AVALIAÇÃO DA HISTÓRIA EVOLUTIVA DO GENE HLA-G POR …§ão_Kaisson.pdf · 2 UNIVERSIDADE FEDERAL...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO AVALIAÇÃO DA HISTÓRIA EVOLUTIVA DO GENE HLA-G POR MEIO DE POLIMORFISMOS DE BASE ÚNICA E DA INSERÇÃO ALUYHG Aluno: Kaisson Ernane dos Santos Orientador: Prof. Dr. Erick da Cruz Castelli Goiânia, outubro de 2013.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
AVALIAÇÃO DA HISTÓRIA EVOLUTIVA DO GENE HLA-G POR MEIO DE
POLIMORFISMOS DE BASE ÚNICA E DA INSERÇÃO ALUYHG
Aluno: Kaisson Ernane dos Santos
Orientador: Prof. Dr. Erick da Cruz Castelli
Goiânia, outubro de 2013.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
AVALIAÇÃO DA HISTÓRIA EVOLUTIVA DO GENE HLA-G POR MEIO DE
POLIMORFISMOS DE BASE ÚNICA E DA INSERÇÃO ALUYHG
Aluno: Kaisson Ernane dos Santos
Orientador: Prof. Dr. Erick da Cruz Castelli
Goiânia, outubro de 2013.
Dissertação de Mestrado realizada sob a orientação
do Prof. Dr. Erick da Cruz Castelli, apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Biologia (área de
concentração Biologia Celular e Molecular) como
pré-requisito para a obtenção do título de Mestre em
Biologia.
3
os meus pais, José Carlos e
Liramênia, e ao meu irmão,
Kleisson, dedico...
A
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rocure ser um homem de valor,
em vez de ser um homem de
sucesso.
Albert Einstein
P
5
Agradeço a Deus pela dádiva da vida. Aos meus pais pelo amor
incondicional e pela educação que recebi: à minha mãe que
por várias vezes se privou do próprio conforto para poder agradar seus filhos, que
sempre estava aqui quando mais precisei, com quem sempre contei em todos os
momentos da minha vida, e que sempre foi exemplo de dedicação à família; a meu
pai, que com seu jeito alegre e extrovertido, mas responsável ao extremo, dedicado
ao bem estar dos outros e quase nunca ao seu próprio, nunca nos deixou faltar
nada, nos ofertando as oportunidades que a vida não lhe deu, projetando em seus
filhos aquilo que gostaria de ter tido. A eles que são o meu exemplo do que “quero
ser quando crescer”.
A meu irmão que por várias vezes deixou de fazer suas próprias vontades
para permitir que eu estudasse ou tivesse algum privilégio. Muito obrigado pela
compreensão.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Erick da Cruz Castelli, pela oportunidade de
ingressar na pós-graduação, pelo voto de confiança que me deu ao me ofertar uma
carta de orientação, pelo exemplo em pesquisa e pela paciência durante a sua
orientação. Espero ter correspondido às expectativas em mim depositadas.
Aos meus avós por todo o incentivo, apoio, suporte, energia positiva e por
representarem meu porto seguro.
Ao meu tio Nelson que foi, de longe, o maior incentivador da realização da
minha pós-graduação e a quem considero como o grande exemplo de vida e luta
profissional e familiar.
A minha melhor amiga, antes de tudo, Natália pelo incentivo, apoio e bondade
durante os últimos 7 anos.
Aos meus queridos amigos de laboratório: Amanda, Andréia, Athamy, Iane,
Denise, Karla, Lais, Leandro, Lya, Mariana, Moisés, Pedro, Thállita e Thiago pelo
convívio, pelo auxílio na bancada, pelos momentos de descontração e de ‘nerdices’
e por ajudar a fazer do laboratório uma extensão de minha casa.
Ao Prof. Dr. Paulo César Gedhini, por nos acolher tão bem e nos oferecer um
espaço físico dentro do Laboratório de Farmacologia Bioquímica e Molecular.
Aos prezados Ana Carolina Arcanjo, Silviene Oliveira, Philippe Moureau,
Andre Garcia, Audrey Sabbagh, Eduardo Donadi, Celso Mendes-Junior, Juliana
Massaro e Gustavo Palomino pela grande ajuda durante a escrita do artigo e por
parte das amostras avaliadas nesse trabalho. Muito obrigado pela grande ajuda.
6
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia da Universidade Federal de
Goiás e ao seu corpo docente pelos ensinamentos.
Aos membros da banca por se disporem a oferecer seu tempo para
contribuírem com a minha formação.
A CAPES por fornecer o apoio financeiro e a bolsa de mestrado. E a todos
aqueles que de forma direta ou indireta contribuíram para que meu trabalho pudesse
ser concluído.
7
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.................................................................................................................................... 9
LISTA DE TABELAS .................................................................................................................................. 11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ........................................................................................................ 12
RESUMO ................................................................................................................................................ 13
ABSTRACT .............................................................................................................................................. 14
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................... 15
1.1 - FUCIONAMENTO, ESTRUTURA E HISTÓRICO DO COMPLEXO PRINCIPAL DE
HISTOCOMPATIBILIDADE HUMANO ................................................................................................. 15
1.2 - O GENE HLA-G ........................................................................................................................... 20
1.2.1. CARACTERÍSTICAS GERAIS ................................................................................................... 20
1.2.2. SELEÇÃO NATURAL E O GENE HLA-G .................................................................................. 24
1.3 - A SEQUÊNCIA AluyHG ............................................................................................................... 26
1.4. O PROJETO 1000Genomes CONSORTIUM ................................................................................. 29
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 30
2.1. OBJETIVO GERAL ........................................................................................................................ 30
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................................. 30
3. JUSTIFICATIVA ................................................................................................................................... 31
4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................................... 32
4.1. CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ............................................................................................... 32
4.2. CARACTERIZAÇÃO DA INSERÇÃO ALUYHG ................................................................................. 33
4.3. VARIABILIDADE DA REGIÃO CODIFICADORA E 3’NT DO GENE HLA-G ....................................... 35
4.4. NOMENCLATURA DOS HAPLÓTIPOS HLA-G ............................................................................... 36
4.5. FORMATAÇÃO DOS BANCOS DE DADOS .................................................................................... 37
4.6. ANÁLISE DOS DADOS .................................................................................................................. 38
5. RESULTADOS ..................................................................................................................................... 41
5.1. FREQUÊNCIAS ALÉLICAS E GENOTÍPICAS DA INSERÇÃO ALUYHG .................................................. 41
5.2. DESEQUILÍBRIO DE LIGAÇÃO ...................................................................................................... 42
5.3. HAPLÓTIPOS HLA-G/ALUYHG E RELAÇÃO ENTRE OS HAPLÓTIPOS ............................................ 44
6. DISCUSSÃO ........................................................................................................................................ 52
8
7. CONCLUSÃO ...................................................................................................................................... 60
8. REFERÊNCIAS ..................................................................................................................................... 61
ANEXO ................................................................................................................................................... 70
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura da região do MHC humano, representando os genes
MHC de classe I, II e III (Shiina et al.,
2009).................................
17
Figura 2 Estrutura comparativa das moléculas de MHC de classe I e
classe II (Abbas, 2010).....................................................
18
Figura 3 Isoformas solúveis e ligadas à membrana celular da molécula
HLA-G. As cores dos éxons são as mesmas encontradas em
cada domínio da molécula produzida. (Donadi et al.,
2011)..........
22
Figura 4 Mapa das posições das inserções Alu dentro do MHC,
evidenciando a inserção AluyHG. Adaptado de (Kulski e Dunn,
2005)............................................................................................
..
28
Figura 5 Gel de agarose apresentando bandas específicas para a
inserção AluyHG........................................................................ 35
Figura 6 Perfil de LD entre os polimorfismo da região 3’NT do gene HLA-
G e a inserção AluyHG considerando dados de genótipos de
indivíduos de quatro populações distintas (brasileira,
senegalesa, congolesa e francesa)............................................ 43
Figura 7 Perfil de LD entre os polimorfismos da região codificadora e
3’NT do gene HLA-G, considerando dados de genótipos de
indivíduos brasileiros e das 14 populações disponibilizadas pelo
Projeto 1000Genomes............................................................... 44
Figura 8 Rede de haplótipos construída a partir dos dados de
polimorfismos da região 3’NT do gene HLA-G e a inserção
AluyHG considerando os dados das populações brasileira,
senegalesa, congolesa e francesa. As cores diferentes indicam
linhagens diferentes desses haplótipos....................................... 50
Figura 9 Rede de haplótipos construída a partir dos dados de
polimorfismos das regiões codificadora e 3’NT do gene HLA-G
10
a partir dos dados disponibilizados pelo Projeto 1000Genomes.
As linhagens têm as mesmas cores da Figura 7 e foram
nomeadas de acordo com (Castelli et al.,
2011)............................................................................................
51
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Número de alelos identificados para os principais genes HLA
de classe I e II (IMGT/HLA - Database 3.14.0, novembro de
2013)........................................................................................... 19
Tabela 2 Reagentes e concentrações utilizadas para a amplificação do
elemento AluyHG......................................................................... 34
Tabela 3 Principais haplótipos da região 3’NT do gene HLA-G.................. 37
Tabela 4 Frequências da ausência (AluyHG*1) e presença (AluyHG*2)
da inserção AluyHG em populações mundiais........................... 42
Tabela 5 Haplótipos entre polimorfismos da região 3’NT do gene HLA-G
e a inserção AluyHG em quatro populações distintas:
brasileiros, senegaleses, congoleses e franceses....................... 46
Tabela 6 Frequências dos haplótipos considerando polimorfismos da
região codificadora e 3’NT do gene HLA-G na população
mundial........................................................................................ 48
12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
.vcf
%
µL
APC
EDTA
HLA
IMGT
Kb
LTA
Mb
MAF
MHC
miRNA
mL
mRNA
ng
NK
NT
ºC
Pb
PCR
SNP
SP
TCR
TNF
UV
V
(Variant Call Format)
Por cento
Microlitro (10-6 litro)
Célula Apresentadora de Antígeno
Acido Etileno Diamino Tetracético
Antígeno Leucocitário Humano (do inglês, human leukocyte antiges)
International Immunogenetics Database
Kilobase (103 bases)
Linfotoxina alfa
Megabase (106 bases)
Frequência alélica mínima (do inglês, minimum allele frequency)
Complexo Principal de Histocompatibilidade (do inglês, Major
Histocompatibility Complex
MicroRNA
Mililitro (10-3 Litro)
RNA mensageiro
Nanograma (10-9 grama)
Célula Natural Killer
Não traduzida
Graus Celsius
Pares de bases
Reação em Cadeia da Polimerase
Polimorfismo de Base Única (do inglês, Single Nucleotide
Polymorphism)
São Paulo
Receptor de Célula T
Fator de Necrose Tumoral
Ultravioleta
Volts
13
RESUMO
O Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) é formado
principalmente por genes que participam da resposta imunológica adaptativa. Entre
esses genes encontramos o grupo denominado de Antígenos Leucocitários
Humanos (HLA), que são responsáveis pela apresentação de antígenos específicos
às células efetoras do sistema imunológico. Os genes HLA de classe I clássicos
(HLA-A, -B e -C), responsáveis pela apresentação antigênica aos linfócitos T
citotóxicos, são considerado como os mais polimórficos do genoma humano e de
outros vertebrados. A variabilidade desses genes e elevada heterozigose é mantida
por seleção mediada por microrganismos. Diferentemente dos genes clássicos, os
genes HLA de classe I não clássicos (HLA-G, -E e -F) apresentam variabilidade
reduzida e como função principal a tolerância imunológica, por meio de sua
interação com receptores inibitórios presentes nas células NK e T. O HLA-G é o
mais estudado entre esses genes e, devido sua importância como molécula
imunomoduladora e sua importância em situações como gestação, e considerando
evidências anteriores de seleção natural mantendo uma elevada heterozigose nas
regiões regulatórias do HLA-G, avaliamos a presença de uma inserção Alu (AluyHG)
próxima a este gene correlacionando os achados com a variabilidade contida nas
suas regiões codificadora e 3’ não traduzida. A inserção AluyHG mostrou-se em
desequilíbrio de ligação (LD) com os polimorfismos do gene HLA-G.
Especificamente, o elemento inserido apresentou-se em LD com um haplótipo
denominado G*01:01:01:01/UTR-1, considerado como um haplótipo de alta
produção da molécula de HLA-G. Esse haplótipo aparentemente é o mais jovem
entre humanos, apesar de sua elevada frequência nas populações estudadas até o
momento.
Palavras-Chave: Complexo Principal de Histocompatibilidade, Antígenos
Leucocitários Humanos, HLA-G, AluyHG, Desequilíbrio de Ligação, Haplótipos.
14
ABSTRACT
The Major Histocompatibility Complex is mainly composed by genes of the
adaptive immune response. In humans, part of this complex is known as the Human
Leukocyte Antigens (HLA), whose genes are responsible for specific antigen
presentation to effector immune cells. The classical class I HLA genes (HLA-A, -B
and -C) are responsible for antigen presentation to T CD8+ cells and they constitute
the most polymorphic genes in the human genome. This variability is maintained by
selection mediated by microorganisms. In contrast to their classical counterparts, the
non classical class I genes (HLA-G, -E and -F) present low variability and are
associated with immune tolerance due to the interaction with NK and T cells inhibitor
receptors. HLA-G is the most studied non classical gene, which is associated with
immune response modulation, mainly during pregnancy. Considering that natural
selection is acting on the HLA-G regulatory regions maintaining high heterozigosity in
this region, we evaluated a nearby Alu insertion (AluyHG) correlating this Alu element
with coding and 3’UTR HLA-G polymorphisms. The AluyHG insertion was particularly
associated with the HLA-G haplotype known as G*01:01:01:01/UTR-1, considered a
high-expressing HLA-G haplotype. The G*01:01:01:01/UTR-1/AluyHG haplotype
would be the most recent HLA-G haplotypes, in spite of its high frequency in
worldwide populations.
Key Words: Major Histocompatibility Complex, Human Leukocyte Antigens, HLA-G,
AluyHG, Linkage Disequilibrium, Haplotypes.
15
1. INTRODUÇÃO
1.1 - FUCIONAMENTO, ESTRUTURA E HISTÓRICO DO COMPLEXO
PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDADE HUMANO
Em vertebrados, a resposta imunitária pode ser dividida em resposta inata e
adaptativa (Parkin e Cohen, 2001). A primeira ocorre de maneira imediata ao dano
sofrido pelos tecidos ou ao contato com microrganismos e tem baixa especificidade,
i.e., não é direcionada a um determinado microrganismo (Delves e Roitt, 2000a;
2000b). A reposta imune inata é conservada em vários organismos (Delves e Roitt,
2000a; 2000b), usualmente envolvendo as mesmas moléculas e células. No entanto,
a resposta adaptativa envolve o reconhecimento de antígenos por receptores
específicos nas células T e B, o que permite o desenvolvimento de uma resposta
mais eficiente, específica e duradoura (Parkin e Cohen, 2001).
O primeiro estágio para que a resposta imune adaptativa ocorra é a
apresentação dos antígenos específicos às células T (Klein e Sato, 2000a; 2000b;
Parkin e Cohen, 2001), por meio de glicoproteínas transmembrânicas responsáveis
por acomodar pequenos peptídeos em sua estrutura e expô-los na superfície celular
(Klein e Sato, 2000a; 2000b). Essas glicoproteínas, em vertebrados, estão
codificadas em genes agrupados em uma região genômica formando um complexo
ou família gênica, denominado Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC,
do inglês Major Histocompatibility Complex).
Sua descoberta deu-se durante ensaios de transplantes alogênicos realizados
em camundongos por George Snell e colaboradores ainda na década de 40 (Abbas,
2010). Durante seus experimentos esses pesquisadores intercruzavam linhagens de
camundongos por pelo menos 20 gerações a fim de obterem animais geneticamente
idênticos divididos em dois grupos com características genéticas distintas. Então,
tecido da pele retirado cirurgicamente era transplantado em animais singênicos e
alogênicos. Após a recuperação notava-se que apenas havia resposta de rejeição
no segundo grupo, o que indicava a participação de proteínas de compatibilidade na
resposta imunitária desses indivíduos (Abbas, 2010).
