
3256.56182382.3484
2702.34082383.3018 3098.56522807.4553
3259.5691
3260.5574
3261.5886 3433.6770
3273.5508
Spot J - 1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am19 2 (0.508) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:3) 1: TOF MS LD+ 2051349.7362
869.4935
870.4826 1033.6090 1320.6492
2000.06461999.0428
1350.7382
1649.8667
1505.8395
1493.7792
1650.8998
1708.9020
1951.0547
1717.8872
2001.0701
2016.0674
2379.34522017.0437 2378.3567
2018.08652248.2151
2380.3342
3258.49632381.3413 3256.5828
2702.30272808.3733 3260.5364 3433.6340
Spot J - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am20 2 (0.489) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:3) 1: TOF MS LD+ 1242000.0480
1999.0592
1349.7362855.0790
1060.0790871.0589
1320.6357
1506.8407 1649.8967 1708.9325
1709.90761710.8525
2001.05352379.3276
2016.0674
2378.3391
2017.0603
2018.07022247.1670
2380.3523
2381.32323258.6013
2382.2942 3256.51982808.37332702.3604
2385.0830 3138.4604
3259.5056
3260.5364 3434.6484
3432.5330
Tese de Doutorado Apêndice 4 Cristiana S. de Magalhães
128
Spot K - 1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am21 2 (0.508) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 2632000.04801349.7362
869.4826
1033.5970 1331.72121115.5988
1999.0428
1350.7382
1505.8395
1352.7300
1649.8967
1708.9020
1709.9227
1710.8831
2001.0535
2379.3276
2378.32102016.0508
2017.0437
2274.22172018.0536
2380.3523
3257.57102381.3232 3256.56182382.3123
2702.34082383.3916 3137.57322808.3928
3259.5691
3260.55743433.5691
3262.5354
Spot K - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am22 3 (0.573) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:3) 1: TOF MS LD+ 2932000.0480
1999.0592
1349.7496
845.50431060.0912
1115.6234
1505.8395
1351.7542
1587.90191708.9171
1951.03831806.9827
2379.3452
2378.32102001.0535
2016.0674
2017.0769
2274.18652018.0536
2038.0693
2380.3523
2381.32323257.5710
3256.56182382.3303
2702.32182383.3555 3241.56742808.3733 3097.5396
3259.5691
3260.5574 3434.6484
3261.5676
Spot L - 1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am23 1 (0.521) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:3) 1: TOF MS LD+ 2422000.0646
1999.0428
1349.7362
845.5150976.4489 1320.7161
1350.7382 1708.9171
1351.7542
1506.84071709.8925
1710.9136
2001.0535
2379.3276
2016.05082378.3391
2017.0603
2360.20392018.0370
2380.3342
3258.6013
2381.32323256.5408
2382.31232702.3604
2391.20632809.3887
3098.5447
3259.5476
3260.5789 3434.6484
3261.5042
Spot L - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am24 3 (0.573) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:3) 1: TOF MS LD+ 2822000.0480
1999.0592
1707.91191349.7362
845.5150976.4720
846.5226 1115.6110
1505.8395
1351.75421533.8560 1709.9076
1710.8831
2001.0535
2379.34522016.0508
2378.3391
2017.0437
2018.07022248.2151
2137.1238
2380.3342
3258.5593
2381.34133256.5198
2382.33032702.2837
2383.28372808.3928
3125.5317
3259.5691
3434.6699
3261.6096 3436.6995
Tese de Doutorado Apêndice 4 Cristiana S. de Magalhães
129
Spot M - 1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am25 1 (0.419) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:3) 1: TOF MS LD+ 68.72000.0316
855.0790
1349.7362
1060.0912856.0815
893.0361 1083.0723
1350.75161505.8680
1351.7136
1951.02201649.8816
1708.8868
1805.9802
2379.32762378.3391
2001.0042
2015.0414
2017.0934
2018.08652247.2368
2221.1599
2381.3413
3257.5920
3256.54082382.3845
2809.34962701.30642383.3735 3098.4626
3259.63213434.6270
3260.51543432.7053
Spot M - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am26 3 (0.573) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:3) 1: TOF MS LD+ 1102000.0480
1999.0262
855.0790
1505.86801349.7225856.0815
1060.1031991.5466 1115.6234
1351.7407
1587.88711952.0316
1709.9076
1710.8831
2379.3452
2001.07012378.3210
2016.0508
2017.0603
2018.08652247.2192
2230.2007
2380.3342
2381.34133258.5383
3256.54082382.2942
2809.40822702.37942383.3735 3137.5112
3259.5476
3433.63403432.5974
Spot N - 1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am27 2 (0.502) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 2771349.7362
869.4826
877.0623 1033.62071332.7166
2000.06461999.0592
1350.7382
1505.8539
1351.7542
1352.7163
1649.89671650.8998
1951.0547
1709.9227
1806.9985
2001.0701
2016.0508
2379.32762017.07692378.3391
