avaliação de diferentes tipos de fases estacionárias para ...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

LAURA MARIA FONTES PRADO

AVALIAÇÃO DE DIFERENTES TIPOS DE

FASES ESTACIONÁRIAS PARA SEPARAÇÕES

RÁPIDAS EM CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

UTILIZANDO ANTIDIABÉTICOS ORAIS COMO

MODELO

Belo Horizonte - MG 2013

LAURA MARIA FONTES PRADO

AVALIAÇÃO DE DIFERENTES TIPOS DE FASES

ESTACIONÁRIAS PARA SEPARAÇÕES RÁPIDAS EM

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA UTILIZANDO

ANTIDIABÉTICOS ORAIS COMO MODELO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade

de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais,

como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre

em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Gerson Antônio Pianetti - UFMG

Co-orientador: Prof. Dr. Christian Fernandes - UFMG

Belo Horizonte - MG 2013

Prado, Laura Maria Fontes.

P896a

Avaliação de diferentes tipos de fases estacionárias para separações

rápidas em cromatografia líquida utilizando antidiabéticos orais como

modelo / Laura Maria Fontes Prado. – 2013.

188 f. : il.

Orientador: Dr. Gerson Antônio Pianetti. Co-orientador: Dr. Christian Fernandes. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Minas Gerais,

Faculdade de Farmácia, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.

1. Cromatografia líquida de alta eficiência - Teses. 2. Medicamentos – Teses. 3. Validação de método – Teses. I. Pianetti, Gerson Antônio. II. Fernandes, Christian. III. Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmácia. IV.Título.

CDD: 615.4

Dedico este trabalho aos meus pais, Guilherme e Dôra, pelo amor e dedicação

incondicionais à ciência. Obrigada por me apresentarem à pesquisa científica e por

serem exemplos de pesquisadores!

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Gerson Antônio Pianetti, por fornecer todas as condições necessárias

para o desenvolvimento dessa dissertação e por confiar no meu trabalho.

Ao professor Dr. Christian Fernandes, pela co-orientação, dedicação, contribuições

técnicas e pelas valiosas discussões.

Ao Ricardo, pela ajuda na operação do UHPLC, pela amizade e disponibilidade em

ajudar durante toda a execução desse trabalho.

Aos amigos do LCQ, Betânia, Fernando, Geovani, Iara, Isabela, Juliana, Léo,

Luciano, Mariana, Paula Enéas, Paula Chelini, Ricardo, Taízia, Tiago e Vinícius,

pelos ensinamentos e amizade.

Aos professores e funcionários da Faculdade de Farmácia da UFMG, em especial

ao Eduardo, pela agradável convivência.

À CIFARMA e à FUNED pelo fornecimento das matérias primas utilizadas.

À minha mãe, minha orientadora desde sempre! Pela preocupação e incentivo

durante toda a minha formação acadêmica. Em especial pela colaboração na

correção desse trabalho, pelas intermináveis discussões e pelo entusiasmo

contagiante, capaz de transformar a correção de uma simples frase em algo

extremamente recompensante.

Ao meu pai, pelo apoio, incentivo e terno cuidado dispensados a mim.

Aos meus irmãos, Renata, Lívia, Paula, Fábio e Andréia, pelo companheirismo e

por, literalmente, “encherem” a minha vida.

Aos meus sobrinhos (Lalá e Biel), avós, tios, primos, cunhados e eternas amigas do

CP e da faculdade, pelos momentos de descontração compartilhados.

Ao Guilherme, que sonha comigo os meus sonhos, que me permite sonhar os seus

e, assim, juntos, sonhamos os nossos! Pela dedicação, carinho, companheirismo e

por encher a minha vida de amor e alegrias.

À Deus, pela oportunidade de concluir mais uma etapa de minha formação.

“Gostaria de te desejar tantas coisas.

Mas nada seria suficiente.

Então, desejo apenas que você tenha muitos desejos.

Desejos grandes.

E que eles possam te mover a cada minuto.”

(Carlos Drummond de Andrade)

“Ambição é o caminho para o sucesso. Persistência é o veículo no qual se chega lá”.

(Bill Eardley)

http://pensador.uol.com.br/autor/carlos_drummond_de_andrade/

RESUMO

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) convencional, que emprega fase estacionária com

partículas totalmente porosas de diâmetro entre 3-5 µm (CV), apresenta limitações no que concerne à

possibilidade de gerar análises rápidas mantendo elevada eficiência cromatográfica. Diante da

demanda por métodos rápidos e eficientes, diferentes fases estacionárias foram desenvolvidas: fases

com partículas de núcleo fundido (NF), com partículas totalmente porosas com diâmetro inferior a

2 µm (Sub 2 μm) e monolíticas (MN). Como ainda há poucos estudos que aplicam e comparam essas

novas fases, o objetivo do presente trabalho foi comparar esses novos materiais, utilizando como

modelo métodos analíticos para determinação de antidiabéticos orais (clorpropamida, glibenclamida,

glimepirida e gliclazida). Inicialmente foi desenvolvido e otimizado método em coluna CV C18 100 x

2,1 mm, 5 μm, acetonitrila:Solução acetato de amônio 5 mM pH 3,0 (50:50) como fase móvel,

volume de injeção 2 μl, detecção em 230 nm, 30 oC. Esse método foi transferido para as colunas MN

(C18 100 x 2,0 mm), NF (C18 100 x 2,1 mm, 2,7 μm) e Sub 2 μm (C18 100 x 2,1 mm, 1,8 μm), após

ajustes nas proporções de acetonitrila e solução de acetato de amônio. Todas as colunas foram

caracterizadas quanto à porosidade total, capacidade de retenção, seletividade, permeabilidade e

volume morto. Com o objetivo de reduzir o efeito extracoluna os parâmetros instrumentais volume do

loop, diâmetro interno do tubo de PEEK e frequência de aquisição dos dados/constante de tempo do

detector foram otimizados. Aplicando-se os parâmetros otimizados e os métodos para determinação

de antidiabéticos, as colunas foram comparadas em termos de eficiência (análise das curvas de Van

Deemter, de Knox e gráficos de performance cinética), velocidade de análise, resolução, simetria do

pico e pressão. A coluna monolítica, apesar de compatível com equipamentos de HPLC e de propiciar

análises mais eficientes do que a convencional em vazões elevadas, apresentou eficiência inferior a

gerada pelas colunas de núcleo fundido e Sub 2 μm, além de dar origem a picos de pior simetria.

Considerando a determinação da glimepirida como exemplo, verificou-se que coluna de núcleo

fundido gerou análises com 90% da eficiência máxima e da velocidade ótima propiciadas pela coluna

Sub 2 μm, com a vantagem de não gerar pressões acima de 400 bar, o que permite o uso de

equipamento de HPLC. Além disso, assim como a coluna Sub 2 μm, a de núcleo fundido foi capaz de

manter elevada eficiência em altas velocidades de análise e de gerar picos de boa simetria. Com o

objetivo de comparar as colunas em uma situação limite de pressão e resolução, métodos

extremamente rápidos para determinação de antidiabéticos foram desenvolvidos. Verificou-se que o

método extremo com a coluna Sub 2 μm foi o mais rápido, mas levando-se em conta velocidade de

análise, eficiência e pressão, o método extremo com a coluna de núcleo fundido foi o ideal. Assim, o

método rápido com esta coluna foi validado, utilizando-se a glibenclamida como modelo. Demonstrou-

se a capacidade da coluna de núcleo fundido em gerar resultados quantitativos confiáveis.

Palavras-chave: coluna monolítica, coluna de núcleo fundido, partículas sub 2 μm, UHPLC, curva de

Van Deemter, gráficos de performance cinética, antidiabéticos orais

ABSTRACT

Conventional High Performance Liquid Chromatography (HPLC), which uses columns packed with

totally porous particles with diameter between 3-5 µm (CV), has some limitations regarding the

possibility to generate fast analysis maintaining high efficiency. Recently new stationary phases, such

as those packed with fused core particles (FC), packed with fully porous particles with diameter less

than 2 μm (Sub 2 μm) and monolithic phases (MN) have been introduced in the market in order to

reduce analysis time maintaining high resolution and efficiency. However, there are few studies

comparing and applying these new approaches. With this in view this study aimed to compare these

new stationary phases, using analytical methods for oral antidiabetics (chlorpropamide, glibenclamide,

gliclazide and glimepiride) determination as model. Initially the followed analytical method for

antidiabetics determination was developed and optimized in CV column (C18 column 100 x 2.1 mm, 5

μm): mobile phase composed of acetonitrile and ammonium acetate buffer 5 mM pH 3.0 (50:50),

volume of injection 2 μl, detection at 230 nm, 30 oC. This method has been transferred to MN (C18

100 x 2.0 mm), NF (C18 100 x 2.1 mm, 2.7 μm) and Sub 2 μm columns (C18 100 x 2.1 mm, 1.8 μm),

after adjustments in acetonitrile and buffer proportion. The columns (CV, MN, FC and Sub 2 μm) were

characterized in terms of dead volume, porosity, retention factor, selectivity and permeability. In order

to reduce extra-column volume the followed instrumental chromatographic parameters were

optimized: loop volume, internal diameter (id) of PEEK tube and data acquisition frequency/detector

time constant. Applying the optimized parameters and the methods for antidiabetics determination, the

columns were compared in terms of performance (analysis of Van Deemter, Knox and kinetic plots),

analysis speed, resolution, peak symmetry and pressure. According to the results fused core column

is the best alternative to conventional one. Although monolithic column conducted to more efficient

analyzes at higher flow rates than conventional one, it was less efficient than fused core and Sub 2 μm

columns. Besides, peaks from monolithic column presented worse symmetry. Considering the

determination of glimepiride as example, fused core column provided analysis with 90% of maximum

efficiency and optimal speed achieved by sub 2 μm column with the advantage of generate pressure

bellow 400 bar, which allows the use of conventional HPLC instrument. Furthermore, as Sub 2 μm

column, fused core was able to maintain high efficiency at high analysis speed and generate peak with

suitable symmetry. Aiming to compare the columns in a extreme situation of pressure and resolution,

fast methods for antidiabetics determination were developed. Extremely method developed in Sub 2

μm column was the fastest, but taking into account analysis speed, efficiency and pressure, the

extreme method developed in fused core column was the ideal. Considering that fused core column

showed the best relation between speed, efficiency and pressure, a quantitative evaluation of its

performance was carried out. The extreme method in fused core column was validated for

glibenclamide and the ability of this column to provide reliable quantitative results was demonstrated.

Key words: monolithic column, fused core column, sub 2- μm particles, UHPLC, Van Deemter curve,

kinetic plot, oral antidiabetics

LISTA DE FIGURAS

INTRODUÇÃO GERAL

1 Histórico do desenvolvimento de partículas para fases estacionárias..................... 27

CAPÍTULO 1

1.1 Estrutura geral das sulfoniluréias................................................................................. 35

1.2 Estruturas químicas da CL, GB, GM e GZ..................................................................... 36

1.3 Cromatograma de rosiglitazona (1), pioglitazona (2), glipizida (3), gliclazida (4),

glibenclamida (5), celecoxibe - padrão interno (6) e repaglinida (7). (a) branco, (b)

plasma humano contaminado com os padrões dos antidiabéticos e padrão

interno (c) mistura sintética contendo antidiabéticos e o padrão interno................

40

1.4 Curva de Van Deemter.................................................................................................... 44

1.5 Espectros de varredura dos antidiabéticos.................................................................. 51

1.6 Curvas de Van Deemter da CL em diferentes fases móveis....................................... 52

1.7 Curvas de Van Deemter da GZ em diferentes fases móveis....................................... 52

1.8 Curvas de Van Deemter da GB em diferentes fases móveis...................................... 52

1.9 Curvas de Van Deemter da GM em diferentes fases móveis...................................... 53

1.10 Relação entre percentual de ACN na fase móvel e k dos antidiabéticos.................. 53

1.11 Relação entre vazão e Rs (GM/GB) nas diferentes fases móveis............................... 54

1.12 Relação entre vazão e pressão do sistema nas diferentes fases móveis................. 55

1.13 Curvas de Van Deemter da GM nas concentrações de 100 e 250 μg/ml.................... 57

1.14 Curvas de Van Deemter da CL nos diferentes volumes de injeção........................... 59

1.15 Curvas de Van Deemter da GM nos diferentes volumes de injeção.......................... 59

1.16 Cromatograma obtido durante análise de antidiabéticos em coluna convencional 61

CAPÍTULO 2

2.1 Micrografia da fase monolítica de sílica....................................................................... 69

2.2 Macroporos de 2 μm (a) e mesoporos de 13 nm (b) da fase monolítica.................... 70

2.3 Micrografia de partícula de núcleo fundido.................................................................. 74

2.4 Esquema de partícula de núcleo fundido..................................................................... 74

2.5 Relação entre a porcentagem de acetonitrila presente na fase móvel e retenção

(k) da gliclazida nas diferentes colunas........................................................................

85

2.6 Relação entre a porcentagem de acetonitrila presente na fase móvel e a

seletividade (α) do par GZ e GB nas diferentes colunas.............................................

86

2.7 Relação entre u0 e ∆Pc nas diferentes colunas........................................................... 87

CAPÍTULO 3

3.1 Esquema de equipamento de HPLC - em vermelho, os fatores que contribuem

para o efeito extracoluna -.............................................................................................. 95

3.2 Medida da largura na linha de base (4 σ) e da largura na meia altura (2,354 σ)....... 97

3.3 Relação entre vazão e σ2

extracoluna em análises com loops de 2, 5 e 10 μl................. 103


extracoluna em análises com PEEK de 0,0025 e 0,004

polegada de di.................................................................................................................

104

3.5 Relação entre vazão e pressão em análises com PEEK de 0,0025 e 0,004

polegada de di.................................................................................................................

105


extracoluna em análises com diferentes pares de

F/t......................................................................................................................................

106

3.7 Relação entre vazão e Er dos antidiabéticos em loops de 10 e 2 μl - Coluna CV..... 108

3.8 Relação entre vazão e Er dos antidiabéticos em loops de 10 e 2 μl - Coluna MN..... 108

3.9 Relação entre vazão e Er dos antidiabéticos em loops de 10 e 2 μl - Coluna NF...... 109

3.10 Relação entre vazão e Er dos antidiabéticos em loops de 10 e 2 μl - Coluna Sub 2

μm.....................................................................................................................................

109

3.11 Relação entre F/t e Er dos antidiabéticos - vazão de 0,6 ml/min................................ 112

3.12 Relação entre F/t e Er dos antidiabéticos - vazão de 0,15 ml/min.............................. 112

CAPÍTULO 4

4.1 Efeito da difusão de Eddy (A) no alargamento do pico............................................... 119

4.2 Efeito da difusão longitudinal (B) no alargamento do pico........................................ 119

4.3 Efeito da resistência à transferência de massa (C) no alargamento do pico............ 120

4.4 Contribuição dos termos A, B e C na obtenção da curva de Van Deemter............... 120

4.5 Curvas de Van Deemter em quatro diferentes colunas obtidas para o

etilbenzeno....................................................................................................................... 122

4.6 Gráfico de performance cinética (N x t0) ...................................................................... 128

4.7 Transformações matemáticas para o cálculo de u0 otm................................................ 132

4.8 Curvas de Van Deemter da CL nas diferentes colunas............................................... 134

4.9 Curvas de Van Deemter da GZ nas diferentes colunas............................................... 134

4.10 Curvas de Van Deemter da GB nas diferentes colunas............................................... 135

4.11 Curvas de Van Deemter da GM nas diferentes colunas.............................................. 135

4.12 Curvas de Knox da GM nas diferentes colunas........................................................... 140

4.13 Gráfico de performance cinética N x t0/N2 da GM........................................................ 141

4.14 Gráfico de performance cinética N x L da GM.............................................................. 142

4.15 Gráfico de performance cinética np x tr da GM............................................................. 143

4.16 Cromatogramas relativos às análises dos antidiabéticos nas colunas (a) CV, (b)

MN, (c) NF e (d) Sub 2 μm - ordem de eluição: CL, GZ, GB, e GM.............................. 146

4.17 Relação entre vazão e pressão nas diferentes colunas.............................................. 148

CAPÍTULO 5

5.1 Cromatogramas referentes à formulação de lidocaína - (1) metilparabeno, (2) 2,6-

dimetilanilina, (3) propilparabeno e (4) lidocaína......................................................... 157

5.2 Cromatograma das substâncias relacionadas da glimepirida a (1) e b (2),

glibenclamida (3) e glimepirida (4)................................................................................ 158

5.3 Cromatogramas referentes às análises dos antidiabéticos utilizando os métodos

extremos desenvolvidos em coluna (a) CV (b) MN (c) NF (d) Sub 2 μm - ordem de

eluição: CL, GZ, GB e GM............................................................................................... 171

5.4 Cromatogramas da GB (a) padrão, (b) amostra, (c) diluente (d) placebo - coluna

CV..................................................................................................................................... 172

5.5 Cromatogramas da GB (a) padrão, (b) amostra, (c) diluente (d) placebo - coluna

NF...................................................................................................................................... 173

5.6 Curva analítica para a determinação de GB em comprimidos - coluna CV............... 176

5.7 Curva analítica para a determinação de GB em comprimidos - coluna NF............... 176

5.8 Gráfico de distribuição de resíduos - coluna CV......................................................... 176

5.9 Gráfico de distribuição de resíduos - coluna NF......................................................... 177

LISTA DE QUADROS

CAPÍTULO 1

1.1 Concentração de glicose plasmática (mg/dl) para diagnóstico de Diabetes

Mellitus e seus estágios pré-clínicos............................................................................ 33

1.2 Medicamentos utilizados no tratamento do DM 2........................................................ 34

1.3 Propriedades físico-químicas dos fármacos CL, GB, GM e GZ.................................. 37

1.4 Mé Métodos farmacopeicos de análise de CL, GB, GM e GZ............................................ 41

1.5 Parâmetros analíticos dos métodos cromatográficos farmacopeicos para

determinação de CL, GB, GM e GZ................................................................................ 42

CAPÍTULO 3

3.1 Volumes dos componentes típicos de equipamentos de HPLC e UHPLC................ 95

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1

1.1 Fabricante, número de lote, pureza e validade dos insumos farmacêuticos

ativos dos fármacos CL, GB, GM e GZ....................................................................... 46

1.2 Condições analíticas preliminares.............................................................................. 48

1.3 Otimização das condições cromatográficas em coluna convencional................... 49

1.4 Fatores de assimetria dos picos dos antidiabéticos nas diferentes fases

móveis............................................................................................................................ 56

1.5 Fatores de assimetria dos picos dos antidiabéticos nas concentrações de 100 e

250 μg/ml....................................................................................................................... 58

1.6 Condições de análise para determinação de antidiabéticos nas diferentes

colunas e valores de k.................................................................................................. 62

CAPÍTULO 2


colunas.......................................................................................................................... 82

2.2 Pressões máximas suportadas pelas colunas e valores de vazão máximos

empregados em cada coluna para determinação de Kv0.......................................... 82

2.3 Volume morto e porosidade total das colunas.......................................................... 83

2.4 Inclinação do gráfico das retas u0 x ∆Pc, viscosidade da fase móvel,

comprimento e permeabilidade das colunas............................................................. 87

CAPÍTULO 3

3.1 Experimentos de otimização dos parâmetros instrumentais cromatográficos...... 100


colunas.......................................................................................................................... 101

3.3 Er para a glibenclamida nas quatro colunas - vazão de 0,3 ml/min......................... 110

3.4 Er dos antidiabéticos na coluna sub 2 μm - vazão de 0,3 ml/min............................ 111

3.5 Er da clorpropamida em diferentes vazões e relações F/t........................................ 113

3.6 Er dos antidiabéticos em diferentes relações F/t - vazão de 0,6 ml/min.................. 113

3.7 Volumes dos componentes do equipamento de UHPLC (Acquity®) e volume

extracoluna ................................................................................................................... 114

CAPÍTULO 4

4.1 Condições de análise para determinação de antidiabéticos nas quatro

colunas..........................................................................................................................

131

4.2 Equações referentes às curvas de Van Deemter da CL e GZ - Figuras 4.8 e

4.9................................................................................................................................... 136

4.3 Equações referentes às curvas de Van Deemter da GB e GM - Figuras 4.10 e

4.11.................................................................................................................................

136

4.4 Valores de Hmin e u0 opt relativos às curvas de Van Deemter das figuras 4.8 a

4.11................................................................................................................................. 138

4.5 Equações e valores de hmin e v0 opt referentes às curvas de Knox da

GM.................................................................................................................................. 140

4.6 Valores de resolução entre GZ/CL, GB/GZ e GM/GB, nas diferentes colunas........ 144

4.7 Fatores de assimetria dos picos dos antidiabéticos orais nas diferentes

colunas.......................................................................................................................... 147

CAPÍTULO 5


colunas.......................................................................................................................... 160

5.2 Pressão máxima suportada pelas diferentes colunas.............................................. 161

5.3 Função farmacotécnica, percentuais usuais e percentuais adicionados dos

excipientes presentes no comprimido referência de glibenclamida (Daonil®)....... 164

5.4 Preparo das soluções de glibenclamida para avaliação da linearidade................. 165

5.5 Preparo das soluções para o ensaio de exatidão...................................................... 167

5.6 Distribuição das variáveis nos experimentos de robustez...................................... 168

5.7 Condições analíticas para determinação extremamente rápida de antidiabéticos

nas diferentes colunas................................................................................................. 169

5.8 Parâmetros cromatográficos obtidos em análises de antidiabéticos utilizando

os métodos extremos desenvolvidos......................................................................... 170

5.9 Valores médios e DPR dos parâmetros de adequabilidade do sistema.................. 173

5.10 Áreas das soluções padrão de trabalho e amostra por período de 4 horas........... 174

5.11 Testes estatísticos aplicados aos dados de regressão linear................................. 174

5.12 Concentrações de glibenclamida e valores de área para a construção das

curvas analíticas........................................................................................................... 175

5.13 Valores de área e teor de glibenclamida em comprimidos para avaliação da

precisão dos métodos extremos relativos às colunas CV e NF............................... 177

5.14 Percentual de recuperação de glibenclamida adicionada ao placebo para

avaliação da exatidão dos métodos extremos nas colunas CV e NF...................... 178

5.15 Limites de detecção e quantificação.......................................................................... 179

5.16 Avaliação do efeito das variáveis na determinação de teor de glibenclamida

utilizando os métodos extremos nas colunas CV e NF............................................ 180

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

A Coeficiente de difusão axial ou difusão de Eddy

ACN Acetonitrila

As Fator de assimetria

AU Absorbância

B Coeficiente de difusão longitudinal

BP Farmacopeia britânica

C Coeficiente de resistência à transferência de massa

CA Chemical Abstract

CL Clorpropamida

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

cp Centipoise

CV Coluna convencional

Conc. Concentração

Dm Coeficiente de difusão do analito

DM 1 Diabetes Mellitus tipo 1

DM 2 Diabetes Mellitus tipo 2

di Diâmetro interno

dp Diâmetro da partícula

DPR Desvio Padrão Relativo

Porosidade total

Er Eficiência remanescente

Eur. Farmacopeia europeia

ECV Extra-column volume

exp. Experimento

F Frequência de aquisição dos dados

F. Bras Farmacopeia Brasileira

FM Fase Móvel

GB Glibenclamida

GM Glimepirida

GZ Gliclazida

H Altura do prato teórico

h Altura do prato teórico reduzido

Hmin Altura mínima do prato teórico

hmin Altura mínima do prato teórico reduzido

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HTLC High Temperature Liquid Chromatography

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

K Constante característica da qualidade da injeção

k Fator de retenção

K+ATP Canais de potássio ATP dependentes

Kv0 Permeabilidade da coluna

L Comprimento da coluna

min. Minutos ou Mínima

max. Máxima

MN Coluna monolítica

N Número de pratos teóricos

Viscosidade da fase móvel

np Fator de capacidade do pico

NF Coluna com partículas de núcleo fundido

OMS Organização Mundial de Saúde

∆Pmax Pressão máxima

∆Pc Pressão da coluna

∆Pec Pressão extracoluna

∆Pt Pressão total

P Pressão do sistema cromatográfico

PEEK Poly(ether-ether-ketone)

rc Raio da coluna

r Coeficiente de correlação linear

Rs Resolução

RENAME Relação Nacional de Medicamentos Essenciais

Sub 2 μm Coluna com partículas porosas de diâmetro menor que 2 μm

t Constante de tempo do detector

T Temperatura

tr Tempo de retenção

t0 Tempo morto

u0 Velocidade linear da fase móvel

u0 otm Velocidade linear ótima da fase móvel

UHPLC Ultra High Performance Liquid Chromatography

USP United State Pharmacopeia

V Vazão

v0 Velocidade linear da fase móvel reduzida

v0 otm Velocidade linear ótima da fase móvel reduzida

Vm Volume morto

Vinj Volume de injeção

w0,5 Largura do pico na meia altura

w Largura do pico na linha de base

Comprimento de onda

α Seletividade

2

coluna/2

c Variância da coluna

2

extracoluna /2

ec Variância extracoluna

2

total/2

t Variância total

2

ec max Variância extracoluna máxima aceitável

Desvio padrão

Fator de resistência da coluna

Fração do alargamento do pico

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL.................................................................................. 25

1 ESTADO DA ARTE DA CLAE.................................................................... 26

2 JUSTIFICATIVA.......................................................................................... 29

3 OBJETIVO GERAL..................................................................................... 29

REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS..............................................................

30

CAPÍTULO 1 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS POR

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA EM DIFERENTES COLUNAS PARA

DETERMINAÇÃO DE ANTIDIABÉTICOS ORAIS........................................

31

1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................... 32

1.1 Diabetes Mellitus...................................................................................... 32

1.2 Tratamento............................................................................................... 33

1.3 Sulfoniluréias............................................................................................ 35

1.4 Curva de Van Deemter............................................................................. 44

2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS....................................................................... 45

3 MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................... 46

3.1 Materiais................................................................................................... 46

3.1.1 Insumos farmacêuticos ativos......................................................... 46

3.1.2 Solventes, reagentes e vidrarias..................................................... 46

3.1.3 Equipamentos e colunas cromatográficas....................................... 46

3.2 Métodos.................................................................................................... 47

3.2.1 Desenvolvimento de método analítico por cromatografia líquida

para a determinação de CL, GB, GM e GZ em coluna CV............................ 47

3.2.2 Otimização de método analítico por cromatografia líquida para a

determinação CL, GB, GM e GZ em coluna CV............................................. 48

3.2.3 Transferência do método desenvolvido e otimizado em coluna CV

para as colunas MN, NF e Sub 2 μm............................................................. 49

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................. 50

4.1 Desenvolvimento de método analítico por cromatografia líquida para a

determinação de CL, GB, GM e GZ em coluna CV........................................ 50

4.2 Otimização de método analítico por cromatografia líquida para a

determinação de CL, GB, GM e GZ em coluna CV........................................

51

4.2.1 Fase móvel...................................................................................... 51

4.2.2 Concentração.................................................................................. 57

4.2.3 Volume de injeção........................................................................... 58

4.2.4 Temperatura.................................................................................... 61

4.3 Transferência do método desenvolvido e otimizado em coluna CV para

as colunas MN, NF e Sub 2 μm..................................................................... 62

5 CONCLUSÃO............................................................................................. 63

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................

64

CAPÍTULO 2 CARACTERIZAÇÃO FÍSICA DAS COLUNAS

CROMATOGRÁFICAS..................................................................................

67


1.1 Coluna monolítica..................................................................................... 68

1.2 Coluna empacotada com partículas de núcleo fundido............................ 72

1.3 Coluna empacotada com partículas porosas sub 2 µm........................... 75

2 OBJETIVO ESPECÍFICO............................................................................ 78


3.1 Materiais................................................................................................... 78




3.2 Métodos.................................................................................................... 78

3.2.1 Estimativa do volume morto e porosidade total das colunas.......... 78

3.2.2 Avaliação da retenção e seletividade das colunas.......................... 79

3.2.3 Estimativa da permeabilidade das colunas..................................... 80


4.1 Estimativa do volume morto e porosidade total das colunas................... 83

4.2 Estimativa da retenção e seletividade das colunas.................................. 84

4.2.1 Retenção......................................................................................... 84

4.2.2 Seletividade..................................................................................... 86

4.3 Estimativa da permeabilidade das colunas.............................................. 87

5 CONCLUSÃO............................................................................................. 88

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 90

CAPÍTULO 3 OTIMIZAÇÃO DE PARÂMETROS INSTRUMENTAIS

CROMATOGRÁFICOS..................................................................................

93


1.1 Efeitos extracoluna e a eficiência cromatográfica.................................... 94



3.1 Materiais................................................................................................... 99




3.1.4 Outros.............................................................................................. 99

3.2 Métodos.................................................................................................... 99

3.2.1 Otimização dos parâmetros instrumentais cromatográficos parte

I: avaliação do efeito extracoluna................................................................... 99

3.2.2 Otimização dos parâmetros instrumentais cromatográficos parte

II: avaliação da eficiência cromatográfica remanescente............................... 101

3.2.3 Determinação do volume extracoluna real (ECV)........................... 102


4.1 Otimização dos parâmetros instrumentais cromatográficos parte I:

avaliação do efeito extracoluna...................................................................... 103

4.1.1 Volume do loop................................................................................ 103

4.1.2 Diâmetro interno da tubulação de PEEK no trajeto da coluna ao

detector........................................................................................................... 104

4.1.3 Frequência de aquisição dos dados (F) e constante de tempo do

detector (t) ..................................................................................................... 106

4.2 Otimização dos parâmetros instrumentais cromatográficos parte II:

avaliação da eficiência cromatográfica remanescente................................... 107

4.2.1 Volume do loop................................................................................ 108

4.2.2 Frequência de aquisição dos dados (F) e constante de tempo do

detector (t) ..................................................................................................... 111

4.3 Cálculo do volume extracoluna (ECV) real............................................... 114

5 CONCLUSÃO............................................................................................. 114

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................

116

CAPÍTULO 4 AVALIAÇÃO E COMPARAÇÃO QUALITATIVA DA

EFICIÊNCIA DE COLUNAS CROMATOGRÁFICAS.................................... 117


1.1 Curvas de Van Deemter e de Knox.......................................................... 118

1.2 Características das curvas de Van Deemter e de Knox das colunas

MN, NF e Sub 2 μm........................................................................................ 122

1.2.1 Coluna monolítica........................................................................... 122

1.2.2 Coluna empacotada com partículas de núcleo fundido.................. 123

1.2.3 Coluna empacotada com partículas sub 2 μm............................... 125

1.3 Gráficos de performance cinética............................................................. 126

2 OBJETIVO ESPECÍFICO............................................................................ 129


3.1 Materiais................................................................................................... 130




3.2 Métodos.................................................................................................... 130

3.2.1 Avaliação da eficiência e velocidade de análise das colunas....... 130

3.2.2 Avaliação da resolução, fator de assimetria e pressão................... 133


4.1 Avaliação da eficiência e velocidade de análise das colunas.................. 134

4.1.1 Curvas de Van Deemter.................................................................. 134

4.1.2 Curvas de Knox............................................................................... 140

4.1.3 Gráficos de performance cinética.................................................... 141

4.2 Avaliação da resolução, fator de assimetria e pressão............................ 143

4.2.1 Resolução........................................................................................ 143

4.2.2 Fator de assimetria dos picos.......................................................... 146

4.2.3 Pressão do sistema cromatográfico................................................ 148

5 CONCLUSÃO............................................................................................. 149


CAPÍTULO 5 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS

EXTREMAMENTE RÁPIDOS........................................................................

155


1.1 Métodos analíticos extremamente rápidos............................................... 156

1.2 Métodos analíticos para determinação de sulfoniluréias.......................... 158



3.1 Materiais................................................................................................... 159




3.1.4 Substâncias químicas de referência e amostras............................. 160

3.2 Métodos.................................................................................................... 160

3.2.1 Desenvolvimento e comparação de métodos analíticos

extremamente rápidos para determinação de antidiabéticos nas colunas

CV, MN, NF e Sub 2 μm.................................................................................

160

3.2.2 Comparação das colunas CV e NF em termos quantitativos.......... 162


4.1 Desenvolvimento e comparação de métodos analíticos extremamente

rápidos para determinação de antidiabéticos nas colunas CV, MN, NF e

Sub 2 μm........................................................................................................ 169

4.2 Comparação das colunas CV e NF em termos quantitativos................... 172

4.2.1 Seletividade e adequabilidade do sistema (system suitability)........ 172

4.2.2 Estabilidade das soluções padrão de trabalho e amostra............... 174

4.2.3 Linearidade...................................................................................... 174

4.2.4 Precisão intra-corrida e precisão inter-corridas............................... 177

4.2.5 Exatidão........................................................................................... 178

4.2.6 Limites de detecção e quantificação............................................... 179

4.2.7 Robustez......................................................................................... 179

5 CONCLUSÃO............................................................................................. 181


CONCLUSÃO FINAL..................................................................................... 184

APÊNDICE - Trabalhos apresentados em congresso................................... 187

25

INTRODUÇÃO GERAL

26

1 ESTADO DA ARTE DA CLAE

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), em inglês High Peformance

Liquid Chromatography (HPLC), é considerada a técnica mais desenvolvida,

difundida e empregada em laboratórios analíticos de indústrias farmacêuticas,

químicas e de pesquisa. Isso se justifica, pois esta técnica é adequada para a

separação eficiente de substâncias, o que se aplica, por exemplo, às análises de

controle de qualidade, nas quais são realizadas determinações quantitativas de

fármacos, de impurezas de síntese e de produtos de degradação, análises

farmacocinéticas e estudos pré-clínicos de moléculas candidatas a fármacos [1, 2,

3].

Desde o início do desenvolvimento da Cromatografia a Líquido, na década de 1950,

até os dias atuais, muitos avanços, impulsionados pelo desenvolvimento de novas

partículas de fases estacionárias e da instrumentação, foram alcançados. A

necessidade de execução de análises mais rápidas, sem que houvesse o

comprometimento do desempenho cromatográfico, foi o que impulsionou as

pesquisas com o objetivo de tornar a técnica mais rápida e eficiente. Em 1950 eram

utilizadas colunas empacotadas com partículas irregulares de 100-200 μm, que

alcançavam eficiência de apenas 200 pratos/15 cm. Por volta dos anos 60 foram

introduzidas as colunas contendo partículas peliculares rígidas de 40-50 μm,

mecanicamente resistentes, que ofereciam maior eficiência (1000 pratos/15 cm). A

transição para partículas porosas menores com diâmetro em torno de 10 μm ocorreu

por volta dos anos 70, propiciando eficiência de 6000 pratos/15 cm. A partir dos

anos 80, com a introdução das partículas esféricas, o desenvolvimento voltou-se

basicamente para a redução do diâmetro das partículas da fase estacionária e

surgiram as primeiras partículas esféricas de diâmetro de 5 μm. Hoje já há

disponíveis colunas com partículas esféricas porosas de 1,7 μm, que permitem

melhor resolução e alta eficiência, que pode chegar a 30000 pratos/15 cm [3]. Na

Figura 1 há um resumo do histórico do desenvolvimento de partículas para fases

estacionárias de HPLC.

27

Ano de introdução

Tamanho da partícula

Tamanho nominal mais popular (μm)

Pratos/15 cm (Aproximado)

1950

100

200

1967

50 pelicular

1000

1972

10 6000

1985

5 12000

1992

3-3,5 22000

1996 1,5* pelicular 30000

1999 5,0 superficie porosa 8000**

2000 2,5 25000

2003 1,8 32500

2006 2,7 -

*Sílica não porosa ou resina ** Para proteína PM 5.700

Figura 1 - Histórico do desenvolvimento de partículas para fases estacionárias

[Adaptado de 4 e 5]

Na área farmacêutica houve um grande aumento no número de análises de pureza,

análises aplicadas aos estudos farmacocinéticos e análises de controle de

qualidade, o que fez com que laboratórios farmacêuticos se tornassem uma das

forças motrizes para o desenvolvimento de análises rápidas. O crescimento da

indústria farmacêutica ocorreu em todo mundo, inclusive no Brasil. Segundo dados

do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), as vendas da indústria

farmacêutica nacional cresceram 9,43% de 2011 para 2012, comparando dados dos

meses de janeiro a julho de ambos os anos. Esse crescimento só foi possível, e só

poderá ser mantido ou ampliado, se a capacidade analítica das indústrias

aumentarem, o que justifica o interesse por técnicas cada vez mais rápidas [2, 6].

