Avaliação Da Concentração e Dos Tipos de Flavonoides Na

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE QUMICA

Ariane Arajo ssimos

Avaliao da Concentrao e dos Tipos de Flavonoides na

Prpolis Utilizando Mtodos Quimiomtricos de Classificao e

Calibrao

Belo Horizonte, MG

2014

ARIANE ARAJO SSIMOS

Avaliao da Concentrao e dos Tipos de Flavonoides na

Prpolis Utilizando Mtodos Quimiomtricos de Classificao e

Calibrao

Dissertao apresentada ao Departamento de

Qumica do Instituto de Cincias Exatas da

Universidade Federal de Minas Gerais como

requisito parcial para obteno do grau de

Mestre em Qumica - Qumica Analtica

Belo Horizonte

2014

UFMG/ ICEx/ DQ 1012

D. 551

III

AGRADECIMENTOS

Deus por ter iluminado meu caminho e me dado foras

Ao meu orientador, Prof. Paulo Barbeira, pela oportunidade de ter desenvolvido esse trabalho

sobre sua orientao, pelos ensinamentos e apoio.

Agradeo aos meus pais, por me ajudarem a suportar os desafios, pelo carinho e amor, e por

sempre acreditarem na minha capacidade. Obrigada pela educao que me deram, por terem

transmitido os mais valorosos saberes e compartilhado comigo cada vitria.

Ao meu namorado, Leo, pela pacincia e amor, pelos conselhos valorosos e por ter estado ao

meu lado em todos os momentos. A sua presena foi essencial para que eu tivesse foras para

chegar at aqui.

minha irm, Tassiane, minha v Billa, e tia Dri e tia Graa, pelos momentos de alegria,

por sempre terem me incentivado e por entenderem os momentos de ausncia.

Agradeo a tambm a todos do laboratrio LIMA, Rosilene, Meliza e Danniel pelas conversas

e companheirismo. Agradeo tambm a Silvinha, quase membro do laboratrio LIMA, por

ter me proporcionado tantos momentos divertidos.

Cristina Bernardes, pela amizade, pelos inmeros conselhos, pelos momentos de desabafo e

por ter me ensinado tanto durante esses anos. Em vrios momentos difceis as suas palavras

foram essenciais para que eu conseguisse seguir em frente. No teria chegado at aqui sem

sua ajuda!

s estagirias Tatiane e Thlia, pelo auxlio com a parte experimental.

Mirra, por toda a ajuda e disposio nos estudos cromatogrficos.

CAPES pelo apoio financeiro

Muito Obrigada a todos!!!!

IV

RESUMO

Neste trabalho foram desenvolvidos mtodos analticos para avaliar a qualidade dos

extratos alcolicos comerciais de prpolis, baseados em mtodos quimiomtricos como a

calibrao multivariada por mnimos quadrados parciais e a anlise discriminante por

mnimos quadrados parciais. Inicialmente, foram otimizadas as condies experimentais da

metodologia colorimtrica utilizada para a determinao da concentrao de flavonoides na

prpolis, que um dos parmetros de qualidade regulamentado pelo MAPA (Ministrio da

Agricultura, Pecuria e Abastecimento), para que pudesse ser aplicada aos extratos comerciais

de prpolis. Foram avaliados o volume de amostra utilizado nas anlises, a concentrao de

nitrato de alumnio e de acetato de ltio e o tipo de solvente. Espectros UV-Vis das amostras

diludas foram utilizados para a construo de um modelo PLS para a determinao da

concentrao de flavonoides nas amostras de prpolis. A metodologia quimiomtrica proposta

mostrou-se eficiente alm de ser muito menos demorada, trabalhosa, e utilizar uma

quantidade de reagente bem menor do que a metodologia colorimtrica tradicional. Na

segunda parte os espectros UV-Vis obtidos anteriormente foram utilizados para a construo

de um modelo PLS-DA para classificar as amostras de acordo com o tipo de composto

fenlico presente. O modelo construdo foi capaz de discriminar as amostras de extratos

comerciais de prpolis em quatro classes quanto ao tipo e concentrao dos compostos

fenlicos presentes e mostrou ser de grande utilidade por prever quais amostras eram

irregulares quanto concentrao de flavonoides. Anlises cromatogrficas foram feitas com

amostras representativas das classes observadas no modelo PLS-DA e foi possvel perceber

que as principais substncias responsveis pela separao nas quatro classes foram o

flavonoide pinocembrina, e os cidos fenlicos artepillin C, cido p-cumrico e cido ferlico.

Palavras chaves: prpolis, flavonoides, compostos fenlicos, quimiometria.

V

ABSTRACT

In this work, analytical methods were developed to assess the quality of commercial

alcoholic extracts of propolis, based on chemometric methods such as Partial Least Squares

Multivariate Calibration (PLS) and Partial Least Squares Discriminating Analysis (PLS-DA).

Initially, the experimental conditions of the spectrophotometric method used for determining

the concentration of flavonoids in propolis , which is a quality parameter regulated by MAPA

(Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento) were optimized , so it could be applied

to commercial extracts of propolis . The volume of sample used in the analysis, the

concentration of aluminum nitrate and lithium acetate, and the type of solvent were evaluated.

The UV-Vis spectra of the diluted samples were used for the construction of a PLS model for

determining the concentration of flavonoids in the samples of propolis. The chemometric

methodology proposed has shown to be very efficient in addition of be less time-consuming ,

laborious, and using a much smaller amount of reagent than the traditional spectrophotometric

method . In the second part the UV-Vis spectra obtained previously were used for the

construction of a PLS -DA model to classify the samples according to the type of phenolic

compound. The constructed model was able to discriminate samples of commercial extracts of

propolis in four classes according to the type and concentration of phenolic compounds and

proved to be very useful for predicting which samples were irregular in concentration of

flavonoids. Chromatographic analyzes were performed on representative samples of the

classes observed in the PLS DA, and it was revealed that the main substances responsible for

the separation in the four classes were the flavonoid pinocembrine and the phenolic acids

artepillinC, p-coumaric acid and ferulic acid.

Keywords: propolis, flavonoids, phenolic compounds, chemometrics.

VI

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Apis mellifera ........................................................................................................ 1

Figura 2: Produo cientfica sobre prpolis (Chemical Abstracts). (a) Em relao dcada

de publicao (b) Em relao ao tipo de publicao. .............................................................. 2

Figura 3: Baccharis dracunculifolia, conhecida como alecrim-do-campo, fonte da prpolis

verde ...................................................................................................................................... 4

Figura 4: Estrutura qumica do artepillin C. .......................................................................... 4

Figura 5: Dalbergia ecastophyllum, conhecida como rabo de bugio, fonte da prpolis

vermelha. ............................................................................................................................... 5

Figura 6: Estrutura bsica dos flavonoides ............................................................................ 9

Figura 7: Flavonoides encontrados na prpolis.................................................................... 10

Figura 8: Espectro tpico de um extrato alcolico de prpolis.............................................. 11

Figura 9 : Esqueleto de uma flavona (a) ; Esqueleto de um flavonol (b) .............................. 13

Figura 10 : Esqueleto de uma isoflavona (a); Esqueleto de uma flavanona (b); Esqueleto de

uma flavanonol (c) ............................................................................................................... 13

Figura 11: Espectros UV-Vis tpico das classes de flavonoides. a) flavona (acacetina); b)

flavonol (quercetina); c) flavanonol (taxifolina); d) isoflavona (iridina); e) flavanona

(pinocembrina). .................................................................................................................... 14

Figura 12: Dados organizados em uma matriz X ................................................................. 16

Figura 13: Distribuio de variveis em torno do eixo cartesiano. a) dados originais b) dados

centrado na mdia. ............................................................................................................... 17

Figura 14: Decomposio dos blocos de dados X e y. ......................................................... 19

Figura 15: Reao de formao do complexo entre os flavonoides e Al(III) ........................ 28

Figura 16: Solues obtidas da complexao do Al(III) com os flavonoides presentes nas

amostras de prpolis ............................................................................................................ 32

Figura 17: Esquema da metodologia utilizada para avaliar qual volume de amostra deveria

ser usado .............................................................................................................................. 36

Figura 18: Dependncia da absorbncia do complexo alumnio-quercetina em diferentes pH e

em diferentes nveis de fora inica...................................................................................... 37

Figura 19: Esquema da metodologia utilizada para avaliar qual a melhor concentrao de

acetato de ltio ...................................................................................................................... 38

VII

Figura 20: Espectro obtidos para a avaliao da concentrao de acetato de lto para uma

amostra de prpolis .............................................................................................................. 38

Figura 21: Espectros obtidos para a avaliao da concentrao de acetato de lto para o

padro quercetina ................................................................................................................. 39

Figura 22: Esquema da metodologia utilizada para avaliar qual a melhor concentrao de

nitrato de alumnio ............................................................................................................... 40

Figura 23: Espectro obtidos para a avaliao da concentrao de nitrato de alumnio para

uma amostra de prpolis e o padro (quercetina) .................................................................. 40

Figura 24: Cromatograma de uma amostra extrato alcolico de prpolis obtido por outros

autores: (a) [78] (b) [79] (c) [60] (d) [59] ; cromatogrma obtido nesse trabalho: (e) . 1)

cido cafico 2) cido p-cumrico 3) cido ferlico 4) cido cinmico 5) quercetina 6)

naringenina 7) kaempferol 8) pinocembrina 9) crisina 10) acacetina 11) galangina 12)

artepillin C. .......................................................................................................................... 46

Figura 25: Curva analtica obtida utilizando como padro a quercetina ............................... 47

Figura 26: Espectro dos complexos formados entre os flavonoides presentes nas amostras de

prpolis e o alumnio, de acordo com a concentrao de flavonoides. ................................... 49

Figura 27: Histograma com as concentraes de flavonoides para as amostras de extrato de

prpolis ................................................................................................................................ 50

