AVALIAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS E CITOTÓXICAS

DE MEMBRANAS DE GELATINA/QUITOSANA COM HIDROXIAPATITA OBTIDAS

POR PRECIPITAÇÃO IN SITU

Rigo, E.C.S., Habitzreuter, F.

nanoBIODEV, Nanotechnology, Biomaterials and Devices Group,

Departamento de Ciências Básicas, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de

Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, BRASIL

filipeh@usp.br

RESUMO

Membranas de gelatina (G) e quitosana (QS) são utilizadas em Regeneração

Tecidual Guiada (RTG) devido às suas propriedades de biodegradabilidade e

elevada adesão celular. A incorporação de hidroxiapatita (HA) induz a osteogênese,

além de conferir resistência mecânica aos compósitos formados. As membranas

foram produzidas por precipitação in situ da HA em uma solução contendo gelatina,

seguido de adição de solução de QS e foram reticuladas com tripolifosfato de sódio

(TPP) e glutaraldeído (GTA). Os compósitos foram caracterizados por

espectroscopia no infravermelho (IV), difração de raios X (DRX), ensaios de

intumescimento e de citotoxicidade. Os espectros de IV indicam concordância entre

as membranas e nos DRX identificaram-se picos de HA e -TCP. A reticulação com

GTA conferiu maior resistência ao meio aquoso, porém diminuiu a viabilidade

celular. Portanto, a precipitação in situ foi eficiente para formação das membranas e,

quando reticuladas com TPP, apresentaram resultados satisfatórios de viabilidade

celular, possibilitando seu uso em RTG.

Palavras-chave: Quitosana, Gelatina, Hidroxiapatita, precipitação in situ,

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INTRODUÇÃO As doenças periodontais, juntamente com as cáries, são o tipo mais comum de

doenças infecciosas da região bucal e a principal causa da perda dentária em

humanos, afetando cerca de 5 a 20% da população mundial(1,2) e cerca de 80% de

cães(3). O tratamento da doença periodontal é realizado por duas principais técnicas:

enxertos ósseos e regeneração tecidual guiada (RTG). O conceito de

compartimentalização dos tecidos periodontais (sua divisão em gengiva, cemento,

osso alveolar e ligamento periodontal) permitiu o desenvolvimento da técnica de

RTG com uso de barreiras físicas em forma de membrana(4). Esta técnica associada

a tratamentos endodônticos obtém sucesso superior a 90% na recuperação da

doença periodontal(5) e em casos de perda dentária, o uso de RTG aumenta o

sucesso de implantação em cerca de 90 a 100% dos casos(6).

Barreiras à base de materiais não-absorvíveis permanecem no local do

implante sem reações negativas (como rejeição) pelo tecido ósseo hospedeiro.

Dentre os materiais que possuem essa característica pode-se incluir o

politetrafluoretileno (PTFE)(7) e malhas de titânio(8). No entanto, estes materiais não-

absorvíveis apresentam desvantagens, como memória (tendem a retornar à

conformação inicial, dificultando sua adaptação aos defeitos ósseos), alto custo

financeiro e possibilidade de exposição da região tratada aos tecidos adjacentes,

muitas vezes causando infecções no local(9). Além disso, é necessário um segundo

ato cirúrgico para a remoção das membranas após o tratamento(10).

As membranas absorvíveis, por outro lado, devem propiciar a regeneração

óssea à medida que são reabsorvidas, e tanto o material como seus produtos de

degradação devem ser tolerados adequadamente pelo organismo. Esta

característica elimina a necessidade de uma segunda intervenção cirúrgica(11). Estas

membranas são normalmente formadas por polímeros, como por exemplo,

colágeno, gelatina, ácidos polilático e poliglicólico e quitina/quitosana. As vantagens

no uso desses polímeros incluem a facilidade de manipulação e manutenção pós-

operatória, no entanto, também apresentam desvantagens como reabsorção rápida,

reações alérgicas e colapso em defeitos intra-ósseos. Além disso, a adição de

fosfatos de cálcio em tais membranas ajuda a promover regeneração óssea.(10).

A utilização de gelatina (G) e quitosana (QS) como biomateriais é bastante

encorajada, pois além de serem materiais baratos e abundantes, apresentam

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elevada biocompatibilidade(12). Biomateriais à base de quitosana causam pouca ou

nenhuma reação de encapsulação fibrosa (como ocorre com materiais metálicos)

(13), pois a quitosana é responsável pelas interações com glicosaminoglicanos

(GAGs) (componentes fundamentais das matrizes extracelulares(14). Esta interação é

de grande importância, pois diversos fatores de crescimento celular estão

relacionados com os GAGs. A gelatina apresenta as mesmas propriedades(15, 16).

