AVALIAÇÃO DE EXTRATOS VEGETAIS BIOATIVOS DE … · ... niacina, entre outras (Okwu e Aluwuo, ......

UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP

AVALIAÇÃO DE EXTRATOS VEGETAIS BIOATIVOS DE

PLANTAS AMAZÔNICAS SOBRE A CONCENTRAÇÃO DE

TESTOSTERONA SÉRICA EM CAMUNDONGOS PÓS

PÚBERES

PAULA ANDREOTTI RODRIGUES

Dissertação de Mestrado apresentado ao

Programa de Pós-graduação em Patologia

Ambiental e Experimental da Universidade

Paulista – UNIP para a obtenção do título de

mestre em Patologia Ambiental e Experimental.

São Paulo

2013

UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP




PÚBERES






Orientador: Profª Dra. Ivana Barbosa Suffredini


São Paulo

2013





PÚBERES






Aprovado em:

BANCA EXAMINADORA

______________________________

Profª Dra. Ivana Barbosa Suffredini

Universidade Paulista- UNIP

______________________________

Profª Dra. Maria Martha Bernardi.

Universidade Paulista- UNIP

______________________________

Profª Dra. Dominique Corinne Hermine.

Faculdade de Ciências Farmacêuticas- USP

DEDICATÓRIA

Dedico esse trabalho ao meu filho, e a minha família que sempre estiveram ao

meu lado.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por estar sempre abençoando e dando

força para continuar e nunca desistir dos meus sonhos. Ao meu filho pela

compreensão de algumas ausências.

Agradeço a minha família pela ajuda com meu filho e sempre apoiando e

dando muita força.

Agradeço a Wilton e a Marilda, técnicos do laboratório pela ajuda

durante todo o experimento.

Agradeço principalmente a minha orientadora Profª Dra. Ivana Barbosa

Suffredini pela ajuda compreensão e principalmente pela paciência.

LISTA DE ABREVIATURAS

LH - Hormônio Luteinizante

GnRH - Hormônio liberador de Gonadotropina

FSH - Hormônio folículo estimulante

HDL - High Density Lipoprotein

ECA - Enzima conversora de angiotensina

DHT - Dehidrotestosterona

V.O - Via oral

I.P - Intraperitoneal

SPF - Specific Pathogen Free Organism

EAA Esteróides Anabólicos Androgênicos

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ 8

2. REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................... 13

2.1. Testosterona ....................................................................................... 13

2.2. Produtos naturais que influenciam a produção de testosterona .......... 16

3. OBJETIVO GERAL ................................................................................... 19

3.1. Objetivos específicos .......................................................................... 19

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 20

5. CONSIDERAÇÕES GERAIS .................................................................... 25

6. ARTIGO CIENTÍFICO ................................................................................ 26

ANEXO I – APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA .................................... 54

ANEXO II – CURRICULUM LATTES .............................................................. 56

ANEXO III – NORMAS PARA PUBLICAÇÃO NA REVISTA MEMÓRIAS DO

INSTITUTO OSWALDO CRUZ ........................................................................ 62

8

1. INTRODUÇÃO

A utilização de plantas com fins terapêuticos é das mais antigas formas

de prática medicinal da humanidade. Entre 250-500 mil espécies de plantas,

somente cerca de 5% foram estudadas quimicamente, e pequena porcentagem

foi avaliada sob os aspectos biológicos, levando ao desconhecimento quase

absoluto dos riscos toxicológicos que conteriam (Kuntze et al, 2012).

Em trabalhos anteriores, dez extratos vegetais, obtidos de diferentes

espécies (tabela 1), foram testados em modelos biológicos de citotoxicidade e

antibacterianos, e apresentaram atividade significante, cujos resultados são

vistos em outras publicações (Suffredini et al., 2006a; Suffredini et al., 2006b;

Suffredini et al., 2006c; Suffredini et al., 2007a; Suffredini et al., 2007b). Por

esse motivo, foram testados quanto à toxicidade aguda e influência sobre

ansiedade e locomoção (Estork, 2011; Gusmão, 2011), além de serem

determinadas as doses letais 50% e as doses não letais, observadas na tabela

1.

9

Tabela 1. Relação das espécies de plantas usadas para obtenção dos dez extratos usados, administrados a camundongos

Balb-c, para verificação de sua influência sobre a concentração sérica de testosterona, após administração de doses repetidas. As

doses administradas por via oral aos camundongos representam 10% da dose não letal determinada em estudos prévios (Estork,

2011; Gusmão, 2011).

Espécie Família Número de

coleta Órgão usado N do extrato

Dose letal 50% [g/kg]*

Dose não letal [g/kg]

Xylopia aromatica Annonaceae IBS08 Caule EB149 1,25 0,6259

Amphirrhox longifolia Violaceae PSC80 Órgãos aéreos EB284 0,6259 0,3125

Abarema auriculata Fabaceae Mimosoidae AAO3353 Caule EB689 0,0098 0,0049

Laetia suaveolens Salicaceae AAO3383 Folhas e caule EB719 0,3125 0,1563

Pentaclethra macroloba Fabaceae Mimosoidae AAO3481 Caule EB827 0,1563 0,0789

Swatzia sericea var. sericea Fabaceae Caesalpiniodeae AAO3501 Frutos EB1097 0,1563 0,0789

Symphonya globulifera Clusiaceae AAO3717 Órgãos aéreos EB1257 0,6256 0,3125

Picrolemma sprucei Simaroubaceae AAO3582 Órgãos aéreos EB1151 0,0625 0,0391

Ipomoea alba Convolvulaceae AAO4031 Órgãos aéreos EB1493 2,500 1,25

Moronobea coccinea Clusiaceae IBS142 Flores EB1765 2,500 1,25

*Fonte: (Estork, 2011; Gusmão, 2011).

10

Amphirrhox longifolia, Violaceae não apresenta qualquer informação

farmacológica ou fitoquímica. Porém, pesquisa com a família revela que

espécies relacionadas apresentariam ciclopeptídeos, proteínas cíclicas que

ocorrem em espécies de Violaceae e Rubiaceae. Nos anos 2000, um novo

grupo de substâncias, as proteínas cíclicas ou cliclopeptídeos, passou a

despertar grande interesse na comunidade científica em decorrência das

atividades farmacológicas relacionadas ao grupo e apor sua estrutura proteica

isolada de modo não usual, por resistir a condições sob as quais proteínas

geralmente desnaturam (Lindholm et al., 2002, Felizmenio-Quimio et al., 2001,

Hallock et al., 2000). Estudos que relacionam atividade biológica com proteínas

cíclicas, como o feito por Hermann et al., em 2008, verificaram o potencial

citotóxico desse grupo de substâncias, isoladas de Viola biflora. Outra espécie,

Viola tricolor, igualmente apresentou atividade citotóxica decorrente dos

ciclopeptídeos presentes. Wang et al. (2008) verificaram que ciclopeptídeos

isolados de Viola yedoensis apresentaram atividade contra HIV. Viola genus,

outra espécie de Violaceae, apresentou atividade antimalárica (Moon et al.,

2007). Além desses compostos, há ocorrência de flavonoides (Vukics et al.,

2008a, Vukics et al., 2008b, 2008c, Flamini, 2007), saponinas triterpênicas

(Moon et al., 2004) e óleos essenciais (Flamini et al., 2003).

