Pró- Reitoria de Graduação

Biomedicina

AVALIAÇÃO DA PREVALÊNCIA DE INDIVÍDUOS PORTADORES DE BETA TALASSEMIA NO HOSPITAL DAS

FORÇAS ARMADAS DE BRASÍLIA- DF

Camilla Eliza Wolf Sonza

Orientadora: Msc.Cintia do Couto Mascarenhas

Co-orientador: Msc. Paulo Roberto Sabino Jr.

Brasília - DF

2010

Co-orientador : Esp. Fábio de França Martins

CAMILLA ELIZA WOLF SONZA

AVALIAÇÃO DA PREVALÊNCIA DE PORTADORES DE BETA TALA SSEMIA NO HOSPITAL DAS FORÇAS ARMADAS DE BRASÍLIA – DF.

Projeto de TCC II apresentado ao curso de

graduação em Biomedicina da Universidade

Católica de Brasília como requisito para obtenção

do título de Bacharel em Biomedicina.

Orientadora: Msc. Cíntia do Couto Mascarenhas

Co-orientadores: Msc. Paulo Roberto Sabino Jr.

Esp. Fábio de França Martins

Brasília

2010

Projeto de TCC II, de autoria de Camilla Eliza Wolf Sonza, intitulado “Avaliação da

prevalência de indivíduos portadores da Beta Talassemia no Hospital das Forças Armadas

de Brasília- DF”, apresentado como requisito para a obtenção do grau de Bacharel em

Biomedicina da Universidade Católica de Brasília, em 04 de novembro de 2010, aprovada

pela banca examinadora abaixo assinada:

____________________________________________________

Prof. Msc. Cíntia do Couto Macarenhas

Orientadora

Doutoranda pela faculdade de ciências médicas da UNICAMP – Pesquisadora voluntária da UCB

_____________________________________________________

Prof. Dr. Anderson Ferreira da Cunha

Professor Adjunto da Universidade Federal de São Carlos

____________________________________________________

Prof. Dra. Rosângela Vieira de Andrade

Professor da Universidade Católica de Brasília

Curso de Biomedicina – UCB

Brasília

2010

RESUMO

SONZA, Camilla. Avaliação da prevalência de portadores da Beta Talassemia no

Hospital das Forças Armadas de Brasília- DF. Brasília. 2010 (57). Trabalho de conclusão

de curso de Biomedicina. Universidade Católica de Brasília.

As hemoglobinopatias são alterações genéticas relacionadas aos genes responsáveis pela síntese da hemoglobina. Com extensa distribuição mundial, principalmente na população do Mediterrâneo, consideradas problemas de saúde pública em muitos países, inclusive no Brasil, as hemoglobinopatias são divididas de acordo com suas alterações estruturais ou funcionais da hemoglobina, sendo identificadas como hemoglobinas variantes e talassemia, respectivamente. As talassemias são qualificadas pela pequena síntese ou ausência da síntese de cadeias globínicas que compõem a hemoglobina, e classificadas conforme a cadeia globínica afetada. Quando se tem uma alteração na cadeia beta da globina, caracteriza-se como beta talassemia, podendo esta apresentar-se de forma assintomática ou sintomática, o que conduz à necessidade de seu conhecimento e diagnóstico. Até o presente momento não há estudos publicados referenciando a prevalência de beta talassemia em Brasília- DF, o que evidencia a importância desta pesquisa. A escolha da referida localidade para ser a capital federal gerou correntes migratórias de várias regiões do nosso país, tornando-a uma área de grande miscigenação, indicando uma possível frequência desta patologia. O objetivo do trabalho foi avaliar entre o período de maio a agosto de 2010, a presença de indivíduos portadores de beta talassemia, em todos os níveis incluindo traço talassêmico. Para isso consideraram-se no estudo 129 pacientes e seis controles com alterações hematológicas ou que apresentaram requisição médica para o exame de eletroforese de hemoglobina por capilaridade, atendidos no laboratório de análises clínicas do Hospital das Forças Armadas de Brasília. O critério de inclusão foi baseado em alterações hematológicas sugestivas de beta talassemia observadas no hemograma, na eletroforese de hemoglobina em pH ácido e alcalino e pela quantificação de hemoglobinas através da eletroforese de hemoglobina por capilaridade. A prevalência encontrada de indivíduos sugestivos de portar traço beta talassêmico neste grupo de estudo, foi de 2,32%. Entretanto, não foram identificados pacientes portadores de beta talassemia maior ou intermediária. Conclui-se que não há grande transferência de genes alterados na população, reforçando a grande variabilidade étnica que há no Brasil em relação à hemoglobinopatias. Entretanto, é necessário realizar novos estudos com um universo amostral maior para determinar a prevalência desta doença na população de Brasília.

Palavras-chave: Hemoglobinopatias. Beta talassemia. Prevalência.

ABSTRACT

Hemoglobinopathies are genetic alterations relate on genes responsible for synthesis of hemoglobin. With an extensive worldwide distribution, mainly in the Mediterranean population, considered public healthy matter in several countries, including Brazil, hemoglobinopathies are divided according to their structural or functional changes of hemoglobin, identified as hemoglobin variants and thalassemia, respectively. Thalassemias are classified by absence or short synthesis of globin chains that compound hemoglobin, and classified according to the affect globin chain. The change in beta globin chain is characterized as beta thalassemia, which can be symptomatic or asymptomatic, what leads to the necessity of its perception and diagnosis. To date, there are no published studies referencing this disease prevalence in Brasília – DF, what glares the importance of this research. The choice of the mentioned location to be the capital of Brazil gave rise to a lot of migratory waves, making it an area of great miscegenation, suggesting a possible frequency of this pathology. The purpose of this study was evaluate between May - August 2010, the presence of individuals with beta thalassemia, in all levels including thalassemic traits. For this study were considered 129 patients and six controls with hematologic changes or had a medical requisition for the exam hemoglobin by capillary electrophoresis, that were attended at the clinical laboratory of Hospital das Forças Armadas de Brasília. The reckon criteria was based upon hematologic changes that suggested beta thalasemia observed in blood count, hemoglobin electrophoresis in acid and alkaline pH and hemoglobin electrophoresis capillary. The prevalence of individuals suggestive to be porting beta thalassemia traits in this population was 2.32%. However, there were no patients with beta thalassemia major or intermedia. We conclude there is no transfer of modified genes in this population, reinforcing the ethnic variability that exists in Brazil regarding hemoglobinopathies. However, it is necessary to perform new studies with a larger sampling universe, in order to define this disease prevalence in Brasília’s population

Keyword: Hemoglobinopathies. Beta thalassemia. Prevalence.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 9

2. REFERENCIAL TEÓRICO 12

2.1. FISIOLOGIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA BETA TALASSEMIA 12

2.2. FORMAS CLÍNICAS DA BETA TALASSEMIA 16

2.2.1. Talassemia maior 16

2.2.2. Talassemia intermediária 17

2.2.3. Talassemia menor (traço talassêmico) 18

2.3. PREVALÊNCIA 18

2.4. DIAGNÓSTICO 20

2.4.1. Diagnóstico do indivíduo homozigoto 21

2.4.2. Diagnóstico do indivíduo heterozigoto 22

2.5. TRATAMENTO 22

2.5.1. Tratamento para beta-talassemia maior 22

2.5.2. Tratamento da beta-talassemia intermediária 24

2.5.1.3. Tratamento da beta-talassemia menor 24

3. JUSTIFICATIVAS 25

4. OBJETIVOS 26

4.1. OBJETIVO GERAL 26

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 26

5. MATERIAS E MÉTODOS 27

5.1. AMOSTRAS 27

5.2. AVALIAÇÃO DAS AMOSTRAS DOS PACIENTES 28

5.2.1. Contagem automatizada e análise microscópica 28

5.2.2. Eletroforese de hemoglobina em pH ácido e alcalino (gel de agarose CELM-150). 29

5.2.3. Eletroforese de hemoglobina por capilaridade (MINICAP®) 30

6. ASPECTOS ÉTICOS 33

7. RESULTADOS 34

7.1. RESULTADOS DA SÉRIE VERMELHA DO HEMOGRAMA DOS PACIENTES SELECIONADOS PARA O ESTUDO A PARTIR DA ANÁLISE DO HEMOGRAMA 35

7.2. RESULTADO DOS 129 PACIENTES ANALISADOS ATRAVÉS DA ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA POR CAPILARIDADE. 38

8. DISCUSSÃO 41

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 45

ANEXOS 53

ANEXO A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO 53

ANEXO B - ELETROFORESE DE Hb EM pH ALCALINO 54

ANEXO C - ELETROFORESE DE Hb EM pH ÁCIDO 56

9

1. INTRODUÇÃO

As hemoglobinopatias são alterações hereditárias relacionadas aos genes responsáveis

pela síntese de globinas, formando assim hemoglobinas (Hb) anormais que levam ao

comprometimento funcional dos eritrócitos (SAKAMOTO et. al., 2008; VARGAS;

YAMAGUSHI, 2008).

Estas doenças têm ampla distribuição mundial, inclusive no Brasil, devido à grande

miscigenação da população. Podemos observar uma incidência variável (MELO et.al., 2008),

sobretudo nas regiões de Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo, região litorânea do

Nordeste, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul e Goiás, devido à migração dos europeus e

asiáticos no Brasil, principalmente portugueses, italianos e espanhóis (SOUZA, 2006).

