VLADIMIR SCHRAIBMAN

AVALIAÇÃO DA PERFUSÃO SEQUENCIAL COM AS SOLUÇÕES DE EURO-COLLINS E BELZER PARA

PRESERVAÇÃO DO PÂNCREAS EM RATOS

São Paulo 2005

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Mestre em Ciências

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VLADIMIR SCHRAIBMAN

AVALIAÇÃO DA PERFUSÃO SEQUENCIAL COM AS SOLUÇÕES DE EURO-COLLINS E BELZER PARA PRESERVAÇÃO DO PÂNCREAS EM RATOS.

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de

Mestre em Ciências

ORIENTADOR: Prof. Dr. Alberto Goldenberg CO-ORIENTADORES: Prof. Dr. Ivan Hong Jun Koh Prof. Dr. Adriano Miziara Gonzalez

São Paulo 2005

Schraibman, Vladimir

AVALIAÇÃO DA PERFUSÃO SEQUENCIAL COM AS SOLUÇÕES DE EURO-COLLINS E BELZER PARA PRESERVAÇÃO DO PÂNCREAS EM RATOS.

/ Vladimir Schraibman – São Paulo, 2005 xi, 66p. Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Gastroenterologia Cirúrgica. Título em inglês: EVALUATION OF SEQUENTIAL PERFUSION WITH EURO-COLLINS AND BELZER SOLUTIONS FOR PANCREAS PRESERVATION IN RATS.

1.Transplante. 2. Pâncreas. 3. Preservação. 4. Perfusão. 5. Ratos

iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CIRURGIA

Chefe do Departamento: Prof. Dr. Tarcísio Triviño Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Prof. Dr. Delcio Matos

iv

Dedicatória

A meus pais, Emil e Tsilia, maiores incentivadores, que com amor e

dedicação, souberam semear em meu coração o gosto pelo estudo, pelo trabalho e

pela vida.

A minha futura esposa, Carolina, que com amor e compreensão

soube entender as minhas ausências e, além de tudo, soube estimular-me, não só

neste trabalho, mas em tudo que realizamos, sempre com alegria.

v

Agradecimentos

Ao Prof. Dr. Alberto Goldenberg, minha gratidão pela oportunidade de ter sido seu

orientando e pelos valiosos ensinamentos em pesquisa científica. Sem dúvida, o

convívio desses anos, sua preciosa participação incondicional como orientador desse

trabalho e, sobretudo, sua amizade, muito contribuíram para a minha formação médica

e humana.

Ao Prof. Dr. Ivan Hong Jun Koh, minha gratidão pelos seus ensinamentos em pesquisa

científica. Sem dúvida, seus ensinamentos e seu preciosismo científico foram

fundamentais para o meu amadurecimento e a minha formação como médico e ser

humano, desde os tempos de graduação.

Ao Prof. Dr. Adriano Miziara Gonzalez, idealizador deste trabalho e co-responsável

pela realização do mesmo. Agradeço pelo estímulo, solidariedade e cooperação

incondicional em todas as etapas deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Delcio Matos, Coordenador do Curso de Pós-Graduação da UNIFESP-

EPM, pela acolhida no curso, pelos valiosos ensinamentos, estímulo, orientação e

formação como Gastrocirugião.

Aos Profs. Edson José Lobo, Tarcísio Triviño, José Carlos Del Grande, Gaspar de

Jesus Lopes Filho e Sarhan Sydney Saad, pelos ensinamentos durante a Residência

Médica e pela minha formação como Gastrocirurgião.

vi

Aos Profs. José Pinus, Jaques Pinus e Edson Khodor Cury, seres humanos únicos, que

com certeza tiveram enorme influência na minha formação médica e no incentivo a

carreira acadêmica.

Ao Dr. Ricardo Artigiani, Patologista do Departamento de Patologia da UNIFESP-EPM,

pela dedicada orientação e análise histológica.

Aos alunos de graduação Adriano Molinari e Stela Cezarino de Morais, pelo valioso

auxílio na execução dos atos operatórios.

A Estaticista Sra Adriana Sanuto, pela dedicada orientação e análise estatística.

A secretária Claudia pela ajuda em todos os momentos da realização desta tese, muito

obrigado.

A todas enfermeiras, funcionários e funcionárias da Disciplina de Gastrocirurgia pelo

convívio e ensino nesses últimos anos.

A todos os funcionários da UNIFESP-EPM que de inúmeras formas me tornaram um

ser humano melhor e mais completo.

A todos os pacientes, que sem dúvida alguma são o objetivo final desta pesquisa.

vii

SUMÁRIO

Lista de figuras ...........................................................................................................viii Lista de tabelas.............................................................................................................ix Lista de quadros............................................................................................................x Resumo .........................................................................................................................xi 1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................1 2 OBJETIVO...................................................................................................................5 3 MÉTODO .....................................................................................................................7 3.1 AMOSTRA ..............................................................................................................8

3.2 DISTRIBUIÇÃO DOS ANIMAIS.....................................................................................8

3.3 COMPONENTES DA SOLUÇÃO ...................................................................................8

3.4 DELINEAMENTO DA PESQUISA ................................................................................10

3.5 PROCEDIMENTO .............................................................................................10

3.5.1 PREPARO PRÉ-OPERATÓRIO E ANESTESIA .............................................. 10

3.5.2 TÉCNICA OPERATÓRIA ..................................................................................11

3.6 VARIÁVEIS ESTUDADAS.................................................................................16

3.6.1 AMILASE ...........................................................................................................16

3.6.2 HISTOLOGIA.....................................................................................................16

4 RESULTADOS.......................................................................................................................................... 19

4.1 TAMANHO DA AMOSTRA ................................................................................20

4.2 PESO DOS ANIMAIS EM CADA GRUPO..........................................................20

4.3 PESO DA PEÇA RESSECADA .........................................................................21

4.4 VALORES DE AMILASE NO LÍQUIDO DE PRESERVAÇÃO ............................22

4.5 HISTOLOGIA.....................................................................................................26

4.5.1 ANÁLISE HISTOLÓGICA ..................................................................................29

5 DISCUSSÃO..............................................................................................................32 6 CONCLUSÃO............................................................................................................40 7 ANEXOS.....................................................................................................................42 8 REFERÊNCIAS ..........................................................................................................44 Abstract ........................................................................................................................50 Bibliografia consultada...............................................................................................51

viii

Lista de figuras

Figura 1 Fotografia demonstrando os locais onde o duodeno foi ligado (setas)............11

Figura 2 Fotografia demonstrando o local no qual a aorta foi reparada (seta).. ........... 12

Figura 3 Fotografia demonstrando a aorta infra-renal reparada com o fio de algodão

(seta)...............................................................................................................................12

Figura 4 Fotografia demonstrando o Gelco 22 fixado na aorta. .............................. 13

Figura 5 Fotografia demonstrando: seta escura indicando local da secção da veia

cava inferior intra-torácica, seta branca indicando local da toracotomia anterior. ........ 14

Figura 6 Fotografia demonstrando a secção da veia cava inferior com drenagem do

perfusato (seta)...............................................................................................................14

Figura 7 Fotografia demonstrando o aspecto do pâncreas após a perfusão................15

Figura 8 Fotografia demonstrando a peça ressecada (duodeno e pâncreas).......... 15

Figura 9 Fotografia demonstrando a peça ressecada e pesada. ............................. 16

Figura 10 Gráfico demonstrando média e erro padrão dos valores de amilase ao......... longo do tempo de preservação de todos os grupos.................................................... 25 Figura 11 Classificação de edema de acordo com o grupo ....................................... 28

Figura 12 Classificação de necrose tecidual de acordo com o grupo ....................... 28

Figura 13 Classificação de necrose de ilhotas de acordo com o grupo ..................... 29

Figura 14 Classificação de infiltrado inflamatório de acordo com o grupo ................ 29

Figura 15 Fotomicrografia mostrando necrose tecidual (seta) no pâncreas do grupo

Soro Fisiológico. ........................................................................................................... 30

Figura 16 Fotomicrografia mostrando necrose de ilhotas (seta) no pâncreas do grupo

Euro-Collins. ................................................................................................................. 31

Figura 17 Fotomicrografia mostrando aspecto normal de ilhota no pâncreas do grupo

CB ................................................................................................................... 31

ix

Lista de tabelas TABELA 1 MEDIDAS DESCRITIVAS DO PESO DOS ANIMAIS SEGUNDO O GRUPO..................................................................... 20

