Avaliação Da Atividade Da Lipoxigenase Na

7/21/2019 Avaliao Da Atividade Da Lipoxigenase Na

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* Tecnloga de Alimentos, Universidade do Estado do Par (UEPA), Camet, PA, Brasil (e-mail: [email protected]).

** Discente, Programa de Ps-Graduao em Cincia e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal doPar, Belm, PA, Brasil (e-mail: [email protected]).

*** Docente, Departamento de Tecnologia de Alimentos, Centro de Cincias Naturais e Tecnologia, UEPA,

Belm, PA, Brasil (e-mail: [email protected]).

B.CEPPA, Curitiba, v. 29, n. 1, p. 1-8, jan./jun. 2011

AVALIAO DA ATIVIDADE DA LIPOXIGENASE NACASTANHA DO BRASIL (Bertholletia excelsa)

FABIELLE NEGRO FERREIRA*ELEDA MARIA PAIXO XAVIER**

ANDRA DA SILVA PINTO**DARLY RODRIGUES POMPEU***

Para determinar as condies timas de atividade da lipoxigenase(LOX) presente na castanha-do-brasil (Bertholletia excelsa)verificou-se sua atividade em funo do pH em solues tampo(pH 4,00; 5,00; 6,00; 6,50; 7,00; 8,00 e 9,00), variando-se o tipode substrato (cido linoleico e linolnico) e suas concentraes(1,00; 2,50; 5,00; 10,00; 15,00; 20,00 e 40,00 mM), bem como aconcentrao de extrato enzimtico (0,50; 1,00; 1,50; 2,00; 2,50 e3,00%). Monitorou-se a atividade da LOX pelo acompanhamentodo aumento da absorbncia a 234 nm durante 240 segundos,

expressos em milimolar por segundo por grama (mM/s.g). Ambos oscidos graxos estudados mostraram picos de atividade de LOX empH 6,5 e concentrao de substrato a 1,5 mM. Aplicando-se os dadosexperimentais equao de Michaelis-Menten e da linearizao deLineawer-Burk, os valores obtidos para a constante de Michaelis-Menten (K

M) e de velocidade enzimtica mxima (V

MAX) variaram

entre: 0,164 a 0,169 mM e 0,083 a 0,093 mM/s.g, respectivamente.O cido linoleico revelou-se o melhor substrato para a enzima efoi utilizado para determinao da atividade da LOX em funo daconcentrao de enzima, que apresentou maior atividade a 3,00%.

PALAVRAS-CHAVE: Bertholletia excelsa; LIPOXIGENASE; ATIVIDADE ENZIMTICA.


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1 INTRODUO

A castanheira (Bertholletia excelsa), pertencente famlia Lecythidaceae, uma das maisimportantes espcies de explorao vegetal da Amaznia e se distribui especialmente na Amazniabrasileira, peruana e boliviana (MULLER e KATO, 1995). A castanha-do-brasil encontra grandeaplicao na indstria de cosmticos e de forma mais acentuada na de alimentos, devido sua

composio qumica e nutricional (MENEZES e SOUZA, 2004).A castanha-do-brasil rica em cido palmtico, esterico, linoleico e linolnico, sendo que a frao

lipdica dos cidos graxos saturados no ultrapassa 25% de seu total. Constitui excelente fonte deselnio, nico mineral antioxidante. Apesar disto, a castanha-do-brasil oxida muito facilmente emfuno da alta concentrao de substratos oxidveis, como os cidos graxos insaturados (FREITASet al., 2007).

O processo de oxidao lipdica pode ocorrer de vrias formas na castanha-do-brasil,sendo mais importante a oxidao enzimtica. A lipoxigenase (isoenzima) catalisa a dioxigenao decidos graxos poliinsaturados, em especial os cidos linoleico e linolnico (SILVA, 2004), que contmo sistema cis,cis-1,4-pentadieno. Como resultado h a formao de perxidos e hidroperxidoscom duplas ligaes conjugadas, que podem se envolver em diferentes reaes degradativas(especialmente a oxidao lipdica) para a formao de seus respectivos derivados hidroperxidos

(OLIVEIRA et al., 2002).As lipoxigenases (LOX) esto amplamente distribudas em plantas e animais superiores

e contm ferro no heme, que necessrio para sua atividade cataltica. Os hidroperxidosproduzidos pelas LOX so responsveis pela reduo do valor nutritivo dos alimentos, influenciandoa degradao de carotenoides, retinol, tocoferois, cido ascrbico, alm de protenas e aminocidos.A interao desses produtos da degradao com peptdeos e aminocidos provoca escurecimentodos produtos e comprometimento do seu valor nutricional (SILVA et al., 2001).