Figura 28: Relao entre os parmetros teor de extrato seco e concentrao de flavonoides. (

Os valores mminos estipulados pelo MAPA encontram-se marcados com linha tracejada). . 51

Figura 29: Cromatograma de uma amostra extrato alcolico de prpolis. 1) cido cafico 2)

cido p-cumrico 3) cido ferlico 4) cido cinmico 5) quercetina 6) naringenina 7)

kaempferol 8) pinocembrina 9) crisina 10) acacetina 11) galangina 12) artepillin C. ............ 52

Figura 30: Espectros de absoro na regio UV-Vis das amostras diludas em etanol 95%

utilizadas na construo do modelo ...................................................................................... 57

Figura 31: Coeficientes de regresso do modelo PLS ......................................................... 59

Figura 32: Grfico de resduos versus concentrao de flavonoides determinado pelo mtodo

de referncia. () Amostras de calibrao; () Amostras de validao. ............................. 60

Figura 33: Valores da concentrao de flavonoides prevista em funo da concetrao de

flavonoides medida. () Amostras de calibrao; () Amostras de validao. ............... 61

Figura 34: Espectros das amostras de extrato de prpolis na presena de Al(III) ................. 67

Figura 35: Escores do modelo PCA. (a) CP1 vs CP2 (b) CP1 vs CP3 ................................. 68

Figura 36: Espectros das amostras separados de acordo com as classes observadas no PCA 69

VIII

Figura 37: Grfico dos pesos em CP1, CP2 e CP3 para o modelo PCA. .............................. 70

Figura 38: Amostras classificadas pelo modelo PLS-DA. Os smbolos cheios correspondem

s amostras de validao, os smbolos vazios s de calibrao. (a) Classe 1 (b) Classe 2 (c)

Classe 3 (d) Classe 4 ............................................................................................................ 72

Figura 39: Coeficientes de regresso para o modelo PLS-DA.............................................. 73

Figura 40: Cromatograma de amostras representativas das classes observadas no PLS-DA. 1)

cido cafico 2) cido p-cumrico 3) cido ferlico 4) cido cinmico 5) quercetina 6)

naringenina 7) kaempferol 8) pinocembrina 9) crisina 10) acacetina 11) galangina 12)

artepillin C. .......................................................................................................................... 74

IX

LISTA DE TABELAS

TABELA I: Classificao da Prpolis Brasileira de acordo com caractersticas fsico-qumicas

e origem geogrfica................................................................................................................ 3

TABELA II: Requisitos fsico-qumicos exigidos pelo MAPA para a comercializao da

prpolis bruta e dos extratos hidroalcolicos .......................................................................... 6

TABELA III: Principais cidos fenlicos derivados do cido benzoico .................................. 7

TABELA IV: Principais cidos fenlicos derivados do cido cinmico .................................. 8

TABELA V: Alguns compostos fenlicos e suas bandas de absoro no ultravioleta ........... 12

TABELA VI: Condies Cromatogrficas de estudos que utilizaram HPLC para a

quantificao dos flavonoides .............................................................................................. 25

Tabela VII: Resumo de alguns trabalhos que utilizaram CG para a quantificao dos

flavonoides .......................................................................................................................... 27

TABELA VIII: Resumos de alguns trabalhos que utilizaram a espectrofotometria para a

quantificao dos flavonoides. ............................................................................................. 30

TABELA IX: Amostras selecionadas para avaliao do volume a ser utilizado nos ensaios.. 36

TABELA X: Programao do gradiente para a separao do cido cafico, cido p-cumrico e

cido ferlico ....................................................................................................................... 42

TABELA XI: Programa de gradiente para a separao do cido trans-cinmico, quercetina,

naringenina, kaempferol e pinocembrina .............................................................................. 43

TABELA XII: Gradiente de eluio utilizado para a separao dos flavonoides, crisina,

acacetina e galangina ........................................................................................................... 44

TABELA XIII: Programao do gradiente final ................................................................... 44

TABELA XIV Deslocamentos batocrmicos observados e absoro mxima das solues dos

flavonoides na adio de Al(III) ........................................................................................... 48

TABELA XV: Estrutura e tempo de reteno (tr) dos compostos avaliados na cromatografia 53

TABELA XVI: Parmetros obtidos das curvas de calibrao por HPLC .............................. 54

TABELA XVII: Concentrao de flavonoides nas amostras pelo mtodo cromatogrfico e

espectrofotomtrico.............................................................................................................. 55

TABELA XVIII: Principais figuras de mrito para o modelo PLS ........................................ 62

TABELA XIX: Porcentagens de varincia explicada pelo modelo PLS-DA ......................... 70

TABELA XX: Sensibilidade e Especificidade do modelo PLS-DA ...................................... 71

X

LISTA DE ABREVIATURAS

CAS: do ingls, Chemical Abstracts Service.

CV: do ingls, Cross Validation.

DAD: do ingls, Diode Array Detector.

DNP: 2,4- dinitrofenilhidrazina.

DPR: Desvio Padro Relativo.

Er: Erro Relativo.

ESI-MS: do ingls, Electrospray Ionization Mass Spectrometry.

GC: do ingls, Gas Chromatography.

GC-MS: do ingls, Gas Chromatograph Mass Spectrometry.

HCA: do ingls, Hierarchical Cluster Analysis.

HPLC: do ingls, High Performance Liquid Chromatography.

HPLC-RP: do ingls, High Performance Liquid Chromatograph Reverse Phase

HRGC: do ingls, High-Temperature High-Resolution Gas Chromatograph.

MAPA: Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento.

PAD: do ingls, Photodiode Array Detector.

PCA: do ingls, Principal Component Analysis.

PLS: do ingls, Partial Least Squares.

PLS-DA: do ingls, Partial Least Squares Discriminant Analysis.

RMSE: do ingls, Root Mean Square Error.

RMSEC: do ingls, Root Mean Square Error of Calibration.

RMSECV: do ingls, Root Mean Square Error Cross Validation.

RMSEP: do ingls, Root Mean Square Error of Prediction.

UV-Vis: Ultravioleta-visvel.

XI

VL: Varivel Latente

XII

SUMRIO

1. Introduo..................................................................................................................... 1

1.1 Prpolis ......................................................................................................... 1

1.2 Composio Qumica ........................................................................................ 5

1.3 Compostos fenlicos ......................................................................................... 7

1.3.1 cidos Fenlicos ........................................................................................ 7

1.3.2 Flavonoides ............................................................................................. 8

1.3.3 Prpolis e Espectroscopia Eletrnica ........................................................ 10

1.4 Quimiometria .............................................................................................. 15

1.4.1 A Organizao dos Dados ...................................................................... 15

1.4.2 Pr-processamento dos Dados .................................................................. 16

1.4.3 Reconhecimento de Padres .................................................................. 17

1.4.4 Calibrao Multivariada......................................................................... 18

1.4.5 Anlise Discriminante por Mnimos Quadrados Parciais PLS-DA....... 21

2. Objetivos .................................................................................................................... 22

3. Desenvolvimento de um mtodo de calibrao multivariada para Quantificao de

flavonoides nos extratos comerciais de prpolis ................................................................... 23

3.1 Mtodos Analticos para a Determinao de Flavonoides na Prpolis .......... 23

3.2 Materiais e Mtodos ........................................................................................ 31

3.2.1 Amostras .................................................................................................. 31

3.2.2 Reagentes ................................................................................................. 31

3.2.3 Metodologia: mtodo espectrofotomtrico ................................................ 31

3.2.4 Metodologia: mtodo cromatogrfico ....................................................... 33

3.2.5 Tratamento Estatstico dos Resultados ...................................................... 33

3.2.6 Anlise Quimiomtrica ............................................................................. 34

3.3 Resultados e Discusso ................................................................................... 35

3.3.1 Mtodo espectrofotomtrico ajuste das condies experimentais ........... 35

XIII

3.3.2 Metodologia cromatogrfica ajuste das condies experimentais ........... 41

3.3.3 Determinao da concentrao de flavonides nos extratos comerciais de

prpolis pelo mtodo espectrofotomtrico .................................................................... 47

3.3.4 Determinao da concentrao de flavonoides nos extratos comerciais de

prpolis pelo mtodo cromatogrfico ........................................................................... 52

3.3.5 Construo do modelo de calibrao multivariada .................................... 56

3.4 Concluso ....................................................................................................... 62

4. Utilizao dos complexos de Alumnio e PLS-DA para a discriminao de extratos

comerciais de prpolis ......................................................................................................... 64

4.1 Materiais e Mtodos ........................................................................................ 64

4.1.1 Amostras .................................................................................................. 64

4.1.2 Reagentes ................................................................................................. 65

4.1.3 Metodologia espectrofotomtrica ............................................................. 65

4.1.4 Metodologia cromatogrfica ..................................................................... 65

4.1.5 Anlise Quimiomtrica ............................................................................. 66

4.2 Resultados e Discusso ................................................................................... 66

4.2.1 Construo do modelo PLS-DA ............................................................... 66

4.2.2 Concluso ................................................................................................ 76

5. Consideraes Finais .................................................................................................. 77

6. Referncias Bibliogrficas .......................................................................................... 79

1 - Introduo 1

1. INTRODUO

1.1 Prpolis

A prpolis (CAS No. 9009-62-5) uma resina de colorao e resistncia variada

produzida pelas abelhas atravs da mistura de substncias coletadas de diversas partes das

plantas (brotos, botes florais e exsudatos resinosos) com secrees produzidas por seu

organismo, cera e plen para a obteno do produto final. So conhecidas atualmente mais de

20 mil espcies de abelhas sendo que as da espcie Apis mellifera (Figura 1) so as mais

conhecidas e difundidas entre os apicultores para a produo de prpolis e mel. [1-5]

Figura 1: Apis mellifera

FONTE: www.ciencias.ies-bezmiliana.org (Acessado em 11/12/13)