TABELA 2 MEDIDAS DESCRITIVA DO PESO DA PEÇA RESSECADA SEGUNDO O GRUPO......................................................... 21

TABELA 3 VALOR DE AMILASE NO GRUPO SORO FISIOLÓGICO AO LONGO DO TEMPO.........................................................22

TABELA 4 VALOR MÉDIO DE AMILASE NO GRUPO EURO-COLLINS AO LONGO DO TEMPO....................................................23

TABELA 5 VALOR MÉDIO DE AMILASE NO GRUPO BELZER AO LONGO DO TEMPO..................................................................23

TABELA 6 VALOR MÉDIO DE AMILASE NO GRUPO EURO-COLLINS/BELZER AO LONGO DO TEMPO..................................24

TABELA 7 DISTRIBUIÇÃO DOS PARÂMETROS DA ANÁLISE HISTOLÓGICA OBSERVADOS NOS GRUPOS .............................27

x

Lista de quadros

QUADRO 1 COMPONENTES DA SOLUÇÃO DE EURO-COLLINS ......................................... 9

QUADRO 2 COMPONENTES DA SOLUÇÃO DE BELZER ................................................... 9

xi

RESUMO

Objetivo: Investigar o efeito das soluções de Euro-collins e Belzer na perfusão sequencial do pâncreas durante a preservação. Métodos: Foram utilizados 45 ratos Wistar-EPM. Os animais foram distribuídos em 4 grupos, de acordo com a solução utilizada para preservação: Grupo Soro Fisiológico (SF) – pâncreas perfundido e preservado em soro fisiológico; Grupo Euro-Collins (C) – pâncreas perfundido e preservado com solução de Euro-Collins; Grupo Belzer (B) – pâncreas perfundido e preservado em solução de Belzer e Grupo Euro-Collins/Belzer (CB) – pâncreas perfundido com solução de Euro-Collins e Belzer em partes iguais e seqüencialmente e preservado em solução de Belzer. Após a perfusão, os animais tiveram o pâncreas ressecado e preservado com a solução destinada em 4º C. Dosagens de amilase em 12, 24, 36 e 48 horas foram realizadas no líquido de preservação. Após a última dosagem a peça foi submetida à análise histológica. Foi realizado estudo estatístico a partir dos resultados. Resultados: Os grupos SF e C foram os que apresentaram os maiores valores de amilase ao longo do tempo, sendo superiores e diferentes dos grupos B e CB (p=0,05). Os grupos B e CB apresentaram valores de amilase similares até o período de 24 horas. A análise histológica demonstrou significância estatística em relação à necrose de ilhotas e edema tecidual. Os grupos B e CB mostraram-se similares histologicamente (p=0,001) e diferentes dos grupos SF e C. Conclusões: A aplicação das soluções de Euro-collins e Belzer de modo seqüencial mostrou-se eficaz na preservação do pâncreas de ratos até o período de 24 horas.

1 INTRODUÇÃO

2

1 INTRODUÇÃO

O transplante simultâneo de pâncreas e rim que teve seu início em 1966 é indicado nos

pacientes diabéticos do tipo 1, com insuficiência renal terminal. Os avanços obtidos com a

realização deste procedimento culminaram com a aceitação pela Associação Americana de

Diabetes do transplante combinado pâncreas–rim como o tratamento de eleição para o

doente diabético tipo I com doença renal terminal (Bennett et al, 1995).

O custo médio do Transplante combinado gira em torno de 110.000 a 125.000

dólares, durante o período de internação, de acordo com dados americanos. (The Diabetes

Control and Complications Trial Research Group, 1993). No Brasil, apesar do alto custo

deste procedimento, o governo tem se esforçado para mantê-los rotineiros; o valor pago

pelo governo é de 13.000 dólares americanos, em média. Apesar desse valor ser baixo em

relação aos valores pagos nos países desenvolvidos, o Brasil se destaca positivamente no

cenário mundial, quando se analisa o número de transplantes por renda per capita (Selby et

al, 1990). Por ser um país em desenvolvimento, com reduzidos recursos para saúde, é

importante que se tente economizar nos procedimentos de alto custo, desde que esta

economia não acarrete perda de qualidade.

O sucesso de um transplante depende de vários fatores, que inclui: o perfil do

doador, a captação do pâncreas, o perfil do receptor e o ato do transplante em si. A partir da

década de 60, o estudo da preservação de órgãos se tornou proeminente. O princípio é

manter sua viabilidade pelo maior tempo possível, para que, quando transplantado, o órgão

funcione imediatamente (Krishnamurthi et al, 2001).

As soluções de preservação, que contêm substâncias osmoticamente ativas para

impedir a entrada de água nas células em isquemia, vêm sendo estudadas e aprimoradas

(American Diabetes Association, 2000). Existem diversas formas no mercado, mas duas

delas se destacaram na prática clínica. Na década de 70, houve o desenvolvimento da

solução de Euro-Collins e, mais recentemente, na década de 80, a solução de Belzer (Kuo

et al, 1997).

3

Toledo-Pereyra et al (1979) demonstraram, em experimento com animais, que

soluções cristalóides, como a de Euro-Collins, não eram suficientes para manter a

preservação do pâncreas por mais de 24 horas, sendo necessário empregar outras

soluções. Abouna et al. (1988) revelaram que a solução de Euro-Collins, em transplante de

pâncreas em cachorro, era insuficiente na preservação após 48 horas de isquemia do

órgão. O enxerto apresentava áreas de necrose e autólise, possivelmente causadas por

oclusão vascular periférica pela precipitação do magnésio em ambiente alcalino.

Apesar da solução de Euro-Collins ter predominado na preservação dos transplantes

de pâncreas até o final da década de 80, Sutherland et al (1987) concluíram que esta

solução não era a mais adequada para este fim.

Toledo-Pereira et al (1985), demonstraram experimentalmente que para atingir 48-72

horas de isquemia, outras soluções necessitavam ser desenvolvidas, pois a solução de

Euro-Collins se mostrava ineficaz, tornando o seu uso um procedimento de risco.

Em 1987, Wahlberg et al. experimentaram a utilização de uma nova solução de

preservação, a de Belzer, no transplante de pâncreas em cachorro, que atingiu 72 horas de

preservação com boa qualidade do enxerto.

Belzer, em 1993, demonstraram que, utilizando sua solução na preservação dos

pâncreas transplantados, o índice de não funcionamento primário do enxerto foi de apenas

0,5%, com tempo médio de isquemia de 18 horas. Esta revolucionária solução ganhou

popularidade e se tornou a solução de preservação padrão nos transplantes, inclusive o de

pâncreas.

Múltiplas técnicas de captação de órgãos com a infusão de soluções geladas pela

aorta têm sido descritas (D’Alessandro et al, 1990). Utiliza-se, em geral, em torno de dois

litros da solução de Belzer, mais um litro no saco plástico onde se armazena o pâncreas

para a realização da “cirurgia de banco” à espera do transplante (Sollinger et al, 1998).

O custo de 1 litro da solução de Belzer é 400 dólares americanos. Utilizam-se, em

geral, 3 litros durante o transplante de pâncreas-rim, gastando-se desta forma

aproximadamente 1200 dólares americanos, ou seja, 8,0% do valor pago pelo governo

4

brasileiro por todo o procedimento. Assim, é notório o valor da solução de Belzer no custo

do transplante combinado pâncreas-rim.

Por outro lado, apesar de a solução de Belzer ser a solução padrão, já houve

questionamento desta em relação ao transplante hepático. Pirenne et al, (2001)

demonstraram que infundindo-se pela aorta uma solução de menor viscosidade que a

solução de Belzer, obtiveram menor índice de estenose da via biliar, provavelmente pelo

fato de a solução penetrar com mais facilidade e rapidez nos pequenos canalículos

vasculares, impedindo, assim, a estagnação de sangue e a formação de pequenos trombos

(Uhlmann et al, 2002).

A solução de Euro-Collins é uma solução mais barata, podendo ser, inclusive,

fabricada em instituições brasileiras ou comprada por 10 dólares americanos, ou seja, em

média, 40 vezes menos que a solução de Belzer. (Hospital São Paulo - Setor de Compras)

O primeiro litro da solução de preservação tem por finalidade iniciar o resfriamento e

retirar o sangue do órgão a ser captado. A solução de Euro-Collins, por ser menos viscosa

(Uhlman et al, 2002), poderia ser utilizada nesta primeira lavagem para substituição do

sangue quente de uma forma rápida e efetiva, sendo que a posterior infusão da solução de

Belzer permaneceria durante todo o período de preservação. Esta mudança traria uma

sensível diminuição nos custos do procedimento.