Informações obtidas de Abarema auriculata (Fabaceae Mimosoidae)

refletem número de estudos inexistentes sobre farmacologia e fitoquímica para

a espécie e para o gênero. Para a subfamília, relata-se a presença de lectinas,

em Parkia platycephala (Gallego Del Sol et al., 2002) e a presença de

saponinas triterpenoides (Haridas et al., 2001).

11

Pentaclethra macroloba é espécie pertencente à família das Fabaceae;

em termos do gênero, estudos fitoquímicos com P. macroloba demonstraram

compostos químicos ou a ocorrência de vários metabólitos secundários, como

alcaloides, saponinas, flavonoides e substâncias fenólicas, e uma série de

vitaminas, como riboflavina, niacina, entre outras (Okwu e Aluwuo, 2008).

A espécie Swartzia sericea var. sericea não apresenta estudo referente

às características fitoquímicas e farmacológicas de seus extratos. Entretanto,

estudos foram feitos em outras espécies de Swartzia em termos fitoquímicos e

biológicos. Observou-se a presença de uma isoflavona nos extratos

clorofórmicos e benzênicos da madeira de S. brachyraquis var. brachyraquis,

isolada por métodos cromatográficos, e analisadas por métodos

espectrométricos (Sanchez et al., 1999). Diterpenos foram isolados de S.

arborescens (Orphelin et al. 1996). Pterocarpanos isolados de S. polyphylla

foram patenteados como substâncias antagônicas ao hormônio masculino

(Hirayama et al., 1994).

Xylopia aromatica apresentou atividade contra espécies de Leishmania sp.

e Trypanosoma cruzi (Osorio et al., 2007), contra plasmódio (de Mesquita et al.,

2007), contra Aedes aegypti (Rodrigues et al., 2006) e atividade antibacteriana

(Takahashi et al., 2006). Além disso, estudos indicam a presença de diterpenos

caurenoicos (de Melo et al., 2001), outros compostos voláteis (Jürgens et al.,

2000) e acetogeninas (Colman-Saizarbitoria et al., 1995; Colman-Saizarbitoria

et al., 1994).

Espécies de Symphonia, encontradas em várzeas de florestas tropicais,

já foram amplamente investigadas fitoquimicamente e quanto aos efeitos

biológicos. Marti et al., 2010, detectaram do extrato etil-acetato da casca das

12

raízes de S. globulifera grande atividade antimalárica (97% a 10μg/mL). A

investigação fitoquímica desse extrato levou ao isolamento de nove compostos

do tipo acilfloroglucinóis poliprenilados policíclicos (PPAPs) e dois derivados

oxidados. Todos os compostos apresentaram atividade antimalárica com

concentração inibitória 50%. Ngouela et al (2006) detectaram atividade

antimalárica em xantona denominada gaboxantona, isolada da casca da

semente de S. globulifera, junto com outros conhecidos, como sistosterol, ácido

oleanólico e citrato de metila. A estrutura do composto foi determinada como

5,10-dihidroxi-8,9-dimetoxi-2,2-dimetil-12-(3-metilbut-2-enil) pirano [3,2-

b]xanten-6(2H)-ona, por meio de análises espectroscópicas. Bayma et al.

(1998) isolaram da casca da raiz de S. globulifera, nova xantona prenilada,

ananixantona. Nkengfack et al. (2002), usando fracionamento biodirecionado

do extrato da casca da raiz de S. globulifera, isolaram estigmasterol e duas

novas xantonas com unidades isoprenoides, denominadas globulixantonas A

(1) e B (2).

Com a proposta de complementar os estudos referentes aos sinais iniciais

de toxicidade, ansiedade e locomoção, o presente trabalho propôs a avaliação

da influência da atividade dos dez extratos vegetais sobre a concentração de

testosterona sérica em camundongos machos adultos.

13

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Testosterona

Os testículos secretam hormônios sexuais masculinos, chamados

coletivamente androgênios, entre os quais testosterona, di-hidrotestosterona e

androstenediona estão incluídas. De acordo com de Lima e Cardoso (2011), no

organismo masculino a testosterona é o esteroide mais abundante, a ponto de

ser considerado o hormônio testicular fundamental. Em torno de 95% da

testosterona circulante é secretada pelos testículos e apenas 5% pelas

glândulas suprarrenais.

A testosterona é considerada o principal andrógeno da circulação,

responsável pelo desenvolvimento e manutenção das características sexuais

masculinas (Gebara et al., 2002), como desenvolvimento reprodutivo, aumento

de massa muscular, presença de pelos e desempenho sexual (Biatek et al.,

2004).

A testosterona é sintetizada a partir do colesterol por uma sequência de

cadeias enzimáticas dentro das células de Leydig, localizadas no interstício do

testículo maduro (Bagatell e Bremner, 1998). O colesterol utilizado pode ser

obtido a partir de síntese de novo realizada pelas próprias células, que

capturam ésteres de colesterol armazenados na matriz extracelular, ou obtido

diretamente de lipoproteínas de baixa densidade, conhecida como LDL

(Gebara et al., 2002). Na mitocôndria da célula de Leydig, o colesterol é

transformado em pregnenolona, que por sua vez difunde-se ao citosol indo até

o retículo endoplasmático liso onde, por ação de enzimas, é convertida,

subsequentemente, em delta-5 pregnenolona, 17 α hidroxiprepnenolona,

14

dihidroepiandrosterona (DHEA), androstenediol e pela ação da enzima 17 β

hidroxiesteroide desidrogenase, em testosterona (Boff, 2010).

Sua produção é controlada por um sistema de retroalimentação negativa

do hipotálamo e da adenohipófise. A secreção testicular de testosterona é

regulada, primariamente, pela secreção de hormônio luteinizante (LH), pela

hipófise anterior, a qual estimula a estereoidogênese nas células de Leydig,

aumentando o substrato para sua formação (Gebara et al, 2002). A quantidade

de testosterona secretada aumenta em proporção direta à quantidade de LH

disponível (Lise et al, 1999).

A maior parte da inibição de LH provavelmente resulta de efeito direto da

testosterona sobre o hipotálamo, reduzindo a secreção do hormônio liberador

de gonadotropina (GnRH), que por sua vez produz redução correspondente na

secreção de LH e de FSH (hormônio folículo estimulante) pela hipófise anterior;

essa redução de LH diminui a secreção de testosterona pelos testículos (de

Lima e Cardoso, 2011).