O atual domínio do uso dos métodos cromatográficos na área farmacêutica, em

especial da técnica HPLC, é evidente nas farmacopeias. Na Farmacopeia

Formato

irregular

Pérola

de

vidro

28

Americana número 16, publicada em 1960, os métodos cromatográficos eram

empregados em aproximadamente 3% das monografias. Já na Farmacopeia

Americana número 34, de 2011, 77% das monografias continham ao menos um

método cromatográfico e 54% eram por HPLC. Esse aumento expressivo na

aplicação da cromatografia em análises farmacêuticas em substituição aos métodos

tradicionais (exemplos: espectrometria no visível e ultravioleta; volumetrias) resultou

em um controle mais efetivo da identidade, potência e pureza dos fármacos [7].

Atualmente a técnica HPLC que emprega fase estacionária convencional,

empacotada com partículas totalmente porosas de diâmetro entre 3 e 5 µm (CV),

ainda é a mais comum nos laboratórios. Cromatógrafos destinados a esse tipo de

cromatografia operam com valores de pressão máxima de 400 bar. Apesar de o

desempenho cromatográfico ser adequado, uma análise corrida analítica por HPLC

pode levar, em média, de 10 a 45 minutos [2, 8].

Alternativas estão sendo desenvolvidas para diminuir o tempo e melhorar a

eficiência de análises realizadas por HPLC. Uma delas refere-se à substituição das

colunas com partículas totalmente porosas tradicionais por colunas monolíticas (MN)

ou de núcleo fundido (NF). Outras opções são a Cromatografia Líquida de Ultra

Eficiência (UHPLC, do inglês Ultra High Performance Liquid Chromatography), em

que o diâmetro médio das partículas porosas constituintes da fase estacionária é

inferior a 2 µm (Sub 2 µm), e a Cromatografia Líquida de Alta Temperatura (HTLC,

do inglês High Temperature Liquid Chromatography) [9].

Nesse trabalho foi realizado um estudo dessas novas alternativas para reduzir o

tempo e melhorar a eficiência de análise por HPLC, excetuando-se a HTLC.

Portanto, colunas MN, NF e Sub 2 µm foram os objetos de estudo desse trabalho,

assim como a coluna CV, utilizada como referência. O presente estudo foi dividido

nos seguintes capítulos:

Capítulo I: Desenvolvimento de métodos analíticos por cromatografia líquida em

diferentes colunas para determinação de antidiabéticos orais

Capítulo II: Caracterização física das colunas cromatográficas

29

Capítulo III: Otimização de parâmetros instrumentais cromatográficos

Capítulo IV: Avaliação e comparação qualitativa da eficiência de colunas

cromatográficas

Capítulo V: Desenvolvimento de métodos analíticos extremamente rápidos

2 JUSTIFICATIVA

O atual crescimento das indústrias farmacêuticas vem acompanhado de uma

demanda por análises cada vez mais rápidas e, ao mesmo tempo, eficientes. As

análises rápidas por Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência foram desenvolvidas

a partir do ano 2000, e ainda há poucos estudos em que se aplicam e comparam as

novas abordagens. Dentre essas abordagens destacam-se a utilização de colunas

cromatográficas monolíticas (MN), de partículas de núcleo fundido (NF) e de

partículas porosas sub 2 μm (Sub 2 μm). A importância da utilização dessas colunas

modernas em análises farmacêuticas justifica as pesquisas sobre o assunto, tendo

em vista a demanda por análises rápidas e eficientes.

Antidiabéticos orais (clorpropamida-CL, glibenclamida-GB, glimepirida-GM e

gliclazida-GZ) foram escolhidos como modelo para o estudo de diferentes tipos de

fases estacionárias para separações rápidas em cromatografia líquida. A escolha

desses fármacos se justifica pela sua ampla utilização, que é consequência da

elevada prevalência de Diabetes Mellitus tipo 2 na população. Faz-se necessário,

portanto, métodos rápidos e eficientes para o controle de qualidade desses

fármacos. Outra razão para a escolha desses fármacos é o fato de que eles, por

apresentarem polaridades diferentes, apresentam também retenções bem distintas,

o que possibilita que as colunas sejam comparadas de uma maneira mais completa.

3 OBJETIVO GERAL

Avaliar e comparar diferentes tipos de colunas cromatográficas (CV, MN, NF e Sub 2

μm) para separações rápidas utilizando fármacos antidiabéticos orais (CL, GB, GM e

GZ) como modelo.

30

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] AL-SAYAH, M. A.; RIZOS, P.; ANTONUCCI, V.; WU, N. High throughput screening of active pharmaceutical ingredients by UPLC. Journal of Separation Science. v. 31, p. 2167-2172, 2008. [2] MALDANER, L.; JARDIM, I. C. S. F. O estado da arte da cromatografia líquida de ultra eficiência. Química Nova. v. 32, n. 32, p. 214-222, 2009. [3] WREN, S. A. C.; TCHELITCHEFF, P. Use of ultra performance liquid chromatography in pharmaceutical development. Journal of Chromatography A. v. 1119, p. 140-146, 2006. [4] MAJORS, R. E. Fast and ultrafast HPLC on sub-2-µm porous particles - where do we go from here? LCGC North America. v. 23, n. 12, p. 1248-1255, 2005. [5] GUIOCHON, G.; GRITTI, F. Shell particles, trials, tribulations and triumphs. Journal of Chromatography A, v. 1218, p. 1915-1938, 2011. [6] INDICADORES ECONÔMICOS, 2012. Disponível em: <http://www. sindusfarma comunica.org.br/indicadores-economicos>. Acesso em: 30 de Agosto de 2012. [7] GÖRÖG, S. The paradigm shifting role of chromatographic methods in pharmaceutical analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. v. 69, p. 2-8, 2012. [8] GUILLARME, D.; NGUYEN, D.; RUDAZ, S.; VEUTHEY, J. Method transfer for fast liquid chromatography in pharmaceutical analysis: Application to short columns packed with small particle. Part I: Isocratic separation. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. v. 66, p. 475-482, 2007. [9] GUILLARME, D.; RUTA J.; RUDAZ, J.; VEUTHEY, J. New trends in fast and high-resolution liquid chromatography: a critical comparison of existing approaches. Analytical and Bioanalytical Chemistry. v. 397, p. 1069-1082, 2010.

31

CAPÍTULO 1

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS POR

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA EM DIFERENTES COLUNAS

PARA DETERMINAÇÃO DE ANTIDIABÉTICOS ORAIS

32

1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1 Diabetes Mellitus

De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), aproximadamente

346 milhões de pessoas sofrem de Diabetes Mellitus (DM) no mundo. Em 2004,

cerca de 3,4 milhões de pessoas morreram em consequência de DM e de acordo

com projeções da OMS, entre 2005 e 2030, o número de mortes irá dobrar [1].

O DM não é uma única doença, mas um grupo heterogêneo de distúrbios

metabólicos que apresenta em comum a hiperglicemia, a qual é resultado de

defeitos na ação ou na secreção de insulina ou ambos. Atualmente é classificado

como DM tipo 1 (DM 1), DM tipo 2 (DM 2), DM gestacional e outros tipos específicos

[2].

O DM 1, presente em 5% a 10% dos casos, é o resultado da destruição de células

beta pancreáticas, com consequente deficiência da produção de insulina. Na maioria

das vezes essa destruição de células beta é mediada por autoimunidade, porém

existem casos em que não há evidência do processo autoimune, sendo, portanto,

referida como forma idiopática. O tratamento envolve a administração diária de

insulina. Sintomas incluem poliúria, polidipsia, fome constante, perda de peso,

alterações na visão e fadiga [1, 2].

Já o DM 2, presente em 90% a 95% dos casos, caracteriza-se por defeitos na ação

e secreção da insulina. A maioria dos pacientes apresenta sobrepeso ou obesidade

e a doença geralmente se manifesta após os 40 anos. Os pacientes não necessitam

de insulina exógena para sobreviver, entretanto podem necessitar da insulina para

controle metabólico adequado. Os sintomas são similares aos do DM 1, entretanto,

menos evidentes, o que faz com que a doença muitas vezes seja diagnosticada de

forma tardia. O tratamento atual visa diminuir a resistência à insulina e melhorar a

função da célula beta pancreática com dieta, exercícios, antidiabéticos orais, drogas

antiobesidade e insulina [1, 3].

33

O diagnóstico do DM é feito por meio da determinação de valores de glicose

plasmática. Os valores de glicose indicativos da doença estão apresentados no

Quadro 1.1.

Quadro 1.1 - Concentração de glicose plasmática (mg/dl) para diagnóstico de Diabetes

Mellitus e seus estágios pré-clínicos [2]

Categoria Jejum* Duas horas após

75 g de glicose Casual**

Glicemia normal < 100 < 140 _

Tolerância à glicose

diminuída > 100 e < 126 ≥140 e < 200 _

Diabetes Mellitus ≥126 ≥ 200 ≥ 200 com sintomas

clássicos***

* Falta de ingestão calórica por no mínimo 8 horas

** Realizada a qualquer hora do dia, sem se observar o intervalo desde a última refeição.

*** Sintomas clássicos: poliúria, polidipsia e perda não explicada de peso.

Nota: deve-se sempre confirmar o diagnóstico de DM pela repetição do teste em outro dia, a menos que

haja hiperglicemia inequívoca com descompensação metabólica aguda ou sintomas óbvios de DM.

1.2 Tratamento

O DM 1, assim que diagnosticado, deve ser tratado com insulina. Já o tratamento do

DM 2 envolve o uso de antidiabéticos orais, e se necessário uso paralelo de insulina

para auxiliar no controle metabólico. Associado ao tratamento medicamentoso faz-se

necessário o controle da alimentação e a prática de atividade física [2].

Existem no momento diversas opções terapêuticas que podem ser utilizadas,

isoladamente ou em associações, para o tratamento de DM2, dentre as quais se

destacam as biguanidas, sulfoniluréias, metaglinidas, tiazolidinadionas, inibidores da

alfa-glicosidase e incretinas. Normalmente o tratamento com apenas um agente

farmacológico não propicia um controle glicêmico adequado, e os pacientes

necessitam de múltiplos antidiabéticos orais, com diferentes mecanismos de ação.

No Quadro 1.2 há a relação dos antidiabéticos orais mais utilizados, com a indicação

das respectivas classes a que pertencem e do mecanismo de ação [3, 4, 5].

34

Quadro 1.2 - Medicamentos utilizados no tratamento do DM 2 [Adaptado de 6]

Classificação Fármaco Mecanismo de ação

Sulfoniluréia de 1ª geração

Tolbutamida

Clorpropamida

Tolazamida

Estimula a liberação de insulina pelas

células β pancreáticas por mecanismo

independente de glicose Sulfoniluréia de 2ª geração

Glimepirida

Glibenclamida

Gliclazida

Glipizida

Meglitinida Repaglinida

Nateglinida

Biguanida Fenformina

Metformina

Inibição da gliconeogênese e redução

da resistência dos tecidos à insulina

Tiazolidinedionas

Ciglitazona

Pioglitazona

Troglitazona

Rosiglitazona

Reduz a resistência do fígado e tecido

periféricos à insulina

Inibidor de α glicosidase Acarbose Retarda a absorção de amido, dextrina

e dissacarídeos

Inibidor de Dipeptipeptidase 4 Linagliptina Estimula a liberação de insulina pelas

células β pancreáticas por mecanismo

dependente de glicose e suprimem a

secreção de glucagon Peptídeo glucagon tipo 1 Exenatide

Dentre os antidiabéticos orais disponíveis, atenção especial será dada às

sulfoniluréias, já que a clorpropamida, glibenclamida, gliclazida e glimepirida serão

objetos de estudo desse trabalho [3]. Dentre as sulfoniluréias que serão utilizadas, a

glibenclamida e a gliclazida estão presentes na Relação Nacional de Medicamentos

Essenciais (RENAME) do Ministério da Saúde de 2012 [7].

As sulfoniluréias agem ligando-se à subunidade SUR1 dos canais de potássio ATP

dependentes (K+ATP), localizados na membrana das células β-pancreáticas. Essa

ligação promove o bloqueio dos canais K+ATP, com consequente despolarização da

célula β-pancreática. A despolarização estimula o influxo de Ca2+, o qual promove a

secreção de insulina [8].

35

Por aumentarem a secreção de insulina, as sulfoniluréias são chamadas de

“secretagogos de insulina”. Em curto prazo promovem o aumento da secreção de

insulina, mas a longo prazo essa secreção pode estar igual ou até diminuída em

relação aos níveis iniciais. No entanto o efeito hipoglicemiante persiste devido às

ações extra-pancreáticas. Alguns estudos sugerem que as sulfoniluréias aumentam

o número de receptores de insulina e/ou possuem efeito pós-receptor, facilitando as

ações desse hormônio, além de atuarem reduzindo a sua depuração hepática [3, 9].

1.3 Sulfoniluréias

Sulfoniluréias são arilsulfoniluréias que diferem quanto aos substituintes na posição

para do anel benzênico e no nitrogênio terminal do grupo ureia (Figura 1.1) [9].

S

O

O

N

R2

O

N

R1

H H

Figura 1.1 - Estrutura geral das sulfoniluréias [10]

As sulfoniluréias são classificadas como de 1a geração (clorpropamida, tolazamida e

tolbutamida) e de 2a geração (glibenclamida, gliclazida, glimepirida e glipizida) [9]. As

estruturas químicas da clorpropamida (CL), glibenclamida (GB), glimepirida (GM) e

gliclazida (GZ) estão representadas na Figura 1.2.

36

S

O

O

N

O

N

H H

N

OOMe

Cl

H

S

O

O

N

O

N

H H

N

O

N

H

O

Et

Me

S

O

O

N

Me

O

N

N

H H

S

O

O

N

Cl

O

N

H H Figura 1.2 - Estruturas químicas da CL, GB, GM e GZ [10]

As propriedades físico-químicas dos antidiabéticos, cujas estruturas estão

apresentadas na Figura 1.2, estão descritas no Quadro 1.3.

Glibenclamida

Clorpropamida

Gliclazida

Glimepirida

37

Quadro 1.3 - Propriedades físico-químicas dos fármacos CL, GB, GM e GZ [Adaptado de 11, 12, 13]

Clorpropamida Glibenclamida Glimepirida Gliclazida

Características Físicas Pó cristalino branco

Pó cristalino,

branco ou quase branco,

inodoro ou quase inodoro

Pó branco ou quase

branco

Pó cristalino branco ou quase

branco

Fórmula química C10H13ClN2O3S C23H28ClN3O5S C24H34N4O5S C15H21N3O3S

Nome CA

(Chemical Abstract)

4-cloro-N-

[(propilamino) carbonil]

benzenosulfonamida

5-Cloro-N-[2-[4-

[[[(cicloexilamino)

carbonil]amino]

sulfonil]fenil]etil]-2

metoxibenzamida

1H-Pirrol-1-carboxamida,

3-etil-2,5-diidro-4-metil-N-

[2-[4-[[[[(trans-4

metilciclohexil)amino]

carbonil]amino]sulfonil]

fenil]etil]-2-oxo-

N[[(Hexaidrociclopenta

[c]pirrol-2(1H)-il)amino]

carbonil]-4 metil

benzenossulfonamida

log P (25 oC) 2,295 ± 0,326 3,076 ± 0,475 3,446 ± 0,536 1,610 ± 0,245

Volume Molar

(20 °C, 760 Torr) 207,4 ± 3,0 cm

3/mol 362,9 ± 5,0 cm

3/mol 378,8 ± 5,0 cm

3/mol 239,2 ± 5,0 cm

3/mol

Massa Molecular 276,74 g 494,00 g 490,62 g 323,41 g

pKa (grupo ácido/25oC) 4,71 ± 0,10 5,11 ± 0,10 5,10 ± 0,10 6,07 ± 0,10

pKa (grupo básico/25oC) -1,57 ± 0,70 -1,63 ± 0,20 -1,48 ± 0,60 3,89 ± 0,20

38

Quadro 1.3 (Continuação)


Solubilidade

Praticamente insolúvel:

Água

Facilmente solúvel:

Acetona

Cloreto de metileno

Solúvel:

Etanol


Água

Éter etílico

Pouco solúvel:

Metanol

Etanol

Clorofórmio

Ligeiramente solúvel:

Cloreto de metileno

Solúvel:

Dimetilformamida


Água

Pouco solúvel:

Metanol

Ligeiramente solúvel:

Cloreto de Metileno

Solúvel:

Dimetilformamida

Praticamente insolúvel

Água

Pouco solúvel

Etanol

Ligeiramente solúvel

Acetona

Facilmente Solúvel

Cloreto de metileno

39

Encontram-se descritos na literatura inúmeros métodos para quantificação de

sulfoniluréias isoladamente ou associadas a fármacos de outras classes de

antidiabéticos orais.

Em trabalho desenvolvido para quantificar glimepirida em formulações

farmacêuticas, empregaram-se coluna C18 250 x 4,6 mm, 5 μm, detecção em 228

nm, vazão de 0,5 ml/min e fase móvel composta por acetonitrila e solução de ácido

fórmico 2%, pH 3,5 (80:20). O tempo de retenção foi de 7 minutos [14].

Em outro trabalho, com o intuito de determinar gliclazida, utilizaram-se coluna C18,

detecção em 230 nm, fase móvel composta de solução aquosa de fosfato de sódio

monobásico 0,1% p/v pH 2,1 ajustado com ácido fosfórico e acetonitrila (34:66). O

tempo de retenção foi de 5,4 minutos [15].

Em estudo realizado em 2011 empregou-se método por HPLC, modo isocrático,

para análise de comprimidos contendo glibenclamida. Para esta análise foram

utilizados coluna C18 250 x 4,6 mm, 5 µm, vazão de 1,0 ml/min e volume de injeção

20 µl. A análise foi realizada a temperatura ambiente e leitura em 210 nm. O tempo

de retenção da glibenclamida foi de 3,0 minutos [16].

Em estudo publicado em 2010, para determinação de clorpropamida e substâncias

relacionadas, empregou-se coluna C18 250 x 4,6 mm, 5 µm, vazão de 1,0 ml/min,

fase móvel composta de acetonitrila e diidrogenofosfato de amônia pH 3,5 ajustado

com ácido fosfórico (62,5:37,5) [17].

Há também na literatura a descrição de métodos para determinação simultânea de

antidiabéticos. Foi desenvolvido e validado método para determinação simultânea de

glibenclamida, gliclazida, glipizida, pioglitazona, repaglinida e rosiglitazona em

formulações farmacêuticas e em plasma. Empregaram-se coluna C18 250 x 4,6 mm,

5 μm, vazão de 1,0 ml/min, detecção em 260 nm e programa de gradiente de fase

móvel, composto por A (solução aquosa de ácido fórmico 0,05 M pH 3.0), B

(Água:Acetonitrila 5:95) e C (Água:Metanol 10:90). Na Figura 1.3 há um

cromatograma referente à análise [18].

40

Figura 1.3 - Cromatograma de rosiglitazona (1), pioglitazona (2), glipizida (3), gliclazida (4),

glibenclamida (5), celecoxibe - padrão interno (6) e repaglinida (7). (a) branco, (b) plasma humano contaminado com os padrões dos antidiabéticos e padrão interno (c) mistura sintética

contendo antidiabéticos e o padrão interno [18]

Outros pesquisadores desenvolveram método para determinação simultânea de

glipizida, rosiglitazona, pioglitazona, glibenclamida e glimepirida em formulações de

comprimidos. Foram utilizados fase móvel composta por solução aquosa de

trietanolamina 0,05% v/v (pH 3,5, ajustado com ácido ortofosfórico), acetonitrila

(ACN) e metanol (55:15:30), vazão de 1 ml/min, coluna C18 150 × 4,6 mm, 5 μm. Os

fármacos foram monitorados em 248 nm e separados em 20 minutos [19].

Nota-se que na maioria dos métodos de análise desenvolvidos para determinação

de sulfoniluréias isoladamente ou em associações, colunas cromatográficas

convencionais, com partículas porosas de 5 µm, foram utilizadas. Foi encontrada

apenas uma referência na qual coluna monolítica (C18 100 x 4,6 mm) foi aplicada na

determinação simultânea de glibenclamida e glimepirida e suas respectivas

substâncias relacionadas. A fase móvel foi preparada misturando-se ACN e tampão

pH 3,0 (55:45) e o comprimento de onda de detecção foi de 228 nm. O tempo de

análise foi de 1,6 minutos [20].

Há, nas principais farmacopeias, métodos analíticos para determinação das

sulfoniluréias em estudo. No Quadro 1.4 há um resumo dos métodos farmacopeicos

de análise dos insumos farmacêuticos ativos e comprimidos de clorpropamida,

glibenclamida, gliclazida e glimepirida e no Quadro 1.5 encontram-se os parâmetros

41

de análise dos métodos farmacopeicos que empregam sistemas de HPLC para

determinação desses antidiabéticos.

Quadro 1.4 - Métodos farmacopeicos de análise de CL, GB, GM e GZ


Farmacopeia

Brasileira

(F.Bras) 5ª Ed.

[11]

Insumo

Farmacêutico Ativo

HPLC; Volumetria

de neutralização

Comprimido

HPLC; UV

Insumo

Farmacêutico Ativo

HPLC; Volumetria

de neutralização

Comprimido

HPLC

_

Insumo

Farmacêutico Ativo

Volumetria de

neutralização

Farmacopeia

Americana

(USP) 34ª Ed.

[12]

Insumo

Farmacêutico Ativo

HPLC

Comprimido

HPLC

Insumo

Farmacêutico Ativo

HPLC

Comprimido

HPLC

Insumo

Farmacêutico Ativo

HPLC

Comprimido

HPLC

_

Farmacopeia

Européia

(Eur.) 7a Ed.

[13]

_

Insumo

Farmacêutico Ativo

Volumetria de

neutralização

Insumo

Farmacêutico Ativo

HPLC

_

Farmacopeia

Britânica

(BP) BP 2011

[21]

Insumo

Farmacêutico Ativo

Volumetria de

neutralização

Comprimido

UV

Insumo

Farmacêutico Ativo

Volumetria de

neutralização

Comprimido

HPLC

Insumo

Farmacêutico Ativo

HPLC

Insumo

Farmacêutico Ativo

Volumetria de

neutralização

Comprimido

HPLC

42

Quadro 1.5 - Parâmetros analíticos dos métodos cromatográficos farmacopeicos para determinação de CL, GB, GM e GZ


F. Bras.

5ª Ed.

[11]

Insumo Farmacêutico Ativo

C18 150 x 4,6 mm, 5 μm

T = 30 oC Vinj = 20 μl

= 240 nm V = 1,5 ml/min

FM = Ácido acético glacial (1:100) e

ACN (50:50)

Conc. = 0,05 mg/ml em FM

Comprimido

Mesmo método do insumo

farmacêutico ativo da F. Bras.


C8 150 x 4,6 mm, 5 μm

T= 30 oC Vinj = 20 μl

= 230 nm V = 1,5 ml/min

FM = Tampão fosfato pH 3,0 e ACN

(45:55)

Conc. = 5,5 μg/ml em tampão

fosfato pH 7,3

Comprimido


farmacêutico ativo da F. Bras, exceto:


(47:53)

Conc. = 0,2 mg/ml em metanol e água

(10:1)

_ _

USP

34ª Ed.

[12]


Mesmo método insumo

farmacêutico ativo e comprimido da

F. Bras exceto:

C18 250 x 4,6 mm


C8 4,6 × 250 mm

T = 30 oC Vinj = 10 µl

= 254 nm V = 2 ml/min

FM = Fosfato de amônio e ACN pH

5,25

Conc. = 0,416 mg/ml

Obs: A progesterona é padrão interno


C18 4,0 x 250 mm

T = 30 oC Vinj = 20 µl

= 228 nm V = 1 ml/min

FM = Tampão fosfato pH 2,1-2,7 e

ACN (50:50)

Conc. = 0,2 mg/ml em ACN e água

(4:1)

_

43

Quadro 1.5 (Continuação)


USP

34ª Ed.

[12]

Comprimido


farmacêutico ativo e comprimido

da F. Bras, exceto:

Coluna = C18 250 x 4,6 mm

Comprimido


farmacêutico ativo da USP

Comprimido


farmacêutico ativo da USP, exceto:

C18 4,0 x 125 mm


(9:1)

_

Eur.

7a Ed.

[13]

_ _


C18 4,0 x 250 mm, 4 μm

T = 30 oC Vinj = 20 μl

= 228 nm V = 1 ml/min


(50:50)


(4:1)

_

BP

BP2011

[21]

_

Comprimido

C18 100 x 4,6 mm, 5 μm

T= 30 oC Vinj = 20 μl

= 300 nm V = 1,5 ml/min

FM = Tampão fosfato de potássio

monobásico pH 3,0

e ACN (53:47).

Conc. = 0,23 mg/ml em metanol e água

(10:1)



farmacêutico ativo da Eur.

Comprimido

C8 4,0 x 250 mm, 4 μm

Vinj = 20 μl

= 235 nm

V = 0,9 ml/min

FM = Trietanolamina, ácido

trifluoroacético, ACN e água

(0,1:0,1:45:55)


(2:3)

44

1.4 Curva de Van Deemter

Curva de Van Deemter (Figura 1.4) é aquela na qual se plota a altura do prato

teórico (H) em função da velocidade linear da fase móvel (u0). O hábito de plotar (H x

u0) surgiu devido ao interesse pela relação entre o alargamento do pico e a vazão da

fase móvel. Por meio da curva de Van Deemter é possível determinar a velocidade

linear (diretamente relacionada à vazão da fase móvel) na qual a altura do prato

teórico (diretamente relacionado ao alargamento do pico) é mínima, ou seja,

velocidade na qual a eficiência é máxima. Um prato teórico representa uma etapa de

equilíbrio do soluto entre as fases móvel e estacionária. Dessa maneira, a altura de

um prato teórico está relacionada ao comprimento da coluna necessário para que

esse equilíbrio ocorra. Quanto menor a altura do prato, mais estreita será a largura

de uma banda cromatográfica e maior será a eficiência [22,23].

Figura 1.4 - Curva de Van Deemter [23]

Para a elaboração desse gráfico varia-se a vazão da fase móvel que a coluna é

submetida. Para cada valor de vazão um pico é obtido, e a ele correspondem

determinado número de pratos teóricos (N) e determinado tempo de retenção (tr). O

par (N, tr) é transformado no par (H, u0) por meio das equações (1.1) e (1.2) [23].

45

N

LH (1.1)

10 kt

Lu

r

(1.2)

H = altura do prato teórico, L = comprimento da coluna, N = número de pratos

teóricos, u0 = velocidade linear da fase móvel, tr = tempo de retenção, k = fator de

retenção.

O cálculo de k, necessário para estimar u0, é realizado utilizando-se a equação (1.3)

[24].

0

0

t

ttk r (1.3)

k = fator de retenção, tr = tempo de retenção e t0 = tempo morto.

2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Foram objetivos dessa etapa do trabalho:

1- Desenvolver e otimizar método por cromatografia líquida utilizando coluna

convencional com partículas porosas de 5 µm de diâmetro (CV), para a

determinação simultânea dos antidiabéticos orais clorpropamida (CL), glibenclamida

(GB), glimepirida (GM) e gliclazida (GZ).

2- Transferir o método desenvolvido em coluna convencional para método de

separação em coluna monolítica (MN), coluna com partículas de núcleo fundido (NF)

e coluna com partículas porosas de diâmetro inferior a 2 μm (Sub 2 μm).

46

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais

3.1.1 Insumos farmacêuticos ativos

A identificação do fabricante, número de lote, pureza e validade dos insumos

farmacêuticos ativos clorpropamida, adquirido na farmácia artesanal, glibenclamida,

gentilmente cedido pela Fundação Ezequiel Dias, e glimepirida e gliclazida,

gentilmente cedidos pela CIFARMA, estão descritos na Tabela 1.1.

Tabela 1.1 - Fabricante, número de lote, pureza e validade dos insumos farmacêuticos ativos

dos fármacos CL, GB, GM e GZ

Insumo Fabricante Lote Pureza Validade

Clorpropamida - CP1007 100,12% 06/2015

Glibenclamida Cadila Pharmaceuticals 0GLL009 99,50% 12/2014

Glimepirida Mantena lab GD/021/11/2011 99,96% 10/2016

Gliclazida Shandong Keyuan

Pharmaceutical 0809130 99,10% 09/2012

3.1.2 Solventes, reagentes e vidrarias

Acetato de amônio Synth (Diadema, Brasil), ácido acético glacial Vetec (Duque de

Caxias, Brasil), acetonitrila grau HPLC Sigma Aldrich (St Louis, Estados Unidos da

America), uracila (Sigma Aldrich, St. Louis, Estados Unidos da America) membrana

de celulose regenerada com porosidade de 0,22 μm Sartorius (Goettingen,

Alemanha), dispositivos filtrantes de celulose regenerada Minisart 15 mm x 0,45 μm

(Goettingen, Alemanha), água ultra pura, pipetas e balões volumétricos calibrados,

béqueres, erlenmeyers, kit de filtração.

3.1.3 Equipamentos e colunas cromatográficas

Ultrapurificador de água (Millipore modelo Direct Q3), ultrassom (Max clean modelo

1400), balança analítica (Sartorius com precisão de 0,01 mg modelo BP210D),

47

UHPLC (Waters Acquity® UPLC), potenciômetro (Metrohm modelo 827 pH lab),

coluna com partículas porosas (ACE, C18, 100 x 2,1 mm, 5 µm - Convencional),

coluna com partículas de núcleo fundido (Poroshell®, Agilent, C18, 100 x 2,1 mm, 2,7

µm - Núcleo Fundido), coluna com partículas porosas (Zorbax®, Agilent, C18, 100 x

2,1 mm, 1,8 µm - Sub 2 μm), coluna monolítica (Onyx®, Phenomenex, C18, 100 x 2,0

mm - Monolítica)

3.2 Métodos

3.2.1 Desenvolvimento de método analítico por cromatografia líquida para a

determinação de CL, GB, GM e GZ em coluna CV

A seleção da fase móvel e diluente do método analítico para a determinação de CL,

GB, GM e GZ foi realizada com base nos métodos para quantificação de

sulfoniluréias descritos na literatura e nas características físico químicas dos

fármacos. O objetivo era que o diluente selecionado tivesse composição similar à

fase móvel, de maneira a evitar o alargamento dos picos cromatográficos.

Após seleção preliminar da fase móvel e do diluente foi realizada uma corrida

exploratória de varredura na região do ultravioleta (200-400 nm) de uma solução

contendo 250 μg/ml de cada um dos antidiabéticos, utilizando as condições

analíticas preliminares descritas na Tabela 1.2. Para obtenção dessa solução partiu-

se de soluções estoques de cada um dos antidiabéticos, a 1 mg/ml, preparadas em

ACN:água (4:1) e submetidas a banho de ultra som por 5 minutos. Posteriormente

realizaram-se diluições dessas soluções estoques de modo a obter uma solução de

trabalho com os quatro antidiabéticos na concentração de 250 μg/ml. O volume da

solução de trabalho foi completado com ACN:solução de acetato de amônio 5 mM

pH 3,0 (50:50). O objetivo dessa corrida exploratória de varredura foi determinar o

comprimento de onda de análise ideal, ou seja, aquele capaz de detectar

seletivamente os quatro antidiabéticos e propiciar a maior absorção possível.

48

Tabela 1.2 - Condições analíticas preliminares*

* Foram utilizados loop de 10 μl, tubo de poli éter cetona (poly ether-ether-ketone - PEEK) de 0,004 polegada e frequência de aquisição dos dados/constante de tempo do detector iguais a 20 Hz/0,1 s.

3.2.2 Otimização de método analítico por cromatografia líquida para a determinação

de CL, GB, GM e GZ em coluna CV

Após seleção das condições cromatográficas preliminares e do comprimento de

onda da análise, algumas condições cromatográficas foram otimizadas. Inicialmente

foram testadas três fases móveis com diferentes proporções de ACN e solução de

acetato de amônio 5 mM pH 3,0. Utilizando a fase móvel selecionada, foram

testadas três concentrações de trabalho. Em seguida, utilizando a fase móvel e a

concentração de trabalho selecionadas, testaram-se três volumes de injeção. Por

último, fazendo-se uso da fase móvel, concentração de trabalho e volume de injeção

selecionados, três temperaturas foram avaliadas. O esquema de otimização está

sumarizado na Tabela 1.3.

Em cada condição teste apresentada na Tabela 1.3, dez diferentes vazões de fase

móvel, variando de 0,02 a 0,6 ml/min, foram experimentadas. Determinaram-se o

número de pratos teóricos e o tempo de retenção dos picos referentes aos quatro

fármacos, em cada vazão avaliada, em cada condição teste. Outro parâmetro

determinado em cada vazão avaliada e em cada condição teste foi o tempo morto da

coluna. Para estimativa do tempo morto, injetaram-se 2 μl de uracila (10 μg/ml).

Parâmetros Condições

Fase móvel ACN:Solução de acetato de amônio 5mM pH 3,0

(50:50)

Vazão da fase móvel 0,2 ml/min

Volume de injeção 2 μl

Coluna C18 100 x 2,1 mm, 5 μm

Temperatura da coluna 30 oC

Solução de CL, GB, GM e GZ 250 μg/ml em fase móvel

Comprimento de onda 200-400 nm

49

Tabela 1.3 - Otimização das condições cromatográficas em coluna convencional

Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Experimento 4

Fase Móvel Concentração Volume de injeção Temperatura

ACN:Solução (55:45)* 250 μg/ml 5 μl 30 oC

ACN :Solução (50:50)* 100 μg/ml 2 μl 35 oC

ACN:Solução(45:55)* 20 μg/ml 1 μl 40 oC

Condições

cromatográficas

Conc. = 250 μg/ml

Vinj = 2 μl

T = 30 oC

= 230 nm

V = 0,02 a 0,6 ml/min

Condições

cromatográficas

FM = Escolhida no

experimento 1

Vinj = 2 μl

T = 30 oC

= 230 nm

V = 0,02 a 0,6 ml/min

Condições

cromatográficas

FM = Escolhida no

experimento 1

Conc . = Escolhida no

experimento 2

T = 30 oC

= 230 nm

V = 0,02 a 0,6 ml/min

Condições

cromatográficas

FM = Escolhida no

experimento 1

Conc. = Escolhida no

experimento 2

Vinj = Escolhido no

experimento 3

= 230 nm

V = 0,02 a 0,6 ml/min

*Solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0

A partir dos dados de número de pratos teóricos, tempo de retenção e tempo morto,

foi construída uma curva de Van Deemter para cada antidiabético em cada condição

testada. Para os cálculos foram utilizadas as equações (1.1), (1.2) e (1.3).

A seleção da fase móvel, concentração, volume de injeção e temperatura ideais

foram realizadas com base na análise das curvas de Van Deemter e também com

base na análise dos parâmetros fator de retenção (k), resolução (Rs), fator de

assimetria dos picos (As) e pressão do sistema cromatográfico (P).

3.2.3 Transferência do método desenvolvido em coluna CV para as colunas MN, NF

e Sub 2 μm

O método desenvolvido e otimizado para análise de antidiabéticos orais em coluna

convencional foi aplicado às colunas cromatográficas empacotadas com partículas

sub 2 μm, com partículas de núcleo fundido e coluna monolítica. Todos os

parâmetros cromatográficos estabelecidos no método desenvolvido e otimizado na

coluna convencional foram mantidos, exceto a proporção de acetonitrila e solução

de acetato de amônio na fase móvel. A constituição da fase móvel foi ajustada para

50

cada coluna cromatográfica em estudo, de forma que os fatores de retenção de

todos os antidiabéticos fossem próximos aos verificados na coluna convencional. O

cálculo de k foi realizado utilizando-se a equação (1.3).

Para ajustar o percentual de acetonitrila e solução de acetato de amônio realizou-se

uma corrida, em cada coluna, aplicando-se o método desenvolvido e otimizado na

coluna convencional. Naquelas colunas em que a retenção foi superior à observada

na coluna convencional, aumentou-se o percentual de acetonitrila progressivamente

até que valores de k próximos aos objetivados fossem alcançados. Já nas colunas

nas quais a retenção foi inferior à observada na coluna convencional, reduziu-se o

percentual de acetonitrila até que valores de k próximos aos de interesse fossem

atingidos.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Desenvolvimento de método analítico por cromatografia líquida para a


Verificou-se que nos métodos descritos na literatura para determinação simultânea

de sulfoniluréias foram utilizadas fases móveis compostas por uma mistura de

solvente orgânico e tampão com pH em torno de 3,0. Por isso tentou-se,

inicialmente, a utilização de solução de acetato de amônio pH 3,0 e acetonitrila, na

proporção de 50:50. Com base no pKa dos fármacos (CL - pKa 4,71 e -1,57;

GB - pKa 5,11 e -1,63; GM - pKa 5,10 e -1,48; GZ - pKa 6,07 e 3,89), espera-se que

em pH 3,0 aproximadamente 98% das moléculas de clorpropamida e 100% das

moléculas de glibenclamida e glimepirida estariam na forma não ionizada e que 90%

das moléculas de gliclazida estariam na forma ionizada. A seleção de um valor de

pH que propicie que a totalidade ou a quase totalidade das moléculas de

determinado analito estejam em sua forma ionizada ou não ionizada é importante

para evitar o alargamento dos picos [24].