O termo prpolis deriva do grego: pro em defesa de, e polis cidade. A prpolis

utilizada pelas abelhas para fechar frestas da colmeia, embalsamar insetos mortos e manter o

ambiente assptico. [3, 6-8]

O uso da prpolis na medicina popular remonta a pelo menos 300 a.C.. No Egito

antigo a prpolis era utilizada no embalsamento dos mortos. Tambm h registros da

utilizao da prpolis pelos gregos e romanos. Suas propriedades medicinais foram

reconhecidas por Aristteles, Dioscrides, Plnio e Galeno. As propriedades biolgicas da

prpolis tambm foram reconhecidas por outras civilizaes, como os Incas que a

empregavam como antipirtico. [2, 4, 6, 9;10]

1 - Introduo 2

A popularizao do uso da prpolis se deve as diversas propriedades biolgicas que

so atribudas a ela, como efeito hepatoprotetor, atividade antitumoral, atividade antioxidante,

atividade microbiana, atividade anti-inflamatria, efeito contra a replicao do vrus HIV-1,

atividade antifngica, imunomodulatria, entre outras. [6;7, 11-14]

O primeiro trabalho indexado no Chemical Abstract sobre prpolis foi publicado em

1903 e a primeira patente foi escrita em 1904 (USA-Composition for treating pins and piano

strings) [15]. A Figura 2 mostra o nmero de publicaes sobre prpolis ao longo das dcadas

e os tipos de documentos publicados. O interesse global a respeito da pesquisa sobre prpolis

se deve a diversidade das propriedades biolgicas e ao alto valor agregado. [2, 7, 9]

(a)

(b)

Figura 2: Produo cientfica sobre prpolis (Chemical Abstracts). (a) Em relao dcada de

publicao (b) Em relao ao tipo de publicao.

1 - Introduo 3

Em relao produo de prpolis, segundo Toreti et. al. [2] o Brasil exportou em

2012 cerca de 40 toneladas de prpolis, correspondendo a cerca de cinco milhes de dlares.

O mercado asitico o principal destino dessas exportaes, sendo que 92% de toda a

prpolis in natura consumida no Japo de origem brasileira e o frasco do extrato alcolico

da substncia vendido a US$ 110. Em torno de 70% da produo de prpolis do Brasil vem

de Minas Gerais, onde foram produzidas em 2012 cerca de 30 toneladas de prpolis.

importante ressaltar que o preo da prpolis varia de acordo com o tipo, pois o valor do

produto est relacionado com sua composio qumica e atividades biolgicas, que variam em

funo de sua origem botnica. [2, 16]

Recentemente, as prpolis brasileiras foram classificadas em 13 tipos de acordo com a

composio qumica e atividades biolgicas (Tabela I). Cinco tipos so provenientes da regio

sul, um proveniente do sudeste e centro-oeste, e sete do nordeste. Os tipos que apresentaram

melhor atividade antimicrobiana foram G3, G6 e G12. [2, 17]

TABELA I: Classificao da Prpolis Brasileira de acordo com caractersticas fsico-qumicas e origem

geogrfica

Tipo Cor Origem da Prpolis

G1 (RS5) Amarelo Sul

G2 (RS1) Marrom Sul

G3 (PR7) Marrom Escuro Sul

G4 (PR8) Marrom Sul

G5 (PR9) Marrom Esverdeado Sul

G6 (BA11) Marrom Avermelhado Nordeste

G7 (BA51) Marrom Esverdeado Nordeste

G8 (PE5) Marrom Escuro Nordeste

G9 (PE3) Amarelo Nordeste

G10 (CE3) Amarelo Escuro Nordeste

G11 (PI11) Amarelo Nordeste

G12 (SP12) Verde ou Marrom Esverdeado Sudeste

G13 (AL) Vermelha Nordeste

Fonte: Adaptado de Toreti et. al. , 2013. [2]

1 - Introduo 4

A prpolis da regio sudeste do Brasil uma das mais bem cotadas no mercado

internacional por se tratar da prpolis verde, cuja origem botnica a planta Baccharis

dracunculifolia (Figura 3), conhecida popularmente como alecrim-do-campo. Os principais

componentes da prpolis verde so os fenil propanides prenilados, que so cidos fenlicos

contendo um grupo prenila. Essas substncias so formadas a partir do cido cinmico e seus

derivados, como o artepillin C (cido 3,5-diprenil-4-hidroxicinmico) (Figura 4), marcador

qumico da prpolis verde, sendo a substncia majoritria. A cotao mdia da prpolis verde

de Minas Gerais no exterior da ordem de US$ 120 o quilo. [14, 18-21]

Figura 3: Baccharis dracunculifolia, conhecida como alecrim-do-campo, fonte da prpolis verde

FONTE: revistaplaneta.terra.com.br; www.reidaverdade.net; www.panoramio.com (Acessado em

02/01/14)

Figura 4: Estrutura qumica do artepillin C.

HO

OH

O

1 - Introduo 5

O 13 tipo de prpolis foi o mais recentemente classificado. Essa prpolis originria

da regio de mangue do estado do Alagoas, e sua origem botnica a leguminosa Dalbergia

ecastophyllum (Figura 5), conhecida popularmente como rabo de bugio devido sua

colorao vermelha intensa. A prpolis vermelha vem demonstrando vrias atividades

biolgicas e pode valer cinco vezes mais que a prpolis verde. O produto chega a custar

R$ 500 o quilo no mercado externo. [15, 22-23]

Figura 5: Dalbergia ecastophyllum, conhecida como rabo de bugio, fonte da prpolis vermelha.

FONTE: meliponariojandaira.blogspot.com; www.agricultura.al.gov.br; www.portaldenoticias.net

(Acessado em 02/01/14)

1.2 Composio Qumica

A composio qumica da prpolis muito complexa e depende da biodiversidade da

flora regional, mas de forma geral ela constituda de aproximadamente 30% de ceras, 50%

de resinas vegetais, 10% de leos volteis, 5% de plen e 5% de outras substncias, incluindo

compostos orgnicos e microelementos. [2, 24-25]

Mais de 300 constituintes j foram descritos em prpolis de diferentes origens. Alguns

componentes esto presentes em todas as amostras de prpolis, enquanto outros s so

encontrados em prpolis derivadas de espcies especficas de plantas. Entre os constituintes

da prpolis temos os flavonoides (como a galangina, quercetina, pinocembrina e kaempferol),

fenis, cidos aromticos e steres, aldedos e cetonas, terpenides e fenil propanides (como

1 - Introduo 6

os cidos cafico e clorognico), esteroides, aminocidos, polissacardeos, cidos graxos e

outros componentes em pequenas quantidades. [2, 7, 17, 26]

Dentre todos esses compostos qumicos destacam-se os compostos fenlicos, que so

os cidos fenlicos e flavonoides, pois a eles so atribudas as diversas atividades biolgicas

presentes na prpolis. Na Europa, Amrica do Norte e oeste da sia, a fonte botnica

predominante para a produo da prpolis o exsudato do boto de lamo (Populus sp.)

Estudos mostram que a prpolis de locais com clima temperado possuem composio qumica

similar, sendo que os principais compostos bioativos so os flavonoides. J as prpolis

originrias de locais com clima tropical e subtropical possuem composio qumica muito

mais complexa, sendo que os principais compostos bioativos so os cidos fenlicos, o que

confere propriedades biolgicas diferenciadas. [6-7, 17, 27-29]

No Brasil a prpolis comercializada principalmente sobre a forma de extratos

alcolicos e aquosos, e podem ser encontrados extratos da prpolis verde e vermelha e outros

sem denominao. Os produtos apcolas so registrados no Ministrio da Agricultura,

Pecuria e Abastecimento (MAPA) e apresentam legislaes especficas. Para assegurar a

qualidade da prpolis, tanto na forma bruta quanto na forma de extrato, utilizam-se as normas

do Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade da Prpolis. Na Tabela II podem ser

verificados alguns requisitos fsico-qumicos exigidos pelo MAPA. [30]

TABELA II: Requisitos fsico-qumicos exigidos pelo MAPA para a comercializao da prpolis bruta

e dos extratos hidroalcolicos

Parmetros Prpolis Bruta Extrato Hidroalcolico

Perda por dessecao Mximo de 8% (m/m) -

Cinzas Mximo de 5% (m/m) -

Cera - 1% do extrato seco

Compostos fenlicos Mnimo de 5% (m/m) Mnimo de 0,50% (m/m)

Flavonoides Mnimo de 0,50 (m/m) Mnimo de 0,25% (m/m)

Atividade de Oxidao Mximo de 22 segundos Mximo de 22 segundos

Massa Mecnica Mximo de 40% (m/m) -

Solveis em Etanol Mnimo de 35% (m/m) -

Extrato Seco - 11% (m/v)

Teor alcolico - Mximo de 70 GL (v/v)

Metanol - Mximo 0,40 mg/L

1 - Introduo 7

Entre os parmetros preconizados pelo MAPA para os extratos alcolicos est a

concentrao de flavonoides, cujo mnimo exigido de 0,25% (m/m). Por estar diretamente

ligada atividade biolgica da prpolis, a determinao da concentrao dos flavonoides

muito importante e agrega valor econmico ao produto.