Schwartz et al (1991) descreveram, pela primeira vez, a utilização das soluções de

Euro-Collins e Belzer de forma sequencial para o transplante de fígado com sucesso.

Gonzalez et al (2005) estudaram a primeira série de casos clínicos comparando a utilização

da solução de Euro-collins e em seqüência a solução de Belzer e, a solução de Belzer

isoladamente no transplante combinado pâncreas-rim, demonstrando não existirem

diferenças quanto ao resultado clínico. Contudo, até o momento, ainda não está bem

estabelecida a utilização das duas soluções e nem há estudo experimental comprovando a

sua eficácia. Isto nos motivou a estudar o uso sequencial da solução de Euro-Collins e

Belzer para o transplante de pâncreas.

5

2 OBJETIVO

6

2 OBJETIVO

Investigar o efeito da perfusão sequencial do pâncreas de ratos com as soluções de Euro-collins e Belzer na fase de preservação.

7

3 MÉTODO

8

3 MÉTODO

3.1 Amostra

Foram utilizados 45 ratos Wistar-EPM fêmeas com idade variando de 3 a 6 meses.

Os procedimentos operatórios obedeceram aos critérios, normas técnica e direitos

internacionais de pesquisa em animais, do Comitê de Ética do Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA). O estudo foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética

em Pesquisa da UNIFESP-EPM ( anexo1).

3.2 Distribuição dos animais

Os animais foram distribuídos em 4 grupos não pareados, de acordo com a solução

utilizada para perfusão e preservação:

- Grupo Soro Fisiológico (SF) – Animais perfundidos e preservados em soro fisiológico

(n=7).

- Grupo Euro-Collins (C) – Animais perfundidos e preservados em solução de Euro-Collins

(n=13).

- Grupo Belzer (B) – Animais perfundidos e preservados em solução de Belzer (n=18).

- Grupo Euro-Collins/Belzer (CB) – Animais perfundidos com solução de Euro-Collins e

Belzer em partes iguais e seqüencialmente e preservados em solução de Belzer (n=7).

3.3. Componentes da solução

Os componentes da solução de Euro-Collins e da solução de Belzer utilizadas no

experimento estão descritos nos quadros 1 e 2.

9

Quadro 1 Componentes da solução de Euro-Collins

Componentes Volume

Potássio 115 (mM)

Sódio 10 (mM)

Fosfato 57,5 (mM)

Magnésio 30 (mM)

Sulfato 30 (mM)

Glicose 140 (mM)

Osmolalidade 350 (mosm/L)

PH 7.1

Fonte: Southard et al (1995)

Quadro 2 Componentes da solução de Belzer

Componentes Volume

K Lactobionato 100 (mmol/L)

KH2PO4 25 (mmol/L)

MgSo4 5 (mmol/L)

Rafinose 30 (mmol/L)

GSH 3 (mmol/L)

Adenosina 5 (mmol/L)

Alopurinol 1 (mmol/L)

Pentafração 50 (g/L)

Penicilina 200.000 (U/L)

Insulina 40 (U/L)

Dexametasona 16 (mg/L)

Sódio 25 (mmol/L)

Potássio 125 (mmol/L)

Osmolalidade 320 (mOsm/L)

Ph 7.4

Fonte: Southard et al (1995)

10

3.4 Delineamento da pesquisa

O esquema abaixo ilustra os procedimentos realizados nos respectivos grupos.

3.5 Procedimentos

Os animais foram inicialmente mantidos em gaiolas comunitárias com número

máximo de 6 animais, por 24 horas antes do experimento no Biotério da UNIFESP-EPM,

com ciclo normal de dia e noite.

3.5.1 Preparo pré-operatório e anestesia

RATOS WISTAR-EPM (n= 45)

GRUPO SF (n= 7)

GRUPO EURO-

COLLINS (n= 13)

GRUPO BELZER (n= 18)

GRUPO EURO-COLLINS/BELZER

(n= 7)

PERFUSÃO COM 20 ml DE SORO FISIOLÓGICO

PERFUSÃO COM 20 ml DE EURO-

COLLINS

PERFUSÃO COM 20 ml DE BELZER

PRESERVAÇÃO COM SORO

FISIOLÓGICO

PRESERVAÇÃO COM EURO-

COLLINS

PRESERVAÇÃO COM BELZER

PRESERVAÇÃO COM BELZER

COLETAS DE AMILASE E HISTOLOGIA

COLETAS DE AMILASE E HISTOLOGIA

COLETAS DE AMILASE E HISTOLOGIA

COLETAS DE AMILASE E HISTOLOGIA

PERFUSÃO COM 10 ml DE BELZER

PERFUSÃO COM 10 ml DE EURO-COLLINS

11

Os animais permaneceram em jejum no pré-operatório por 12 horas. Todos os

animais foram anestesiados e operados pelo mesmo cirurgião (V.S.) no Laboratório de

Cirurgia Experimental da Disciplina de Técnica Operatória da UNIFESP-EPM. No dia do

experimento foram pesados e submetidos à anestesia geral. A anestesia utilizada foi a

combinação de Ketamina (20%) e Xelasina (80%), na dose de 0,1ml/100g de peso do

animal, por via intra-peritoneal. Após a anestesia, o animal foi levado à mesa cirúrgica,

sendo mantido na posição dorsal por meio da contenção dos 4 membros. A anti-sepsia da

pele foi feita com álcool 70%. A seguir, o campo operatório foi delimitado utilizando-se

gazes estéreis e o ato operatório realizado com técnica asséptica.

3.5.2. Técnica operatória

Foi realizada uma laparotomia mediana com exposição da cavidade abdominal. A

partir deste momento foi utilizado o microscópio D. F. Vasconcellos, modelo M 900 com

aumento de 16 X. O duodeno foi exposto e ligado com fio de algodão 2-0 em dois pontos,

logo após o piloro e na transição duodeno-jejunal (figura 1), nas porções duodenais que

englobam o tecido pancreático.

Figura 1 – Fotografia demonstrando os locais onde o duodeno foi ligado (setas).

12

A seguir, foi realizada a identificação e dissecção da aorta abdominal, e o

posicionamento dos reparos com fio de algodão 2-0, junto ao diafragma (figura 2) e ao nível

das artérias renais (figura 3) a fim de delimitar os limites proximal e distal. Em seqüência foi

reparada a veia cava inferior ao nível da veia renal direita, onde foi puncionada e injetado,

com seringa de 1 ml e agulha 23G, o volume de 0,1 ml de heparina e aguardado o tempo de

1 minuto.

Figura 2 – Fotografia demonstrando o local no qual a aorta foi reparada (seta).

13

Figura 3 – Fotografia demonstrando a aorta infra-renal reparada com o fio de algodão

(seta).

A aorta ao nível da artéria renal foi puncionada com Gelco 22 (figura 4) e o mesmo

fixado neste ponto com algodão 2-0.

Figura 4 – Fotografia demonstrando o Gelco 22 fixado na aorta.

A seguir, a aorta infra-diafragmática foi ligada e iniciada a infusão da solução pré-

destinada através do uso de bomba de infusão (SAMTRONIC, modelo ST 670 – fluxo de

150 ml/hora) com volume total de 20 ml. Neste momento foi seccionada a veia cava inferior

intra-torácica por meio de toracotomia anterior para drenagem do perfusato (figuras 5 e 6).

14

Figura 5 – Fotografia demonstrando: seta escura indicando local da secção da veia

cava inferior intra-torácica, seta branca indicando local da toracotomia anterior.

Figura 6 – Fotografia demonstrando a secção da veia cava inferior com drenagem do

perfusato (seta).

15

No grupo Euro-collins-Belzer foi infundido inicialmente 10 ml da solução de Euro-

collins seguido de 10 ml da solução de Belzer. Após a perfusão com a solução designada, o

duodeno, juntamente com o pâncreas, foi ressecado (figura 7 e 8).

Figura 7 – Fotografia demonstrando o aspecto do pâncreas após a perfusão (seta).

Figura 8 – Fotografia demonstrando a peça ressecada (duodeno e pâncreas).

A peça foi então pesada em balança digital (figura 9) (modelo GEHAKA – BG 400) e

imersa no mesmo tipo de solução infundida, no volume de 20 ml, dentro de um frasco de

coleta. No grupo Euro-collins-Belzer foi colocada a solução de Belzer no líquido de

preservação.