Tentou-se inicialmente, sem sucesso, dissolver os insumos dos antidiabéticos em

acetonitrila. Posteriormente tentou-se a mistura ACN:água (4:1), sugerida como

diluente do padrão de glimepirida pelas farmacopeias européia 7ª edição e

51

americana 34a edição. A mistura ACN:água (4:1) foi capaz de solubilizar todos os

quatro antidiabéticos orais, após banho de ultra som de 5 minutos, produzindo

soluções estoque de 1 mg/ml de cada um deles.

Os espectros de varredura dos antidiabéticos utilizando as condições analíticas

descritas na Tabela 1.2 estão apresentados na Figura 1.5.

Figura 1.5 - Espectros de varredura dos antidiabéticos

A partir da análise dos espectros foi selecionado 230 nm como o comprimento de

onda ideal, capaz de propiciar absortividades próximas às máximas de todos os

quatro fármacos.

4.2 Otimização de método analítico por cromatografia líquida para a


Quatro parâmetros do método analítico desenvolvido em coluna convencional foram

otimizados: fase móvel, concentração de trabalho, volume de injeção e temperatura.

4.2.1 Fase móvel

O primeiro parâmetro otimizado foi a proporção de ACN e da solução de acetato de

amônio na fase móvel. As curvas de Van Deemter referentes aos quatro

antidiabéticos (Figuras 1.6, 1.7, 1.8 e 1.9), em cada uma das três fases móveis

testadas, são mostradas a seguir.

52

Figura 1.6 - Curvas de Van Deemter da CL em diferentes fases móveis

Figura 1.7 - Curvas de Van Deemter da GZ em diferentes fases móveis

Figura 1.8 - Curvas de Van Deemter da GB em diferentes fases móveis

8

12

16

20

24

28

32

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00

H (

µm

)

u0 (mm/s)

45% ACN

50% ACN

55% ACN

8

12

16

20

24

28

32

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00

H (

µm

)

u0 (mm/s)

45% ACN

50% ACN

55% ACN

8

12

16

20

24

28

32

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00

H (

µm

)

u0 (mm/s)

45% ACN

50% ACN

55% ACN

53

Figura 1.9 - Curvas de Van Deemter da GM em diferentes fases móveis

Percebe-se que em todos os gráficos as curvas estão praticamente sobrepostas,

indicando que em termos de eficiência cromatográfica, não há grande diferença

entre as fases móveis testadas. Para exemplificar, considere-se a Figura 1.7,

referente às curvas de Van Deemter da gliclazida. A eficiência máxima alcançada

com as três fases móveis ocorreu em velocidade linear próxima a 0,6 mm/s, com

uma altura de prato teórico H em torno de 11 μm.

Outro parâmetro cromatográfico avaliado para as três fases móveis foi o fator de

retenção dos quatro analitos. Os resultados estão apresentados na Figura 1.10.

Figura 1.10 - Relação entre percentual de ACN na fase móvel e k dos antidiabéticos

Percebe-se que quanto maior o percentual de acetonitrila menor é a retenção dos

fármacos, já que em cromatografia de fase reversa a maior proporção de solvente

8

12

16

20

24

28

32

0 1 2 3 4 5

H (

μm

)

u0 (mm/s)

45% ACN

50% ACN

55% ACN

0

2

4

6

8

10

40 45 50 55 60

K

% ACN

GM

GB

GZ

CL

54

orgânico contribui para o aumento da força eluotrópica da fase móvel. Além disso,

quanto menor a força eluotrópica da fase móvel, maior é a diferença entre os valores

de k dos analitos, o que permite uma separação mais eficiente. Conclui-se também

que os analitos menos retidos, como a clorpropamida, têm o valor de k menos

influenciado por variações na força da fase móvel do que os analitos mais retidos,

como a glimepirida. Considerando que idealmente o fator de retenção deve estar

entre 1 e 10 [24], a fase móvel composta por 55% de acetonitrila não seria

adequada, já que a clorpropamida apresentou k = 0,95 nessa condição.

De acordo com a teoria cromatográfica, o aumento do fator de retenção vem

acompanhado da redução do Hmin, ou seja, aumento da eficiência [24]. Sendo assim,

seria esperado que a fase móvel constituída por ACN:solução de acetato de amônio

5mM pH 3,0 (45:55) propiciasse análises mais eficientes, com menor Hmin.

Entretanto, nenhuma diferença significativa foi observada entre a eficiência gerada

pelas três fases móveis. Uma hipótese para explicar esse comportamento é que a

fase móvel constituída por ACN:solução de acetato de amônio 5mM pH 3,0 (45:55) é

mais viscosa (η ACN:solução de acetato de amônio (45:55): 0,78 cp e η ACN:solução de acetato de amônio

(55:45): 0,69 cp - valores calculados com base na η da água e da ACN). Sabe-se que

o aumento de viscosidade contribui para a redução da eficiência cromatográfica [24].

Sendo assim, com a redução do percentual de solvente acetonitrila tem-se o

aumento de k dos analitos, que é favorável à melhora da eficiência, mas ao mesmo

tempo há um aumento da viscosidade da fase móvel, que é desfavorável.

A resolução entre os picos também foi avaliada. Para exemplificar plotou-se na

Figura 1.11 a resolução (Rs) entre o par de picos adjacentes mais próximos

(glimepirida e glibenclamida), em função da vazão, para cada fase móvel.

Figura 1.11 - Relação entre vazão e Rs (GM/GB) nas diferentes fases móveis

0

1

2

3

4

5

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80

Rs G

M/G

B

Vazão (ml/min)

45% ACN

50% ACN

55% ACN

55

Com qualquer uma das fases móveis, em qualquer vazão testada, a resolução entre

o par de picos refrentes a glimepirida e glibenclamida está adequada, pois foi

superior a 2,0 [25]. Analisando-se a Figura 1.11 percebe-se que em qualquer vazão,

quanto maior a força eluotrópica da fase móvel, menor é a resolução. Isso é

justificado, pois o aumento da força da fase móvel promove redução da seletividade

(α) e redução de k, parâmetros que afetam diretamente a resolução (equação 1.4). É

interessante destacar que o formato da curva de resolução x vazão é similar ao

formato da curva de Van Deemter invertida, já que a resolução é proporcional a N .

k

kNRs

1)1(4/1 (1.4)

Rs = Resolução, α = seletividade, N = número de pratos teóricos e k = fator de

retenção

Por último, avaliou-se a pressão do sistema (Figura 1.12) e o fator de assimetria (As)

dos picos (Tabela 1.4) nas diferentes fases móveis.

Figura 1.12 - Relação entre vazão e pressão do sistema nas diferentes fases móveis

0

20

40

60

80

100

120

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80

Pre

ssão

(b

ar)

Vazão (ml/min)

45% ACN

50% ACN

55% ACN

56

Tabela 1.4 - Fatores de assimetria dos picos dos antidiabéticos nas diferentes fases móveis

Antidiabético Fator de assimetria médio*

ACN:Solução (45:55)** ACN:Solução (50:50)** ACN:Solução (55:45)**

Clorpropamida 1,21 1,24 1,26

Gliclazida 1,08 1,12 1,16

Glibenclamida 1,03 1,05 1,08

Glimepirida 1,05 1,05 1,07

* Média dos fatores de assimetria nas 10 vazões analisadas ** Solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0

Como esperado, quanto maior o percentual de solvente orgânico na fase móvel,

menor é a pressão gerada no sistema, o que é consequência da redução da

viscosidade da fase móvel [24]. Entretanto, na prática, em todas as vazões testadas

a diferença entre os valores de pressão verificados em função da fase móvel não foi

significativa. O mesmo pode-se dizer em relação à simetria dos picos: apesar das

pequenas diferenças, na prática, empregando-se qualquer uma das fases móveis,

picos com fatores de assimetria dentro da faixa ideal de 0,8-1,8 foram obtidos [26].

Vale destacar que apesar de não haver diferença significativa na assimetria dos

picos em função do percentual de ACN na fase móvel, observa-se que os fatores de

assimetria se aproximam do valor ideal (As = 1) com a redução do percentual de

ACN e consequente aumento de k dos analitos (conforme Figura 1.10). Esse

comportamento (melhora da simetria do pico com aumento de k) ocorre quando são

os efeitos extracoluna os principais responsáveis pela piora da simetria dos picos

[24].

Considerando os resultados e as discussões, a fase móvel constituída por 55% de

acetonitrila não foi selecionada, já que com essa fase móvel o k da clorpropamida foi

inferior a 1 (k = 0,95). Os outros parâmetros avaliados (eficiência, resolução, pressão

e assimetria) não justificam a escolha da fase móvel constituídas por 50% ou 45%

de acetonitrila. Sendo assim, optou-se pela fase móvel selecionada preliminarmente,

constituída por 50% de acetonitrila e 50% de solução de acetato de amônio 5 mM

pH 3,0, objetivando-se a obtenção de uma análise mais rápida.

57

4.2.2 Concentração

Após seleção da fase móvel otimizou-se a concentração de trabalho dos

antidiabéticos. As concentrações de 20, 100 e 250 μg/ml foram testadas. Os

resultados obtidos com soluções de concentração igual a 20 μg/ml não foram

reprodutíveis, provavelmente em consequência da baixa relação sinal ruído, e não

foram considerados.

Para exemplificar, as curvas de Van Deemter obtidas para a glimepirida, nas

concentrações de 100 e 250 μg/ml, estão apresentadas na Figura 1.13.

Figura 1.13 - Curvas de Van Deemter da GM nas concentrações de 100 e 250 μg/ml

Verifica-se que as duas curvas se sobrepõem, indicando que em termos de

eficiência cromatográfica as concentrações testadas se equivalem. O mesmo

comportamento foi observado para os outros três antidiabéticos.

A assimetria e resolução entre os picos também foram avaliadas. Os fatores de

assimetria nas duas concentrações (100 e 250 µg/ml) foram próximos (Tabela 1.5)

e dentro da faixa ideal (0,8-1,8) [26]. Os valores de resolução entre os picos foram

todos superiores a 2,0, valor mínimo aceitável [25] e praticamente não houve

diferença entre os valores de resolução obtidos nas duas concentrações

experimentadas. Para exemplificar: a resolução média nas 10 vazões

experimentadas entre o par de picos adjacentes mais próximos (glibenclamida e

glimepirida) foi igual a 3,47 para a concentração de 250 µg/ml e igual a 3,51 para a

concentração de 100 µg/ml.

8

12

16

20

24

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00

H (

μm

)

u0 (mm/s)

250 μg/ml

100 μg/ml

58

Tabela 1.5 - Fatores de assimetria dos picos dos antidiabéticos nas concentrações de 100 e

250 μg/ml

Antidiabético Fator de assimetria médio*

250 μg/ml 100 μg/ml

Clorpropamida 1,24 1,23

Glibenclamida 1,05 1,07

Glimepirida 1,05 1,05

Gliclazida 1,12 1,12

* Média da dos fatores de assimetria nas 10 vazões experimentadas

Como não houve diferença em termos de eficiência, resolução e fator de assimetria

entre as concentrações de 100 e 250 μg/ml, optou-se pela seleção da concentração

de 100 μg/ml, objetivando a simplificação dos cálculos durante a validação dos

métodos analíticos no capítulo 5 desse trabalho.

4.2.3 Volume de injeção

Após seleção da fase móvel e concentração ideais, avaliaram-se os seguintes

volumes de injeção: 1, 2 e 5 μl. Com a finalidade de evitar a dispersão da amostra e

consequente redução da eficiência cromatográfica, o volume de injeção deve ser

reduzido, embora volumes de injeção muito pequenos possam conduzir a uma baixa

detectabilidade do método [24,27]. Faz-se necessário, portanto, otimizar o volume

de injeção objetivando eficiência cromatográfica e detectabilidade satisfatórias.

A seguir encontram-se apresentadas as curvas de Van Deemter da clorpropamida

(Figura 1.14) e glimepirida (Figura 1.15), nos três volumes de injeção testados.

Os resultados da clorpropamida e glimepirida foram selecionados como exemplos

porque eles representam os analitos de menor (k = 1,3) e maior retenção (k = 5,2),

respectivamente.

59

Figura 1.14 - Curvas de Van Deemter da CL nos diferentes volumes de injeção

Figura 1.15 - Curvas de Van Deemter da GM nos diferentes volumes de injeção

Analisando-se os gráficos apresentados nas Figuras 1.14 e 1.15 percebe-se que

para a glimepirida, independente do volume de injeção, o valor de Hmin está em

torno de 10 μm. Já para a clorpropamida a eficiência varia em função do volume de

injeção. Quando 5 μl foram injetados o valor mínimo de H obtido ficou em torno de

21 μm. Já com as injeções de 1 e 2 μl a eficiência foi superior, e valores de Hmin

menores, em torno de 17 μm, foram obtidos.

Esse comportamento pode ser explicado porque o volume de injeção máximo que

não contribue excessivamente para o alargamento depende do fator de retenção

dos compostos de interesse. Em geral, podem ser injetados volumes maiores de

analitos mais retidos sem que ocorra alargamento excessivo do pico [27]. Esse fato

pode ser comprovado pela equação 1.5 [28].

10

15

20

25

30

35

40

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00

H (

µm

)

u0 (mm/s)

1

2

5

10

15

20

25

30

35

40

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00

H (

μm

)

u0 (mm/s)

1

2

5

60

N

KVV r

inj

(1.5)

Vinj = volume de injeção, = fração do alargamento do pico, Vr = volume de

retenção, K = constante característica da qualidade da injeção normalmente igual a

2, N = número de pratos teóricos

Analisando-se a equação 1.5 verifica-se que considerando um mesmo volume de

injeção, analitos mais retidos (maior Vr e, portanto, maior fator de retenção k)

sofrerão menor alargamento (menor ).

Sendo assim, como a glimepirida possui maior fator de retenção (k = 5,2), o pico

relativo a ela sofreu menor alargamento quando o volume de injeção de 5 μl foi

injetado, tendo apresentado eficiência semelhante às verificadas quando volumes

de 1 e 2 μl foram utilizados. Já o pico da clorpropamida (k = 1,3) sofreu maior

alargamento quando 5 μl foram injetados, o que explica o fato de a eficiência

cromatográfica com esse volume de injeção ter sido inferior a eficiência observada

quando 1 e 2 μl foram injetados. O comportamento da gliclazida (k = 2,7) e da

glibenclamida (k = 4,2) foi similar ao da clorpropamida, ou seja, houve redução da

eficiência (aumento de Hmin) quando 5 μl foram injetados.

Considerando o exposto, os volumes de injeção de 1 e 2 μl poderiam ser utilizados,

já que garantem uma maior eficiência cromatográfica dos quatro antidiabéticos

quando comparados ao volume de injeção de 5 μl. Analisando-se os parâmetros

assimetria e resolução entre os picos, percebe-se que os volumes de 1 e 2 μl se

mostraram novamente equivalentes: valores de fator de assimetria e resolução

similares e satisfatórios (0,8<As<1,8 e Rs>2,0) [25, 26] foram obtidos. Para

exemplificar: a resolução média nas 10 vazões experimentadas, entre o par de

picos mais crítico (glibenclamida e glimepirida), foi igual a 3,49 para o volume de

injeção de 1 μl e igual a 3,51 para o volume de injeção de 2 μl; o fator de assimetria

médio do pico de glibenclamida nas 10 vazões testadas foi igual a 1,09 para o

volume de injeção de 1 μl e igual a 1,07 para o volume de injeção de 2 μl.

61

Deve-se destacar que com os volumes de injeção de 1 e 2 μl picos com relações

sinal/ruído superiores a 10, adequadas à quantificação [29], foram gerados. Ao final,

arbitrariamente, optou-se pela seleção do volume de injeção de 2 μl.

4.2.4 Temperatura

Por último, foi realizada avaliação da temperatura de análise. Foram avaliadas

temperaturas de 30, 35 e 40 oC. Nenhuma diferença significativa em termos de

eficiência, fator de retenção, resolução, fator de assimetria e pressão foram

observadas. Possivelmente esse comportamento é consequência da pequena

variação de temperatura testada. Optou-se por manter a temperatura de 30 oC

estabelecida preliminarmente, visando aumentar o tempo de vida útil das colunas.

Concluindo, as condições analíticas selecionadas para determinação de

antidiabéticos em coluna convencional foram: fase móvel constituída por ACN:

solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0 (50:50), concentração de trabalho de

100 μg/ml, volume de injeção de 2 μl e temperatura de 30 oC. Nessas condições os

fatores de retenção dos antidiabéticos foram aproximadamente iguais a:

clorpropamida k = 1,3; gliclazida k = 2,7; glibenclamida k = 4,2 e glimepirida k = 5,2.

Na Figura 1.16 há um cromatograma referente à análise dos antidiabéticos em

coluna convencional aplicando-se as condições acima e vazão de 0,4 ml/min.

Figura 1.16 - Cromatograma obtido durante análise de antidiabéticos em coluna

convencional

62

4.3 Transferência do método desenvolvido e otimizado em coluna CV para as

colunas MN, NF e Sub 2 μm

A proporção de acetonitrila e Solução de acetato de amônio 5 mM, pH 3,0 na fase

móvel foi ajustada para cada coluna cromatográfica (MN, NF e Sub 2 μm), de

maneira que os fatores de retenção (k) de todos os antidiabéticos ficassem próximos

aos verificados na coluna convencional. Esse procedimento foi realizado para

permitir a comparação do desempenho das colunas cromatográficas, que será

descrita no capítulo 4. Como os valores de k influenciam na eficiência e formato das

curvas de Van Deemter, devem ser ajustados em todas as colunas [30].

No caso da coluna monolítica, para que a retenção observada na coluna

convencional fosse mantida, foi necessário reduzir a força eluotrópica da fase móvel.

Já com a coluna de partículas sub 2 μm ocorreu o contrário e portanto a manutenção

dos fatores de retenção ocorreu mediante aumento da força eluotrópica da fase

móvel. Apesar de a coluna de núcleo fundido apresentar capacidade de retenção um

pouco menor do que a coluna convencional, na prática nenhum ajuste na força da

fase móvel foi necessário. Na Tabela 1.6 há a descrição das condições selecionadas

para a análise e os valores de k dos antidiabéticos em cada uma das colunas.

Tabela 1.6 - Condições de análise para determinação de antidiabéticos nas diferentes colunas

e valores de k

Colunas

Fase Móvel

Vinj

(μl)

(nm)

T

(oC)

Conc.

(μg/ml) K

Convencional ACN: Solução

(50:50)** 2 230 30 100

CL 1,3 - GB 2,7

GZ 4,2 - GM 5,2

Monolítica ACN: Solução

(43:57)** 2 230 30 100

CL 0,9 - GB 2,2

GZ 4,3 - GM 5,5

Núcleo

Fundido

ACN: Solução

(50:50)** 2 230 30 100

CL 1,3 - GB 2,7

GZ 4,5 - GM 5,6

Sub 2 μm ACN: Solução

(53:47)** 2 230 30 100

CL 1,2 - GB 2,7

GZ 4,2 - GM 5,2

* Foram utilizados loop de 10 μl, tubo de PEEK de 0,004 polegada e frequência de aquisição dos dados e constante de tempo do detector iguais a 20 Hz/0,1 s * *Solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0

63

5 CONCLUSÃO

Método analítico para quantificação de clorpropamida, glibenclamida, glimepirida e

gliclazida foi desenvolvido e otimizado em coluna convencional com partículas

totalmente porosas de 5 μm de diâmetro. Posteriormente, as condições analíticas

selecionadas foram transferidas e otimizadas para a análise dos antidiabéticos

utilizando colunas monolítica, empacotada com partícula de núcleo fundido e

empacotada com partículas totalmente porosas sub 2 μm. O único ajuste realizado

foi na proporção de acetonitrila e solução de acetato de amônio 5mM pH 3,0 na fase

móvel. Esses métodos, descritos na Tabela 1.6, foram utilizados nas etapas

subsequentes desse trabalho.

64


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[28] MEYER, V. R. High-performance liquid chromatographic theory for the practitioner. Journal of Chromatography,v. 334, p.197-209, 1985. [29] BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RE no. 899, de 29 de Maio de 2003. Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. Diário Oficial da União, Brasília, DF, Poder Executivo, de 02 de Junho de 2003c. [30] OLAH, E.; FEKETE, S.; FEKETE, J.; GANZLER, K. Comparative study of new shell-type, sub-2μm fully porous and monolith stationary phases, focusing on mass-transfer resistance. Journal of Chromatography A. v.1217, p. 3642-3653, 2010.

67

CAPÍTULO 2

CARACTERIZAÇÃO FÍSICA DAS COLUNAS

CROMATOGRÁFICAS

68


Nesta revisão serão apresentadas características físicas, vantagens e desvantagens

das colunas cromatográficas: monolítica (MN), empacotada com partículas de núcleo

fundido (NF) e empacotada com partículas porosas de diâmetro inferior a 2 m (Sub

2 m). Além disso, serão realizadas comparações dessas colunas com a coluna

convencional (CV), empacotada com partículas porosas de diâmetro entre 3-5 µm.

1.1 Coluna monolítica

As fases estacionárias monolíticas surgiram no final da década de 80 e início da

década de 90. A popularização dessas fases, entretanto, só aconteceu a partir do

ano 2000, quando monolitos de sílica se tornaram disponíveis comercialmente. Ao

longo dos últimos cinco anos os monolitos, que podem ser feitos de material

orgânico sintético (ex: resina acrílica), natural (ex: celulose) ou material inorgânico

(ex: sílica), foram amplamente difundidos [1, 2].

A fase monolítica de sílica é preparada no formato de um cilindro, pelo processo

“sol-gel”. Esse preparo não ocorre dentro das colunas cromatográficas

convencionais de aço inoxidável, pois após a etapa de secagem o cilindro monolítico

encolhe e perde o contato com a parede interna da coluna cromatográfica. Sendo

assim, materiais especiais, como o PEEK, devem ser utilizado, pois se ajustam mais

facilmente ao diâmetro do monolito de sílica [1].

Em um procedimento típico de preparo de monolitos de sílica pelo processo “sol-

gel”, tetrametoxissilano ou tetraetoxissilano é adicionado a uma solução aquosa de

poli(oxietileno) (agente porogênico) contendo ácido ou base (catalisador). A mistura

é agitada a 0 oC e a solução resultante é colocada dentro de um molde de

policarbonato para que ocorram as reações de hidrólise e policondensação. A

primeira etapa é a formação de um “sol”, suspensão coloidal de espécies sólidas em

um líquido. Em seguida, a suspensão é convertida em gel, por meio de um processo

de policondensação. A amostra na forma de gel é então envelhecida por alguns

dias. O cilindro de sílica úmido formado é colocado em uma solução aquosa para

formar as estruturas mesoporosas. Sucessivas evaporações, secagens e

69

tratamentos térmicos são realizados para decompor os constituintes orgânicos e

estabilizar a superfície do gel hidrofílico de sílica. Após as etapas de envelhecimento

e secagem, o monolito de sílica encolhe dentro do molde. O cilindro monolítico é

retirado do molde e encaixado em um tubo de PEEK, e por meio de aquecimento e

aplicação de pressão externa o tubo de PEEK se ajusta ao monolito, assegurando a

inexistência de espaços vazios. O monolito é posteriormente funcionalizado com o

reagente de interesse [3].

A fase monolítica é um meio contínuo de separação, contendo uma "partícula única".

Possui uma estrutura sólida e altamente porosa, de pequenos domínios, que fornece

elevada eficiência cromatográfica (Figura 2.1) [1].

Figura 2.1 - Micrografia da fase monolítica de sílica [4]

Os domínios do monolito podem ser micro, macro ou mesoporosos. Segundo a

IUPAC, os microporos são poros com diâmetros que não excedem 2 nm (20 Å), os

mesoporos são poros de tamanhos intermediários entre 2 e 50 nm e os macroporos

são definidos como poros com diâmetros superiores a 50 nm (500 Å). Nas colunas

monolíticas de sílica de primeira geração os macroporos, em inglês chamados de

through-pore, são de 2 µm. É principalmente através deles que a fase móvel passa

durante o processo de eluição cromatográfica. Já os mesoporos, chamados em

inglês de skeleton-pore, possuem poros de aproximadamente 13 nm nos monolitos

de primeira geração. São os mesoporos que geram a área superficial, normalmente

entre 50 a 300 m2/g, necessária à separação cromatográfica [1,5]. Na figura 2.2 há

um esquema de uma coluna monolítica e os respectivos macroporos e mesoporos.

http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-40422006000200022&script=sci_arttext#fig1

70

Figura 2.2 - Macroporos de 2 μm (a) e mesoporos de 13 nm (b) da fase monolítica [4]

Característica física importante das colunas monolíticas é a elevada porosidade (ε),

situada em torno de 80% [5]. A alta porosidade justifica os elevados valores de

permeabilidade (Kv0) característicos desse tipo de coluna. Valores de permeabilidade

iguais a 5,00 x 10-14 e 8,00 x 10-14 m2 foram descritos na literatura para a coluna

monolítica da marca Onyx® [6, 7]. Verifica-se que, em consequência da elevada

porosidade e da baixa densidade características das colunas monolíticas, o fator de

retenção (k) dos analitos nesse tipo de coluna é inferior ao observada nas colunas

com partículas porosas convencionais de diâmetro entre 3 e 5 µm. Observa-se

também que colunas monolíticas e convencionais que possuem o mesmo grupo

químico ligante apresentam valores de seletividade (α) próximos, indicando que os

mecanismos que governam a separação em ambas são similares [8].

Como já foi relatado, a geometria dos canais dos monolitos apresentam estrutura

altamente permeável e, portanto, de menor resistência à vazão da fase móvel do

que a gerada pelas partículas porosas presentes nas colunas cromatográficas

convencionais. Sendo assim, é possível realizar análises rápidas, em vazões

elevadas (> 5 ml/min), utilizando instrumentos convencionais de cromatografia

líquida (HPLC), sem que haja aumento da pressão para valores acima do máximo

suportado por eles (400 bar) [1, 2].

Embora as colunas monolíticas apresentem as vantagens mencionadas, menos de

1% dos profissionais que trabalham com cromatografia as utilizam. Os motivos são o

pequeno número de fornecedores (apenas Merck e Phenomenex) e de grupos

químicos ligantes (sílica, C8, C18), inexistência de colunas com comprimento

superior a 100 mm (por limitações durante o processo produtivo), estabilidade

71

química limitada a uma estreita faixa de pH (2-8) e elevado consumo de solvente [9,

10]. Além disso, a limitação do número de fornecedores faz com que o custo das

colunas monolíticas seja elevado. Em cotação realizada no primeiro semetre de

2011, a coluna monolítica da marca Phenomenex (Onyx® C18 100 x 2,0 mm) foi

cotada em R$ 1700,00, enqunato que a coluna convencional da marca ACE (C18

100 x 2,1 mm) foi cotada em R$ 960,00.

Outro ponto negativo é que as fases monolíticas dão origem a picos de pior simetria

[11]. Além disso, a eficiência cromatográfica das colunas monolíticas, apesar de ser

comparável à apresentada por colunas convencionais com partículas porosas de

diâmetro entre 3,5 e 5,0 μm, é inferior à alcançada por colunas empacotadas com

partículas de núcleo fundido e partículas porosas sub 2 μm [1,10,12].

Com o objetivo de melhorar o desempenho das colunas monolíticas, a empresa

Merck introduziu no mercado, no fim de 2011, a fase monolítica de sílica de segunda

geração. Essa nova fase é chamada de Chromolithic High Resolution® e possui duas

vantagens em relação à fase de primeira geração: gera uma maior eficiência

cromatográfica (H fase monolítica 2a geração < 7 μm; H fase monolítica 1

a geração < 12,5 μm) e

propicia a obtenção de picos mais simétricos. Essas características foram

alcançadas mediante o desenvolvimento de um processo de fabricação mais

reprodutível, garantindo que poros de tamanhos homogêneos fossem formados,

além da redução do tamanho dos macroporos. Na fase de primeira geração o

macroporo possui tamanho entre 1,8-2,0 μm, já na de segunda geração esse

tamanho encontra-se situado entre 1,1-1,2 μm. É óbvio que a redução do tamanho

do macroporo conduziu a um aumento da pressão, entretanto as colunas

Chromolithic High Resolution® ainda podem ser utilizadas em cromatógrafos

convencionais, pois a pressão gerada é inferior a 400 bar [12].

Apesar de não serem utilizadas com elevada frequência, muitos trabalhos científicos

vem sendo realizados com os monolitos. Separações de compostos orgânicos sob

condições de fase reversa, dos quais se destacam fármacos, peptídeos e proteínas,

representam a quase totalidade dos trabalhos publicados [1]. Exemplo de aplicação

das colunas monolíticas é a determinação de tadalafil em coluna C18, 100 x 4,6 mm,

empregando-se vazão de 5 ml/min, em aproximadamente 10 minutos [13].

72

1.2 Coluna empacotada com partículas de núcleo fundido

O conceito de partículas peliculares ou superficialmente porosas, constituídas por

um núcleo sólido e uma fina camada porosa, foi inicialmente sugerido por Hórvath e

Lipsky, na década de 60, e foi aplicado a colunas de cromatografia de troca iônica,

um tipo de cromatografia líquido-sólido. O desenvolvimento dessas partículas foi

realizado considerando o princípio de que o menor caminho de difusão presente nas

partículas peliculares, comparado ao presente nas partículas totalmente porosas,

poderia propiciar uma difusão mais rápida do analito, aumentando a eficiência

cromatográfica. Apesar da excelente capacidade de separação apresentada por

essas partículas, elas não foram adotadas pela comunidade científica pelo fato de a

cromatografia de troca iônica apresentar aplicação limitada. Na época, o interesse

maior era pela cromatografia líquido-líquido [14].

Também na década de 60 e pelo mesmo motivo, Kirkland e colaboradores

desenvolveram as chamadas shell particles, constituídas por um núcleo sólido e por

uma camada porosa mais espessa do que a sugerida por Hórvath e Lipsky. Kirkland

foi o primeiro pesquisador a desenvolver partículas desse tipo aplicadas à

cromatografia líquido-líquido. Na década de 70, colunas como Corasil® I e II, da

Waters, empacotadas com shell particles, foram comercializadas. Entre 5 e 10% do

volume dessas partículas era ocupado pela camada porosa. Apesar do sucesso

inicial, com o passar do tempo percebeu-se que essas colunas eram instáveis:

rapidamente perdiam fase estacionária, arrastada pela fase móvel, gerando análises

de baixa reprodutibilidade. Além disso, constatou-se a baixa capacidade de amostra

em consequência da menor superfície porosa desse tipo de partícula [14].

Ao mesmo tempo em que as limitações das shell particles foram evidenciadas, eram

produzidas partículas totalmente porosas com diâmetros cada vez menores,

capazes de gerar análises extremamente eficientes. A redução do tamanho das

partículas totalmente porosas passou a ser o foco das pesquisas e os estudos

envolvendo as shell particles foram temporariamente interrompidos [14].

Recentemente, a necessidade de desenvolver colunas eficientes que pudessem

operar em equipamentos de HPLC levou ao desenvolvimento de novas gerações de

73

colunas empacotadas com shell particles. As colunas empacotadas com partículas

totalmente porosas de tamanho muito reduzido, apesar de eficientes, geram

pressões acima de 400 bar, sendo compatíveis com equipamentos de UHPLC.

Pensando nisso, em 1992 a Agilent desenvolveu a coluna Poroshell 300®,

constituída por partículas de 7 μm de diâmetro, envolvidas por camada porosa de

1 μm. Entretanto, o real sucesso dessas partículas ocorreu em 2006, com a

introdução da coluna Halo core-shell® pela Advanced Material Technologies. Essa

coluna é constituída por shell particles, de 2,7 μm de diâmetro, envolvida por 0,5 μm

de camada porosa. A camada porosa, agora estável quimicamente, ocupa 75% do

volume da partícula, e não apenas 10% como nas shell particles desenvolvidas na

década de 60, solucionando o problema da baixa capacidade de amostra [14].

Procedimento típico de preparo das shell particles envolve a suspensão de

partículas de sílica não porosas em uma mistura de etanol e água. Uma solução

concentrada de hidróxido de amônio deve ser vertida sobre a suspensão, fazendo

com que os grupos silanóis presentes na superfície da sílica fiquem carregados

negativamente. Em seguida adiciona-se uma solução de surfactante orgânico

catiônico (C18TABr+) e as moléculas desse surfactante, carregadas positivamente,

são adsorvidas às partículas de sílica, que estão carregadas negativamente. Por

último adiciona-se tetraetilortosilicato, que tem como função construir a estrutura de

sílica porosa em torno das moléculas de surfactante adsorvidas. Finalmente, as

novas partículas formadas são centrifugadas e o mesmo processo é repetido até

que a espessura da camada porosa desejada seja alcançada [14].

As shell particles também têm sido chamadas fused core, core shell e porous shell.

Em português, o termo mais empregado é partículas de núcleo fundido. As colunas

com partículas de núcleo fundido (Figura 2.3), ao contrário das monolíticas, não são

um sistema contínuo. São constituídas por um núcleo sólido de sílica fundida não

poroso (core), normalmente de 1,6 ou 1,7 µm de diâmetro, revestido por uma parte

externa porosa (shell) com espessura geralmente de 0,5 µm. Sendo assim, essas

partículas possuem um diâmetro total de 2,6 ou 2,7 µm (Figura 2.4) [15]. Já há no

mercado, entretanto, partículas de núcleo fundido com diâmetro total de 1,7 µm

(núcleo de 1,25 µm de diâmetro e a parte externa de 0,23 µm de espessura),

74

1,3 µm, assim como partículas de 2,6 µm de diâmetro total com parte externa porosa

de 0,35 µm e núcleo de 1,9 µm.

Figura 2.3 - Micrografia de partícula de núcleo fundido [16]

Figura 2.4 - Esquema de partícula de núcleo fundido [17]

As colunas de núcleo fundido possuem porosidade (ε) entre 50% e 60%. Na

literatura encontram-se descritos valores de ε iguais a 56% (Poroshell® 2,7 μm), 55%

(Kinetex® 2,6 μm) e 51% (Halo® 2,7 μm) [18, 19]. A permeabilidade (Kv0) desse tipo

de coluna é inferior à observada em colunas monolíticas. Valores de Kv0 iguais a

1,18 x 10-14 m2 (Kinetex® 2,6 μm), 1,02 x 10-14 m2 (Halo® 2,7 μm) e 0,99 x 10-14 m2

(Poroshell® 2,7 μm) foram descritos na literatura [20]. Observa-se que a retenção

dos analitos em colunas com partículas de núcleo fundido é inferior à observada em

colunas convencionais empacotadas com partíclas totalmente porosas. A explicação

está no fato de o volume de fase estacionária presente em partículas de núcleo

fundido ser inferior ao presente em partículas totalmente porosas [14].

O maior benefício de colunas com partículas de núcleo fundido é a possibilidade de

redução do tempo de análise, com eficiência cromatográfica comparável à propiciada

por colunas com partículas porosas sub 2 µm e manutenção da pressão em níveis

compatíveis com os requeridos por um instrumento de HPLC (400 bar) [21].

75

Apesar das vantagens, de modo similar às colunas monolíticas há um número

limitado de fabricantes (exemplos: Phenomenex, Agilent, Advanced Materials

Technologies, Supelco) e de grupos químicos ligantes disponíveis, o que é um fator

que contribui para a baixa utilização desse tipo de coluna [10]. Em cotação realizada

no primeiro semestre de 2011, a coluna de núcleo fundido da marca Phenomenex

(Kinetex® C18, 100 x 2,1mm, 2,6 µm) foi cotada em R$ 1490,00. Já a coluna da

marca Agilent (Poroshell® C18, 100 x 2,1mm, 2.7 µm) foi cotada em R$ 975,00,

preço próximo ao cobrado pelas tradicionais colunas convencionais.