As hemoglobinopatias são divididas de acordo com suas alterações estruturais e

funcionais, sendo caracterizadas como hemoglobinas variantes e talassemias, respectivamente

(PATRINOS et. al., 2004; SAKAMOTO et al., 2008; PENMAN et al., 2009; SACHDEV et

al., 2010).

A hemoglobina é uma proteína constituída por quatro cadeias globínicas conexas a

grupos heme. Estes grupos são formados por um átomo de ferro em uma estrutura porfírica

(ZAMARO et al., 2002). Cada cadeia da globina é formada por uma sequência de

aminoácidos, sendo a cadeia alfa (α) composta por 141 aminoácidos e a cadeia beta (β) por

146 aminoácidos. As formas pelas quais as cadeias de proteínas se combinam geram

diferentes hemoglobinas presentes nos eritrócitos desde o período intra-uterino até a fase

adulta (GALIZA; PITOMBEIRA, 2003).

As mudanças que ocorrem na expressão dos genes estão relacionadas com a organização

destes grupos em dois clusters: no cromossomo 11 e no cromossomo 16 (ZAMARO, et.al.,

2002). Estão inclusos no cromossomo 16 os genes que sintetizam as cadeias zeta (ζ), alfa (α) e

teta (θ), já no cromossomo 11 são sintetizadas as cadeias épsilon (ε), gama (γA e γG), delta (δ)

e beta (β) (Figura 1.). Estes genes são ativados em ordem linear, da mesma forma em que são

distribuídos no cromossomo (SOUZA, 2006) (Figura 1.).

10

Durante o desenvolvimento ontogenético normal ocorrem mudanças na expressão dos

genes responsáveis pelos diferentes tipos de hemoglobinas humanas. No período embrionário

encontram-se as Hb Gower I (ζ2ε2), Gower II (α2ε2) e Portland (ε2γ2), no período fetal a

HbF (α2γ2), e na vida adulta a HbA (α2β2) e a HbA2 (α2δ2) (GALIZA; PITOMBEIRA,

2003; SOUZA, 2006) (Tabela 1.).

Figura 1. Organização dos genes, que compõem o grupo globina e que ao

se combinarem com a parte heme, formam a hemoglobina. No

cromossomo 16 estão inclusos genes que sintetizam cadeias zeta, alfa e

teta, enquanto no cromossomo 11 estão inclusos genes que sintetizam

cadeias épsilon, gama, delta e beta. FONTE: Naoum, 1990, adaptado.

Tabela 1. Representação dos diferentes tipos de hemoglobina relacionando

o principal período de produção e composição da cadeia globínica. FONTE:

GALIZA; PITOMBEIRA, 2003.

Tipo de

hemoglobina

Período preponderante

de síntese

Cadeias

globínicas

Gower-1 Embrião – até 3 meses ζ2ε2

Portland Embrião – até 3 meses ζ2γ2

Gower-2 Embrião – até 3 meses α2ε2

HbF Feto – até 6 meses α2γ2

HbA 2 Feto / Vida adulta α2δ2

HbA Vida adulta α2β2

11

As talassemias estão relacionadas a uma diminuição da síntese ou ausência da síntese

de cadeias globínicas, e são classificadas de acordo com a cadeia afetada, podendo apresentar-

se como alfa talassemia, beta talassemia, delta talassemia, delta-beta-talassemia ou gama-

delta-beta-talassemia (ZAGO, 2004). Quando a alteração ocorre na cadeia beta, caracteriza-se

uma beta talassemia, que faz parte de um grupo de doenças genéticas autossômicas recessivas

e que pode ser fatal, quando em homozigose (HAZIROLAM et al., 2009; AMINI et al., 2007;

DWIVEDI; KUMAR, 2007; ASSARI et.al., 2009; DSOUKY et al., 2009).

Na beta talassemia existem cerca de duzentas diferentes alterações moleculares

definidas, e podemos agrupá-las em: grandes deleções, pequenas deleções ou inserções e

mutações, sendo as mutações pontuais as mais freqüentes.

As mutações pontuais afetam a qualidade e a quantidade do mRNA produzido,

gerando uma tradução ineficaz (KIMURA et al., 2003; LONKAR et al., 2009;

CUNNINGHAM, 2010), tendo consequências diferentes de acordo com o local onde ocorre.

Estas mutações são classificadas de acordo com o comprometimento causado a regulação da

expressão do gene, podendo ser na transcrição, processamento do RNA ou tradução (THEIN,

2005).

O comprometimento da transcrição por alguma destas mutações envolvem sequências

de DNA que constituem o promotor da beta globina, resultando geralmente em uma

deficiência mínima na produção de β globina, podendo ser silenciosa em portadores de β

talassemia (THEIN, 2005).

O processamento alterado do DNA leva a formação de hemoglobinas com

funcionalidade prejudicada e assim originam a β talassemia, sendo esta maior, intemediária ou

menor (THEIN, 2005). Metade dos alelos de β talassemia comprometem diferentes estágios

da tradução do RNA, determinando uma talassemia β0. Isto ocorre devido ausência da

produção de cadeias β globínicas pela introdução prematura de códons de terminação

(THEIN, 2005).

Portanto, devido as alterações moleculares que ocorrem na beta talassemia, o

indivíduo pode ser heterozigoto (portador de um gene β talassêmico) ou homozigoto (portador

de dois genes β talassêmicos). No caso de homozigose as alterações moleculares podem

12

originar ausência completa ou apenas supressão parcial da síntese das cadeias β da globina,

denominando-se β0 e β+, respectivamente (ZAGO, 2004; THEIN, 2005).

A maior parte dos indivíduos, heterozigotos, é assintomática, tendo expectativa de

vida semelhante a dos indivíduos que não são portadores de hemoglobinas anormais. As

alterações são observadas através de exames laboratoriais (ESTEVÃO, 2009). Os indivíduos

homozigotos e os heterozigotos compostos (aqueles que carregam a herança de β talassemia

associada a outro defeito, funcional ou estrutural, na hemoglobina) têm manifestações clínicas

variando desde assintomáticos até as mais graves da doença (ZAGO, 2004).

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1.FISIOLOGIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA BETA TALASSEMIA

Sollaino e colaboradores (2009) descrevem que as manifestações clínicas da beta

talassemia são variáveis e estão associadas à condição dependente de transfusão da beta

talassemia maior e intermediária, assim como o estado assintomático do indivíduo que possui

apenas o traço talassêmico.

Na beta talassemia maior as manifestações estão relacionadas diretamente a fatores

como: a intensidade da hemólise, os riscos relacionados às transfusões de hemácias

(CANÇADO, 2008), defeito da hemoglobinização, distúrbios proliferativos e metabólicos dos

eritroblastos, lesão da membrana eritrocitária e desequilíbrio da síntese de globina. (NAOUM,

1999; ZAGO, 2004).

Os principais sintomas dos pacientes com beta talassemia maior são astenia, palidez,

fraqueza muscular, hipodesenvolvimento físico e sexual, sopros no precórdio, taquicardia,

insuficiência cardíaca e maior susceptibilidade a infecções (NAOUM, 1990; ZAGO, 2004).

13

Como resultado da alteração molecular que ocorre na beta talassemia, há síntese

anormal de hemoglobina que leva ao excesso de cadeias α, tanto nos precursores eritróides,

quanto nos eritrócitos periféricos (SCOTT et, al., 1992). Estas cadeias α excedentes não são

viáveis para formar tetrâmeros e precipitam dentro do eritrócito gerando lesões na membrana,

além de causar comprometimento da mitose e do metabolismo celular desses eritrócitos

(ZAGO, 2004; THEIN, 2005; LITHANATUDOM et al., 2009).

Existem várias modificações celulares associadas aos eritrócitos dos indivíduos

talassêmicos, como hipocromia microcitose, anisopoiquilocitose e dano oxidativo da

membrana. A hipocromia e a microcitose são características encontradas tanto na anemia

ferropriva como nas talassemias (MATOS et. al., 2008). Já o dano oxidativo da membrana

pode ser potencializado devido ao ferro liberado pela degradação de cadeias alfa da

hemoglobina (VAN DENBERG et.al., 1993).

Também podemos observar nesta doença a diseritropoese que é caracterizada por

alterações morfológicas variadas nos eritroblastos, como núcleos com contornos irregulares,

segmentados ou em forma de trevo, células bi ou multinucleadas, micronúcleos e

fragmentação nuclear, pontes citoplasmáticas ou internucleares e vacuolização citoplasmática.

Observa-se ainda invaginação da membrana plasmática, acúmulo de ferro, agregados de

glicogênio, corpos de inclusão e alterações de membrana (ZAGO, 2004).

Os agregados da cadeia α podem ser visualizados nos citoplasmas dos eritroblastos pela

coloração com metilvioleta e com coloração panóptica, na qual as inclusões aparecem como

massas claras e homogêneas. Além disso, estas inclusões contribuem para a poiquilocitose por

meio de três mecanismos: lesão mecânica direta e formação de hemicromos aderidos à

membrana, alteração da estrutura de proteínas e peroxidação de lipídios e lesão da membrana

por fagocitose parcial quando os corpos de inclusão são retirados das células circulantes pelo

baço (NAOUM, P; NAOUM, F, 2004; ZAGO, 2004).