16
Em humanos, a descoberta do MHC ocorreu por volta do ano de 1958 por
meio do trabalho realizado por três pesquisadores, Jean Dausset, Jon van Rood e
Rose Payne. Esses pesquisadores trabalhavam na identificação de anticorpos no
soro de pacientes que recebiam múltiplas transfusões sanguíneas. Entretanto, o
crédito pela descoberta do primeiro Antígeno Leucocitário Humano (HLA, do inglês
Human Leucocyte Antigen), e por consequência do MHC humano, foi de Jean
Dausset, que recebeu um prêmio Nobel em 1980 (Thorsby, 2009).
A principal função do MHC em nossa espécie é referida como a apresentação
de antígenos aos linfócitos T durante o desenvolvimento da resposta imune
adaptativa (Klein e Sato, 2000a; 2000b; Parkin e Cohen, 2001). Entretanto, estudos
apontam que, além da deflagração da resposta adaptativa, algumas dessas
moléculas estão também relacionadas à modulação do sistema imune humano
(Moscoso et al., 2006; Carosella, 2011; Donadi et al., 2011). Alguns estudos
apontam, ainda, o possível papel dessas moléculas na escolha sexual de parceiros
em nossa espécie (Wedekind et al., 1995; Jacob et al., 2002).
Na espécie humana, o MHC está localizado no cromossomo 6 (6p21.3),
apresentando aproximadamente 3,6 megabases (Mb) e 224 genes (Klein e Sato,
2000a; Garcia-Obregon et al., 2011). Essa família de genes é, didaticamente,
dividida em três grupos denominados genes de classe I, II e III (Horton et al., 2004)
(Figura 1). Na região de classe I e II está o sistema conhecido como HLA (do inglês,
Human Leukocyte Antigens) (Shiina et al., 2009). As moléculas de classe I e II, ou
HLA de classe I e II, são responsáveis pela apresentação de antígenos às células T
do sistema imune (Parkin e Cohen, 2001). Os genes de HLA classe I podem ainda
ser divididos, de acordo com a sua função, em genes clássicos (Ia), representados
pelos genes HLA-A, -B e -C, envolvidos na apresentação de antígenos aos linfócitos
T (Klein e Sato, 2000a; 2000b), e genes não clássicos (Ib), representados pelos
genes HLA-E, -F e -G, envolvidos na modulação do sistema imunitário (Geraghty et
al., 1992; Klein e Sato, 2000a; 2000b).
17
Figura 1. Estrutura da região do MHC humano, representando os genes MHC
de classe I, II e III (Shiina et al., 2009). O gene alvo desse estudo encontra-se
destacado.
18
Estruturalmente, as moléculas de classe I, tanto clássicas como não
clássicas, são formadas pela união de duas outras moléculas: uma cadeia α,
codificada pelos genes MHC de classe I, e uma molécula β2-microglobulina,
codificada por um gene localizado no cromossomo 15, fora do MHC (Klein e Sato,
2000a) (Figura 2). A cadeia α é dividida em cinco domínios: α1 e α2 (formam a fenda
de ligação ao peptídeo), α3 (domínio extracelular do tipo imunoglobulina), um
domínio transmembrana e um domínio citoplasmático (Klein e Sato, 2000a).
Possivelmente essa semelhança estrutural ocorre devido ao fato de os genes desse
complexo terem se originado por duplicações imperfeitas de blocos gênicos (Kulski
et al., 2000).
Por outro lado, as moléculas de classe II são formadas pela união de duas
cadeias (α e β) ambas codificadas por genes situados no MHC humano (Klein e
Sato, 2000a) (Figura 2). Cada uma das cadeias pode ser dividida em quatro
domínios: α1 e β1 que formam a fenda de ligação à peptídeos; α2 e β2,
extracelulares; um domínio transmembrana; e um domínio citoplasmático (Klein e
Sato, 2000a).
Figura 2 - Estrutura comparativa das moléculas de MHC de classe I e classe
II (Abbas, 2010).
Devido ao seu papel de ligação e apresentação de peptídeos diversos,
oriundos tanto de patógenos quanto do próprio organismo, tem-se considerado a
presença de forças seletivas mantendo uma alta diversidade e heterozigosidade nos
genes HLA classe I e II, aumentando o repertório de moléculas de classe I e II em
19
uma população, permitindo, assim, a apresentação de uma maior quantidade de
epítopos (Meyer e Thomson, 2001; Segal e Hill, 2003; Piertney e Oliver, 2006;
Solberg et al., 2008). Nas moléculas de classe I e II, o polimorfismo está
principalmente confinado aos sítios de ligação de peptídeos. Moléculas codificadas
por diferentes alelos de um mesmo gene HLA apresentam diferentes sítios de
ligação a peptídeos. Este polimorfismo é a razão da especificidade de ligação de
cada molécula HLA a determinados peptídeos antigênicos (Parkin e Cohen, 2001).
Provavelmente devido a esse fato, o MHC apresenta-se como a região mais
variável do genoma humano e da maioria dos vertebrados (Penn et al., 2002). No
entanto, este polimorfismo acentuado concentra-se em alguns genes importantes
para a apresentação antigênica, como os genes clássicos de classe I, que em
conjunto apresentam 7553 alelos ou haplótipos codificadores distintos (Tabela 1).
Diversos estudos demonstraram a seleção a favor da variabilidade nos genes de
classe Ia, que seriam os responsáveis pela manutenção da resposta imunitária
adaptativa como descrito anteriormente (Meyer e Thomson, 2001; Segal e Hill, 2003;
Piertney e Oliver, 2006; Solberg et al., 2008; Donadi et al., 2011). Nas espécies até
hoje estudadas, essa variabilidade é interessante considerando a necessidade de
combater patógenos. Por outro lado, os genes não clássicos de classe I, embora
vizinhos dos genes mais variáveis do genoma humano, apresentam poucos alelos.
Um estudo prévio mostrou que o gene de classe Ib HLA-G, por exemplo, apresenta
este perfil de elevada heterozigose somente nas suas regiões regulatórias (Castelli
et al., 2011).
Tabela 1 - Número de alelos identificados para os principais genes HLA de classe I
e II (IMGT/HLA - Database 3.14.0, outubro de 2013).
CLASSE I CLASSE II
Loco Alelos Loco Alelos
Clássicos (Ia) HLA-DRA cadeia α do HLA-DR 7
HLA-A 2432 HLA-DRB cadeia β1 do HLA-DR 1476
HLA-B 3086 HLA-DQA1 cadeia α do HLA-DQ 51
HLA-C 2035 HLA-DQB1 cadeia β do HLA-DQ 459
HLA-DPA1 cadeia α do HLA-DP 37
Não-Clássicos (Ib) HLA-DPB1 cadeia β do HLA-DP 193
HLA-E 13 HLA-DOA cadeia α do HLA-DO 12
HLA-F 22 HLA-DOB cadeia β do HLA-DO 13
HLA-G 50 HLA-DMA cadeia α do HLA-DM 7
HLA-DMB cadeia β do HLA-DM 13
20
No entanto, a capacidade de cada variante do MHC de acomodar peptídeos
específicos tem sido estudada como um dos motivos que explicam a razão pela qual
algumas variantes MHC estão associadas com susceptibilidade a doenças
autoimunes e neoplásicas. Para tumores, por exemplo, postula-se que tipos
parecidos de lesões expressam antígenos tumorais semelhantes e que algumas
variantes MHC não seriam capazes de apresentar peptídeos oriundos de tais
antígenos, pré-dispondo o indivíduo ao desenvolvimento de determinada neoplasia
por falha da imunovigilância tumoral. Para doenças autoimunes, por exemplo, é bem
conhecida teoria do Epítopo Compartilhado e artrite reumatoide, que prediz que
diferentes moléculas de HLA podem carregar sequências de aminoácidos
conservadas, modificando sua interação com os receptores da célula T (Gregersen
et al., 1987; De Almeida et al., 2010). Assim, mesmo que haja diferentes moléculas
capazes de apresentar diferentes antígenos, a estrutura molecular da interação
entre HLA e receptor na célula T pode dirigir o tipo de resposta dada pelas células
efetoras do sistema imunitário (Gregersen et al., 1987).
Não obstante, a grande diversidade genética encontrada no HLA faz com que
haja uma diferença na predisposição a enfermidades comparando-se grupos
geneticamente distintos, fato este evolutivamente importante, pois torna mais difícil a
ocorrência de grandes epidemias que poderiam dizimar a espécie (Van Rood, 1993).
1.2 - O GENE HLA-G
1.2.1. CARACTERÍSTICAS GERAIS
Em contraste com a expressão ubíqua das moléculas de HLA de classe I
clássicas bem como com sua grande variabilidade genética, as moléculas HLA de
classe I não clássicas, de maneira geral, ou apresentam sua expressão restrita aos
tecidos em que há a necessidade de modulação da resposta imune (caso da
molécula HLA-G) ou expressão ubíqua, porém reduzida (caso da molécula HLA-E),
e uma variabilidade genética reduzida (Donadi et al., 2011; Veiga-Castelli et al.,
2012). Apesar da sua menor influência na apresentação antigênica aos linfócitos T,
21
sua função na resposta imune tem sido intensamente estudada desde a descoberta
do primeiro gene não clássicos (HLA-G) por Geraghty e colaboradores entre 1987 e
1992 (Geraghty et al., 1987; Geraghty et al., 1992). Entre eles, o HLA-G tem sido
alvo da maioria das pesquisas recentes.
Esse gene possui a mesma estrutura apresentada pelos genes de classe I
(Donadi et al., 2011). O primeiro éxon 1 traduzido codifica para o peptídeo sinal (que
é utilizado na montagem da molécula de HLA-E, por exemplo), o segundo e terceiro
éxons traduzidos codificam para a fenda de ligação a peptídeos (domínios α1 e α2,
respectivamente), o quarto éxon traduzido codifica o domínio extracelular chamado
α3, o quinto e sexto éxons traduzidos codificam a porção transmembrana e
citoplasmática da molécula de HLA-G (Carosella et al., 2008). Uma região 3’ não
traduzida (3’NT) é formada após um códon de parada prematuro localizado no sexto
éxon traduzido e o éxon subsequente (Castelli et al., 2010).
Esse gene produz uma molécula estruturalmente semelhante às moléculas
produzidas pelos genes clássicos de classe I, entretanto apresenta algumas
diferenças (Donadi et al., 2011). Entre essas diferenças estão: (a) uma limitada
variabilidade genética e proteica (Tabela 1), (b) apresentação de isoformas ligadas à
membrana e solúveis, formadas por edição alternativa do transcrito primário (Figura
3) (Ishitani e Geraghty, 1992; Donadi et al., 2011), (c) estrutura molecular única, com
a presença de uma cauda citoplasmática curta devido à presença de um códon de
parada prematuro (Donadi et al., 2011), (d) é responsável pela modulação da
resposta imune (tolerância imunológica) (Carosella et al., 2008) e (e) apresenta
expressão restrita a alguns tecidos (Donadi et al., 2011).
Os estudos sobre esse gene têm revelado que os polimorfismos mais
importantes para a função biológica dessas moléculas estão presentes em locais
diferentes quando comparados aos genes clássicos, i.e., na fenda de ligação a
peptídeos. Aqui, os principais polimorfismos encontrados na forma de SNP (do
inglês, Single Nucleotide Polymorphism) estão presentes nas regiões promotora 5’,
influenciando sua transcrição (Moreau et al., 2009), e na região 3’NT, influenciando a
estabilidade do RNA mensageiro e sua tradução (Castelli et al., 2010).
Ainda, diferentemente dos genes clássicos, em que os sítios de variação da
região codificadora ocorrem principalmente nos éxons 2 e 3, os polimorfismos da
região codificadora do HLA-G apresentam-se distribuídos, principalmente, entre os
éxons 2, 3 e 4 bem como em seus íntrons (Donadi et al., 2011). No entanto, a
22
maioria desses sítios polimórficos dentro de sequências exônicas constituem
mutações sinônimas, gerando uma baixa diversidade proteica (Donadi et al., 2011).
Figura 3 - Isoformas solúveis e ligadas à membrana celular do molécula HLA-
G. As cores dos éxons são as mesmas encontradas em cada domínio da molécula
produzida (Donadi et al., 2011).
Recentemente, o perfil de polimorfismos das regiões regulatórias tem sido
avaliado em outros genes não clássicos, notadamente o HLA-E, que tem
apresentado uma variabilidade mais reduzida do que a encontrada no HLA-G
(Veiga-Castelli et al., 2012). É inegável, entretanto, a importância dos polimorfismos
que ocorrem nessa região para a função desempenhada por essas moléculas, já
que esses sítios de variação podem gerar isoformas solúveis e ligadas à membrana
celular, modificando sua forma de interação com as células efetoras do sistema
imune (Donadi et al., 2011).
Com relação aos polimorfismos que fazem parte da região 3’NT do gene HLA-
G, muitos esforços foram depositados para o entendimento da variabilidade da
23
região em si (Castelli et al., 2010), bem como sua importância para a produção da
molécula de HLA-G (Tan et al., 2007; Yie et al., 2008; Castelli et al., 2009; Veit e
Chies, 2009; Donadi et al., 2011).
A região 3’NT do HLA-G foi pioneiramente caracterizada em brasileiros do
Estado de São Paulo (Castelli et al., 2010). Neste estudo, oito polimorfismos foram
encontrados na região 3’NT, caracterizando sete haplótipos frequentes denominados
UTR-1 a UTR-7. Posteriormente, outros grupos populacionais brasileiros foram
explorados, indicando que o perfil observado em São Paulo também era observado
em outras regiões (Mendes et al., 2007; Lucena-Silva et al., 2012). Em seguida, este
perfil brasileiro tornou-se referência mundial, visto que diversos outros trabalhos
mostraram que os mesmos polimorfismos e haplótipos eram frequentemente
encontrado em diversas populações mundiais (Ober e Aldrich, 1997; Hviid et al.,
1999; Hviid et al., 2004; Tan et al., 2005; Hviid, 2006; Larsen e Hviid, 2009; Cervera
et al., 2010; Castelli et al., 2011; Donadi et al., 2011; Lucena-Silva et al., 2012;
Courtin et al., 2013; Di Cristofaro et al., 2013; Garcia et al., 2013; Martinez-Laso et
al., 2013; Sabbagh et al., 2013).
É bem caracterizado que polimorfismos presentes na região 3’NT podem
influenciar na tradução de um determinado RNA mensageiro. Os principais
mecanismos que regulam a tradução e que agem sobre a região 3’NT são: a ligação
de proteínas específicas que dirigem a localização e a degradação da molécula de
RNA mensageiro, e, nesse contexto, um dado polimorfismo poderá modificar essas
regiões aumentando ou diminuindo a afinidade dessas proteínas àquele sítio
(Kuersten e Goodwin, 2003); a taxa de decaimento do RNA mensageiro maduro,
provocada por variantes deletérias (Kuersten e Goodwin, 2003); a ligação a
microRNAs (miRNA) específicos, que pode levar o RNA mensageiro à degradação
por diferentes vias (Bartel, 2004).
Em relação ao gene HLA-G, foi demonstrado que a presença de uma
Guanina na posição +3142 pode favorecer a ligação a determinados microRNAs
(miR-148a, miR-148b, miR-152, por exemplo), que podem dirigir à degradação
desse RNA mensageiro (Tan et al., 2007). Além disso, a presença de um fragmento
de inserção/deleção de 14 pares de base (14pb), geralmente encontrado em
desequilíbrio de ligação (LD) com o polimorfismo +3142, também pode influenciar a
estabilidade do RNA mensageiro maduro (Hviid et al., 2003). Nesse contexto, a
presença do fragmento de 14pb tem sido associada a uma baixa produção da
24
molécula de HLA-G em trofoblastos (Hviid et al., 2003). Por outro lado, a presença
da sequência de 14pb pode levar a uma edição alternativa do RNA mensageiro, que
culmina com a retirada de 92 nucleotídeos que incluem alguns polimorfismos, como
o 14pb, +3003 e o +3010 (Hviid et al., 2003). Assim, esses autores comentam que
esse evento gera uma molécula menor e mais estável de RNA mensageiro. Ainda, a
presença de uma Adenina na posição +3187 aumenta um motivo rico em AU
(Adenina e Uracila), diminuindo a estabilidade do RNA mensageiro e favorecendo
sua degradação (Yie et al., 2008).
