Avaliação da diversidade microbiana

Amostragem, processamento e detecção

Técnicas tradicionais

Dificuldades na avaliação (aula anterior):

• Falta de recursos humanos capacitados• Amplitude da diversidade• Erosão da diversidade• Falta de metodologias

Porquê avaliar?

•Assegurar que microrganismos desempenhem processos

necessários a produtividade e sustentabilidade.

•Assegurar que pelo menos alguns microrganismos sejam

tolerantes a estresses.

   

• Amostragem

• Processamento

• Detecção e avaliação:

- Técnicas Fenotípicas

- Técnicas Imunológicas

- Técnicas Moleculares

• Etapa crítica

• São usados equipamentos especializados

• Devem ser considerados os seguintes fatores:

- Representatividade

- Não alterar os números e as atividades

- Evitar a introdução de contaminantes

- Estocar em condições adequadas

• Utilizar amostras compostas em ambientes com

distribuição heterogênea

• Determinar o número mínimo de amostras:

Os limites de confiança e extrapolações devem ser determinadas estatisticamente.

Como minimizar o problema da representatividade

Estratégias de amostragem

Acesso - direto

Número de microrganismos - Baixo

Equipamentos

Processamento (acoplado) - Concentração em filtros

O Ar é um meio restritivo para

os microrganismo

s (*)

(*) Apesar de restritivo transmite inúmeros agentes patogênicos

Amostragemno

Os microrganismos alcançam o ar através dos aerossóis

Depende do tipo de microrganismo, partículas e fase gasosa

Diferente de outros ambientes, no ar os microrganismos não se multiplicam

Morte dos microrganismos no ar:

dN/dt = -k.N ou ln(N/No) = -k.t

k - coeficiente de inativação (velocidade específica de morte)

Depende do tipo de microrganismo e das condições ambientais

Fatores ambientais:Umidade relativa

Temperatura

Radiação (pigmentação, reparo do DNA)

Radicais de O2

Íons

Amostragem do ar

2. Simulação respiratória

(tamanho partícula 0,8 – 15 μm; velocidade do ar)

3. Colisão - Captura em líquido. Ex: AG-30

1. Impacto - deposição em superfícies sólidas. Ex: coletor de Andersen

4. Centrifugação

5. Filtração

6. Deposição - Coleta passiva

Amostrador de Andersen

Simulação respiratória

Placas após incubação

Ágar Sangue

Ágar Dextrose

Impacto em líquido: AG-30

Equipamentos para amostragem do ar:

Amostragem passivaApenas microrganismos que caem nas placas

Amostragem ativaRecuperação forçada usando um volume determinado

Método usado nas estações espaciais(Dados NASA)

Importância Aeromicrobiologia extramuro:

Dispersão de patógenos e toxinas (botulínica, estafilocócica, LPS)

Fitopatógenos (ferrugem)

Doenças pulmonares e gastro-intestinais de animais

Despejo de resíduos (sólidos e líquidos)

Guerra biológica

Aeromicrobiologia intramuro:

Edifícios (doenças dos Legionários-Legionella

pneumophila, bactéria aquática disseminada

pelos aparelhos de ar condicionado e água potável)

Viagens de avião

Saúde pública - gripes

Acesso - Direto ou remoto

Números - elevados ou baixos

Equipamentos -Recipientes, filtros, ROV

Processamento - diluição ou concentração

Amostragemna

Depende do nível de matéria orgânica

Equipamentos

• ROV (Veículo operado de forma remota) usados nas águas hidrotermais (Yellowstone Park)

• Águas termais são difíceis de amostrar convencionalmente

Robô controlado remotamente abre o recipiente no local de amostragem para não ocorrer contaminação com microrganismos de outras profundidades.

Acesso - Remoto

Número de microrganismos - elevado

Equipamentos - observatórios, sondas

Processamento - diluição

Amostragemem

Microbiota dos sedimentos

Cowen, 2004

Existem observatórios penetrando 300 m nos sedimentos e crostas

Um método efetivo de acesso ao sedimento enterrado é através de observatórios.

Controle da pressão da amostra.

Baixa abundância (biomassa), porém microrganismos sempre presentes.

Ventarolas marinhas

Uso de sondas fluorescentes específicas para rRNA de Archaea e Bacteria e C radioativo para detectar atividade na crosta basáltica oceânica.