Apesar de ainda pouco utilizada, há várias publicações empregando coluna de

núcleo fundido. Exemplo é o trabalho publicado em 2011 por Kirkland e

colaboradores, no qual é descrita a separação de nove proteínas, em menos de dois

minutos, com resolução mínima de 1,5, utilizando-se coluna de núcleo fundido [22].

1.3 Coluna empacotada com partículas porosas sub 2 µm

O desafio de desenvolver partículas com diâmetro inferior a 2 µm, resistentes à

pressão gerada no sistema cromatográfico em consequência da redução do

tamanho das partículas, foi vencido, inicialmente, pela obtenção de partículas não

porosas de 1,5 µm de diâmetro. Embora essas partículas não porosas sub 2 µm

conduzissem a análises de alta eficiência, apresentavam baixa capacidade de

amostra e baixa retenção devido à pequena superfície de contato com o analito.

Para que não houvesse redução da retenção e da capacidade de amostra era

preciso desenvolver partículas porosas sub 2 µm que fossem capazes de resistir a

altas pressões. Pensando nisso pesquisadores da Waters, em 2004, desenvolveram

a primeira coluna empacotada com partículas porosas de diâmetro inferior a 2 µm

resistentes mecanicamente. Nessas colunas, denominadas Acquity®, a resistência

das partículas porosas sub 2 µm é alcançada por meio de pontes de etano inseridas

na estrutura da sílica [23].

As colunas empacotadas com partículas porosas com diâmetro inferior a 2 µm, ao

contrário das monolíticas e das empacotadas com partículas de núcleo fundido,

aplicam-se a análises realizadas em instrumentos que operam sob pressão de até

76

1000 bar (UHPLC) [24]. Instrumentos de UHPLC ainda não são comuns devido ao

custo 25% maior quando comparado aos instrumentos de HPLC [15].

O primeiro cromatógrafo a suportar altas pressões foi desenvolvido pela Waters e

lançado em 2004 com o nome de Acquity UPLC®. As modificações requeridas em

um sistema desse tipo em relação ao HPLC são: resistência a altas pressões

(tipicamente até 1000 bar), volumes internos menores, melhoramento nos sistema

de controle de dados, injetores com precisão na faixa de pequenos volumes de

injeção, sistema de injeção rápido e capaz de suportar pressões elevadas, detector

com elevada frequência de aquisição de dados, filtros de colunas com porosidade

menor que 2 µm. Depois de 2004, outros sistemas de UHPLC, que suportam

pressões de até 1300 bar, foram desenvolvidos [25,26].

As colunas com partículas porosas sub 2 μm possuem valores de permeabilidade

(Kv0) da ordem de 10-15 e, portanto são menos permeáveis que as monolíticas. Na

literatura encontram-se relatados valores de Kv0 iguais a 6,28 x 10-15 m2 para a

coluna Zorbax SB® e 4,50 x 10-15 m2 para a coluna Acquity® [27]. Quanto à

porosidade, valor de 63% foi descrito para a coluna Acquity® [19]. Em relação à

retenção verifica-se que colunas com partículas porosas sub 2 μm apresentam maior

capacidade de retenção do que colunas com partículas de núcleo fundido. Isso se

deve ao fato de essas partículas serem menores e totalmente porosas, o que

aumenta a superfície de contato entre analito e fase estacionária [21].

A principal vantagem das colunas com partículas porosas sub 2 μm é possibilitar

análises rápidas, o que contribui para a redução do consumo de solventes, com

elevada eficiência de separação. A eficiência de uma análise, determinada pelo

número de pratos teóricos (N), é inversamente proporcional ao diâmetro das

partículas, o que explica o fato de colunas empacotadas com partículas tão

pequenas, como as de diâmetro inferior a 2 μm, propiciarem análises de elevada

eficiência [28]. Ao benefício da alta eficiência se contrapõe a elevação da pressão do

sistema cromatográfico, já que a pressão gerada é inversamente proporcional ao

quadrado do diâmetro das partículas (equação 2.1), requerendo a utilização de um

sistema de UHPLC, mais caros e de menor disponibilidade nos laboratórios [5, 23].

77

2

0

p

td

uLP

(2.1)

Pt = pressão no sistema cromatográficos, = fator de resistência da coluna, L =

comprimento da coluna, u0 = velocidade linear da fase móvel, dp = diâmetro da

partícula

Vale destacar que, ao contrário do que ocorre com as colunas monolíticas e de

partículas de núcleo fundido, há uma grande variedade de grupos químicos ligantes

e de fabricantes das colunas com partículas porosas sub 2 μm disponíveis no

mercado [10]. Em cotação realizada no primeiro semestre de 2011, a coluna da

marca Waters (Acquity UPLC BEH C18, 100 x 2,1mm, 1,7 µm) foi cotada em

R$ 3310,18. Já a coluna da marca Agilent (Zorbax C18, 100 x 2,1mm, 1,8 µm) foi

cotada em R$ 975,00.

Além das vantagens já relatadas, com partículas porosas sub 2 μm são obtidos

picos com larguras na meia altura (W0,5) inferiores a 1 segundo, propiciando um

aumento de 2 a 3 vezes na detectabilidade se comparada à propiciada por colunas

convencionais [21].

Característica importante das colunas com partículas sub 2 µm é a limitação do

diâmetro interno, que deve estar compreendido na faixa de 1,0 a 2,1 mm, a fim de

minimizar o efeito frictional heating. Esse efeito é caracterizado pelo aquecimento

dos solventes da fase móvel quando submetidos a altos valores de pressão,

promovendo gradiente de temperatura ao longo da coluna e consequente redução

da eficiência [9, 10, 23]. Outros problemas a serem destacados nesse tipo de coluna

é a menor reprodutibilidade de empacotamento, o que é consequência da redução

do tamanho das partículas, e o menor tempo de vida útil, que é consequência dos

altos valores de pressão a que essas colunas são submetidas [9, 29].

A determinação de triancinolona e compostos relacionados em 1,5 minuto é um

exemplo da aplicação das colunas porosas com partículas sub 2 μm em análises

farmacêuticas. A análise foi conduzida em um UHPLC (Acquity UPLC®), coluna C18

78

2,1 x 50 mm, 1,7 μm, a 25 oC, utilizando fase móvel composta de ACN e água

(40:60) e vazão variando de 0,5 a 0,6 ml/min [29].

2 OBJETIVO ESPECÍFICO

O objetivo do trabalho descrito nesse capítulo foi caracterizar fisicamente as colunas

CV, MN, NF e Sub 2 μm utilizando os parâmetros volume morto, porosidade total,

fator de retenção, seletividade e permeabilidade.


3.1 Materiais


Os mesmos descritos no capítulo 1, item 3.1.1.





3.2 Métodos

3.2.1 Estimativa do volume morto e porosidade total das colunas

Volume morto de uma coluna cromatográfica representa o volume total de líquido

que é capaz de ocupá-la, e está diretamente relacionado à porosidade [28]. Para

estimá-lo injetaram-se, em triplicata, em todas as quatro colunas, solução de uracila

(10 µg/ml em fase móvel). A fase móvel foi composta por ACN:solução de acetato de

amônio 5 mM, pH 3,0 (50:50). A análise foi conduzida sob temperatura de 30 ºC,

79

vazão de 0,1 ml/min, volume de injeção de 1 μl e comprimento de onda de 254 nm.

Utilizando o valor médio do tempo de detecção da uracila (tempo morto), o volume

morto de cada coluna foi calculado por meio da equação (2.2) [30].

0tVVm (2.2)

Vm = volume morto, V = vazão da fase móvel, t0 = tempo morto

A partir dos valores de volume morto foi possível estimar a porosidade total de cada

coluna utilizando-se a equação (2.3) [28]. A porosidade representa o espaço livre

total de uma coluna, e é composta pela porosidade externa (espaços vazios entre as

partículas) e pela porosidade interna (espaços vazios dentro das partículas) [19].

Lr

V

c

m

214,3

(2.3)

ε = porosidade total Vm = volume morto, rc = raio da coluna, L = comprimento da

coluna

3.2.2 Avaliação da retenção e seletividade das colunas

O fator de retenção (k) é o parâmetro utilizado para avaliação da retenção, que está

relacionada à capacidade da coluna em manter as moléculas dos analitos retidas na

fase estacionária. Já a seletividade (α) está relacionada à capacidade de separação

de duas substâncias que eluem lado a lado [28].

A seletividade e o fator de retenção das colunas foram estimados em três fases

móveis de forças eluotrópicas diferentes, utilizando como modelo os fármacos

clorpropamida (CL), glibenclamida (GB), glimepirida (GM) e gliclazida (GZ). Para a

execução do experimento foram utilizadas condições previamente estabelecidas:

fase móvel composta por ACN e solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0;

volume de injeção 2 µl; temperatura 30 oC; vazão de 0,2 ml/min e comprimento de

onda 230 nm.

80

As três fases móveis utilizadas foram ACN: solução de acetato de amônio nas

proporções 55:45, 50:50 e 45:55. Utilizando cada uma delas, injetou-se, em

triplicata, solução contendo 100 μg/ml de cada um dos antidiabéticos e solução de

uracila 10 μg/ml para determinação do tempo morto. O procedimento acima descrito

foi executado nas quatro colunas cromatográficas.

Para o cálculo do fator de retenção determinou-se o tempo de retenção médio de

cada analito e o tempo morto médio, em cada uma das colunas, empregando-se

cada uma das fases móveis. O cálculo foi realizado por meio da equação (2.4) [28].

0

0

t

ttk r

(2.4)

k = fator de retenção, tr = tempo de retenção, t0 = tempo morto

A seletividade (α) também foi determinada para cada uma das colunas e fases

móveis experimentadas para os pares de analitos adjacentes. A equação (2.5) foi

utilizada para realização dos cálculos [28].

1

2

k

k

(2.5)

α = seletividade, k2 = fator de retenção do analito mais retido e k1 = fator de retenção

do analito menos retido.

3.2.3 Estimativa da permeabilidade das colunas

A permeabilidade (Kv0) das colunas foi determinada com o auxílio do gráfico de

velocidade linear (u0) em função da pressão na coluna (∆Pc). A permeabilidade pode

ser calculada por meio da equação (2.6), e a pressão da coluna e a velocidade linear

são determinadas com auxílio das equações (2.7) e (2.8), respectivamente [6, 7].

81

c

vP

LuK

00 (2.6)

ectc PPP (2.7)

00 / tLu (2.8)

Kv0 = permeabilidade, u0 = velocidade linear da fase móvel, η = viscosidade da fase

móvel, L = comprimento da coluna, ∆Pc = pressão na coluna, ∆Pt = pressão total do

sistema com a coluna, ∆Pec = pressão extracoluna (pressão do sistema na ausência

da coluna), t0 = tempo morto

Considerando-se u0 como variável independente (x) e ∆Pc como variável dependente

(y), a seguinte transformação pode ser realizada na equação (2.6):

c

vP

LuK

00

y

LxKv

0

0vK

Lxy

A partir da relação matemática apresentada, conclui-se que a inclinação do gráfico

u0 x ∆Pc pode ser escrita como:

0vK

LInclinação

Portanto, Kv0 pode ser calculado com o auxílio da equação (2.9).

Inclinação

LKv

0

(2.9)

Para a execução dos experimentos de determinação de permeabilidade, método

analítico desenvolvido para determinação dos antidiabéticos orais em coluna CV, e

aqueles obtidos após transferência para as colunas MN, NF e sub 2 μm, foram

82

utilizados (Tabela 2.1). O desenvolvimento do método e a transferência para as

outras colunas estão descritos no capítulo 1.

Tabela 2.1 - Condições de análise para determinação de antidiabéticos nas diferentes

colunas*

Colunas Fase Móvel Vinj (μl) (nm) T (oC)

Convencional ACN: Solução (50:50)** 2 230 30

Monolítica ACN: Solução (43:57)** 2 230 30

Núcleo Fundido ACN: Solução (50:50)** 2 230 30

Sub 2 μm ACN: Solução (53:47)** 2 230 30

* Foram utilizados loop de 10 μl, tubo de PEEK de 0,004 polegada e frequência de aquisição dos dados e constante de tempo do detector iguais a 20 Hz/0,1 s ** Solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0

As colunas foram submetidas a vazões crescentes utilizando as respectivas fases

móveis e, para cada valor de vazão, um par de dados u0 x ∆Pc foi obtido. Para uma

estimativa mais correta da permeabilidade, os valores de vazão máximos

empregados em cada coluna foram aqueles que conduziram a valores de pressão

próximos aos máximos suportados por cada uma (Tabela 2.2). A determinação da

permeabilidade empregando vazões que geram pressões muito abaixo da máxima

suportada pela coluna pode conduzir a uma estimativa da permeabilidade superior a

real [27].

Tabela 2.2 - Pressões máximas suportadas pelas colunas e valores de vazão máximos

empregados em cada coluna para determinação de Kv0

Coluna Pressão máxima (bar) Vazão limite (ml/min)

Convencional 275 1,2

Monolítica 200 1,2

Núcleo Fundido 400* 1,0

Sub 2 μm 1034** 1,2

*Apesar de a coluna com partículas de núcleo fundido suportar 600 bar, o valor limite considerado será de 400

bar, já que a vantagem de sua utilização está no fato de ela propiciar uma boa eficiência cromatográfica sem a necessidade da utilização de equipamentos sob alta pressão do tipo UHPLC.

**Apesar de a coluna com partículas sub 2 μm suportar 1200 bar, o valor limite considerado será de 1034 bar,

valor máximo suportado pelo equipamento UPLC Acquity® utilizado.

Com as colunas conectadas ao sistema determinou-se a pressão total em cada

vazão (∆Pt). Posteriormente a coluna foi substituída por um conector de volume

morto desprezível, e novamente em cada valor de vazão determinou-se a pressão

83

extracoluna (∆Pec). Subtraindo-se a pressão total da extracoluna, conforme equação

2.7, determinou-se a pressão em cada coluna (∆Pc).

Para cálculo de u0 foi necessária a determinação do tempo morto (t0) em cada uma

das vazões, em cada uma das colunas, por meio da injeção de solução de uracila a

10 μg/ml. Dividindo-se o comprimento de cada coluna (L = 100 mm), pelo tempo

morto (equação 2.8), foi possível calcular u0 em cada coluna e vazão.

Os pares de valores u0 x ∆Pc relativos a cada coluna foram plotados. Fazendo-se

uso do método dos mínimos quadrados realizou-se análise de regressão linear e os

valores de inclinação dos gráficos foram determinados. Utilizando-se os valores de

inclinação determinados, os valores tabelados de viscosidade da fase móvel de

acordo com a proporção dos componentes orgânico e aquoso [30] e empregando-se

o comprimento das colunas (L = 100 mm), os valores de permeabilidade das colunas

foram calculados por meio da equação (2.9).


4.1 Estimativa do volume morto e porosidade total das colunas

Na Tabela 2.3 estão apresentados os valores estimados de volume morto e

porosidade total das colunas.

Tabela 2.3 - Volume morto e porosidade total das colunas

Coluna Volume morto (μL) Porosidade (%)

Convencional 221 64

Monolítica 261 83

Núcleo Fundido 208 60

Sub 2 μm 196 57

Encontra-se descrito na literatura que a porosidade de coluna monolítica é de cerca

de 80% [1], portanto o valor encontrado, 83%, é coerente. Observa-se ainda que a

coluna monolítica é aquela que apresenta maior volume morto (261 μl). Isso é

84

explicado pelo fato de a coluna mais porosa ser a que apresenta maior volume de

espaços vazios que podem ser percorridos pela fase móvel.

Na literatura foram descritos valores de porosidade em torno de 66% para coluna

convencional [2] e de 63% para coluna com partículas sub 2 μm (Acquity®) [19].

Portanto, os valores encontrados (ε CV= 64% e ε sub 2 μm= 57%) estão próximos aos

descritos.

Considerando-se que nas partículas de núcleo fundido apenas a parte externa é

porosa [13], pode-se afirma que a porosidade interna (espaços vazios dentro das

partículas) é menor do que a presente nas partículas totalmente porosas de 5 e 2

μm. Entretanto, para se avaliar a porosidade total deve-se considerar também a

porosidade externa (espaços vazios entre as partículas). Sabe-se que o aumento do

diâmetro das partículas contribui para o aumento da porosidade externa [19]. Sendo

assim, a maior porosidade total da coluna convencional em relação à coluna de

núcleo fundido ( CV = 64% > ε NF = 60%), verificada experimentalmente, era

esperada, já que as colunas com partículas totalmente porosas de 5 μm

apresentam, além da maior porosidade externa, maior porosidade interna.

Verificou-se também que a porosidade total da coluna com partículas de núcleo

fundido foi superior àquela da coluna com partículas sub 2 μm ( NF = 60% >

sub2 = 57%), o que não está de acordo com os resultados apresentados na

literatura. Na literatura valores de ε = 56% (Poroshell® 2,7 μm) [18] e 51% (Halo®

2,7 μm) [19] foram descritos para colunas de núcleo fundido, e valores superiores

(ε = 63%) foram relatados para colunas sub 2 μm.

4.2 Estimativa da retenção e seletividade das colunas

4.2.1 Retenção

Para demonstrar o comportamento das colunas quanto à capacidade de retenção,

está apresentado a seguir, na Figura 2.5, o gráfico que relaciona o percentual de

85

ACN na fase móvel e o fator de retenção da gliclazida. Os gráficos referentes aos

outros fármacos apresentam o mesmo perfil e por isso não foram apresentados.

Figura 2.5 - Relação entre a porcentagem de acetonitrila presente na fase móvel e a retenção

(k) da gliclazida nas diferentes colunas

Como todos os tipos de colunas em estudo possuem fases estacionárias do tipo C18

(fase reversa), é óbvio que o aumento do percentual de solvente orgânico na fase

móvel, com consequente elevação da força eluotrópica, conduza à redução do fator

de retenção [30]. Esse comportamento pode ser observado na Figura 2.5.

Ainda analisando o gráfico da Figura 2.5 percebe-se que para uma mesma

composição de fase móvel, o fator de retenção da gliclazida é maior na coluna de

partículas sub 2 μm, seguida da coluna convencional, da coluna de partículas de

núcleo fundido e, por último, da coluna monolítica. Portanto, a capacidade de

retenção das colunas segue a ordem: Sub 2 μm > CV > NF > MN.

Os resultados encontrados estão de acordo com o descrito na literatura. A menor

retenção da coluna monolítica se deve à elevada porosidade e baixa densidade

características dos monolitos [8]. Já a coluna empacotada com partículas de núcleo

fundido apresenta menor retenção do que as colunas empacotadas com partículas

sub 2 μm e partículas convencionais de 5 μm, porque, ao contrário dessas, as

partículas de núcleo fundido não são totalmente porosas, o que reduz a superfície

de contato e a interação com o analito. Por último, verificou-se que as colunas

constituídas por partículas totalmente porosas (empacotadas com partículas de 5 μm

e com partículas sub 2 μm) apresentaram maior capacidade de retenção, já que a

0

1

2

3

4

5

6

40 45 50 55 60

k

% ACN

Sub 2 μm

CV

NF

MN

86

maior porosidade permite o estabelecimento de maior interação com os analitos. O

menor tamanho das partículas sub 2 μm, em comparação com as partículas de 5

μm, contribui para maior uma superfície de contato e consequente maior interação

da fase estacionária com os analitos, e explica a maior retenção das colunas com

partículas sub 2 μm em relação a coluna convencional.

4.2.2 Seletividade

Para demonstrar o comportamento das colunas quanto à seletividade está

apresentado a seguir, na Figura 2.6, o gráfico no qual se relacionam o percentual de

acetonitrila na fase móvel e a seletividade (α) do par de analitos gliclazida e

glibenclamida, selecionado como modelo para apresentação dos resultados. É

importante destacar que todas as quatro colunas possuem fase ligada do tipo C18.

Os gráficos referentes aos outros pares de analitos adjacentes apresentam o mesmo

perfil e por isso não foram apresentados.

Figura 2.6 - Relação entre a porcentagem de acetonitrila presente na fase móvel e a

seletividade (α) do par GZ e GB nas diferentes colunas

O gráfico apresentado na Figura 2.6 indica que o aumento do percentual de

acetonitrila, com consequente elevação da força eluotrópica da fase móvel (já que

se trata de cromatografia em fase reversa), conduz a uma pequena redução da

seletividade em todas as colunas.

Percebe-se também que para uma mesma composição de fase móvel, embora os

valores encontrados sejam muito próximos, a seletividade segue a seguinte ordem:

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

2.20

40 45 50 55 60

α

GB

/GZ

% ACN

Sub 2 μm

NF

MN

CV

87

α Sub 2 μm > α NF > α MN > α CV. A título de ilustração, para a fase móvel constituída de

ACN:solução de acetato de amônio (50:50) os valores de seletividade são α CV =

1,55; α MN = 1,59; α NF = 1,66; α Sub 2 μm = 1,71. A pequena diferença de seletividade

entre as colunas, todas de fase ligada C18, torna possível supor que os mecanismos

que governam a separação nas quatro colunas sejam similares.

4.3 Estimativa da permeabilidade das colunas

Há na Figura 2.7 o gráfico da variação de pressão (∆Pc) em função da velocidade

linear da fase móvel (u0) para as quatro colunas.

Figura 2.7 - Relação entre u0 e ∆Pc nas diferentes colunas

Os valores de inclinação dos gráficos, de viscosidade das fases móveis e do

comprimento das colunas, utilizados para o cálculo da permeabilidade (Kv0) por meio

da equação (2.8), estão relacionados na Tabela 2.4.

Tabela 2.4 - Inclinação do gráfico das retas u0 x ∆Pc, viscosidade da fase móvel,

comprimento e permeabilidade das colunas

Coluna Inclinação η (Pascal.s) L (mm) Kv0 (m2)

Convencional 2 x 109 0,00074 100 3,70 x 10-14

Monolítica 2 x 109 0,00080 100 4,00 x 10-14

Núcleo Fundido 8 x 109 0,00074 100 9,25 x 10-15

Sub 2 μm 1 x 1010 0,00072 100 7,20 x 10-15

0

20000000

40000000

60000000

80000000

100000000

0.00E+00 4.00E-03 8.00E-03

∆P

c (

Pascal)

u0 (m/s)

Sub 2 μm

NF

MN

CV

88

Analisando-se os resultados da Tabela 2.4 verifica-se que a permeabilidade das

colunas segue a seguinte ordem: Kv0 MN > Kv0 CV > Kv0 NF > Kv0 Sub2. A ordem

encontrada e os valores de Kv0 são similares aos descritos na literatura e podem ser

explicados com base nas características de cada coluna [6, 7, 27].

A maior permeabilidade apresentada pela coluna monolítica (Kv0 = 4,00 x 10-14 m2)

deve-se à estrutura de macroporos, pelos quais a fase móvel passa sem grande

resistência [1]. Na literatura, Kv0 = 6,00 x 10-14 m2 [6] e Kv0 = 8,00 x 10-14 m2 [7] foram

descritos para coluna a monolítica Onyx®.

Já a coluna empacotada com partícula totalmente porosa sub 2 µm foi a de menor

permeabilidade (Kv0 = 7,20 x 10-15 m2). A despeito de a coluna ser totalmente porosa,

o que contribuiria para aumentar permeabilidade, as partículas são muito pequenas

(1,8 μm) e o que dificulta a passagem da fase móvel entre as partículas. Isso

contribui para a menor permeabilidade desse tipo de coluna e explica a alta pressão

que ela gera no sistema. Na literatura foram descritos valores de Kv0 iguais a 6,28 x

10-15 m2 para a coluna Zorbax SB® e 4,50 x 10-15 m2 para a coluna Acquity® [27].

Por outro lado, a coluna empacotada com partículas de núcleo fundido de 2,7 μm de

diâmetro apresentou permeabilidade igual a 9,25 x 10-15 m2, valor intermediário entre

as permeabilidades das colunas convencional (partícula totalmente porosa de 5 μm)

e de partículas sub 2 μm (partícula totalmente porosa de 1,8 μm). A menor

permeabilidade comparada à coluna convencional pode ser explicada pela estrutura

parcialmente porosa e por possuir tamanho de partícula inferior (2,7 μm < 5 μm). Já

a maior permeabilidade comparada à coluna de partículas sub 2 μm é explicada pelo

maior tamanho de partícula (2,7 μm > 1,8 μm). Na literatura foram descritos valores

de Kv0 para colunas de núcleo fundido iguais a 1,18 x 10-14 m2 (Kinetex® 2,6 μm),

1,02 x 10-14 m2 (Halo® 2,7 μm) e 0,99 x 10-14 m2 (Poroshell® 2,7 μm) [20].

5 CONCLUSÃO

As colunas foram caracterizadas segundo os seguintes parâmetros: volume morto,

porosidade, retenção, seletividade e permeabilidade. Verificou-se que a coluna

monolítica apresentou maior porosidade (83%), e consequentemente maior volume

89

morto, o que é justificável pela presença de uma estrutura de meso e macroporos.

Já as outras três colunas apresentaram porosidades na faixa de 57% a 64%.

Constatou-se que as colunas, todas de fase ligada C18, apresentaram seletividades

similares, o que permite supor que os mecanismos que governam a separação nas

quatro colunas sejam similares.

A coluna monolítica apresentou a menor capacidade de retenção, em função da alta

porosidade e menor interação dos analitos com a fase estacionária. Analisando-se

as outras três colunas verifica-se que os fatores de retenção, apesar de maiores na

coluna de partículas sub 2 μm, seguida da convencional e da empacotada com

partículas de núcleo fundido, não foram muito diferentes.

O último parâmetro avaliado foi a permeabilidade (Kv0). Os valores de

permeabilidade das colunas em estudo estão de acordo com os descritos na

literatura e seguem a seguinte ordem: Kv0 MN > Kv0 CV > Kv0 NF > Kv0 Sub2. É importante

destacar que a permeabilidade da coluna está diretamente relacionada com a

pressão que ela gera no sistema cromatográfico. Sendo assim, a menor

permeabilidade da coluna empacotada com partículas sub 2 μm explica o fato de

esse tipo de partícula gerar pressões na ordem de 1000 bar, justificando a

necessidade do emprego de um equipamento de UHPLC. Já a maior permeabilidade

das colunas monolíticas explica o fato de elas poderem ser submetidas a altos

valores de vazão de fase móvel e mesmo assim poderem ser utilizadas em

equipamento de HPLC que operam sob pressão máxima de 400 bar.

90


[1] FARIA, A. M.; BOTTOLI, C. B. G.; JARDIM, C. S. F.; COLLINS, C. H. Fases estacionárias monolíticas para separações cromatográficas. Química Nova. v. 29, n.2, p. 300-309, 2006. [2] MISTRY, K.; GRINBERG, N. Application of Monolithic Columns in High Performance Liquid Chromatography. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies. v. 28, p. 1055-1074, 2005. [3] SIOUFFI, A. M. Silica gel-based monoliths prepared by the sol–gel method: facts and figures. Journal of Chromatography A. v. 1000, p. 801-818, 2003. [4] MONOLITHIC SILICA COLUMNS: BENEFITS AND APPLICATIONS OF CHROMOLITH®HPLC COLUMNSHTTP. Disponível em: <www.docstoc.com/docs/ 24844699/Monolithic-silica-columns-benefits-and-applications-of-Chromolith>. Acesso em: 05 de Dezembro de 2012. [5] UNGER, K. K.; SKUDAS, R.; SCHULTE, M. M. Particle packed columns and monolithic columns in high-performance liquid chromatography comparison and critical appraisal. Journal of Chromatography A. v. 1184, p. 393-415, 2008. [6] DESMET, G.; CLICQ, D.; NGUYEN, D. T.T.; GUILLARME, D.; RUDAZ, S.; VEUTHEY, J.L.; VERVOORT, N.; TOROK, G.; CABOOTER, D.; GZIL, P. Practical constraints in the kinetic plot representation of chromatographic performance data: theory and application to experimental data. Analytical Chemistry. v. 78, p. 2150-2162, 2006. [7] CABOOTER, D.; VILLIERS, A.; CLICQ, D. SZUCS, R.; SANDRA, P.; DESMET,G. Method to predict and compare the influence of the particle size on the isocratic peak capacity of high-performance liquid chromatography columns. Journal of Chromatography A. v. 1147, p. 183-191, 2007. [8] WUA, N.; DEMPSEYB, J.; YEHLA, P. M.; DOVLETOGLOUA, A.; ELLISONA, D.; WYVRATTA, J. Practical aspects of fast HPLC separations for pharmaceutical process development using monolithic columns. Analytica Chimica Acta. v. 523, p. 149-156, 2004. [9] MALDANER, L.; JARDIM, I. C. S. F. O estado da arte da cromatografia líquida de ultra-eficiência. Química Nova. v. 32, n. 32, p. 214-222, 2009. [10] GUILLERME, D.; RUTA J.; RUDAZ, J.; VEUTHEY, J. New trends in fast and high-resolution liquid chromatography: a critical comparison of existing approaches. Analytical and Bioanalytical Chemistry. v. 397, p. 1069-1082, 2010. [11] MCCALLEY, D. V. Comparison of conventional microparticulate and a monolithic reversed-phase column for high-efficiency fast liquid chromatography of basic

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93

CAPÍTULO 3

OTIMIZAÇÃO DE PARÂMETROS INSTRUMENTAIS

CROMATOGRÁFICOS

94


1.1 Efeitos extracoluna e a eficiência cromatográfica

Equipamentos de HPLC não são capazes de operar sob pressão superior a 400 bar,

e, portanto, são inadequados para análises com colunas empacotadas com

partículas com diâmetro sub 2 μm. Essa limitação levou ao desenvolvimento de

sistemas de UHPLC, que suportam pressão de aproximadamente 1000 bar. Além de

bombas capazes de trabalhar em pressões superiores, sistemas de injeção,

detecção e tubulação foram adaptados para que a eficiência das partículas sub 2 μm

fosse aproveitada e para que houvesse redução do efeito extracoluna [1].

Atualmente, além de UHPLC, outros sistemas cromatográficos são empregados para

separações rápidas (em inglês Rapid Resolution Liquid Chromatography, Ultra-Fast

Liquid Chromatography, Rapid Separation Liquid Chromatography). Os

equipamentos para execução da cromatografia rápida assemelham-se aos de

HPLC, que suportam até 400 bar, porém apresentam redução dos efeitos

extracoluna. As técnicas de cromatografia rápida são as mais adequadas para que

colunas de alta eficiência, como a empacotada com partículas de núcleo fundido e a

monolítica, que não geram altas pressões, possam ser usadas com sucesso, sendo

desnecessária a utilização de cromatógrafos como UHPLC [2].

Do ponto de vista estatístico, a largura do pico cromatográfico é definida por meio da

variância total (2 total), que corresponde à soma da variância da coluna (2

coluna) e da

variância extracoluna (2 extracoluna). Portanto, a eficiência total de uma separação

decorre da coluna (eficiência intrínseca) e de aspectos extracoluna [2].

A eficiência intrínseca da coluna é matematicamente definida pela equação de Van

Deemter e envolve os termos A (difusão de Eddy), B (difusão longitudinal) e C

(resistência à transferência de massa) [2]. Já os aspectos extracoluna podem ser

divididos em dois tipos. O primeiro é de natureza volumétrica, chamado de volume

extracoluna (ECV, do inglês extra-column volume) e está relacionado aos volumes

de injeção, do detector e dos tubos de conexão. O segundo refere-se a eventos de

tempo, como frequência de aquisição dos dados e constante de tempo do detector.

95

É importante destacar que a variância extracoluna também depende da vazão da

fase móvel. O aumento da vazão, até determinado limite, contribui para o aumento

da variância extracoluna. A partir da vazão na qual um fluxo turbulento é

estabelecido, a variância extracoluna deixa de aumentar com a vazão. Os fatores

responsáveis pelos efeitos extracoluna estão descritos na equação (3.1) e

representados na Figura 3.1 [1, 2].

22

sec

2

det

22

sdadosquisiçãodoeventosdeaonexõestuboectorinjetoraextracolun (3.1)

Figura 3.1- Esquema de equipamento de HPLC - em vermelho, os fatores que contribuem

para o efeito extracoluna – [2]

Exemplos de volumes dos componentes típicos de equipamentos de HPLC e

UHPLC estão apresentados no Quadro 3.1 [3,4].

Quadro 3.1 - Volumes dos componentes típicos de equipamentos de HPLC e UHPLC

[Adaptado de 3,4]

Descrição UHPLC Acquity® UPLC HPLC Agilent® 1100

Tubo de entrada 6,3 μl 17,7 μl

Tubo de saída 2,3 μl 10,1 μl

Volume do loop 2,0 μl 10,0 μl

Assento capilar da agulha NA 3,7 μl

Célula de fluxo do detector 0,5 μl 8,0 μl

Volume extracoluna total (ECV)* 11,1μl 49,5 μl

* Normalmente o ECV de UHPLC está próximo a 10 μL e de HPLC entre 30-50 μL [4].

96

Em um sistema bem configurado a contribuição dos processos ocorridos fora da

coluna deve ser desprezível, evitando-se a redução da eficiência de separação. É

desejável que a variância extracoluna seja minimizada de forma que a redução do

número de pratos teóricos em consequência do efeito extracoluna não exceda 10%,

ou seja, a eficiência total deve ser no mínimo 90% da capacidade da coluna. A

variância extracoluna máxima aceitável é definida pela equação (3.2) [3]. O valor,

em porcentagem, que a eficiência total de uma análise (estimada na presença dos

efeitos extracoluna) representa em relação à eficiência da coluna, é denominado

eficiência remanescente (Er) e é calculada com o auxílio da equação 3.3 [5].

N

kLrccolunaec

224222

max

)1(10,010,0

(3.2)

2

2

.100total

colunarE

(3.3)

2ec max = variância extracoluna máxima aceitável, 2

coluna = variância da coluna,

L = comprimento da coluna, rc = raio da coluna, ε = porosidade da coluna, k = fator

de retenção do analito, N = número de pratos teóricos, Er = eficiência remanescente,

2total = variância total

Analisando a equação (3.2), percebe-se que para colunas com menor raio (menor rc)

e mais curtas (menor L) a variância máxima aceitável é menor e, portanto, essas

colunas são mais susceptíveis aos efeitos extracoluna. O mesmo raciocínio se aplica

àquelas colunas empacotadas com partículas porosas sub 2 μm e de núcleo

fundido, que apresentam maior eficiência (maior N). Além disso, a equação (3.2)

indica que para analitos menos retidos (menor k) a variância extracoluna máxima

aceitável é menor do que para os analitos mais retidos.

A estimativa da 2extracoluna é feita a partir de pico obtido em um sistema

cromatográfico sem coluna. As condições de análise devem ser similares às que

seriam utilizadas para a análise cromatográfica (mesma fase móvel, vazão, volume

de injeção). Todavia, no local da coluna, deve ser utilizado um conector com volume

97

morto desprezível. Deve-se injetar solução contendo um dos analitos de interesse

ou, alternativamente, uracila ou acetona. A partir do pico registrado calcula-se o

valor de tangenciando o pico nos pontos de inflexão até a linha de base (largura

entre as tangentes na linha de base = 4) ou medindo-se a largura do pico na meia

altura (largura do pico na meia altura = 2,354), como demonstrado na Figura 3.2

[2,4].

Figura 3.2 - Medida da largura na linha de base (4σ) e da largura na meia altura (2,354σ) [6]

O valor de , calculado em unidade de tempo, deve ser multiplicado pela vazão, de

maneira a se encontrar o valor de em unidade volumétrica. O quadrado do valor

encontrado corresponde a 2extracoluna [2,4].

Para estimar o ECV do sistema cromatográfico deve-se multiplicar 4, medido em

unidade de tempo, pela vazão empregada. Esse cálculo é apenas uma estimativa, já

que parte-se do princípio de que toda 2extracoluna é advinda do ECV. De fato há

também a contribuição dos eventos relacionados ao tempo, como frequência de

aquisição dos dados e constante de tempo do detector. O valor real de ECV consiste

na adição de todos os volumes do sistema: volumes de injeção, do tubo de PEEK do

injetor a coluna, do tubo de PEEK da coluna ao detector, da célula de detecção,

filtros de linha e demais conectores [4].

Há estratégias para reduzir os efeitos extracoluna de um sistema cromatográfico. A

primeira delas é ajustar a condição de detecção: a constante de tempo do detector

(t) deve ser suficientemente reduzida pelo fato de as larguras de base dos picos

98

serem estreitas (apenas poucos segundos); deve haver alta frequência de aquisição

dos dados (F) para que sejam adquiridos dados suficientes em pouco tempo [7]. Em

sistemas de UHPLC a frequência deve ser de no mínimo 20 Hz e a constante de

tempo do detector 0,1 s [8]; em sistemas de HPLC a frequência deve ser de no

mínimo 10 Hz e a constante de tempo do detector 0,3 s [7]. Outras estratégias são

substituir a tubulação do equipamento por tubos de menor volume e reduzir os

volumes de injeção da amostra e da cela do detector [7].