A caracterização dessas moléculas passa a ter importância na função
biológica desempenhada pelo HLA-G no contexto da resposta imune. Os estudos
realizados até agora apontam para a característica de modulação da resposta
imunológica apresentada pelas moléculas de HLA-G, em contrapartida de seus
correlatos clássicos (Donadi et al., 2011). Várias são as peculiaridades que fazem
desse gene um importante regulador do sistema imunológico: (a) a cauda
citoplasmática mais curta prolonga a meia vida da molécula na membrana biológica
(Park et al., 2001; Park e Ahn, 2003), o que permite a interação com várias células
pertencentes ao sistema imune e por mais tempo; (b) os domínios extracelulares
interagem com receptores inibitórios nos linfócitos, como CD8, LILRB1 e LILRB2, e
células NK (do inglês, Natural Killer), como KIR2DL4 (Gao et al., 2000; Shiroishi et
al., 2003; Shiroishi et al., 2006). Assim, as moléculas produzidas por esse gene
passam a ter grande importância em contextos fisiológicos em que há a necessidade
de modulação fina do sistema imune, como por exemplo, durante a gestação, em
doenças autoimunes, transplantes e doenças crônicas, como tumores (Donadi et al.,
2011).
1.2.2. SELEÇÃO NATURAL E O GENE HLA-G
Evolutivamente, o gene HLA-G comporta-se de maneira diversa de seus
correlatos clássicos. Segundo Castelli et. al. (2011), há evidência de seleção
purificadora atuando sobre a região codificadora desse gene (Castelli et al., 2011),
enquanto que nos genes clássicos de classe I há evidência de seleção balanceadora
atuando sobre essa região (Solberg et al., 2008; Donadi et al., 2011). A baixa
25
variabilidade do gene HLA-G ganha grande importância quando passamos a
analisar a função desempenhada pelas moléculas não clássicas de classe I (Castelli
et al., 2011; Donadi et al., 2011). Sua função precípua não é a apresentação
antigênica e sim a modulação da resposta imune, por meio da interação com
receptores inibitórios menos variáveis do que os receptores para reconhecimento de
antígenos (Contini et al., 2003a; Contini et al., 2003b).
Entretanto, as duas regiões regulatórias (5’URR e 3’NT) do gene HLA-G
apresentam evidência de seleção balanceadora em diferentes populações com
história de formação distintas (Tan et al., 2005; Mendes et al., 2007; Castelli et al.,
2011; Donadi et al., 2011; Veit et al., 2012; Mendes-Junior et al., 2013). De fato, o
perfil de distribuição de haplótipos desse gene aponta para o fato de que há poucos
haplótipos em altas frequências em torno do mundo (Donadi et al., 2011),
geralmente ocorrendo uma heterozigose entre um haplótipo de alta produção e um
de baixa produção da molécula de HLA-G (Mendes et al., 2007; Castelli et al., 2010;
Castelli et al., 2011; Donadi et al., 2011). De fato, é obervado que o haplótipo
conhecido como UTR-1, descrito inicialmente no Brasil (Castelli et al., 2010),
considerado como de alta produção da molécula de HLA-G (Martelli-Palomino et al.,
2013), é frequentemente encontrado em heterozigose com um haplótipo
considerado de baixa produção dessa molécula, conhecido como UTR-2.
Funcionalmente, a heterozigose tem importância devido ao fato de a resposta
imunitária ter que atuar ora de maneira ávida, ora de maneira permissiva, i.e.,
durante a infecção por qualquer patógeno, por exemplo, há a necessidade de forte
atuação das células efetoras imunológicas, com o intuito de eficazmente combater a
infecção. Nesse sentido, a baixa produção da molécula de HLA-G, que tem função
modulatória e, portanto, de aumentar a tolerância imunológica (Donadi et al., 2011),
torna-se importante a fim de permitir a correta atuação das células efetoras. Por
outro lado, há casos em que há necessidade de modulação e tolerância
imunológica, como, por exemplo, durante a gestação (Hviid, 2006). Nesse contexto,
para que haja a aceitação materno-fetal, as células efetoras do sistema imunitário
devem ser reguladas e a presença de haplótipos de alta produção da molécula de
HLA-G garante a produção dessa molécula. Assim, a presença de força seletiva em
favor da manutenção de heterozigose nessa região toma grande importância.
Esse mesmo perfil também é observado para a região promotora desse gene
(Tan et al., 2005). Novamente, há a presença de alguns polimorfismos associados à
26
alta produção da molécula de HLA-G em heterozigose com aqueles associados à
baixa produção dessa molécula (Donadi et al., 2011), também favorecendo a
dualidade de respostas necessárias em condições fisiológicas normais. Além disso,
já foi descrito que há forte LD entre sítios polimórficos da região promotora e da
região 3’NT, o que aponta para a importância dessas duas regiões atuando em
conjunto para a correta regulação da produção da molécula de HLA-G em locais e
tempos em que há a necessidade (Donadi et al., 2011). Entretanto, mais estudos
são necessários para que se tenha o conhecimento completo de como a seleção
molda as frequências dos haplótipos desse gene em torno do mundo.
1.3 - A SEQUÊNCIA AluyHG
Na tentativa de elucidar alguns mecanismos evolutivos envolvidos na
formação dos genes HLA de classe I, realizaram-se estudos da presença ou
ausência de inserções Alu presentes nesse complexo gênico (Kulski e Dunn, 2005).
Em humanos, as sequências Alu são os mais abundantes representantes de uma
família de retrotransposons chamados de SINE (do inglês, Short Interspersed
Nuclear Element), e receberam esse nome devido à presença de um sítio de
restrição para a enzima Alu em sua estrutura (Houck et al., 1979). Os elementos Alu
são compostos por aproximadamente 300pb, divididos em dois braços praticamente
idênticos, separados por uma região rica em adeninas (A) (Batzer e Deininger,
2002). O motivo rico em Adenina presente no centro da estrutura geralmente possui
a repetição A5TACA6 (Batzer e Deininger, 2002). As sequências Alu possuem uma
cauda terminal oligo-(dA) de tamanho variável e repetições curtas de Timinas e
Adeninas (T + A) flanqueando a sequência, refletindo sua inserção cromossomal
(Jurka, 1997). Como parte da sequência, há a presença de um promotor para a
enzima RNA polimerase III (Batzer e Deininger, 2002), necessária à sua
retrotranscrição.
Esses elementos móveis são derivados, ancestralmente, do RNA 7SL,
envolvido na ligação com o peptídeo sinal para a translocação de proteínas ao
retículo endoplasmático (Ullu e Tschudi, 1984). Essa função tem sido atribuída,
27
ainda, a alguns elementos Alu distribuídos no genoma humano (Weichenrieder et al.,
2001).
O seu mecanismo de transposição envolve a retrotranscrição de um produto
originado a partir da ação da enzima RNA polimerase III, provavelmente pela ação
de uma transcriptase reversa codificada por uma sequência do tipo LINE (do inglês,
Long interspersed Nuclear Elements) (Mathias et al., 1991), já que os elementos Alu
perderam, ao longo do processo evolutivo, a sequência que codifica essa enzima
(Batzer e Deininger, 2002). Esses autores comentam, ainda, a importância de
regiões conservadas (TTAAA) flanqueando a sequência Alu necessárias ao
reconhecimento por endonucleases para que ocorra o processo de integração ao
genoma.
Há cerca de 1,1 milhão de cópias de sequências Alu, o que corresponde a
aproximadamente 10% de todo o genoma haplóide, presentes no genoma humano
(Kriegs et al., 2007). Entre as sequências presentes na espécie humana existem
aquelas mais antigas, compartilhadas com outros primatas, chamadas de AluJ e
AluS (Jurka e Smith, 1988) e algumas sequências específicas da espécie humana,
notadamente as de inserções mais recentes, chamadas AluY (Batzer et al., 1994).
Para a diferenciação das famílias de inserções Alu há consenso em utilizarem-se
diferenças nas suas sequências, como algumas mutações que são características
para cada família e acumuladas durante o processo evolutivo (Jurka e Smith, 1988;
Batzer et al., 1996; Kapitonov e Jurka, 1996).
Dentre as famílias Alu descritas acima, a AluY mostra-se a mais útil no estudo
populacional, devido ao fato de algumas sequências dessa família ainda não terem
alcançado sua completa fixação no genoma (Kulski et al., 2001), sendo dimórficos
entre a população, ou seja, ou estão presentes ou ausentes (Dunn et al., 2002).
Ainda, considera-se sua característica de terem identidade por descendência, ou
seja, devido ao fato de não haver mecanismo que retire a inserção Alu do genoma,
dois indivíduos compartilhando uma inserção em um mesmo lócus terá,
provavelmente, a mesma origem evolutiva (Deininger e Batzer, 1999). Além disso,
sua avaliação é um procedimento rápido e fácil por meio da reação em cadeia da
polimerase (PCR) e posterior eletroforese (Roy-Engel et al., 2001), apresentando
uma taxa de nova inserção de uma a cada 20 nascimentos (Cordaux et al., 2006).
Uma série de estudos foram realizados avaliando a presença de inserções
Alu localizadas no MHC humano. Como resultado foram encontradas cinco
28
inserções margeando alguns genes, dentre as quais: AluyMICB, encontrado no
primeiro íntron do gene MICB (Kulski et al., 2002); AluyTF, localizado entre os genes
HLA-B e HLA-E, a cerca de 505 kb centromérico em relação ao último (Dunn et al.,
2003); AluyHG localizado a aproximadamente 20 kb da ponta 3’ do gene HLA-G
(Kulski et al., 2001); AluyHJ, localizado a aproximadamente 190 kb centromérico em
relação a HLA-G (Dunn et al., 2002); AluyHF, localizado a aproximadamente 130 kb
telomérico em relação a HLA-G (Dunn et al., 2002) (Figura 4).
Figura 4. Mapa das posições das inserções Alu dentro do MHC, evidenciando
a inserção AluyHG. Adaptado de (Kulski e Dunn, 2005).
Dentre essas inserções a que se mostra mais próxima ao gene não clássico
HLA-G é a inserção AluyHG. Desta forma, este elemento torna-se bastante útil no
estudo de sua relação com esse gene. Kulski e colaboradores em 2001 mostraram
que esse polimorfismo apresentava desequilíbrio de ligação com o gene HLA-A e
que apresentava frequências compatíveis com o grupo alélico HLA-A*02 desse
mesmo gene (Kulski et al., 2001). Entretanto, apesar de sua proximidade ao gene
HLA-G, nenhum estudo teve como foco a análise da relação entre a presença dessa
inserção e polimorfismos desse gene.
29
1.4. O PROJETO 1000Genomes CONSORTIUM
O projeto 1000Genomes (The 1000Genomes Project Consortium, 2010; The
1000Genomes Project Consortium, 2012) é um consórcio internacional que,
utilizando técnicas de sequenciamento de nova geração, avaliou o genoma completo
de 1092 indivíduos oriundos de 14 populações diferentes. A comparação dos dados
obtidos por este projeto torna-se uma valiosa fonte para estudos de associação e
identificação de genes candidatos para diferentes doenças (Harrow et al., 2012),
resposta individual e metabolização de fármacos (Allen, 2005) e padrões de
diversidade gênica ao longo de diferentes populações. Neste aspecto, o
sequenciamento em larga escala de diferentes indivíduos pode gerar dados mais
completos e complementares aos dois consórcios iniciais que se propuseram a
sequenciar o genoma humano de poucos indivíduos (International Human Genome
Sequencing Consortium, 2001; Venter et al., 2001; Venter, 2003; International
Human Genome Sequencing Consortium, 2004).
Em nenhum dos projetos de sequenciamento completo do genoma humano a
população brasileira foi avaliada. Neste aspecto, essa população torna-se uma
excelente fonte de estudos, tendo em vista que constitui uma das populações mais
heterogêneas do mundo, fruto de mais de cinco séculos de miscigenação entre as
populações de quatro diferentes continentes: 1) Americano: população nativa de
ameríndios; 2) Africano: escravos vindos para o Brasil entre o século 16 e o ano de
1850; 3) Europeu: principalmente portugueses que colonizaram o Brasil, seguidos
por italianos, espanhóis e alemães (Pimenta et al., 2006); 4) Asiático: japoneses que
chegaram ao Brasil principalmente no período pós 2ª Guerra Mundial.
Assim, concatenar dados disponibilizados pelo Projeto 1000Genomes com
dados obtidos de populações brasileiras permite a observação de distribuição de
frequências de alelos e haplótipos em torno do mundo.
30
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Analisar a frequência da presença da inserção AluyHG em amostras de três
continentes (Brasileiros, Franceses e Africanos) e correlacionar este elemento com a
variabilidade da região 3’NT do gene HLA-G.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
● Avaliar a presença da inserção AluyHG em uma amostra de brasileiros
(estado de São Paulo), franceses e africanos;
● Avaliar a relação entre o elemento AluyHG e polimorfismos na região 3’NT
do HLA-G;
● Inferir haplótipos HLA-G/AluyHG;
● Avaliar a distribuição mundial dos haplótipos de HLA-G considerando dados
brasileiros e do projeto 1000Genomes;
31
3. JUSTIFICATIVA
O gene HLA-G tem grande importância na fisiologia do sistema imune
humano, principalmente no contexto da gravidez, transplantes, tumores e doenças
autoimunes (Donadi et al., 2011). Entretanto, alguns tópicos relacionados a esse
gene ainda permanecem obscuros, como perfil de expressão de todas as variantes
proteicas, regulação da transcrição e tradução, bem como mecanismos evolutivos
adjacentes à formação desse gene no curso da especiação humana. Assim,
entender os mecanismos adjacentes à evolução desse gene pode permitir o
entendimento da distribuição de poucos haplótipos em torno do mundo.
A identificação de sequências Alu próximas aos genes não clássicos e, em
especial, uma localizada a 20kb de distância da região 3’NT do gene HLA-G, permite
o estudo de sua relação com esse gene. Devido à proximidade dessas inserções e
os genes de HLA, estudos realizados na última década têm buscado identificar perfis
de desequilíbrio de ligação (LD, do inglês Linkage Disequilibrium) entre ambos..
Além disso, a proximidade entre o elemento AluyHG e o gene HLA-G pode
permitir a identificação de haplótipos associados à inserção AluyHG, o que pode
permitir sua fácil identificação para futuros estudos por meio de reações simples de
PCR. A abordagem utilizada até o momento para a definição e triagem de haplótipos
é o sequenciamento, técnica mais cara e mais trabalhosa em comparação à técnica
de PCR. Portanto, em estudos em que é necessária apenas a identificação de alelos
de alta e/ou baixa produção da molécula de HLA-G, a utilização de um marcador
torna-se bastante útil.
32
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
Para a caracterização da presença da inserção AluyHG, foram utilizadas 641
amostras originárias de três diferentes continentes: 165 brasileiros (BRA), 161
congoleses (CNG), 193 senegaleses (SEE) e 122 franceses (FRA).
A população brasileira foi composta por doadores de medula óssea, não
relacionados e saudáveis oriundos do Hemocentro de Ribeirão Preto - SP,
selecionados de forma aleatória. Estas amostras foram utilizadas em estudos
prévios que avaliaram a variabilidade de outros genes do complexo HLA, incluindo
os genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1 e HLA-G, realizados pelo grupo
(Castelli et al., 2010; Castelli et al., 2011). Este protocolo experimental foi aprovado
pelo comitê de Ética em pesquisa da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - SP,
Universidade de São Paulo (FMRP-USP) sob o protocolo 12398/2004, autorizando
sua utilização para estudos envolvendo a variabilidade dos genes HLA-G e HLA-E,
estando as amostras disponíveis para estudo.
A população congolesa foi composta por indivíduos saudáveis não
relacionados oriundos da província de Badundu da República Democrática do
Congo, gentilmente cedidas pelo Dr. Andre Garcia. O Ministério do Congo aprovou a
utilização dessas amostras para estudos de variabilidade de genes do complexo
HLA, estando essas amostras disponíveis para o estudo.
A população senegalesa foi composta por indivíduos saudáveis não
relacionados oriundos da área de Niakhar, Senegal, também gentilmente cedidas
pelo Dr. Andre Garcia. O protocolo experimental foi aprovado pelo comitê de Ética
local para a utilização dessas amostras em estudos de variabilidade genética dos
genes de HLA, estando essas amostras disponíveis para o presente estudo.