Fisk et al., 1998.

Sedimentos:

• Elevada diversidade de Bacteria e Archaea

• 180 reações metabólicas envolvendo N, S e C inorgânico, metais e minerais assim como compostos orgânicos

• Existência de diversos micro-nichos

Acesso - direto

Números de microrganismos – normalmente elevado

Equipamentos - trados, pás

Processamento - diluição

Amostragemno

Problemas:

solo

Distribuição dos microrganismos em

agrupamentos 1-5 g solo

Elevada variabilidade entre amostras

Estatística

Solo propriamente dito

Elevada população devido a riqueza nutricional da rizosfera. BIOMASSA - 1010 /g

Características:

1. Micro colônias (interação ativa dentro das populações)

2. Populações com elevadas velocidades crescimento

3. Modificações ambientais locais

4. Troca genética

Elevada diversidade governada pela Lei do Mínimo de Liebig.

Subsolo

BIOMASSA - 107/g

Distribuição não homogênea

Alguns números sobre a estrutura do solo

Microrganismos no solo

Em cada grama de solo tipicamente franco

• 2,8 X 105 m2 - dimensões continentais para microrganismos• > 1X 1010 células viáveis• > 4 X103 espécies• < 0,1% são cultivadas in vitro

• Maioria dos grupos são conhecidos apenas por informações de sequenciamento de DNA

• Poucos membros cultivados pertencem a ordens conhecidas

Maioria diversidade é desconhecida!

• Macrofauna e flora são relativamente fáceis de identificar e expressar

usando riqueza específica e outros índices.

• Mas as estimativas da diversidade microbiana são difíceis:• heterogeneidade, grupos difíceis de cultivar em meio de cultura • Estratégias

•FAME (ésteres metílicos de ácidos graxos)•CHO (carboidratos)•Técnicas moleculares usando PCR •Sorologia

Solo

Populações - 107 /g

Importantes patogênicos para

homem

Amostragemno

Cerca de 40 % da água consumida pelo homem provem de fontes subterrâneas

Existem gradientes nestas regiões que causam a movimentação dos microrganismos, como quando a água é movimentada em grandes volumes.

Vírus, bactérias e protozoários tem diferentes dimensões, metabolismos, mecanismos de sobrevivência e mecanismos de transporte diferenciados.

Estudo da diversidade da microbiota da subsuperficie é muito complexa.

Microbiota do subsolo

Pesquisada nas últimas décadas (dificuldades de amostragem)

Inúmeros aeróbios

oligotróficos: 103-107/gAnálise comunidades: Archaea e Bacteria

Como vivem?

Quimioautotróficos e Quimiolitotróficos

Metanogênicas

(CO2) CH4

Acetogênicas

(HCO3-) acetato

Bactérias redutoras de sulfatos (BRS)

(SO4-2) gás sulfídrico

A 3,4 Km abaixo da superfície

Possibilidades:

1. Foram incorporados nos sedimentos durante a formação das rochas há milhões de anos e sobrevivem em condições nutricionais de “dieta mínima”.

2. Infiltraram com as águas subterrâneas a partir de águas de superfície.

3. Crescem lentamente a partir de fontes de energia inorgânicas fornecendo carbono orgânico para outros microrganismos na matriz rochosa.

1-10 microrganismos por g de rocha (109/ g de solo rizosférico)

Densidade das comunidades é desconhecida:

- Metabolismo microbiano é lento (dificuldade distinguir viável de

inviável)

- Células inviáveis são fonte nutricional para células viáveis (baixo

movimento de água e nutrientes)

- Difícil reproduzir as condições das profundezas em laboratório

- Recentemente 9000 estirpes do subsolo foram catalogadas.

- Peso dos microrganismos subterrâneos pode ser equivalente aos da superfície.

Subsolo

Plantas - seiva, filosfera, tecidos

Animais - sangue, dentes, excrementos, secreções

Não destrutivas

Amostras

Processamento

Concentração - centrifugação e passagem por filtros

Diluição - diluições seriadas

Problemas:Porosidade dos filtrosComposição química

Problemas:Composição do

diluenteTempo de misturaGrau de agitação

Muito raramente as populações microbianas ocorrem em

concentrações apropriadas para

a contagem.