Normalmente, sistemas de HPLC apresentam variância extracoluna entre 40 e

60 μl2, enquanto que em sistemas de UHPLC a variância extracoluna encontra-se

entre 4 a 10 μl2 [4]. Embora em sistemas de UHPLC a variância extracoluna seja

reduzida, em se tratando de análise com colunas muito eficientes, pode haver perda

de eficiência superior aos 10% aceitáveis [2]. Como exemplo cita-se estudo

publicado em 2011, no qual foi verificada perda de 35% da eficiência em análise

realizada utilizando sistema de UHPLC da Waters e coluna C18 - 50 × 2,1 mm, 1,7

μm [9]. Os resultados desse estudo confirmam que mesmo utilizando sistemas de

reduzido volume extracoluna, como os de UHPLC, a perda de eficiência

cromatográfica devido à variância extracoluna pode ser elevada quando colunas de

alta eficiência são utilizadas.



1- Otimizar parâmetros instrumentais cromatográficos do equipamento de UHPLC

visando à redução da variância extracoluna.

2- Investigar a influência da variância extracoluna na eficiência remanescente das

colunas em estudo (convencional, sub 2 µm, núcleo fundido e monolítica), durante

análise dos quatro antidiabéticos orais (clorpropamida, glibenclamida, glimepirida e

gliclazida), procurando compreender como o tipo de coluna e os fatores de retenção

dos analitos interferem no grau de influência da variância extracoluna na eficiência

remanescente.

99

3- Verificar se os níveis dos parâmetros instrumentais otimizados com base na

variância extracoluna (objetivo 1) são os ideais para garantir a maior eficiência

remanescente durante análise dos antidiabéticos (objetivo 2).


3.1 Materiais






Os mesmos descritos no capítulo1, item 3.1.3.

3.1.4 Outros materiais

Loops de 10 μl, 5 μL e 2 μl.

Tubos de PEEK de diâmetro interno iguais a 0,004 polegada (0,1016 mm) e 0,0025

polegada (0,0635 mm) e 270 mm de comprimento.

3.2 Métodos

3.2.1 Otimização dos parâmetros instrumentais cromatográficos parte I: avaliação do

efeito extracoluna

Os parâmetros instrumentais cromatográficos submetidos à otimização, os níveis em

que foram testados, bem como o desenho experimental univariado empregado para

a realização da otimização, encontram-se descritos na Tabela 3.1.

100

Tabela 3.1 - Experimentos de otimização dos parâmetros instrumentais cromatográficos

Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3

Loop PEEK F/t

2 μl 0,004 polegada 10 Hz/0,4 s = 25

5 μl 0,0025 polegada 20 Hz/0,2 s = 100

10 μl 20 Hz/0,1 s = 200

40 Hz/0,1 s = 400

40 Hz/0,025 s = 1600

Parâmetros fixos

PEEK: 0,004 polegada

F/t: 20 Hz/0,1 s

Parâmetros fixos

Loop: Escolhido no exp. 1

F/t: 20 Hz/0,1 s

Parâmetros fixos

Loop: Escolhido no exp. 1

PEEK: Escolhido no exp. 2

Para decidir sobre o melhor nível de cada um dos parâmetros, a variância

extracoluna (2extracoluna) e o volume extracoluna (ECV) foram estimados. No local da

coluna foi inserido um conector com volume morto desprezível e injetou-se solução

de uracila a 10 μg/ml, em vazões crescentes (de 0,02 a 0,6 ml/min). As condições de

análise desenvolvidas para determinação simultânea de antidiabéticos orais em

coluna convencional, descritas no Capítulo 1, foram utilizadas (fase móvel composta

de ACN:solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0 (50:50), temperatura 30 oC e

volume de injeção 2 μl).

Para cada valor de vazão, a solução de uracila foi injetada em triplicata e a largura

na meia altura média (w0,5) dos picos registrada. Para as estimativas da σ2extracoluna e

do ECV as equações (3.4), (3.5), (3.6) e (3.7) foram utilizadas [4].

354,25,0w (3.4)

354,2/5,0w (3.5)

22 )( vazãoaextracolun (3.6)

vazãoECV 4 (3.7)

101

w0,5= largura na meia altura, σ = desvio padrão, σ2extracoluna = variância extracoluna,

ECV = volume extracoluna

3.2.2 Otimização dos parâmetros instrumentais cromatográficos parte II: avaliação

da eficiência cromatográfica remanescente

Nessa segunda etapa loops de diferentes volumes e diferentes pares de frequência

de aquisição dos dados (F) e constante de tempo do detector (t) foram avaliados. O

diâmetro interno do tubo de PEEK que conecta a coluna ao detector não foi avaliado

porque resultados descritos no item 4.1.2 deste capítulo demonstraram que os

PEEKs testados (0,004 e 0,0025 polegada) pouco se diferenciaram em termos de

σ2 extracoluna.

Os volumes de loop foram avaliados nas quatro colunas. Foram realizadas três

injeções de solução contendo 100 μg/ml dos antidiabéticos, conforme os métodos

analíticos desenvolvidos no capítulo 1 (Tabela 3.2), empregando-se loops de 2 e

10 μl. O experimento foi realizado em vazões de 0,02 a 0,6 ml/min.


colunas*

Colunas Fase Móvel Vinj (μl) (nm) T (oC)

Convencional ACN: Solução (50:50)** 2 230 30

Monolítica ACN: Solução (43:57)** 2 230 30

Núcleo Fundido ACN: Solução (50:50)** 2 230 30

Sub 2 μm ACN: Solução (53:47)** 2 230 30

*Utilizou-se PEEK de 0,004 polegada e F/t = 40 Hz/0,0025 s **Solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0

Para cada valor de vazão, em cada um dos loops e colunas, determinou-se, para os

quatro antidiabéticos, a média da largura na meia altura (w0,5). Esse valor foi

utilizado para a determinação da σ2total (equação 3.8). A σ2

extracoluna, necessária para

o cálculo da σ2coluna, foi estimada em cada valor de vazão, com loops de 2 e 10 μl,

utilizando-se os métodos descritos na Tabela 3.2, substituindo-se a coluna por tubo

de volume morto desprezível e injetando-se uracila (conforme descrito no item

3.2.1). Com os valores de σ2total e σ2

extracoluna foi possível determinar σ2coluna.

102

2

5,02

354,2

vazão

wtotal (3.8)

222

aextracoluntotalcoluna (3.9)

Em seguida, com os valores de σ2total e σ

2coluna, calculou-se a eficiência remanescente

(Er) por meio da equação 3.3 [5].

Já os parâmetros frequência de aquisição e constante de tempo do detector foram

avaliados utilizando-se apenas a coluna de partículas sub 2 μm. Essa coluna foi

escolhida porque, dentre as quatro em estudo, é a que, de acordo com dados da

literatura, possui maior eficiência cromatográfica. Isso significa que a performance

da coluna de partículas sub 2 μm é influenciada de forma mais significativa por

aumentos da σ2extracoluna advindas de mudanças em F/t. O desenho experimental

incluiu a injeção em triplicata de solução de antidiabéticos orais (100 μg/ml),

seguindo método analítico desenvolvido para a coluna de partículas sub 2 μm

descrito na Tabela 3.2, utilizando-se loops de 2 μl e PEEK de 0,004 di. Os seguintes

pares de F/t foram avaliados: 10 Hz/0,4 s , 20 Hz/0,2 s, 20 Hz/0,1 s, 40 Hz/0,1 s e 40

Hz/0,025 s. O experimento foi realizado nas vazões de 0,15 ml/min e 0,6 ml/min.

Para cada valor de vazão e par de F/t determinou-se a média da largura na meia

altura (w0,5), a σ2total (equação 3.8) e a σ2

coluna (equação 3.9), para os quatro

antidiabéticos. A σ2extracoluna, necessária para o cálculo da σ2

coluna, foi estimada

conforme procedimento descrito no item 3.2.1, nas vazões de 0,15 e 0,6 ml/min, em

todos os pares F/t. Em seguida, com os valores de σ2total e σ

2extracoluna, calculou-se a

eficiência remanescente (Er) por meio da equação 3.3 [5].

3.2.3 Determinação do volume extracoluna real (ECV)

O valor real do volume extracoluna, determinado após otimização dos parâmetros

intrumentais cromatográficos, foi calculado somando-se os volumes dos seguintes

componentes do equipamento Acquity® UPLC: tubo de PEEK de entrada, tubo de

PEEK de saída, volume do loop e célula de fluxo do detector.

103

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Otimização dos parâmetros instrumentais cromatográficos parte I:

avaliação do efeito extracoluna

Como já relatado, a proposta do presente trabalho foi otimizar parâmetros

instrumentais cromatográficos do equipamento de UHPLC utilizado, visando à

redução dos efeitos extracoluna. A redução desses efeitos implica no aumento da

eficiência cromatográfica e possibilita que a efetiva capacidade cromatográfica das

colunas seja aproveitada. O equipamento utilizado nesse trabalho já é fabricado

visando à redução dos efeitos extracoluna. No entanto, análises utilizando colunas

de alta eficiência e com diâmetro interno igual ou menor que 2,1 mm são

extremamente susceptíveis aos efeitos extracoluna. Portanto, qualquer redução

nesses efeitos pode ser significativa para aumentar a eficiência cromatográfica.

Os resultados da otimização do volume do loop, do diâmetro interno do tubo de

PEEK e da frequência de aquisição dos dados/tempo de constante de filtro, estão

apresentados e discutidos a seguir.

4.1.1 Volume do loop

O primeiro parâmetro avaliado foi o volume do loop. Na Figura 3.3 observa-se a

relação entre vazão e variância extracoluna empregando-se loops de 2, 5 e 10 μl.

Figura 3.3 - Relação entre vazão e σ2

extracoluna em análises com loops de 2, 5 e 10 μl

0.00

4.00

8.00

12.00

16.00

20.00

24.00

28.00

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80

σ2 extr

aco

lun

a (

µl2

)

Vazão (ml/min)

Loop 10

Loop 5

Loop 2

104

Analisando-se a Figura 3.3 percebe-se que a variância extracoluna diminui com a

redução do volume do loop, o que já era esperado, uma vez que quanto menor o

volume do loop, menor o ECV e, consequentemente, menor o alargamento do pico

[7]. Os valores médios de ECV utilizando-se os loops de 10, 5 e 2 μl, estimados a

partir dos dados do gráfico apresentado na Figura 3.3, são 18,55, 14,45 e 11,38 μl,

respectivamente. Vale destacar que a pressão do sistema foi praticamente a

mesma, independente do volume do loop utilizado. Sendo assim, como o loop de

2 μl propiciou menor efeito extracoluna, sem gerar aumento da pressão do sistema,

foi selecionado e utilizado nas etapas seguintes.

Ainda analisando a Figura 3.3 percebe-se que o aumento da vazão contribuiu para o

aumento da variância extracoluna até determinado limite (cerca de 0,10 ml/min). A

partir desse ponto observa-se uma tendência de a variância extracoluna se manter

constante. Essa observação está de acordo com o descrito na literatura [1].

4.1.2 Diâmetro interno da tubulação de PEEK no trajeto da coluna ao detector

O segundo parâmetro avaliado foi o diâmetro interno (d.i.) da tubulação de PEEK

que faz conexão da coluna ao detector. O gráfico da Figura 3.4 indica a relação

entre vazão e variância extracoluna e o gráfico da figura 3.5 indica a relação entre

vazão e pressão, ambos para análises realizadas com tubos de PEEK com

diâmetros de 0,0025 e 0,004 polegada.

Figura 3.4 - Relação entre vazão e σ2extracoluna em análises com PEEK de 0,0025 e 0,004

polegada de di

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

σ2 extr

aco

lun

a (

µl2

)

Vazão (ml/min)

peek 0,004

peek 0,0025

105

Figura 3.5 - Relação entre vazão e pressão em análises com PEEK de 0,0025 e 0,004

polegada de di

Analisando-se a Figura 3.4 observa-se que o aumento da vazão contribuiu para o

aumento da variância extracoluna até determinado limite (cerca de 0,1 ml/min). Além

disso, percebe-se que com a redução do diâmetro interno do tubo de PEEK de 0,004

para 0,0025 polegada, houve ligeira diminuição da variância extracoluna. A redução

observada ocorreu como consequência da redução do volume do sistema

cromatográfico (menor ECV) [7]. Ressalta-se que a pequena diferença observada

indica que, na prática, esse parâmetro não foi significativo para melhorar a variância

extracoluna. Os valores de ECVmédio estimados foram 11,38 μl utilizando o PEEK de

0,0025 polegada e 11,62 μl para o PEEK de 0,004 polegada.

Analisando-se o gráfico da Figura 3.5 percebe-se que o PEEK de 0,0025 polegada

levou a um aumento significativo na pressão em relação ao de 0,004 polegada. São

elucidativos os valores de pressão na vazão de 0,4 ml/min: a pressão quando da

utilização do PEEK de 0,0025 polegada (848 bar) foi praticamente o dobro da

verificada quando utilizou-se o PEEK de 0,004 polegada (453 bar).

Assim, o PEEK de 0,004 polegada foi o selecionado para as análises posteriores,

pois há um aumento insignificante da variância extracoluna em relação ao PEEK

0,0025 polegada e a pressão gerada é significativamente menor.

0

200

400

600

800

1000

1200

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

Pre

ssão

(b

ar)

Vazão (ml/min)

peek 0,0025

peek 0,004

106

4.1.3 Frequência de aquisição dos dados (F) e constante de tempo do detector (t)

Os últimos parâmetros avaliados foram a frequência de aquisição dos dados e a

constante de tempo do detector (Figura 3.6).

Figura 3.6 - Relação entre vazão e σ2

extracoluna em análises com diferentes pares de F/t

Analisando-se o gráfico da Figura 3.6 percebe-se que em vazões menores a

frequência e a constante de tempo do detector praticamente não influenciaram na

variância extracoluna. Entretanto, em análises mais rápidas, realizadas em vazões

maiores, o aumento da frequência de aquisição dos dados e a redução da constante

de tempo do detector, contribuíram para a diminuição da variância extracoluna.

Esse comportamento pode ser explicado com base na teoria cromatográfica. Em

vazões menores o sinal chega ao detector com uma velocidade menor, e, portanto,

uma frequência de aquisição de dados menor é suficiente. Além disso, nessas

condições a base dos picos cromatográficos não é muito estreita, o que justifica o

fato de a constante de tempo do detector não precisar ser extremamente reduzida.

Já em vazões maiores o sinal chega rapidamente ao detector, e se a frequência de

aquisição não acompanhar a chegada desses dados ocorre o alargamento do pico

cromatográfico. As bases dos picos são estreitas (poucos segundos), e por isso a

resposta do detector deve ser rápida, ou seja, a constante de tempo deve ser

suficientemente reduzida [10].

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80

σ2 extr

aco

lun

a (

µl2

)

Vazão (ml/min)

10/0,4

20/0,2

20/0,1

40/0,1

40/0,025

107

Conforme verificado no gráfico da Figura 3.6, a variância extracoluna para os valores

F/t de 10 Hz/0,4 s e 20 Hz/0,2 s são maiores que os valores de variância verificados

para os outros três pares de F/t investigados, sobretudo em vazões maiores. A

despeito de as diferenças dos valores de variância extracoluna serem pequenas nas

análises realizadas com F/t de 20 Hz/0,1 s, 40 Hz/0,1 s e 40 Hz/0,025 s e serem

menos influenciadas pela vazão, a maior frequência (40 Hz) e a menor constante de

tempo do detector (0,025 s) levaram à menor variância extracoluna

(σ2extracoluna média = 8,10 μl). Dessa forma, objetivando-se a máxima redução do efeito

extracoluna, o par 40 Hz/0,025 s foi selecionado como o ideal.

Concluindo, os seguintes níveis dos parâmetros instrumentais foram selecionados:

loop de 2 μl, PEEK com d.i de 0,004 polegada, F de 40 Hz e t de 0,025 s. A variância

extracoluna média, calculada a partir dos valores de variância extracoluna obtidos

em cada vazão testada aplicando-se os parâmetros instrumentais cromatográficos

otimizados foi igual a 8,10 μl2 e o ECVmédio igual a 11,33 μl. Esses valores estão

próximos aos descritos na literatura para equipamentos de UHPLC: a variância

extracoluna deve estar entre 4 e 10 μl2 e o ECV próximo a 10 μl [2,4].

4.2 Otimização dos parâmetros instrumentais cromatográficos parte II:

avaliação da eficiência cromatográfica remanescente

A avaliação do efeito extracoluna como critério para seleção dos níveis ideais dos

parâmetros instrumentais cromatográficos, descrita no item 4.1, é uma maneira

indireta de otimizar a separação cromatográfica, uma vez que há uma relação

inversa entre a variância extracoluna e a eficiência cromatográfica. A intensidade

dessa relação pode variar em função do tipo de coluna e do fator de retenção dos

analitos [6]. Por outro lado, a eficiência cromatográfica remanescente (Er) relaciona-

se diretamente com a eficiência cromatográfica e também pode ser usada para a

seleção dos níveis ideais dos parâmetros instrumentais cromatográficos.

Os resultados da otimização do volume do loop e da frequência de aquisição (F) e

tempo da constante de filtro (t) utilizando Er como critério, e discussões sobre como

o tipo de coluna e o fator de retenção dos analitos interferem na intensidade da

relação entre efeito extracoluna e a Er, estão apresentados a seguir.

108

4.2.1 Volume do loop

Os resultados da eficiência remanescente em função da vazão dos antidiabéticos

(CL, GZ, GB e GM), em loops de 2 e 10 μl, nas colunas CV (Figura 3.7), MN (Figura

3.8), NF (Figura 3.9), Sub 2 μm (Figura 3.10), estão representados a seguir.

Figura 3.7 - Relação entre vazão e Er dos antidiabéticos em loops de 10 e 2 μl - Coluna CV

Figura 3.8 - Relação entre vazão e Er dos antidiabéticos em loops de 10 e 2 μl - Coluna MN

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

Er (%

)

Vazão (ml/min)

CL loop10

CL Loop 2

GZ Loop 10

GZ Loop 2

GB Loop 10

GB Loop 2

GM Loop 10

GM Loop 2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

Er (%

)

Vazão (ml/min)

CL loop10

CL Loop 2

GZ Loop 10

GZ Loop 2

GB Loop 10

GB Loop 2

GM Loop 10

GM Loop 2

109

Figura 3.9 - Relação entre vazão e Er dos antidiabéticos em loops de 10 e 2 μl - Coluna NF

Figura 3.10 - Relação entre vazão e Er dos antidiabéticos em loops de 10 e 2 μl - Coluna Sub

2 μm

A análise dos resultados apresentados nas Figuras 3.7 a 3.10 permitem discutir a

influência do volume do loop e fator de retenção dos analitos na eficiência

remanescente das colunas em estudo.

Analisando as curvas referentes a determinada coluna e a um mesmo volume de

loop, percebe-se que quanto menor retenção do analito (k CL < k GZ < k GB < k GM)

menor é a eficiência remanescente (Er CL < Er GZ < Er GB < Er GM). Para exemplificar:

na Figura 3.7, referente à coluna convencional, na vazão de 0,3 ml/min, utilizando

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

Er (

%)

Vazão (ml/min)

CL loop10

CL Loop 2

GZ Loop 10

GZ Loop 2

GB Loop 10

GB Loop 2

GM Loop 10

GM Loop 2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

Er (

%)

Vazão (ml/min)

CL loop10

CL Loop 2

GZ Loop 10

GZ Loop 2

GB Loop 10

GB Loop 2

GM Loop 10

GM Loop 2

110

loop de 10 μl, as eficiências remanescentes da CL, GZ, GB e GM foram de 67%,

82%, 91% e 93% respectivamente.

Analisando as curvas de todas as colunas relativas a um mesmo volume de loop e

mesmo analito verifica-se que a Er é menor na coluna sub 2 μm e aumenta

sucessivamente nas colunas de núcleo fundido, monolítica e convencional.

Exemplificando: utilizando o loop de 10 μl, na vazão de 0,3 ml/min, as eficiências

remanescentes para a clorpropamida nas colunas sub 2 μm, NF, MN e CV foram de

12%, 44%, 60% e 67% respectivamente.

A análise das curvas referentes a determinada coluna e a um mesmo analito permite

observar que o aumento do volume do loop, o qual promove aumento da variância

extracoluna (conforme demonstrado na Figura 3.3 - item 4.1.1), vem acompanhado

da redução da Er. Por exemplo, na figura 3.9, observa-se que para a gliclazida,

utilizando coluna de NF e vazão de 0,3 ml/min, as eficiências remanescentes foram

de 92,51% quando se usou loop de 2 μl e de 64,58% no caso de loop de 10 μl.

Analisando-se as curvas de determinada coluna e determinado analito, percebe-se

que a influência do aumento do volume do loop, com consequente aumento da

variância extracoluna (conforme demonstrado na Figura 3.3 - item 4.1.1), na redução

da Er, é mais significativa na coluna de sub 2 μm, seguida das colunas NF, MN e CV.

A título de exemplo, encontram-se relacionados a seguir, na Tabela 3.3, os valores

de eficiência remanescente obtidos para a glibenclamida nas análises realizadas

com as quatro colunas, vazão de 0,3 ml/min, loops de 2 e 10 μl, bem como a

diferença entre os valores de Er quando os diferentes volumes de loop foram

empregados.

Tabela 3.3 - Er para a glibenclamida nas quatro colunas - vazão de 0,3 ml/min

loop 2 μl loop 10 μl Er loop 2 μl - Er loop 10 μl

Er Sub2 90% 71% 19%

Er NF 93% 81% 12%

Er MN 97% 90% 7%

Er CV 91% 96% 5%

111

Nas curvas referentes a determinada coluna, percebe-se que a influência do

aumento do volume do loop, com consequente aumento da variância extracoluna, na

redução da Er, é mais significativa para analitos menos retidos. Nos dados

apresentados a seguir referentes à Figura 3.10, para coluna sub 2 μm, loops de 2 e

10 μl, vazão de 0,3 ml/min, torna-se evidente esta observação (Tabela 3.4)

Tabela 3.4 - Er dos antidiabéticos na coluna sub 2 μm - vazão de 0,3 ml/min

loop 2 μl loop 10 μl Er loop 2 μl - Er loop 10 μl

Er CL 67% 12% 55%

Er GZ 80% 46% 34%

Er GB 90% 71% 19%

Er GM 92% 76% 16%

Destaca-se ainda que os gráficos de vazão versus Er apresentam aspecto inverso

aos gráficos de vazão versus σ2extracoluna. O aumento da vazão contribui para o

aumento da σ2extracoluna (até determinado limite) e esse aumento σ2

extracoluna resulta

em redução da eficiência cromatográfica remanescente.

Os resultados apresentados indicam que a influência negativa do aumento da

variância extracoluna na eficiência cromatográfica, como resultado do aumento do

volume do loop, foi maior para os analitos menos retidos (clorpropamida e gliclazida)

e para as colunas mais eficientes (Sub 2 μm, NF). Os resultados obtidos estão de

acordo com os da literatura [1, 6] e baseado neles confirma-se a escolha do loop de

2 μl descrito no item 4.1.1 como o ideal para garantir uma maior Er, ou seja, garantir

uma melhor eficiência cromatográfica.

4.2.2 Frequência de aquisição dos dados (F) e constante de tempo do detector (t)

Os resultados da eficiência remanescente (Er) em função de F/t, dos quatro

antidiabéticos, na coluna de partículas sub 2 μm, estão apresentados a seguir. Nas

Figuras 3.11 e 3.12 encontram-se os resultados referentes às análises realizadas

nas vazões de 0,6 e 0,15 ml/min, respectivamente. Ë importante destacar que na

abscissa dos gráficos não estão plotados os valores nominais de F/t (10 Hz/0,4 s,

112

20 Hz/0,2 s, 20 Hz/0,1 s, 40 Hz/0,1 s e 40 Hz/0,025 s) e sim o resultados da divisão

entre F e t (10/0,4 = 25; 20/0,2= 100; 20/0,1= 200; 40/0,1= 400; 40/0,025 = 1600).

Figura 3.11 - Relação entre F/t e Er dos antidiabéticos - Vazão de 0,6 ml/min

Figura 3.12 - Relação entre F/t e Er dos antidiabéticos - Vazão de 0,15 ml/min

Os gráficos apresentados nas Figuras 3.11 e 3.12 trazem informações acerca da

influência da relação entre F/t, fator de retenção dos analitos e vazão da fase móvel

na eficiência cromatográfica remanescente.

Analisando-se os gráficos percebe-se que o aumento da relação F/t, com

consequente redução da σ2extracoluna (conforme demonstrado na Figura 3.6 - item

4.1.3), vem acompanhado do aumento da Er. Para exemplificar, no gráfico da Figura

3.11, referente à gliclazida, vazão de 0,6 ml/min, as eficiências remanescentes

encontradas nas relações F/t de 25 e 1600 foram 53% e 80% respectivamente.

30

40

50

60

70

80

90

100

0 400 800 1200 1600

Er (%

)

Relação F/t

GM

GB

GZ

CL

30

40

50

60

70

80

90

100

0 400 800 1200 1600

Er (%

)

Relação F/t

GM

GB

GZ

CL

113

Analisando as curvas referentes a um mesmo analito, nas Figuras 3.11 e 3.12,

percebe-se que a influência do aumento da relação F/t no aumento da Er é mais

significativa em vazões maiores, o que pode ser evidenciado nos dados

apresentados na Tabela 3.5 referentes à clorpropamida.

Tabela 3.5 - Er da clorpropamida em diferentes vazões e relações F/t

Er CL 25 Er CL 1600 Er CL 1600 - Er CL 25

Vazão 0,6 ml/min 34% 66% 32%

Vazão 0,15 ml/min 56% 58% 2%

Analisando as curvas dos quatro analitos em uma mesma vazão, percebe-se que a

influência do aumento da relação F/t, com consequente redução da σ2extracoluna, no

aumento da Er, é mais significativa para analitos menos retidos. Para exemplificar,

encontram-se apresentados na Tabela 3.6 os dados observados no gráfico da

Figura 3.11.

Tabela 3.6 - Er dos antidiabéticos em diferentes relações F/t - vazão de 0,6 ml/min

Er CL 25 Er CL 1600 Er CL 1600 - Er CL 25

Er CL 34% 66% 32%

Er GZ 53% 80% 27%

Er GB 74% 90% 16%

Er GM 74% 90% 16%

Os resultados são compatíveis com os descritos na literatura [1] e permitem concluir

que a eficiência da clorpropamida, analito menos retido, é mais susceptível aos

efeitos do aumento da σ2extracoluna em consequência da redução da relação F/t. Além

disso, em vazões baixas, que geram picos mais largos, a influência da relação F/t é

negligenciável, tornando-se importante em altas vazões, sendo necessário o

aumento da relação F/t para que não haja perda significativa da eficiência.

Considerando as discussões acerca dos gráficos apresentados nas Figuras 3.11 e

3.12 confirma-se a escolha da frequência de 40 Hz e da constante de tempo do

detector de 0,025 s, selecionadas anteriormente no item 4.1.3, como as ideais para

garantir um melhor desempenho cromatográfico.

114

Vale destacar que o aumento da relação F/t, apesar de contribuir para diminuir a

variância extracoluna, leva também à redução da relação sinal/ruído (S/R) [6].

Entretanto, analisando a relação S/R dos picos dos antidiabéticos, verificou-se que

mesmo com uma frequência elevada (40 Hz) e uma constante de tempo do detector

reduzida (0,025 s), as relações S/R, em todas as vazões testadas, foram superiores

a 10, relação mínima recomendada para uma análise quantitativa exata e precisa

segundo a RDC 899 [11].

4.3 Cálculo do volume extracoluna (ECV) real

Os volumes dos componentes do equipamento de UHPLC (desde a injeção até a

detecção), que dão origem ao volume extracoluna, estão descritos na Tabela 3.7.

Tabela 3.7 - Volumes estimados dos componentes do equipamento de UHPLC (Acquity®) e

volume extracoluna

Fonte Volume (μl)

Tubo de entrada 5,0

Tubo de saída 2,2

Volume do loop 2

Célula de fluxo do detector 0,5

Volume extracoluna 9,7

5 CONCLUSÃO

Conclui-se que os melhores níveis de parâmetros instrumentais cromatográficos,

selecionados por meio da análise dos menores valores de variância extracoluna, e

confirmados por meio de análises da eficiência cromatográfica remanescente, foram:

loop de 2 μl, PEEK de 0,004 polegada de diâmetro interno e frequência de aquisição

dos dados/constante de tempo do detector de 40 Hz/0,025 s.

A influência negativa da 2extracoluna na eficiência cromatográfica foi maior para a

clorpropamida e gliclazida (analitos menos retidos) e quando colunas mais eficientes

(sub 2 μm e núcleo fundido) foram empregadas. Em condições de elevada 2extracoluna

(baixa relação F/t, elevado volume de loop), os valores de Er da clorpropamida e

115

gliclazida nas colunas de núcleo fundido e de partículas sub 2 μm variaram entre 20

e 60%, o que significa que foram bem inferiores aos 90% recomendados. Entretanto,

após a otimização e consequente redução da 2extracoluna (alta relação F/t, reduzido

volume de loop), houve uma melhora significativa: os valores de Er da clorpropamida

e gliclazida nas colunas de núcleo fundido e de partículas sub 2 μm passaram a ficar

entre 70 e 80% e portanto mais próximos ao ideal valor de 90%.

Apesar de menos significativa, a melhora da 2extracoluna também contribuiu para o

aumento da eficiência remanescente durante a análise dos analitos mais retidos

(glibenclamida e glimepirida) nas colunas convencional e monolítica. Após redução

da 2extracoluna, os valores de Er da glibenclamida e glimepirida nas colunas

convencional e monolítica passaram de aproximadamente 90% para 95%.

Portanto, a otimização do sistema cromatográfico foi essencial para permitir que a

performance das colunas cromatográficas, em especial das colunas empacotadas

com partículas sub 2 µm e com partículas de núcleo fundido, fosse bem aproveitada,

apesar das limitações relacionadas à instrumentação e às próprias colunas. Por

último, vale destacar que o volume extracoluna estimado, calculado por meio da

soma dos volumes dos componentes do equipamento de UHPLC Acquity UPLC®, foi

igual a 9,7 μL e está de acordo com o valor próximo a 10 μL previsto na literatura

[2,4].

116


[1] FOUNTAIN, K. J.; NEUE, U. D.; GRUMBACH, E. S.; DIEHL, D. M. Effects of extra-column band spreading, liquid chromatography system operating pressure, and column temperature on the performance of sub-2μm porous particles. Journal of Chromatography A. v. 1216, p. 5979-5988, 2009. [2] NETO, A. J. S. Como obter maior eficiência com partículas superficialmente porosas em HPLC. Scientia Chromatographica, v. 3, n.1, p. 65-87, 2011. [3] BRADLEY, A. C.; WELCH, C. J.; ZHANG, L. Effect of extra-column volume on practical chromatographic parameters of sub-2-μm particle-packed columns in ultra-high pressure liquid chromatography. Journal of separation science. v. 35, p. 2018-2025, 2012. [4] HOW TO MEASURE AND REDUCE HPLC EQUIPMENT EXTRA COLUMN VOLUME. Disponível em: <http://www.mac-mod.com/pdf/MMA084-ReduceECV_ MM_Singles.pdf>. Acesso em: 20 de agosto de 2012. [5] FEKETE, S.; FEKETE, J. The impact of extra-column band broadening on the chromatographic efficiency of 5 cm long narrow-bore very efficient columns. Journal of Chromatography A. v. 1218, p. 5286-5291, 2011. [6] MAJORS, R. E. Are You Getting the Most Out of Your HPLC Column? LCGC North america. v. 21, n. 12, p.1124-1133, 2003. [7] AMPARO, M. R.; FRANZINI, C. D.; SCHIAVON, B.; CARVALHO, L. S.; de, NETO, A. J. S. Influência dos parâmetros instrumentais sobre o desempenho de coluna de HPLC com partículas superficialmente porosas sub-3 μm. Scientia Chromatographica. v. 3, n. 2, p.51-66, 2011. [8] GUIDELINES FOR THE USE OF UHPLC INSTRUMENTS. Disponível em: <http://www.unige.ch/sciences/pharm/fanal/lcap/Guidelines%20for%20the%20use%20of%20UHPLC%20instruments%20-%20site%20WEB%20labo.pdf>. Acesso em: 20 de Novembro de 2012. [9] FEKETEA, S.; GANZLER, K.; FEKETE,J. Efficiency of the new sub-2_m core–shell (KinetexTM) column in practice, applied for small and large molecule separation. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. v. 54, p. 482-490, 2011. [10] MCCALLEY, D. V. Instrumental considerations for the effective operation of short, highly efficient fused-core columns. Investigation of performance at high flow rates and elevated temperatures. Journal of Chromatography A. v. 1217, p. 4561-4567, 2010. [11] BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RE no. 899, de 29 de Maio de 2003. Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. Diário Oficial da União, Brasília, DF, Poder Executivo, de 02 de Junho de 2003c.

http://www.mac-mod.com/pdf/MMA084-ReduceECV_%20MM_Singles.pdf

http://www.mac-mod.com/pdf/MMA084-ReduceECV_%20MM_Singles.pdf

117

CAPÍTULO 4

AVALIAÇÃO E COMPARAÇÃO QUALITATIVA DA

EFICIÊNCIA DE COLUNAS CROMATOGRÁFICAS

118


1.1 Curvas de Van Deemter e de Knox

Tradicionalmente, colunas cromatográficas são caracterizadas e comparadas por

meio de suas respectivas curvas de Van Deemter, nas quais se plota a altura do

prato teórico (H) em função da velocidade linear da fase móvel (u0). A obtenção da

curva (H x u0) permite relacionar o alargamento do pico cromatográfico e a vazão da

fase móvel e determinar a velocidade linear (diretamente relacionada à vazão da

fase móvel) na qual a altura do prato teórico (diretamente relacionada ao

alargamento do pico) é mínima, ou seja, velocidade na qual a eficiência da coluna é

máxima. A altura mínima do prato teórica é abreviada como Hmin e a velocidade

linear ótima é abreviada como u0 otm. Um prato teórico representa uma etapa de

equilíbrio do soluto entre as fases móvel e estacionária. Dessa maneira, a altura de

um prato teórico está relacionada ao comprimento da coluna necessário para que

ocorra o equilíbrio. Quanto menor a altura do prato, mais estreita será a largura de

uma banda cromatográfica e maior a eficiência [1,2, 3].

A curva de Van Deemter é regida pela equação (4.1):

0

0

uCu

BAH (4.1)

H = altura do prato teórico, A = coeficiente de difusão de Eddy, B = coeficiente de

difusão longitudinal, C = coeficiente de resistência à transferência de massa, u0 =

velocidade linear da fase móvel.

Altos valores do termo A (coeficiente de difusão de Eddy) ocorrem em colunas que

não são bem empacotadas, o que resulta na presença de caminhos múltiplos e,

consequentemente, na difusão axial do soluto e alargamento do pico (Figura 4.1).

Quanto menor o diâmetro das partículas, menor é a possibilidade de formação de

caminhos múltiplos e menor é o coeficiente A. O termo A independe da velocidade

linear da fase móvel [4].

119

Figura 4.1 - Efeito da difusão de Eddy (A) no alargamento do pico [3]

Altos valores do termo B (coeficiente de difusão longitudinal) ocorrem em vazões

baixas da fase móvel (baixa velocidade linear) e quando um soluto de alto

coeficiente de difusão é analisado. Nessas condições a difusão longitudinal do soluto

aumenta, o que resulta em alargamento do pico (Figura 4.2) [4].

Figura 4.2 - Efeito da difusão longitudinal (B) no alargamento do pico [3]

Já o termo C (coeficiente de resistência à transferência de massa) diz respeito à

resistência à transferência de massa do analito entre as fases estacionária e móvel

(Figura 4.3) e está relacionado à taxa de sorção/dessorção ou difusão do soluto

entre as fases. Fenômenos como a estagnação da fase móvel entre os poros da

fase estacionária, diferentes velocidades de transferência do analito ao longo da

coluna e baixa dessorção e/ou difusão do analito contribuem para o aumento do

termo C e consequente alargamento do pico. Fatores que colaboram para a

elevação do termo C são o aumento da velocidade linear, do tamanho das partículas

da fase estacionária e a diminuição do coeficiente de difusão do analito [4].