A população francesa foi composta por indivíduos saudáveis não relacionados
oriundos de Paris, França, gentilmente cedidas pelo Dr. Philippe Moreau. O Governo
Francês autorizou o uso dessas amostras para estudo de variabilidade genética dos
genes de HLA, estando essas amostras também disponíveis para o estudo.
33
Todas as 641 amostras utilizadas já haviam sido avaliadas quanto à
variabilidade da região 3’NT do gene HLA-G em estudos já publicados anteriormente
(Castelli et al., 2010; Castelli et al., 2011; Courtin et al., 2013; Garcia et al., 2013;
Martelli-Palomino et al., 2013; Sabbagh et al., 2013). Os dados de variabilidade
foram gentilmente cedidos pelos pesquisadores responsáveis.
4.2. CARACTERIZAÇÃO DA INSERÇÃO ALUYHG
A inserção AluyHG foi caracterizada por procedimento de PCR (do inglês,
Polymerase Chain Reaction) já descrito previamente (Kulski et al., 2001). O DNA de
cada amostra, já previamente extraído por kits comerciais ou métodos caseiros do
tipo salting-out, foi amplificado por meio dos iniciadores AluyHGF-
CAGGACAACCAGTAAAGATGCTGG e AluyHGR-
GCTTCAGTTAACATGCAAGTTTATGCC (Kulski et al., 2001).
A reação de PCR foi realizada em volume final de 25μL. Os reagentes
utilizados para a reação de amplificação foram misturados em tubo separado
conforme especificado na Tabela 2. Em cada tubo para PCR de 0,2mL, previamente
identificado, foi adicionado 23,5μL da mistura de reagentes (Tabela 2) e mais 1,5μL
de amostra de DNA diluído a 100ng/μL. Em cada bateria de amplificação foi
adicionado um controle negativo apenas com a mistura de reagentes, portanto sem
DNA, para a confirmação da ausência de contaminação dos reagentes por
fragmentos de DNA que poderiam ser amplificados pelo conjunto de iniciadores
utilizados.
As condições de ciclagem consistiram em: (a) desnaturação inicial do DNA a
94ºC por 3 minutos; (b) 30 ciclos de 94ºC de desnaturação por 30 segundos, 58ºC
de temperatura de anelamento por 30 segundos, 72ºC de temperatura de extensão
por 50 segundos; (c) um ciclo de extensão final a 72ºC por 5 minutos. O produto
obtido foi armazenado em freezer a -20ºC até sua utilização como descrito adiante.
A amplificação correta foi, avaliada em gel de agarose a 1,5% corado com
brometo de etídeo. Para cada amostra foi aplicado um volume de 6μL de produto de
PCR junto com 1μL de tampão de carregamento 6x Loading DyeTM (Fermentas -
Vilnius, Lituânia).
34
Tabela 2 - Reagentes e concentrações utilizadas para a amplificação do elemento
AluyHG.
Componentes da reação [ ] Solução de
Uso 1X
(μL) [ ]
Final
Água - 16,05 -
Tampão de amplificação da DNA polimerase
10X 2,0 0,8X
MgCl2 25mM 0,75 1,50m
M
Solução de dNTPs 5mM 0,25 0,20m
M
Iniciador AluyHGF 10pM 1,5 15pmol
Iniciador AluyHGR 10pM 1,5 15pmol
DMSO 100% 1,25 5% v/v
DNA Polimerase (Platinum – Invitrogen) 5U/μL 0,2 1U
Volume Total - 23,5 -
Volume de Amostra (100 ng/uL) - 1,5 -
A eletroforese foi realizada durante 1 hora mantendo-se a voltagem fixada em
90 V. Os géis foram expostos à luz ultravioleta (UV) e, posteriormente, fotografados
em um fotodocumentador. Em cada corrida foi adicionada uma escada alélica
GeneRuler™ (Fermentas – Vilnius, Lituânia) com tamanho específico para
conferência do tamanho aproximado dos produtos de amplificação gerados pela
reação de PCR, bem como foi adicionado o controle negativo como um parâmetro
de ausência de contaminação.
O tamanho esperado de cada fragmento de amplificação foi de 218pb para a
ausência da inserção AluyHG e 540pb para a presença da inserção AluyHG (Figura
5), pois os iniciadores foram desenhados para amplificar regiões que flanqueiam o
local de inserção dessa sequência em estudo.
35
Figura 5 - Gel de agarose apresentando bandas específicas para a inserção
AluyHG. A banda superior (540pb) reflete a presença da inserção, enquanto que a
banda inferior (218pb) reflete a ausência de inserção. Corrida 1: marcador de peso
molecular, corridas 2, 4 e 5: heterozigotos para o elemento AluyHG, corridas 3 e 7:
homozigotos para ausência do elemento AluyHG, corrida 6: homozigoto para a
presença do elementos AluyHG.
4.3. VARIABILIDADE DA REGIÃO CODIFICADORA E 3’NT DO GENE HLA-
G
A variabilidade da região codificadora do gene HLA-G na amostra de
brasileiros utilizada neste estudo foi previamente avaliada e publicada em um artigo
do grupo de pesquisa (Castelli et al., 2011). Esta avaliação considerou a região
compreendida pelos éxons 1 a 4 e os íntrons 1, 2 e parte do íntron 3. Desta forma,
os pontos de variação detectados nesse estudo ocorreram na posição +15, +36,
+99, +126, +130, +147, +188, +292, +297, +372, +706, +748, +755, +814, +1016,
+1019, +1054, +1590, +1799 e +1827, considerando +1 como a Adenina do primeiro
ATG traduzido. As amostras francesas e africanas não foram avaliadas quanto à
variabilidade da região codificadora do HLA-G.
100pb
300pb
500pb
218pb
540pb
1 2 3 4 5 6 7
36
A variabilidade da região 3’NT do HLA-G, por sua vez, foi previamente
analisada para todos os grupos populacionais aqui estudados e os dados publicados
(Castelli et al., 2010; Castelli et al., 2011; Courtin et al., 2013; Garcia et al., 2013;
Martelli-Palomino et al., 2013; Sabbagh et al., 2013), seguindo uma metodologia
descrita por nosso grupo (Castelli et al., 2010).
Os dados de variabilidade das 14 populações disponibilizadas pelo projeto
1000Genomes foram adquiridos diretamente no browser do projeto, considerando as
mesmas regiões previamente analisadas para as amostras brasileiras, africanas e
europeias.
4.4. NOMENCLATURA DOS HAPLÓTIPOS HLA-G
A nomenclatura dos haplótipos da região 3’NT do gene HLA-G foi dada de
acordo com o descrito em estudos anteriores (Castelli et al., 2010; Castelli et al.,
2011; Lucena-Silva et al., 2012). A tabela 3 indica os haplótipos já descritos para a
região 3’NT, o nome pelo qual este haplótipo é conhecido, e os polimorfismos
associados com cada haplótipo.
A nomenclatura dos haplótipos de região codificadora, por sua vez, é
regulamentada pelo International Immunogenetics Database (IMGT/HLA). Usando
como exemplo o alelo HLA-G*01:01:01:01, este padrão de nomenclatura segue as
seguintes regras:
(a) anterior ao asterisco está o nome do gene (HLA-G, no caso);
(b) o separador é sempre o asterisco (*);
(c) o primeiro número indica o grupo alélico, dado pelo tipo sorológico do antígeno
produzido pelo gene (neste caso, G*01);
(d) o separador (:) separa cada nível da nomenclatura;
(e) o segundo número indica uma proteína específica do gene por conta da
presença de mutações não sinônimas;
(f) o terceiro número indica substituições sinônimas na região codificadora (sem a
produção de variantes proteicas);
(g) e o quarto número indica mudanças de nucleotídeos nas regiões regulatórias do
gene.
37
(h) um sufixo no final do nome indica mudanças na expressão dessa molécula,
como, por exemplo, HLA-G*01:05N, em que o sufixo “N” indica que esse alelo é
nulo.
Tabela 3 - Principais haplótipos da região 3’NT do gene HLA-G.
Haplótipo Polimorfismos da região 3'NT
14pb +3003 +3010 +3027 +3035 +3142 +3187 +3196
UTR-1 Dela
T G C C C G C
UTR-2 Insb
T C C C G A G
UTR-3 Del T C C C G A C
UTR-4 Del C G C C C A C
UTR-5 Ins T C C T G A C
UTR-6 Del T G C C C A C
UTR-7 Ins T C A T G A C
UTR-8 Ins T G C C G A G
UTR-9 Ins T G C T G A C
UTR-10 Del T C C C G A G
UTR-11 Del C C C C G A C
UTR-13 Del T C C T G A C
UTR-14 Del T G C C G G C
UTR-15 Ins T C C C G A C
UTR-16 Ins T C C T G A G
Os haplótipos foram nomeados de acordo com o descrito anteriormente em literatura (Castelli et al., 2010;
Castelli et al., 2011; Lucena-Silva et al., 2012).
a Del - Deleção
b Ins - Inserção
4.5. FORMATAÇÃO DOS BANCOS DE DADOS
Inicialmente, os dados de variabilidade do gene HLA-G foram obtidos no
browser oficial do Projeto 1000Genomes
(http://browser.1000genomes.org/index.html). Os arquivos .vcf obtidos foram
convertido para o formato genepop (Rousset, 2008) usando o programa PGDSpider
2.0.19 (Lischer e Excoffier, 2012). Os dados obtidos foram analisados
separadamente e posteriormente concatenados aos dados disponibilizados para o
gene HLA-G das 641 amostras desse estudo, incluindo as avaliações de AluyHG.
Entretanto, dados referentes a polimorfismos do tipo INDEL geralmente não são
38
disponibilizados pelo projeto 1000Genomes, o que neste caso inclui a AluyHG e o
polimorfismos de 14pb da região 3’NT do gene HLA-G. No caso destes marcadores,
os bancos de dados continham a informação de “ausência” do dado para todos os
registros provenientes do projeto 1000Genomes.
Este banco de dados único (ou frações deste banco conforme a
necessidade), foi inicialmente convertido em um arquivo .ped (Plink Ped format),
para elaboração de um plot de LD pelo software Haploview 4.2 (Barrett et al., 2005).
Em seguida, os bancos de dados foram recodificados em um formato compatível
com os softwares PHASE 2.1.1 (Stephens et al., 2001; Stephens e Donnelly, 2003),
com auxílio de macros criados no Microsoft Word 2010. Estes últimos bancos de
dados foram utilizados para inferência de haplótipos conforme descrito adiante.
Finalmente, os dados de haplótipos foram convertidos em um formato de
texto plano compatível com o software Network 4.6.1.1 (Bandelt et al., 1999) para
elaboração de uma rede de interação envolvendo os haplótipos inferidos.
4.6. ANÁLISE DOS DADOS
As frequências alélicas e genotípicas da presença ou ausência da inserção
AluyHG foram estimadas por contagem direta. A aderência das frequências
genotípicas em relação às proporções teóricas de Hardy-Weinberg foi avaliada pelo
teste exato de Guo e Thompson (Guo e Thompson, 1992), implementado no
software Genepop® 4.2 (Raymond e Rousset, 1995).
Para a análise do desequilíbrio de ligação (LD) envolvendo os polimorfismos
do gene HLA-G e a inserção AluyHG foi utilizada a metodologia de D’ e LOD,
utilizando-se o software Haploview® (Barrett et al., 2005). As imagens de LD foram
geradas por esse programa utilizando-se os pontos de variação cuja frequência
alélica mínima (MAF) fosse 0,01, em que as áreas em vermelho escuro indicam forte
LD (LOD ≥ 2, D’ = 1), áreas em rosa indicam moderado LD (LOD ≥ 2, D’ < 1), áreas
em azul indicam fraco LD (LOD < 2, D’ = 1) e áreas em branco indicam ausência de
LD (LOD < 2, D’ < 1).
Foram utilizadas duas abordagens para a análise do LD entre as populações
do estudo. A primeira teve como foco os dados referentes à inserção AluyHG e os
39
polimorfismos presentes na região 3’NT do gene HLA-G buscando a identificação de
haplótipos entre essas duas regiões distantes entre si cerca de 20kb. Assim, nessa
primeira abordagem, foram utilizadas as populações brasileira, congolesa,
senegalesa e francesa. A segunda abordagem, por sua vez, teve como foco o
próprio gene HLA-G com a utilização dos dados das 14 populações do Projeto
1000Genomes disponibilizados publicamente e a população brasileira. Foram
avaliados, nesse contexto, polimorfismos presentes na região codificadora e na
região 3’NT do referido gene.
Dada uma associação positiva entre os alelos dos pontos de variação
encontrados, mas a fase gamética desconhecida, foi realizada uma inferência
computacional dos haplótipos definindo-se a provável constituição de cada um dos
cromossomos dos indivíduos analisados.
Para a inferência dos haplótipos, dois métodos probabilísticos foram
empregados: o software PHASE v2 (Stephens et al., 2001; Stephens e Donnelly,
2003) que implementa um método Bayesiano para reconstrução do haplótipo mais
provável; e algoritmo de máxima verossimilhança implementado no software PL-EM
(Qin et al., 2002), que calcula pela maximização da expectativa para cada um dos
haplótipos presentes nas amostras. Foram realizadas 10 corridas independentes
para cada um dos métodos e os resultados foram então comparados entre si. Para
este procedimento foi utilizado um script em Perl denominado HaploRunner
(desenvolvido por E. C. Castelli – disponível em http://www.castelli-lab.net), versão
1.1b. Este script executou as 10 corridas independentes de cada algoritmo,
comparando os resultados obtidos em todas as corridas e entre ambos os métodos.
Foram aceitas somente as inferências de haplótipos que atenderam a dois
requisitos: a) tiveram probabilidade de inferência superior a 90%; b) obtiveram o
mesmo haplótipo inferido em todas as corridas para os dois programas. Para o
método PHASE foram utilizados os seguintes parâmetros: number of iteractions:
1000; thinning interval: 1; burn-in value: 1000 e valores seed diferentes para cada
corrida, conforme descrito em um trabalho prévio (Castelli et al., 2011). Para o
algoritmo PL-EM foram utilizados os seguintes parâmetros: Top value: 0; Parsize
value: 2; Buffer: 1300 e Round value: 200.
Apesar dos dados do Projeto 1000Genomes estarem em fase, os dados
brasileiros não estavam por se tratar de sequenciamento de produto de PCR. Desta
forma, a mesma abordagem de inferência foi realizada para todas as 14 populações
40
agrupadas e os dados brasileiros. A compatibilidade entre as fases obtidas
computacionalmente e as descritas pelo projeto 1000Genomes foi maior que 99%.
As relações entre os haplótipos obtidos foram inferidas construindo-se uma
network, utilizando-se para tanto o algoritmo median-joining implementado no
programa Network® 4.6.1.0 (http://www.fluxus-engineering.com/sharenet.htm).
Foram utilizados os haplótipos com frequências superiores a 1% e excluídos os
haplótipos recombinantes a fim de facilitar a leitura da Network. As imagens geradas
pelo software foram reconstruídas utilizando-se programa de edição vetorial.
41
5. RESULTADOS
5.1. FREQUÊNCIAS ALÉLICAS E GENOTÍPICAS DA INSERÇÃO ALUYHG
Após a análise dos 641 indivíduos, compostos por 165 brasileiros (BRA), 161
congoleses (CNG), 193 senegaleses (SEE) e 122 franceses (FRA), foram
contabilizadas as frequências do alelo de ausência de inserção AluyHG (AluyHG*1)
e de presença de inserção AluyHG (AluyHG*2), como demonstrado na Tabela 4. Em
todas essas populações as frequências genotípicas foram compatíveis com o
esperado pelo teorema de Hardy-Weinberg. A Tabela 3 mostra, ainda, dados sobre
o polimorfismo AluyHG em diferentes populações estudadas até agora. Para facilitar
a compreensão, as populações foram divididas em relação ao seu componente de
ancestralidade em cinco grandes grupos: (a) África, composto pelas populações
Sekele San, Bantu, !Kung San, Khoi, senegaleses e congoleses; (b) Ásia, composto
pelas populações tailandesa, japoneses, mongóis, malaio chineses, Hunan da etnia
Han, mongóis da etnia Han, mongóis da etnia Mongol, Guangdong da etnia Han; (c)
Oceania, composto por australianos de origem europeia; (d) Europa, composto pelos
franceses; (e) América, composto por brasileiros.