Após a sua secreção pelos testículos, cerca de 97% da testosterona

liga-se de forma fraca à albumina plasmática e mais fortemente a uma beta-

globulina denominada globulina ligadora de hormônios sexuais (SHBG) e

circula na sua forma ligada no sangue (Lima, 2008).

Pequena porcentagem da testosterona é convertida em metabólitos

biologicamente ativos; entretanto, a maioria é convertida em metabólitos

inativos, excretados pelos rins e vias biliares. A testosterona é convertida, pela

5-alfa-redutase, em dihidroepiandrosterona na próstata, e em menor extensão

na pele e no fígado. A dihidroepiandrosterona é o mais ativo agonista receptor

de testosterona, que por aromatização é igualmente convertida em estradiol em

15

menor proporção. No cérebro, a aromatização da testosterona em estradiol tem

importante efeito na regulação da secreção de gonadotrofina e na função

sexual (Gebara et al, 2002).

Em geral, a testosterona é responsável pelas características peculiares

do corpo masculino e é secretada durante três fases da vida. Na vida fetal,

quantidades moderadas de testosterona são produzidas durante todo o

desenvolvimento fetal e durante três ou mais semanas após o nascimento.

Quando os testículos não são funcionais durante a vida fetal, ou quando existe

ausência genética de receptores de androgênios nas células alvo, não há

desenvolvimento de qualquer dos órgãos sexuais masculinos, e

consequentemente, em seu lugar, formam-se os órgãos sexuais femininos.

Em camundongos machos, os picos acentuados de testosterona

acontecem entre o 18º e 19º dias de gestação, e novamente após as primeiras

horas após o parto; essa exposição resulta na masculinização e

desfeminização do cérebro (Bernardi, 2006).

Grandes mudanças nos níveis de hormônios reprodutivos ocorrem

durante a puberdade, como GnRH aumenta gradualmente, o LH estimula a

maturação das células de Leydig, resultando na esteroidogênese ativa e

aumento da concentração de andrógeno intratesticular. Com o passar dos

anos, a partir da terceira década de vida, os níveis de testosterona em homens

saudáveis diminui de 1% a 2% por ano (Andersen et al, 2011).

Os esteroides anabólico-androgênicos (EAA) são um grupo de

compostos sintéticos formados pela testosterona e seus derivados, utilizados

primariamente em indivíduos do sexo masculino com deficiência androgênica e

manutenção das características secundárias masculinas, em crianças com

16

retardo da puberdade e adultos com insuficiência testicular (Lize et al, 1999).

Os EAA são geralmente usados por via oral ou parenteral, porém exercem

efeitos tóxicos no fígado. Para minimizar a toxicidade hepática, a estrutura

molecular dos compostos é alterada por alquilação ou esterificação. A

alquilação na posição 17-α diminui a metabolização hepática, aumentando a

efetividade oral. A esterificação do grupo 17-β-hidroxil com ácidos carboxílicos

resulta em compostos que podem ser utilizados como injetáveis de liberação

lenta, o que diminui a toxicidade hepática em relação aos orais, e apresentam

menor potência, como, por exemplo, o proprionato de testosterona. Quanto

maior a cadeia carbônica do éster, mais lipossolúvel se torna o esteroide e

mais prolongada sua ação (de Lima e Cardoso, 2011).

A utilização de EAA é contraindicada em homens portadores de câncer

de próstata, em mulheres com câncer de mama e gestantes, pois esses

fármacos atravessam a barreira placentária e podem causar masculinização

em fetos femininos (Lize et al, 1999).

2.2. Produtos naturais que influenciam a produção de testosterona

Uma variedade de plantas é utilizada com o objetivo de estimular a

produção de testosterona. Estudos com extrato de Tribulus alatus

demonstraram aumento significativo dos níveis de testosterona endógena de

ratos machos após administração oral do extrato alcoólico de Tribulus alatus,

uma vez ao dia, durante 40 dias (El-Tantawny et al., 2007). Segundo

Gauthaman et al (2002), a protodiocina, um tipo de saponina esteroidal

encontrada em extratos vegetais de T. terrestris, aumenta os níveis de

testosterona, hormônio luteinizante, dehidroepiandrosterona, conforme estudos

17

com ratos castrados, que demonstraram melhora do comportamento sexual.

Além disso, estudos comprovaram o efeito anti-hipertensivo do extrato aquoso

da fruta do T. terrestis em ratos; constatou-se atividade maior da enzima

conversora de angiotensina (ECA) nos tecidos e soro dos ratos alimentados

com T. terrestis (Lemos et al, 2011).

Panax ginseng C.A Meyer (Araliaceae) possui como principais

componentes ativos ao menos 18 ginsenosídeos, um grupo diverso de

saponinas esteroidais que podem atuar em diversos tecidos e produzir uma

variedade de respostas farmacológicas complexas. Outros componentes

incluem polissacarídeos, flavonoides, aminoácidos e vitaminas (Nocerino et al.,

2000; Schenkel, 2007). Frequentemente, P.ginseng é utilizado para aumentar o

desempenho físico e melhorar a vitalidade, a função imunológica, a função

sexual e a fertilidade. Contudo, não há estudos conclusivos sobre a ação

benéfica de P.ginseng, porém, no aspecto reprodutivo, proporcionou a

produção de gametas. Os ginsenosídeos Rb2, RC e Re demonstraram ação

estimulatória sobre a motilidade e capacitação dos espermatozoides in vitro

(Kuntze et al, 2012).

Segundo Kuntze et al, 2012, Ginko biloba L. (Ginkoaceae) contém

alguns traços de constituintes potencialmente perigosos, os ácidos ginkgólicos,

mas garante certa quantidade de outros componentes ativos, como glicosídeos

flavonoides e terpenos. Os componentes flavonoídicos atuam como

antioxidantes e reduzem a fragilidade capilar (Tesch, 2002). Em ratos machos,

a administração oral de G. biloba L. intensificou o comportamento copulatório,

indicando efeito afrodisíaco. Em células de Leydig cultivadas in vitro, os autores

18

verificaram que o extrato padrão induziu a produção de testosterona (Kuntze et

al, 2012).

O extrato lipoesterólico de Serenoa repens, além de ser um potente anti-

inflamatório, demonstrou resultados promissores no tratamento da hiperplasia

benigna de próstata, por meio da inibição da atividade da enzima 5α-redutase.

Os compostos responsáveis pelo efeito seriam os fitoesteróis, que igualmente

apresentaram afinidade pelos receptores androgênicos citossólicos da

dehidrotestosterona (DHT), assim competindo com esse hormônio, resultando

na diminuição da exposição das células prostáticas à estimulação hormonal

(Yunes et al, 2001).