16

Figura 9 – Fotografia demonstrando a peça ressecada e pesada.

O frasco de coleta, contendo o órgão e a solução, foi mantido em geladeira a 4ºC por

48 horas.

3.6 Variáveis estudadas

3.6.1 Amilase

A dosagem de amilase foi realizada pelo método colorimétrico enzimático com o kit

Bayer – 1650, no aparelho ADVIA 1650 Chemistry System

Foram realizadas coletas de 2 ml do líquido de preservação após 12, 24, 36 e 48

horas da ressecção do órgão. O volume retirado era reposto conforme o líquido de

preservação utilizado. Estas amostras foram enviadas ao Laboratório Central da UNIFESP-

EPM para dosagem de amilase.

.

3.6.2 Histologia

A avaliação histológica dos enxertos pancreáticos foi realizada após 48 horas de

preservação. As peças foram retiradas do frasco de preservação e fixadas em solução

17

aquosa de formaldeído a 10%. O fragmento da peça, a ser incluído em parafina, foi obtido

por secção, no sentido longitudinal ao plano mediano do parênquima pancreático, de forma

a abrangê-lo completamente.

Foram realizados, em micrótomo, 3 cortes com 5 micra de espessura, escalonados,

em cada superfície de secção. Posteriormente, os fragmentos foram estendidos em banho-

maria, colados em lâminas de vidro e corados pelo método de Hematoxilina-eosina.

Um único patologista do Departamento de Patologia – UNIFESP EPM (R.A), avaliou

as peças, sem conhecimento do grupo a qual pertencia o órgão. Esta análise avaliou a

presença e a intensidade de: edema (leve ou moderado), infiltrado inflamatório (leve ou

moderado), necrose de ilhotas (ausente, leve ou intenso) e necrose tecidual (ausente, leve

ou intenso), de acordo com a classificação utilizada por Schmidt et al (1992).

3.7 Análise estatística

Para as variáveis quantitativas (PESO do animal, PESO da peça e AMILASE) foram

calculadas medidas resumo tais como média, desvio-padrão, mediana, mínimo e máximo

para cada um dos grupos avaliados. No caso da amilase, como foi realizada mais do que

uma medida ao longo do tempo então essas medidas também foram calculadas em cada

um dos tempos de avaliação. A comparação do peso tanto do animal como da peça foi

realizada através de uma análise de variância com um fator (ANOVA-ONEWAY) seguido de

comparações múltiplas do tipo Tukey para detectar possíveis diferenças entre os grupos

avaliados (Altman, 1991).

Como a Amilase foi avaliada ao longo do tempo (12, 24, 36 e 48 horas) isso induz

uma correlação entre as medidas. Foi utilizado um modelo de Análise de Variância

(ANOVA) com medida repetida que permitiu a inclusão do efeito do Grupo (Soro Fisiológico,

Euro-Collins, Belzer e Euro-Collins/Belzer), Tempo (12, 24, 36 e 48 horas) e a interação

18

entre Grupo e Tempo. Possíveis diferenças entre as categorias desses efeitos foram

avaliadas através da construção de contrastes (Singer et al, 2000).

A associação entre os parâmetros da análise da microscopia e grupo foi avaliada

através do teste do Qui-Quadrado ou Generalização do Teste Exato de Fisher caso alguma

das freqüências esperadas fosse menor do que 5 (Altman, 1991).

Em toda análise estatística foi adotado um nível de significância de 5% (alfa=0,05),

ou seja, foram considerados significantes resultados que apresentaram p-valor inferior a 5%

(p<0,05).

Para o cálculo do tamanho da amostra e a distribuição dos animais entre os grupos,

foi calculado o poder do efeito de interação obtido da ANOVA com medida repetida fixando-

se o nível de significância (Erro Tipo I) em 5%. O poder obtido para o efeito da interação

entre Grupo e Tempo foi de 90%, ou seja, se de fato houver alguma diferença entre os

grupos ao longo do tempo, a probabilidade dessa diferença ser detectada é de 90%.

19

4 RESULTADOS

20

4 RESULTADOS

4.1 Tamanho da amostra Os grupos foram considerados comparáveis entre si segundo a análise estatística do

cálculo do tamanho da amostra.

4.2 Peso dos animais em cada grupo

Tabela 1 - MEDIDAS DESCRITIVAS DO PESO DOS ANIMAIS SEGUNDO O GRUPO

GRUPO

Soro Fisiológico Euro-collins Belzer

Euro-

collins/Belzer

Média 195,0 203,1 210,9 263,6

Desvio padrão 29,3 16,7 21,7 28,8

Mediana 190,0 200,0 203,5 260,0

Mínimo 160,0 170,0 180,0 220,0

Máximo 240,0 230,0 250,0 300,0

Nº animais 7 13 18 7

Por meio da análise de variância (ANOVA-ONEWAY) observou-se diferença

estatisticamente significante do peso médio dos animais (p<0,001). Através do método de

comparações múltiplas de Tukey observou-se que os animais dos grupos: Soro Fisiológico,

Euro-Collins e Belzer apresentaram pesos semelhantes (p=0,409). Somente os animais do

grupo Euro-Collins/Belzer apresentaram peso maior que os outros três grupos (p<0,001).

21

4.3 Peso da peça ressecada em cada grupo

Tabela 2 - MEDIDAS DESCRITIVAS DO PESO DA PEÇA RESSECADA SEGUNDO O GRUPO

GRUPO

Soro Fisiológico Euro-Collins Belzer

Euro-

Collins/Belzer

Média 1,51 1,50 1,35 1,66

Desvio padrão 0,29 0,26 0,20 0,25

Mediana 1,52 1,45 1,31 1,72

Mínimo 1,05 1,07 1,06 1,34

Máximo 1,93 2,12 1,77 1,92

Nº animais 7 13 18 7

Por meio de uma análise de variância (ANOVA-ONEWAY) observou-se diferença

estatisticamente significante do peso médio da peça ressecada dos animais (p=0,036).

Através do método de comparações múltiplas de Tukey observou-se que o peso médio da

peça ressecada dos animais do grupo Euro-Collins/Belzer foi maior do que o do grupo

Belzer (p=0,029). Os grupos Soro Fisiológico, Euro-Collins e Belzer não se diferenciaram

em termos do peso da peça ressecada (p>0,307). Não foram encontradas diferença

estatisticamente significante do peso da peça ressecada entre os grupos Soro Fisiológico,

Euro-Collins e Euro-Collins/Belzer (p>0,513).

22

4.4 Valores de amilase no líquido de preservação

As Tabelas 3 a 6 apresentam as medidas para os valores médios de amilase ao

longo do tempo para cada grupo. De acordo com essas tabelas pode-se observar que todos

os grupos apresentaram aumento progressivo dos níveis de amilase ao longo do tempo,

porém este aumento apresentou variabilidade ao longo do tempo e entre os grupos; com

exceção do grupo Soro Fisiológico que teve um aumento da variabilidade do tempo 12

horas para o tempo 24 horas, porém do tempo 24 horas para o tempo 36 horas essa

variabilidade apresentou um decréscimo e voltou a aumentar no tempo 36 horas.

Tabela 3 - VALOR DE AMILASE NO GRUPO SORO FISIOLÓGICO AO LONGO DO TEMPO

Tempo

Soro Fisiológico 12 horas 24 horas 36 horas 48 horas

Média 1869,9 3116,4 4077,5 4484,8

Desvio padrão 669,0 1027,6 684,4 1101,9

Mediana 2180,0 3560,0 4330,0 4802,0

Mínimo 819,0 1335,0 3070,0 2980,0

Máximo 2650,0 4091,0 4580,0 5355,0

Nº animais 7 7 7 7

Legenda:

Amilase expressa em UI/ml

23

Tabela 4 - VALOR MÉDIO DE AMILASE NO GRUPO EURO-COLLINS AO LONGO DO TEMPO

Tempo

Euro-collins 12 horas 24 horas 36 horas 48 horas

Média 1453,2 2823,5 3587,1 4413,6

Desvio padrão 1046,7 1932,5 2306,8 2677,7

Mediana 990,0 2235,0 2640,0 3440,0

Mínimo 315,0 554,0 1530,0 1780,0

Máximo 3950,0 6925,0 7695,0 9230,0

Nº animais 13 13 13 13

Legenda:

Amilase expressa em UI/ml

Tabela 5 - VALOR MÉDIO DE AMILASE NO GRUPO BELZER AO LONGO DO TEMPO

Tempo

Belzer 12 horas 24 horas 36 horas 48 horas

Média 763,8 1619,3 2822,2 3806,5

Desvio padrão 486,4 849,3 1477,7 1923,0

Mediana 610,0 1449,5 2761,5 3506,5

Mínimo 190,0 378,0 569,0 721,0

Máximo 2067,0 4131,0 6218,0 7207,0

Nº animais 18 18 18 18

Legenda:

Amilase expressa em UI/ml

24

Tabela 6 - VALOR MÉDIO DE AMILASE NO GRUPO EURO-COLLINS/BELZER AO LONGO DO TEMPO

Tempo

Euro-

Collins/Belzer 12 horas 24 horas 36 horas 48 horas

Média 780,7 1917,9 3625,3 5157,5

Desvio padrão 248,9 827,5 1090,9 1481,4

Mediana 738,0 2015,0 3227,0 4805,0

Mínimo 442,0 923,0 2260,0 3770,0

Máximo 1093,0 3009,0 5101,0 7250,0

Nº animais 7 7 7 7

Legenda:

Amilase expressa em UI/ml

A Figura 10 apresenta os valores médios e erro padrão de amilase ao longo do

tempo.