Axelrod, Cheesbrough e Laasko (1981) demonstraram a presena de trs isoenzimas daLOX na soja, chamadas de LOX-1, LOX-2 e LOX-3. Essas isoenzimas apresentam condies deatividade diferentes, como pH timo 9,50, 6,50, e 5,00 9,00 e ponto isoeltrico 5,68, 6,25, 6,15,respectivamente. Tambm h diferena em relao ao substrato, pois a LOX-1 tem alta afinidadepor cidos graxos ionizados, enquanto a LOX-2 e a LOX-3 apresentam afinidade pelo cido graxo

no ionizado (LANNA, 1995).A existncia de determinada enzima num alimento, ou sua diferenciao de outras

enzimas nele presentes, somente pode ser demonstrada por mtodos indiretos atravs da medidade sua atividade cataltica. Por essa razo, torna-se necessrio efetuar anlises dos parmetrosque influenciam a velocidade de cada reao enzimtica (BELITZ e GROSCH, 1997). A anlisequantitativa do efeito de cada um dos fatores que influenciam a atividade enzimtica avaliada peloaumento ou reduo da velocidade da reao catalisada, utilizando-se mecanismos matemticoscomo a equao de Michaelis-Menten. Essa equao possibilita relacionar quantitativamente avelocidade inicial (V

0), a velocidade inicial mxima (V

MAX) e a concentrao inicial de substratos

(NELSON e COX, 1995).Apesar de se conhecer bem o mecanismo de atuao da LOX, suas condies timas de

atividade sobre a castanha-do-brasil so quase desconhecidas. Este trabalho teve como objetivo

determinar as condies timas de atividade da LOX da castanha-do-brasil (B. excelsa). Para isso,estudou-se o efeito do pH, o tipo e a concentrao do substrato (cido linoleico e cido linolnico),a concentrao de enzima, bem como foram determinados os valores de K

Me V

MAX.

2 MATERIAL E MTODOS

2.1 MATERIAL

As amndoas da castanha-do-brasil foram adquiridas na feira do Ver-o-Peso em Belm (PA)e transportadas para a Usina de Alimentos do Laboratrio de Engenharia Qumica e de Alimentosda Universidade Federal do Par. As amndoas foram devidamente higienizadas com gua cloradae descascadas manualmente com a utilizao de facas estreis e luvas. A obteno do extratoenzimtico foi feita de acordo com Silva, Borges e Ferreira (1999) com algumas modificaes.


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Pesaram-se 50 g de castanha-do-brasil, as quais foram trituradas, maceradas, homogeneizadascom 100 mL de gua ultra pura e filtradas a vcuo. A soluo obtida foi centrifugada a 3.700 gdurante 20 minutos a 4C. Em seguida, separou-se o sobrenadante que foi utilizado como fonte deenzima. O extrato enzimtico foi saturado com N

2e refrigerado at a realizao das anlises, sendo

sempre preparado no mesmo dia.

2.2 MTODOS

2.2.1 Determinao da atividade da lipoxigenase em funo do pH

Para determinao das condies timas de pH foram testados os tampes pH: 4,00(cido ctrico / citrato de sdio), 5,00 (cido ctrico / fosfato de sdio dibsico anidro), 6,00(fosfato de potssio dibsico / fosfato de potssio monobsico), 6,50 (potssio dibsico / fosfatode potssio monobsico), 7,00 (fosfato de potssio dibsico / fosfato de potssio monobsico),8,00 (dihidrogeno fosfato / HCl) e 9,00 (cido brico / borato de sdio na concentrao 0,05 M).Em todos os casos, as solues de cido linoleico e linolnico (10 Mm) foram utilizadas comosubstrato (AXELROD, CHEESBROUGH e LAASKO, 1981; OLIVEIRA et al., 2002). Em cubetas dequartzo foram adicionados 1.750 L de soluo tampo, 200 L de soluo de substrato (10 mM)e 50 L de extrato enzimtico (1:3; m:v). A mistura foi homogeneizada levemente e colocada em