120

Figura 4.3 - Efeito da resistência à transferência de massa (C) no alargamento do pico [3]

A relação entre a altura do prato teórico e os termos A, B e C, em função da

velocidade linear da fase móvel, é demonstrada na Figura 4.4. A soma da influência

desses coeficientes resulta na curva de Van Deemter [4].

Figura 4.4 - Contribuição dos termos A, B e C na obtenção da curva de Van Deemter [5]

Além das tradicionais curvas de Van Deemter, as chamadas curvas de Knox,

construídas a partir dos parâmetros H e u0 na forma reduzida, representados como h

e v, também podem ser utilizadas para fins de comparação do desempenho de

colunas. Essas curvas permitem a comparação das colunas eliminando a

121

variabilidade proporcionada pelos diferentes tamanhos de partículas das colunas e

coeficientes de difusão dos analitos, e são regidas pela equação de Knox (equação

4.2). A maior eficiência cromatográfica ocorre no menor valor de h (hmin), e a

velocidade linear reduzida ótima na qual hmin ocorre é abreviada como v0 opt. Baixos

valores de hmin estão relacionados a um empacotamento de alta qualidade. Para o

cálculo dos parâmetros reduzidos h e v aplicam-se as equações (4.3) e (4.4) [6].

CvBvAvh 3

1

(4.2)

pd

Hh (4.3)

m

p

D

duv

0 (4.4)

A = coeficiente de difusão de Eddy, B = coeficiente de difusão longitudinal,

C = coeficiente de resistência à transferência de massa, h = altura do prato teórico

reduzido, v = velocidade linear da fase móvel reduzida, u0 = velocidade linear da

fase móvel, H = altura do prato teórico, dp = diâmetro da partícula, Dm = coeficiente

de difusão do analito

Os formatos das curvas de Van Deemter e de Knox são influenciados pelo fator de

retenção do analito (k), já que os termos B e C de ambas dependem de k. Assim,

para comparação de duas ou mais colunas por meio de suas respectivas curvas de

Van Deemter ou Knox, o analito deve possuir fatores de retenção similares nas

colunas em estudo. Para tanto se faz necessário ajustar a composição da fase

móvel em cada coluna para garantir valores de k similares. É importante destacar

que o ajuste na composição da fase móvel introduz alterações em termos de

viscosidade da fase móvel e difusão do analito, fatores que também interferem no

formato das curvas de Van Deemter [7].

122

1.2 Características das curvas de Van Deemter e de Knox das colunas MN, NF

e Sub 2 μm

1.2.1 Coluna monolítica

As colunas monolíticas de sílica de primeira geração apresentam altura de prato na

faixa de 5 a 20 μm, e muitas vezes, a eficiência é comparável às de colunas

convencionais com partículas porosas de diâmetro entre 3,5-5 μm [8,9]. Por outro

lado, a eficiência das colunas monolíticas é inferior à de colunas empacotadas com

partículas de núcleo fundido e empacotada com partículas porosas sub 2 μm. Essas

observações podem ser ilustradas nas curvas de Van Deemter do etilbenzeno

(Figura 4.5), nas quais verifica-se que Hmin sub 2 μm = 4 μm < Hmin NF = 5 μm <

Hmin MN = 8 μm = Hmin CV = 8 μm. As condições de análise são fase móvel ACN:água

(70:30) e volume de injeção de 0,6 μl [10].

Figura 4.5 - Curvas de Van Deemter em quatro diferentes colunas obtidas para o etilbenzeno

[10]

Comparando-se as curvas de Van Deemter referentes às colunas convencional e

monolítica, apresentadas na Figura 4.5, percebe-se que a curva da coluna

monolítica é menos inclinada após o ponto mínimo. Significa que monolitos de sílica

exibem menores valores do termo C do que a coluna convencional, e, portanto,

maiores valores de vazão podem ser usados, propiciando análises mais rápidas com

menor perda de eficiência [11]. Esse comportamento pode ser explicado pela

123

natureza porosa do monolito de sílica, que propicia uma aprimorada transferência de

massa do analito entre as fases estacionária e móvel. Outra vantagem dessa

estrutura porosa e altamente permeável é a geração de valores de pressão baixos,

compatíveis com equipamento de HPLC [12].

Em trabalho publicado em 2004, verificou-se que coluna monolítica C18

(Chromolith®) foi comparável em termos de seletividade, reprodutibilidade e

eficiência à coluna particulada totalmente porosa de 3 μm, C18 (YMC®). A pressão

produzida em coluna monolítica foi 3,5 vezes menor que a produzida pela coluna

particulada, e a retenção foi 3,5 vezes menor. O fator de cauda obtido com a coluna

monolítica foi maior, entretanto aceitável [13]. Além desse, outro estudo também

destaca a tendência das colunas monolíticas (em especial as de primeira geração)

de gerar picos mais assimétricos, principalmente durante a análise de substâncias

básicas [14].

1.2.2 Coluna empacotada com partículas de núcleo fundido

As partículas de núcleo fundido são constituídas por um núcleo sólido, normalmente

de 1,7 µm de diâmetro, e uma camada porosa, normalmente de 0,5 µm, pela qual

ocorre o processo de difusão do analito. O menor caminho de difusão (0,5 µm),

quando comparado ao caminho de difusão presente nas partículas totalmente

porosas, facilita a transferência de massa e reduz o caminho intra partícula, o que

contribui para a redução do termo C (coeficiente de resistência à transferência de

massa) da equação de Van Deemter. A redução do coeficiente C minimiza o

alargamento dos picos, contribuindo para o aumento da eficiência, e é

especialmente importante em elevados valores de vazão da fase móvel, condição

que favorece o aumento do termo C [15].

Outra característica a ser destacada em colunas com partículas de núcleo fundido,

quando comparada às partículas totalmente porosas, é a distribuição mais

homogênea do tamanho das partículas no leito cromatográfico. Acredita-se que a

maior aspereza da superfície das partículas de núcleo fundido seja essencial para a

obtenção do leito cromatográfico mais homogêneo [16]. Como consequência há

menos caminhos múltiplos, o que diminui a difusão axial do analito. O resultado é a

124

redução do termo A (coeficiente de difusão de Eddy) da equação de Van Deemter, o

que minimiza o alargamento dos picos e contribui para o aumento da eficiência [15].

Os pequenos valores de hmin, (entre 1,5 e 4,0 μm) descritos na literatura para colunas

com partículas de núcleo fundido evidenciam a qualidade do leito cromatográfico

desse tipo de coluna [17].

Em trabalho de revisão publicado em 2011 foi relatado que em colunas com

partículas de núcleo fundido também há a redução da difusão longitudinal, ou seja,

redução do coeficiente B da equação de Van Deemter [16]. Esse comportamento é

decorrente do fato de aproximadamente 20% do volume da coluna ser ocupado por

uma sílica não porosa pela qual o analito não pode se difundir [17].

Resumindo, pode-se dizer que a melhora na eficiência cromatográfica verificada nas

colunas empacotadas com partículas de núcleo fundido, quando comparada às

colunas empacotadas com partículas totalmente porosas convencionais, é

consequência da redução dos termos A, B e C da equação de Van Deemter [16].

Analisando-se as curvas de Van Deemter referentes ao etilbenzeno (Figura 4.5),

observa-se o aumento da eficiência já que Hmin NF = 5 μm < Hmin CV = 8 μm [10]. Em

levantamento bibliográfico valores de Hmin entre 3 e 11 μm foram relatados para

análises em colunas de núcleo fundido de diferentes marcas [17].

Vale destacar que a redução do termo C justifica o fato de as curvas de Van

Deemter referentes às colunas de núcleo fundido serem menos inclinadas do que as

curvas das colunas com partículas porosas convencionais. Em colunas de partículas

de núcleo fundido, ao contrário do que acontece nas convencionais, verifica-se que

mesmo com o aumento da velocidade linear da fase móvel não há perda significativa

de eficiência, ou seja, não há aumento representativo de H. Sendo assim, utilizando-

se colunas com partículas de núcleo fundido, é possível a realização de análises

rápidas, com elevada velocidade linear da fase móvel, sem perda significativa de

eficiência. Além disso, deve-se lembrar de que as pressões geradas pelas colunas

com partícula de núcleo fundido são compatíveis com HPLC [16].

Estudos têm sido realizados atualmente com o objetivo de comparar as colunas de

partículas de núcleo fundido com aquelas empacotadas com partículas porosas sub

125

2 µm. Em 2008 um estudo foi realizado utilizando-se como modelo um método

analítico para separação de torcetrapibe e impurezas. Comparada com a coluna de

partícula porosa sub 2 µm, a de núcleo fundido atingiu 80% da eficiência e gerou

aproximadamente a metade da pressão [10].

1.2.3 Coluna empacotada com partículas sub 2 μm

As colunas com partículas totalmente porosas de diâmetro inferior a 2 μm

apresentam características que permitem análises rápidas e eficientes [18]. O

pequeno diâmetro das partículas (dp) contribui para a redução dos termos A e C da

curva de Van Deemter, o que minimiza o alargamento dos picos e aumenta a

eficiência (redução da altura do prato teórico H) [4].

A redução do termo A como resultado da redução do tamanho das partículas ocorre

porque o empacotamento de partículas menores gera menos espaços vazios dentro

do leito cromatográfico. Como consequência há menos caminhos, o que reduz a

difusão de Eddy das moléculas do soluto por entre a fase estacionária [4]. Já a

redução do termo C, também como consequência da redução do tamanho das

partículas, é explicada pelo fato de o menor diâmetro das partículas corresponder a

um menor caminho percorrido pelo analito na fase estacionária, facilitando a

transferência de massa do analito entre as fases estacionária e móvel [4].

Apesar das vantagens relatadas, a redução do diâmetro das partículas vem

acompanhada do aumento da pressão do sistema cromatográfico, já que a pressão

gerada é inversamente proporcional ao quadrado do diâmetro das partículas. Sendo

assim faz-se necessário a utilização de sistemas cromatográficos denominados

UHPLC, que suportam valores de pressões na ordem de 1000 bar [16,18].

Analisando-se o formato típico de uma curva de Van Deemter relativa à coluna de

partículas sub 2 μm (Figura 4.5), observa-se que de maneira similar ao que ocorre

com as colunas de núcleo fundido, o aumento da velocidade linear da fase móvel

não implica em perda significativa da eficiência, ou seja, não há aumento

significativo de H. É importante destacar que esse comportamento, que é

consequência da redução do termo C, é mais pronunciado nas colunas com

126

partículas sub 2 μm do que nas colunas com partículas de núcleo fundido. Além

disso, a eficiência cromatográfica gerada por colunas com partículas sub 2 μm é

superior à gerada por colunas com partículas de núcleo fundido, o que é evidenciado

comparando-se os valores de Hmin do etilbenzeno (Figura 4.5): Hmin NF = 5 μm > Hmin

Sub 2 μm = 4 μm [10]. Segundo dados da literatura, valores de Hmin entre 3 e 7 μm

foram encontrados para colunas com partículas sub 2 μm de diferentes marcas [17].

Encontram-se na literatura várias publicações relacionadas ao emprego de coluna

sub 2 µm e comparando-a com outras colunas. Exemplo é a análise de extrato de

raiz de gengibre por HPLC (coluna C18 - 2,1 x 100 mm - 5 µm) e por UHPLC (coluna

C18 - 2,1 x 100 mm - 1,7 µm). Foi verificado que o uso de UHPLC resultou em

aumento da resolução, da velocidade de análise, e melhora na detectabilidade [18].

1.3 Gráficos de performance cinética

Quando apenas colunas cromatográficas empacotadas eram utilizadas, elas podiam

ser comparadas a partir de seus respectivos valores de altura do prato teórico (H) ou

prato teórico reduzido (h). Entretanto, com a introdução de colunas monolíticas,

poliméricas e outras com diferentes formas e tamanhos, que apresentam maior

permeabilidade e menor resistência ao fluxo, a comparação em função dos valores

mínimos de H e h deixou de ser suficiente. Analisando as equações de Van Deemter

e de Knox verifica-se que a permeabilidade do leito cromatográfico não é um fator

considerado, e, portanto, informações sobre resistência ao fluxo e a possibilidade de

se utilizar altos valores de vazão e/ou colunas de maior comprimento não são

consideradas [19].

Para minimizar o problema que emergiu com a evolução das colunas

cromatográficas, pesquisadores passaram a avaliar a altura do prato teórico (H) e o

coeficiente de permeabilidade (Kv0) para comparação entre colunas. Entretanto,

tornou-se difícil avaliar simultaneamente os dois parâmetros. Além disso, nenhum

desses parâmetros trazia informação acerca do tempo de análise [19].

Na tentativa de correlacionar permeabilidade do leito cromatográfico, eficiência

cromatográfica e tempo de análise, Poppe e colaboradores propuseram a

127

elaboração de um gráfico de performance cinética (do inglês Kinetic Performance

Plot) do tipo (N x t0). Entretanto, a construção desse gráfico envolvia a utilização de

algoritmos e cálculos matemáticos, o que limitou a sua aplicabilidade [19,20].

Em 2005, Desmet e colaboradores desenvolveram fórmulas matemáticas simples

para a construção do gráfico de performance cinética (N x t0), anteriormente

proposto por Poppe. Para a construção desse gráfico faz-se necessário aplicar às

colunas cromatográficas valores crescentes de vazão da fase móvel. Para cada

valor de vazão testado um par de valores (u0 x H) é calculado (equações 4.5 e 4.6).

Posteriormente, fazendo-se uso dos pares de valores u0 e H e dos valores de

viscosidade da fase móvel, permeabilidade do leito cromatográfico e pressão

máxima suportada por cada coluna, os pares de valores (N x t0) são calculados

utilizando-se as equações (4.7) e (4.8) e, em seguida, plotados (Figura 4.6) [19].

N

LH (4.5)

10 kt

Lu

r

(4.6)

Hu

KvPN

0

0max

(4.7)

2

0

0max0

u

KvPt

(4.8)

H = altura do prato teórico, L = comprimento da coluna, N = número de pratos

teóricos, u0 = velocidade linear da fase móvel, tr = tempo de retenção, k = fator de

retenção, ΔPMax = pressão máxima suportada pelo sistema, η = viscosidade da fase

móvel, Kv0 = permeabilidade da coluna, u0 = velocidade linear da fase móvel, t0 =

tempo morto

128

Figura 4.6 - Gráfico de performance cinética (N x t0) [19]

As equações (4.5) e (4.6) transformam valores experimentais H e u0 em um número

projetado de pratos teóricos (N) e tempo morto (t0) que seriam obtidos caso a coluna

cromatográfica em estudo tivesse um comprimento tal que permitisse que a pressão

máxima suportada por ela fosse alcançada, considerando a análise em determinado

valor de u0 [1,19]. Portanto, o gráfico permite a comparação da relação entre

eficiência máxima estimada e tempo de análise mínimo de diferentes colunas [21].

A principal vantagem do gráfico de performance cinética (N x t0) é a visualização

direta da relação entre eficiência e tempo, e é ideal para a comparação do potencial

cromatográfico entre colunas de diferentes tamanhos e tipos de partículas. Por meio

dele é possível obter parâmetros importantes como o número de pratos teóricos no

qual a coluna atinge a melhor relação tempo de análise/pressão (Nopt) e o tempo

para se obter Nopt (Topt). O ponto Nopt x Topt é determinado traçando-se uma reta

tangente à curva obtida por meio do gráfico (N x t0), conforme representado na

Figura 4.6. Alternativamente, para facilitar a localização do ponto Nopt x Topt, pode-se

plotar o gráfico (N x t0/N2) e nesse gráfico o par Nopt x Topt está localizado no ponto

mínimo da curva [19].

Outros possíveis gráficos de performance cinética também podem ser construídos

por meio da aplicação de fórmulas matemáticas que convertem valores

experimentais u0 e H em outros pares de valores de interesse, como por exemplo

(np x tr) e (N, L). As variáveis np (capacidade de picos) e L (comprimento da coluna)

podem ser obtidas com o auxílio das equações (4.9) e (4.10), respectivamente [19].

129

kN

np 1ln4

1 (4.9)

HNL (4.10)

np = capacidade de picos, N = número de pratos teóricos, k = fator de retenção, L =

comprimento da coluna, H = altura do prato teórico

O gráfico de performance (np x tr) possibilita determinar o tempo mínimo necessário

para que determinado fator de capacidade de picos seja alcançado ou determinar o

maior fator de capacidade de picos que pode ser alcançado em determinado tempo,

considerando que a coluna é longa o bastante para que a pressão máxima por ela

suportada seja alcançada [1]. A capacidade de picos representa o número máximo de

picos que podem ser separados entre o tempo morto e o tempo de eluição do último

analito [22]. Já o gráfico (N x L) possibilita determinar o comprimento da coluna

cromatográfica necessário para que determinado valor N projetado seja alcançado.

Dessa forma é possível verificar se os valores projetados de N correspondem a

colunas de comprimento impraticáveis (muito longas ou curtas) [1].

Embora haja vantagens, os gráficos de performance cinética apresentam limitações.

Assume-se, para fins de cálculos, que a viscosidade da fase móvel (η), o fator de

retenção (k) e a permeabilidade do leito cromatográfico (Kv0) são constantes, ou

seja, que independem da vazão da fase móvel. Isso é verdade em condições

cromatográficas de pressão inferior a 400 bar. Sabe-se, entretanto, que em pressões

mais elevadas o aquecimento da fase móvel promove alterações nesses

parâmetros, muitas vezes difíceis de serem previstas. Assim, a análise dos gráficos

de performance cinética pode conduzir a estimativas incorretas acerca dos

potenciais cromatográficos das colunas que estão sendo comparadas [20, 23].

2 OBJETIVO ESPECÍFICO

O objetivo do estudo descrito nesse capítulo foi comparar colunas cromatográficas

monolítica (MN) e empacotadas com partículas porosas de 5 μm (CV), com

130

partículas de núcleo fundido de 2,7 μm (NF) e com partículas porosas de 1,8 μm

(Sub 2 μm), utilizando como modelo método analítico para determinação de

antidiabéticos orais (CL, GB, GM e GZ) e os parâmetros eficiência, velocidade de

análise, pressão, resolução entre os picos e fator de assimetria dos picos.


3.1 Materiais






Os mesmos descritos no capítulo1, item 3.1.3.

3.2 Métodos

3.2.1 Avaliação da eficiência e velocidade de análise das colunas

Para comparar a eficiência e velocidade de análise das colunas cromatográficas

utilizou-se como modelo o método analítico para determinação de antidiabéticos

orais desenvolvido em coluna convencional e aplicado às outras colunas após os

necessários ajustes na composição da fase móvel, conforme foi descrito no capítulo

1. O ajuste na composição da fase móvel foi realizado com o objetivo de manter os

valores dos fatores de retenção (k) dos analitos próximos em todas as colunas, já

que as curvas de Van Deemter e de Knox, usadas para comparar a eficiência das

colunas e velocidade de análise, têm o formato influenciado por k [7].

131

Os parâmetros instrumentais cromatográficos otimizados, descritos no capítulo 3,

foram utilizados nessa etapa do trabalho. O volume do loop, o diâmetro interno do

tubo de PEEK e a frequência de aquisição dos dados/tempo da constante de filtro

que promoveram a redução do efeito da variância extracoluna foram essenciais para

uma comparação mais fidedigna do real desempenho das colunas cromatográficas.

Na Tabela 4.1 encontra-se a descrição das condições de análise utilizadas.

Tabela 4.1 - Condições de análise para determinação de antidiabéticos nas quatro colunas*

Colunas Fase Móvel Vinj (μl) (nm) T (oC) Conc. (μg/ml)

Convencional ACN: Solução (50:50)** 2 230 30 100

Monolítica ACN: Solução (43:57)** 2 230 30 100

Núcleo Fundido ACN: Solução (50:50)** 2 230 30 100

Sub 2 μm ACN: Solução (53:47)** 2 230 30 100

* Parâmetros instrumentais cromatográficos: loop de 2 μl, tubo de PEEK de 0,004 polegada e frequência de aquisição dos dados e tempo da constante de filtros iguais a 40 Hz/0,025 s ** Solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0

Além das curvas de Van Deemter e de Knox, gráficos de performance cinética

também foram usados para comparação da performance e velocidade de análise

obtidas com cada uma das colunas cromatográficas avaliadas.

3.2.1.1 Curvas de Van Deemter

Aplicando-se os respectivos métodos analíticos apresentados na Tabela 4.1, cada

coluna foi submetida a valores crescentes de vazão (0,02 a 0,6 ml/min para as

colunas CV, NF e Sub 2 μm e 0,02 a 1,0 ml/min para a coluna MN). Determinaram-

se o número de pratos teóricos e o tempo de retenção dos picos referentes aos

quatro fármacos, em cada vazão avaliada e em cada coluna. Outro parâmetro

determinado em cada vazão e em cada coluna foi o tempo morto. Para estimativa do

tempo morto injetaram-se 2 μl de uracila (10 μg/ml).

A partir do número de pratos teóricos, tempo de retenção, tempo morto e fatores de

retenção (k), as alturas dos pratos teóricos (H) e os valores de velocidade linear da

fase móvel (u0) para cada antidiabético, em cada uma das vazões e colunas, foram

calculados. Para a realização dos cálculos foram utilizadas as equações (4.5) e

132

(4.6). A partir dos pares de valores (u0 x H) calculados, foram construídas curvas de

Van Deemter para os quatro antidiabético em cada coluna.

As equações matemáticas que descrevem cada uma das curvas de Van Deemter

construídas foram determinadas com o auxílio de um macro do Excel. A significância

das equações foi comprovada por meio da análise de variância (α = 5%) e a

significância dos coeficientes A, B e C de cada equação foi comprovada a partir da

aplicação do teste t-student (α = 5%).

A partir das equações matemáticas referentes às curvas de Van Deemter, os valores

de u0 opt e Hmin de cada analito, em cada coluna, foram calculados. Considerando

que o par de valores u0 opt e Hmin ocorre no ponto mínimo da curva, no qual a

inclinação da reta tangente é nula, pode-se dizer que a derivada da equação nesse

ponto é igual a zero. Considerando os arranjos matemáticos (Figura 4.7) u0 opt foi

estimado a partir das constantes B e C da equação de Van Deemter.

0

0

0 )( Cuu

BAuH

2

0

0'u

BCuH 0'

2

0

0 otm

otmu

BCuH

C

Bu otm 0

Figura 4.7 - Transformações matemáticas para o cálculo de u0 otm

Sendo assim, calculando-se a raiz da razão entre as constantes B e C, os valores de

u0 opt de cada analito, em cada coluna, foram determinados. Os valores de u0 opt

foram aplicados às equações de Van Deemter determinadas para cálculo dos

respectivos valores de Hmin.

3.2.1.2 Curvas de Knox

A partir dos pares de valores de u0 e H, usados na construção das curvas de Van

Deemter, foram calculados os parâmetros reduzidos v0 e h (equações 4.3 e 4.4).

133

O coeficiente de difusão (Dm) de cada analito foi estimado por meio da aplicação da

equação de Wilke Chang [24] e o diâmetro das partículas fornecido pelo fabricante

de cada coluna foram utilizados para a realização dos cálculos dos parâmetros

reduzidos. Como a coluna monolítica não possui partículas, o tamanho médio dos

poros do monolito de sílica da marca Onyx®, descrito na literatura como sendo igual

a 3,5 μm, foi utilizado em substituição ao diâmetro das partículas [25].

3.2.1.3 Gráficos de performance cinética

A partir dos pares de valores de u0 e H, usados na construção das curvas de Van

Deemter, foram calculados os pares de valores (N x t0), (np x tr) e (N, L) por meio das

equações 4.7. 4.8, 4.9 e 4.10. Em seguida esses pares de valores foram plotados

em gráficos. Para a realização dos cálculos foram utilizadas planilhas do Excel

desenvolvidas por Desmet e colaboradores [26].

3.2.2 Avaliação da resolução, fator de assimetria e pressão

Aplicando-se os métodos analíticos da Tabela 4.1, cada coluna foi submetida a

vazões crescentes de fase móvel. Para cada valor de vazão a pressão do sistema

foi registrada e os valores de resolução entre os pares de picos adjacentes e o fator

de assimetria dos picos calculados utilizando-se as equações (4.11) e (4.12) [2].

21

122

ww

ttR rr

s

(4.11)

A

BAs (4.12)

Rs = Resolução, tr1 e tr2 = tempos de retenção, w1 e w2 = larguras dos picos na linha

de base, As = Fator de assimetria, A = largura da metade direita do pico dividido a

partir do ponto de altura máxima, a 10% da altura, B = largura da metade esquerda

do pico dividido a partir do ponto de altura máxima, a 10 % da altura.

134


4.1 Avaliação da eficiência e velocidade de análise das colunas

4.1.1 Curvas de Van Deemter

As curvas de Van Deemter da clorpropamida (Figura 4.8), gliclazida (Figura 4.9),

glibenclamida (Figura 4.10) e glimepirida (Figura 4.11) em cada coluna em estudo

estão apresentadas a seguir.

Figura 4.8 - Curvas de Van Deemter da CL nas diferentes colunas

Figura 4.9 - Curvas de Van Deemter da GZ nas diferentes colunas

5

10

15

20

25

30

0.00 2.00 4.00 6.00

H (

μm

)

u0 (mm/s)

MN

CV

NF

Sub2

5

10

15

20

25

30

0.00 2.00 4.00 6.00

H (

μm

)

u0 (mm/s)

MN

CV

NF

Sub2

135

Figura 4.10 - Curvas de Van Deemter da GB nas diferentes colunas

Figura 4.11- Curvas de Van Deemter da GM nas diferentes colunas

As equações matemáticas que descrevem as curvas de Van Deemter das Figuras

4.8 e 4.9 estão apresentadas na Tabela 4.2 e as equações matemáticas que

descrevem as curvas de Van Deemter das Figuras 4.10 e 4.11 estão apresentadas

na Tabela 4.3.

5

10

15

20

25

30

0.00 2.00 4.00 6.00

H (

μm

)

u0 (mm/s)

MN

CV

NF

Sub2

5

10

15

20

25

30

0.00 2.00 4.00 6.00

H (

μm

)

u0 (mm/s)

MN

CV

NF

Sub2

136

Tabela 4.2 - Equações referentes as curvas de Van Deemter da CL e GZ - Figuras 4.8 e 4.9

Coluna Analito

Clorpropamida Gliclazida

CV H = 12,66 + 1,04/u0 + 3,14u0 H = 7,71 + 1,89/u0 + 3,36u0

MN H = 18,91 + 0,67/u0 + 1,84u0 H = 15,77 + 0,80/u0 + 1,58u0

NF H = 11,00 + 1,17/u0 + 0,88u0 H = 5,66 + 2,06/u0 + 0,85u0

Sub 2 μm H = 9,81 + 0,98/u0 + 0,54u0 H = 5,52 + 1,60/u0 + 0,48u0

Tabela 4.3 - Equações referentes as curvas de Van Deemter da GB e GM - Figuras 4.10 e 4.11

Coluna Analito

Glibenclamida Glimepirida

CV H = 6,63 + 1,90/u0 + 4,08u0 H = 6,59 + 1,69/u0 + 3,70u0

MN H = 13,57 + 0,97/u0 + 2,24u0 H = 13,91 + 1,14/u0 + 1,50u0

NF H = 5,24 + 1,72/u0 + 0,90u0 H = 4,55 + 1,85/u0 + 0,73u0

Sub 2 μm H = 5,14 + 1,46/u0 + 0,61u0 H = 4,44 + 1,51/u0 + 0,48u0

Analisando-se o perfil das curvas de Van Deemter apresentadas nas Figuras 4.8 a

4.11, verifica-se que aquelas referentes à coluna sub 2 μm, seguida da coluna com

partículas de núcleo fundido, são as menos inclinadas após o ponto de máxima

eficiência (Hmin). Significa que mesmo em altas velocidades lineares da fase móvel é

possível obter valores de eficiência próximos ao máximo quando essas colunas são

usadas. Por outro lado, as curvas de Van Deemter referentes à coluna convencional

são as mais inclinadas. Portanto, o emprego de altas velocidades lineares da fase

móvel na coluna convencional implica na obtenção de valores de eficiência distantes

do máximo que ela poderia propiciar. Já as curvas de Van Deemter relativas à

coluna monolítica apresentaram inclinações intermediárias. Curvas com aspectos

similares aos observados foram descritas na literatura, destacando-se trabalho

publicado em 2009 por Brice e colaboradores [10].

É sabido que quanto maior a influência do aumento da velocidade linear da fase

móvel na perda da eficiência cromatográfica, maior é a inclinação da curva de Van

Deemter após o ponto de máxima eficiência e maior é o coeficiente C [4]. Sendo

assim e considerando o exposto no parágrafo anterior, esperar-se-ia que para um

137

mesmo analito as equações relativas à coluna convencional apresentassem os

maiores valores do termo C, seguidos daqueles das colunas monolítica,

empacotadas com partículas de núcleo fundido e com partículas sub 2 μm. Os

resultados encontrados para o termo C, apresentadas na Tabela 4.2 e 4.3, são

compatíveis com o previsto. Para ilustrar, os termos C das equações relativas a

glimepirida em cada coluna são: C CV = 3,70; C MN =1,50; C NF = 0,73 e

C sub 2μm = 0,48.

Os dados apresentados na Tabela 4.2 e 4.3, evidenciam que o coeficiente A das

equações relativas a um mesmo analito foi maior nas análises realizadas em coluna

monolítica, seguida das análises em colunas convencional, empacotadas com

partículas de núcleo fundido e com partículas sub 2 μm. Para exemplificar os termos

A das equações relativas a glimepirida em cada coluna são: A MN = 13,91;

A CV = 6,59; A NF = 4,55 e A sub 2μm = 4,44. Para compreender os resultados é

importante considerar que o coeficiente A é tanto maior quanto maior for o número

de caminhos múltiplos e que o número de caminhos múltiplos é diretamente

proporcional ao diâmetro das partículas (dp) e inversamente proporcional à qualidade

do empacotamento/formação da coluna [4]. Sendo assim, como o diâmetro das

partículas na coluna sub 2 μm é 1,8 μm, menor que o presente na coluna de

partículas de núcleo fundido (dp = 2,7 μm), há menos caminhos múltiplos na coluna

sub 2 μm, o que explica o menor valor de A nas equações de Van Deemter relativas

à coluna sub 2 μm. O mesmo raciocínio se aplica para explicar a razão de o termo A

das equações relativas à coluna de núcleo fundido (dp = 2,7 μm) ser menor do que o

presente nas equações relativas à coluna convencional (dp = 5 μm). Para justificar os

maiores valores do termo A verificados nas equações relativas à coluna monolítica

pode-se supor a presença de um leito cromatográfico de baixa qualidade, com baixa

homogeneidade de tamanho dos poros, como já foi relatado em trabalhos da

literatura [10].

Na Tabela 4.4, apresentada a seguir, estão descritos os valores de Hmin e u0 opt das

curvas de Van Deemter apresentadas nas Figuras 4.8 a 4.11.

138

Tabela 4.4 - Valores de Hmin e u0 opt relativos às curvas de Van Deemter - Figuras 4.8 a 4.11

Analito Coluna cromatográfica

CV MN NF Sub 2 μm

Hmin

(μm)

u0 opt

(mm/s)

Hmin

(μm)

u0 opt

(mm/s)

Hmin

(μm)

u0 opt

(mm/s)

Hmin

(μm)

u0 opt

(mm/s)

CL 16,27 0,57 21,13 0,60 13,03 1,15 11,26 1,34

GZ 12,75 0,75 18,02 0,71 8,31 1,56 7,27 1,83

GB 12,20 0,68 16,52 0,66 6,36 1,38 7,03 1,54

GM 11,59 0,68 16,53 0,87 6,87 1,60 6,14 1,78

Analisando-se os resultados percebe-se que os valores de Hmin dos antidiabéticos

analisados em uma mesma coluna são tanto menores quanto maior é o fator de

retenção (kGM > kGB > kGZ > kCL). Essa observação deve-se ao fato de os analitos

menos retidos serem mais afetados pelo efeito extracoluna, o que promove redução

da eficiência, como foi discutido no capítulo 3 [27]. Verifica-se também que a

influência do fator de retenção na eficiência é mais significativa nas colunas

empacotadas com partículas sub 2 μm e de núcleo fundido, seguida da coluna

monolítica e por último da convencional. Justifica-se esse resultado considerando

que as colunas empacotadas com partículas sub 2 μm e de núcleo fundido são mais

afetados pelo efeito extracoluna, como também foi discutido no capítulo 3.

Para fins de comparação da eficiência cromatográfica das colunas, serão discutidos

apenas os resultados relativos à glimepirida, fármaco mais retido e, portanto, menos

influenciado pelo efeito extracoluna. A menor influência do efeito extracoluna

permite que a eficiência verificada experimentalmente seja a mais próxima da real

eficiência que a coluna é capaz de gerar. Analisando-se os resultados referentes à

glimepirida apresentados na Tabela 4.4 verifica-se que o menor valor de Hmin foi

obtido em análise realizada na coluna de partículas sub 2 μm (Hmin = 6,14). O valor

de Hmin obtido na coluna empacotado com partículas de núcleo fundido foi um pouco

maior (Hmin = 6,87), e essa diferença significa que a coluna de núcleo fundido

apresentou eficiência máxima equivalente a 89% da eficiência máxima propiciada

pela coluna de partículas sub 2 μm. Maiores valores de Hmin foram gerados pelas

colunas convencional (Hmin = 11,59) e monolítica (Hmin = 16,53).

139

De acordo com a literatura era de se esperar que a coluna com partículas sub 2 μm

fosse a mais eficiente (em função do menor tamanho de partícula) e que a eficiência

da coluna de partículas de núcleo fundido, também elevada (em função da estrutura

superficialmente porosa), fosse um pouco inferior [15,18]. Entretanto, a maior

eficiência da coluna convencional quando comparada à propiciada pela coluna

monolítica não está de acordo com a literatura. Esperar-se-ia que a coluna

monolítica apresentasse eficiência comparável à da coluna convencional [8, 9].

É importante também comparar os valores de velocidade ótima (u0 opt) das quatro

colunas cromatográficas, apresentados na Tabela 4.4. Como a velocidade linear

ótima da fase móvel é inversamente proporcional ao diâmetro das partículas (dp), era

de se esperar que a coluna convencional (dp = 5 μm) apresentasse a menor

velocidade (u0 opt = 0,68 mm/s - vazão de aproximadamente 0,08 ml/min) e que a

coluna com partículas sub 2 μm (dp = 1,8 μm) apresentasse a maior velocidade

(u0 opt = 1,78 mm/s - vazão de aproximadamente 0,2 ml/min) [28]. A velocidade linear

ótima de análise da glimepirida em coluna de núcleo fundido (u0 opt = 1,60 mm/s -

vazão um pouco abaixo de 0,2 ml/min), apesar de um pouco menor, foi próxima a

obtida em coluna com partículas sub 2 μm (u0 opt = 1,78 mm/s). Resultados similares

já foram descritos na literatura. Em experimento realizado com benzofenona

verificou-se que a velocidade linear ótima de análise em colunas de núcleo fundido e

de partículas sub 2 μm foram bem próximas, ficando em torno de 3 mm/s [10].

Quanto à velocidade linear ótima da coluna monolítica (u0 opt = 0,87 mm/s - vazão de

aproximadamente 0,15 ml/min), verificou-se que ela foi maior do que a apresentada

pela coluna convencional, mas inferior à das outras colunas.

Considerando as discussões sobre o formato das curvas de Van Deemter e sobre

valores de Hmin e u0 opt, conclui-se que as colunas com partículas sub 2 μm e com

partículas de núcleo fundido apresentaram maior eficiência máxima, ou seja,

menores valores de Hmin, os quais ocorreram em maiores velocidades. O formato

menos inclinado das curvas de Van Deemter referentes a essas colunas permite o

emprego de altas velocidades lineares da fase móvel com obtenção de eficiência

próxima ao máximo que elas poderiam propiciar, ou seja, há nessas colunas um

maior compromisso entre eficiência e velocidade de análise. As colunas monolítica e

convencional são menos eficientes (maiores valores de Hmin) e ao aumento da

140

velocidade de análise corresponde maior perda de eficiência (maiores valores do

termo C). É importante destacar que quando se comparam apenas as colunas

monolítica e convencional, apesar de a convencional ter apresentado maior

eficiência máxima, em maiores velocidades de análise a eficiência propiciada pela

coluna monolítica foi maior, em consequência da estrutura altamente porosa, que

permite maior transferência de massa, inclusive em altas velocidades.