As anormalidades dos eritrócitos levam a uma anemia e eritropoese ineficaz, pois

ocorre a indução da apoptose na fase de eritroblasto policromático, devido à precipitação das

cadeias α e pelo acúmulo de ferro que levam à hemólise. A eritropoese ineficaz caracteriza-se

pela hiperplasia eritróide da medula óssea (CUNNINGHAM, 2010; LITHANATUDOM et

al., 2009, GALANELLO; ORIGA 2010)

14

A anemia é uma das manifestações clínicas mais importantes. Alguns pacientes

sintomáticos podem ter nível de hemoglobina mais elevado (ou próximo a normalidade),

quando comparados com pacientes com beta talassemia maior, (7 a 10 g/dL), sendo

classificados como talassêmicos intermediários. Já os pacientes com beta talassemia menor,

têm discreta redução dos níveis de hemoglobina e geralmente são assintomáticos.

Pacientes com beta talassemia maior apresentam uma produção eritróide aumentada

cerca de 7 a 30 vezes quando comparada ao indivíduo normal, na tentativa de compensar o

organismo da eritropoese ineficaz. As conseqüências são: aumento da absorção gastrintestinal

de ferro, alterações ósseas e desvio de nutrientes e energia alimentar para a MO

(LITHANATUDOM et al., 2009).

Entretanto, esta hiperplasia é ineficaz, pois a maioria das células produzidas são

destruídas ainda na MO (LITHANATUDOM et al., 2009; MELLOULI et.al., 2010). A

destruição celular contínua tem como conseqüência a liberação de enzimas intracelulares,

como a desidrogenase lática – DHL, e elevada produção de catabólitos derivados da

destruição de ácidos nucléicos e da hemoglobina, ácido úrico e bilirrubina, respectivamente

(LITHANATUDOM et.al., 2009; ZAGO, 2004).

Os eritrócitos que conseguem alcançar a circulação periférica são captados pelo baço,

que é sensível a qualquer tipo de alteração na membrana das hemácias, levando ao aumento

do baço. Então, a esplenomegalia ocorre devido à hiperplasia do sistema fagocítico pela

destruição de eritrócitos anormais, com ingurgitação e depósitos de ferro. O hiperesplenismo

ocorre devido à esplenomegalia, retendo e armazenando todos os tipos de células sangúineas,

reduzindo o número de eritrócitos, leucócitos e plaquetas. (SOUZA, 2006; ZAGO, 2004).

O aumento do ferro além de ser ocasionado pela hiperplasia da medula óssea, também

ocorre devido às transfusões sanguíneas, já que 2/3 do ferro do nosso organismo encontram-se

dentro das hemácias (ZAGO, 2004).

A sobrecarga do ferro, na ausência do tratamento, faz com que este se deposite na

forma de ferritina e hemossiderina em vários órgãos ou tecidos, como fígado, baço, medula

óssea, miocárdio e glândulas endócrinas, levando à hemocromatose (CANÇADO, 2008;

ESTEVÃO, 2009; ZAGO, 2004). A hemocromatose ocasiona alterações como o retardo no

crescimento e na maturidade sexual, anormalidades endocrinológicas, alterações cardíacas,

15

escurecimento da pele, lesões celulares e teciduais e o comprometimento hepático

(CANÇADO, 2008; LO; SINGER, 2002).

O ferro pode lesar vários tecidos, pois catalisa a reação que converte peróxidos de

oxigênio em íons de radicais livres, destruindo a membrana celular, proteínas e DNA,

causando hipertrofia cardíaca, dilatação e degeneração das fibras do miocárdio, provocando

injúria dos miócitos (HAZIROLAN et.al., 2009). Portanto, é importante que haja um

tratamento com quelante de ferro dos pacientes que apresentam níveis elevados de ferro

sérico, ferritina e transferrina (ZAGO, 2004).

Em um estudo realizado por Olivieri e colaboradores foi observada a importância da

determinação da ferritina sérica em pacientes beta-talassêmicos, já que estes autores

demonstraram que quanto maior o tempo que a ferritina for mantida menor que 2.500ng/mL,

menor a chance de desenvolver doença cardíaca e maior a sobrevida deste paciente

(OLIVIERI, 1999). Além disso, a sobrecarga de ferro pode contribuir para a osteopatia

talassêmica, pois provoca o hipoparatiroidismo e diminuição de vitamina C, que também pode

ocasionar osteoporose, escorbuto e hiperatividade dos osteoclastos (CANÇADO, 2008)

Além do aumento do ferro no organismo, a hiperplasia da medula óssea pode levar a

alterações endócrinas e o hipodesenvolvimento somático e sexual, pois esta consome muitos

nutrientes e energia, comprometendo o aporte para outros tecidos. O hipodesenvolvimento

somático e sexual se caracteriza por um menor crescimento pôndero-estatural na infância,

redução da massa muscular e ausência ou retardo da maturidade sexual na adolescência (LO;

SINGER, 2002). As alterações ósseas e articulares, observadas no rosto e crânio de indivíduos

portadores de beta talassemia maior, também são ocasionados devido a hiperplasia da medula

óssea (AMINI et al., 2007).

.

16

2.2. FORMAS CLÍNICAS DA BETA TALASSEMIA

2.2.1. Talassemia maior

Também conhecida como anemia do Mediterrâneo, anemia eritroblástica ou anemia de

Cooley, é a forma mais grave, sintomática e dependente de transfusão sanguínea. Com

manifestações clínicas presentes desde o primeiro ano de vida. A caracterização do indivíduos

como sendo portador de beta talassemia maior e intermediária é realizada pela frequência de

transfusões que esses pacientes recebem, bem como pela associação das manifestações

clinicas, relacionando-as aos exames laboratoriais que caracterizam o genótipo do indivíduo

(ZAGO, 2004).

As manifestações clínicas da beta talassemia maior são: anemia severa, episódios

recorrentes de febre, diarréia, irritabilidade, apatia, palidez e aumento progressivo do

abdômen devido à esplenomegalia, retardo no crescimento, icterícia, musculatura fraca,

úlceras nas pernas, desenvolvimento de massa extramedular e alterações ósseas decorrentes

da expansão da MO (CAO; GALANELLO, 2010; LIMA, 2001; LO; SINGER, 2002; ZAGO,

2004; THEIN, 2005). Estas alterações em decorrência da expansão da MO são: deformidades

nos ossos longos das pernas e alterações craniofaciais típicas – relevo do crânio, eminência

malar proeminente, inclinação mongolóide do olho, depressão da ponte do nariz, hipertrofia

maxilar que expõe os dentes superiores (GALANELLO; ORIGA, 2010).

O indivíduo acometido pode não apresentar anemia nos seus primeiros seis meses de

vida, devido ao nível de hemoglobina fetal presente. Porém com a diminuição dessa

hemoglobina instala-se uma anemia severa (CAO; GALANELLO, 2010), com hemoglobina

abaixo de 6,5g/dL (ZAGO, 2004). As células vermelhas apresentam alterações como

microcitose, hipocromia, anisiocitose, poiquilocitose e presença de eritroblastos no sangue

periférico (CAO; GALANELLO, 2010; LIMA, 2001).

17

2.2.2 Talassemia intermediária

É uma forma sintomática, porém de menor gravidade que a talassemia maior.

Apresentando níveis de hemoglobina entre 7 a 11 g/dL, e não dependem de transfusões

regulares (ZAGO, 2004; SOLLAINO et al., 2009).

As manifestações clínicas mais freqüentes da beta talassemia intermediária são:

palidez, icterícia, colestase, hepatoesplenomegalia moderada a severa, alterações faciais,

diminuição da massa muscular, úlceras crônicas nas pernas e anemia crônica (ELDOR;

RACHMILEWITZ, 2002; CAO; GALANELLO, 2010). Podem apresentar também cálculos

biliares, hipertrofia da medula eritróide com hematopoese medular e extramedular e suas

complicações – osteoporose, massas do tecido eritropoietico que afetam o baço, fígado,

linfonodos, tórax e coluna, e deformidades ósseas e alterações faciais (CAO; GALANELLO

2010).

Esta patologia resulta de combinações genéticas, como (THEIN, 2005):

- β+/β+ (homozigoto, com produção moderada de cadeia β, apresentando quantidade

moderada de HbA).

- β0/β0 (homozigoto, com produção moderada de cadeia - β, apresentando quantidade

moderada de HbA).

- β0/β+ (heterozigoto, com produção moderada de cadeia β, apresentando quantidade

moderada de HbA).

- Associação entre β+/δβ – talassemia;

- Presença de uma modificação adicional que reduz o excesso de cadeias α (co-herança

de α-talassemia) ou que aumenta a produção de cadeias γ (Persistência de HbF – PHHF);

- Heterozigose para o gene β- talassêmico particularmente grave.

18

2.2.3. Talassemia menor (traço talassêmico)

Normalmente estes pacientes são assintomáticos, apenas carregam o gene beta

talassêmico (heterozigotos) apresentando nível de hemoglobina ligeiramente diminuído em

algumas situações como na infância, na gravidez e na presença de infecções ou inflamação

crônica. (LO; SINGER, 2002; ZAGO, 2004).