1.3 Compostos fenlicos

1.3.1 cidos Fenlicos

Os cidos fenlicos pertencem ao grupo dos compostos fenlicos e so caracterizados

por possurem um anel benznico, um grupamento carboxlico e um ou mais grupamentos

hidroxilas e/ou metoxila na molcula. Eles so divididos formalmente em derivados do cido

benzoico (Tabela III), como cido glico, e derivados do cido cinmico (Tabela IV), como o

cido p-cumrico. Os cidos fenlicos possuem atividade antioxidante que geralmente

determinada pelo nmero de hidroxilas presentes na molcula e tambm com a proximidade

do grupo CO2H com o grupo fenil. Quanto mais prximo este grupo estiver do grupo fenil,

maior ser a capacidade antioxidante do grupo hidroxila na posio meta. [31;32]

TABELA III: Principais cidos fenlicos derivados do cido benzoico

Derivados do cido Benzoico Substituintes

R1 = OH (cido Saliclico)

R1 = R4 = OH (cido Gentsico)

R3 = OH (cido p- hidroxibenzoico)

R2 = R3 = OH (cido Protocatequnico)

R2 = OCH3 ; R3 = OH (cido Vanlico)

R2 = R3 = R4 = OH (cido Glico)

R2 = R4 = OCH3; R3 = OH (cido Sirngico)

R1R2

R3

R4

COOH

1 - Introduo 8

TABELA IV: Principais cidos fenlicos derivados do cido cinmico

Derivados do cido Cinmico Substituintes

R1 = R2 = R3 = R4 = H (cido cinmico)

R1 = OH (cido o- cumrico)

R2 = OH (cido m- cumrico)

R3 = OH (cido p- cumrico)

R2 = R3 = OH (cido Cafico)

R2 = OCH3; R3 = OH (cido Ferlico)

R2 = R4 = OCH3; R3 = OH (cido Sinpico)

Os principais cidos fenlicos presentes na prpolis so cido glico, vanlico,

ferlico, p-cumrico, cafico e sirngico. [10, 31]

1.3.2 Flavonoides

O hngaro Albert Szent-Gyrgi, descobriu os flavonoides em 1936. Baseado em

evidncias de seus experimentos ele levantou a hiptese de ter descoberto uma nova vitamina.

Apesar de sua suposio de que os flavonoides eram vitaminas estar errada, a pesquisa a

respeito dessas substncias, e seu potencial benfico, continuou e cresceu intensamente nos

anos que se passaram. [33]

A palavra flavonoide tem origem no latim flavus, que significa amarelo. No incio o

conceito de flavonoide somente inclua grupos de compostos que apresentavam a cor amarela.

Hoje, este termo inclui tambm compostos menos coloridos e incolores, bem como as

antocianinas que apresentam colorao vermelha ou azul. Esses compostos constituem uma

grande classe de substncias de origem natural, cuja sntese no ocorre na espcie humana,

mas so encontrados em vegetais, legumes, frutas, chs de ervas, mel, prpolis, entre outros

produtos de consumo cotidiano. [31, 33]

Os flavonoides absorvem radiao eletromagntica na faixa do ultravioleta (UV) e do

visvel e assim apresentam um papel de defesa das plantas perante a radiao UV da luz solar.

Eles tambm representam uma barreira qumica de defesa contra microrganismos (bactrias,

R1R2

R3

R4

CH CH COOH

1 - Introduo 9

fungos e vrus), insetos e outros animais herbvoros. Alm disso, os flavonoides atuam

tambm em relacionamentos harmnicos entre plantas e insetos, sendo que uma das funes

dessas substncias conferir colorao s flores atraindo polinizadores. [31, 34;35]

Estruturalmente, os flavonoides so substncias aromticas com 15 tomos de carbono

(C15), dispostos em uma configurao C6-C3-C6, como pode ser visto na Figura 6. [33, 36]

Figura 6: Estrutura bsica dos flavonoides

Mltiplos grupos hidroxila, glicosil, oxignios ou grupos metil podem estar ligados

estrutura bsica do flavonoide. Dependendo do estado de oxidao do anel heterocclico, os

flavonoides podem ser separados em diversas classes, tais como: flavonas, flavonis,

flavanonis e flavanonas, antocianidinas, isoflavonoides, auronas, neoflavonoides,

biflavonoides, catequinas e seus precursores metablicos conhecidos como chalconas, e

podem ocorrer como agliconas, glicolsilados e como derivados metilados. J foram

identificadas mais de 4000 substncias pertencentes ao grupo dos flavonoides. [10, 33, 37]

A Figura 7 mostra estruturas de flavonoides comumente encontrados na prpolis: a

quercetina, miricetina e a galangina so flavonis; a apigenina, a crisina e o canferol so

exemplos de flavonas e a pinocembrina e a naringenina so flavanonas. [10, 33, 35;36, 38]

O

O

A C

B

1 - Introduo 10

Figura 7: Flavonoides encontrados na prpolis

Vrios estudos conduzidos nos ltimos anos relatam o importante papel dos

flavonoides na sade humana. Propriedades como atividade antioxidante, antifngica,

antiprotozorios, antivirais, anti-inflamatria, antimicrobiana, anticancergena, entre outras,

tm sido relatadas na literatura. [33;34]

1.3.3 Prpolis e Espectroscopia Eletrnica

Os flavonoides e cidos fenlicos presentes na prpolis apresentam absoro na regio

do ultravioleta-visvel devidos presena do cromforo do benzeno. As transies que

resultam em absoro de radiao eletromagntica nessa regio do espectro ocorrem entre

nveis de energia eletrnicos, sendo o cromforo do benzeno do tipo *. [39;40]

O espectro eletrnico dos extratos de prpolis tambm um dos parmetros

regulamentados pelo MAPA, que estabelece que o espectro de absoro de radiaes no UV-

Vis deve apresentar bandas caractersticas das principais classes de flavonoides entre 200 e

400 nm (Figura 8). [30]

Quercetina

1 - Introduo 11

Figura 8: Espectro tpico de um extrato alcolico de prpolis

O espectro ultravioleta do extrato alcolico de prpolis consiste em duas bandas de

absoro nas faixas de 280-500 nm (banda I) e entre 190-240 nm (banda II). A posio

precisa dessas bandas e as intensidades dos mximos fornecem informaes sobre a natureza

do composto fenlico e de seu padro de substituio. Na Tabela V tm-se as bandas de

absoro no UV-Vis para alguns compostos fenlicos. [40]

1 - Introduo 12

TABELA V: Alguns compostos fenlicos e suas bandas de absoro no ultravioleta

Nome do composto II

(nm)

I (nm)

cido 3,5-diprenil-p-cumrico 310 -

cido 4-hidroxi-benzoico 257 -

cido cafico 325 -

cido glico 273 -

cido p-cumrico 309 -

cido saliclico 305 -

cido sinpico 325 -

cido sirngico 273 -

cido vanilnico 261 293

Apgenina 265 337

Canferol 265 365

Crisina 269 313

Flavanona 253 321

Flavona 253 295

Galangina 267 359

Pinocembrina 299 -

Quercetina 253 369

Vanilina 291 309

Fonte: Adaptado de CHANG, 2005. [41]

Os espectros em metanol das flavonas e flavonis apresentam duas bandas de maior

absoro na regio de 240-400 nm. Esses dois picos so referidos comumente como banda I

(normalmente de 300-380 nm) e banda II (normalmente em 240-280 nm). A banda I est

associada com a absoro do anel B, e a banda II com a absoro do anel A (Figura 9).

Flavonas e flavonis oxigenados no anel A, mas no no B, tendem a ter a banda II mais

pronunciada que a I. Em molculas que tambm possuem o anel B oxigenado, o espectro

apresenta a banda I mais pronunciada, a qual aparece em comprimentos de onda no muito

distantes. A posio da banda I nos d informao sobre o tipo de flavonoide e tambm sobre

o grau de oxidao. A banda I das flavonas ocorre na faixa de 304-350 nm, enquanto que a

dos flavonis aparece em 352-385 nm. Entretanto os flavonis com o grupo 3-hidroxil

substitudo (metilado ou glicosilado) possuem a banda I em 328-357 nm, e em geral os seus

espectros so prximos aos das flavonas.[41]

1 - Introduo 13

O

O

O

O

OH

B

A

B

A

(a) (b)

Figura 9 : Esqueleto de uma flavona (a) ; Esqueleto de um flavonol (b)

J o espectro das flavanonas, isoflavonas e flavanonis so parecidos por apresentarem

pouca ou nenhuma conjugao entre os anis A e B (Figura 10). Esses espectros apresentam

uma banda II de grande intensidade de absoro com somente um ombro ou uma banda com

baixa intensidade representando a banda I. A banda II das isoflavonas ocorre normalmente na

regio de 245-270 nm e no muito afetada pela hidroxilao do anel B. O espectro das

flavanonas e flavanonis possui a banda II na faixa de 270-295 nm. A remoo do grupo 5-

hidroxil de uma flavanona ou flavanonol provoca um deslocamento hipsocrmico de 10-15

nm na banda II. O aumento da oxigenao no anel B de flavanonas e flavanonis no possui

efeitos relatados no espectro UV. Na Figura 11 tem-se o espectro UV-Vis em metanol para as

principais classes de flavonoides. [41]

O

O

A

B

O

O

O

O

OH

A

B

A

B

(a) (b)

(c)

Figura 10 : Esqueleto de uma isoflavona (a); Esqueleto de uma flavanona (b); Esqueleto de uma

flavanonol (c)

1 - Introduo 14

Figura 11: Espectros UV-Vis tpico das classes de flavonoides. a) flavona (acacetina); b) flavonol (quercetina);

c) flavanonol (taxifolina); d) isoflavona (iridina); e) flavanona (pinocembrina).

1 - Introduo 15

1.4 Quimiometria

A quimiometria tem como objetivo a anlise de dados qumicos de natureza

multivariada e pode ser definida como uma disciplina qumica que emprega mtodos

matemticos e estatsticos para planejar ou selecionar experimentos de forma otimizada e para

fornecer o mximo de informao qumica com a anlise dos dados obtidos. [42]

A utilizao de ferramentas quimiomtricas iniciou-se no Brasil na primeira metade da

dcada de 70, mas s se firmou definitivamente com a instalao de computadores nos

laboratrios qumicos. [43]

Os trabalhos que usam Quimiometria podem ser agrupados em trs reas:

planejamento e otimizao de experimentos, reconhecimento de padres (mtodos de anlise

exploratria e classificao) e calibrao multivariada. [43]

A respeito de estudos feitos com a prpolis, a quimiometria empregada

principalmente para a determinao da fonte botnica e origem geogrfica de amostras atravs

da anlise de componentes principais (PCA- do ingls, Principal Component Analysis). [28,

44-47]

1.4.1 A Organizao dos Dados

Os dados obtidos em um experimento devem ser organizados antes de serem

submetidos analise multivariada.