O extrato aquoso de Lepidium meyenni Walp, Brassicacea, quando

administrado na dose de 2g/kg, por 14 dias, produziu aumento significativo dos

níveis séricos de testosterona em camundongos machos (Ramírez e Acevedo,

2012).

No norte da Tailândia, extratos vegetais preservados em álcool são

usados para fazer crescer a libido de homens com idade avançada, o que se

dá pelo aumento da produção de testosterona sérica no sangue. Porém,

estudos com sete desses extratos vegetais obtidos de espécies de Betula

alnoides, Begonia strigosa, Polygala chinensi, Desmodium renifolium,

Shenodesme pentandra, Myrica esculenta e Pothos catchcarti indicaram

redução dos níveis séricos de testosterona, com aumento dos níveis de

prolactina, possivelmente porque esses extratos possuem substâncias

biologicamente ativas que induziriam distúrbios hormonais (Wanichacheewa et

al, 2000).

19

3. OBJETIVO GERAL

O objetivo geral do trabalho foi avaliar a influência de extratos vegetais

obtidos de plantas amazônicas e da Mata Atlântica sobre a concentração sérica

de testosterona.

3.1. Objetivos específicos

Avaliar a concentração sérica de testosterona em camundongos

Balc-c machos;

Avaliar o peso corpóreo de camundongos Balc-c machos;

Avaliar o peso dos testículos + epidídimo de camundongos Balc-c

machos.

20

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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25

5. CONSIDERAÇÕES GERAIS

Os extratos interferiram na concentração sérica de testosterona em

camundongos pós-púberes. As moléculas presentes nesses extratos, que

seriam consideradas responsáveis pela influência sobre a produção de

testosterona, ainda não foram isoladas, porém, com base nos dados da

literatura, provavelmente moléculas de saponinas terpênicas e xantinas seriam

apontados como prováveis grupos a serem investigados.

26

6. ARTIGO CIENTÍFICO

27

AVALIAÇÃO DE EXTRATOS VEGETAIS BIOATIVOS DE PLANTAS

AMAZÔNICAS SOBRE A CONCENTRAÇÃO DE TESTOSTERONA SÉRICA

EM CAMUNDONGOS PÓS-PÚBERES

Paula Andreotti Rodriguesa, Maria Martha Bernardia, Ivana Barbosa Suffredinia,b

aPrograma de Pós-Graduação em Patologia Ambiental e Experimental,

Universidade Paulista – UNIP, São Paulo, Brasil; bLaboratório de Extração do

Núcleo de Pesquisas em Biodiversidade, Universidade Paulista - UNIP - São

Paulo, Brasil.

RESUMO

Extratos vegetais antitumorais e antibacterianos obtidos das espécies

Amphirrhox longifolia (Violaceae), Abarema auriculata, Pentaclethra macroloba

e Swartzia sericea var. sericea (Fabaceae), Xylopia aromatica (Annonaceae),

Symphonia globulifera e Moronobea coccinea (Clusiaceae), Picrolemma

sprucei (Simaroubaceae), Laetia suaveolens (Salicaceae) e Ipomoea alba

foram previamente avaliados quanto à toxicidade, e quanto à influência sobre

ansiedade e locomoção. No presente estudo, os mesmos extratos foram

avaliados quanto à influência sobre a concentração de testosterona sérica em

camundongos machos adultos. Grupos de 12 animais foram usados para testar

cada um dos extratos, o veículo usado para suspender os extratos e

testosterona, que foi administrada por via oral e intraperitoneal (V.O. e I.P).

Doses correspondentes a 10% da dose não letal (dado obtido em trabalhos do

grupo) de cada extrato foram administradas V.O., por seis dias consecutivos,

com descanso no sétimo dia. Seis animais de cada grupo foram eutanasiados

28

no 22º dia de tratamento, e o peso corporal e dos testículos/epidídimo foi

obtido, como o sangue foi retirado para a quantificação hormonal em kits

ELISA. Os seis animais remanescentes permaneceram por mais 23 dias sem

receber os tratamentos e, no 45º dia, foram pesados, eutanasiados, os

testículos+epidídimo foram retirados e pesados e o sangue retirado para se

medir a quantidade de testosterona sérica. Os extratos antitumorais e

antibacterianos testados, identificados como EB149, EB284, EB689, EB719,

EB827, EB1097, EB1151, EB1257, EB1493 e EB1765, interferiram na

concentração sérica de testosterona em camundongos pós-púberes. O peso

corpóreo dos camundongos tratados com os extratos EB817, Eb1097, EB1257,

EB1493 e EB1765 apresentou-se alterado em relação aos grupos controle; por

esse motivo, ao analisar o ganho de peso no período de tratamento, observou-

se que apenas os camundongos tratados com os extratos EB149 e EB689

apresentaram alterações em relação aos animais dos grupos controle. Por fim,

camundongos tratados com os extratos EB827, EB1257 e EB1765

apresentaram testículos+epidídimo (pesados em conjunto) com peso mais

elevado, em relação aos camundongos dos grupos controle.

Palavras-chave: extratos vegetais, testosterona, toxicidade, hormônios.

29

ABSTRACT

Antitumor and antibacterial plant extracts obtained from Amphirrhox

longifolia (Violaceae), Abarema auriculata, Pentaclethra macroloba e Swartzia

sericea var. sericea (Fabaceae), Xylopia aromatica (Annonaceae), Symphonia

globulifera e Moronobea coccinea (Clusiaceae), Picrolemma sprucei

(Simaroubaceae), Laetia suaveolens (Salicaceae) e Ipomoea alba were

previously evaluated in relation to their toxicity and influence on behavior and

locomotion. In the present work, the influence of these extracts on seric

testosterone of post-pubertal mice. Groups of 12 animals were used for testing

each plant extract, or testosterone or the vehicle used to suspend extracts and

testosterone. All treatments were orally administered, but testosterone, which

were both orally and intraperitoneally administered. Doses corresponding to

10% of the non-lethal dose (data found elsewhere) of each extract were

administered for six consecutive days, suspending treatment administration on

the seventh day. Six animals per group were euthanized on the 22nd Day of

treatment, and body weight, as well as testis+epididimum weight were obtained.

Blood of each animal was collected to the serum quantification of testosterone

using immunoassay. The six animals of each group remained for 23 extra days

without receiving treatments, and in the 45th day they were weighed,

euthanized, testis+epididimum taken and weighed and blood was collected and

tested for seric testosterone concentration. Plant extracts identified as EB149,

EB284, EB689, EB719, EB827, EB1097, EB1151, EB1257, EB1493 and

EB1765 influenced seric testosterone concentration in male post-pubertal mice.

Mice that received extracts EB817, Eb1097, EB1257, EB1493 and EB1765 as

treatments showed alterations in body weight, in relation to control mice. Weight

30

gain was also analysed and showed that only extracts EB149 and EB689

showed improvement in weight in relation to controls. Finally, elevated weight of

testis+epididimum of mice treated with extracts EB827, EB1257 and EB1765

were shown.