2018.07022247.2017
2019.0304
3258.53832380.3523
3256.58282381.3232
3137.55222702.2837 2809.4473
3259.5476
3260.5999 3433.5691
Spot N - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am28 2 (0.489) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 2822000.0646
1349.7496
869.4826
1033.5970 1331.7346
1999.0592
1350.7516
1505.8680
1351.7542
1352.7300
1649.8967
1708.9171
1709.9076
1808.0013
2001.0535
2016.0674
2379.34522017.0603
2378.37482018.0370
2247.18412019.0637
3258.62232380.35233256.54082381.3413
2382.3123 3138.58452703.2991 2808.3733
3259.6111
3260.5789 3434.6699
Tese de Doutorado Apêndice 4 Cristiana S. de Magalhães
130
Spot O - 1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am29 1 (0.419) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 2561349.7362
869.4826
1033.6090 1331.72121034.6163
2000.06461999.05921350.7516
1649.89671505.8539
1351.7542
1352.7434
1951.07081651.9032
1708.91711709.9227
2001.0535
2016.06742379.3452
2017.0603 2378.3210
2248.17992018.0536
3258.62232380.3342
3256.56182381.3594
2702.32182382.3123 3138.58452808.3733
3259.5476
3260.5574 3434.69143432.7053
Spot O - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am30 2 (0.489) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 2512000.0646
1349.7496
869.4826
976.47201033.6090 1331.7212
1999.0592
1350.7516
1650.91491505.8539
1351.7542
1352.7300
1952.04771651.9181
1709.9076
2001.0701
2379.36332016.0508
2378.35672017.0769
2274.22172018.0865
2137.1238
2380.37043257.5710
3256.56182381.3232
2702.28372382.3665 3240.58152809.4277 3096.5962
3259.5901
3260.6208 3434.6699
3432.5974
Spot P - 1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am31 2 (0.503) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 2382000.06461349.7496
869.4935
1033.6090 1320.6758
1116.5961
1999.0592
1350.7516
1587.90191505.8680
1351.7542
1352.7300
1649.8967
1951.0547
1708.88681709.8925
2001.0701
2016.0674
2379.36332017.0769
2378.3210
2018.05362248.1799
2019.0801
3257.57102380.3523
3256.58282381.3594
2382.3665 2702.3408 2808.37333137.5317
3259.6531
3433.6770
Spot P - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am32 2 (0.489) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:3) 1: TOF MS LD+ 2531349.7362
869.4826
1033.6090 1331.72121034.6044
2000.0646
1999.05921350.7516
1587.88711505.8539
1351.7542
1352.7571
1649.9116
1952.0477
1709.9076
1808.0013
2001.0701
2016.0840
2379.34522017.07692378.35672018.0536
2248.19752019.0637
3257.57102380.35233256.60382381.3594
2808.41242702.30272382.3484 3139.6162
3259.52663434.6050
3433.5691
Tese de Doutorado Apêndice 4 Cristiana S. de Magalhães
131
Spot Q - 1 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am33 2 (0.503) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 2842000.0646
1349.7496
869.4826 1033.62071331.7346
1115.5988
1350.7516
1505.8680
1351.7678
1488.8264
1649.8816 1952.0641
1708.8715
1806.9985
2001.0701
2379.34522016.0674
2378.3391
2017.0769
2018.02042248.1799
2019.0967
2380.35233258.6013
2381.3413 3256.5618
2382.40213138.60502702.3027
3259.5476
3260.5154 3433.59063272.6021
Spot Q - 2 Zezzi4_160108
m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400
%
0
100
Zezzi4_160108_Am34 2 (0.489) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:3) 1: TOF MS LD+ 5802000.0646
1999.0592
1349.7496
869.48261033.6090 1331.7212
1115.6110
1350.7516
1505.8539
1351.7542 1649.89671952.0477
1709.9076
2001.0701
2016.0674
2379.3633
2378.35672017.0603
2018.07022274.2217
2239.1899
3257.57102380.3523
3256.54082381.3594
2382.3665 3124.58452702.3794
3259.56913260.6418 3433.6770
3261.6096
Tese de Doutorado Apêndice 5 Cristiana S. de Magalhães
133
Apêndice 5:
Exemplo do cálculo para a estimativa do número de mols de íons Fe por número de
mols de moléculas de proteínas para o spot D.
Para o spot D e o Fe:
1) Determinação da massa da molécula de proteína:
1 Da = 1,661 x 10 -24 g
23500 Da = X g
X = 3,90 x 10-20 g
2) Determinação do número de moléculas de proteína no spot
1 molécula = 3,90 x 10-20 g
X moléculas = 292,6x10-6 g
X = 7,50x1015 moléculas
3) Determinação do número de átomos da espécie metálica (Fe)
55,845 g = 6,022x1023 átomos
122892x10-12 g = X átomos
X = 1,33x1015 átomos
4) Porcentagem de moléculas de proteínas com átomos da espécie metálica em
sua estrutura
7,50x1015 moléculas = 100%
1,33x1015 átomos = X %
X = 17,73%