As blendas de G/QS apresentam melhor flexibilidade e melhor capacidade de

absorção de água em comparação com os hidrogéis formados somente por

gelatina(17). Além disso, em contato com soluções de tampão fosfato e enzimas

estes hidrogéis apresentaram elevada biodegradabilidade, e as blendas de G/QS

apresentam máxima resistência mecânica quando úmidas na proporção de 50:50

em massa(18), além de ser ideal para crescimento celular(19). Diversos trabalhos na

literatura utilizam blendas de G/QS para uso como biomateriais(15, 20).

A hidroxiapatita (HA) também é amplamente utilizada como biomaterial, sendo

aplicada para tratamento de defeitos ósseos tanto como implantes diretos ou como

recobrimento de outros materiais cerâmicos e até metálicos(21). Além disso, a HA

possui uma grande similaridade com as apatitas biológicas com relação à sua

estequiometria e cristalinidade tornando-a um material osteocondutor(22). A

precipitação da HA diretamente no meio polimérico é encorajada, pois forma

materiais mais homogêneos, diminuindo riscos de inflamação e rejeição pós-

implante(23). Assim, a formação de materiais à base de G/QS/HA é importante para

aplicação em RTG, tendo em vista as propriedades biológicas dos polímeros

associado à capacidade de osteocondução da hidroxiapatita.

MATERIAIS E MÉTODOS

A gelatina, do tipo suína, foi obtida comercialmente da Gelnex Indústria e

Comércio, bloom de 270 e granulometria de 40 Mesh. A quitosana, extraída do

caranguejo (mínimo de 85% de quitina desacetilada), foi adquirida da Polymar

Ciência e Nutrição.

Preparo das membranas de G/QS

Inicialmente, a gelatina foi solubilizada em água destilada a 40ºC, com

quantidade de gelatina suficiente para formação de uma solução 4% (m/v). Em

seguida, uma solução aquosa previamente filtrada de QS com ácido acético (1% v/v)

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e 2% (m/m) de QS foi adicionada à gelatina. Por fim, foram adicionados 0,5% v/v de

glicerina à mistura de G/QS, como plastificante.

Para a formação das membranas, foram vertidas alíquotas de 25 mL da

mistura em placas de Petri, que por sua vez foram secas em estufa de recirculação

de ar a 30ºC por 48h.

Preparo das membranas de G/QS/HA

Após a solubilização da gelatina (4% m/v) a 40ºC, foram adicionados os

precursores da HA (Ca(OH)2 e H3PO4). O Ca(OH)2 foi adicionado diretamente à

gelatina e uma solução de H3PO4 foi gotejada lentamente à mistura. As quantidades

de Ca(OH)2 e H3PO4 foram equivalentes para formação de uma mistura com 0,3 M

de HA. Após a adição, a mistura foi envelhecida por 6h sob agitação constante e a

40ºC. Após este período, a quitosana foi adicionada conforme o método de preparo

descrito na seção anterior. Por último, foram adicionados 0,5% (v/v) de glicerina.

Todas as amostras passaram por uma etapa de neutralização através da

imersão em solução 0,1M de NaOH em etanol por 30min, lavadas com etanol e

secas à temperatura ambiente.

Ensaio de intumescimento

O ensaio de intumescimento tem por objetivo analisar o comportamento das

membranas em meio aquoso, verificando o grau de intumescimento através da sua

imersão em uma solução de PBS (Phosphate Buffer Saline). O grau de

intumescimento é obtido de acordo com a Equação (A)(24):

)(100s

su

M

MMGI

Equação (A)

Onde GI é o grau de intumescimento, Mu e Ms correspondem à massa em

gramas das membranas úmidas e das membranas secas, respectivamente.

As membranas foram imersas em PBS e colocadas em estufa incubadora a

37ºC. As massas foram medidas antes da imersão e em períodos de tempo

subsequentes. Os dados foram tratados com o software Microcal Origin 9.

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Reticulação As membranas foram reticuladas por tripolifosfato de sódio (TPP) e

glutaraldeído (GTA), de acordo com metodologia adotada por Oliveira(25). Os

processos de reticulação ocorreram de duas formas: por imersão e a vapor. No

método de imersão, as membranas foram colocadas em placas de Petri e imersas

em soluções aquosas de TPP ou GTA, na concentração de 1% v/v em água por 30

min e em seguida foram secas em temperatura ambiente.

O processo a vapor foi realizado somente utilizando GTA. Uma solução aquosa

de GTA com 10% v/v foi colocada em uma placa de Petri no fundo de um

dessecador. Sobre a placa porosa do dessecador, foram colocadas as membranas

em placas de Petri. Em seguida, com auxílio de uma bomba de vácuo, o ar foi

retirado, permitindo a evaporação do glutaraldeído, promovendo a reação de

reticulação. As amostras foram deixadas por 5 dias no dessecador e em seguida

secas em temperatura ambiente.