Keywords: plant extracts, testosterone, cytotoxicity, hormones.

31

1. INTRODUÇÃO

A testosterona é o hormônio gonadal testicular mais relevante, responsável

pelo desenvolvimento reprodutivo, pelo aumento de massa muscular, presença

de pelos, desempenho sexual e libido e diminuição do risco de osteoporose, e

exerce influência sobre diversos tecidos, como o cerebral (Biatek et al., 2004),

a musculatura cardíaca (Elamm et al., 2012), sobre tecidos renais e sistemas

endócrinos (Hewitson et al., 2012), entre outros. Variações da concentração

desse hormônio no decorrer da vida levaria ao desenvolvimento de

cardiopatias (Elamm et al., 2012), da Doença de Alzheimer (Rosario et al.,

2010), à queda da massa muscular e à predisposição à arteriosclerose e

alterações enzimáticas relacionadas ao metabolismo de proteínas, carboidratos

e gordura (Kaufman and Vermeulen, 2005), além de afetar fatores relacionados

à memória e comportamento (Gerardin et al., 2005; Ǻgmo, 1997). A produção

de testosterona pelas células de Leydig localizadas nos testículos é feita a

partir do colesterol, e controlada por um sistema de retroalimentação

denominado eixo hipotálamo-hipofisário-gonadal (Kumar e Kaur, 2013), que se

altera com o envelhecimento do macho, alterando suas funções e o deixando

predisponível a doenças. Portanto, estudos relacionados à interferência de

medicamentos sobre a produção hormonal são relevantes, pois a ingestão de

medicamentos tende a aumentar no decorrer da vida. A utilização de

medicamentos naturais, que apresentam compostos de estrutura química

semelhantes aos hormônios, deve ser avaliada com rigor nas diferentes fases

de vida, no que diz respeito às interações com os hormônios sexuais.

A testosterona, em termos químicos, apresenta o núcleo esteroidal comum

a vários hormônios. Essa estrutura está relacionada à sua biossíntese, que se

32

dá a partir do colesterol. De modo geral, a síntese é feita a partir de uma

sequência de cadeias enzimáticas existentes nas células de Leydig, em tecidos

testiculares já maduros. O colesterol utilizado pode ser obtido a partir de

síntese de novo realizada pelas próprias células que captura, ésteres de

colesterol armazenados na matriz extracelular ou ser obtido diretamente de

lipoproteínas de baixa densidade, ou LDL (Gebara et al., 2002).

Cai et al. (2001) isolaram várias saponinas esteroidais de Tribulus

terrestris, planta cujo uso é difundido por melhorar desempenhos relacionados

à testosterona. O extrato aquoso de Lepidium meyenii Walp (Brassicacea)

apresentou aumento significativo dos níveis séricos de testosterona em ratos

machos jovens (Ramírez e Acevedo, 2012), possivelmente por ação indireta de

saponinas. Desse modo, verifica-se que extratos vegetais apresentariam

interferência direta na concentração de testosterona sérica em ratos e

camundongos por conta da similaridade estrutural de moléculas naturais aos

hormônios sexuais (Oshima, 2003).

Em trabalhos anteriores, dez extratos vegetais obtidos de Amphirrhox

longifolia (Violaceae), Abarema auriculata, Pentaclethra macroloba e Swartzia

sericea var. sericea (Fabaceae), Xylopia aromatica (Annonaceae), Symphonia

globulifera e Moronobea coccinea (Clusiaceae), Picrolemma sprucei

(Simaroubaceae), Laetia suaveolens (Salicaceae) e Ipomoea alba

(Convolvulaceae), foram testados em modelos biológicos de citotoxicidade e

antibacterianos, e apresentaram atividade significante, cujos resultados são

vistos em outras publicações (Suffredini et al., 2006a; Suffredini et al., 2006b;

Suffredini et al., 2006c; Suffredini et al., 2007a; Suffredini et al., 2007b). Por

esse motivo, foram testados quanto à toxicidade aguda e influência sobre

33

ansiedade e locomoção (Estork, 2011; Gusmão, 2011), além de serem

determinadas as doses letais 50% e as doses não letais, observadas na tabela

1. Com a proposta de complementar os estudos referentes aos sinais iniciais

de toxicidade, ansiedade e locomoção, o presente trabalho propôs a avaliação

da influência da atividade dos dez extratos vegetais sobre a concentração de

testosterona sérica em camundongos machos adultos.

.

34

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Coleta de plantas

Diferentes órgãos das espécies vegetais A. longifolia, A. auriculata, P.

macroloba, S. sericea var. sericea, X. aromatica, S. globulifera, M. coccinea, P.

sprucei, L. suaveolens e I. alba foram coletados na Floresta Amazônica e na

Mata Atlântica, em áreas sob jurisdição do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente

e dos Recursos Renováveis (Ibama), com licença obtida nesse órgão, número

12A/2008. Uma exsicata de cada material foi depositada no Herbário UNIP; os

números de registro, a identificação taxonômica das espécies e as partes

coletadas encontram-se descritos na tabela 1. O material vegetal, após ser

limpo, foi seco em estufa de circulação de ar (Fanem) a 40 ºC e depois moído

em moinho de martelo (Holmes). O material moído foi acondicionado em sacos

plásticos, selado, identificado e mantido em câmara fria até ser usado para

fazer os extratos (Younes et al., 2000).

2.2. Obtenção dos extratos

O material moído foi colocado em percoladores de vidro (Kontes) e a

mistura de solventes, composta por diclorometano e metanol (Synth ou Merck)

na proporção de 1:1, foi adicionada aos percoladores. O conjunto pó-mistura de

solventes foi mantido em contato por 24h, em maceração. O solvente foi

removido por evaporação rotativa (Buchii) e o extrato seco armazenado em

câmara fria a –20 ºC. Em seguida, água Milli-Q foi acrescentada ao pó da

planta e nova maceração foi feita por mais 24h. O extrato aquoso foi congelado

(Revco) e liofilizado (Virtis). O armazenamento dos extratos secos foi feito em

câmara fria, a –20 ºC. Dois extratos foram obtidos, portanto, com o mesmo

35

material vegetal: um extrato orgânico e um extrato aquoso (Younes et al.,

2000). No presente trabalho, apenas o extrato ativo de cada parte de planta foi

avaliado. Os extratos receberam identificação, relacionada na tabela 1.

2.3. Preparo dos extratos e substâncias de referência

Os extratos vegetais foram preparados na forma de suspensão em óleo de

amêndoas doces, tendo 5% de polissorbato 80 diluído em água como agente

suspensor dos extratos e como veículo a ser administrado no grupo controle

negativo. A dose a ser administrada variou conforme o extrato, e foi

determinada em 10% da dose não letal obtida em ensaios anteriores (Estork,

2011; Gusmão, 2011), como observado na tabela 1.