Quando uma determinada amostra (objeto) analisada, os resultados obtidos so as

variveis para determinado objeto. Esses resultados podem ser expressos, por exemplo, em

termos de concentrao, altura do pico, absorbncia, entre outros dados. Os dados so

dispostos em forma de uma matriz X (n x m), em que cada linha representa uma amostra (n) e

as colunas as variveis (m), como pode ser visto na Figura 12. [42, 48]

1 - Introduo 16

Figura 12: Dados organizados em uma matriz X

importante analisar se as variveis so homogneas (mesma unidade de medida), ou

heterogneas (unidades distintas), pois essa informao ajuda na deciso sobre a qual pr-

processamento os dados devem ser submetidos. [48]

1.4.2 Pr-processamento dos Dados

A etapa de pr-processamento dos dados necessria quando os dados experimentais

no tm uma distribuio adequada para a anlise como, por exemplo, so obtidas medidas

em diferentes unidades e variveis com diferentes varincias. Ajustam-se ento as grandezas

de forma que elas tenham valores equivalentes para que todas tenham a mesma importncia

sobre o modelo. [42]

Os mtodos de pr-processamento mais utilizados so:

a) Centrar na mdia: calcula-se a mdia de cada coluna de variveis e

subtrai-se dos seus respectivos valores. Com este tratamento a origem dos

eixos deslocada de forma que os dados passam a ficar distribudos em torno

da origem (Figura 13). No caso de dados espectroscpicos, recomenda-se

centrar os dados na mdia devido ao fato de as medidas apresentarem variveis

com unidades iguais. [42, 48]

1 - Introduo 17

Figura 13: Distribuio de variveis em torno do eixo cartesiano. a) dados originais b) dados centrado na mdia.

FONTE: BRERETON, 2003. [49]

b) Autoescalar: consiste em centrar os dados na mdia e dividi-los pelo respectivo

desvio padro de cada coluna/varivel. Com esse tratamento cada varivel

passa a ter mdia zero e desvio padro igual a 1. O autoescalamento dos dados

recomendado quando os dados esto em escala muito diferentes e se quer

atribuir a mesma significncia a todos. [42, 48]

1.4.3 Reconhecimento de Padres

Os mtodos de reconhecimento de padres podem ser aplicados com diferentes

finalidades, entre elas a anlise exploratria de dados. [43]

A anlise exploratria usada para tentar detectar padres de associao no conjunto

de dados, a partir dos quais se pode estabelecer relaes entre objetos e variveis. Os dois

mtodos de anlise exploratria mais usados so a Anlise de Componentes Principais (PCA)

e a Anlise de Agrupamento Hierrquica (HCA- do ingls, Hierarchical Cluster

Analysis).[42]

A PCA encontra-se entre as mais importantes ferramentas de anlise multivariada,

inclusive por constituir a base na qual se fundamentam a maioria dos outros mtodos

multivariados de anlise de dados. O principal objetivo da PCA reduzir a dimensionalidade

do conjunto de dados, preservando ao mesmo tempo o mximo de informao. Isto feito

calculando-se combinaes lineares das variveis originais. [42]

1 - Introduo 18

A primeira componente principal, PC1, a combinao linear de mxima varincia. A

segunda componente principal, PC2, tambm descreve a mxima varincia restante, porm

ortogonal a PC1. A terceira PC de mxima varincia restante e ortogonal s duas primeiras

PCs, e assim por diante. Como esses eixos so calculados em ordem decrescente de

importncia, muitas vezes a informao relevante fica concentrada nas duas ou trs primeiras

PCs, que podem ser ento examinadas procura de padres. A PCA um mtodo no

supervisionado j, que no se conhece a priori a que classes pertencem os objetos ou pelo

menos essa informao no utilizada na construo do modelo. [43, 50-51]

To importante quanto a determinao do nmero de componentes principais que

devem ser utilizadas para a construo do modelo tambm a identificao dos outliers, que

pode ser feita avaliando o leverage e os resduos de Student. O leverage uma medida da

influncia de uma amostra em comparao com o resto do conjunto de dados e os resduos de

Student uma media da informao da amostra que no foi modelada. As similaridades e

diferenas entre objetos e variveis podem ser vistos atravs de grficos, em que os Escores

ou pesos das PCs so plotados uns contra os outros. [51]

1.4.4 Calibrao Multivariada

A anlise de regresso o mtodo estatstico usado para predizer valores de uma ou

mais variveis respostas (dependentes) a partir de uma coleo de valores de variveis

preditoras (independentes). Uma das tcnicas mais utilizadas para se obter essa correlao a

calibrao multivariada por mnimos quadrados parciais (PLS- do ingls, Partial Least

Squares). [52]

O modelo PLS desenvolvido a partir de um conjunto de calibrao de n amostras,

com k variveis x, representadas por xk (k=1, 2, ...., n) e m variveis y representadas por ym

(1, 2, ..., m). A partir deste conjunto de treinamento so formadas duas matrizes X e Y de

dimenses (n*k) e (n*m). A matriz X formada pelas variveis independentes, ou preditoras,

e a matriz Y formada pelas variveis dependentes. [48, 52]

Nessa tcnica de calibrao multivariada, as matrizes X e Y so decompostas em

matrizes menores de acordo com as Equaes 1.1 e 1.2. [51]

X =TP+E (Equao 1.1)

Y=UQ+F (Equao 1.2)

1 - Introduo 19

onde,

X e Y so as matrizes que sero decompostas

T e U so as matrizes de escores

P a matriz de pesos X,

E contm os erros (resduos) de X,

Q a matriz de pesos Y,

F contm os erros (resduos) de Y.

A Figura 14 mostra como ocorre a decomposio dos dados dos blocos X e Y, em que

p= variveis; h= variveis latentes.

Figura 14: Decomposio dos blocos de dados X e y.

Uma relao linear estabelecida aps a decomposio de X e y, entre os escores t e

u, como pode ser visto na Equao 1.3. [48]

u=bhth (Equao 1.3)

onde,

b o vetor dos coeficientes de regresso

h o nmero de variveis latente usadas no modelo PLS

1 - Introduo 20

Os resduos dos dados, parte da varincia que no explicada no modelo, trazem

informao sobre o sistema. No caso em que se tm grandes valores de resduos em y o

modelo no est bem ajustado, e os resduos em X podem informa quais so as amostras

anmalas (outliers). [48]

O mtodo de Validao Cruzada (CV- do ingls, Cross Validation) o mais utilizado

e consiste na avaliao da magnitude dos erros de previso de um dado modelo de calibrao.

[48, 51]

A validao cruzada tambm utilizada para a escolha do nmero de variveis

latentes que iro descrever o modelo. O nmero de variveis latentes utilizado deve ser aquele

que minimiza a raiz quadrada dos erros mdios quadrados da validao cruzada (RMSECV,

do ingls, Root Mean Square Error Cross Validation), conforme Equao 1.4. [48, 51]

( Equao 1.4)

onde e so, respectivamente, os valores previstos e os de referncia para a propriedade

de interesse, e n o nmero de amostras. Para a deteco de amostras anmalas, utilizam-se os

resduos e os valores de leverage.

Para avaliar a eficincia dos modelos de calibrao, validao e previso utiliza-se o

erro mdio quadrtico (RMSE- do ingls, Root Mean Square Error) e o erro relativo. Esses

valores expressam a veracidade do modelo, ou seja, a proximidade entre o valor calculado

pelo modelo (yprev) e o valor obtido pelo mtodo de referncia (yreal).

Para avaliar a exatido do conjunto de calibrao, utiliza-se o erro mdio quadrtico de

calibrao (RMSEC- do ingls, Root Mean Square Error of Calibration).

(Equao 1.5)

Onde n o nmero de amostras, o nmero de graus de liberdade perdidos, que igual ao

nmero de variveis latentes +1, para dados centrados na mdia. [51]

Para avaliar a exatido do conjunto de previso, utiliza-se o erro mdio quadrtico de

previso (RMSEP- do ingls , Root Mean Square Error of Prediction). [51]

1 - Introduo 21

(Equao 1.6)

1.4.5 Anlise Discriminante por Mnimos Quadrados Parciais PLS-DA

O PLS no foi originalmente designado como uma ferramenta estatstica para anlise

discriminante. Apesar disso, ele tem sido utilizado frequentemente com essa finalidade e tem

mostrado um timo desempenho nesse papel. [53]

O mtodo PLS-DA (do ingls- Partial Least Squares Discriminant Analysis) um

mtodo multivariado, supervisionado (a informao sobre a que classes pertencem os objetos

j est disponvel e usada na construo do modelo), utilizado para classificao de

amostras, no qual feita a reduo de variveis e no est claro se as diferenas entre grupos

iro dominar a variabilidade total das amostras. O vetor y em um modelo PLS-DA indica a

classe ao qual a amostra pertence. Quando se tem duas classes a serem discriminadas utiliza-

se o mtodo PLS1. Neste caso, existe uma varivel dependente, y, que pode assumir valores 0

ou 1. [53]

Para o caso no qual trs ou mais classes esto presentes utiliza-se o mtodo PLS2. A

varivel dependente uma matriz com o nmero de colunas igual ao nmero de classes

assumindo valores iguais a 0 ou 1, que indicam se a amostra pertence ou no classe. Por

exemplo, no caso de existirem quatro classes e a amostra pertence classe 2 , o valor de y

para essa amostra ser y = {0 1 0 0}. Os valores previstos so idealmente os valores zero e

um, mas na prtica os valores aproximam-se destes. [53]

calculado um valor limite (threshold), para o qual os valores acima dele indicam que

a amostra pertence classe modelada e os abaixo que no pertencem classe modelada.