espectrofotmetro Ultravioleta/Visvel PHAMACIA BIOTECH, modelo Ultrospec 2000 (Cambridge,Inglaterra) para o acompanhamento da cintica enzimtica durante 6 min a 234 nm. Com basenas absorbncias obtidas determinou-se a atividade enzimtica de acordo com Silva Borges eFerreira (1999). Os resultados foram expressos em milimolar por grama de extrato por segundo(mM/gs). Os ensaios foram realizados em triplicata.

2.2.2 Determinao da ativ idade de lipoxigenase em funoda concentrao de substrato

Os cidos linoleico e linolnico foram usados como substrato a fim de se avaliar a atividadede lipoxigenase da castanha-do-brasil em funo da concentrao desses cidos poliinsaturadosem tampo fosfato de sdio pH 6,50. As concentraes das solues de substrato, adaptadas de

Buco et al. (2006), foram: 1,00 ; 2,50 ; 5,00 ; 10,00 ; 15,00 ; 20,00 e 40,00 mM. Foram adicionados1.750 L de soluo tampo, 200 L de soluo de substrato e 50 L de extrato enzimtico (1:3;m:v). A mistura foi homogeneizada levemente por 2 segundos e colocada em espectrofotmetroUV/Visvel (PHAMACIA BIOTECH, modelo Ultrospec 2000) para o acompanhamento da cinticaenzimtica durante 6 min a 234 nm.

2.2.3 Determinao da atividade de lipoxigenase em funo da concentrao de enzima

Utilizou-se o cido linoleico como substrato em tampo fosfato de sdio pH 6,50, com asseguintes concentraes de enzima (soluo de castanha-do-brasil na relao massa:volume; m:v):6,70%, 13,30%, 20%, 26,70%, 33% e 40%. Essas proporoes foram adaptadas de Mazzuchetti eVineis (2005). Foram adicionados 1.750 L de soluo tampo, 200 L de cido linolico (15 mM) e50 L de extrato enzimtico. A mistura foi homogeneizada levemente por 2 segundos e colocada em

espectrofotmetro UV/Visvel (PHAMACIA BIOTECH, modelo Ultrospec 2000) para o acompanhamentoda cintica enzimtica durante 6 min a 234 nm.

3 RESULTADOS E DISCUSSO

3.1 EFEITO DO pH SOBRE A ATIVIDADE ENZIMTICA DA LIPOXIGENASENA CASTANHA-DO-BRASIL

De acordo com a Figura 1 houve crescimento da atividade enzimtica em funo do pH atvalores de, aproximadamente, 6,50 para os dois substratos, seguido de acentuado decrscimo daatividade em valores de pH superiores a 6,50.

Os resultados encontrados neste trabalho esto de acordo com Bobbio e Bobbio (2003)que relataram que a maioria das enzimas apresenta atividade tima em valores de pH entre 4,50


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e 8,00. Buranasompob et al. (2006), utilizando cido linoleico como substrato de lipoxigenase denozes e amndoas, encontraram pH timo de atividade enzimtica entre 5,50 e 7,50, porm commaior pico de atividade em pH 7,00. Mosqueira, Galan e Fernandez (1993) relataram que o pHtimo de atividade da lipoxigenase do pimento foi 5,00. Koch et al. (1992) determinaram que o pHtimo da atividade de lipoxigenase em folhas de tomate inoculadas com Pseudomonas syringaeest entre 6,40 e 7,20. Lanna et al. (1996) obtiveram valores de atividade tima entre pH 6,00 e 7,00

para folhas de soja.A atividade de lipoxigenase em funo do pH, utilizando-se cido linolnico como substrato

apresentou picos em pH 5,00 e 6,50, enquanto que o pico para o cido linoleico ocorreu em pH 6,50.A partir desse resultado verificou-se a presena de LOX na castanha-do-brasil, supondo-se que asisoenzimas sejam do tipo LOX 2 e/ou LOX 3. De acordo com Lanna (1995), tais enzimas atuam nafaixa de pH timo encontrada para as lipoxigenases da castanha-do-brasil, sendo que a atividadetima de pH na LOX-2 se restringe a 6,50 e a LOX- 3 alcana altos nveis de atividade na faixa depH entre 5,00 a 9,00.