Dois grupos controles positivos foram estipulados. Para ambos, utilizou-se

propionato de testosterona 1g/kg (4-androsteno-3-ona, 17beta-ol), diluído em

óleo de amêndoas doces, porém, um grupo recebeu administração por via oral

e outro grupo por via intraperitoneal.

2.4. Animais

Foram utilizados camundongos Balb/C machos (Mus musculus), com

idade de 6 a 9 semanas, e peso com variação de 20g a 35g, provenientes do

biotério da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Os

camundongos foram trazidos ao Biotério UNIP e mantidos em microisoladores

para animais SPF (Specific Pathogen Free Organism), cinco animais por

gaiola. Os microisoladores foram colocados em sala com ciclo de luz

36

controlado de 12 horas claro por 12 horas escuro. Água e comida foram

fornecidas aos animais à vontade.

2.5. Ensaio hormonal

Animais dos grupos controle e experimentais foram divididos em grupos

de 12, cada (n=12, ntotal=156). Os tratamentos foram administrados por via oral

(V.O.) ou via intraperitoneal (I.P.), em um volume total que não excedesse 0,1

mg/kg. O experimento foi programado para ser realizado em 45 dias, sendo

que os animais receberam os tratamentos nos primeiros 22 dias e depois

ficaram sem recebê-los durante os outros 23 dias. Os tratamentos foram

administrados durante 6 dias por semana, intercalados com um dia sem o

recebimento do tratamento. Após os 22 dias iniciais, metade do grupo (n=6) foi

anestesiada e eutanasiada, e o sangue dos animais retirado por punção

hepática. O mesmo tratamento foi feito com a outra metade do grupo (n=6), no

45º dia.

O peso corpóreo dos animais foi obtido no 1º, 22º e 45º dias de

experimento. O peso dos testículos + epidídimo foi obtido no 22º e 45º dias de

experimento.

2.5.1. Avaliação da dosagem da testosterona sérica

A dosagem da testosterona sérica foi avaliada pelo Kit de ELISA USCN-

E90458Mu Enzyme-linked Ammunosorbent Assay Kit for Testosterone for

37

mouse. Os experimentos foram feitos de acordo com as instruções do

fabricante, pela empresa Genese Produtos Diagnósticos Ltda.

2.6. Forma de análise dos resultados

Os resultados dos níveis séricos de testosterona e do peso corporal e

dos testículos+epidídimo foram analisados por análise de variância ANOVA de

duas entradas e teste posterior de comparação das diferenças entre as médias

obtidas de Bonferroni (GraphPad® Prism 5.0).

3. Resultados e discussão

Dez extratos vegetais obtidos de espécies de A. longifolia (EB284), A.

auriculata (EB689), P. macroloba (EB827), S. sericea var. sericea (EB1097), X.

aromatica (EB149), S. globulifera (EB1257), M. coccinea (EB1765), P. sprucei

(EB1151), L. suaveolens (EB719) e I. alba (EB1493) foram previamente

submetidos a ensaios de toxicidade aguda, ansiedade e locomoção, em

camundongos (Estork, 2011; Gusmão, 2011). A atividade dos extratos vegetais

sobre a concentração de testosterona sérica em camundongos foi avaliada

como dado toxicológico complementar, pois a principal atividade farmacológica

atribuída aos extratos relaciona-se à atividade antitumoral e antimicrobiana.

Em relação à concentração sérica de testosterona (figura 2), o

tratamento com diferentes extratos afetou os resultados experimentais de modo

muito significante (F(12;130)=2,87; p<0.01) e representa 16,45% da variância

total. Já a medida nos diferentes tempos teve influência significante

(F(1;130)=5.82; p<0.05), e representa apenas 2,78% do total da variância. Já a

38

interação entre as duas variáveis é muito significante (F(12;129)=3,25; p<0.001), e

representa 18,62% do total da variância.

Em relação aos grupos controles, não foram observadas diferenças

entre as concentrações séricas de testosterona nos animais do grupo controle

veículo e do grupo Testo V.O. Por outro lado, diferenças significantes foram

observadas na concentração sérica de testosterona dos animais do grupo

controle Testo I.P. (p<0,001), no 45º dia de experimento, que foram menores

do que as observadas para o grupo controle veículo. Portanto, o que se pode

concluir é o fato de a molécula de propionato de testosterona administrada por

via oral pode ter sofrido o efeito de primeira passagem, resultando em um

metabólito menos ativo do que a molécula original, que demonstrou ser mais

ativa quando administrada por via intraperitoneal.

A administração dos extratos por 22 dias, no regime de 6 dias de

tratamento e 1 dia de descanso, resultou em interferências significantes na

concentração sérica dos animais, nos dados referentes ao 45º dia. De acordo

com a figura 2, observa-se que, de modo significante (p<0,05), todos os grupos

tratados com extratos vegetais (EB149, EB284, EB689, EB719, EB827,

EB1097, EB1151, EB1257, EB1493 e EB1765) influenciaram a concentração

sérica de testosterona em relação ao controle. Porém, não foram observadas

diferenças entre os grupos no 22º dia de experimento. As diferenças

observadas podem se referir a uma alteração no desenvolvimento das gônadas

dos animais, pois os extratos foram administrados na fase pós-púbere na qual

se encontravam. Considera-se, para se estabelecer os parâmetros de análise

relativos à idade dos animais, o tempo de vida que os animais chegaram ao

laboratório (entre 6 e 9 semanas), acrescido de uma semana de adaptação às

39

condições experimentais, mais três semanas de tratamento, o que leva os

animais a apresentarem idade variando entre 10 e 13 semanas ao final do 22º

dia, e 13 a 16 semanas no 45º dia, considerados recém-saídos da puberdade

durante o período experimental. Observa-se que, de acordo com a figura 3,

todos os animais apresentam baixa concentração de testosterona no 22º dia, o

que caracteriza essa condição, reforçada pela elevada concentração de

hormônios do grupo controle no 45º dia. A maturidade sexual dos

camundongos ocorre entre a 5ª e a 8ª semanas de vida, sendo que os machos

têm a tendência ao amadurecimento em período posterior ao das fêmeas

(www.research.uci.edu/tmf/husbandry.htm). Entre a 8ª e a 12ª semanas de

vida, casais de camundongos podem ser colocados para cruzar.

A interferência na produção de testosterona nos grupos tratados com

extratos vegetais abre a possibilidade de os extratos vegetais apresentarem

algum componente pertencente a grupos específicos de princípios ativos,

particularmente os que apresentam estrutura esteroidal, como alguns tipos de

saponinas, ou glicosídeos cardioativos. De modo geral, espécies como Tribulus

alatus, cujo uso popular está relacionado ao aumento de massa muscular,

apresenta essas propriedades possivelmente relacionadas à presença de

saponinas esteroidais (El-Tantawny et al., 2007).