Apesar de serem assintomáticos podem apresentar anemia, microcítica e hipocrômica,

além de aumento de HbA2 ( >4% ) (THEIN, 2005; YANG et.al., 2009). Ainda podem ter

redução do volume corpuscular médio (VCM) e hemoglobina corpuscular média (HCM),

entretanto não se observa eritroblastos presentes na circulação periférica (CAO;

GALANELLO, 2010).

2.3. PREVALÊNCIA

As hemoglobinopatias são doenças muito frequentes mundialmente, atingindo 7,0% da

população, sendo que a cada ano 300 a 400 mil recém-nascidos são acometidos por uma

forma mais severa (SOUZA, 2006).

De acordo com a Organização Mundial da Saúde 270 milhões de pessoas têm genes

que determinam hemoglobinopatias (SOUZA, 2006), e cerca de 90 milhões de pessoas têm

genes defeituosos de talassemia (DSOUKY et al., 2009). Hajibeiji (2009) cita que a cada ano

aproximadamente 60 mil bebês nascem no mundo com talassemia e Amini e colaboradores

(2007) relatam que 150 milhões de pessoas no mundo carregam genes beta-talassêmicos

(Figura 2.).

19

Figura 2. Distribuição geográfica das hemoglobinopatias como: talassemias, anemia falciforme,

hemoglobina E, hemoglobina C e hemoglobina D. FONTE: MANUAL DO EQUIPAMENTO SEBIA, 2010.

A beta talassemia ocorre mais frequentemente no Mediterrâneo, Norte e Oeste da

África, Índia, Oriente Médio e Ásia (AMINI et al., 2007; DSOUKY et al., 2009). No Egito

tem-se a beta-talassemia como causa mais comum de anemia hemolítica (DSOUKY et al.,

2009).

No Brasil temos um alto grau de miscigenação, devido à colonização por europeus e o

grande trabalho escravo vindo da África (VINCI DE MORAES, 2000; MELO et al., 2008),

principalmente para o Nordeste do Brasil, influenciando na prevalência de

hemoglobinopatias, e consequentemente da β-talassemia no país (DSOUKY et al., 2009).

Também contribuiu para o aumento da prevalência desta doença no Brasil, assim como todas

as outras hemoglobinopatias, a grande imigração de italianos, principalmente para o Sul do

Brasil, no final do século XIX. (ROSATELLI et al., 1992; LISOT; SILLA, 2004; ROBBINS

et al., 2005). Souza (2006) relata que no Brasil 10 milhões de indivíduos são heterozigotos

para hemoglobinopatias.

20

2.4. DIAGNÓSTICO

Como método de screening, de acordo com Protocolos de Metodologias Laboratoriais

Clássicas Para o Diagnóstico de Hemoglobinopatias da UNESP (2003) e Vargas e Yamagushi

(2008), tem-se basicamente a análise do eritrograma, da morfologia eritrocitária e o teste de

resistência ao NaCl.

A partir do eritrograma é possível avaliar parâmetros como índices de VCM, CHCM,

HCM, RDW, hematócrito e hemoglobina. Estas técnicas são de baixo custo, rápidas e

confiáveis (DSOUKY et al., 2009). Thein (2005) e colaboradores demonstraram em um

estudo que indivíduos que possuíam genes β0 talassêmicos apresentavam valores aproximados

de VCM = 63,1fl e HCM = 19,7 pg, enquanto que indivíduos que possuíam genes β+

talassêmicos apresentavam VCM de aproximadamente; 69,3 fl e HCM de 21,8 pg (THEIN,

2005).

Pela análise da morfologia eritrocitária observamos informações importantes sobre

qual é o tipo de anemia presente (como no caso de talassemias: anemia microcítica e

hipocrômica) e alterações como anisiopoiquilocitose, hemácias em alvo, pontos basofílicos

entre outras características da talassemia (LIMA, 2001).

O teste de resistência ao NaCl (0,36%) pode ser utilizado para auxiliar outros métodos

de diagnósticos para a beta talassemia. Ele é utilizado principalmente quando há suspeita de

beta talassemia heterozigótica. Nestes casos, os eritrócitos são mais resistentes à hemólise,

então quando os eritrócitos de um indivíduo beta talassêmico heterozigoto são submetidos a

essa concentração de NaCl não ocorre hemólise, já nos eritrócitos de um individuo controle

ocorre hemólise (UNESP, 2003).

Existem técnicas avançadas que podem revelar mais precisamente informações sobre

as Hb variantes e os tipos de talassemias, porém são técnicas de maior custo em relação às

usadas para o screening (DSOUKY et al., 2009). Dentre elas podemos citar a eletroforese de

Hb (ácida ou alcalina), a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), a eletroforese de

hemoglobina por capilaridade, a análise por espectrometria de massa e o sequenciamento do

DNA (BHAT et al., 2010).

21

2.4.1. Diagnóstico do indivíduo homozigoto

As principais alterações hematológicas presentes nos indivíduos homozigotos são a

anemia microcitica e hipocromica (Hb menor que 9g/dl), anisopoiquilocitose intensa,

hemácias e eritroblastos com granulações basofílicas, anel de Cabot, policromasia e

hemograma com desvio a esquerda nos granulócitos (ZAGO, 2004).

Os micrócitos encontrados são mais delgados que os eritrócitos normais, causa pela

qual a fragilidade osmótica está diminuída. A contagem de reticulócitos está aumentada e há

presença de inclusões intracitoplásmicas, que são os precipitados das cadeias alfa (LIMA,

2001). Também podemos observar os níveis de ferritina, ferro sérico e transferrina elevados

(LIMA, 2001; NAOUM, P.; NAOUM, F., 2004; ZAGO, 2004) além do aumento da

bilirrubina indireta (CAO, 2010) e do urobilinogênio (LIMA, 2001; ZAGO, 2004).

Nem todo indivíduo que tem beta talassemia apresenta aumento de HbF, o que ocorre

é que na ausência de HbA, a HbF é mais significativa (LIMA, 2001). A HbF é formada por

duas cadeias alfa e duas gama, com expressão dos genes γG e γA, pertencentes à família beta

globina (figura 1.). O gene da cadeia beta globina atuam em diferentes fases do

desenvolvimento, com pouca intensidade nas primeiras semanas de vida fetal, e após esse

período a síntese de cadeia γ é substituída pela síntese de cadeia β, formando a HbA

(GALIZA; PITOMBEIRA, 2002; ZAMARO et.al., 2003), e consequentemente reduzindo a

síntese de HbF. Portanto, quando há redução ou ausência da síntese de cadeia β é possível que

a HbF continue sendo expressa (ZAMARO, et.al., 2003).

Em indivíduos homozigotos pode-se encontrar na eletroforese presença de HbF (20 a

100%), aumento de HbA2 (cerca de 1 a 6% em relação ao normal) e presença de HbA (0 a

20%) (LIMA, 2001).

22

2.4.2. Diagnóstico do indivíduo heterozigoto

Em casos clássicos, é comum encontrar nos indivíduos heterozigotos níveis de Hb

ligeiramente inferiores ao normal (10,5 a 13g/dL), microcitose e hipocromia (nível de HCM

em torno de 20 pg), ferro sérico normal, aumento da HbA2 (3,5 a 6%) e níveis de HbF

normais (até 1%) ou ligeiramente aumentados (>5%) em relação ao normal (LIMA, 2001). As

alterações eritrocíticas podem ser as mesmas encontradas na talassemia maior, porém de

forma menos intensa (LIMA, 2001; ZAGO, 2004).

2.5. TRATAMENTO

O tratamento da beta talassemia é feito de acordo com o quadro clínico que o paciente

se encontra. Porém, mais frequentemente realiza-se um regime de transfusões sanguíneas e

terapia quelante de ferro com o objetivo de aumentar a sobrevida e reduzir a morbidade do

paciente (ORIGA et al., 2009 ; SUMBOONNANONDA et.al., 2009). O medicamento mais

comumente utilizado para o tratamento destes indivíduos além da hidroxiureia é o Deferasirox

(Exjade®), que é um quelante de ferro que se mostra eficaz na remoção do ferro hepático

além de oferecer uma proteção cardíaca (GAMARRA et al., 2009; ZAGO, 2204).

2.5.1. Tratamento para beta-talassemia maior

Alguns dos tratamentos utilizados para diminuir as manifestações clinicas destes

pacientes são transfusões regulares, supressão da eritropoese e inibição da absorção

gastrointestinal de ferro, utilizando terapia quelante de ferro, entretanto, a única forma de cura

é o transplante de MO por doador HLA idêntico (CAO; GALANELLO, 2010).

23

O transplante alogênico com doador familiar HLA - idêntico proporciona uma

sobrevida superior a 85% em relação aos indivíduos não transplantados, mas em pacientes

que têm complicações mais avançadas a sobrevida pode ser menor (LO; SINGER, 2002;

ZAGO, 2004).

O tratamento transfusional deste paciente é iniciado logo que ocorre diagnóstico (nos

primeiros anos de vida), quando a hemoglobina permanecer abaixo ou entre 6,5 a 7g/dL. O

paciente deve continuar sendo examinado semanalmente, para que consiga manter o nível de

Hb em torno de 10g/dL (LO; SINGER, 2002; ZAGO, 2004). Com este tratamento, percebe-se

a diminuição das manifestações e o crescimento do indivíduo ocorre normalmente até os 10

ou 11 anos. Após esta idade a criança apresenta o risco de desenvolver complicações graves

relacionadas à sobrecarga de ferro (CAO; GALANELLO, 2010).