Enriquecimento

Enriquecimento

Para microrganismos que metabolizam uma substância particular ou que ocorrem em baixas populações na amostra.

Desenvolvido por Beijerinck

Consiste na promoção de condições favoráveis específicas para o crescimento de um tipo particular de microrganismo.

Ex 1: para isolar um fixador de nitrogênio o meio de enriquecimento não poderá conter uma fonte de nitrogênio.

Ex 2: bactéria que degrada naftaleno deve-se cultivar a amostra em um meio cuja única fonte de carbono é o naftaleno.

Ex 3: coluna de Winogradsky - enriquecimento de quimiolitotróficos.

Ex 4: Para isolar Bacillus formadoras de esporos deve-se aquecer a cultura

Detecção dos microrganismos

Métodos:

Fenotípicos - baseados no cultivo ou avaliação de certas

propriedades do microrganismos

Imunológicos – baseados nas características sorológicas

Moleculares - baseados na constituição genotípica

FenotípicosMétodos baratos e não requeremtreinamento diferenciado

Cultivo em meio de cultura

Detectar grupos que usam determinada substância ou fonte energética e que vivem em determinadas condições físico-químicas.

Isolamento cultura pura identificação

Ex: Geobacter metallireducens

CH3COO - + 8Fe3+ + 4H2O 2HCO3- + 8Fe 2++ 9H+

Utilizar acetato como única fonte de C permite a detecção de microrganismos que usam ferro como fonte de energia

Avaliação da abundância

Enumeração

Biomassa

Atividade

Contagem direta

Contagem indireta

Contagem direta

Lâmina Petroff-Hauser ao microscópio

Fluorescência, anticorpos

Vantagens:

Não requerem separação do microrganismo.

Fornecem estimativas elevadas

Desvantagens:

Ás vezes distingue entre viáveis e não viáveis.

Não permite análises subsequentes

Lâminas para contagem direta

Contagem indireta

Contagem em placas NMP

Técnica de Diluição e plaqueamento

Diluição seriada

Plaqueamento

Amplificação sinal fenotípico

colônias

Diluições seriadas (resultado)

Enumeração NMP

NMP – número mais provável

Contagem indireta

Vantagens:

- detecção de viáveis

- seletividade (uso de meios específicos)

Desvantagens:

- permite a contagem de somente alguns tipos

- Ausência dos não cultiváveis

• Bioluminescência: detecta ATP residual

• Impedância/condutância: microrganismos alteram a corrente

elétrica.

Avaliação da biomassaParâmetro importante porque avalia os recursos energéticos disponíveis para a comunidade.

Expresso em gramas e pode-se converter em energia: 4,9 Kcal/g peso seco

Baseia-se no fato de existir uma correlação direta entre a abundância de um microrganismo com alguma substância característica.

Proteína

Peptideoglicano

Quitina

LPS

DNA

Dentre outros

Indireta

DiretaFiltração

CentrifuçãoPesagem

Avaliação da atividade

Fotossíntese – taxa de produção primária

Respiração - consumo de O2 ou produção de CO2

Potencial heterotrófico - taxa de absorção de substâncias marcadas com radioisótopos

Atividade enzimática - lacase, celulase, nitrogenase, amilase ...

Viáveis mas não cultiváveis (VNC)

Os microrganismos que não são cultiváveis, mas são viáveis, se denominam VNC e requerem técnicas apropriadas para sua detecção.

Ex: Fungos micorrízicos vesículo-arbusculares.

Outras técnicas fenotípicas

MARA - multiple antibiotic resistance activity

CSU - carbon source utilization

Detecção de hospedeiros de vírus

FAME - Fatty acids methyl ester analysis

Perfil lipídico - FAME

Tem sido usado no estudo da diversidade microbiana em sistemas de tratamento de esgoto, em solos contaminados e biofilmes de sistemas de distribuição de água.

Existe variabilidade no perfil da composição e proporção de ácidos graxos das membranas, os quais podem ser comparados com dados catalogados.

Após comparação, identifica-se os microrganismos desconhecidos.

Detecção com corantes vitais e fluorescência

População mista de Micrococcus luteus e Bacillus cereus com células vivas em verde.Corantes DAPI , fluoresceina e vermelho Texas.

Corantes ácidos de núcleo: DAPI e verde SYTOX. Células danificadas exibem fluorescência verde.