Figura 10: Gráfico demonstrando média e erro padrão dos valores de amilase ao longo do

tempo de preservação de todos os grupos.

25

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 12 24 36 48Tempos de Coleta (h)

Nív

el S

éric

o de

Am

ilase

SF Collins Belzer Collins-Belzer

Por meio da Figura 10 pode ser observado que o grupo Belzer apresentou níveis de

amilase menores do que o apresentado pelas outras três soluções ao longo de todo o

tempo. O grupo Euro-Collins/Belzer apresentou até 24 horas um comportamento de amilase

próximo ao apresentado pelo grupo da solução Belzer, no tempo 36 horas a média de

amilase apresentada pelos grupos Euro-Collins/Belzer e Euro-Collins não apresenta

diferenças. No tempo 48 horas o grupo Euro-Collins/Belzer apresentou média de amilase

maior do que os outros três grupos, sendo essa média a maior de todo o experimento.

Pelo teste de ANOVA verificou-se efeito significante de interação entre grupo e tempo

(p<0,001), ou seja, os grupos não apresentaram ao longo do tempo o mesmo

comportamento de amilase.

Os grupos Soro Fisiológico e Euro-Collins apresentaram, em média, o mesmo

comportamento de amilase ao longo das quatro coletas (p=0,288), além disso não foi

observada diferença estatisticamente significante entre o valor médio de amilase

apresentado por esses dois grupos ao longo de toda coleta (p=0,855). Para os grupos Soro

26

Fisiológico e Euro-Collins ocorreu um acréscimo médio do valor de amilase do tempo 12h

para o tempo 36h estimado em 2436,9 ± 450,9 UI/ml (p<0,001).

Entre os tempos 12h e 24h os grupos Belzer e Euro-Collins/Belzer apresentaram

valores similares de amilase (p=0,385). Do tempo 12h para o tempo 24 horas esses grupos

apresentaram um aumento médio na quantidade de amilase estimado em 996,3 ± 160,3

UI/ml (p<0,001).

No tempo 36 horas os grupos Belzer e Euro-Collins/Belzer apresentaram valores

similares de amilase (p=0,320).

No tempo 48 horas o grupo Euro-Collins/Belzer apresentou, em média, 1883,5 ±

999,5 UI/ml a mais de amilase do que o grupo Belzer, porém o teste estatístico para essa

comparação mostrou-se apenas marginalmente significante uma vez que o valor de p obtido

foi de p=0,067, portanto sem significância estatística para este período.

Também pode ser observado através das Tabelas 3 a 6 que o comportamento da

mediana do nível de amilase foi o mesmo descrito para a média do nível de amilase.

4.5 Histologia

Os achados histológicos estão relacionados na tabela 7 e nas Figuras 11, 12, 13 e 14.

27

Tabela 7 - DISTRIBUIÇÃO DOS PARÂMETROS DA ANÁLISE HISTOLÓGICA OBSERVADOS NOS GRUPOS

GRUPOS

SF

(n=7)

Euro-Collins/Belzer

(n=13)

Belzer

(n=18)

CB

(n=7)

p-valor+

Edema 0,001 *

Leve 4 (57,1%) 2 (15,4%) 12 (66,7%) 7 (100,0%)

Moderado 3 (42,9%) 11 (84,6%) 6 (33,3%) -

Necrose Tecidual

0,610

Ausente 1 (14,3%) 1 (7,7%) 1 (5,6%) -

Leve 5 (71,4%) 8 (61,5%) 14 (77,8%) 7 (100,0%)

Intenso 1 (14,3%) 4 (30,8%) 3 (16,7%) -

Necrose de Ilhotas

0,001 *

Ausente 1 (14,3%) 1 (7,7%) 4 (22,2%) 3 (42,9%)

Leve 1 (14,3%) 8 (61,5%) 14 (77,8%) 4 (57,1%)

Intenso 5 (71,4%) 4 (30,8%) - -

Infiltrado Inflamatório

0,171

Leve 7 (100,0%) 11 (84,6%) 18 (100,0%) 7 (100,0%)

Moderado - 2 (15,4%) - -

Legenda: + Generalização do Teste Exato de Fisher

* Significância estatística

28

0%

20%

40%

60%

80%

100%

SF Collins Belzer CB

Tipos de soluções

LeveModerado

Figura 11 – CLASSIFICAÇÃO DO EDEMA DE ACORDO COM O GRUPO

0%

20%

40%

60%

80%

100%

SF Collins Belzer CB

Tipos de soluções

AusenteLeveIntenso

Figura 12 – CLASSIFICAÇÃO DA NECROSE TECIDUAL DE ACORDO COM O GRUPO

29

0%

20%

40%

60%

80%

100%

SF Collins Belzer CB

Tipos de soluções

AusenteLeveIntenso

Figura 13 – CLASSIFICAÇÃO DE NECROSE DE ILHOTAS DE ACORDO COM O GRUPO

0%

20%

40%

60%

80%

100%

SF Collins Belzer CB

Tipos de soluções

LeveModerado

Figura 14 – CLASSIFICAÇÃO DE INFILTRADO INFLAMATÓRIO DE ACORDO COM O GRUPO

4.5.1 Análise histológica

Quanto à necrose tecidual e infiltrado inflamatório, os achados foram semelhantes

entre os grupos (p>0,05). (figura 15)

30

No entanto a avaliação quanto ao edema e necrose de ilhotas mostrou uma relação

estatisticamente significante relacionada a solução de preservação (p=0,001).

O achado de edema foi similar nos grupos Soro Fisiológico e Euro-Collins (maior

número em grau moderado). Os grupos Belzer e Euro-Collins/Belzer apresentaram achado

de edema similar (maior número grau leve). Esta diferença entre os grupos (Belzer e Euro-

Collins/Belzer) e (Soro Fisiológico e Euro-Collins) mostrou-se estatisticamente significante.

Necrose de ilhotas (figura 16 e 17) também se mostrou associada com o tipo de

solução (p=0,001). Os grupos que apresentaram maior grau de necrose foram o Soro

Fisiológico e Euro-Collins quando comparados aos grupos Belzer e Euro-Collins/Belzer.

Esta diferença entre os grupos (Belzer e Euro-Collins/Belzer) e (Soro Fisiológico e Euro-

Collins) mostrou-se estatisticamente significante.

Figura 15 – FOTOMICROGRAFIA MOSTRANDO NECROSE TECIDUAL (SETA) NO PÂNCREAS DO GRUPO SORO FISIOLÓGICO. (400 X HE)

31

Figura 16 - FOTOMICROGRAFIA MOSTRANDO NECROSE DE ILHOTAS (SETA) NO PÂNCREAS DO GRUPO EURO-COLLINS. (400 X HE)

Figura 17 - FOTOMICROGRAFIA MOSTRANDO ASPECTO NORMAL DE ILHOTA NO PÂNCREAS DO GRUPO CB. (400 X HE)

32

5 DISCUSSÃO

33

5 DISCUSSÃO

Em 1967 deu-se o início a era dos transplantes de pâncreas e rim; Kelly et al.

(1967), relataram os dois primeiros pacientes transplantados rim-pâncreas. Desde então,

numerosas mudanças foram feitas a fim de se diminuir a morbidade e a mortalidade

associadas a este procedimento.