Se não for possível alcançar este nível de hemoglobina, significa que pode haver

hiperesplenismo e consequentemente o consumo transfusional não diminui, então considera-

se a hipótese de esplenectomia (ZAGO, 2004). A esplenectomia é uma terapia auxiliar,

realizada quando as complicações excedem os benefícios da permanência do baço no

organismo. Uma das indicações é quando há elevado consumo de sangue transfundido (LO;

SINGER, 2002)

Após 10 a 12 meses de transfusões deve-se iniciar a terapia quelante de ferro (ZAGO,

2004), sendo esta a única forma para suprimir o ferro dos pacientes talassêmicos. Atualmente

o quelante mais usado é Desferioxamine ® (DFO) (VOGIATZY et al., 2009). Também há

terapia combinada (TC), que permite a redução das doses de cada droga, e age sobre

compartimentos distintos de ferro no organismo, somando para a eficiência da quelação

(PAULA et.al., 2003).

Um estudo recente mostrou que o Deferiprone ® por ser uma pequena molécula, tem

capacidade maior de penetrar em vários tecidos aumentando a eficiência na remoção do ferro

presente no coração, melhorando assim a função cardíaca (AESSOPOS et al., 2009).

Outro tratamento utilizado é a indução da produção de HbF utilizando a hidroxiuréia,

que atua principalmente reduzindo a massa extramedular e aumentando a síntese de HbF

(CAO; GALANELLO, 2010).

24

2.5.2. Tratamento da beta-talassemia intermediária

Apesar destes pacientes serem sintomáticos, não necessitam de transfusões regulares

pois conseguem manter níveis de Hb acima de 7g/dl. Entretanto, estes indivíduos devem

receber suplementação com ácido fólico (5mg/dia), pois a carência de folato pode acentuar a

anemia. Outra causa que agrava a anemia é a esplenomegalia, neste caso, a partir da avaliação

do quadro clínico, o paciente pode ser submetido à esplenectomia (CAO; GALANELLO,

2010).

2.5.1.3. Tratamento da beta-talassemia menor

Estes indivíduos são heterozigotos e assintomáticos, não sendo necessário tratamento

habitual apesar de que pode ser observada uma leve hipocromia, microcitose e níveis de Hb

ligeiramente inferiores ao normal (ZAGO, 2004).

25

3. JUSTIFICATIVAS

Não há estudos publicados até o presente momento descrevendo a prevalência da beta

talassemia em Brasília- DF, por isso a importância desta pesquisa, sendo, portanto a primeira

a descrever esta patologia em Brasília. Pois estamos nos referindo a uma região em que o

fluxo migratório foi intenso durante alguns anos devido às circunstâncias da época da

construção de Brasília, influenciando a possível presença de hemoglobinopatias na região.

Assim, nosso objetivo foi pesquisar a presença e prevalência de beta talassemia,

inclusive traço talassêmico, na população que apresentou alteração hematológica, atendida no

laboratório do Hospital das Forças Armadas de Brasília – DF (HFA – DF). Após este estudo,

o HFA poderá ser um hospital referência para estudos de hemoglobinopatias, devido às

técnicas já utilizadas na rotina laboratorial, como a eletroforese de hemoglobinas por

capilaridade.

26

4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GERAL

Identificar a prevalência da Beta Talassemia nos pacientes que apresentaram alteração

hematologia, atendidos no laboratório de análises clínicas do Hospital das Forças Armadas

de Brasília- DF, entre o período de maio a agosto de 2010.

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Diagnosticar indivíduos com Beta Talassemia maior, intermediária e menor (traço

beta talassêmico).

- Identificar a prevalência de Beta Talassemia na população de estudo.

27

5. MATERIAS E MÉTODOS

5.1. AMOSTRAS

Após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, aprovado pelo

comitê de ética em pesquisa do HFA (Anexo A), 129 amostras e seis controles fizeram parte

do estudo, sendo estas coletadas, em tubo contendo anticoagulante EDTA, durante a rotina

laboratorial do Hospital das Forças Armadas de Brasília, entre o período de maio a agosto de

2010, não sendo identificados os pacientes, mantendo-se sigilo sobre seus dados.

A inclusão de pacientes para o grupo de estudo foi realizada por indivíduos que

apresentaram alguma alteração hematológica no hemograma ou de indivíduos que possuíam

requisição médica para realização de eletroforese de hemoglobina por capilaridade.

Os pacientes selecionados a partir do hemograma foram aqueles que apresentaram

diagnóstico de anemia e, para tal, foram analisadas as variáveis de Hb, VCM, HCM, CHCM e

alterações morfológicas das hemácias. A eletroforese de hemoglobina em pH ácido e alcalino,

foi realizada em seguida, demonstrando a mobilidade eletroforética de bandas normais e

anormais presentes no gel. Após a identificação de hemoglobinas em regiões não específicas

para HbA e HbA2 , foi realizada a eletroforese de hemoglobina por capilaridade (Figura 3.).

Os pacientes selecionados a partir da eletroforese de hemoglobina por capilaridade

foram aqueles que deram entrada no laboratório com pedido médico para a realização deste

exame. Portanto, esta seleção baseou-se na identificação e quantificação das hemoglobinas

presentes (Figura 3.).

Um grupo controle, de doadores de sangue sadios, foi utilizado como padrão para

todas as técnicas realizadas neste estudo.

28

Figura 3. Fluxograma das análises realizadas para rastreamento da beta talassemia na

população de estudo.

5.2. AVALIAÇÃO DAS AMOSTRAS DOS PACIENTES

5.2.1. Contagem automatizada e análise microscópica

As amostras de sangue periférico foram coletadas em tubos contendo anticoagulante

EDTA, seguindo para a realização do esfregaço sanguíneo utilizando 5µL de sangue e

coloração com corante Wright. Para a análise do eritrograma foi utilizado os valores de

referência padronizados pelo laboratório de acordo com a idade dos pacientes, apresentados

na tabela 2. A leitura dos índices hematimétricos foi realizada por contador eletrônico de

células (Beckman-Coulter®), sendo selecionados pacientes que apresentassem nível de

29

hemoglobina (Hb) inferior ao valor de referência, valores diminuídos de VCM, e/ou HCM

e/ou alterações morfológicas das hemácias que indicassem a existência de beta talassemia.

Tabela 2. Valores de referência do hemograma,

padronizado pelo laboratório de análises clínicas do

HFA - DF. Foi calculado uma média pra os valores de

eritrócitos, hemoglobina e hematócrito que variam de

acordo com a idade e sexo do paciente.

HEMOGRAMA Parâmetros Valores de referência Eritrócitos 4,1 – 5,1(x 106µL) Hemoglobina 11,7 a 15,7g/dL Hematócrito 35 a 47%

VCM 80 a 100fL HCM 24 a 34 pg

CHCM 31 a 37g/dL RDW 11,5 a 15,4%

5.2.2. Eletroforese de hemoglobina em pH ácido e alcalino (gel de agarose CELM-150).

Depois de realizado o hemograma e caracterizada uma anemia ou morfologia das

hemácias compatível com beta talassemia, foi realizada a seleção dos pacientes para nosso

estudo. Estas amostras foram submetidas à eletroforese de hemoglobina em pH ácido e

alcalino.

A eletroforese de hemoglobina é capaz de identificar anormalidades hemoglobínicas

qualitativas, através de suas diferentes mobilidades eletroforéticas devido ao peso molecular,

observando um aumento ou diminuição de frações e presença de frações anormais. Protocolos

– Anexo B e C.

30

5.2.3. Eletroforese de hemoglobina por capilaridade (MINICAP®)

Conforme o Colégio Americano de Patologistas (CAP) recomenda, o diagnóstico para

portadores de traço β talassêmico deve ser realizado usando a técnica de cromatografia líquida

de alta pressão (HPLC). Entretanto, foi relatada também, para diagnóstico, a técnica de

eletroforese por capilaridade, que mostrou ter um bom desempenho para este diagnóstico

(HIGGINS et. al., 2009; Yang et.al., 2009).

As amostras submetidas a este procedimento foram aquelas cadastradas no sistema do

laboratório para realização de eletroforese de hemoglobina por capilaridade, bem como as que

apresentaram alterações na eletroforese de hemoglobina em pH ácido e/ou alcalino como:

- presença de banda mais espessa de Hb A2;

- presença de HbF;

- bandas presentes no gel em região não específica para HbA e HbA2 (UNESP, 2003).

O MINICAP realiza vários testes simultaneamente e é totalmente automatizado,

possuindo, por exemplo, um bom coeficiente de variância para HbA2 (MANUAL DO

EQUIPAMENTO SEBIA, 2010; YANG et.al., 2009). Na tabela 3. mostramos outras

vantagens deste método em relação ao HPLC.

O aparelho MINICAP® realiza eletroforese de hemoglobina por capilaridade,

separando as hemoglobinas de acordo com ponto isoelétrico em um campo elétrico em meio

líquido. Por conseguinte quantifica todas as hemoglobinas presentes na amostra (MANUAL

DO EQUIPAMENTO SEBIA, 2010).