As frequências do alelo AluyHG*2 variam entre as populações estudadas. As
populações de origem asiática, incluindo as populações malaio chinesa, Hunan da
etnia Han, mongóis da etnia Han, mongóis da etnia Mongol e Guangdong da etnia
Han apresentaram altas frequências desse alelo quando comparadas às outras
populações estudadas até o momento. Em contrapartida, as populações de origem
africana, incluindo as populações congolesa e senegalesa (alvos do presente
estudo), Bantu, Khoi, Sekele San e !Kung San geralmente apresentam as
frequências mais baixas quando comparadas às outras populações estudadas até
agora. As populações brasileira e francesa (alvos do presente estudo) apresentaram
frequências intermediárias às frequências de populações asiáticas e africanas para o
alelo AluyHG*2 (Tabela 4).
42
TABELA 4 - Frequências da ausência (AluyHG*1) e presença (AluyHG*2) da
inserção AluyHG em populações mundiais.
Continente População N AluyHG*1 AluyHG*2 Referência
África
Sekele San 60 0,9670 0,0330 (Kulski e Dunn, 2005)
Bantu 50 0,9400 0,0600 (Kulski e Dunn, 2005)
!Kung San 42 0,9270 0,0730 (Kulski e Dunn, 2005)
Khoi 43 0,8690 0,1310 (Kulski e Dunn, 2005)
Senegaleses 193 0,8964 0,1036 Este trabalho
Congoleses 161 0,8944 0,1056 Este trabalho
Ásia
Tailandeses 192 0,7080 0,2920 (Dunn et al., 2006)
Japoneses 99 0,7300 0,2700 (Kulski e Dunn, 2005)
Mongóis 41 0,7800 0,2200 (Kulski e Dunn, 2005)
Malaios Chineses 50 0,4400 0,5600 (Dunn et al., 2007)
Hunan da etnia Han 147 0,5646 0,4354 (Tian et al., 2008)
Mongóis da etnia Han 104 0,6106 0,3894 (Tian et al., 2008)
Mongóis da etnia Mongol 87 0,6322 0,3678 (Tian et al., 2008)
Guangdong da etnia Han 107 0,6121 0,3879 (Tian et al., 2008)
Oceania Australianos 105 0,6990 0,3010 (Kulski e Dunn, 2005)
Europa Franceses 122 0,7787 0,2213 Este trabalho
América
Coorte Brasileiro 1 a 165 0,7333 0,2667 Este trabalho
Coorte Brasileiro 2 b 101 0,7570 0,2430 Silva ACA
d
Coorte Brasileiro 3 c 61 0,7000 0,3000 Silva ACA
d
Nota: N: número de indivíduos; a
Brasileiros de Ribeirão Preto - SP; b
Brasileiros de Brasília - DF; c População Kalunga (População brasileira afrodescendente);
d Silva ACA, et al. (comunicação pessoal).
5.2. DESEQUILÍBRIO DE LIGAÇÃO
A presença de uma associação significativa entre os pontos de variação do
gene HLA-G e a inserção AluyHG foi avaliada mediante avaliação do desequilíbrio
de ligação (D’) (Lewontin, 1964), utilizando o software Haploview 4.1 (Barrett et al.,
2005), conforme previamente descrito. As figuras 6 e 7 mostram os padrões de LD
obtidos utilizando-se os pontos de variação que apresentaram frequência alélica
mínima de 1%.
Foram realizadas duas abordagens distintas para a mensuração do LD entre
as regiões citadas acima. A primeira abordagem analisou o padrão de desequilíbrio
43
de ligação entre a inserção AluyHG e os polimorfismos presentes na região 3’NT do
gene HLA-G considerando os dados de genótipos de indivíduos de quatro
populações distintas (brasileiros, senegaleses, congoleses e franceses). Essa
análise revelou a provável existência de um bloco único de segregação que engloba
a região 3’NT do HLA-G e estende-se por pelo menos 20kb de distância dessa
região, alcançando o sítio de inserção do retroelemento AluyHG (Figura 6).
Figura 6 - Perfil de LD entre os polimorfismo da região 3’NT do gene HLA-G e a
inserção AluyHG considerando dados de genótipos de indivíduos de quatro
populações distintas (brasileira, senegalesa, congolesa e francesa).
A segunda abordagem avaliou o padrão de LD entre os polimorfismos das
regiões codificadora e 3’NT do gene HLA-G, considerando os dados de 15
populações distintas, i.e., a brasileira (Castelli et al., 2011) e as 14 populações
disponibilizadas pelo Projeto 1000Genomes. Da mesma forma, nota-se a provável
existência de um bloco de segregação único que engloba desde o éxon 1 até a
região 3’NT do gene HLA-G, sem evidências de sítios de recombinação existentes
entre essas duas regiões (Figura 7).
44
Extrapolando os dados obtidos (Figura 6 e 7), podemos concluir que o
padrão de LD observado estende-se desde a região codificadora do gene HLA-G até
pelo menos 20kb de distância, chegando ao sítio de inserção do retroelemento
AluyHG.
Figura 7 - Perfil de LD entre os polimorfismos da região codificadora e 3’NT do gene
HLA-G, considerando dados de genótipos de indivíduos brasileiros e das 14
populações disponibilizadas pelo Projeto 1000Genomes.
5.3. HAPLÓTIPOS HLA-G/ALUYHG E RELAÇÃO ENTRE OS HAPLÓTIPOS
Dada a associação positiva entre todos os polimorfismos do gene HLA-G e a
inserção AluyHG (Figura 6), mas fase gamética desconhecida, haplótipos foram
inferidos por métodos probabilísticos como citado na seção de materiais e métodos.
A inferência de haplótipos foi realizada em 1733 indivíduos (1092 amostras do
Projeto 1000Genomes e 641 amostras do presente trabalho), divididos, assim como
para a análise do LD, em duas abordagens.
45
Os dados de 641 indivíduos (brasileiros, franceses, senegaleses e
congoleses) foram usados para a inferência de haplótipos considerando os
polimorfismos da região 3’NT do HLA-G e do elemento AluYHG. Destes, 628
inferências passaram nos critérios de qualidade previamente descritos
(aproximadamente 97,97%). A análise revelou a presença de 14 haplótipos distintos,
considerando-se 8 pontos de variação da região 3’NT e a inserção AluyHG, entre as
quatro populações. As frequências haplotípicas variaram entre 0,31% e 27,98%
(Tabela 5). A probabilidade média de inferência de cada par de haplótipos foi de
0,9952 para o método PHASE e de 0,9990 para o método PL-EM. A Tabela 4
apresenta o conjunto de haplótipos encontrados bem como suas frequências para as
quatro populações estudadas. O nome dos haplótipos referentes à região 3’NT do
gene HLA-G foram dados de acordo com estudos já realizados (Castelli et al., 2010;
Lucena-Silva et al., 2012), conforme tabela 3.
A população congolesa foi a que apresentou a maior quantidade de
haplótipos distintos (11 no total) em relação às outras, enquanto que senegaleses
apresentaram a menor quantidade de haplótipos (8 no total). A presença do
elemento AluyHG está associada à presença do haplótipo de 3’NT denominado
UTR-1. De fato, houve apenas uma ocorrência da presença do alelo AluyHG*2 em
ligação com outro haplótipo, denominado UTR-3, na população francesa. Assim, as
frequências do alelo AluyHG*2 e do haplótipo UTR-1 são compatíveis entre
si,indicando uma possível utilização desse polimorfismo como um marcador
molecular para o haplótipo UTR-1.
Além disso, o haplótipo UTR-1/AluyHG*2 foi o mais frequente no Brasil e o
segundo mais comum na França, tendo, em contrapartida, frequências mais baixas
nos países de origem africana (Tabela 5). Apesar dessa associação, o haplótipo
UTR-1 associado à ausência da inserção AluyHG foi encontrado em todas as
populações analisadas, em baixas frequências, com as maiores frequências
apresentadas pela população francesa. Ainda, não foram encontrados haplótipos
UTR-7 nas duas populações africanas (Tabela 5).
46
Tabela 5 - Haplótipos entre polimorfismos da região 3’NT do gene HLA-G e a
inserção AluyHG em quatro populações distintas: brasileiros, senegaleses,
congoleses e franceses.
Brasileirosa Congoleses Senegaleses Franceses
Nc 152d 161 193 122
Haplótipos 3’NT b
Alelo AluyHG
Frequências
UTR-1 Presente 0,2500 0,1056 0,1036 0,2131
UTR-1 Ausente 0,0230 0,0342 0,0052 0,0533
UTR-2 Ausente 0,2500 0,2112 0,3575 0,2664
UTR-3 Presente - - - 0,0082
UTR-3 Ausente 0,1250 0,3043 0,2798 0,1352
UTR-4 Ausente 0,1282 0,1056 0,0518 0,1434
UTR-5 Ausente 0,0757 0,0932 0,1321 0,0369
UTR-6 Ausente 0,1020 0,1304 0,0648 0,0861
UTR-7 Ausente 0,0428 - - 0,0533
UTR-8 Ausente 0,0033 0,0031 - -
UTR-15 Ausente - 0,0124 - 0,0041
UTR-16 Ausente - - 0,0052 -
UTR-17 e Ausente - 0,0093 - -
UTR-13 Ausente - 0,0031 - - a Brasileiros de Ribeirão Preto, São Paulo, Brasill.
b Os haplótipos foram nomeados de acordo com (Castelli et al., 2010; Lucena-Silva et al., 2012).
c Número de indivíduos.
d O tamanho da amostra difere do original devido ao fato de os dados da região 3’NT do gene HLA-G
não estarem disponíveis para 13 amostras. e Estes haplótipos de 3’NT não foram detectados por (Castelli et al., 2010; Lucena-Silva et al., 2012).
Em seguida, haplótipos foram inferidos a partir dos dados dos polimorfismos
do gene HLA-G (regiões codificadora e 3’NT) para as 14 populações do Projeto
1000Genomes e concatenados aos dados já publicados da população brasileira
(Castelli et al., 2011). A inferência foi realizada totalizando 1092 pares de haplótipos.
A comparação das fases obtidas computacionalmente com as fases definida pelo
sequenciamento de nova geração resultou nos mesmos haplótipos em 99% das
amostras. A Tabela 6 apresenta um total de 32 haplótipos entre as regiões
codificadora e 3’NT encontrados considerando-se as 14 populações estudadas, com
47
frequências variando entre 0,5% e 42,5%. A probabilidade média de inferência para
o método PHASE foi de 0,9738, enquanto que para o método PL-EM essa
probabilidade foi de 0,9778.
O perfil de distribuição de haplótipos do HLA-G (regiões codificadora e 3’NT)
em torno do mundo foi o mesmo descrito no Brasil (Castelli et al., 2010; Castelli et
al., 2011) e em outros estudos (Hviid et al., 2004; Hviid, 2006; Larsen e Hviid, 2009;
Jassem et al., 2012; Martinez-Laso et al., 2013). O haplótipo UTR-1 foi encontrado
em todas as populações analisadas, principalmente associado ao haplótipo de
região codificadora denominado G*01:01:01:01, e em haplótipos recombinantes em
que a porção final da sequência da região codificadora apresenta a mesma
sequência de polimorfismos do haplótipo G*01:01:01:01. Poucos haplótipos
recombinantes, tal como G*01:01:01:04/UTR-1, foram encontrados, principalmente
na população africana (Tabela 6). No Brasil, todos os haplótipos UTR-1 estavam
associados ao haplótipo codificador G*01:01:01:01. As frequências desse haplótipo
variaram de 12,18% para a população Yorubá (africana) a 42,50% para a população
Han do sul da China (asiática).
Dado o fato de que o mesmo perfil de haplótipos da região codificadora/3’NT
encontrado no Brasil também foi encontrado para outras populações mundiais, e que
o perfil de LD mostra evidência de associação entre a região 3’NT e o sítio de
inserção da sequência AluyHG, o mesmo padrão de associação entre a região
3’NT/AluyHG encontrado para as populações brasileira, senegalesa, congolesa e
francesa foi extrapolado para a população mundial. Soma-se a isso o fato de as
frequências do haplótipo G*01:01:01:01/UTR-1 serem compatíveis à frequência da
inserção AluyHG. Assim, podemos estimar a presença de um haplótipo estendido
G*01:01:01:01/UTR-1/AluyHG.
Nota-se também a ausência do haplótipo UTR-6 (e de seus haplótipos
codificadores associados) nas populações de origem asiática, bem como a ausência
do haplótipo UTR-7 (e de seus codificadores associados) nas populações de origem
africana. Além disso, as populações africanas são as que apresentam as maiores
frequências para o haplótipo UTR-3 e seus codificadores associados (Tabela 6).
48
Tabela 6 - Frequências dos haplótipos considerando polimorfismos da região codificadora e 3’NT do gene HLA-G na população
mundial.
Europa Ásia África América
População
Bri
tân
ico
s
(In
gla
terr
a/E
sc
óc
ia)
Fin
lan
de
ses
(Fin
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dia
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A)
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UA
)
Bra
sil
eir
os a
(S
ud
este
do
Bra
sil
)
Haplótipos 3’NT b Haplótipos Codificadora
c N 89 93 14 98 100 97 89 88 97 55 60 66 85 61 108
UTR-1
G*01:01:01:01 0,3371 0,3602 0,3214 0,2908 0,4250 0,2947 0,2619 0,1218 0,2391 0,2778 0,2373 0,2727 0,3941 0,2182 0,2360
G*01:01:01:04 - - - - - - - 0,0256 0,0109 0,0093 - 0,0076 - 0,0091 -
G*01:01:03 / G*01:01:01:01d - - - - 0,0050 - - - - - - - - - -
UTR-2
G*01:01:02:01 0,2303 0,1774 0,3571 0,2041 0,0400 0,1105 0,1607 0,1410 0,1848 0,1111 0,1780 0,2127 0,2059 0,2091 0,1530
G*01:01:02:02 - - - 0,0051 - - - 0,0064 0,0380 - - - - - -
G*01:06 0,0618 0,0269 0,0357 0,0663 0,0100 0,0263 0,0060 - 0,0054 0,0278 0,0424 0,0227 0,0471 0,0091 0,0510
G*01:05N - 0,0108 - 0,0255 0,0150 0,0421 0,0060 0,0962 0,0543 - 0,0085 0,0303 0,0059 0,0636 0,0420
G*01:05N (+188 C)e - - - 0,0153 - 0,0053 - 0,0128 0,0217 - 0,0085 0,0152 - 0,0182 -
G*01:01:03:01 / G*01:01:02:01d 0,0056 - - - - - 0,0060 - - - - - - 0,0182 -
G*01:01:14 - - - - - - - - - - - - - - 0,0050
UTR-3
G*01:04:01 0,0449 0,0591 0,0714 0,0969 0,2550 0,2474 0,4524 0,0256 0,0109 0,1296 0,1780 0,1515 0,0647 0,0364 0,0460
G*01:04:03 - - - - 0,0050 0,0053 0,0179 - - - - - - - 0,0050
G*01:04:04 0,0112 0,0054 - 0,0306 - - - 0,2244 0,0978 0,0556 0,0339 0,0076 0,0235 0,1000 0,0320
G*01:04:05 - - - - - - - 0,0064 0,0109 0,0093 0,0169 - - 0,0091 -
G*01:01:08 - - - - - 0,0053 0,0119 - - - - - - - -
G*01:04:04 (+188 C)e - - - - - - - 0,0064 - - - - - - -
G*01:01:03 / G*01:04:01d - - - - 0,0050 0,0158 0,0119 - - - - - - - -
UTR-4 G*01:01:01:05 0,1180 0,2849 0,1071 0,1429 0,0200 0,0474 0,0060 0,1154 0,0761 0,1296 0,1356 0,0758 0,1529 0,0545 0,0970
G*01:01:09 - - - - - - - 0,0321 0,0272 - 0,0085 0,0076 - 0,0091 0,0050
49
UTR-5
G*01:03 0,0281 0,0161 - 0,0306 - 0,0263 0,0179 0,0897 0,0870 0,1111 0,0763 0,0985 0,0353 0,1364 0,0880
G*01:04:01 0,0056 - - 0,0051 - - - - - 0,0093 - - - - -
G*01:01:08 - - - - - - - - - - - - - - 0,0090
UTR-6
G*01:01:01:04 0,0618 0,0108 0,0714 0,0204 - - - 0,0833 0,1359 0,0833 0,0678 0,0379 0,0118 0,1000 0,0740
G*01:01:01:01 - - - 0,0051 - - - - - - - - 0,0059 - 0,0090
G*01:01:01:05 - - - 0,0051 - - - 0,0128 - - - - - - 0,0149
G*01:01:01:04 (+1019 C)e - - - 0,0051 - - - - - - - - - - -
UTR-7 G*01:01:03:01 0,0899 0,0484 0,0357 0,0459 0,2200 0,1684 0,0471 - - 0,0463 0,0085 0,0455 0,0471 0,0091 0,0370
G*01:01:05 - - - - - - - - - - - - - - 0,0050
UTR-8 G*01:06 - - - - - - - - - - - - - - 0,0140
UTR-9 G*01:01:08 0,0056 - - 0,0051 - 0,0053 - - - - - - - - -
UTR-18f G*01:01:02:01 - - - - - - - - - - - 0,0076 - - -
UTR-19f G*01:01:03:01 - - - - - - - - - - - - 0,0059 - -
N - número de indivíduos a Brasileiros de Ribeirão Preto, São Paulo. A variabilidade do gene HLA-G foi publicada previamente (Castelli et al., 2011).
b Os haplótipos da região 3’NT do gene HLA-G foram nomeados de acordo com (Castelli et al., 2010; Lucena-Silva et al., 2012).
c Os haplótipos da região codificadora foram nomeados de acordo com o padronizado pelo IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/).
d Haplótipos recombinantes.
e Haplótipo ancestral mais provável e a mutação que define esse novo haplótipo.
f Esses haplótipos não foram detectados previamente (Castelli et al., 2010; Lucena-Silva et al., 2012).