FIGURA 1 - EFEITO DO pH SOBRE A ATIVIDADE DA LIPOXIGENASEDA CASTANHA-DO-BRASIL COM DIFERENTES SUBSTRATOS

(CIDO LINOLEICO E CIDO LINOLNICO)

3.2 ATIVIDADE DA LIPOXIGENASE EM FUNO DACONCENTRAO DO SUBSTRATO

A fim de determinar os valores de KM

e VMAX

elaboraram-se os grficos da concentraodo substrato (cidos linoleico e linolnico) em funo da atividade enzimtica, expressa emmM/sg. Determinou-se tambm qual substrato o mais indicado para quantificao da atividadeenzimtica da lipoxigenase de castanha-do-brasil. Nessa etapa do trabalho utilizou-se o pH dotampo que apresentou maior atividade enzimtica no passo anterior, tampo fosfato de sdio pH6,50 (0,05 M).

De acordo com a Figura 2, a atividade enzimtica da LOX da castanha-do-brasil aumentaem funo de maiores concentraes dos cidos linoleico e linolnico. Os maiores valores deatividade enzimtica acontecem, em ambos os casos, na concentrao de 1,50 mM de substrato.Verificou-se a estabilizao da atividade a partir desses nveis de concentrao.

Sawazaki Teixeira e Miranda (1987) obtiveram atividade enzimtica mxima da lipoxigenaseutilizando cido linoleico em concentraes variando de 0,178 a 0,267 mM. Em concentraes desubstrato acima de 0,891 mM houve inibio da atividade enzimtica, possivelmente em razo da

ligao dos substratos a determinados grupos no catalticos da enzima, que acabam modificandoa conformao ativa da mesma diminuindo sua atividade cataltica. Bucco et al. (2006), utilizandosubstrato de Enzimas Lipozyme, observaram que a velocidade da reao aumenta com a elevao


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da concentrao inicial do substrato, atingindo valor mximo de 0,011 mol L-1min-1em concentraoinicial de 0,65 mol.L-1.

FIGURA 2 - EFEITO DA CONCENTRAO DO SUBSTRATO (CIDO LINOLEICO ECIDO LINOLNICO) NA ATIVIDADE ENZIMTICA DA LIPOXIGENASE

DA CASTANHA-DO-BRASIL

Na Figura 3 pode-se observar a linearizao da equao de Michaelis-Menten, o chamadogrfico de duplos recprocos ou simplesmente equao de Lineweaver-Burk para a lipoxigenase dacastanha-do-brasil. Essa linearizao permitiu a determinao das constantes (Tabela 1) K

M

e VMAX

que representam, respectivamente, a constante de Michaelis-Mentem e a velocidade mxima deatividade enzimtica. Segundo Nelson e Cox (1995), K

Mreflete o ambiente celular, a concentrao

do substrato normalmente encontrada in vivopela enzima, e a qumica da reao que est sendocatalisada. V

MAXconstitui parmetro cintico que depende da constante cataltica e da concentrao

da enzima no experimento.

FIGURA 3 - LINEARIZAO DA EQUAO DE MICHAELIS-MENTEN (EQUAO DELINEWEAVER-BURK) PARA A LIPOXIGENASE DA CASTANHA-DO-BRASIL


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A constante de Michaelis-Menten indica a adequao relativa de substratos alternativospara determinada enzima, ou seja, o substrato com o valor mais baixo de K

Mtem aparentemente

maior afinidade com a enzima (NELSON e COX, 1995). A partir da avaliao do comportamentoda lipoxigenase da castanha-do-brasil em funo da concentrao e do tipo de substrato pde-seobservar que a referida enzima tem maior capacidade de reagir com o cido linoleico na concentraode 2 mM, no havendo aumento aparente na atividade enzimtica para valores superiores a essa

concentrao.