O sistema é composto por um carrossel de amostras, uma unidade de análise, um

compartimento de reagentes, uma unidade de controle e o software de processamento de

dados. As diluições das amostras são feitas pelo próprio aparelho

A unidade de análise é composta por: dois cartuchos termo condutores, uma unidade

de controle de temperatura para manter os capilares a uma temperatura estável, um sistema

31

de sensores, um sistema hidráulico que faz circular os reagentes dos capilares e uma fonte

de alta voltagem ligada a um conector de platina

Tabela 3. Comparação entre o método de HPLC e MINICAP, em relação à identificação e quantificação das hemoglobinas.

MINICAP HPLC Capacidade 34 testes por hora 10 testes por hora

Reprodutibilidade Muito boa Muito boa Tubo primário Não pode ser realizado com o sangue

total, apenas após remoção do plasma Realizado com o sangue total

Intereferência das proteínas plasmáticas

Sem interferência Possíveis interferências

Principais variantes Todas detectadas (mais de 50 variantes identificadas)

Todas detectadas (em torno de 45 identificadas)

Variantes raras Possível superposição com principais picos

Possível superposição com principais picos

Hb Bart’s e HbH Detecta e quantifica A fração glicada da HbA interfere na quantificação

Formas glicadas Não são detectadas. As frações são incluídas na hemoglobina

correspondente

Todas as frações glicadas são separadas.

Interferências das formas glicadas Sem interferência na quantificação Interferência da HbS glicada nos valores da HbA2

Quantificação dos picos Maior exatidão Valores de HbF em amostras

normais Sempre são detectados concentrações

menores que 0,5% Menor sensibilidade, devido a

forma glicada da HbA

HbA2 em amostras normais Igual Igual HbE Separada da HbA2 Não é separada da fração A2,

sendo impossível o diagnóstico de beta talassemia com presença de

HbE.

Para realização do exame o plasma é separado das hemácias, e em seguida a amostra á

colocada dentro do MINICAP. Após isso, o equipamento aspira a amostra e coloca-as em

cubetas, para que o hemolisante seja adicionado. Depois da lise das hemácias, esta é

transferida para os capilares, onde está presente o tampão de corrida (pH 9,4). A corrida de

eletroforese ocorre nesse capilar em meio líquido, e as hemoglobinas presentes na amostra são

detectadas e lidas por um programa chamado phoresis.

As hemoglobinas lidas pelo programa phoresis são apresentadas em um gráfico

(eletroferograma), representado por zonas que variam de Z1 a Z15, encontradas no eixo x do

gráfico, de acordo com a densidade óptica da hemoglobina (figura 4.). As hemoglobinas A e

A2, que são encontradas normalmente, são apresentadas sempre nas zonas Z9 e Z3 do gráfico,

respectivamente.

32

A validação do método é realizada utilizando amostras controles do próprio aparelho.

Para calibração e controle do equipamento, a amostra controle é passada no aparelho três

vezes, apresentando como referência, a densidade óptica das hemoglobinas A e A2 de 150 e

240, respectivamente. Assim, a quantificação das Hb A e A2, seguindo suas densidades

ópticas são 96,8 a 97,8% de HbA e 2,2 a 3,2% de HbA2.

Vários estudos descrevem que dosagens de HbA2 aumentadas fazem parte da triagem

para beta talassemia (LISOT; SILLA, 2004). Portanto, por ser indicativo desta patologia,

utilizamos um cutoff de 3,2%, para esta hemoglobina, conforme os valores de referência

(figura 4.).

Figura 4. Amostra controle do equipamento MINICAP. No

método de eletroforese de hemoglobina por capilaridade, as

hemoglobinas são apresentadas em zonas, que variam de Z1 a

Z15. As hemoglobinas encontradas normalmente, HbA e HbA2,

são apresentadas sempre nas zonas Z9 e Z3, respectivamente.

33

6. ASPECTOS ÉTICOS

O estudo foi realizado após aprovação do Comitê de Ética em pesquisa do Hospital

das Forças Armadas de Brasília. Nenhum material adicional foi coletado. Os procedimentos

foram realizados somente após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido pelo

paciente.

34

7. RESULTADOS

Foram incluídos neste estudo pacientes que apresentaram alteração hematológica

sugestiva de beta talassemia e pacientes que apresentaram requisição médica para realização

do exame de eletroforese de hemoglobina por capilaridade. Portanto foram 129 pacientes e

seis controles, entre o período de maio a agosto de 2010, sendo 78 mulheres e 51 homens

(tabela 4.).

Tabela 4. População de estudo avaliada a partir de dois métodos: o hemograma e a eletroforese de

hemoglobina por capilaridade, e os valores de referência do laboratório de análises clínicas do Hospital das

Forças Armadas de Brasilia- DF. As siglas “N”, “D” e “A”, significam normal, diminuído e aumentado,

respectivamente, em relação ao valor de referência.

Pacientes selecionados a partir do hemograma

Hemograma Total de pacientes 65 Sexo feminino Sexo masculino 39 26 Parâmetros Valores de referência Seleção dos pacientes Eritrócitos 4,1 – 5,1(x 106µL) N ou D Hemoglobina 11,7 a 15,7g/dL D Hematócrito 35 a 47% N ou D VCM 80 a 100fL D HCM 24 a 34 pg N ou D CHCM 31 a 37g/dL N ou D RDW 11,5 a 15,4% N ou A Análise microscópica

Alterações morfológicas das hemácias

Microcitose e/ou hipocromia ou alterações compatíveis com beta

talassemia Eletroforese de hemoglobina em pH ácido e alcalino

Mobilidade eletroforética das hemoglobinas

Bandas: HbA e HbA2 Bandas de HbA2 mais espessa, ou presença de HbF, ou bandas em

região não específicas para HbA e HbA2

Eletroforese de hemoglobina por capilaridade

Confirmação das hemoglobinas presentes pela eletroforese ácida e alcalina e quantificação de todas as hemoglobinas presentes

HbA: 96,8 a 97,8% HbA: < valor de referência

HbA2: 2,2 a 3,2% HbA2: > valor de referência

Pacientes selecionados a partir da eletroforese de hemoglobina por capilaridade Eletroforese de hemoglobina por capilaridade Total de pacientes 64 Sexo feminino Sexo masculino 39 25 Parâmetros Valores de referência Seleção dos pacientes Identificação e quantificação de

todas as hemoglobinas presentes HbA: 96,8 a 97,8% HbA: < valor de referência

HbA2: 2,2 a 3,2% HbA2: > valor de referência

35

Um exemplo de resultado de eletroforese em pH ácido e alcalino, que foi realizado

para os sessenta e cinco pacientes selecionados pelo hemograma, é demostrado pelo gel da

figura 5. Todos estes pacientes foram submetidos à eletroforese em pH ácido e alcalino,

portanto, confirmando a presença das hemoglobinas presentes.

Figura 5. Gel de eletroforese em pH ácido e alcalino, respectivamente. O controle utilizado para os dois géis

está demonstrado pela amostra número 10. O gel ácido apresenta as hemoglobinas F, A, S e Hb variante

(var.). O gel alcalino apresenta as hemoglobinas A, S e A2.

7.1. RESULTADOS DA SÉRIE VERMELHA DO HEMOGRAMA DOS PACIENTES SELECIONADOS PARA O ESTUDO A PARTIR DA ANÁLISE DO HEMOGRAMA

Sessenta e cinco pacientes foram selecionados a partir da avaliação do nível de

hemoglobina (Hb) compatível com anemia, dos valores diminuídos de VCM, e/ou HCM e/ou

alterações morfológicas das hemácias que indicassem a existência de beta talassemia.

A maioria desta população 87,69% (57/65) apresentou hemoglobina abaixo dos seus

valores de referência (gráfico 1.). A relação dos índices hematimétricos de VCM e HCM

estão expostos nos gráficos 2 e 3, indicando que o VCM da população de estudo foi menor em

relação aos valores de referência, enquanto o HCM manteve-se em seu nível normal em

grande parte da população. Dentre os 65 pacientes, ao realizarmos uma média 34,61% desta

população apresentou anemia microcítica e hipocrômica. Para o laboratório do HFA – DF a

microcitose e hipocromia são determinadas por “+”, indicando assim o grau de microcitose e

hipocromia do paciente (gráfico 4.).

36

Gráfico 1. Demonstração dos níveis de hemoglobina encontrados nos 65

pacientes. Todos os pacientes apresentaram hemoglobina abaixo do valor de

referência, utilizado pelo laboratório de análises clínicas do HFA- DF.

37

Gráfico 2. Análise do VCM na população de 65 pacientes.

Neste gráfico, os níveis de VCM estão separados em relação ao

valor de referência, ou seja, ≤ 80fL, entre 80 a 100 fL e ≥ 100fL.

Gráfico 3. Análise do HCM na população de 65 pacientes. Os níveis

de HCM estão separados conforme seus valores de referência, ou

seja, <26pg, entre 26 a 34pg e >34pg.

38

Gráfico 4. Avaliação de pacientes que apresentaram microcitose e hipocromia,

entre o total de 65 pacientes analisados pelo resultado do hemograma. Nenhum

dos pacientes apresentou alteração morfológica das hemácias.

7.2. RESULTADO DOS 129 PACIENTES ANALISADOS ATRAVÉS DA ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA POR CAPILARIDADE.