Dos extratos estudados, poucos apresentam estudos químicos

relatados. Estudos anteriores mostram que X. aromatica apresenta diterpenos

caurenoicos (de Melo et al., 2001), compostos voláteis (Jürgens et al., 2000) e

acetogeninas (Colman-Saizarbitoria et al., 1995; Colman-Saizarbitoria et al.,

1994). A. longifolia não apresenta dados químicos, mas espécies correlatas

apresentam compostos da classe dos ciclopeptídeos/ciclotídeos (Svangard et

http://www.research.uci.edu/tmf/husbandry.htm

40

al., 2004); além desses compostos, há a ocorrência de flavonoides (Vukics et

al., 2008a, Vukics et al., 2008b, Flamini, 2007), saponinas triterpênicas (Moon

et al., 2004) e óleos essenciais (Flamini et al., 2003). Os extratos EB689,

EB827 e EB1097 foram obtidos de espécies de Fabaceae (Leguminosae), e

ainda não foram estudados quimicamente. Porém, espécies correlatas

apresentam saponinas triterpênicas (Haridas et al., 2001). O extrato 719 foi

obtido de L. suaveolens, planta cujos relatos químicos são inexistentes, porém,

espécies pertencentes ao mesmo gênero foram estudadas e apresentaram

diterpênicos clerodânicos, chamados de corymbulosinas A, B e C (Henry et al.,

2006). O extrato 1151, obtido de P. sprucei, também não apresenta relatos de

estudos químicos. Estudos prévios com essa espécie mostraram a presença de

quassinosídeos, denominados isobruceína B e neosergeolídeo (Silva et al.,

2009), além de neosergeolídeo (de Andrade-Neto et al., 2007). S. globulifera foi

a planta usada para se obter o extrato 1257. Estudos prévios mostraram a

presença de acilfloroglucinóis poliprenilados policíclicos, e M. coccinea, planta

da qual o extrato 1765 foi isolado, apresentou benzofenonas polipreniladas

(Marti et al., 2010). Diversos tipos de xantonas foram isoladas de S. globulifera.

Por fim, I. alba é a planta que originou o extrato 1493, e nenhum dado químico

da espécie foi encontrado, o que não acontece para várias espécies do gênero,

algumas muito estudadas, como a batata-doce.

O peso corporal dos animais e o peso dos testículos + epidídimo foram

obtidos. Em relação ao peso corporal (figura 3), observou-se que os

tratamentos representaram 36,41% da variância total (F(12;335)=32,08; p<0,001),

o tempo representou 16,62% da variância total (F(2;335)=87,87; p<0,001) e a

relação entre os dois representou 5.02% do total de variância (F(24;335)=2,21;

41

p<0,01). Para os extratos EB827, EB1097, EB1257, EB1493 e EB1765 houve

diferença muito significativa de peso em relação aos três controles usados

(p<0,001). Como essa diferença já foi observada desde a divisão dos animais

em grupos, no 1º dia de experimentos talvez essa alteração de peso esteja

relacionada não à influência dos hormônios sobre a massa muscular dos

animais, mas simplesmente à variação natural de peso que se manteve

durante o período de experimentos. Para evidenciar quaisquer alterações de

peso envolvidas com a administração dos extratos, foi feita análise do ganho

de peso, nos dias 22 e 45 em relação ao início do tratamento. Nessa análise,

observou-se que os tratamentos representaram um total de 15,42% da

variância (F(12;192)=6,93; p<0.001), e o tempo representou 7,84% do total de

variância (F(1;192)=225,38; p<0.001); a interação entre os dois não se mostrou

significante. Nas duas medidas obtidas, apenas os extratos EB149 (p<0,01) e

EB689 (p<0,05) apresentaram-se diferentes em relação ao controle.

A análise do peso dos testículos=epidídimo (tabela 4) foi feita após

eutanásia dos animais, nos dias 22 e 45 após o início do tratamento, que

mostrou-se significante (F(12;120)=4,60; p<0.01). O tempo não apresentou

significância relevante, porém a interação entre tratamento e tempo mostrou-se

significante (F(12;120)=2.58; p<0.001). Os dados indicam aumento no peso dos

testículos + epidídimo dos animais tratados com os extratos EB827, EB1257 e

EB1765, e a significância varia de p<0,05 a p<0,001.

42

4. Conclusões

Os extratos antitumorais e antibacterianos testados, identificados como

EB149, EB284, EB689, EB719, EB827, EB1097, EB1151, EB1257, EB1493 e

EB1765, interferiram na concentração sérica de testosterona em camundongos

pós-púberes. O peso corpóreo dos camundongos tratados com os extratos

EB817, Eb1097, EB1257, EB1493 e EB1765 apresentou-se alterado em

relação aos grupos controle, e por esse motivo, ao analisar o ganho de peso no

período de tratamento, observou-se que apenas os camundongos tratados com

os extratos EB149 e EB689 apresentaram alterações em relação aos animais

dos grupos controle. Por fim, camundongos tratados com os extratos EB827,

EB1257 e EB1765 apresentaram testículos+epidídimo (pesados em conjunto)

com peso mais elevado, em relação aos camundongos dos grupos controle.

43

Agradecimentos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP

(2008/58706-8).

Revista para a qual pretende-se enviar o artigo: Memórias do Instituto

Oswaldo Cruz.

4. Referências bibliográficas

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49

Tabela 1. Relação das espécies de plantas usadas para obtenção dos dez extratos usados administrados a camundongos Balb-c, para

verificação de sua influência sobre a concentração sérica de testosterona, após administração de doses repetidas. As doses administradas por

via oral aos camundongos representam 10% da dose não letal determinada em estudos prévios (Estork, 2011; Gusmão, 2011).

Espécie Família Número de

coleta Órgão usado N do extrato

Dose letal

50% [g/kg]*

Dose não

letal [g/kg]

Dose

experimental

[g/kg]

Xylopia aromatica Annonaceae IBS08 Caule EB149 1,25 0,6259 0,063

Amphirrhox longifolia Violaceae PSC80 Órgãos aéreos EB284 0,6259 0,3125 0,03125

Abarema auriculata Fabaceae Mimosoidae AAO3353 Caule EB689 0,0098 0,0049 0,0005

Laetia suaveolens Salicaceae AAO3383 Folhas e caule EB719 0,3125 0,1563 0,0156

Pentaclethra macroloba Fabaceae Mimosoidae AAO3481 Caule EB827 0,1563 0,0789 0,0079

Swatzia sericea var.

sericea

Fabaceae

Caesalpiniodeae AAO3501 Frutos EB1097 0,1563 0,0789 0,0079

Symphonya globulifera Clusiaceae AAO3717 Órgãos aéreos EB1257 0,6256 0,3125 0,0312

Picrolemma sprucei Simaroubaceae AAO3582 Órgãos aéreos EB1151 0,0625 0,0391 0,0039

Ipomoea alba Convolvulaceae AAO4031 Órgãos aéreos EB1493 2,500 1,25 0,1250

Moronobea coccinea Clusiaceae IBS142 Flores EB1765 2,500 1,25 0,1250

*Fonte: (Estork, 2011; Gusmão, 2011).