Em 1979, Calne et al. introduziram o uso da ciclosporina na prática clínica, com

grande melhora na imunosupressão. Aprimoramentos da técnica cirúrgica (Cook et al,

1983), o entendimento nos eventos celulares associados à rejeição e preservação dos

órgãos, os melhores esquemas antibióticos, a evolução no diagnóstico radiológico e

abordagens percutâneas trouxeram resultados bastante animadores (Kuo et al, 1997).

No entanto, apesar de o transplante de pâncreas estar ganhando popularidade,

com aumento progressivo no número de centros ao redor do mundo, ele ainda continua

sendo o transplante com o maior índice de complicações cirúrgicas entre todos os órgãos

sólidos, o que o torna um procedimento de alto custo (Humar et al, 2000). Segundo dados

americanos o custo médio atual do transplante de pâncreas – rim durante o período de

internação é de US$ 110.000 a 125.000 dólares (Kuo et al, 1997).

Stratta et al (1997) avaliaram o custo hospitalar do transplante de pâncreas – rim

em duas épocas (1991 e 1995) e notaram diminuição no tempo de internação e no uso de

recursos hospitalares. No entanto, o aumento dos gastos no processo de captação de

órgãos fez com que o custo hospitalar nos dois períodos se mantivesse estável, em torno de

US$ 111.000 dólares (Stratta et al, 1997).

De acordo com Belzer et al (1993), o objetivo da preservação de órgãos a serem

transplantados é que permita usar o maior número de órgãos possível, com a máxima

qualidade e com o menor custo.

34

No processo de preservação, três princípios básicos devem ser notados: a

hipotermia, a prevenção do edema celular e os efeitos bioquímicos (Belzer et al, 1993). A

hipotermia retarda o efeito da isquemia, entretanto, diminui o metabolismo e inibe a bomba

de sódio e potássio da membrana, uma das responsáveis pelo edema celular. Durante a

isquemia, a quebra da glicose, por processo anaeróbio, é estimulada. Neste momento,

torna-se importante à utilização das soluções de preservação (Olthoff et al, 1990).

Diversas substâncias vêm sendo estudadas para a preservação de órgãos, contudo

duas delas têm se destacado; a partir da década de 70, houve o surgimento da solução de

Euro-collins e, mais recentemente, na década de 80, a solução de Belzer (Southard et al,

1995).

Numerosos estudos têm sido realizados com ambas as soluções com o intuito de

melhor definir e aprimorar a utilização e as limitações, contudo, a indiscutível eficácia da

solução de preservação de Belzer revolucionou a prática dos transplantes, tornando-a a

solução padrão-ouro na preservação dos órgãos abdominais (Uhlmann et al, 2002; Toledo-

Pereyra et al, 1979, Abouna et al, 1988; Stratta et al, 1990).

Por outro lado, o alto custo da solução de Belzer (Adam et al, 1996) e à

exclusividade de benefícios associada ao seu uso, fazem necessários novos estudos a fim

de se encontrar a melhor relação custo-benefício; ou seja, uma solução de custo baixo e

efetividade comprovada.

Na prática clínica, o alto custo da solução de Belzer, faz com que muitas equipes

responsáveis pela captação de fígados utilizem esquemas diversos, como fazer uso da

solução de Euro-Collins previamente à de Belzer, ou mesmo de outras soluções, como

histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK) ou Celsior.

Assim sendo, o desenvolvimento de uma solução de preservação ideal é assunto

de grande interesse no meio médico, visto que o número de transplantes vêm aumentando

significantemente nos últimos anos (American Diabetes Association, 2000).

Gonzalez et al (2005) descreveram a primeira série de casos clínicos comparando a

utilização da solução de Euro-Collins e em sequência a solução de Belzer isoladamente no

35

transplante combinado pâncreas-rim, mostrando não existirem diferenças quanto ao

resultado clínico e, com a vantagem de custos menores.

Até o presente momento nenhum trabalho experimental foi realizado na tentativa de

comprovar a eficácia da utilização da solução de Euro-Collins e Belzer de forma seqüencial

na perfusão do pâncreas.

Na intenção de investigar os efeitos da associação de duas soluções no transplante

de pâncreas, após a análise da literatura, dois trabalhos demonstraram que a dosagem da

amilase no líquido de preservação, pode demonstrar a viabilidade do tecido pancreático

perfundido (Kinasiewicz et al, 2003; Fiedor et al, 1996). Com a progressão do tempo de

isquemia, existe uma liberação de amilase pelo tecido pancreático, estando relacionada à

elevação do seu valor à evolução da lesão tecidual (Kinasiewicz et al, 2003; Fiedor et al,

1996). A partir destes relatos, a dosagem de amilase no líquido de preservação pôde ser

utilizada como um parâmetro laboratorial de forma a predizer o grau de lesão tecidual do

pâncreas ao longo do tempo. Ainda, a dosagem de amilase do líquido de preservação,

possui utilidade prática para o uso rotineiro em um ambiente de captação de órgãos em

seres humanos, tornando este método factível e realista para as equipes de captação de

órgãos.

Hoffmann et al (1995) demonstraram que a lesão de isquemia-reperfusão provoca

uma reação inflamatória similar à causada por um quadro de pancreatite aguda. Neste

sentido, a análise histológica foi definida como parâmetro de avaliação por ser um método já

bem estabelecido e descrito por Schmidt FV et al. (1992), de baixo custo, praticidade e

aplicabilidade a fim de se avaliar a lesão de isquemia, em moldes similares às avaliações de

quadros pancreáticos inflamatórios como os de pancreatite aguda.

Numerosos trabalhos experimentais têm utilizado o rato com sucesso para o

transplante de pâncreas (Obermaier et al, 2002; Vollmar et al, 1999), devido a facilidade de

obtenção, baixos custos e ter características histológicas similares ao ser humano. Por

estes motivos utilizou-se o rato neste estudo.

No grupo Belzer foram alocados maior número de animais. Apesar do número de

animais ser diferente nas quatro amostras, não houve prejuízo na análise estatística.

36

A técnica operatória para perfusão e ressecção do pâncreas, foi baseada nos

trabalhos de Lee et al (1972) e Yongping et al (2001) e adaptada para realização no

Laboratório de Cirurgia Experimental da Técnica Operatória da UNIFESP- EPM.

No transplante clínico de pâncreas em adulto, a perfusão do órgão é feita com cerca

de 2 litros de Belzer, independentemente do peso do paciente ou do órgão. Utilizamos no

nosso experimento um método similar ao que é feito no transplante clínico, com uma

perfusão padrão de 20 ml independentemente do peso do animal; volume no qual ocorre o

clareamento total do órgão. Foi utilizada uma bomba de infusão a fim de manter estável o

fluxo, minimizando assim a lesão por alteração de fluxo e pressão da perfusão.

O tempo das coletas para dosagem de amilase foi padronizado de acordo com

resultados obtidos em um projeto piloto no qual evidenciou-se que o nível de amilase cresce

até o período de 48 horas. A partir deste período os valores tornam-se heterogêneos devido

à necrose do órgão. Para a análise histológica, padronizou-se o tempo de 48 horas baseado

no projeto piloto, aonde foi notado que antes deste período não são detectáveis alterações

histológicas.

Pode-se observar que existe ao longo do tempo um aumento do valor da amilase nas

soluções de preservação. Este aumento está relacionado à liberação de amilase pelo tecido

pancreático que sofre a lesão de isquemia (Kinasiewicz et al, 2003; Fiedor et al, 1996). O

aumento progressivo demonstra a progressão da lesão (Kinasiewicz et al, 2003).

Embora os animais do grupo Collins-Belzer tenham apresentado o maior peso

corporal e o maior peso da peça ressecada, os valores de amilase não foram maiores que

dos outros grupos, mostrando que este fato não alterou os resultados.

Os grupos Euro-Collins e Soro Fisiológico apresentaram valores de amilase em 12

horas superiores estatisticamente em relação aos grupos Belzer e Euro-Collins/Belzer;

diferença esta que permaneceu até 24 horas de isquemia. Isto sugere que a associação das

duas soluções (Euro-Collins + Belzer) produz resultado similar quanto à preservação

quando avaliado pelo valor de amilase no líquido de preservação. Após este período não

houve diferença estatística entre os grupos (Belzer e Euro-Collins/Belzer) e (Soro Fisiológico

37

e Euro-Collins) em relação ao valor da amilase, levando a pensar que, após 24 horas, o

efeito benéfico das soluções de preservação ”gold standard” diminui, e a produção de

amilase pelo pâncreas é acelerada, levando a níveis similares aos do grupo Soro Fisiológico

e Euro-Collins em períodos mais tardios.