50
Para avaliar a similaridade entre os haplótipos encontrados por meio das duas
abordagens citadas, duas redes foram construídas (Figuras 8 e 9). A partir da
análise da primeira rede (Figura 8), construída a partir dos dados de polimorfismos
da região 3’NT do gene HLA-G e da inserção AluyHG, pudemos definir 5 linhagens
de acordo com o descrito na literatura (Castelli et al., 2011). Notamos que a
linhagem que carrega o haplótipo AluyHG*2 aparece na extremidade da rede e em
alta frequência. Apesar disso, esse haplótipo pode ser um dos mais recentes na
história evolutiva humana.
Por meio da análise da segunda rede (Figura 9), construída a partir dos
polimorfismos das regiões codificadora e 3’NT do gene HLA-G, as 5 principais
linhagens já anteriormente também estão representadas. Novamente, a rede mostra
o haplótipo G*01:01:01:01/UTR-1 na extremidade e em alta frequência.
Considerando a associação entre AluyHG e o haplótipos UTR-1, é provável que o
haplótipos estendido G*01:01:01:01/UTR1/AluyHG seja um dos mais recentes no
curso da história evolutiva humana, apesar de sua elevada frequência.
Figura 8 - Rede de haplótipos construída a partir dos dados de polimorfismos da
região 3’NT do gene HLA-G e a inserção AluyHG considerando os dados das
51
populações brasileira, senegalesa, congolesa e francesa. As cores diferentes
indicam linhagens diferentes desses haplótipos.
Figura 9 - Rede de haplótipos construída a partir dos dados de polimorfismos das
regiões codificadora e 3’NT do gene HLA-G a partir dos dados disponibilizados pelo
Projeto 1000Genomes. As linhagens têm as mesmas cores da Figura 7 e foram
nomeadas de acordo com (Castelli et al., 2011).
52
6. DISCUSSÃO
O presente trabalho consiste no primeiro a avaliar a relação entre a inserção
AluyHG e polimorfismos presentes no gene HLA-G. Foram caracterizadas 641
amostras de quatro populações distintas, incluindo uma amostra da população
brasileira do estado de São Paulo, e amostras do Congo, Senegal e França, quanto
à presença ou ausência do retroelemento AluyHG e sua relação com sítios
polimórficos encontrados nas regiões codificadora e 3’NT do gene HLA-G. Os
resultados obtidos foram comparados com dados disponibilizados pelo Projeto
1000Genomes, permitindo uma avaliação global da distribuição dos haplótipos de
HLA-G no mundo.
Estudos anteriores relataram a presença da inserção AluyHG em altas
frequências nas populações asiáticas (Tabela 4), principalmente entre chineses
(Dunn et al., 2007; Tian et al., 2008). No Brasil, as frequências do alelo de inserção,
AluyHG*2, foram similares as frequências já descritas para populações europeias,
japonesas e tailandesas (Tabela 4). Esta similaridade pode ser explicada pela
história de formação da população brasileira do estado de São Paulo, que apresenta
como principal componente de ancestralidade as populações de origem europeia
(Ferreira et al., 2006; Muniz et al., 2008). Além disso, as frequências do alelo
AluyHG*2 (ausência do elemento AluyHG) foram similares às encontradas para a
população de Brasília - DF (Capital Federal, distante aproximadamente 706 km de
Ribeirão Preto - SP) e também para a população Kalunga (população
afrodescendente habitante do Estado de Goiás - GO) (Silva ACA, comunicação
pessoal). A população Kalunga, considerada afrodescendente, apresentou
frequência do alelo AluyHG*2 mais elevada do que a encontrada para a população
de Ribeirão Preto – SP (Tabela 4). Em geral, as populações africanas apresentaram
as menores frequências deste elemento. Acredita-se que este fato deva-se à
miscigenação que a população Kalunga sofreu ao longo do seu processo de
formação.
Por outro lado, as frequências do alelo AluyHG*2 na população francesa
apresentam-se intermediárias às encontradas para os grupos brasileiro e africanos.
Entretanto, apesar de serem baixas as frequências de inserção desse retroelemento
nas populações africanas, o fato de podermos encontrar cromossomos
53
apresentando tal inserção nesse continente indica que provavelmente o evento de
inserção ocorreu antes da dispersão do homem para outros continentes. Tal
hipótese é baseada no fato de que o evento de transposição do elemento AluyHG é
considerado um processo aleatório, ou seja, não há predileção de inserção em uma
sequência específica de um cromossomo (Jurka, 1997). Assim, é pouco provável
que uma mesma sequência de transposição seja inserida exatamente no mesmo
loco por dois eventos diversos de inserção que ocorreram também em tempos
diversos (Kulski e Dunn, 2005). Além disso, não há mecanismo conhecido
responsável por retirar a sequência Alu após sua inserção em um determinado loco.
Portanto, podemos inferir que aqueles indivíduos que apresentam a mesma
sequência Alu no mesmo loco apresentam um ancestral comum, devido à sua
característica de identidade por descendência (Kulski e Dunn, 2005), e que o
processo de transposição ocorreu ainda na África antes da dispersão do homem a
outros continentes. Essas baixas frequências no continente africano indicam que a
inserção do elemento AluyHG é recente na história humana, mas antiga o suficiente
para que fosse difundido pelos outros continentes durante a dispersão do homem.
Entretanto, vale ressaltar que o processo de transposição pode ser dirigido
por sequências específicas apresentadas em certos cromossomos (Jurka, 1997).
Além disso, a frequência de determinados haplótipos presentes à época do evento
inicial de transposição também pode facilitar a sua inserção em determinados
haplótipos, notadamente os mais frequentes, sem, entretanto, desobedecermos à
premissa de que a inserção é um evento aleatório. Assim, apesar do possível
direcionamento do evento de transposição para haplótipos mais frequentes, continua
pouco provável que dois eventos distintos insiram uma mesma sequência de
transposição num mesmo loco.
As frequências do alelo AluyHG*2 apontam para o fato de que o possível
efeito fundador sofrido durante a formação das populações humanas a partir da sua
saída do continente africano (Henn et al., 2012) pode ser responsável pelo aumento
dessas frequências nas populações consideradas não africanas (Tabela 4). De fato,
quando comparamos as frequências do elemento AluyHG com o evento de
dispersão do homem, bem como suas rotas migratórias (Henn et al., 2012),
observamos um aumento gradual das frequências com o aumento do tempo e da
distância da dispersão do homem à partir da África para os outros continentes.
Assim, as frequências aumentadas do alelo AluyHG*2 em continentes não africanos
54
pode ser consequência do isolamento pela distância dessas populações em relação
às populações africanas, além da possível pressão seletiva atuando sobre essa
região. As frequências das quatro populações avaliadas pelo presente estudo
corroboram tal hipótese, indicando a possibilidade de sucessivos efeitos fundadores
atuando sobre esse loco, pois notamos frequências baixas do alelo de inserção
desse elemento no continente africano, frequências intermediárias na população
europeia e frequências ligeiramente mais altas na população brasileira (Tabela 4).
Frequências aumentadas desse retroelemento apresentadas por populações
de origem asiática, notadamente as chinesas, podem representar um reflexo cultural
dessas populações, incluindo maior incidência de endogamia, principalmente em se
tratando de grupos étnicos fechados dentro dessas populações (Chen et al., 2007),
somada à possível pressão seletiva diferenciada apresentada nessa região do
mundo.
Embora a teoria da evolução neutra possa explicar a distribuição do
retroelemento AluyHG, devido à sua localização ser intergênica, a região
cromossômica adjacente é um dos principais alvos de seleção do genoma humano
(Solberg et al., 2008). Tal característica ocorre devido ao fato de essa região
apresentar genes relacionados à função do sistema imune, sendo moldada por
exposição a patógenos específicos (Klein e Sato, 2000a; 2000b). De fato, há
evidências de sinais de seleção balanceadora atuando sobre regiões regulatórias do
gene HLA-G (Tan et al., 2005; Castelli et al., 2011), notadamente em sua região
3’NT (Castelli et al., 2011), distante apenas 20kb do sítio de inserção AluyHG. Além
disso, a assinatura de seleção balanceadora que atua sobre essas regiões do gene
HLA-G pode ser devida à seleção balanceadora atuando em outros genes da
mesma região cromossômica (Gaudieri et al., 2000), principalmente sobre o gene
HLA-A (responsável por apresentação antigênica e um dos mais variáveis do
genoma humano), localizado após a inserção AluyHG. Assim, como a inserção
AluyHG encontra-se entre esses dois importantes genes do sistema imune e já foi
demonstrado forte LD entre essa inserção e grupos alélicos específicos de HLA-A,
notadamente o grupo HLA-A*02 (Kulski et al., 2001), acreditamos que essa região,
apesar de intergênica, pode sofrer a influência da seleção natural atuando em genes
localizados em sua periferia.
Considerando sua proximidade ao gene HLA-G (cerca de 20kb) e sua relação
já demonstrada com certos grupos alélicos do gene HLA-A (Kulski et al., 2001),
55
avaliamos o perfil de desequilíbrio de ligação entre a inserção AluyHG e os
polimorfismos presentes na região 3’NT do gene HLA-G (Figura 6), que apresenta
grande importância na regulação pós-transcricional desse gene e sinais de seleção
balanceadora mantendo alta heterozigosidade (Castelli et al., 2011; Martinez-Laso et
al., 2013). Devido ao fato de o evento de tranposição da inserção AluyHG ser um
evento antigo, provavelmente ocorrido antes da dispersão do homem à partir da
África, e também considerando sua distância em relação ao gene HLA-G, era
esperado que eventos de recombinação gerassem diferentes haplótipos de 3’NT
associados com a inserção do AluyHG. Entretanto, observamos que a inserção
AluyHG somente foi associada a apenas um haplótipo de 3’NT, denominado UTR-1
(Tabela 4).
O haplótipo UTR-1 foi recentemente considerado como um haplótipo
associado com alta produção da molécula de HLA-G (Martelli-Palomino et al., 2013)
e apresenta altas frequências nas populações mundiais (Castelli et al., 2011; Donadi
et al., 2011). Este haplótipo possui um polimorfismo do tipo indel caracterizado pela
deleção de 14pb na região 3’NT, previamente associada com uma maior produção
de HLA-G (Hviid et al., 2003; Rousseau et al., 2003; Castelli et al., 2011; Donadi et
al., 2011; Martelli-Palomino et al., 2013), além de outros polimorfismos que
aumentam a estabilidade do mRNA e diminuem sua afinidade por microRNAs
(Martelli-Palomino et al., 2013). As frequências do haplótipo UTR-1 foram bastante
similares às frequências encontradas para a inserção AluyHG (Tabelas 4 e 5),
indicando que essa inserção pode ser considerada um marcador para esse
haplótipo. Novamente, observamos que as frequências do haplótipo UTR-
1/AluyHG*2 aumentam periodicamente em relação ao aumento da distância e do
tempo de dispersão do homem a partir da África, como já descrito. Entretanto, a
hipótese de sinais de seleção atuando sobre a região de inserção faz-se mais
plausível sobre o olhar de sua relação com o gene HLA-G. Assim, o aumento de
frequências tanto do haplótipo UTR-1 e da inserção AluyHG pode ser reflexo dessas
duas forças atuando sobre essas regiões.
Apesar da forte associação encontrada entre o elemento AluyHG e o
haplótipo UTR-1, observamos a presença desse haplótipo associado com a
ausência da inserção AluyHG em todas as populações avaliadas, em baixas
frequências. Teoricamente, esse haplótipo (UTR-1/AluyHG*1) pode ser considerado
como o haplótipo ancestral, mostrando que o evento de inserção, apesar de
56
bastante antigo como já demonstrado, ainda não conseguiu fixar a inserção ao
haplótipo de UTR-1. Entretanto, possíveis eventos de recombinação entre haplótipos
UTR-1/AluyHG*2 e qualquer outro haplótipo que não apresenta a inserção não pode
ser descartada. Tal fato pode ser comprovado pela presença de um cromossomo
apresentando o haplótipo UTR-3/AluyHG*2 na França (Tabela 5). Além disso, era
esperado que o haplótipo UTR-1/AluyHG*1 fosse encontrado em frequências
elevadas no continente africano, considerado o continente ancestral. Entretanto, era
esperada a presença de haplótipos diferentes acompanhados pela inserção AluyHG
em todas as populações analisadas, o que torna pouco provável que os haplótipos
UTR-1/AluyHG*1 sejam recombinantes. Desta forma, é provável que o haplótipo
UTR-1/AluyHG*1 seja o haplótipo ancestral da inserção AluyHG.
A distribuição de haplótipos de 3’NT do HLA-G em torno do mundo é
praticamente a mesma já definida em estudos prévios para a população brasileira
(Castelli et al., 2011; Lucena-Silva et al., 2012), com exceção ao haplótipo UTR-7. O
haplótipo UTR-7 não foi encontrado no continente africano, indicando que sua
formação pode ser um evento recente, após a dispersão do homem a partir da África
e que o fluxo gênico ainda não a introduziu nesse continente ou sua frequência é
muita baixa para ser encontrado considerando a amostra analisada. Entretanto, mais
estudos são necessários para se desvendar o verdadeiro significado da sua
ausência nesse continente, já que a seleção direcionada por patógenos também
pode moldar suas frequências em torno do mundo.
O haplótipo UTR-1, de maneira geral, ocorre em cromossomos também
portando o haplótipo de região codificadora G*01:01:01:01 (Castelli et al., 2011).
Considerando que o mesmo perfil de associação entre haplótipos foi observado no
mundo todo, bem como a presença de blocos únicos de segregação englobando o
gene HLA-G e o elementos AluyHG, é provável que o haplótipo G*01:01:01:01/UTR-
1/AluyHG também ocorra no mundo todo acompanhando as frequências observadas
para o haplótipo G*01:01:01:01/UTR-1. Curiosamente, o haplótipo
G*01:01:01:01/UTR-1 tem baixas frequências no continente africano e frequências
mais altas nas outras partes do mundo, seguindo o mesmo modelo já descrito tanto
para a inserção AluyHG como para o haplótipo de UTR-1 (Tabela 6).
O haplótipo G*01:01:01:01/UTR-1 foi recentemente associado a alta produção
da molécula de HLA-G por meio da combinação de características, que incluem: (a)
a transcrição de um RNA mensageiro mais estável (Yie et al., 2008); (b) baixa
57
afinidade por microRNAs, responsáveis por mediar a degradação do RNA
mensageiro por meio de um complexo enzimático (Tan et al., 2007; Castelli et al.,
2009; Manaster et al., 2012); (c) uma região regulatória 5’ única, inclusive
apresentando fortes sítios promotores para o hormônio progesterona (Hviid et al.,
1999; Solier et al., 2001; Tan et al., 2005; Castelli et al., 2011; Martinez-Laso et al.,
2013). Desta forma, é razoável propor que, devido às características de alta
produção da molécula de HLA-G apresentada pelo haplótipo G*01:01:01:01/UTR-1,
as frequências aumentadas desse haplótipo e, em consequência, da inserção
AluyHG, nas populações modernas, pode ser devido ao efeito da seleção natural
atuando sobre essa região.