4.1.2 Curvas de Knox

Curvas de Knox relativas à glimepirida nas quatro colunas estão apresentadas na

Figura 4.12. Esse fármaco foi selecionado como modelo, pois, como já explicado, é

o mais retido e, portanto, menos influenciado pelo efeito extracoluna.

Figura 4.12 - Curvas de Knox da GM nas diferentes colunas

As equações relativas às curvas apresentadas na Figura 4.12, bem como os valores de

hmin e v0 opt de cada curva, estão descritos na Tabela 4.5.

Tabela 4.5 - Equações e valores de hmin e vo opt correspondentes às curvas de Knox da GM

Equação hmin (μm) v0 opt (mm/s)

CV h = 1,32 + 2,72/v0 + 0,09v0 2,31 5,43

MN h = 4,97 + 1,93/v0 + 0,11v0 5,89 4,14

NF h = 1,68 + 2,98/v0 + 0,06v0 2,53 6,93

Sub 2 μm h = 2,47 + 2,30/v0 + 0,10v0 3,43 4,89

0

2

4

6

8

10

12

0.00 10.00 20.00 30.00 40.00

h (

μm

)

v0 (mm/s)

MN

Sub2

NF

CV

141

Com o auxílio das curvas de Knox a performance das colunas cromatográficas

podem ser avaliadas independentemente do diâmetro das partículas (dp) das

colunas e dos coeficientes de difusão (Dm) dos analito, já que os parâmetros

reduzidos h e v0 são normalizados em função de dp e Dm, como pode ser verificado

nas equações 4.3 e 4.4. Sendo assim, as diferenças entre os valores de hmin e v0 opt

são consequência apenas da qualidade do empacotamento da coluna [4]. Os

resultados apresentados na Tabela 4.5 evidenciam que as colunas convencional e

com partículas de núcleo fundido são as mais bem empacotadas (hmin CV = 2,31 μm e

hmin NF = 2,53 μm), seguidas da coluna com partículas sub 2 μm (hmin Sub 2 μm = 3,43

μm) e por último da coluna monolítica (hmin MN = 5,89 μm). A elevada qualidade de

empacotamento da colunas de núcleo fundido já foi descrita na literatura e está

relacionada a uma distribuição homogênea do tamanho das partículas [16]. Era de

se esperar que a coluna convencional, que possui partículas de diâmetro igual a 5

μm, apresentasse melhor empacotamento do que a coluna com partículas sub 2 μm,

já que é mais difícil a produção de partículas menores de tamanho homogêneo [29].

O elevado valor de hmin obtido pela coluna monolítica pode ser consequência de um

leito cromatográfico com poros irregulares, situação já descrita na literatura [10,13].

4.1.3 Gráficos de performance cinética

Serão apresentados gráficos de performance cinética relativos à glimepirida

(fármaco mais retido e portanto menos influenciado pelo efeitos extracoluna) nas

diferentes colunas. O primeiro deles (Figura 4.13) é um gráfico do tipo (N x T0/N2).

Figura 4.13 - Gráfico de performance cinética (N x t0/N2) da GM

1.00E-08

1.00E-07

1.00E-06

1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 1.00E+06

MN

CV

NF

Sub2

t0/N2 (s)

N (/)

142

Avaliando-se o gráfico apresentado na Figura 4.13 percebe-se que análises que

requerem número de pratos teóricos em torno de 1 x 105 serão realizadas mais

rapidamente em colunas empacotadas com partículas sub 2 μm. Pela aparente

tendência dos gráficos verifica-se também que análises que exijem uma eficiência

maior, com o número de pratos em torno de 1 x 106, serão realizadas mais

rapidamente em colunas de núcleo fundido, e aquelas que exijem menores

eficiências serão realizadas mais rapidamente em colunas empacotadas com

partículas sub 2 μm. Outro dado importante obtido diz respeito aos valores ótimos de

eficiência (Nopt) de cada coluna (ponto mínimo das curvas), que diz respeito ao

número de pratos teóricos obtidos quando a coluna atinge a sua melhor performance

cinética (menor relação entre tempo e eficiência em dada pressão). Os valores de

Nopt das colunas empacotadas com partículas de núcleo fundido e com partículas

sub 2 μm estão na faixa de 1,5 x 105 e os valores de Nopt das colunas convencional e

monolítica são menores (cerca de 5 a 6 x 104).

O segundo gráfico de performance cinética é do tipo (N x L) e está apresentado na

Figura 4.14.

Figura 4.14 - Gráfico de performance cinética (N x L) da GM

O gráfico apresentado na Figura 4.14 demonstra o tamanho da coluna necessário

para que um determinado número de pratos teóricos seja alcançado. Como exemplo,

para a coluna Sub 2 µm seria necessária uma coluna de, aproximadamente, 90 cm

para que um número de pratos de 1 x 105 fosse alcançado.

0.10

1.00

10.00

1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 1.00E+06

MN

CV

NF

Sub2

L (m)

N (/)

143

O último gráfico de performance cinética elaborado é do tipo (np x tr) (Figura 4.15).

Figura 4.15 - Gráfico de performance cinética (np x tr) da GM

O gráfico apresentado na Figura 4.15 evidencia que, considerando o mesmo tempo

de análise, é possível que um maior número de picos sejam separados na coluna

empacotada com partículas sub 2 μm, seguida da coluna de núcleo fundido,

convencional e monolítica. Como exemplo, considerando um tempo de análise de

10000 s (aproximadamente 3 horas), seria possível separar aproximadamente 130

picos na coluna monolítica, 160 na coluna convencional, 210 na coluna de núcleo

fundido e 230 na coluna empacotada com partículas sub 2 μm.

4.2 Avaliação da resolução, fator de assimetria e pressão

4.2.1 Resolução

Na Tabela 4.6 estão apresentados os resultados de resolução (Rs) entre os pares de

picos adjacentes (gliclazida e clorpropamida - GZ/CL; glibenclamida e gliclazida -

GB/GZ; glimepirida e glibenclamida - GM/GB), em vazões de 0,02 a 0,6 ml/min.

1.00E+00

1.00E+01

1.00E+02

1.00E+03

1.00E+04

1.00E+05

1.00E+06

10 60 110 160 210 260 310 360 410

MN

CV

NF

Sub2

tr (s)

np (/)

144

Tabela 4.6 - Valores de resolução entre GZ/CL, GB/GZ e GM/GB nas diferentes colunas

Vazão (ml/min)

Resolução - Rs

GZ/CL GB/GZ GM/GB

CV MN NF Sub2 CV MN NF Sub2 CV MN NF Sub2

0,60 7,35 7,65 11,08 12,22 5,53 8,07 10,10 10,03 2,72 3,23 4,57 4,75

0,40 8,08 7,93 11,72 13,37 6,16 8,35 10,40 10,15 3,04 3,34 4,79 4,79

0,30 8,58 8,10 12,11 13,21 6,56 8,51 10,66 10,01 3,26 3,38 4,98 4,85

0,20 9,19 8,34 12,18 13,11 7,08 8,93 10,60 9,80 3,57 3,55 5,02 4,87

0,15 9,23 8,47 12,19 12,96 7,33 9,14 10,60 9,66 3,74 3,67 5,11 4,89

0,10 9,71 8,63 11,80 12,77 7,57 9,32 10,10 9,42 3,83 3,75 4,89 4,88

0,08 9,75 8,73 11,67 12,52 7,64 9,48 9,90 9,17 3,91 3,83 4,79 4,79

0,06 9,83 8,72 11,50 12,32 7,63 9,43 9,60 8,84 3,82 3,80 4,57 4,62

0,04 9,23 8,60 10,73 11,77 7,16 9,19 8,70 8,18 3,64 3,69 4,16 4,32

0,02 8,03 7,63 9,03 9,96 5,82 7,92 7,10 6,78 3,04 3,17 3,36 3,53

Média 8,90 8,28 11,40 12,42 6,85 8,83 9,77 9,20 3,46 3,54 4,62 4,63

Antes de analisar os dados é importante lembrar que a resolução (Rs) entre dois

picos cromatográficos depende da seletividade (α), do número de pratos teóricos (N)

e do fator de retenção (k), como poder ser verificado na equação 4.13 [2].

k

kNRs

1)1(4/1

(4.13)

Os fatores de retenção dos analitos em todas as colunas são similares, já que foi

realizado o ajuste na composição da fase móvel para que isso ocorresse. Sendo

assim, as diferenças entre os valores de resolução verificados devem-se às

diferenças na seletividade e no número de pratos teóricos.

Foi constatado no capítulo 2 que as colunas em estudo, todas de fase ligada C18,

possuem seletividades similares. Entretanto é importante destacar que nesse

experimento foram utilizadas fases móveis de diferentes composições, o que

também interfere na seletividade [2,4]. Considerando que as fases móveis utilizadas

nas colunas convencional e de núcleo fundido possuem a mesma composição

(ACN: solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0 50:50), a qual é muito similar a

fase móvel utilizada na coluna de partículas sub 2 μm (ACN:solução de acetato de

amônio 5 mM pH 3,0 53:47), pode-se dizer que o principal fator que explica as

145

diferenças nos valores de resolução verificados entre as colunas convencional, de

partículas de núcleo fundido e de partículas sub 2 μm é o número de pratos teóricos.

Já a coluna monolítica foi submetida a uma fase móvel de composição bem distinta,

de menor força eluotrópica (ACN:solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0 43:57).

Sendo assim as diferenças nos valores de resolução verificados entre a coluna

monolítica e as outras é devido aos fatores seletividade e número de pratos teóricos.

Analisando-se os valores médios de resolução entre os picos (Tabela 4.6), constata-

se que os maiores valores foram alcançados com as colunas de partículas sub 2 μm

e de núcleo fundido e os menores valores correspondem às colunas monolítica e

convencional. Esse resultado pode ser atribuído ao fato de as colunas de partículas

sub 2 μm e de núcleo fundido gerarem maior eficiência (maior número de pratos

teóricos) do que as colunas monolítica e convencional. A eficiência cromatográfica

dessas colunas pode ser constatada nas curvas de Van Deemter apresentadas nas

Figuras 4.8 a 4.11. A vantagem, em termos de resolução, propiciada pelas colunas

de partículas de núcleo fundido e sub 2 μm em relação às colunas monolítica e

convencional já foram relatadas na literatura [10, 30, 31].

É importante destacar que apesar de a coluna monolítica ter sido menos eficiente do

que a coluna convencional, como verificado nas Figuras 4.8 a 4.11, as resoluções

propiciadas por ela foram próximos e até maiores do que as observadas entre os

picos gerados pela coluna convencional. Esse comportamento é devido à maior

seletividade da fase móvel utilizada na análise com coluna monolítica, a qual possui

menor força eluotrópica [2,4]. Avaliando-se a equação 4.13 percebe-se que a

resolução é mais influenciada pela seletividade (α) do que pelo número de pratos

teóricos (N) [32]. Isso explica o fato de os valores de resolução entre os picos

obtidos em coluna monolítica, apesar de apresentarem menor número de pratos

teóricos do que os obtidos em coluna convencional, serem próximos e até maiores

do que os valores de resolução entre os picos obtidos em coluna convencional.

Para ilustrar, estão apresentados na Figura 4.16 os cromatogramas referentes às

análises dos antidiabéticos em cada coluna, na vazão de 0,4 ml/min.

146

Figura 4.16 - Cromatogramas relativos às análises dos antidiabéticos nas colunas (a) CV,

(b) MN, (c) NF e (d) Sub 2 μm - ordem de eluição: CL, GZ, GB e GM.

4.2.2 Fator de assimetria dos picos

Na Tabela 4.7 estão apresentados os resultados dos fatores de assimetria dos picos

referentes aos antidiabéticos, determinados em vazões de 0,02 a 0,6 ml/min.

147

Tabela 4.7 - Fatores de assimetria dos picos dos antidiabéticos orais nas diferentes colunas

Vazão (ml/min)

Fator de Assimetria

Clorpropamida Gliclazida Glibenclamida Glimepirida

CV MN NF Sub2 CV MN NF Sub2 CV MN NF Sub2 CV MN NF Sub2

0,60 1,12 1,01 1,23 1,23 1,05 0,83 1,09 1,08 1,03 0,81 0,97 0,93 1,03 0,78 1,01 0,98

0,40 1,13 1,02 1,22 1,15 1,06 0,83 1,09 1,01 1,03 0,82 0,96 0,90 1,05 0,78 0,99 0,92

0,30 1,12 1,03 1,21 1,14 1,07 0,84 1,09 1,02 1,01 0,82 0,96 0,91 1,03 0,79 0,99 0,92

0,20 1,13 1,07 1,19 1,16 1,07 0,89 1,08 1,03 1,02 0,85 0,97 0,91 1,03 0,81 1,00 0,93

0,15 1,13 1,08 1,17 1,12 1,09 0,92 1,06 1,03 1,02 0,87 0,98 0,93 1,03 0,83 0,99 0,94

0,10 1,10 1,08 1,12 1,13 1,07 0,96 1,06 1,04 1,03 0,92 0,95 0,99 0,92 1,01 0,96 1,00

0,08 1,10 1,08 1,12 1,08 1,05 0,98 1,06 1,06 1,01 0,97 0,96 1,00 0,97 1,04 0,99 1,00

0,06 1,07 1,09 1,10 1,10 1,05 1,02 1,05 1,05 1,02 0,98 0,97 1,00 0,98 1,01 0,99 1,02

0,04 1,07 1,08 1,06 1,09 1,03 1,01 1,06 1,04 1,02 1,07 0,99 1,00 1,07 1,01 1,00 1,02

0,02 1,05 1,05 1,05 1,05 1,02 1,08 1,01 1,08 0,99 1,03 0,99 1,00 1,03 1,05 1,01 1,03

Média 1,10 1,06 1,15 1,13 1,06 0,94 1,07 1,04 1,02 0,91 0,98 0,95 1,03 0,88 1,01 0,96

148

O fator de assimetria de um pico cromatográfico deve estar compreendido entre 0,8-

1,8, sendo que o fator ideal é 1,0 [33]. Percebe-se que há uma tendência de melhora

da simetria dos picos com o aumento da retenção dos analitos (kGM > kGB > kGZ >

kCL) para análises realizadas nas colunas convencional, de núcleo fundido e sub 2

μm. Isso ocorre porque analitos mais retidos sofrem menos o efeito extracoluna e

consequentemente picos mais simétricos são obtidos.

Já nas análises realizadas em coluna monolítica a situação inverte-se: a simetria do

pico piora com o aumento da retenção. Esse comportamento ocorre porque a causa

predominante da piora da simetria dos picos analisados em coluna monolítica não é

o efeito extracoluna e sim o fato de a fase monolítica apresentar um leito

cromatográfico irregular, com baixa homogeneidade de tamanho de poros, como já

foi descrito na literatuta [10, 13, 14]. Sendo assim, quanto maior a interação com

esse leito irregular (maior k), pior é a simetria do pico. Na literatura há trabalhos que

descrevem que, de uma maneira geral, os picos em colunas monolíticas, em

especial os relativos a substâncias básicas, são menos simétricos do que os

gerados em colunas empacotadas. Esse foi um dos motivos que impulsionou o

desenvolvimento das fases monolíticas de segunda geração, que dentre outras

características, dão origem a picos de melhor simetria [8].

4.2.3 Pressão do sistema cromatográfico

A relação entre vazão e pressão durante a análise dos antidiabéticos orais nas

diferentes colunas está apresentada na Figura 4.17.

Figura 4.17 - Relação entre vazão e pressão nas diferentes colunas

0

200

400

600

800

1000

0.00 0.30 0.60 0.90 1.20

Pre

ssão

(b

ar)

Vazão (ml/min)

Sub2

NF

MN

CV

149

Verifica-se que em um mesmo valor de vazão os maiores valores de pressão foram

gerados pela coluna com partículas totalmente porosas sub 2 μm. Para exemplificar:

na vazão de 0,6 ml/min a pressão gerada pela coluna sub 2 μm foi de 632 bar,

aproximadamente cinco vezes maior do que a pressão gerada pelas colunas

convencionais e monolítica, e 1,5 vezes maior do que a gerada pela coluna com

partículas de núcleo fundido. Considerando que a pressão é inversamente

proporcional ao quadrado do diâmetro das partículas da coluna, e que a coluna sub

2 μm utilizada possui partículas de apenas 1,8 μm de diâmetro, elevados valores de

pressão, já descritos na literatura, eram esperados. Esse aumento da pressão

justifica a necessidade da utilização de um equipamento de UHPLC [15,18].

Como já foi dito, quando se trabalhou com partículas de núcleo fundido a pressão foi

de aproximadamente 65% da gerada por partículas totalmente porosas sub 2 μm.

Na literatura há trabalhos que demonstram que essa relação está em torno de 50%

[10]. É importante destacar que a pressão gerada pela coluna de núcleo fundido foi

compatível com o sistema de HPLC (Pmax = 400 bar).

As colunas monolítica e convencional apresentaram valores de pressão mais baixos,

compatíveis com sistemas de HPLC, e próximos entre si.

5 CONCLUSÃO

Conclui-se que as colunas com partículas sub 2 μm e com partículas de núcleo

fundido apresentaram maior eficiência máxima (Ex.: Hmin Sub 2μm GM = 6,14 μm e

Hmin NF GM = 6,87 μm), os quais ocorreram em maiores velocidades lineares de fase

móvel (Ex.: u0 opt Sub 2μm GM = 1,78 mm/s e u0 opt NF GM = 1,60 mm/s). O formato menos

inclinado das curvas de Van Deemter referentes a essas colunas permite o emprego

de altas velocidades de fase móvel com obtenção de eficiência próxima a máxima.

Já as colunas monolítica e convencional foram menos eficientes

(Ex.: Hmin MN GM = 16,53 μm e Hmin CV = 11,59 μm) e com o aumento da velocidade de

análise houve uma maior perda de eficiência (maiores valores do termo C). Quando

se comparam apenas as colunas monolítica e convencional, apesar de a

convencional ter propiciado análises de maior eficiência máxima, em altas

150

velocidades a eficiência gerada pela monolítica foi maior, o que é consequência da

estrutura permeável, que permite melhor transferência de massa.

Analisando-se as curvas de Knox percebe-se que as colunas convencional e com

partículas de núcleo fundido foram melhor empacotadas (Ex.: hmin CV GM = 2,31 μm e

hmin NF GM = 2,53 μm), seguidas das colunas com partículas sub 2 μm

(Ex.: hmin Sub 2 μm GM = 3,43 μm). A coluna monolítica apresentou o pior processo

produtivo (Ex.: hmin MN GM = 5,89 μm).

Avaliando-se os gráficos de performance cinética verifica-se que a coluna

empacotada com partículas sub 2 μm, seguida da coluna de núcleo fundido, são

capazes de dar origem a análises com maior capacidade de picos e com maior

número de pratos teóricos em tempos de análise mais curtos.

Analisando-se a resolução constata-se que maiores valores foram alcançados com

as colunas de partículas sub 2 μm e de núcleo fundido. Quanto à simetria nota-se

que com exceção da monolítica, que gerou picos mais assimétricos, todas as outras

colunas deram origem a picos de boa simetria. Quanto à pressão nota-se que a

gerada pela coluna sub 2 μm foi aproximadamente 1,5 maior do que a gerada pela

coluna com partículas de núcleo fundido, sendo que em vazões acima de 0,4 ml/min

a coluna sub 2 μm gerou pressões que requerem sistemas de UHPLC, ao contrário

da coluna de núcleo fundido, que gerou pressão compatível com sistemas de HPLC.

As colunas monolítica e convencional geraram os valores mais baixos de pressão,

também compatíveis com sistemas de HPLC.

Considerando o exposto conclui-se que a coluna empacotada com partículas de

núcleo fundido é a melhor alternativa à coluna convencional. A coluna monolítica,

apesar de compatível com HPLC e de propiciar análises mais rápidas com maior

eficiência do que a coluna convencional, apresenta eficiência cromatográfica bem

inferior à gerada pelas colunas de núcleo fundido e sub 2 μm, além de dar origem a

picos de pior simetria e ser, dentre todas as colunas, a de maior custo.

Considerando a análise da glimepirida para exemplificar, verifica-se que coluna de

núcleo fundido gerou análises com 90% da eficiência máxima e da velocidade ótima

e aproximadamente a mesma resolução propiciada pela coluna sub 2 μm, com a

151

grande vantagem de não gerar no sistema pressões acima de 400 bar, e portanto

não requerer a utilização de sistemas de UHPLC, mais caros e menos disponíveis.

Da mesma maneira que a coluna sub 2 μm, a coluna de núcleo fundido foi capaz de

manter elevada eficiência em altas velocidades de análise e de gerar picos de boa

simetria. Além disso, já é possível encontrar no mercado colunas de núcleo fundido

com aproximadamente o mesmo preço que colunas convencionais.

152


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155

CAPÍTULO 5

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS

EXTREMAMENTE RÁPIDOS

156


1.1 Métodos analíticos extremamente rápidos

Há uma crescente demanda para aumentar a produtividade e reduzir os custos em

análise farmacêutica. Recentemente, novas colunas cromatográficas (monolítica,

empacotada com partículas de núcleo fundido e empacotada com partículas porosas

de diâmetro inferior a 2 μm), novas geometrias (menores comprimento e diâmetro

interno), novas abordagens (como o uso de temperatura elevada - HTLC) e novos

instrumentos (UHPLC) foram introduzidos no mercado de modo a reduzir o tempo de

análise mantendo a eficiência cromatográfica [1].

Associado às novas alternativas, o aumento da vazão da fase móvel é uma maneira

simples de reduzir o tempo de análise. Entretanto, com o aumento da vazão tem-se

elevação da pressão e, portanto, para se estabelecer a vazão máxima à qual uma

coluna pode ser submetida deve-se considerar a pressão máxima que ela suporta.

[1, 2].

As colunas convencional com partículas totalmente porosas (CV), monolítica (MN),

empacotada com partículas de núcleo fundido (NF) e empacotada com partículas

porosas de diâmetro inferior a 2 μm (Sub 2 μm), podem ser submetidas a diferentes

valores máximos de pressão. Normalmente, as colunas monolíticas de sílica

suportam uma pressão máxima de 200 bar, as empacotadas com partículas de

núcleo fundido resistem a uma pressão de até 600 bar e as empacotadas com

partículas totalmente porosas de diâmetro inferior a 2 μm podem ser submetidas a

valores de pressão em torno de 1000 bar [3]. Colunas convencionais, empacotadas

com partículas totalmente porosas de diâmetro entre 3 e 5 μm suportam pressão

máxima de aproximadamente 275 bar [4].

Em função da demanda para aumentar a produtividade em análise farmacêutica, há

trabalhos na literatura que descrevem o desenvolvimento de análises extremamente

rápidas utilizando novas colunas cromatográficas. Em um deles métodos rápidos

para análise de formulação de lidocaína foram desenvolvidos e validados em coluna

monolítica e em coluna empacotada com partículas sub 2 μm. Em seguida,

157

comparação em termos quantitativos entre os métodos desenvolvidos foi realizada

utilizando os parâmetros seletividade, exatidão e precisão. Na Figura 5.1 estão

apresentados os cromatogramas referentes às análises da formulação de lidocaína

nas colunas convencional (C18 150 × 4,6 mm, 5 μm, fase móvel composta por ACN

e acetato de amônio pH 7,2 (60:40) na vazão 1 ml/min e temperatura 30 oC),

monolítica (C18 100 × 4,6 mm, fase móvel composta por ACN e acetato de amônio

pH 6 (32:68), vazão 5 ml/min e temperatura 30 oC) e sub 2 μm (C18 50 × 2,1 mm,

1.7 μm, fase móvel constituída de ACN e acetato de amônio pH 7,2 (60:40), vazão

1 ml/min e temperatura 30 oC) [5].

Figura 5.1 - Cromatogramas referentes à formulação de lidocaína - (1) metilparabeno, (2) 2,6-

dimetilanilina, (3) propilparabeno e (4) lidocaína nas colunas (a) CV, (b) MN e (c) Sub 2 μm [5]

Em relação à comparação dos parâmetros quantitativos foi verificado que todos os

métodos foram seletivos e exatos (percentual de recuperação entre 99,2 - 101,3%).

Quanto à precisão (repetibilidade e precisão intermediária) valores aceitáveis foram

observados, com apenas dois valores superiores ao limite de repetibilidade

esperado [5].

Em outro estudo foi demonstrada a capacidade da coluna empacotada com

partículas de núcleo fundido em conduzir análise extremamente rápida de quatro

compostos farmacêuticos de pequena massa molecular (entre 300 e 500 daltons). A

158

análise em coluna convencional (C18, 5 μm, 2,1 × 50 mm, vazão da fase móvel 0,4

ml/min) foi realizada em 3,10 minutos e a análise realizada em coluna de núcleo

fundido (C18, 2,7 μm, 2,1 mm × 20 mm, vazão da fase móvel 1 ml/min) levou apenas

0,85 minuto [6].

1.2 Métodos analíticos para determinação de sulfoniluréias

Há na literatura métodos para quantificação de sulfoniluréias e sulfuniluréias

associadas à antidiabéticos orais de outras classes. Nota-se que na maioria desses

métodos colunas convencionais com partículas porosas de 5 µm foram usadas. Foi

encontrada apenas uma referência na qual coluna monolítica (C18 100 x 4,6 mm) foi

aplicada na determinação simultânea de glibenclamida e glimepirida e suas

respectivas substâncias relacionadas. Na Figura 5.2 há um cromatograma relativo à

análise [7].

Figura 5.2 - Cromatograma das substâncias relacionadas da glimepirida a (1) e b (2),

glibenclamida (3) e glimepirida (4) [7]

Como já foi dito, a maioria dos métodos para determinação de antidiabéticos foi

desenvolvido em coluna convencional. Um deles foi desenvolvido para quantificação

de glibenclamida, gliclazida, glipizida, pioglitazona, repaglinida e rosiglitazona em

formulações farmacêuticas. Empregaram-se coluna C18 - 250 x 4,6 mm, 5 μm e

vazão de 1 ml/min. O tempo de análise foi de 28 minutos [8]. Outro método foi

desenvolvido para determinação de glipizida, rosiglitazona, pioglitazona,

glibenclamida e glimepirida em comprimidos. Foram empregados vazão de 1 ml/min,

159

fase móvel composta por solução de trietanolamina 0,05% v/v (pH 3,5, ajustado com

ácido ortofosfórico), acetonitrila e metanol, na proporção de 55:15:30, coluna C18 -

150 × 4,6 mm, 5 μm. Os fármacos foram separados em 20 minutos [9].

Não foi encontrado na literatura nenhum método para quantificação simultânea de

clorpropamida, glibenclamida, glimepirida e glicazida em coluna convencional ou em

colunas que permitem análises mais rápidas (monolítica, com partículas de núcleo

fundido ou com partículas totalmente porosas Sub 2 µm).



1- Desenvolver e comparar métodos analíticos extremamente rápidos para

quantificação dos antidiabéticos orais clorpropamida (CL), glibenclamida (GB),

glimepirida (GM) e gliclazida (GZ), utilizando as colunas CV, MN, NF e Sub 2 μm.

2- Validar os métodos analíticos extremamente rápidos desenvolvidos em coluna CV

e de NF e comparar essas colunas cromatográficas em termos quantitativos,

verificando a capacidade de originarem métodos confiáveis.


3.1 Materiais





160



3.1.4 Substâncias químicas de referência e amostras

Glibenclamida SQR (Farmacopeia Brasileira, lote 1018) e Daonil® comprimidos

(5 mg de glibenclamida, lote 139672, validade 09/201, Sanofi Aventis – São Paulo,

Brasil)

3.2 Métodos

3.2.1 Desenvolvimento e comparação de métodos analíticos extremamente rápidos

para determinação de antidiabéticos nas colunas CV, MN, NF e Sub 2 μm

O desenvolvimento de métodos analíticos extremamente rápidos para quantificação

de antidiabéticos orais (métodos extremos) em cada coluna foi realizado a partir dos

métodos previamente desenvolvidos e descritos no capítulo 1, e utilizando-se os

parâmetros instrumentais cromatográficos otimizados no capítulo 3 (Tabela 5.1).


colunas*

* Parâmetros instrumentais: loop de 2 μl, tubo de PEEK de 0,004 polegada e frequência de aquisição dos dados e constante de tempo do detector iguais a 40 Hz/0,025 s ** Solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0

Para desenvolver os métodos extremos a partir dos métodos apresentados na

Tabela 5.1, as etapas 1 e 2 descritas a seguir foram realizadas em cada coluna.

Colunas Fase Móvel Vinj (μl) (nm) T (oC) Conc. (μg/ml)

Convencional ACN: Solução (50:50)** 2 230 30 100

Monolítica ACN: Solução (43:57)** 2 230 30 100

Núcleo Fundido ACN: Solução (50:50)** 2 230 30 100

Sub 2 μm ACN: Solução (53:47)** 2 230 30 100

161

Etapa 1 - Determinação da vazão máxima

Análises de antidiabéticos foram conduzidas em cada coluna utilizando-se os

respectivos parâmetros analíticos descritos na Tabela 5.1. A vazão da fase móvel foi

aumentada de forma progressiva até que a pressão máxima suportada por cada

coluna (Tabela 5.2) ou que resolução mínima próxima a 2,5 entre os picos referentes

à glibenclamida e glimepirida (picos adjacentes mais próximos) fosse atingida. Se a

pressão máxima foi atingida, mas a resolução mínima não, prosseguiu-se com a

etapa 2. Se a resolução mínima ou ambas as condições foram alcançadas concluiu-

se que o método extremo relativo à coluna em teste apresentava as condições de

análise descritas na Tabela 5.1 e a maior vazão testada.

Tabela 5.2 - Pressão máxima suportada pelas diferentes colunas

Colunas Pressão máxima (bar)

Convencional 275

Monolítica 200

Núcleo Fundido 400 *

Sub 2 μm 1034**

* Apesar da coluna com partículas de núcleo fundido suportar 600 bar, o valor limite será de 400 bar, já que a

vantagem de sua utilização está no fato de ela propiciar uma boa eficiência cromatográfica sem a necessidade da utilização de UHPLC. ** Apesar da coluna com partículas sub 2 μm suportar 1200 bar, o valor limite considerado será de 1034 bar, valor máximo suportado pelo equipamento UPLC Acquity

® utilizado.

Etapa 2 - Determinação da composição da fase móvel

Análises de antidiabéticos foram conduzidas em cada coluna utilizando-se os

respectivos parâmetros analíticos descritos na Tabela 5.1 e a vazão selecionada na

etapa 1. Aumentou-se progressivamente o percentual de acetonitrila da fase móvel

até que resolução mínima próxima a 2,5 entre os picos da glibenclamida e

glimepirida fosse atingida. Concluiu-se que o método extremo relativo à coluna em

teste apresentava a vazão máxima determinada na etapa 1, a composição da fase

móvel determinada na etapa 2 e o restante das condições de análise conforme

descrito na Tabela 5.1.

162

Após serem desenvolvidos, os métodos analíticos extremos referentes a cada

coluna foram comparados em termos de velocidade de análise e eficiência. Para

tanto foram utilizados como parâmetros o tempo de retenção do analito mais retido

(glimepirida) e as alturas de prato teórico (H) dos picos relativos aos antidiabéticos.

3.2.2 Comparação das colunas CV e NF em termos quantitativos

Além de avaliar as colunas cromatográficas em termos qualitativos, faz-se

necessário também avaliar o impacto dessas novas colunas em termos

quantitativos. Avaliações qualitativas já foram abordadas nos capítulos 2 e 4, e

dizem respeito aos parâmetros seletividade, fator de retenção, pressão, eficiência,

resolução, simetria, tempo de análise. Já as avaliações quantitativas têm por

objetivo comparar a capacidade das novas colunas em dar origem a métodos

analíticos que assegurem a confiabilidade dos resultados.

Para realização da avaliação quantitativa foram validados os métodos em condições

extremas nas colunas convencional e de núcleo fundido, entretanto apenas a

glibenclamida foi utilizada como modelo nos procedimentos experimentais de

validação. Os resultados da validação do método extremo desenvolvido em coluna

convencional serviram de base para avaliação dos resultados da validação do

método extremo em coluna de núcleo fundido.

Para a realização das validações foi necessário determinar os parâmetros

seletividade, adequabilidade do sistema, estabilidade das soluções, linearidade,

precisão, exatidão e robustez, de acordo com as normas da RE 899/2003 da

ANVISA e outras referências complementares. Esses parâmetros foram

determinados nas colunas convencional e de núcleo fundido, utilizando os

respectivos métodos extremos desenvolvidos.

163

3.2.2.1 Seletividade e adequabilidade do sistema (system suitability)

As soluções a seguir foram preparadas e injetadas no cromatógrafo em triplicata,

exceto a solução padrão de trabalho, que foi injetada cinco vezes para avaliação da

adequabilidade do sistema.

- Diluente: ACN:solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0 (1:1)

- Solução padrão de trabalho (100 μg/ml): Pesaram-se exatamente cerca de 25,0 mg

de glibenclamida SQR em balão volumétrico de 25 ml. Adicionaram-se cerca de 20

ml de acetonitrila:solução de acetato de amônio (4:1) e o balão foi levado para

banho de ultrassom por 5 minutos. O volume foi completado com ACN:solução de

acetato de amônio (4:1). Pipetou-se 1 ml dessa solução para balão de 10 ml e o

volume foi completado com acetonitrila:solução de acetato de amônio (1:1).

- Solução amostra de comprimido de glibenclamida (100 μg/ml): O peso médio de 20

comprimidos foi determinado e em seguida os comprimidos foram triturados até

formarem pó. Pesou-se quantidade de pó correspondente a 1 peso médio,

equivalente a 5 mg de glibenclamida, e transferiu-se para balão volumétrico de 25

ml. Foram adicionados cerca de 20 ml de ACN:solução de acetato de amônio (4:1) e

o balão foi levado para banho de ultrassom por 30 minutos. Em seguida o volume do

balão foi completado com ACN:solução de acetato de amônio (4:1). A solução foi

filtrada, descartando-se os primeiros 5 ml. Pipetaram-se 5 ml do filtrado para balão

volumétrico de 10 ml e o volume foi completado com ACN:solução de acetato de

amônio (1:4).

- Solução placebo de comprimido de glibenclamida: Pesaram-se cerca de 157,0 mg

de placebo (Tabela 5.3) em balão volumétrico de 25 ml. Adicionaram-se cerca de 20

ml de ACN:solução de acetato de amônio (4:1) e o balão foi levado para banho de

ultrassom por 30 minutos. Em seguida o volume do balão foi completado com

ACN:solução de acetato de amônio (4:1). A solução foi filtrada e os primeiros 5 ml

descartados. Pipetaram-se 5 ml do filtrado para balão volumétrico de 10 ml e o

volume foi completado com acetonitrila:solução de acetato de amônio (1:4).

164

Tabela 5.3 - Função farmacotécnica, percentuais usuais e percentuais adicionados dos

excipientes presentes no comprimido referência de glibenclamida (Daonil®)*

Excipientes Função Farmacotécnica* % usual* % adicionado

Estearato de magnésio Lubrificante 0,25-5% 5%

Aerosil Deslizante 0,1-5% 0,5%

Lactose Diluente 65%-85% 65%

Amido Desintegrante 3-15% 15%

Talco Diluente 1-30% 14,5%

*O placebo foi preparado misturando-se os excipientes descritos na bula do Daonil®, comprimido

referência da glibenclamida. A quantidade de cada excipiente adicionada ao placebo foi estimada com base no percentual de cada tipo de excipiente que é usualmente utilizado em comprimidos [10].

Para que os métodos sejam considerados seletivos o diluente e o placebo não

devem apresentar picos interferentes no mesmo tempo de retenção da

glibenclamida. Além disso, os picos de glibenclamida obtidos na amostra e no

padrão de trabalho devem apresentar pureza de pico [11].

Para que os sistemas sejam considerados adequados os seguintes critérios devem

ser atendidos: fator de retenção (k) entre 1 e 10 [2], fator de assimetria (As) entre

0,8 - 1,8 [12], desvio padrão relativo área (DPR área) menor ou igual a 1% [13,14] e

desvio padrão relativo tempo de retenção (DPR tr) menor ou igual a 1% [13,14].

3.2.2.2 Estabilidade das soluções padrão de trabalho e amostra

Solução padrão de trabalho de glibenclamida (100 μg/ml) foi preparada conforme

descrito no item 3.2.2.1 deste capítulo e injetada, em triplicata, de hora em hora, por

quatro horas. As áreas dos picos de glibenclamida foram registradas e comparadas.