Isto mostra que a preservação do órgão é semelhante nos grupos Belzer e Euro-

Collins/Belzer no período de 24 horas. Após este período a dosagem de amilase no grupo

Euro-Collins/Belzer passa a ser maior do que do grupo Belzer. No período 36 horas, embora

não haja significância estatística, a amilase do grupo Euro-Collins/Belzer é maior do que do

grupo Belzer e a diferença torna-se estatisticamente significante no período 48 horas.

Estes achados indicam que a preservação do pâncreas para transplante é tão boa no

grupo Belzer quanto no Euro-Collins/Belzer até 24 horas; após este período deve-se ficar

atento a um maior sofrimento no grupo Euro-Collins/Belzer.

A avaliação histológica em relação ao enxerto demonstrou não existir diferença

estatisticamente significante da distribuição de necrose tecidual e infiltrado inflamatório

segundo o tipo de solução empregada (p>0,005). Muito provavelmente isto ocorreu porque

a necrose tecidual é a última manifestação do processo de isquemia (Drognitz et al. 2004),

sendo necessário talvez, um período mais prolongado a fim de se evidenciar este tipo de

alteração.

Para o achado de edema, observou-se que no grupo Euro-Collins/Belzer todas as

peças apresentaram edema leve ao passo que para o grupo Euro-Collins, aproximadamente

85% dos enxertos apresentaram edema moderado. Através da Generalização do Teste

Exato de Fisher observou-se associação estatisticamente significante entre edema e tipo de

solução (p=0,001). Contudo, o achado de edema é pouco específico e está presente em

inúmeros processos inflamatórios que envolvem o pâncreas (Hackert et al. 2005).

Necrose de ilhotas também se mostrou associada com o tipo de solução empregada

(p=0,001) sendo que aproximadamente 71% dos animais no grupo Soro Fisiológico

apresentaram necrose de ilhotas intensa sendo que para os outros grupos a maioria das

peças apresentou necrose de ilhotas leve. A partir deste achado podemos caracterizar,

segundo alguns autores (Orsoni et al, 1993; Kuroda et al, 1992), que a necrose de ilhotas é

38

a primeira manifestação de isquemia. O encontro de diferença estatisticamente significante

entre os grupos Soro Fisiológico e Euro-Collins/Belzer, Euro-Collins e Euro-Collins/Belzer e

similaridade dos grupos Belzer e Euro-Collins/Belzer nos faz pensar que, histologicamente,

os grupos Belzer e Euro-Collins/Belzer são similares. Logo, sofreram menor grau de

necrose de ilhotas e conseqüentemente menor lesão por isquemia do que os grupos Euro-

Collins e Soro Fisiológico.

A análise histológica mostrou não haver diferenças entre os grupos Belzer e Euro-

Collins/Belzer, porém como já foi comentado, a amilase mostrou diferença, por isso não se

recomenda a sua utilização em pâncreas perfundido com as soluções após 24 horas.

Podemos tentar avaliar se é o tecido pancreático localizado na periferia ou no centro

do enxerto o primeiro a sofrer as lesões e a liberar amilase no líquido de preservação, de

modo a que possa ser efetivamente contabilizada. Sabe-se que a superfície periférica do

enxerto se mantém embebida no líquido de preservação, enquanto que a parte mais central

do enxerto já sofreu o processo de perfusão e não mais mantém contato com o líquido

mantido no frasco de preservação. Assim sendo, pode-se supor que as células do órgão a

ser transplantado sofrem agressões diferentes se localizadas na periferia ou no centro do

órgão.

As peças ressecadas permaneceram imersas na solução de preservação. O grupo

Soro Fisiológico em soro fisiológico, o grupo Euro-Collins em solução de Euro-collins, o

grupo Belzer em solução de Belzer e o grupo Euro-Collins/Belzer em solução de Belzer.

Este líquido de preservação banha o tecido, teoricamente as células periféricas estariam

mais protegidas do que as células centrais, as quais receberam a solução de preservação

somente no momento da perfusão. Histologicamente este fato não foi comprovado.

Na prática clínica, tanto para o fígado quanto para o pâncreas, quando se perfunde

inicialmente com Euro-Collins e depois com Belzer, o líquido de preservação em que a peça

esta imersa é a solução de Belzer. Se a peça ficasse imersa na solução de Euro-Collins, os

custos iriam diminuir ainda mais. Isto abre a possibilidade de novos estudos perfundindo

inicialmente com Euro-Collins, a seguir o Belzer e imersão em Euro-Collins.

39

A partir dos achados provenientes dos valores de amilase e da análise histológica do

enxerto pudemos comprovar o benefício experimental do uso seqüencial das soluções de

Euro-Collins e Belzer na preservação do pâncreas em ratos. Ainda são necessários mais

estudos a fim de avaliar melhor o foco isquêmico no enxerto, a interação entre os tempos da

perfusão e preservação e suas relações com as soluções de preservação a fim de melhor

elucidar os mecanismos envolvidos na preservação de órgãos.

40

6 CONCLUSÃO

41

6 CONCLUSÃO

A aplicação das soluções de Euro-collins e Belzer de modo seqüencial mostrou-se

eficaz na preservação do pâncreas de ratos até o período de 24 horas.

42

7 ANEXOS

43

44

8 REFERÊNCIAS

45

1. Bennett PH, Haffner S, Kasiske BL, Keane WF, Mogensen CE, Parving HH, Steffes

MW, Striker GE. Screening and management of microalbuminuria in patients with

diabetes mellitus: recommendations to the Scientific Advisory Board of the National

Kidney Foundation from an ad hoc committee of the Council on Diabetes Mellitus of

the National Kidney Foundation. Am J Kidney Dis 1995; 25(1):107-12.

2. The Diabetes Control and Complications Trial Reasearch Group. The effect of

intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term

complications in insulin-dependent diabetes mellitus. The Diabetes Control and

Complications Trial Research Group. N Engl J Med 1993; 329(14):977-86.

3. Selby JV, Fitz Simmons SC, Newman JM, Katz PP, Sepe S, Showstack J. The natural

history and epidemiology of diabetic nephropathy. Implications for prevention and

control. JAMA 1990; 263(14):1954-60.

4. Krishnamurthi V, Philosophe B, Bartlett ST. Pancreas transplantation: contemporary

surgical techniques. Urol Clin North Am 2001; 28(4):833-8.

5. Pancreas transplantation for patients with type 1 diabetes: American Diabetes

Association. Diabetes Care 2000; 23(1):117.

6. Kuo PC, Johnson LB, Schweitzer EJ, Bartlett ST. Simultaneous pancreas/kidney

transplantation--a comparison of enteric and bladder drainage of exocrine pancreatic

secretions. Transplantation 1997; 63(2):238-43.

7. Toledo-Pereyra LH, Chee M, Condie RM, Najarian JS, Lillehei RC. Forty-eight hours

hypothermic storage of whole canine pancreas allografts. Improved preservation with

a colloid hyperosmolar solution. Cryobiology. 1979; 16(3):221-8.

8. Abouna GM, Heil JE, Sutherland DE, Najarian JS. Factors necessary for successful

48-hour preservation of pancreas grafts. Transplantation 1988; 45(2):270-4.

9. Sutherland DE, Moudry KC. Clinical pancreas and islet transplantation Transplant

Proc 1987; 19:113-20.

46

10. Wahlberg JA, Love R, Landegaard L, Southard JH, Belzer FO. 72-hour preservation

of the canine pancreas. Transplantation 1987; 43(1):5-8.

11. Belzer FO. Evaluation of preservation of the intra-abdominal organs. Transplant Proc

1993; 25(4):2527-30.

12. D'Alessandro AM, Sollinger HW, Hoffmann RM, Kalayoglu M, Melzer JS, Reed A,

Knechtle SJ, Pirsch JD, Belzer FO. Experience with combined hepatic,

pancreaticoduodenal, and renal procurement with UW solution. Transplant Proc 1990;

22(4):2076-7.

13. Sollinger HW, Odorico JS, Knechtle SJ, D'Alessandro AM, Kalayoglu M, Pirsch JD.

Experience with 500 simultaneous pancreas-kidney transplants. Ann Surg 1998;

228(3):284-96.

14. Pirenne J, Van Gelder F, Coosemans W, Aerts R, Gunson B, Koshiba T, Fourneau I,

Mirza D, Van Steenbergen W, Fevery J, Nevens F, McMaster P. Type of donor aortic

preservation solution and not cold ischemia time is a major determinant of biliary

strictures after liver transplantation. Liver Transpl 2001; 7(6):540-5.