A Tabela 1 indica as nomenclaturas adotadas para cada membrana obtida:

Tabela 1. Nomenclaturas para as membranas confeccionadas

GQS Gelatina / Quitosana 50:50 v/v

GQSHA Gelatina / Quitosana 50:50 v/v / HA

GQSHA GTA1% Reticulada por imersão em solução 1% de GTA

GQSHA TPP1% Reticulada por imersão em solução 1% de TPP

GQSHA GTA10% Reticulada por vapor de solução 10% de GTA

Caracterizações

As membranas secas foram caracterizadas por ensaios físico-químicos e in

vitro. As caracterizações físico-químicas foram realizadas utilizando espectroscopia

no infravermelho com transformada de Fourier (IV) em um espectrômetro Spectrum

One da Perkin Elmer através da técnica de Reflectância Total Atenuada, localizado

no Laboratório de Tecnologia de Alimentos (LTA/ZEA). Para cada membrana foram

realizadas 32 varreduras entre 4000 a 650 cm-1. Além disso, duas amostras de HA

foram analisadas: uma proveniente da calcinação a 600ºC da membrana GQSHA,

nomeada HAmemb e outra precipitada em laboratório a partir do gotejamento de

solução aquosa de H3PO4 em suspensão de Ca(OH)2 (HAprec)(26). Essas amostras

foram analisadas com pastilha de KBr com 32 varreduras de 4000 a 450 cm-1 a fim

de identificar presença de HA no compósito, e comparado com o IV de HA obtida em

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laboratório. Também foram realizadas análises de difração de raios X (DRX) das

membranas com e sem HA, bem como da amostra HAmemb em um difratômetro

Miniflex 600 da Rigaku com ângulos (2) de 10º a 60º e velocidade de varredura de

1º/min localizado no Laboratório Multiusuário de Caracterização de Materiais

(MultMat/ZEB). Além dos ensaios físico-químicos as membranas foram analisadas

pelo ensaio de intumescimento e a citotoxicidade foi avaliada mediante ensaio de

viabilidade celular in vitro através da técnica de incorporação de Vermelho Neutro,

baseado na norma ISO 10993-5 de 2009.

RESULTADOS E DISCUSSÃO A Figura 1 apresenta os espectros de infravermelho das amostras obtidas.

Notam-se bandas características da gelatina, como amida I na região de 1640 cm-1 e

amida II em 1560 cm-1. Também estão presentes bandas referentes à QS, como

bandas das ligações C-O que formam os grupos sacarídeos na região de 1030 e

1080 cm-1. Além disso, estiramento –OH é encontrado na região de 3300 cm-1 e os

estiramentos das ligações –CH2 e –CH3 na região de 2910 e 2865 cm-1.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

Tra

nsm

itân

cia

Número de Onda (cm-1)

GQS

GQSHA

GQSHA GTA1%

GQSHA TPP1%

GQSHA GTA10%

Figura 1. Espectros de Infravermelho das amostras obtidas.

As bandas intensas na região de 1020 cm-1 para as amostras reticuladas com

GTA indicam presença de grupos carbonila (C=O), confirmando presença de GTA

não reagido. A formação de ligações imina (C=N), características da reação com

GTA encontra-se na região de 1640 cm-1 e coincide com as bandas da amida I. Além

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das bandas mencionadas, temos também bandas de fosfato na região de 1060 cm-1

e carbonato em 880 cm-1 na amostra GQSHA TPP1%(20,27).

Com intuito de distinguir a presença de bandas mais características de grupos

fosfato da hidroxiapatita, a amostra GQSHA foi calcinada a 600ºC e o pó resultante

foi comparado com HA obtida em laboratório através do mesmo método.

Na Figura 2, são apresentados os resultados de infravermelho destas

amostras, e notamos presença de grupos fosfato em 1040, 600 e 560 cm-1 e

estiramento da hidroxila em 3400 cm-1(30).

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Número de onda (cm-1)

HAmemb

HAprec

Tra

nsm

itância

Figura 2. Comparação dos espectros de IV das hidroxiapatitas.

Além disso, foram identificadas bandas referentes à grupos carbonato, como

em 1640 e 1420 cm-1, e 870 cm-1 para a amostra precipitada. Assim, confirmamos

presença de HA carbonatada nas membranas confeccionadas pelo método de

precipitação in situ. Esses resultados estão de acordo com encontrados na

literatura(21,22,26,28).