TABELA 1 - VALORES DE KME V

MAXDOS CIDOS LINOLEICO E LINOLNICO PARA A

LIPOXIGENASE DA CASTANHA-DO-BRASIL

Subatrato VMAX Km

cido Linoleico 0,093 0,002 0,16 0,003

cido linolnico 0,083 0,005 0,169 0,001

3.3 ATIVIDADE DA LIPOXIGENASE EM FUNO DA CONCENTRAO ENZIMTICA

A fim de determinar a concentrao de enzima para se obter a atividade tima dalipoxigenase da castanha-do-brasil foram realizados ensaios com as concentraes de extrato deenzima de 0,50, 1,00, 1,50, 2,00, 2,50 e 3,00% de amostra (essas concentraes se referem asconcentraes na cubeta), escolhidas com base em anlises anteriores.

A Figura 4 apresenta o efeito da concentrao de extrato de enzima na atividadeda lipoxigenase da castanha-do-brasil. Observou-se linearidade da atividade enzimtica emconcentraes prximas a 2,50%, ocorrendo a partir de 2,50 3,00% sua estabilizao. Tal fatorevela que os produtos da reao esto sendo formados mais rapidamente, devido ao aumentona concentrao de enzima. Quanto maior a concentrao de enzima, mais rpido o complexo

enzimtico ser formado e o produto da reao tambm.

FIGURA 4 - EFEITO DA CONCENTRAO DE ENZIMA SOBRE A ATIVIDADE DALIPOXIGENASE DA CASTANHA-DO-BRASIL, UTILIZANDO-SE O CIDO

LINOLEICO COMO SUBSTRATO


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4 CONCLUSO

Constatou-se, pelas anlises realizadas, a presena de lipoxigenase em castanha-do-brasil, supostamente do tipo LOX 2 e/ou LOX 3. As condies timas para determinao daatividade enzimtica para lipoxigenase da castanha-do-brasil foram pH 6,50 e cido linoleico comosubstrato na concentrao de 1,50 mM. A escolha do substrato ocorreu em funo dos valores de

KMe VMAXdeterminados para os dois substratos utilizados (cido linoleico e cido linolnico). Comas condies de determinao da lipoxigenase da castanha-do-brasil conhecida, trabalhos futurosso necessrios no sentido de desnaturar/inativar a referida enzima para minimizar seus efeitos deoxidao.

ABSTRACT

EVALUATION OF LIPOXYGENASE ACTIVITY OF THE BRAZIL NUT (Bertholletia excelsa)

To determine the optimum conditions of lipoxygenase activity (LOX) of the Brazil nut ( Bertholletia excels) wasconsidered the activity accordinh to pH in buffer solutions (pH 4.00, 5.00, 6.00, 6.50, 7.00, 8.00 and 9.00), vary-ing the substrates type (linoleic acid and linolenic acid) and its concentration (0.10, 0.25, 0.50, 1.00, 1.50, 2.00

and 4.00 mM) as well as the concentration of enzyme extract (0.50, 1.00, 1.50, 2.00, 2.50 and 3.00%). The ac-tivity of LOX was monitored by absorbance increase at 234 nm during 240 s, expressed in millimolar per secondper gram (mM/sg). Both fatty acids studied showed peak LOX activity: at pH 6.50 and substrate concentration of1.5 mM. Experimental data obtained by Michaelis-Menten equation and Lineawer-Burk linearization presentedMichaelis-Menten constant (KM) and the maximum velocity of enzyme (VMAX) values ranged from: 0.164 to0.169 mM and 0.083 to 0.093 mM/sg, respectively. Linoleic acid proved to be the best substrate for the enzyme,and was used to determine the LOX activity considering the enzyme concentration. The most active enzymeconcentration was 3.00%.

KEY-WORDS: Bertholletia excelsa; LIPOXYGENASE; ENZYMATIC ACTIVITY.

REFERNCIAS

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