A presença do haplótipo UTR-1 geralmente é acompanhada de outro
haplótipo de baixa produção da molécula de HLA-G, notadamente o UTR-2. Esse
fato está em acordo com as evidências de seleção balanceadora já observadas para
a região 3’NT desse gene, ou seja, favorecendo a heterozigose (Castelli et al.,
2011). Fisiologicamente, essa dualidade passa a ser favorável ao indivíduo, que
estaria melhor adaptado para responder a diferentes situações adequadamente,
como durante a gestação ou doenças autoimunes (necessidade de inibição do
sistema imunitário) ou infecções crônicas (necessidade de uma resposta
imunológica mais ativa). Assim, teoricamente, indivíduos que apresentam alelos
para alta e baixa produção da molécula de HLA-G, considerada como de modulação
do sistema imune, têm um perfil de atuação das células do sistema imune mais
preciso (Donadi et al., 2011).
De maneira global, observamos que as frequências da inserção AluyHG
foram compatíveis com as frequências de UTR-1 nas populações analisadas nesse
trabalho, provavelmente devido ao efeito carona atuando entre essas duas regiões.
Estendendo nossa análise para todo o gene HLA-G, em que notamos forte
desequilíbrio de ligação entre os pontos de variação pertencentes às suas regiões
codificadora e 3’NT, podemos observar que há um bloco de haplótipos definido que
engloba todo o gene HLA-G e pelo menos 20kb de nucleotídeos além da região
3’NT, local onde está inserida a sequência AluyHG (Figuras 6 e 7). Soma-se a isso o
achado de Kulski et al. (2001) de que o forte LD também pode ser encontrado até o
gene HLA-A, mostrando que esse bloco de haplótipos pode chegar a 200kb.
Portanto, os eventos que atuam sobre o gene HLA-G e aumentam as frequência de
determinados haplótipos, notadamente o G*01:01:01:01/UTR-1, também atuam
58
sobre a região de inserção AluyHG. Acreditamos que esse conservado bloco de
haplótipos pode ser uma consequência do importante papel desempenhado pelo
gene HLA-G na modulação do sistema imune e na tolerância imunológica, tão
importante, por exemplo, durante a gravidez (Hviid, 2006; Larsen e Hviid, 2009;
Donadi et al., 2011), pois a manutenção de moléculas ativas na imunomodulação é
de grande importância para a fisiologia humana.
As frequências mais altas para o haplótipo G*01:01:01:01/UTR-1 foram
encontradas nas populações asiáticas, principalmente na população Chinesa do
grupo étnico Han, o que está em acordo com as altas frequências da inserção
AluyHG na Ásia (Dunn et al., 2007; Tian et al., 2008). Essas populações não
apresentam o haplótipo UTR-6 ou seus haplótipos codificadores associados.
Acreditamos que esse haplótipo possa ter sido perdido no curso evolutivo de
formação dessa população por deriva genética ou por pressões seletivas, i.e., as
mesmas razões para o aumento das frequências do haplótipo G*01:01:01:01/UTR-1.
Em contraste, essas populações, assim como as africanas, apresentam altas
frequências do haplótipo UTR-3 (Tabela 5), o que também pode ser observado para
as populações senegalesa e congolesa analisadas nesse estudo (Tabela 5).
As frequências do haplótipo UTR-3 são baixas no continente africano,
provavelmente também devido à atuação de efeito fundador somado às pressões
seletivas. Essas populações não apresentam o haplótipo UTR-7 assim como seus
codificadores associados (Tabelas 4 e 5). A UTR-7 foi, recentemente, associada
com baixas produções da molécula solúvel de HLA-G (Martelli-Palomino et al.,
2013). A sua ausência nessas populações pode significar a presença de forças
seletivas negativas atuando sobre esse haplótipo ou mesmo que ele seja mais
recente, como já discutido. Entretanto, mais estudos são necessários para se
desvendar esse cenário.
Não obstante, o fato de praticamente não haver recombinante (99% do alelo
AluyHG foi associado com UTR-1 considerando-se o Brasil, Congo, Senegal e
França, e 100% do alelo AluyHG foi associado ao haplótipo G*01:01:01:01/UTR-1,
(considerando somente o Brasil) e a presença de baixas frequências de AluyHG na
África, nos permite dizer que, apesar de apresentar altas frequências nas
populações modernas, o haplótipo G*01:01:01:01/UTR-1 pode ser um dos mais
recentes haplótipos de HLA-G. Caso contrário, seria esperada uma alta taxa de
recombinação entre essas duas regiões. Da mesma forma, a análise das redes
59
(Figuras 8 e 9) sugere que, caso o haplótipo G*01:01:01:01/UTR-1 fosse antigo,
seria esperado que outros haplótipos também compartilhassem a presença da
inserção AluyHG. De fato, é bastante provável que a inserção tenha ocorrido cedo
durante a emergência do haplótipo G*01:01:01:01/UTR-1 ainda na África, e que
esse padrão permaneceu o mesmo desde então, ocorrendo tão somente o aumento
de frequências até os dias atuais. Contudo, esse haplótipo já havia sido considerado
como possivelmente um dos mais recentes haplótipos de HLA-G devido à ausência
de uma inserção de 14pb presente na sua região 3’NT (Castro et al., 2000). Esses
pesquisadores mostraram que essa sequência estava presente em primatas e,
teoricamente, os haplótipos modernos que possuem os 14pb em sua sequência são
mais antigos em relação aos que não a apresentam.
As mesmas linhagens para o haplótipo estendido de HLA-G descritas por
Castelli et al. (2011) foram encontradas pelo presente trabalho. Além disso, essas
linhagens também foram encontradas quando utilizamos apenas os dados de
polimorfismos da região 3’NT, somados ao dado da inserção AluyHG (Figura 8).
Assim, novamente a identificação de associação entre a UTR-1 e a inserção AluyHG
corrobora o fato de esse haplótipo ser considerado um dos mais recentes na história
evolutiva desse gene. De fato, como não existe nenhum mecanismo conhecido que
retire exatamente a sequência Alu de uma dada localização cromossômica, é pouco
provável que a raiz da rede seja a linhagem HG010101, ou os haplótipos derivados
desse também apresentariam a inserção AluyHG.
60
7. CONCLUSÃO
As frequências da inserção AluyHG nas quatro populações analisadas no
presente manuscrito são menores nas populações africanas (congoleses e
senegaleses) em comparação com as populações brasileira e francesa, indicando
possível efeito do fundador atuando nessa região aumentando as frequências dessa
inserção ao longo do tempo. Além disso, a existência dessa inserção em populações
africanas, mesmo que em baixas frequências, indica que o evento de transposição
ocorreu ainda nesse continente, antes da dispersão do homem aos outros
continentes.
O perfil de Desequilíbrio de Ligação (LD) encontrado entre a inserção AluyHG
e pontos de variação na região 3’NT do gene HLA-G, além do LD entre os pontos de
variação da região 3’NT e da região codificadora desse gene, incluindo-se os dados
disponibilizados pelo 1000Genomes Project Consortium, sugere a existência de um
bloco único de segregação abrangendo todo o gene HLA-G e estendendo-se por,
pelo menos, 20-kb à partir da região 3’NT, indicando que essa região sofreu poucos
eventos de recombinação desde a dispersão do homem à partir da África.
O presente trabalho corrobora a evidência de que o haplótipo
G*01:01:01:01/UTR-1 pode ser o mais recente entre os mais frequentes haplótipos
encontrados para o gene HLA-G. As frequências do haplótipo G*01:01:01:01/UTR-
1/AluyHG em torno do mundo (e também para outros haplótipos do gene HLA-G)
pode ser consequência de consecutivos efeitos de fundador atuando sobre esse
gene desde a saída do homem do continente africano, bem como de seleção
atuando sobre essas frequências.
61
8. REFERÊNCIAS
ABBAS, A. K. ET AL. Cellular and Molecular Immunology. Philadelphia: Saunders/Elsevier, 2010. 566. ALLEN, P. D. Anesthesia and the human genome project: the quest for accurate prediction of drug responses. Anesthesiology, v. 102, n. 3, p. 494-5, Mar 2005. BANDELT, H. J.; FORSTER P.; ROHL A. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies. Mol Biol Evol, v. 16, n. 1, p. 37-48, Jan 1999. BARRETT, J. C.; FRY B.; MALLER J. et al. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics, v. 21, n. 2, p. 263-5, Jan 15 2005. BARTEL, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, v. 116, n. 2, p. 281-97, Jan 23 2004. BATZER, M. A.; DEININGER P. L. Alu repeats and human genomic diversity. Nat Rev Genet, v. 3, n. 5, p. 370-9, May 2002. BATZER, M. A.; DEININGER P. L.; HELLMANNBLUMBERG U. et al. Standardized nomenclature for Alu repeats. Journal of Molecular Evolution, v. 42, n. 1, p. 3-6, Jan 1996. BATZER, M. A.; STONEKING M.; ALEGRIA-HARTMAN M. et al. African origin of human-specific polymorphic Alu insertions. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 91, n. 25, p. 12288-92, Dec 6 1994. CAROSELLA, E. D. The tolerogenic molecule HLA-G. Immunol Lett, v. 138, n. 1, p. 22-4, Jul 2011. CAROSELLA, E. D.; FAVIER B.; ROUAS-FREISS N. et al. Beyond the increasing complexity of the immunomodulatory HLA-G molecule. Blood, v. 111, n. 10, p. 4862-70, May 15 2008. CASTELLI, E. C.; MENDES-JUNIOR C. T.; DEGHAIDE N. H. et al. The genetic structure of 3'untranslated region of the HLA-G gene: polymorphisms and haplotypes. Genes Immun, v. 11, n. 2, p. 134-41, Mar 2010. CASTELLI, E. C.; MENDES-JUNIOR C. T.; VEIGA-CASTELLI L. C. et al. A comprehensive study of polymorphic sites along the HLA-G gene: implication for gene regulation and evolution. Mol Biol Evol, v. 28, n. 11, p. 3069-86, Nov 2011. CASTELLI, E. C.; MOREAU P.; OYA E CHIROMATZO A. et al. In silico analysis of microRNAS targeting the HLA-G 3' untranslated region alleles and haplotypes. Hum Immunol, v. 70, n. 12, p. 1020-5, Dec 2009.
62
CASTRO, M. J.; MORALES P.; MARTINEZ-LASO J. et al. Evolution of MHC-G in humans and primates based on three new 3'UT polymorphisms. Hum Immunol, v. 61, n. 11, p. 1157-63, Nov 2000. CERVERA, I.; HERRAIZ M. A.; PENALOZA J. et al. Human leukocyte antigen-G allele polymorphisms have evolved following three different evolutionary lineages based on intron sequences. Hum Immunol, v. 71, n. 11, p. 1109-15, Nov 2010. CHEN, S.; HU Q.; LIU Z. et al. The distribution of HLA alleles revealed a founder effect in the geographically isolated Chinese population, Drung. Mol Immunol, v. 44, n. 8, p. 2017-22, Mar 2007. CONTINI, P.; GHIO M.; POGGI A. et al. Soluble HLA-G1/CD8 ligation triggers apoptosis in CD8(+) T lymphocytes and NK cells by FAS/FASL interaction and inhibits cytotoxic T-cell activity. Tissue Antigens, v. 62, n. 4, p. 347-347, Oct 2003a. CONTINI, P.; GHIO M.; POGGI A. et al. Soluble HLA-A,-B,-C and -G molecules induce apoptosis in T and NKCD8(+) cells and inhibit cytotoxic T cell activity through CD8 ligation. European Journal of Immunology, v. 33, n. 1, p. 125-134, Jan 2003b. CORDAUX, R.; HEDGES D. J.; HERKE S. W. et al. Estimating the retrotransposition rate of human Alu elements. Gene, v. 373, p. 134-7, May 24 2006. COURTIN, D.; MILET J.; SABBAGH A. et al. HLA-G 3' UTR-2 haplotype is associated with Human African trypanosomiasis susceptibility. Infect Genet Evol, Mar 26 2013. DE ALMEIDA, D. E.; LING S.; PI X. et al. Immune dysregulation by the rheumatoid arthritis shared epitope. J Immunol, v. 185, n. 3, p. 1927-34, Aug 1 2010. DEININGER, P. L.; BATZER M. A. Alu repeats and human disease. Mol Genet Metab, v. 67, n. 3, p. 183-93, Jul 1999. DELVES, P. J.; ROITT I. M. The immune system. First of two parts. N Engl J Med, v. 343, n. 1, p. 37-49, Jul 6 2000a. DELVES, P. J.; ROITT I. M. The immune system. Second of two parts. N Engl J Med, v. 343, n. 2, p. 108-17, Jul 13 2000b. DI CRISTOFARO, J.; EL MOUJALLY D.; AGNEL A. et al. HLA-G haplotype structure shows good conservation between different populations and good correlation with high, normal and low soluble HLA-G expression. Hum Immunol, v. 74, n. 2, p. 203-6, Feb 2013. DONADI, E. A.; CASTELLI E. C.; ARNAIZ-VILLENA A. et al. Implications of the polymorphism of HLA-G on its function, regulation, evolution and disease association. Cell Mol Life Sci, v. 68, n. 3, p. 369-95, Feb 2011.
63
DUNN, D. S.; CHOY M. K.; PHIPPS M. E. et al. The distribution of major histocompatibility complex class I polymorphic Alu insertions and their associations with HLA alleles in a Chinese population from Malaysia. Tissue Antigens, v. 70, n. 2, p. 136-43, Aug 2007. DUNN, D. S.; INOKO H.; KULSKI J. K. Dimorphic Alu element located between the TFIIH and CDSN genes within the major histocompatibility complex. Electrophoresis, v. 24, n. 16, p. 2740-2748, Aug 2003. DUNN, D. S.; INOKO H.; KULSKI J. K. The association between non-melanoma skin cancer and a young dimorphic Alu element within the major histocompatibility complex class I genomic region. Tissue Antigens, v. 68, n. 2, p. 127-34, Aug 2006. DUNN, D. S.; NARUSE T.; INOKO H. et al. The association between HLA-A alleles and young Alu dimorphisms near the HLA-J, -H, and -F genes in workshop cell lines and Japanese and Australian populations. Journal of Molecular Evolution, v. 55, n. 6, p. 718-726, Dec 2002. FERREIRA, L. B.; MENDES-JUNIOR C. T.; WIEZEL C. E. et al. Genomic ancestry of a sample population from the state of Sao Paulo, Brazil. Am J Hum Biol, v. 18, n. 5, p. 702-5, Sep-Oct 2006. GAO, G. F.; WILLCOX B. E.; WYER J. R. et al. Classical and nonclassical class I major histocompatibility complex molecules exhibit subtle conformational differences that affect binding to CD8alphaalpha. J Biol Chem, v. 275, n. 20, p. 15232-8, May 19 2000. GARCIA-OBREGON, S.; ALFONSO-SANCHEZ M. A.; GOMEZ-PEREZ L. et al. Microsatellites and Alu elements from the human MHC in Valencia (Spain): analysis of genetic relationships and linkage disequilibrium. Int J Immunogenet, v. 38, n. 6, p. 483-91, Dec 2011. GARCIA, A.; MILET J.; COURTIN D. et al. Association of HLA-G 3'UTR polymorphisms with response to malaria infection: A first insight. Infect Genet Evol, Mar 14 2013. GAUDIERI, S.; DAWKINS R. L.; HABARA K. et al. SNP profile within the human major histocompatibility complex reveals an extreme and interrupted level of nucleotide diversity. Genome Res, v. 10, n. 10, p. 1579-86, Oct 2000. GERAGHTY, D. E.; KOLLER B. H.; HANSEN J. A. et al. The Hla Class-I Gene Family Includes at Least 6 Genes and 12 Pseudogenes and Gene Fragments. Journal of Immunology, v. 149, n. 6, p. 1934-1946, Sep 15 1992. GERAGHTY, D. E.; KOLLER B. H.; ORR H. T. A human major histocompatibility complex class I gene that encodes a protein with a shortened cytoplasmic segment. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 84, n. 24, p. 9145-9, Dec 1987.