A eletroforese de hemoglobina por capilaridade foi realizada para os 65 pacientes

selecionados por apresentarem alteração hematológica observada pelo hemograma, bem como

para os 64 pacientes incluídos no estudo a partir da requisição médica para a realização da

eletroforese de hemoglobina por capilaridade, e que, portanto não apresentaram dados do

hemograma (figura 3. e tabela 4.).

Assim, o equipamento MINICAP indicou 40,31% (52/129) da população analisada

com presença de hemoglobinas anormais ou aumento de HbA2. Desta população (n=129), a

freqüência seguiu em 14,72% (19/129) para HbS, 12,40% (16/129) para HbF, 5,42% (7/129)

para HbC e 12,40% (16/129) para aumento de HbA2 (gráfico 5.).

39

Gráfico 5. Frequência de hemoglobinas encontradas na população atendida no

Hospital das Forças Armadas de Brasília, no período de maio a agosto de 2010.

Destaca-se em amarelo o aumento de HbA2, de 12,40%, sugestivo de beta talassemia.

Entre os dezesseis pacientes que apresentaram aumento de HbA2, cinco casos estão

relacionados à presença de HbAS, dois à HbSC e F, um à HbAS e F, um à aumento de HbA2

e HbF e cinco apresentaram apenas aumento de HbA2 (tabela 5.)

Três pacientes apresentaram aumento significativo de HbA2 (>4%), sugerindo serem

portadores de traço beta talassêmico, determinando uma prevalência de 2,32% (3/129) na

população de estudo (tabela 5). Podemos observar que estes pacientes eram dois homens e

uma mulher, entre estes homens, um adulto, de 49 anos e uma criança de 5 anos. Já a mulher

apresenta idade de 39 anos.

40

Tabela 5. Pacientes que apresentaram aumento de HbA2 quando realizada a eletroforese de hemoglobina

por capilaridade. São indicados, em azul, três pacientes sugestivos de serem portadores de beta talassemia.

Treze pacientes sem indicativo de beta talassemia apresentaram aumento de HbA2. Os pacientes em negrito

são os pacientes selecionados através do hemograma.

Paciente Sexo Idade HbA HbA2 HbF HbS HbC β talassemia

2 F 49 55,40% 3,30% -- 41,30% -- Não

1 M 1 96,40% 3,30% 0,40% -- -- Não

3 F 16 -- 3,50% 1,80% 50,30% 44,50% Não

4 M 19 61% 3,60% -- 35,50% -- Não

5 M 14 -- 4% 0,90% 51% 44,10% Não

6 M 22 17,60% 4,50% 5,30% 72,50% -- Não

7 M 34 55,4 3,4 -- 41,2 -- Não

8 M 48 55 3,4 -- 41,6 -- Não

9 M 7 96 3,5 0,5 -- -- Não

11 M 19 61 3,6 -- 35,5 -- Não

10 F 52 96,4 3,6 -- -- -- Não

12 F 59 97,3 3,7 -- -- -- Não

13 M 38 97,3 3,7 -- -- -- Não

14 M 5 95,6 4,4 -- -- -- Sim

15 F 39 94,5 5,2 0,3 -- -- Sim

16 M 49 94,2 5,8 -- -- -- Sim

A seguir estão expostos os eletroferogramas plotados pelo aparelho MINICAP®,

exemplificando os pacientes que apresentaram aumento de HbA2 mais significativo, acima de

4%, de acordo com Yang et. al. (2009), sugerindo traço beta talassêmico.

Figura 6. Pacientes sugestivos de traço beta talassêmico por apresentar aumento de HbA2, detectada quando realizada a

eletroforese de hemoglobina por capilaridade. As hemoglobinas presentes foram HbA HbA2 e um paciente apresentou HbF.

41

8. DISCUSSÃO

Em âmbito de diagnóstico, os métodos de escolha para o rastreamento da beta

talassemia são análise da série vermelha do hemograma e a eletroforese de hemoglobina em

pH alcalino. Sendo que, a eletroforese ácida é utilizada para confirmação ou quando há

resultados inconclusivos. Para confirmação do diagnóstico, a história clínica do paciente deve

ser avaliada e se necessário utiliza-se a quantificação de hemoglobinas através de métodos

como eluição de hemoglobina específica, HPLC e a eletroforese de hemoglobina por

capilaridade (UNESP, 2003; ZAMARO et.al., 2002; YANG et.al., 2009).

Os pacientes selecionados a partir do hemograma apresentaram com maior freqüência

níveis de hemoglobina menor do que os valores de referência e, portanto seria um dado inicial

para o rastreamento de provável beta talassemia (THEIN, 2005; SOLLAINO et al., 2009;

ZAGO, 2004).

Entretanto, para complementar o diagnóstico, além da anemia seria necessário que

esta se caracterizasse como microcítica e hipocrômica (TIWARI et.al., 2009), anisocitose,

poiquilocitose e presença de eritroblastos para ser qualificada como beta talassemia maior. Os

pacientes portadores de beta talassemia apresentam anemia com diminuição nos níveis de

VCM e HCM, e com ausência de eritroblastos (CAO, 2010). Assim, pode-se sugerir que os

pacientes apresentam características de portadores de traço beta talassêmico.

Observa-se que, 34,61% dos pacientes que apresentaram anemia caracterizaram-se

com microcitose e hipocromia. Contudo, como a microcitose e hipocromia são comumente

encontradas no hemograma de pacientes que possuem carência de ferro e em pacientes beta

talassêmicos (HAZIROLAN et.al., 2009; TIWARI et.al., 2009), não podemos concluir que

estes pacientes sejam portadores de beta talassemia, com base apenas neste dado.

A distinção entre anemia ferropriva e a beta talassemia é realizada através das

dosagens de ferro, ferritina e transferrina (TIWARI et.al., 2009). No entanto, não foi possível

42

realizar a verificação destas dosagens, pois muitos pacientes não tinham amostras colhidas em

tubo sem anticoagulante.

Com isso, para todas as amostras que apresentaram índices sugestivos de anemia

realizamos a eletroforese de hemoglobina em pH ácido e alcalino, de forma paralela,

identificando as hemoglobinas presentes. O gel apresentado pela figura 5. mostra por

exemplo, que a amostra 80 apresentou presença de Hb variante que indica, quando em pH

ácido, uma possível HbC ou HbA2, porém quando realizada a eletroforese em pH alcalino,

confirmou-se a presença de HbA2 nesta amostra. A amostra número 10 foi utilizada como

nosso controle na eletroforese de pH alcalino e ácido, por apresentar apenas HbA e HbA2.

A quantificação de todas as hemoglobinas encontradas, dos 129 pacientes analisados

no estudo, foi realizada através da eletroforese de hemoglobina por capilaridade. As técnicas

de eletroforese têm grande importância para o nosso estudo devido à quantificação das

hemoglobinas, principalmente em relação à detecção e quantificação de HbF e de HbA2, que

são sugestivas de beta talassemia (CAO; GALANELLO, 2010; LISOT; SILLA, 2004; YANG

et.al., 2009). De acordo com Cao e Galanello (2010), portadores de beta talassemia

apresentam níveis de HbA2 >3,5% , HbF 0,5 a 4% e HbA 92 a 95%. Enquanto Yang e

colaboradores (2010) e Omar e colaboradores (2010) descrevem que o diagnóstico de traço

beta talassêmico é determinado pelo aumento de HbA2 >4%, independente dos dados do

hemograma do paciente.

Deste modo, após a análise da quantificação das hemoglobinas 40,31% (52/129) da

população apresentou hemoglobinas anormais ou aumento da HbA2. Em relação ao aumento

de HbA2, a frequência apresentada pela população foi de 12,40% (16/129) (Gráfico 5.).

O aumento de HbA2, mostrou-se associado também com outras hemoglobinas, como

Hb S, C e F. Embora nestes casos não possamos sugerir um diagnóstico de beta talassemia, já

que o aumento de HbA2 também ocorre devido à presença de HbS, sabe-se que a anemia

falciforme pode existir junto com a beta talassemia, contribuindo para o aumento da HbA2

destes pacientes (YANG et.al., 2009).

Considerando que, o diagnóstico de traço beta talassêmico pode ser baseado apenas no

aumento de HbA2 >4% (OMAR et.al., 2010; YANG. et.al., 2009; LISTOT; SILLA, 2004), a

prevalência de traço beta talassêmico foi de 2,32% (3/129) para pacientes que apresentaram

43

alguma alteração hematológica ou como nesses três casos possuíam apenas a requisição

médica para a realização da eletroforese de hemoglobina por capilaridade. Ou seja, três

pacientes são sugestivos de serem portadores de traço beta talassêmico (tabela 5).

Entre os três pacientes, dois apresentaram aumento de 1,2% e de 2,6% de HbA2, em

relação ao seu cutoff de 3,2%. Enquanto, o outro paciente apresentou 0,5% de HbF na zona 7,

juntamente com 2% de HbA2 acima de seu cutoff de 3,2% (figura 6.). Este dado corrobora

para os casos em que Thein (2005) e Mosca et.al. (2009) citam que a HbF pode ser encontrada

na beta talassemia homozigótica e heterozigótica, porém com aumento variável. Nos casos de

heterozigose, como o traço beta talassêmico, a HbF pode estar presente de forma ligeiramente

aumentada (CAO; GALANELLO, 2010; MOSCA et.al., 2009; ZAMARO et.al., 2003).