Esse experimento foi realizado apenas na coluna convencional, utilizando o

respectivo método. Para que a solução de trabalho seja considerada estável a

variação entre a área do pico de glibenclamida no tempo inicial (zero hora) e no

tempo final (quatro horas) não deve exceder 2%. Mesmo procedimento e critério de

aceitação foram utilizados para avaliar a estabilidade da solução amostra [13].

165

3.2.2.3 Linearidade

Foram preparadas, em triplicata, soluções estoque de glibenclamida a 1 mg/ml, em

acetonitrila:solução de acetato de amônio (4:1). A partir de cada solução estoque,

foram feitas diluições para cinco diferentes concentrações, conforme Tabela 5.4,

totalizando 15 soluções. Cada solução foi injetada em triplicata.

Tabela 5.4 - Preparo das soluções de glibenclamida para avaliação da linearidade

*Em relação à concentração de trabalho de 100 μg/ml

As curvas analíticas foram construídas com os valores de área dos picos de

glibenclamida obtidos em cada nível de concentração. Os dados foram submetidos

aos seguintes testes estatísticos: outlier (teste do resíduo padronizado Jacknife),

normalidade dos resíduos (teste de Ryan-Joiner), independência dos resíduos (teste

de Durbin-Watson), homoscedasticidade dos resíduos (teste de Brown-Forsythe ou

Levene modificado). Após a aplicação dos testes, as regressões lineares foram

calculadas pelo método dos mínimos quadrados e foram construídos os gráficos de

distribuição de resíduos. Ao final, avaliação da significância das regressões foram

realizadas por meio da aplicação do teste de análise de variância (ANOVA). Todos

os testes estatísticos foram realizados com auxílio de planilha desenvolvida por

Souza e colaboradores [15].

Para que haja linearidade a regressão deve ser estatisticamente significativa, o

coeficiente de correlação (r) deve ser superior a 0,99 e o gráfico de resíduos não

deve apresentar nenhuma tendência [11, 14].

Nível de concentração*

Volume de solução estoque (ml)

ACN:Solução (1:1) q.s.p. (ml)

Concentração (μg/ml)

60% 1,5 25,0 60

80% 2,0 25,0 80

100% 2,5 25,0 100

120% 3,0 25,0 120

140% 3,5 25,0 140

166

3.2.2.4 Precisão intra-corrida e precisão inter-corridas

A precisão intra-corrida (repetibilidade) foi avaliada por meio de seis determinações

a 100% da concentração de trabalho (100 μg/ml de glibenclamida). As soluções

amostra para a análise foram preparadas conforme procedimento descrito no item

3.2.2.1 e injetadas três vezes. A precisão inter-corridas (precisão intermediária) foi

realizada pela repetição deste procedimento em outro dia. Os resultados foram

agrupados e calcularam-se os teores de glibenclamida e os desvios padrões

relativos (DPR) das seis determinações do primeiro dia e das 12 determinações

realizadas no primeiro e segundo dias. Para que os métodos apresentem precisão

intra e inter-corridas o DPR entre as seis e 12 determinações não deve exceder 2%

[11, 13, 14].

3.2.2.5 Exatidão

A determinação da exatidão foi realizada em três níveis de concentração, com a

adição de quantidades conhecidas de glibenclamida SQR ao placebo do comprimido

de referência de glibenclamida (Daonil®). O placebo foi preparado conforme Tabela

5.3.

Foram preparadas três soluções padrão estoque de glibenclamida, na concentração

de 1 mg/ml, em acetonitrila:solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0 (4:1). A partir

de cada solução padrão estoque, foram preparadas três soluções com

concentrações equivalentes a 80%, 100% e 120% da concentração de trabalho de

glibenclamida (100 μg/ml). Todas as soluções foram fortificadas com 157,0 mg de

placebo (massa correspondente à quantidade de excipientes na amostra na

concentração de trabalho do doseamento), e submetidas ao procedimento de

preparo da amostra de comprimido de glibenclamida, descrito no item 3.2.2.1. Cada

uma das nove soluções foi injetada três vezes. Na Tabela 5.5 há um resumo de

como foram preparadas as soluções para o ensaio de exatidão.

167

Tabela 5.5 - Preparo das soluções para o ensaio de exatidão

Níveis de concentração

Massa de placebo (mg)

Volume de solução estoque de padrão (ml)

Conc. Glibenclamida

(µg/ml)

Exatidão 80% 157,0 4 80

Exatidão 100% 157,0 5 100

Exatidão 120% 157,0 6 120

A exatidão foi calculada pela relação entre a concentração obtida experimentalmente

e a concentração teórica de glibenclamida nas soluções fortificadas com o placebo.

Para que os métodos sejam considerados exatos o percentual de recuperação deve

estar entre 98% - 102% [13].

3.2.2.6 Limites de detecção e quantificação

Para determinação dos limites de quantificação e detecção foram realizadas

diluições seriadas a partir de uma solução padrão de trabalho de glibenclamida (100

μg/ml), preparada de acordo com o item 3.2.2.1. Cada solução foi injetada três

vezes. Determinou-se o desvio padrão relativo (DPR) entre as áreas dos picos, bem

como a relação sinal/ruído (S/R).

O limite de detecção de cada método foi estimado como sendo igual a concentração

da solução que produziu S/R = 3. Já o limite de quantificação foi considerado como

sendo igual a concentração da solução que deu origem a um pico de S/R = 10 e a

áreas reprodutíveis (DPR ≤ 2% entre as áreas de três injeções) [11].

3.2.2.7 Robustez

A robustez dos métodos foi avaliada variando-se deliberadamente algumas

condições cromatográficas e verificando-se a influência das modificações nos

resultados do doseamento de glibenclamida em comprimido. Em cada condição

modificada foram realizadas injeções do padrão (cinco) e da amostra (três). Os

parâmetros foram variados de acordo com o método estatístico de Youden e Steiner

[16]. As variáveis modificadas, bem como a distribuição dessas variáveis nos

168

experimentos de robustez, estão descritas na Tabela 5.6.

Tabela 5.6 - Descrição das variáveis nos experimentos de robustez

A, a

Vazão da

fase móvel*

B, b

Balão

Volumétrico

C, c

Agitação da

Amostra

D, d

pH da

fase móvel

Resultado

(%)

1

A

+0,1 ml/min

B

Transparente

C

35 min

D

3,05 S

2

A

+0,1 ml/min

B

Transparente

c

25 min

D

3,05

T

3

A

+0,1 ml/min

b

âmbar

C

35 min

d

2,95

U

4

A

+0,1 ml/min

b

âmbar

c

25 min

d

2,95

V

5

a

-0,1 ml/min

B

Transparente

C

35 min

d

2,95

W

6

a

-0,1 ml/min

B

Transparente

c

25 min

d

2,95

X

7

a

-0,1 ml/min

b

âmbar

C

35 min

D

3,05

Y

8

a

-0,1 ml/min

b

âmbar

c

25 min

D

3,05

Z

* Em relação à vazão do método extremo da coluna em teste

O método é considerado robusto para todos os parâmetros testados se o efeito de

cada variável for menor que o efeito maior. O efeito de cada variável é calculado

subtraindo-se a média dos resultados obtidos nos quatro experimentos em que

determinada variável foi utilizada em nível alto, pela média dos resultados obtidos

169

nos quatro experimentos em que a mesma variável foi utilizada em nível baixo,

conforme demonstrado na equação 5.1 [16].

Efeito da variável A/a = (S + T + U + V)/4 – (W+X+Y+Z)/4 (5.1)

Já o cálculo do efeito maior é realizado multiplicando-se o desvio padrão relativo

entre os valores de teor obtidos nos oito experimentos por raiz de dois.


4.1 Desenvolvimento e comparação de métodos analíticos extremamente

rápidos para determinação de antidiabéticos nas colunas CV, MN, NF e Sub 2

μm

Na Tabela 5.7 estão descritas as condições analíticas dos métodos extremamente

rápidos desenvolvidos em cada coluna.

Tabela 5.7 - Condições analíticas para determinação extremamente rápida de antidiabéticos

nas diferentes colunas*

Colunas Fase Móvel Vazão

(ml/min)

Vinj

(μl)

(nm)

T

(o C)

Conc.

(μg/ml)

Convencional ACN: Solução (50:50)** 1,0 2 230 30 100

Monolítica ACN: Solução (50:50)** 1,2 2 230 30 100

Núcleo Fundido ACN: Solução (65:35)** 0,6 2 230 30 100

Sub 2 μm ACN: Solução (65:35)** 1,2 2 230 30 100

* Parâmetros instrumentais: loop de 2 μl, tubo de PEEK de 0,004 polegada e frequência de aquisição dos dados e constante de tempo do detector iguais a 40 Hz/0,025 s ** Solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0

Analisando-se a Tabela 5.7 verifica-se que foi possível desenvolver um método

extremo em coluna empacotada com partículas sub 2 μm que apresentou elevado

valor de vazão e alto percentual de acetonitrila na fase móvel. Isso provavelmente foi

possível porque a coluna com partículas sub 2 μm resiste mecanicamente ao

aumento de pressão provocado pelo aumento da vazão (suporta pressão de até

1200 bar) e possui elevado poder de resolução, o que permite que haja resolução

170

mínima de 2,5 entre a glibenclamida e glimepirida (picos adjacentes mais próximos)

mesmo quando fase móvel de elevada força eluotrópica foi utilizada. O método

extremo desenvolvido em coluna de núcleo fundido também apresenta fase móvel

de elevada força eluotrópica, o que provavelmente só foi possível em função do

elevado poder de resolução desse tipo de coluna. O menor valor de vazão máximo é

consequência da menor resistência mecânica das partículas de núcleo fundido ao

aumento da pressão.

Ainda avaliando-se os resultados da Tabela 5.7 pode-se dizer que o fato das

colunas monolítica e convencional apresentarem um menor poder de resolução

justifica que fases móveis com apenas 50% de acetonitrila, e, portanto de menor

força eluotrópica do que as utilizadas nos métodos relativos às colunas de partículas

sub 2 μm e partículas de núcleo fundido, já conduzam ao limite mínimo de resolução

estabelecido como 2,5.

Na Tabela 5.8 a seguir estão relacionados parâmetros cromatográficos obtidos

durante a análise de antidiabéticos utilizando os métodos extremos desenvolvidos.

Tabela 5.8 - Parâmetros cromatográficos obtidos em análises de antidiabéticos utilizando os

métodos extremos desenvolvidos

Colunas Pmáx.

(bar)

Patingida

(bar)

HCL

(μm)

HGZ

(μm)

HGB

(μm)

HGM

(μm) Rs mín.

tr GM

(min)

CV 275 185 29,75 29,83 34,05 31,40 2,32 1,37

MN 200 186 18,78 19,46 21,39 19,50 2,54 0,74

NF 400* 356 14,17 10,96 11,26 10,19 2,54 0,86

Sub 2 μm 1034** 840 13,94 10,99 11,69 10,79 2,64 0,52

* Apesar da coluna com partículas de núcleo fundido suportar 600 bar, o valor limite considerado será de 400

bar, já que a vantagem de sua utilização está no fato de ela propiciar uma boa eficiência cromatográfica sem a necessidade da utilização de equipamentos sob alta pressão do tipo UHPLC. ** Apesar da coluna com partículas sub 2 μm suportar 1200 bar, o valor limite considerado será de 1034 bar, valor máximo suportado pelo equipamento UPLC Acquity

® utilizado.

Para analisar os dados da Tabela 5.8 deve-se lembrar de que o objetivo do

desenvolvimento desses métodos era propiciar análises extremamente rápidas de

antidiabéticos orais. Considerando esse objetivo pode-se dizer que a coluna com

partículas sub 2 μm foi capaz de propiciar a análise mais rápida, já que o tempo de

171

retenção da glimepirida (tr GM), último analito eluído, foi de apenas 0,52 minuto. O

método extremo desenvolvido em coluna convencional foi o mais lento (tr GM = 1,37

minuto), e os referentes às colunas com partículas de núcleo fundido e monolítica

apresentaram velocidades intermediárias.

Ë importante destacar que o aumento da velocidade de análise vem acompanhado

de perda de eficiência, o que pode ser comprovado pelos elevados valores de altura

de prato teórico (H) descritos na Tabela 5.8. Nota-se que mesmo em condições

extremas as colunas empacotadas com partículas sub 2 μm e partículas de núcleo

fundido foram mais eficientes (menores valores de H) do que as colunas monolítica

e convencional. Destaca-se que em elevadas velocidades a coluna monolítica foi

mais eficiente (H entre 19 e 21 μm) do que a convencional (H entre 30 e 34 μm).

Além disso, com o aumento da velocidade de análise valores de k menores que 1,0,

valor mínimo ideal, foram obtidos para a clorpropamida nas colunas monolítica, sub

2 μm e convencional. Na Figura 5.3 estão representados os cromatogramas

referentes às análises dos antidiabéticos utilizando os métodos extremos

desenvolvidos.

Figura 5.3 - Cromatogramas referentes às análises dos antidiabéticos utilizando os métodos

extremos em coluna (a) CV (b) MN (c) NF (d) Sub 2 μm - ordem de eluição: CL, GZ, GB e GM.

172

Analisando-se os cromatogramas nota-se que os picos gerados em análises

realizadas nas colunas de núcleo fundido e sub 2 μm (Figura 5.3 c e d) são mais

altos, indicando a capacidade dessas colunas em propiciar métodos com maior

detectabilidade do que as colunas convencional e monolítica (Figura 5.3 a e b).

4.2 Comparação das colunas CV e NF em termos quantitativos

A fim de facilitar a execução experimental, a validação foi realizada apenas para a

glibenclamida. O método extremo desenvolvido em coluna de núcleo fundido foi

selecionado para ser validado e em paralelo, para comparação, realizou-se

validação em coluna convencional.

4.2.1 Seletividade e adequabilidade do sistema (system suitability)

Os métodos desenvolvidos nas colunas convencional e de núcleo fundido foram

seletivos, o que significa que o diluente e o placebo não apresentaram picos

interferentes no mesmo tempo de retenção da glibenclamida e que foi verificada a

pureza dos picos referentes à glibenclamida nas soluções padrão de trabalho e

amostra. Para exemplificar, nas Figuras 5.4 e 5.5 estão apresentados os

cromatogramas referentes ao diluente e soluções placebo, padrão de trabalho e

amostra em coluna convencional e de núcleo fundido, respectivamente.

Figura 5.4 - Cromatogramas da GB - (a) padrão, (b) amostra, (c) diluente (d) placebo -

coluna CV

173

Figura 5.5 - Cromatogramas da GB - (a) padrão, (b) amostra, (c) diluente (d) placebo –

coluna NF

Os valores médios e os desvios padrões relativos (DPR) dos parâmetros de

adequabilidade do sistema obtidos após cinco injeções da solução padrão de

trabalho de glibenclamida nas colunas convencional e de núcleo fundido, utilizando

os métodos extremos desenvolvidos, estão apresentados na Tabela 5.9.

Tabela 5.9 - Valores médios e DPR dos parâmetros de adequabilidade do sistema

Área (AU.s) tr (min.) As K

CV

Média 310158 1,14 1,08 4,20

DPR (%) 0,38 0,48 1,52 0,65

NF

Média 523592 0,76 1,13 1,25

DPR (%) 0,26 0,00 0,40 0,92

Os resultados de adequabilidade do sistema foram satisfatórios. O DPR entre as

áreas e entre os tempos de retenção foi inferior a 1%, os fatores de assimetria (As)

ficaram entre 0,8 e 1,8, os fatores de retenção (k) estão entre 1 e 10.

174

4.2.2 Estabilidade das soluções padrão de trabalho e amostra

As áreas relativas ao pico de glibenclamida nas soluções padrão de trabalho e

amostra, determinadas de hora em hora por 4 horas, em coluna convencional, estão

descritas na Tabela 5.10.

Tabela 5.10 - Áreas das soluções padrão de trabalho e amostra em período de 4 horas

Hora Área (AU.s) da amostra

Área (AU.s) do padrão

0 317660 310158

1 316784 311415

2 316115 312496

3 317345 312647

4 318899 313485

∆ % (Hora 0 – Hora 4) 0,39% 1,07%

Como houve uma variação inferior a 2% entre as áreas registradas no início (hora

zero) e no final do experimento (hora quatro), conclui-se que as soluções padrão de

trabalho e amostra são estáveis por, pelo menos, 4 horas.

4.2.3 Linearidade

Para estimar as regressões lineares, as quais estabelecem a relação entre área e

concentração de glibenclamida, optou-se pela utilização do método dos mínimos

quadrados (MMQ). Antes da aplicação do MMQ testes estatísticos foram aplicados

aos dados de regressão linear (Tabela 5.11).

Tabela 5.11 - Testes estatísticos aplicados aos dados de regressão linear

Outliers

Resíduo Jacknife

Normalidade

Ryan-Joiner

Homocedasticidade

Levene modificado

Independência

Durbin-Watson

CV Não há outliers Dados seguem a

normal

Dados são

homocedásticos

Dados são

independentes

NF Há 1 outlier Dados seguem a

normal

Dados são

homocedásticos

Dados são

independentes

175

De acordo com a Tabela 5.11 percebe-se que os dados de regressão dos métodos

analíticos, em todas as colunas, são passíveis de serem tratados pelo MMQ, já que

todos seguem a distribuição normal, são homocedásticos e independentes.

Na Tabela 5.12 estão apresentados os dados de regressão linear relativos às

colunas convencional e núcleo fundido, os quais foram submetidos ao método dos

mínimos quadrados.

Tabela 5.12 - Concentrações de glibenclamida e valores de área para a construção das

curvas analíticas

Glibenclamida Nível de

concentração N

Área (AU.s)

CO

NV

EN

CIO

NA

L

60 60% 1 2 3

191674 191698 187923

80 80% 1 2 3

254599 256441 250450

100 100% 1 2 3

317926 316438 323956

120 120% 1 2 3

384642 387554 377181

140 140% 1 2 3

451851 443013 444486

NÚ

CL

EO

FU

ND

IDO

60 60% 1 2 3

306233 312254 305766

80 80% 1 2 3

408035 417134 401414

100 100% 1 2 3

511206 505373 518806

120 120% 1 2 3

626778 630699* 609504

140 140% 1 2 3

724971 710136 713492

*outlier – Dado excluído

As curvas analíticas obtidas a partir da aplicação do método dos mínimos quadrados

aos dados da Tabela 5.12, bem como as equações das retas e os coeficientes de

correlação (r), estão apresentados nas Figuras 5.6 e 5.7

176

Figura 5.6 - Curva analítica para a determinação de GB em comprimidos - Coluna de CV

Figura 5.7 - Curva analítica para a determinação de GB em comprimidos - Coluna NF

Após aplicação do teste de significância da regressão (α = 0,05) verificou-se que as

regressões apresentadas nas Figuras 5.7 e 5.8 são estatisticamente significativas.

Nas Figuras 5.8 e 5.9 a seguir estão representados os gráficos de distribuição de

resíduos. Analisando-os verifica-se uma distribuição aleatória dos pontos e, portanto,

ausência de qualquer tendência.

Figura 5.8 - Gráfico de distribuição de resíduos - coluna CV

y = 3206,7x - 2011 r = 0,9993

100000

200000

300000

400000

500000

0 30 60 90 120 150 180

Áre

a (

AU

.s)


y = 5122x + 191,12 r = 0,9991

100000

250000

400000

550000

700000

850000

0 30 60 90 120 150 180

Áre

a (

AU

.s)


-8000

-4000

0

4000

8000

40 60 80 100 120 140 160 Resíd

uo

s


177

Figura 5.9 - Gráfico de distribuição de resíduos - coluna NF

Considerando as discussões apresentadas pode-se concluir que os dois métodos

apresentam linearidade. Os resultados das análises estatísticas indicaram ajustes

adequados ao modelo de regressão linear: o coeficiente de correlação r foi superior

a 0,99 e a ANOVA demonstrou que as regressões foram estatisticamente

significativas a um nível de significância de 5%. Além disso, analisando-se os

gráficos de resíduos, não se observou nenhuma tendência.

4.2.4 Precisão intra-corrida e precisão inter-corridas

Avaliou-se a precisão intra-corrida dos métodos por meio de seis determinações a

100% da concentração de trabalho (100 μg/ml) e a inter-corrida por meio de 12

determinações Os valores de teor e DPR estão apresentados na Tabela 5.13.

Tabela 5.13 - Valores de área e teor de glibenclamida em comprimidos para avaliação da

precisão dos métodos extremos relativos às colunas CV e NF

CV NF

1o d

ia

Intr

a-

co

rrid

a Área Média (AU. s) 311576 531507

Teor médio (AU. s) 100,40 100,46

DPR (%) 0,24 0,18

2o d

ia

Intr

a-

co

rrid

a Área Média (AU. s) 310241 526201

Teor médio (AU. s) 99,97 99,45

DPR (%) 0,22 0,34

Inte

r-

co

rrid

as Área Média (AU. s) 310908

528854

Teor médio (AU. s) 100,18 99,95

DPR (%) 0,33 0,58

-14000

-7000

0

7000

14000

40 60 80 100 120 140 160 Resíd

uo

s


178

Os valores de DPR obtidos foram inferiores a 2,0%, indicando que os métodos

apresentaram precisão intra-corrida (repetibilidade) e precisão inter-corridas

(precisão intermediária) satisfatórias.

4.2.5 Exatidão

Na Tabela 5.14 estão apresentados os resultados referentes ao percentual de analito

que, após ter sido adicionado ao placebo e submetido ao mesmo procedimento de

preparo da amostra de comprimido de glibenclamida, foi recuperado.

Tabela 5.14 - Percentual de recuperação de glibenclamida adicionada ao placebo para

avaliação da exatidão dos métodos extremos nas colunas CV e NF

Nível N Conc. teórica

(μg/ml)

Recuperado

(μg/ml)

Porcentagem

(%)

Médias

(%)

CO

NV

EN

CIO

NA

L

80%

(80 μg/ml)

1

2

3

80,35

80,10

80,32

80,24

80,04

80,16

99,86

99,92

99,80

99,86

100%

(100 μg/ml)

1

2

3

100,44

100,13

100,40

100,06

100,08

100,45

99,62

99,96

100,05

99,87

120%

(120 μg/ml)

1

2

3

120,53

120,16

120,48

120,73

120,95

121,02

100,17

100,66

100,45

100,43

NÚ

CL

EO

FU

ND

IDO

80%

(80 μg/ml)

1

2

3

80,35

80,10

80,32

80,42

80,47

80,59

100,08

100,46

100,34

100,29

100%

(100 μg/ml)

1

2

3

100,44

100,13

100,40

101,15

100,29

101,03

100,71

100,17

100,62

100,50

120%

(120 μg/ml)

1

2

3

120,53

120,16

120,48

121,84

121,64

122,00

101,09

101,24

101,26

101,19

Os valores de porcentagem de recuperação entre 98% e 102% indicam que os

métodos apresentaram exatidão adequada para quantificação de glibenclamida em

comprimidos.

179

4.2.6 Limites de detecção e quantificação

Os limites de detecção e quantificação de glibenclamida referentes aos métodos

extremos desenvolvidos nas colunas CV e NF estão descritos na Tabela 5.15.

Tabela 5.15 - Limites de detecção e quantificação

Coluna LD (μg/ml) LQ (μg/ml)

CV 2,5 7,5

NF 0,5 2,5

Os resultados apresentados na Tabela 5.15 são apenas informativos já que os

métodos em questão são para determinação quantitativa de glibenclamida em

comprimidos, e, portanto, o limite de detecção não precisaria ser determinado. Além

disso, como a concentração de trabalho é alta (100 μg/ml) o limite de quantificação

também não precisaria ser estimado.

Analisando-se os dados nota-se que o método extremo desenvolvido em coluna de

núcleo fundido apresentou menor limite de detecção e de quantificação do que o

método extremo desenvolvido em coluna convencional. Isso é consequência da

redução do tamanho das partículas (de 5 μm na coluna CV para 2,7 μm na coluna

de NF) e do menor caminho de difusão presente nas partículas de núcleo fundido.

Ambos os fatores contribuem para um menor alargamento do pico cromatográfico,

dando origem a um pico de maior relação sinal/ruído [17,18].

4.2.7 Robustez

Os resultados de robustez estão apresentados na Tabela 5.16. Os efeitos de cada

variável e o efeito maior foram calculados para que a influência das modificações

propostas na quantificação da glibenclamida em comprimidos fosse avaliada.

180

Tabela 5.16 - Avaliação do efeito das variáveis na determinação de teor de glibenclamida

utilizando os métodos extremos nas colunas CV e NF

Coluna Variável Média dos

teores*

Efeito da

variável**

Efeito

maior***

CO

NV

EN

CIO

NA

L

Vazão A: 1,1 ml/min 100,01 100,01-99,46=

0,55

1,51

a: 0,9 ml/min 99,46

Balão B: Transparente 99,18 99,18-100,28= -

1,10 b: Âmbar 100,28

Agitação C: 35 minutos 99,84 99,84-99,63=

0,21 c: 25 minutos 99,63

pH da FM D:3,05 100,47 100,47-99,0=

1,47

d:2,95

99,00

NÚ

CL

EO

FU

ND

IDO

Vazão A: 0,7 ml/min 99,81 99,81-99,34=

0,46

1,12

a: 0,5 ml/min 99,34

Balão B: Transparente 98,94 98,94-100,21= -

1,28 b: Âmbar 100,21

Agitação C: 35 minutos 99,66 99,66-99,49=

0,17 c: 25 minutos 99,49

pH da FM D:3,05 99,79 99,79-99,36=

0,44

d:2,95 99,36

*Média dos teores dos 4 experimentos realizados com determinada variável no nível alto ou baixo. **Média dos teores dos 4 experimentos realizados com determinada variável no nível alto menos a média dos teores dos 4 experimentos realizados com determinada variável no nível baixo

*** DPR entre os teores obtidos nos 8 experimentos x 2 .

Analisando-se os resultados da Tabela 5.16 verifica-se que o método extremo

desenvolvido em coluna convencional foi robusto para todos os parâmetros

avaliados (vazão e pH da fase móvel, tipo de balão volumétrico, tempo de agitação),

já que os efeitos das variávies foram inferiores ao efeito maior. Já o método extremo

desenvolvido em coluna de núcleo fundido foi robusto para os parâmetros vazão e

pH da fase móvel e tempo de agitação. Verifica-se que no experimento realizado em

coluna de núcleo fundido o efeito da variável balão volumétrico (1,28) foi superior ao

efeito maior (1,12), indicando ser esse um parâmetro significativo durante a

quantificação de glibenclamida realizada em coluna de núcleo fundido. Entretanto

considerando que o preparo da amostra relativo aos métodos em coluna

convencional e de núcleo fundido é o mesmo, que o tipo de balão volumétrico

(âmbar ou transparente) não demonstrou efeito significativo durante a quantificação

181

de glibenclamida realizada em coluna convencional e que referências da literatura

apontam para a fotoestabilidade da glibenclamida [19], não faz sentido que o tipo de

balão seja considerado parâmetro de efeito significativo na determinação de

glibenclamida em coluna de núcleo fundido.

5 CONCLUSÃO

O método extremo desenvolvido em coluna empacotada com partículas sub 2 μm foi

o mais rápido, já que o tempo de retenção da glimepirida, último analito a ser eluído,

foi de apenas 0,52 minutos. O método extremo desenvolvido em coluna

convencional foi o mais lento (tr GM = 1,37 minuto), e os referentes às colunas

empacotadas com partículas de núcleo fundido (tr GM = 0,86 minuto) e monolítica

(tr GM = 0,74 minuto) apresentaram velocidades intermediárias.

Verificou-se que mesmo em condições extremas as colunas empacotadas com

partículas sub 2 μm e partículas de núcleo fundido geraram análises mais eficientes

do que as colunas monolítica e convencional. É importante destacar que as

pressões atingidas pelas colunas convencional, monolítica e de núcleo fundido

foram compatíveis com HPLC (inferior a 400 bar). Já a pressão atingida pela coluna

de partículas sub 2 μm é compatível com UHPLC (próxima a 1000 bar).

Considerando apenas velocidade de análise o método extremo desenvolvido em

coluna Sub 2 μm foi o ideal, já que propiciou a análise mais rápida. Entretanto

considerando simultaneamente os fatores velocidade, eficiência e a limitação de

pressão, o método extremo relativo à coluna de núcleo fundido foi o ideal.

Os métodos extremos em coluna convencional e de núcleo fundido para

determinação de glibenclamida em comprimido foram adequadamente validados

quanto aos parâmetros seletividade, linearidade, precisão, exatidão, limites de

detecção e quantificação e robustez. Além disso, verificou-se a adequabilidade de

ambos os sistemas (system suitability). Conclui-se que o método desenvolvido em

coluna de núcleo fundido, assim como o método desenvolvido na coluna

convencional, é confiável para determinação quantitativa de glibenclamida em

comprimidos.

182


[1] AL-SAYAH, M. A.; RIZOS, P.; ANTONUCCI, V.; WU, N. High throughput of active pharmaceutical ingredients by UPLC. Journal of Separation Science. v. 31, p. 2167-2172, 2008. [2] SNYDER, L. R., KIRKLAND, J. J., GLAJCH, J. L. Practical HPLC method development. 2 ed. New York: John Wiley & Sons, 1997. 765 p. [3] GUILLARME, D.; RUTA, J.; RUDAZ, J.; VEUTHEY, J. New trends in fast and high-resolution liquid chromatography: a critical comparison of existing approaches. Analytical and Bioanalytical Chemistry. v. 397, p. 1069-1082, 2010. [4] MCMASTER, M. C. HPLC A Practical User’s Guide. 2 ed. New York: John Wiley & Sons, 2007. 238 p. [5] GUILLARME, D.; NGUYEN, D. T.T.; RUDAZ, S.; VEUTHEY, J. L. Recent developments in liquid chromatography-Impact on qualitative and quantitative performance. Journal of Chromatography A. v. 1149, p. 20-29, 2007. [6] BADMAN, E. R.; BEARDSLEY, R. L., LIANG, Z.; BANSAL, S. Accelerating high quality bioanalytical LC/MS/MS assays using fused-core columns. Journal of Chromatography B. v. 878, p. 2307-2313, 2010. [7] KAMINSKI, L.; DEEB, S. E.; WATZIG, H. Repeatability of monolithic HPLC columns while using a flow program Journal of separation science. v. 31, p. 1745-1749, 2008. [8] VENKATESH, P.; HARISUDHAN,T.; CHOUDHURY, H.; MULLANGI, R.; SRINIVAS, N. R. Simultaneous estimation of six anti-diabetic drugs - glibenclamide, gliclazide, glipizide, pioglitazone, repaglinide and rosiglitazone: development of a novel HPLC method for use in the analysis of pharmaceutical formulations and its application to human plasma assay. Biomedical Chromatography, v. 20, p.1043-1048, 2006. [9] LAKSHMI, K. S.; RAJESH, T. Development and Validation of RP-HPLC Method for Simultaneous Determination of Glipizide, Rosiglitazone, Pioglitazone, Glibenclamide and Glimepiride in Pharmaceutical Dosage Forms and Human Plasma. Journal of The Iranian Chemical Society, v. 8, n. 1, p. 31-37, 2011. [10] FERREIRA, Anderson de Oliveira. Guia prático da farmácia magistral. 4. ed. São Paulo: Pharmabooks, 2010-2011. v.1. 736 p. [11] BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RE no. 899, de 29 de Maio de 2003. Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. Diário Oficial da União, Brasília, DF, Poder Executivo, de 02 de Junho de 2003c. [12] PATNAIK, P. Handbook of environmental analysis. 2 ed. New York: CRC press,1997.

183

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[17] FEKETE, S.; OLAH, E.; FEKETE, J. Fast liquid chromatography: The domination of core–shell and very fine particles. Journal of Chromatography A. v. 1228, p. 57-71, 2012. [18] LOUGH, W. J.; WAINER, I. W. High performance liquid chromatography: fundamental principles and practice. London: Black Academic & Professional, 1996. 276 p.

[19] BANNSAL, G.; SINGH, M.; JINDAL, K. C.; SINGH, S. Ultraviolet-Photodiode

Array an High-Performance Liquid Chromatographic/ Mass Spectrometric Studies on

forced degradation behaviorof glibenclamide and development on a validated

stability-indicating method. Journal of AOAC International. v. 91, n. 4, p. 709-719,

2008.

184

CONCLUSÃO FINAL

185

- Método analítico para quantificação de clorpropamida, glibenclamida, glimepirida e

gliclazida foi desenvolvido e otimizado em coluna convencional com partículas

porosas de 5 μm de diâmetro e transferido para as colunas monolítica, empacotada

com partícula de núcleo fundido e empacotada com partículas porosas sub 2 μm.

- As quatro colunas foram caracterizadas de acordo com os seguintes parâmetros:

volume morto, porosidade, retenção, seletividade e permeabilidade.

- Parâmetros instrumentais cromatográficos foram otimizados para permitir que a

performance das colunas cromatográficas fosse aproveitada ao máximo durante a

análise dos antidiabéticos orais. A otimização foi realizada baseada na análise dos

valores de variância extracoluna e eficiência cromatográfica remanescente.

- Verificou-se que a influência negativa da variância extracoluna na eficiência

cromatográfica foi mais intensa durante a análise da clorpropamida e gliclazida

(analitos menos retidos) e quando colunas mais eficientes (sub 2 μm e núcleo

fundido) foram empregadas. Portanto, a otimização do sistema cromatográfico foi

especialmente importante para que o potencial cromatográfico das colunas

empacotadas com partículas sub 2 µm e com partículas de núcleo fundido fosse

aproveitado. Dessa forma foi possível realizar uma comparação fidedigna do

desempenho cromatográfico das quatro colunas em estudo.

- Considerando as análises das curvas de Van Deemter e de Knox, gráficos de

performance cinética, resolução, simetria e pressão, conclui-se que a coluna

empacotada com partículas de núcleo fundido é a melhor alternativa à coluna

convencional quando o objetivo é a obtenção de análises rápidas e ao mesmo

tempo eficientes. A coluna monolítica, apesar de compatível com equipamento de

HPLC e de propiciar análises mais rápidas com maior eficiência do que a coluna

convencional, apresenta eficiência cromatográfica bem inferior à gerada pelas

colunas de núcleo fundido e sub 2 μm, além de dar origem a picos de pior simetria.

Para exemplificar, considerando a análise da glimepirida, verificou-se que coluna de

núcleo fundido gerou análises com 90% da eficiência máxima e da velocidade ótima

e aproximadamente a mesma resolução propiciada pela coluna sub 2 μm, com a

grande vantagem de não gerar no sistema pressões acima de 400 bar, e portanto

186

não requerer a utilização de sistemas de UHPLC, mais caros e menos disponíveis.

Além disso, assim como a coluna sub 2 μm, a coluna de núcleo fundido foi capaz de

manter elevada eficiência em altas velocidades de análise e de gerar picos de boa

simetria.

- O método extremo desenvolvido em coluna empacotada com partículas sub 2 μm

foi o mais rápido, o desenvolvido em coluna convencional o mais lento (tr GM = 1,37

minuto), e os referentes às colunas empacotadas com partículas de núcleo fundido

(tr GM = 0,86 minuto) e monolítica (tr GM = 0,74 minuto) apresentaram velocidades

intermediárias. Verificou-se que mesmo em condições extremas as colunas

empacotadas com partículas sub 2 μm e partículas de núcleo fundido foram mais

eficientes. É importante destacar que as pressões limites atingidas pelas colunas

convencional, monolítica e de núcleo fundido foram compatíveis com equipamentos

de HPLC (inferior a 400 bar). Já a pressão atingida pela coluna de partículas sub 2

μm é compatível com equipamento de UHPLC (próximo a 1000 bar).

- Considerando apenas velocidade de análise o método extremo desenvolvido em

coluna empacotada com partículas sub 2 μm é o ideal. Entretanto considerando a

velocidade de análise, eficiência e a limitação da pressão máxima, o método

extremo desenvolvido em coluna de núcleo fundido é o ideal.

- Os métodos extremos em coluna convencional e de núcleo fundido para

determinação de glibenclamida em comprimido foram adequadamente validados.

Conclui-se que o método desenvolvido em coluna de núcleo fundido, assim como o

método desenvolvido na coluna convencional, é confiável para determinação

quantitativa de glibenclamida em comprimidos.

- Por último destaca-se a importância desse tipo de estudo para a escolha,

compreensão das limitaçoes, vantagens e cuidados necessários ao aproveitamento

dessas novas fases estacionárias disponíveis no mercado.

187

APÊNDICE

TRABALHOS APRESENTADOS EM CONGRESSO

avaliação de diferentes tipos de fases estacionárias para ...

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