64
GREGERSEN, P. K.; SILVER J.; WINCHESTER R. J. The shared epitope hypothesis. An approach to understanding the molecular genetics of susceptibility to rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, v. 30, n. 11, p. 1205-13, Nov 1987. GUO, S. W.; THOMPSON E. A. Performing the exact test of Hardy-Weinberg proportion for multiple alleles. Biometrics, v. 48, n. 2, p. 361-72, Jun 1992. HARROW, J.; FRANKISH A.; GONZALEZ J. M. et al. GENCODE: the reference human genome annotation for The ENCODE Project. Genome Res, v. 22, n. 9, p. 1760-74, Sep 2012. HENN, B. M.; CAVALLI-SFORZA L. L.; FELDMAN M. W. The great human expansion. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 109, n. 44, p. 17758-64, Oct 30 2012. HORTON, R.; WILMING L.; RAND V. et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet, v. 5, n. 12, p. 889-99, Dec 2004. HOUCK, C. M.; RINEHART F. P.; SCHMID C. W. A ubiquitous family of repeated DNA sequences in the human genome. J Mol Biol, v. 132, n. 3, p. 289-306, Aug 15 1979. HVIID, T. V. HLA-G in human reproduction: aspects of genetics, function and pregnancy complications. Hum Reprod Update, v. 12, n. 3, p. 209-32, May-Jun 2006. HVIID, T. V.; HYLENIUS S.; RORBYE C. et al. HLA-G allelic variants are associated with differences in the HLA-G mRNA isoform profile and HLA-G mRNA levels. Immunogenetics, v. 55, n. 2, p. 63-79, May 2003. HVIID, T. V.; RIZZO R.; CHRISTIANSEN O. B. et al. HLA-G and IL-10 in serum in relation to HLA-G genotype and polymorphisms. Immunogenetics, v. 56, n. 3, p. 135-41, Jun 2004. HVIID, T. V.; SORENSEN S.; MORLING N. Polymorphism in the regulatory region located more than 1.1 kilobases 5' to the start site of transcription, the promoter region, and exon 1 of the HLA-G gene. Hum Immunol, v. 60, n. 12, p. 1237-44, Dec 1999. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, v. 409, n. 6822, p. 860-921, Feb 15 2001. International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature, v. 431, n. 7011, p. 931-45, Oct 21 2004. ISHITANI, A.; GERAGHTY D. E. Alternative splicing of HLA-G transcripts yields proteins with primary structures resembling both class I and class II antigens. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 89, n. 9, p. 3947-51, May 1 1992.
65
JACOB, S.; MCCLINTOCK M. K.; ZELANO B. et al. Paternally inherited HLA alleles are associated with women's choice of male odor. Nat Genet, v. 30, n. 2, p. 175-9, Feb 2002. JASSEM, R. M.; SHANI W. S.; LOISEL D. A. et al. HLA-G polymorphisms and soluble HLA-G protein levels in women with recurrent pregnancy loss from Basrah province in Iraq. Hum Immunol, v. 73, n. 8, p. 811-7, Aug 2012. JURKA, J. Sequence patterns indicate an enzymatic involvement in integration of mammalian retroposons. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 94, n. 5, p. 1872-7, Mar 4 1997. JURKA, J.; SMITH T. A fundamental division in the Alu family of repeated sequences. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 85, n. 13, p. 4775-8, Jul 1988. KAPITONOV, V.; JURKA J. The age of Alu subfamilies. J Mol Evol, v. 42, n. 1, p. 59-65, Jan 1996. KLEIN, J.; SATO A. The HLA system. First of two parts. N Engl J Med, v. 343, n. 10, p. 702-9, Sep 7 2000a. KLEIN, J.; SATO A. The HLA system. Second of two parts. N Engl J Med, v. 343, n. 11, p. 782-6, Sep 14 2000b. KRIEGS, J. O.; CHURAKOV G.; JURKA J. et al. Evolutionary history of 7SL RNA-derived SINEs in Supraprimates. Trends Genet, v. 23, n. 4, p. 158-61, Apr 2007. KUERSTEN, S.; GOODWIN E. B. The power of the 3' UTR: translational control and development. Nat Rev Genet, v. 4, n. 8, p. 626-37, Aug 2003. KULSKI, J. K.; DUNN D. S. Polymorphic Alu insertions within the Major Histocompatibility Complex class I genomic region: a brief review. Cytogenet Genome Res, v. 110, n. 1-4, p. 193-202, 2005. KULSKI, J. K.; DUNN D. S.; HUI J. et al. Alu polymorphism within the MICB gene and association with HLA-B alleles (vol 53, pg 975, 2002). Immunogenetics, v. 54, n. 5, p. 365-365, Aug 2002. KULSKI, J. K.; GAUDIERI S.; DAWKINS R. L. Using Alu J elements as molecular clocks to trace the evolutionary relationships between duplicated HLA class I genomic segments. Journal of Molecular Evolution, v. 50, n. 6, p. 510-519, Jun 2000. KULSKI, J. K.; MARTINEZ P.; LONGMAN-JACOBSEN N. et al. The association between HLA-A alleles and an Alu dimorphism near HLA-G. Journal of Molecular Evolution, v. 53, n. 2, p. 114-123, Aug 2001. LARSEN, M. H.; HVIID T. V. Human leukocyte antigen-G polymorphism in relation to expression, function, and disease. Hum Immunol, v. 70, n. 12, p. 1026-34, Dec 2009.
66
LEWONTIN, R. C. The Interaction of Selection and Linkage. Ii. Optimum Models. Genetics, v. 50, p. 757-82, Oct 1964. LISCHER, H. E.; EXCOFFIER L. PGDSpider: an automated data conversion tool for connecting population genetics and genomics programs. Bioinformatics, v. 28, n. 2, p. 298-9, Jan 15 2012. LUCENA-SILVA, N.; MONTEIRO A. R.; DE ALBUQUERQUE R. S. et al. Haplotype frequencies based on eight polymorphic sites at the 3' untranslated region of the HLA-G gene in individuals from two different geographical regions of Brazil. Tissue Antigens, v. 79, n. 4, p. 272-8, Apr 2012. MANASTER, I.; GOLDMAN-WOHL D.; GREENFIELD C. et al. MiRNA-mediated control of HLA-G expression and function. PLoS One, v. 7, n. 3, p. e33395, 2012. MARTELLI-PALOMINO, G.; PANCOTO J.A.; MUNIZ Y.C.N. et al. Polymorphic sites at the 3’ untranslated region of the HLA-G gene are associated with differential HLA-G soluble levels in the Brazilian and French population. Plos One, v. (in press), 2013. MARTINEZ-LASO, J.; HERRAIZ M. A.; PENALOZA J. et al. Promoter sequences confirm the three different evolutionary lineages described for HLA-G. Hum Immunol, v. 74, n. 3, p. 383-8, Mar 2013. MATHIAS, S. L.; SCOTT A. F.; KAZAZIAN H. H., JR. et al. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science, v. 254, n. 5039, p. 1808-10, Dec 20 1991. MENDES-JUNIOR, C. T.; CASTELLI E. C.; MEYER D. et al. Genetic diversity of the HLA-G coding region in Amerindian populations from the Brazilian Amazon: a possible role of natural selection. Genes Immun, Oct 3 2013. MENDES, C. T.; CASTELLI E. C.; SIMOES R. T. et al. HLA-G 14-bp polymorphism at exon 8 in Amerindian populations from the Brazilian Amazon. Tissue Antigens, v. 69, n. 3, p. 255-260, Mar 2007. MEYER, D.; THOMSON G. How selection shapes variation of the human major histocompatibility complex: a review. Annals of Human Genetics, v. 65, p. 1-26, Jan 2001. MOREAU, P.; FLAJOLLET S.; CAROSELLA E. D. Non-classical transcriptional regulation of HLA-G: an update. Journal of Cellular and Molecular Medicine, v. 13, n. 9B, p. 2973-2989, Sep 2009. MOSCOSO, J.; SERRANO-VELA J. I.; PACHECO R. et al. HLA-G, -E and -F: allelism, function and evolution. Transpl Immunol, v. 17, n. 1, p. 61-4, Dec 2006. MUNIZ, Y. C.; FERREIRA L. B.; MENDES-JUNIOR C. T. et al. Genomic ancestry in urban Afro-Brazilians. Ann Hum Biol, v. 35, n. 1, p. 104-11, Jan-Feb 2008.
67
OBER, C.; ALDRICH C. L. HLA-G polymorphisms: neutral evolution or novel function? J Reprod Immunol, v. 36, n. 1-2, p. 1-21, Nov 30 1997. PARK, B.; AHN K. An essential function of tapasin in quality control of HLA-G molecules. J Biol Chem, v. 278, n. 16, p. 14337-45, Apr 18 2003. PARK, B.; LEE S.; KIM E. et al. The truncated cytoplasmic tail of HLA-G serves a quality-control function in post-ER compartments. Immunity, v. 15, n. 2, p. 213-24, Aug 2001. PARKIN, J.; COHEN B. An overview of the immune system. Lancet, v. 357, n. 9270, p. 1777-89, Jun 2 2001. PENN, D. J.; DAMJANOVICH K.; POTTS W. K. MHC heterozygosity confers a selective advantage against multiple-strain infections. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 99, n. 17, p. 11260-4, Aug 20 2002. PIERTNEY, S. B.; OLIVER M. K. The evolutionary ecology of the major histocompatibility complex. Heredity, v. 96, n. 1, p. 7-21, Jan 2006. PIMENTA, J. R.; ZUCCHERATO L. W.; DEBES A. A. et al. Color and genomic ancestry in Brazilians: a study with forensic microsatellites. Hum Hered, v. 62, n. 4, p. 190-5, 2006. QIN, Z. S.; NIU T.; LIU J. S. Partition-ligation-expectation-maximization algorithm for haplotype inference with single-nucleotide polymorphisms. Am J Hum Genet, v. 71, n. 5, p. 1242-7, Nov 2002. RAYMOND, M.; ROUSSET F. Genepop (Version-1.2) - Population-Genetics Software for Exact Tests and Ecumenicism. Journal of Heredity, v. 86, n. 3, p. 248-249, May-Jun 1995. ROUSSEAU, P.; LE DISCORDE M.; MOUILLOT G. et al. The 14 bp deletion-insertion polymorphism in the 3' UT region of the HLA-G gene influences HLA-G mRNA stability. Hum Immunol, v. 64, n. 11, p. 1005-10, Nov 2003. ROUSSET, F. genepop'007: a complete re-implementation of the genepop software for Windows and Linux. Mol Ecol Resour, v. 8, n. 1, p. 103-6, Jan 2008. ROY-ENGEL, A. M.; CARROLL M. L.; VOGEL E. et al. Alu insertion polymorphisms for the study of human genomic diversity. Genetics, v. 159, n. 1, p. 279-90, Sep 2001. SABBAGH, A.; COURTIN D.; MILET J. et al. Association of HLA-G 3' untranslated region polymorphisms with antibody response against Plasmodium falciparum antigens: preliminary results. Tissue Antigens, v. 82, n. 1, p. 53-8, Jul 2013. SEGAL, S.; HILL A. V. S. Genetic susceptibility to infectious disease. Trends in Microbiology, v. 11, n. 9, p. 445-448, Sep 2003.
68
SHIINA, T.; HOSOMICHI K.; INOKO H. et al. The HLA genomic loci map: expression, interaction, diversity and disease. Journal of Human Genetics, v. 54, n. 1, p. 15-39, Jan 2009. SHIROISHI, M.; KUROKI K.; RASUBALA L. et al. Structural basis for recognition of the nonclassical MHC molecule HLA-G by the leukocyte Ig-like receptor B2 (LILRB2/LIR2/ILT4/CD85d). Proc Natl Acad Sci U S A, v. 103, n. 44, p. 16412-7, Oct 31 2006. SHIROISHI, M.; TSUMOTO K.; AMANO K. et al. Human inhibitory receptors Ig-like transcript 2 (ILT2) and ILT4 compete with CD8 for MHC class I binding and bind preferentially to HLA-G. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 100, n. 15, p. 8856-61, Jul 22 2003. SOLBERG, O. D.; MACK S. J.; LANCASTER A. K. et al. Balancing selection and heterogeneity across the classical human leukocyte antigen loci: a meta-analytic review of 497 population studies. Hum Immunol, v. 69, n. 7, p. 443-64, Jul 2008. SOLIER, C.; MALLET V.; LENFANT F. et al. HLA-G unique promoter region: functional implications. Immunogenetics, v. 53, n. 8, p. 617-25, Oct 2001. STEPHENS, M.; DONNELLY P. A comparison of bayesian methods for haplotype reconstruction from population genotype data. Am J Hum Genet, v. 73, n. 5, p. 1162-9, Nov 2003. STEPHENS, M.; SMITH N. J.; DONNELLY P. A new statistical method for haplotype reconstruction from population data. Am J Hum Genet, v. 68, n. 4, p. 978-89, Apr 2001. TAN, Z.; RANDALL G.; FAN J. et al. Allele-specific targeting of microRNAs to HLA-G and risk of asthma. Am J Hum Genet, v. 81, n. 4, p. 829-34, Oct 2007. TAN, Z.; SHON A. M.; OBER C. Evidence of balancing selection at the HLA-G promoter region. Hum Mol Genet, v. 14, n. 23, p. 3619-28, Dec 1 2005. The 1000Genomes Project Consortium. A map of human genome variation from population-scale sequencing. Nature, v. 467, n. 7319, p. 1061-73, Oct 28 2010. The 1000Genomes Project Consortium. An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes. Nature, v. 491, n. 7422, p. 56-65, Nov 1 2012. THORSBY, E. A short history of HLA. Tissue Antigens, v. 74, n. 2, p. 101-16, Aug 2009. TIAN, W.; WANG F.; CAI J. H. et al. Polymorphic insertions in 5 Alu loci within the major histocompatibility complex class I region and their linkage disequilibria with HLA alleles in four distinct populations in mainland China. Tissue Antigens, v. 72, n. 6, p. 559-67, Dec 2008.
69
ULLU, E.; TSCHUDI C. Alu Sequences Are Processed 7sl Rna Genes. Nature, v. 312, n. 5990, p. 171-172, 1984. VAN ROOD, J. J. The impact of the HLA-system in clinical medicine. Schweiz Med Wochenschr, v. 123, n. 3, p. 85-92, Jan 23 1993. VEIGA-CASTELLI, L. C.; CASTELLI E. C.; MENDES C. T., JR. et al. Non-classical HLA-E gene variability in Brazilians: a nearly invariable locus surrounded by the most variable genes in the human genome. Tissue Antigens, v. 79, n. 1, p. 15-24, Jan 2012. VEIT, T. D.; CAZAROLLI J.; SALZANO F. M. et al. New evidence for balancing selection at the HLA-G locus in South Amerindians. Genet Mol Biol, v. 35, n. 4 (suppl), p. 919-23, Dec 2012. VEIT, T. D.; CHIES J. A. Tolerance versus immune response -- microRNAs as important elements in the regulation of the HLA-G gene expression. Transpl Immunol, v. 20, n. 4, p. 229-31, Mar 2009. VENTER, J. C. A part of the human genome sequence. Science, v. 299, n. 5610, p. 1183-4, Feb 21 2003. VENTER, J. C.; ADAMS M. D.; MYERS E. W. et al. The sequence of the human genome. Science, v. 291, n. 5507, p. 1304-51, Feb 16 2001. WEDEKIND, C.; SEEBECK T.; BETTENS F. et al. MHC-dependent mate preferences in humans. Proc Biol Sci, v. 260, n. 1359, p. 245-9, Jun 22 1995. WEICHENRIEDER, O.; STEHLIN C.; KAPP U. et al. Hierarchical assembly of the Alu domain of the mammalian signal recognition particle. RNA, v. 7, n. 5, p. 731-40, May 2001. YIE, S. M.; LI L. H.; XIAO R. et al. A single base-pair mutation in the 3'-untranslated region of HLA-G mRNA is associated with pre-eclampsia. Mol Hum Reprod, v. 14, n. 11, p. 649-53, Nov 2008.
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ANEXO