Todos os procedimentos que so usados para selecionar um melhor modelo PLS tambm so

usados para selecionar um melhor modelo PLS-DA. [53]

2 - Objetivos 22

2. OBJETIVOS

Devido importncia farmacolgica e comercial da prpolis nos mercados nacional e

internacional, h a necessidade de constante evoluo dos mtodos analticos de modo a

garantir o cumprimento das normas preconizadas pelo MAPA e, consequentemente, a

qualidade do produto.

Os flavonoides so as principais substncias responsveis pelas atividades biolgicas

da prpolis. Os extratos alcolicos de prpolis que possuem uma maior quantidade dessas

substncias possuem um maior valor econmico e muitas vezes so destinados para o

mercado exterior. Dessa forma, de grande importncia o desenvolvimento de metodologias

para a quantificao dos flavonoides.

Um dos objetivos dessa dissertao utilizar os resultados das anlises que so feitas

em laboratrios de rotina de controle de qualidade dos extratos alcolicos de prpolis para a

construo de um modelo de calibrao multivariada por mnimos quadrados parciais (PLS),

para determinar a concentrao de flavonoides nas amostras. Esse modelo visa diminuir o

tempo de anlise, o custo e tambm a utilizao de reagentes.

Outro objetivo desse trabalho discriminar os extratos alcolicos comerciais de

prpolis quanto ao tipo de flavonoide, utilizando os espectros dos complexos de Al(III) que

so obtidos nas anlises de rotina para a quantificao de flavonoides. A importncia da

determinao dos tipos de flavonoides presentes nas amostras est no fato de alguns deles

apresentarem propriedades biolgicas diferenciadas. Assim, o conhecimento do tipo e

concentrao do flavonoide presente no extrato faz com que ele possa ser destinado a fins

teraputicos especficos, agregando valor ao produto.

3 - Desenvolvimento de um mtodo de calibrao multivariada para quantificao de 23

flavonoides nos extratos comerciais de prpolis

3. DESENVOLVIMENTO DE UM MTODO DE CALIBRAO MULTIVARIADA

PARA QUANTIFICAO DE FLAVONOIDES NOS EXTRATOS COMERCIAIS

DE PRPOLIS

Um dos parmetros avaliados pelo MAPA para controle de qualidade do extrato

comercial de prpolis a concentrao de flavonoides, cujo mnimo exigido de 0,25%

(m/m). O mtodo espectrofotomtrico o mais utilizado para a determinao da concentrao

de flavonoides nos laboratrios de controle de qualidade por ser mais simples, rpido e de

baixo custo.

A quantificao dos flavonoides presentes na prpolis muito importante, pois a essas

substncias so atribudas as diversas propriedades biolgicas presentes na prpolis. Assim,

amostras que possuem uma maior concentrao de flavonoides, possuem maior valor

econmico.

Ultimamente, os espectros na regio do UV-Vis tm sido muito utilizados na

construo de modelos de calibrao multivariada, tanto para a determinao da concentrao

de analitos como de propriedades fsico-qumicas. A utilizao desses modelos de calibrao

multivariada surge como uma alternativa para mtodos que, em geral, so muito laboriosos,

apresentam interferentes, no possuem uma nica varivel seletiva que permita a calibrao

univariada ou que no apresentam boa resoluo do sinal analtico. [51]

Nesse trabalho foram utilizados os espectros de absoro desses extratos em conjunto

com a anlise multivariada para a construo do modelo PLS. A calibrao multivariada

capaz de prever uma determinada propriedade, como a concentrao de flavonoides, a partir

da obteno do espectro na regio do UV-Vis, que no caso da prpolis esto diretamente

relacionados com a presena dessas substncias nas amostras.

3.1 Mtodos Analticos para a Determinao de Flavonoides na Prpolis

O aumento do uso da prpolis e da sua importncia econmica fez com que surgisse a

necessidade do desenvolvimento de tcnicas adequadas para a determinao quantitativa dos

flavonoides. Vrios mtodos tm sido empregados para essa quantificao, mas as mais

utilizadas so as reaes colorimtricas, a cromatografia gasosa e a cromatografia lquida de

alta eficincia (HPLC- do ingls, High Performance Liquid Cromatography).



A HPLC foi utilizada pela primeira vez para a determinao de flavonoides em 1976

por Fisher e Wheaton. Como os extratos de prpolis so solveis em solues etanlicas e

hidroalcolicas, a HPLC com fase reversa se tornou a tcnica cromatogrfica mais utilizada

para a determinao qualitativa e quantitativa dos flavonoides presentes na prpolis. [27, 54]

Como os flavonoides absorvem radiao UV-Vis, o detector de arranjo de diodos

(DAD- do ingls, Diode Array Detector) a forma de deteco mais utilizada. A tcnica

HPLC-DAD tem sido aplicada para a tipificao da prpolis brasileira e tambm para a

identificao dos seus componentes principais. [27, 36]

Alm do DAD, estudos avaliam o emprego de outros tipos de detectores. Segundo

Aaby et. al. [55], detectores eletroqumicos possuem maior sensibilidade, seletividade e

fornecem mais informaes sobre a estrutura dos compostos fenlicos quando comparados

com os espectros obtidos por detectores de arranjo de diodos. Isso ocorre devido ao fato de

que diferentes substituintes ativos eletroquimicamente, em estruturas anlogas, fornecem

caractersticas diferentes no comportamento voltamtrico.

Outro detector utilizado para a quantificao dos flavonoides na prpolis o ESI-MS.

A ionizao por eletrospray (ESI- do ingls, Electrospray Ionization) permite a ionizao

direta e a transferncia das molculas para o espectrmetro de massas (MS-do ingls, Mass

Spectrometry) e tem estendido a aplicabilidade da espectrometria de massas para um maior

nmero de classes de molculas que possuem instabilidade trmica, alta polaridade e alta

massa molecular. Entretanto, a espectrometria de massas mais cara e, normalmente, no

encontrada em laboratrio de anlise de rotina. [29]

Alm de diferentes detectores, relatada na literatura a utilizao de diferentes

condies cromatogrficas para a quantificao de flavonoides, como a utilizao de

diferentes colunas e diferentes fases mveis (Tabela VI), com o objetivo de se obter uma

melhor separao, em um tempo adequado.

3 - Desenvolvimento de um mtodo de calibrao multivariada para quantificao de 25 flavonoides nos extratos comerciais de prpolis

TABELA VI: Condies Cromatogrficas de estudos que utilizaram HPLC para a quantificao dos flavonoides

Tcnica Coluna Fase Mvel Tipo de

Eluio Deteco

Compostos fenlicos

analisados

Faixa

Linear Referncia

HPLC-RP

C18 CLC-ODS

(4,6 mm x 250

mm)

A:(cido actico/acetato de

amnio/metanol/gua

0.8:0.3:5.0:93.9 m/v/v/v) e 25% do

solvente B (acetonitrila), finalizando

com 100% de acetonitrila.

Gradiente DAD - 280

nm

cido cafico, cido cinmico, cido

ferlico, cido cumrico,

isosakuranetina, bacarina, drupanina,

artepillin C.

28,83 533,33

g/mL 56

HPLC-RP

Thermo

C18(4,6mm x 250

mm) partculas de 5m.

Metanol e gua 80:20 Isocrtica DAD - 280

nm Propolins - 57

HPLC-RP

Intersil 5 ODS-2

(4,6 mm x 250

mm)

A: gua e cido actico 95:5, v/ve B:

metanol Gradiente UV -290 nm

cido cafico, cido p-cumrico, cido

ferlico, kaempferol, pinocembrina,

crisina, galangina, pinostrobina,

cafeato de feniletila, cafeato de benzila

e cafeato de isopentila

- 58

HPLC-RP

Capcell Pak ACR 120 C18 ( 2 mm x

250 mm)

partculas de 5m.

A: 0,1% cido frmico e gua e B:

0,08% cido frmico: acetonitrila Gradiente

PAD 195-

650 nm ;

ESI-MS

cido cafico, cido p-cumrico, quercetina, apigenina, kaempferol,

pinobanksina, crisina, pinocembrina,

galangina, tectocrisina, artepillin C,

cido, 3,4-dimetoxicinmico.

- 59

HPLC-RP C18 (4,6 mm x

220 mm)

A: 30 mM NaH2PO4 pH 3 e

acetonitrila Gradiente

DAD- 265,

290, 360 nm

e MS

cido cafico, p- e m-

cumrico,quercetina, kaempferol,

naringenina, crisina, galangina e

pinocembrina

3-80

g/ml 25

HPLC-RP YMC Pack ODS-

A cido actico: metanol: gua

(5:75:60 v/v) Isocrtica

DAD- 254 nm

Quercetina, kaempferol, apigenina,

isorhamnetina, rhamnetina, pinocembrina, sakuranetina, crisina,

acacetina, galangina, kaempferide, e

tectocrisina

- 60



Apesar dos mtodos de quantificao dos flavonoides na prpolis por HPLC

mostrarem bons resultados, eles no so os mais utilizados para controle de qualidade por

requererem instrumentos avanados, padres autenticados e demandarem mais tempo de

anlise.

O desenvolvimento da cromatografia gasosa (GC- do ingls, Gas Chromatography)

precedeu o primeiro uso do moderno HPLC. A anlise de derivados de flavonoides por CG

foi reportada na dcada de 60. Isso permitiu estudos para a determinao de flavonoides em

bebidas em 1973, usando colunas de vidro recheadas com VYDAC. [38]

A anlise dos flavonoides por GC, normalmente envolve trs etapas distintas: extrao

da amostra, derivatizao e anlise GC. [29,38]

Devido ao fato da cromatografia gasosa se limitar a compostos volteis que possuem

estabilidade trmica na temperatura de operao, h uma preferncia pelos pesquisadores na

utilizao do HPLC, o que tem refletido em um crescente nmero de publicaes relatando a

investigao de flavonoides por essa tcnica. Apesar da tendncia da utilizao do HPLC para

esse fim, estudos mostram que em termos gerais h uma melhor separao dos componentes

por GC. [29,38]

Alm disso, a quantificao de flavonoides por HPLC pode ser problemtica devido a

alguns fatores como sinal de rudos muito alto devido a impurezas na amostra, alargamento

dos picos (que reduz a eficincia) tanto com a utilizao dos modos isocrtico e gradiente.