Outra análise importante para identificar a presença de hidroxiapatita nas

amostras é a técnica de difração de raios X. Esta análise permite identificar fases

cristalinas das amostras, e na Figura 3 são comparados difratogramas das amostras

GQS, GQSHA e HAmemb. A região em torno de 22º é referente à quitosana para as

amostras GQS e GQSHA. Os picos em 26º (deslocado para 25,5º na amostra com

polímero), 32º, 34º e 39,7º (deslocado para 39,1º na amostra com polímero) são

referentes à fase HA e em 27,9º, 31º e 32,8º referentes à fase β-TCP. Esses

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resultados estão de acordo com as fichas 9-432 e 9-169 do JCPDS e dados da

literatura(26, 28).

15 20 25 30 35 40

2

GQS

GQSHA

HAmemb

HA

-TCP

Figura 3. Difração de raios X das membranas e de HA obtida por precipitação.

Em seguida, foram realizados ensaios de intumescimento das amostras em

tampão fosfato (PBS) (Figura 4). As amostras GQS e GQSHA ficaram quebradiças,

respectivamente, após 2h e 45min em contato com a solução. A presença de HA

diminui o grau de intumescimento, e também diminui o tempo em que ela resiste ao

meio aquoso.

15min 30min 45min 1h 2h 1d 2d

20

30

40

50

60

70

80

90

% Intu

mescim

ento

Tempo

GQS

GQSHA

GQSHA GTA1%

GQSHA TPP1%

GQSHA GTA10%

Figura 4. Ensaios de intumescimento.

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A amostra GQSHA GTA1% quebrou após um dia, visto que o processo de

reticulação por imersão com GTA a tornou bastante quebradiça. Além disso, ela teve

um intumescimento próximo à amostra GQSHA TPP1%. Por outro lado, a amostra

GQSHA GTA10% apresentou baixo intumescimento, indicando que o processo de

reticulação foi mais completo, diminuindo a movimentação das cadeias poliméricas,

levando a menor absorção de água.

0 20 40 60 80 100

0

20

40

60

80

100

Via

bili

dade C

elu

lar

(%)

Concentração do extrato (%)

CN (Al2O3)

CP (Fenol 0,2%)

GQS

GQSHA

GQSHA 1%GTA

GQSHA 1% TPP

GQSHA 10%GTA

Figura 5. Ensaios de viabilidade celular das amostras.

Os resultados dos ensaios de viabilidade celular in vitro estão expressos na

Figura 5. Nota-se que as amostras GQS e GQSHA TPP1% apresentam boa

viabilidade celular (acompanhando o controle negativo, Al2O3), enquanto que as

amostras GQSHA e GQSHA GTA1% mostraram citotoxicidade em concentrações de

extrato a partir de 100% e 25% respectivamente. Por fim, a amostra GQSHA

GTA10% mostrou-se menos citotóxica em comparação ao processo de reticulação

por imersão com GTA, mas ainda assim apresentou resultados de viabilidade celular

abaixo do esperado, com viabilidade celular abaixo de 50% para concentração de

100% de extrato.

CONCLUSÕES

O método de precipitação in situ proposto foi eficaz para preparação de

membranas de gelatina/quitosana e hidroxiapatita. Através dos ensaios de

intumescimento, fica evidente que o processo de reticulação com glutaraldeído

diminui a capacidade de absorção de água das membranas, entretanto os ensaios

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de citotoxicidade mostram que as membranas reticuladas com TPP obtiveram

melhor viabilidade celular, tornando-as mais atraentes para uso em RTG. A

reticulação em vapor de GTA aumenta a biocompatibilidade das membranas e deve

ser mais investigada.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos ao CNPq pelo apoio financeiro.

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EVALUATION OF THE PHYSICAL-CHEMICAL AND CYTOTOXIC

CHARACTERISTICS OF GELATIN/CHITOSAN MEMBRANES WITH

HYDROHYAPATITE OBTAINED BY IN SITU PRECIPITATION

ABSTRACT

Gelatin (G) and chitosan (QS) membranes are used with Guided Tissue

Regeneration (RTG) due to its biodegradability and high cell adhesion. The

incorporation of hydroxyapatite (HA) induces osteogenesis and grants mechanical

resistance to the formed composites. The membranes were produced by in situ

precipitation of HA in a solution containing gelatin, followed by QS addition.

Crosslinking with sodium tripolyphosphate (TPP) and glutaraldehyde (GTA) were

carried out. The composites were characterized by infrared spectroscopy (IV), X-ray

diffraction (DRX), swelling and cytotoxicity assays. The IV spectra indicate

agreement among the membranes, and through DRX HA and -TCP peaks were

identified. The crosslinking with GTA bestowed higher resistance to aqueous

medium, but it lowered the cell viability. Therefore, the in situ precipitation method

was effective to form the membranes, and after crosslinking with TPP, they showed

good results concerning cell viability, indicating that these membranes are promising

to be used with RTG.

Keywords: Gelatin, Chitosan, Hydroxyapatite, in situ precipitation

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