Assim, a prevalência encontrada como sugestiva de traço beta talassêmico nesta

população, é um fator importante por dois motivos: para evidenciar que não há grande

transferência de genes alterados para beta talassemia na população estudada, e que mesmo

essa prevalência sendo pequena, pode revelar uma provável descendência de povos italianos,

africanos, do sudeste da Ásia ou do Mediterrêneo, de onde mais se têm prevalência de beta

talassemia no mundo (ESTEVÃO, 2009; MELO et.al., 2008; SOUZA, 2006).

Outro fator importante ao encontrar este resultado para esta população, é que estes

pacientes bem como suas famílias devem ter um acompanhamento médico, a fim de ter um

aconselhamento genético correto. Pois, um dos pacientes sugestivo de portar traço beta

talassêmico tem apenas cinco anos de idade, portanto é importante que se faça o diagnóstico

dos pais para prevenção de transferência deste gene para outro filho. Até mesmo para que

futuramente este paciente seja consciente que é portador de um gene beta talassêmico e saiba

quais são as possíveis complicações se combinado a outro gene alterado, ou mesmo quais são

as possibilidades de transferir este gene para um filho.

No Brasil esta prevalência é variável, devido à variabilidade étnica da população

(DUCATTI et.al., 2001; ESTEVÃO, 2009; MELO et. al., 2008; SOUZA, 2006), sendo

encontrada mais frequentemente nas regiões do Sul e Sudeste, devido à imigração italiana

(SOUZA, 2006). Este fato explica a diferença dos resultados em vários estudos brasileiros

(DUCATTI et.al., 2001).

44

Um estudo realizado por Lisot e Silla (2004) com 9.000 doadores de sangue no Rio

Grande do Sul, apresentou 12% da população com alguma hemoglobinopatia, sendo 9,87%

portadores de beta talassemia. Melo et.al. (2000) determinaram em uma população de 23.981

doadores de sangue em Minas Gerais, 820 pacientes com hemoglobinopatias, sendo 0,13%

portadores de beta talassemia menor. Orlando e colaboradores. (2000) em São José do Rio

Preto – SP demonstraram em 265 amostras de doadores de sangue, 13 pacientes com

hemoglobinopatias, sendo 0,38% indivíduos portadores de beta talassemia. Já Ducatti e

colaboradores (2001) em uma pesquisa realizada em cordão umbilical de 913 recém-nascidos

(RN) em São José do Rio Preto – SP encontraram 100 RN portadores de alguma

hemoglobinopatia, sendo 23 portadores de beta talassemia.

Assim, quando comparado com outros estudos, podemos concluir que nossa pesquisa,

embora realizada com um pequeno universo amostral, reforça que há no Brasil uma

prevalência variável de beta talassemia, assim como de outras hemoglobinopatias. Entretanto,

novos estudos englobando uma população maior precisam ser realizados.

45

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53

ANEXOS

ANEXO A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Eu, __________________________________________________________________ ( )(Concordo) ( )(Discordo) que o material coletado para realização dos exames constantes nesta guia, assim como os resultados destas análises, os quais estarão armazenados nas bases de dados do LAC, sejam utilizados na composição de pesquisas e outros trabalhos executados pelo laboratório com finalidades acadêmicas e científicas, inclusive para publicação, desde que seja preservado o sigilo da minha identidade.

54

ANEXO B - ELETROFORESE DE Hb EM pH ALCALINO (Protocolos de Metodologias Clássicas para o Diagnóstico de Hemoglobinopatias- UNESP, 2003, modificado).

Amostra: sangue total com EDTA

Material necessário:

Filme de agarose para separação eletroforética das Hb em pH alcalino (Hb alcalina)

Seringa micro-volume para pipetar amostras para o filme de agarose.

Tampão alcalino TRIS pH 9,5 ±0,2 CELMGEL

Hemolisante (do Kit)

Corante Ponceau S (5,0 g CELM + 50,0 g de ácido tricloroacético)

Descorante para eletroforese de Hb (100mL ácido acético glacial + 50 mL metanol

P.A, completando com água até 1000 mL)

Placas de Petri

Secador

Aparelho CELM FEA – 250

Procedimento

Preparação do hemolisado

Centrifugar parte do sangue total com EDTA e desprezar o plasma.

Lavar hemácias com solução salina 0,9% ( para cada 100µL de hemácias acrescentar

200µL de solução fisiológica) até obter sobrenadante límpido.

Misturar partes iguais das hemácias e hemolisante (para 100µL de hemácias 100µL de

hemolisante), em um tubo de ensaio.

Agitar vigorosamente em vortex por aproximadamente 30 segundos.

Determinar a concentração de hemoglobina no equipamento de hemograma e ajustar a

concentração de Hb em aproximadamente 1g/dL, diluindo com água destilada ou deionizada

até atingir concentração desejada.

O hemolisado obtido é estável por 24 horas quando armazenado entre 2 e 8º C.

Eletroforese

Com seringa de micro-volume, pipetar 1,0 µL de cada hemolisado em uma cavidade

numerada no gel alcalino.

Ligar o aparelho CELM FEA – 250 e ajustar para 30 minutos e 150 volts.

55

Colocar o gel alcalino no porta filme, coincidindo os pólos positivos e negativos do

filme e da cuba.

Colocar 80 mL de tampão alcalino gelado (2 a 8ºC), na cuba para cobrir o eletroldo

metálico.

Colocar o porta filme com o gel alcalino dentro da cuba ligá-la.

Após os 30 minutos deve-se desligar e retirar o porta-filme da cuba e deixar escorrer o

excesso de tampão em papel toalha.

Retirar o gel alcalino e colocá-lo a 60ºC (secador) até secar completamente, por

aproximadamente 15 minutos.

Mergulhar o gel em placa Petri, contendo o corante Ponceau S, por 10 minutos, sem

agitação.

Retira-lo do corante Ponceau e colocá-lo em outra placa contendo o descorante (ácido

acético / metanol), por 10 minutos.

Repetir o procedimento acima com descorante limpo por 10 minutos.

Completar a descoloração deixando o gel alcalino mergulhado por 10 minutos ou até

sua total descoloração em ácido acético 5,0%.

Secar completamente o gel alcalino à 60ºC (secador).

56

ANEXO C - ELETROFORESE DE Hb EM pH ÁCIDO (Protocolos de Metodologias Clássicas para o Diagnóstico de Hemoglobinopatias- UNESP, 2003, modificado).

Amostra: sangue total com EDTA

Material necessário:

Filme de agarose para diferenciação da Hb S, C e F(Hb ácida)

Seringa micro-volume para pipetar amostras para o filme de agarose

Tampão citrato pH 6,3 ± 0,2 CELMGEL

Hemolisante (do Kit)

Corante Amido-Black (Negro amido 0,1% em ácido acético a 5%)

Descorante para eletroforese de Hb (ácido acético a 5%)

Placas de Petri

Secador

Aparelho CELM FEA – 250

Procedimento

Preparação do hemolisado

Centrifugar parte do sangue total com EDTA e desprezar o plasma.

Lavar hemácias com solução salina 0,9% (para cada 100µL de hemácias acrescentar

200 µL de solução fisiológica) até obter sobrenadante límpido.

Misturar partes iguais das hemácias e hemolisante (para 100µL de hemácias 100µL de

hemolisante), em um tubo de ensaio.

Agitar vigorosamente em um vórtex por aproximadamente 30 segundos.

Determinar a concentração de hemoglobina no esquipamento de hemograma e ajustar

a concentração de Hb em aproximadamente 1g/dL, diluindo com água destilada ou deionizada

até atingir concentração desejada.

O hemolisado obtido é estável por 24 horas quando armazenado entre 2 e 8º C.

Eletroforese

Com seringa de micro-volume, pipetar 0,5µL de cada hemolisado em uma cavidade

numerada no gel ácido. Aguardar alguns segundos para que o hemolisado penetre no gel e

aplicar mais 0,5µL do hemolisado.

57

Ligar o aparelho CELM FEA – 250 e ajustar para 55 minutos e 50 volts.

Colocar o gel ácido no porta-filme, coincidindo o pólo positivo da cuba com o pólo

negativo do gel ácido.

Colocar 90 mL de tampão citrato pH 6,3 ± 0,2 gelado (2 a 8ºC), na cuba para cobrir o

eletroldo metálico.

Colocar o porta filme com o gel alcalino dentro da cuba ligá-la.

Após os 55 minutos deve-se desligar e retirar o porta-filme da cuba e deixar escorrer o

excesso de tampão em papel toalha.

Retirar o gel ácido e colocá-lo em uma placa de Petri com o corante Amido-Black por

5 minutos, sem agitação.

Retira-lo do corante Amido – Black e colocá-lo em outra placa contendo o descorante

(ácido acético 5%), por 5 minutos.

Retirar o excesso de descorante do gel e colocá-lo à 60º (secador) até secá-lo

completamente, por aproximadamente 15 minutos.

Completar descoloração deixando o gel ácido mergulhado em ácido acético 5% até

que o fundo fique transparente, se necessário trocar o descorante.

Colocar o gel ácido em uma placa de Petri com água destilada por 2 minutos.

Secar completamente o gell ácido a 60ºC (secador).