Tambm pode ser observada adsoro competitiva entre componentes, o que negligencivel

por GC. [38]

Para a determinao dos flavonoides na prpolis muito utilizada a cromatografia

gasosa acoplada com o espectrmetro de massas. A espectrometria de massas (MS) permite a

aquisio da massa molecular e tambm de informaes estruturais, sendo usada tanto pra fins

qualitativos, quanto quantitativos. Entretanto, a prpolis contm alguns componentes que no

so suficientemente volteis para anlise direta por GC-MS, e necessita da utilizao da

derivatizao ou de outras tcnicas como a cromatografia gasosa de alta resoluo (HT-

HRGC- do ingls, High-Temperature High-Resolution Gas Chromatography). A Tabela VII

apresenta alguns trabalhos que utilizaram a GC para a determinao dos flavonoides na

prpolis, alguns tipos de colunas e os flavonoides analisados. [29]



Tabela VII: Resumo de alguns trabalhos que utilizaram CG para a quantificao dos flavonoides

Coluna Flavonoides analisados Referncia

0,25 mm x 9 m I.D. de

slica fundida com fase

estacionria SE-54

Pinocembrina e Galangina 61

0,25 mm x 25 m HP-1

capilar de metil-silicone

cido cinmico, pinobanksina, pinocembrina,

pinobanksina 3-acetato, cido 1,1-dimetil

cafico,crisina, galangina, pinocembrina 7-metil

ter, crisina 7-metil ter, e galangina 7-metil ter

62

0,25 mm x 23 m HP5-MS

coluna capilar

Pinostrobina, pinocembrina,benzilferulato,

galangina, crisina, feniletilcafeatoekaempferol 63

0,20 mm x 17 m HP5-MS

coluna capilar 5%

fenilmetilpolisiloxano

Isoflavonoides 64

No geral, a cromatografia gasosa no utilizada para a determinao quantitativa dos

flavonoides presentes na amostra de prpolis, mas mostra-se muito eficiente na identificao

dos compostos nessa substncia to complexa.

As tcnicas espectrofotomtricas so muito utilizadas para controle de qualidade

devido sua rapidez e baixo custo. [29, 58]

Apesar dos mtodos cromatogrficos serem mais exatos e precisos na identificao e

quantificao dos flavonoides, esses mtodos exigem pessoas altamente qualificadas para a

operao, materiais e equipamentos caros. Alm disso, os mtodos cromatogrficos limitam-

se quantificao dos compostos majoritrios e estudos mostram que a quantificao dos

componentes ativos em grupos com a mesma estrutura qumica ou similar correlaciona-se

melhor com a atividade biolgica, o que torna os mtodos espectrofotomtricos ainda mais

vantajosos. [29, 57;58]

O mtodo espectrofotomtrico para a quantificao de flavonoides na prpolis

baseado na formao de um complexo entre o Al(III) e os grupos carbonila e hidroxila dos

flavonoides. (Figura 15). Na presena do Al(III) observado um deslocamento batocrmico

nas bandas I e II do espectro do flavonoide, e tambm um aumento da absoro. Dessa

forma, possvel quantificar os flavonoides, evitando-se a interferncia de outras substncias



fenlicas, principalmente os cidos fenlicos. Esse comportamento observado para todos os

flavonoides que possuem grupos 5-hidroxi-4-ceto, 3-hidroxi-4-ceto e/ou o-dihidroxi,

sugerindo que esses grupos so importantes para a formao do complexo. O deslocamento

batocrmico causado pelo aumento do efeito conjugativo quando os complexos so

formados, surgindo um novo anel. A amostra, metanol e o Al(III) so misturados e reagem

por 30 minutos. As leituras de absorbncia so feitas em torno de 425 nm. Para a construo

da curva analtica o flavonoide mais utilizado a quercetina. [29, 33, 41]

Figura 15: Reao de formao do complexo entre os flavonoides e Al(III)

Segundo Marcucci et. al. [35], o uso do cloreto de alumnio foi primeiramente

empregado para a identificao de antocianinas. Ainda segundo Marcucci, em 1954 Harbone

sugeriu o uso do cloreto de alumnio para a determinao espectrofotomtrica de certos

subgrupos dos flavonoides, o qual tambm passou a ser usado como um reagente de desvios

(shift reagent) em espectroscopia UV-Vis para a determinao estrutural de flavonoides.

Apesar de ser uma tcnica barata, rpida, de fcil execuo e precisa, ela pouco

exata. Normalmente os valores so subestimados. De acordo com Marghitas et. al. [65], isso

se deve ao fato de o cloreto de alumnio reagir melhor com os flavonoides do grupo das

flavonas e flavonis. Dessa forma, o valor medido e o valor real so tanto mais prximos

quanto maior a proporo de flavonas e flavonis nas amostras analisada. [35, 65]

Chang et. al. [66] propuseram que em conjunto com a tcnica da utilizao do cloreto

de alumnio, tambm seja empregado o mtodo espectrofotomtrico baseado na complexao

dos flavonoides com a 2-4-dinitrofenilhidrazina (DNP). As flavanonas e flavanonis

interagem com o DNP em meio cido para formar fenilhidrazonas coloridas. A absorbncia



medida em 486 nm. As curvas analticas so obtidas utilizando principalmente a

pinocembrina como padro. Vrios estudos mostram que a soma dos flavonoides

determinados pelo mtodo do cloreto de alumnio e o DNP representam melhor o real

contedo de flavonoides na prpolis. A Tabela VIII sumariza vrios estudos que utilizaram o

mtodo espectrofotomtrico para a determinao de flavonoides na prpolis. [57,65-67]


TABELA VIII: Resumos de alguns trabalhos que utilizaram a espectrofotometria para a quantificao dos flavonoides.

Substncia de

referncia Complexante Faixa de trabalho Solvente Tampo Referncia

Propolina C e Propolina

D 4:1. DNP 486 nm 0.4842.017 mg/mL Metanol - 57

Galangina e

Pinocembrina

AlCl3(galangina) ;

DNP

(pinocembrina)

Galangina (425

nm);

Pinocembrina

(486 nm)

4-40 g/ml (galangina); 0,14-1mg/ml

(pinocembrina)

Metanol - 65

Quercetina AlCl3 425 nm 04-12 g/ml Etanol - 11

Quercetina Al(NO3)3 415 nm - Etanol 80

% (m/v)

Acetato de

potssio 68

Quercetina e

Naringenina

AlCl3(quercetina) ;

DNP (naringenina)

Quercetina (415

nm);

Naringenina

(495 nm)

0-100 g/ml (quercetina); 500-2000 g/ml

(naringenina)

Etanol

95%

(m/v)

Acetato de

potssio 66

Quercetina e

Naringenina

AlCl3(quercetina) ;

DNP (naringenina)

Quercetina (415

nm);

Naringenina

(495 nm)

25-100 g/ml (quercetina); 500-2000 g/ml

(naringenina)

Etanol

95%

(m/v)

Acetato de

potssio 67

Galangina e

Pinocembrina

AlCl3(galangina) ;

DNP

(pinocembrina)

Galangina (425

nm);

Pinocembrina

(486 nm)

432 g/mL (galangina); 0.181.8 mg/mL

(pinocembrina) ; 37326 g/mL (galangina e pinocembrina 2:1)

Metanol - 58


Quercetina AlCl3 425 nm 5-40 g/ml Metanol - 70


Quercetina AlCl3 425 nm - Metanol - 72


3.2 Materiais e Mtodos

3.2.1 Amostras

Foram estudadas 97 amostras de extratos alcolicos de prpolis de diferentes origens,

adquiridas no comrcio ou doadas pelos produtores. As amostras foram nomeadas como

comum (C) e verde (V), de acordo com as informaes no rtulo. Aquelas que no tinham

informao sobre o tipo na embalagem foram classificadas como comum. Antes de serem

submetidas anlise, uma alquota das amostras foi centrifugada a 3000 rpm por 5 minutos.

Algumas amostras apresentaram formao de corpo de fundo. Somente o sobrenadante dessas

amostras foi utilizado para a quantificao.

3.2.2 Reagentes

Para o preparo das solues da metodologia colorimtrica para a quantificao dos

flavonoides, utilizou-se metanol PA da marca Synth, Al(NO3)3.9H2O da Sigma-Aldrich e

CH3COOLi da marca VETEC.

Para a construo da curva de calibrao foi utilizada quercetina da marca Sigma-

Aldrich.

Para o preparo das solues para obteno dos espectros eletrnicos das amostras, foi

utilizado etanol 95%(v/v) da marca Synth.

Nos estudos cromatogrficos os seguintes padres de flavonoides e cidos fenlicos

foram investigados: cido p-cumrico, quercetina, pinocembrina, crisina, cido cinmico,

cido ferlico, kaempferol, acacetina, naringenina e galangina, todos da Sigma-Aldrich e de

grau cromatogrfico. Para o preparo a diluio das amostras e preparo das solues dos

padres foi utilizado metanol de grau cromatogrfico da marca J. T. Baker. Para o preparo das

fases mveis, alm do metanol, foi utilizado 2-propanol da J. T. Baker, acetonitrila da marca

CRQ e cido actico da marca VETEC. Para diluio dos extratos de prpolis utilizou-se

etanol VETEC de grau HPLC.