15. Uhlmann D, Armann B, Ludwig S, Escher E, Pietsch UC, Tannapfel A, Teupser D,

Hauss J, Witzigmann H. Comparison of Celsior and UW solution in experimental

pancreas preservation. J Surg Res 2002; 105(2):173-80.

16. Schwartz ME, Nishizaki T, Thung SN, Manzarbeitia C, Maharajh A, Gordon R, Miller

CM. Initial flush solution for donor liver procurement: lactated Ringers' or UW

solution? A randomized, prospective trial. Transplant Proc 1991; 23:1554-6.

17. Gonzalez AM, Lopes Filho GJ, Pestana JOM, Linhares M, Silva MHG, Moura RMAM,

Melaragno C, Sá JR, Rangel EB, Trivino T. Effects of Eurocollins Solution as Aortic

Flush for the Procurement of Human Pancreas.Transplantation. No prelo 2005.

18. Southard JH, Belzer FO. Organ preservation. Annu Rev Med 1995; 46:235-47.

47

19. Schmidt J, Lewandrowsi K, Warshaw AL, Compton CC, Rattner DW. Morphometric

characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat. Int J

Pancreatol. 1992 Aug;12(1):41-51.

20. Douglas G. Altman; Practical Statistics for Medical Research. Chapman &

Hall/CRC.1991. 611p.

21. Singer, J.M. and Andrade, D.F. (2000). Analysis of Longitudinal Data. In Handbook of

Statistics, Volume 18: Bio-Environmental and Public Health Statistics, P.K.Sen and

C.R.Rao (eds). Amsterdam: North Holland. (p. 115 a 160).

22. Kelly WD, Lillehei RC, Merkel FK, Idezuki Y, Goetz FC. Allotransplantation of the

pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy. Surgery

1967; 61(6):827-37.

23. Calne RY, Rolles K, White DJ, Thiru S, Evans DB, McMaster P, Dunn DC, Craddock

GN, Henderson RG, Aziz S, Lewis P. Cyclosporin A initially as the only

immunosuppressant in 34 recipients of cadaveric organs: 32 kidneys, 2 pancreases,

and 2 livers. Lancet 1979; 2(8151):1033-6.

24. Cook K, Sollinger HW, Warner T, Kamps D, Belzer FO. Pancreaticocystostomy: an

alternative method for exocrine drainage of segmental pancreatic allografts.

Transplantation 1983; 35(6):634-6.

25. Kuo PC, Johnson LB, Schweitzer EJ, Bartlett ST. Simultaneous pancreas/kidney

transplantation--a comparison of enteric and bladder drainage of exocrine pancreatic

secretions. Transplantation 1997; 63(2):238-43.

26. Humar A, Kandaswamy R, Granger D, Gruessner RW, Gruessner AC, Sutherland DE.

Decreased surgical risks of pancreas transplantation in the modern era. Ann Surg

2000; 231(2):269-75.

48

27. Stratta RJ, Cushing KA, Frisbie K, Miller SA. Analysis of hospital charges after

simultaneous pancreas-kidney transplantation in the era of managed care.

Transplantation 1997; 64(2):287-92.

28. Olthoff KM, Millis JM, Imagawa DK, Nuesse BJ, Derus LJ, Rosenthal JT, Milewicz AL,

Busuttil RW. Comparison of UW solution and Euro-collins solutions for cold

preservation of human liver grafts. Transplantation 1990; 49(2):284-90.

29. Adam R, Astarcioglu I, Raccuia JS, Ducot B, Reynes M, Bismuth H. Beneficial effects

of EuroEuro-collins as aortic flush for the procurement of human livers.

Transplantation 1996; 61(5):705-9.

30. Kinasiewicz A, Fiedor P. Amylase levels in preservation solutions as a marker of

exocrine tissue injury and as a prognostic factor for pancreatic islet isolation.

Transplant Proc. 2003 Sep;35(6):2345-6.

31. Fiedor P, Goodman ER, Sung RS, Czerwinski J, Rowinski W, Hardy MA. The effect of

clinical and biochemical donor parameters on pancreatic islet isolation yield from

cadaveric organ donors. Ann Transplant. 1996;1(1):59-62.

32. Hoffmann TF, Leiderer R, Waldner H, Arbogast S, Messmer K. Ischemia reperfusion

of the pancreas: a new in vivo model for acute pancreatitis in rats. Res Exp Med

(Berl). 1995;195(3):125-44.

33. Obermaier R, Benz S, Von Dobschuetz E, Drognitz O, Schareck W, Jonas L,

Messmer K, Hopt UT. Characterization of microcirculatory disturbance in a novel

model of pancreatic ischemia-reperfusion using intravital fluorescence-microscopy.

Pancreas. 2002 Aug;25(2):142-8.

34. Vollmar B, Janata J, Yamauchi J, Wolf B, Heuser M, Menger MD. Exocrine, but not

endocrine, tissue is susceptible to microvascular ischemia/reperfusion injury following

pancreas transplantation in the rat. Transpl Int. 1999;12(1):50-5.

49

35. Lee S, Tung KS, Koopmans H, Chandler JG, Orloff MJ. Pancreaticoduodenal

transplantation in the rat. Transplantation. 1972 Apr;13(4):421-5.

36. Yongping G, Jianyun G, Jieshou L. Combined pancreaticoduodenal-kidney

transplantation in rats. Microsurgery. 2001;21(2):55-7.

37. Drognitz O, Obermaier R, Liu X, Neeff H, von Dobschuetz E, Hopt UT, Benz S.

Effects of organ preservation, ischemia time and caspase inhibition on apoptosis and

microcirculation in rat pancreas transplantation. Am J Transplant. 2004 Jul;4(7):1042-

50. Erratum in: Am J Transplant. 2004 Nov;4(11):1928-9.

38. Hackert T, Werner J, Uhl W, Gebhard MM, Buchler MW, Schmidt J. Reduction of

ischemia/reperfusion injury by antithrombin III after experimental pancreas

transplantation. Am J Surg. 2005 Jan;189(1):92-7.

39. Orsoni P, Houvenaeghel G, Monges G, Delpero JR, Picaud R, Guerinel G. Pancreas

transplantation in dogs, effect on the endocrine pancreas of pancreatic duct

obliteration and the mode of pancreas preservation. Histological study by surface

analysis in dogs. Chirurgie. 1993-94;119(4):168-71. French.

40. Kuroda Y, Fujino Y, Morita A, Tanioka Y, Suzuki Y, Kawamura T, Ku Y, Saitoh Y.

Successful 96-hour preservation of the canine pancreas. Transpl Int. 1992;5 Suppl

1:S388-90.

50

Abstract Objective: Investigate the effect of Euro-collins and Belzer solution in the sequential perfusion of the pancreas, during the preservation period. Methods: Forty five Wistar-EPM rats were used. The animals were distributed in 4 groups, according to the solution used during preservation: Saline solution (SF), pancreas perfused and preserved with saline solution; Euro-collins group (C), pancreas perfused and preserved with euro-collins solution; Belzer group (B) pancreas perfused and preserved with belzer solution; Euro-collins/Belzer group (CB), pancreas perfused with euro-collins and belzer solutions in equal parts and sequentially and preserved with Belzer solution. After the perfusion, the animals had their pancreas resected and preserved according to the destinated solution in 4º C. Amilase dosages after 12, 24, 36 e 48 hours were performed in the preservation solution. After last dosage, the pancreas was submitted to histological analysis. Statistical analysis was done. Results: SF and C groups presented the higher amilase levels in the preserving solution during all periods, being superior to C and CB groups (p=0,05). Amilase levels were similar in b and CB groups until 24 hours (p=0,05). Histological analysis was statistically significant for pancreas islet cells and tecidual edema. Groups B and CB were histologically similar (p=0,001) and different from groups SF and C. Conclusions: The use of Euro-collins and Belzer solution sequentially showed to be effective in pancreas preservation in rats until 24 hours.

51

Bibliografia consultada

52

1. Rother ET, Braga MER. Como elaborar sua tese: estrutura e referências.

São Paulo; 2001.

2. DeCS – Descritores em Ciências da Saúde. São Paulo: Bireme; 1996.

3. International Serials Data System International Organization

Standardization – Liste d’abreviations de mots des titres de publications

em série: conforme à ISSO 4-1984/ Listo f serial title word abreviations: in

accordance with ISSO 4-1984. Paris: ISDS/ISSO, 1985.

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