3.2.3 Metodologia: mtodo espectrofotomtrico

No ensaio de quantificao de flavonoides pelo mtodo espectrofotomtrico uma

alquota de 25 L da amostra foi transferida para um balo volumtrico de 25 mL. Em


seguida, adicionou-se 500 L de uma soluo de acetato de ltio 0,1 mol L-1. Por ltimo,

adicionou-se 100 L de uma soluo de nitrato de alumnio 10% m/v. O volume do balo foi

completado com metanol. Na Figura 16 podem-se observar o aspecto das solues

preparadas.

Figura 16: Solues obtidas da complexao do Al(III) com os flavonoides presentes nas amostras de prpolis

Aps uma hora, realizou-se a leitura da absorbncia das solues. Os espectros UV-

Vis foram obtidos no espectrofotmetro Hewlett-Packard, modelo 8451A, em cubetas de

quartzo de 0,5 cm de caminho tico, com varredura de 190 a 500 nm, com incrementos de

2 nm.

Os ensaios foram realizados em quintuplicata para cada amostra, e as leituras das

absorbncias foram feitas em triplicata para cada soluo.

A curva analtica foi construda utilizando soluo estoque de quercetina

500 g mL-1 em metanol.

Para a obteno dos espectros eletrnicos das amostras foram preparadas solues

contendo 20 L de amostra, completando-se o volume do balo volumtrico (25,00 mL) com


etanol 95% (v/v). Os espectros foram obtidos em cubeta de quartzo de 2 mm de caminho

tico, com varredura de 190 a 500 nm e incrementos de 2 nm. Os ensaios tambm foram

realizados em quintuplicata para cada amostra (replicatas independentes), e as leituras das

absorbncias de cada soluo foram tambm feitas em triplicata.

3.2.4 Metodologia: mtodo cromatogrfico

Para a anlise cromatogrfica foram separadas 40 amostras. As amostras foram

diludas 80 vezes em etanol 75% (m/v) e filtradas em filtro de seringa Milipore de 0,21 m de

poro antes da injeo no HPLC.

Para a construo das curvas analtica preparou-se solues estoque de 1000 g/mL.

Em seguida, uma mistura contendo os 11 padres foi preparada, diluindo-se adequadamente

os padres de forma a obter uma curva com 16 nveis de concentrao na faixa de 0,19 a

50,40 g mL-1. A curva foi obtida plotando-se a rea integrada do pico do composto em

funo da sua concentrao na soluo.

As solues das amostras e dos padres foram injetadas em um cromatgrafo lquido

de alta eficincia Shimadzu com detector de arranjo de diodos (SPD-M20A) e coluna

cromatogrfica Kinetex Phenomenex C18, com partculas de 2,6 m, 150 mm de

comprimento e 4,6 mm de dimetro. Foram empregadas quatro fases mveis, a Fase A

consistiu de uma soluo aquosa 5% de cido actico, a Fase B consistiu em uma soluo

30:5:70:1 de gua, 2-propanol, metanol e cido actico, na Fase C utilizou-se como eluente o

metanol e na Fase D empregou-se uma soluo 20:20:30:30:2 de gua, 2-propanol,

acetonitrila, metanol e cido actico.

3.2.5 Tratamento Estatstico dos Resultados

Determinou-se o intervalo de confiana dos resultados obtidos pela metodologia

colorimtrica para um nvel de confiana de 95%, utilizando a Equao 3.1.

(Equao 3.1)

em que :


= mdia dos valores obtidos pra amostra

s = desvio padro

t = valor do teste t de Student

Para a identificao de amostras anmalas foi utilizado o teste de Grubbs para

confiana de 95%, utilizando a Equao 3.2.

| |

(Equao 3.2)

onde,

= mdia dos valores obtidos pra amostra

s = desvio padro

Para comparar os resultados obtidos pelo mtodo espectrofotomtrico e pelo mtodo

cromatogrfico utilizou-se o teste t pareado para 95% de confiana.

(Equao 3.3)

Onde,

( )

(Equao 3.4)

em que,

= diferena mdia entre os mtodos A e B

n = nmero de amostras

di = diferena entre os resultados obtidos com os mtodos A e B

3.2.6 Anlise Quimiomtrica

O programa Mathlab R2009b e o pacote PLS_Toolbox-522 foram usados para o

tratamento quimiomtrico dos dados obtidos.


O modelo PLS foi construdo utilizando as concentraes de flavonoides nas amostras

e os espectros eletrnicos das amostras diludas em etanol 95% (v/v).

Os espectros eletrnicos tiveram a linha base corrigida utilizando a funo baseline.

As amostras foram separadas em um conjunto de calibrao e outro de validao. Para

realizar essa separao utilizou-se o algoritmo de Kennard-Stone [73], sendo que 2/3 das

amostras foram utilizadas para a calibrao (60 amostras) e 1/3 para a validao (30 amostras)

do modelo PLS. Sete amostras no foram utilizadas na construo do modelo, trs foram

separadas para os ensaios de avaliao da preciso e as outras quatro amostras apresentaram

distores em seu espectro eletrnico, o que foi verificado visualmente.

O pr-processamento utilizado foi centrar os dados na mdia, pois as variveis para a

construo do modelo quimiomtrico correspondem aos comprimentos de onda obtidos no

espectro UV-Vis e possuem, portanto, unidades equivalentes. O mtodo de validao cruzada

utilizado foi o dos blocos contnuos (do ingls, Contiguous Blocks) que o mais utilizado

quando se tem um conjunto de dados com mais de 20 amostras.

Para a verificao de possveis outliers foi utilizada uma rotina proposta por Braga em

que as amostras consideradas anmalas no foram utilizadas na construo do modelo. [74]

3.3 Resultados e Discusso

3.3.1 Mtodo espectrofotomtrico ajuste das condies experimentais

Na literatura no h condies uniformes, sendo utilizados diferentes mtodos para a

determinao dos flavonoides totais. Um grande nmero de mtodos descrito (Tabela VIII)

em que so utilizados diferentes solventes, concentrao de amostra e reagentes. Alm disso,

a maior parte dos estudos avalia a concentrao de flavonoides na prpolis bruta, em que os

extratos so preparados e tem-se conhecimento da concentrao da soluo da amostra

utilizada [75]. Dessa forma, primeiramente realizou-se um ajuste das condies experimentais

do mtodo espectrofotomtrico para adequar sua aplicao para amostras de extratos

alcolicos de prpolis comercias.

Para avaliar qual o volume de amostra deveria ser utilizado nas anlises selecionaram-

se 19 amostras de extrato alcolico de prpolis com teores de extrato seco variados

(Tabela IX). O teor de extrato seco o resduo obtido aps a secagem de um volume

conhecido de extrato de prpolis. Alguns estudos mostram que o teor de extrato seco pode


estar ligado presena de seus compostos bioativos, por isso utilizou-se esse parmetro

fsico-qumico para realizar a triagem das amostras que seriam utilizadas. [4;5, 24]

Prepararam-se solues adicionando 25 e 50 L de amostra e 100 L de nitrato de

alumnio 10% (m/v) em bales volumtricos de 25,00 mL, completando-se o volume com

etanol 95% e metanol. Aps uma hora obtiveram-se os espectros das solues. Na Figura 17

apresentado um esquema para melhor entendimento dos procedimentos realizados.

TABELA IX: Amostras selecionadas para avaliao do volume a ser utilizado nos ensaios

Teor de Extrato Seco % m/v Amostras Selecionadas

0-5 C10; C14; C48; C73

5-10 C27; C59; C64; C83

10-15 C85; C89; V20; V33

15-20 C75; V5; V6; V13

>40 V17; V24; V31

Figura 17: Esquema da metodologia utilizada para avaliar qual volume de amostra deveria ser usado

Algumas amostras apresentaram absorbncia maior que 1,0 quando se adicionou o

volume de 50 L. Para absorbncias maiores que 1,0 o espectro comea a apresentar

distores nas bandas, portanto optou-se pela a utilizao do volume de 25 L nos ensaios.


Uma controvrsia observada na literatura sobre o uso ou no do acetato de potssio.

Segundo Malesev [33], os flavonoides so cidos fracos que tendem a estar protonados.

Assim, o pH tem impacto considervel na formao dos complexos. Segundo Dowd [76], os

complexos entre os flavonoides e o alumnio se formam mais eficientemente em pH 4,0,

como pode ser observado na Figura 18.

Figura 18: Dependncia da absorbncia do complexo alumnio-quercetina em diferentes pH e em diferentes

nveis de fora inica.

FONTE: L.E. Dowd, 1959 [76]

Na maioria dos trabalhos que utilizam o tampo, o reagente o acetato de potssio,

mas observou-se que sua solubilizao muito difcil tanto em etanol quanto em metanol.

Assim, foi testado o uso do acetato de ltio, que se mostrou mais solvel nos dois solventes.

Em seguida, avaliou-se a influncia da presena ou no do acetato de ltio e sua concentrao


mais adequada. Para isso, fixou-se o volume de nitrato de alumnio adicionado no balo

volumtrico de 25,00 mL em 100 L e variou-se a concentrao de acetato de ltio no balo,

sendo as concentraes utilizadas 0, 2, 4, 6, 8 e 10 mmol L-1

. Esse teste foi realizado com trs

amostras de extrato alcolico de prpolis (C15, C63 e C99), e com o padro quercetina. A

Figura 19 apresenta um esquema para melhor entendimento dos ensaios realizados e a

Figura 20 apresenta os espectros de uma amostra de extrato alcolico de prpolis em

diferentes concentraes de acetato de ltio.

Figura 19: Esquema da metodologia utilizada para avaliar qual a melhor concentrao de acetato de ltio

Figura 20: Espectro obtidos para a avaliao da concentrao de acetato de lto para uma amostra de prpolis


Na literatura a concentrao de acetato utilizada de 20 mmol L-1

,

Avaliação Da Concentração e Dos Tipos de Flavonoides Na

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