50

O

OH

Figura1. Representação estrutural da molécula de testosterona

51

Concentração de testosterona em soro de camundongo

Tratamento

[pg

/mL

]

149

284

689

719

827

1097

1151

1257

1493

1765

vehic

le c

ontrol

test

oster

ona V.O

.

test

oster

ona I.P

.0

5000

10000

15000

20000

***

***

***

***

*

*** ***

*

****** ***

Figura 2. Concentração de testosterona sérica obtida de camundongos tratados com

extratos vegetais, a partir de radioimunoensaio em placas de ELISA (USCN Kit

E90458Mu 96 tests enzyme-linked). Análise estatística ANOVA de duas entradas,

com teste posterior de Bonferroni e nível de significância p<0.05.

52

Peso corporal dos camundongos

Tratamento

peso

[g

]

Contr

ole v

eícu

lo

Testo

I.P.

Testo

V.O

.

EB14

9

EB28

4

EB68

9

EB71

9

EB82

7

EB10

97

EB11

51

EB12

57

EB14

93

EB17

65

15

20

25

30

35Controle veículo

Testo I.P.

Testo V.O.

EB149

EB284

EB689

EB719

EB827

EB1097

EB1151

EB1257

EB1493

EB1765

*

******

****** ***

***

****** ***

***

*######

# #

######

###

### #####

#$$$$$$

$

$$$

$

$

$$

Variação de peso corporal

Tratamento

[g]

Contr

ole v

eícu

lo

Testo

I.P.

Testo

V.O

.

EB14

9

EB28

4

EB68

9

EB71

9

EB82

7

EB10

97

EB11

51

EB12

57

EB14

93

EB17

65

-2

0

2

4

6

8

****

A

Figura 3. (A) Peso dos camundongos tratados com extratos vegetais, obtido nos dias

22 e 45 a partir do início do tratamento. (B) Ganho de peso dos camundongos tratados

com extratos vegetais, obtido nos dias 22 e 45 a partir do início do tratamento. Análise

estatística ANOVA de duas entradas, com teste posterior de Bonferroni e nível de

significância de p<0.05.

53

Peso dos testículos de camundongos

Tratamento

peso

[g

]

contr

ole v

eícu

lo

Testo

V.O

.

Testo

I.P.

EB14

9

EB28

4

EB68

9

EB71

9

EB82

7

EB10

97

EB11

51

EB12

57

EB14

93

EB17

65

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

*** ** **

Figura 4. Peso dos testículos de camundongos tratados com extratos vegetais aos 22

e 45 dias do início do tratamento. Análise de variância ANOVA de duas entradas, com

teste posterior de Bonferroni e nível de significância de p<0.05.

54

ANEXO I – Aprovação pelo Comitê de Ética

56

ANEXO II – Curriculum Lattes

Paula Andreotti Rodrigues

Curriculum Vitae

Fevereiro/2013

57

Paula Andreotti Rodrigues

Curriculum Vitae ______________________________________________________________________________________

Dados pessoais

Nome Paula Andreotti Rodrigues Nome em citações bibliográficas RODRIGUES, P. A. Sexo Feminino Filiação Wilson Rodrigues e Alice Andreotti Rodrigues Nascimento 08/07/1983 - São Paulo/SP - Brasil Carteira de Identidade 339318867 SSP - SP - 06/08/2007 CPF 322.663.588-39 Endereço residencial Praça Sampaio Vidal , 121, apto 114 Vila Formosa - Sao Paulo 03356-060, SP - Brasil Telefone: 11 27834968 ______________________________________________________________________________________

Formação acadêmica/titulação

2006 - 2007 Especialização em Fisioterapia Dermato-Funcional. Universidade Gama Filho, UGF, Brasil Título: Avaliação da Toxicidade do Nicotinato de Metila utilizado com o

método de fonoforese Orientador: Daclé Juliane Macrini 2000 - 2005 Graduação em Fisioterapia. Centro Universitário São Camilo, SÃO CAMILO, Brasil Título: Teste de caminhada de seis minutos em DPOC Orientador: Renata Trimer ______________________________________________________________________________________

Formação complementar

2008 - 2008 Curso de curta duração em Maquilador. SENAC, SENAC, Brasil 2007 - 2007 Curso de curta duração em Destoxiredução. Campcursos, 111, Brasil 2007 - 2007 Curso de curta duração em Shiatsu Nivel I. SENAC, SENAC, Brasil ______________________________________________________________________________________

Atuação profissional

1. Universidade Paulista - UNIP __________________________________________________________________

58

__________ Vínculo institucional 2007 - Atual Vínculo: Docente , Enquadramento funcional: Docente , Carga

horária: 25, Regime: Dedicação exclusiva

2. Vitaderm Hipoalergênica - VITADERM __________________________________________________________________

__________ Vínculo institucional 2007 - Atual Vínculo: Autônomo , Enquadramento funcional: Técnica , Carga

horária: 6, Regime: Parcial

3. Cruz Vermelha Brasileira - São Paulo - CVB/SP __________________________________________________________________

__________ Vínculo institucional 2007 - 2009 Vínculo: autônomo , Enquadramento funcional: Docente ,

Carga horária: 6, Regime: Parcial

4. Estética Onodera - ONODERA __________________________________________________________________

__________ Vínculo institucional 2006 - 2007 Vínculo: Avaliadora , Enquadramento funcional: Avaliadora e

atendimento em Dermato funcional , Carga horária: 30, Regime: Dedicação exclusiva

5. Centro Estético Roma - ROMA __________________________________________________________________

__________ Vínculo institucional 2005 - 2006 Vínculo: contratada , Enquadramento funcional: Avaliadora,

atendimento em Dermato Funcional , Carga horária: 35, Regime: Dedicação exclusiva

6. Le Ru - Estética especializada - LE RU __________________________________________________________________

__________ Vínculo institucional 2002 - 2005 Vínculo: contratada , Enquadramento funcional: Avaliadora ,

Carga horária: 30, Regime: Dedicação exclusiva Outras informações: Atendente, avaliadora, cooredenadora de procedimentos e gerente

______________________________________________________________________________________

59

Idiomas

Inglês Compreende Razoavelmente , Fala Razoavelmente , Escreve Pouco , Lê

Razoavelmente

Producão

______________________________________________________________________________________

Produção bibliográfica Livros publicados 1. Calvi, Eliziane Nitz de Carvalho, RODRIGUES, P. A., Thais Andreotti Gelsi Bambuterapia. São Paulo : Yendis, 2009, v.01. p.156. Palavras-chave: bambu, estética Áreas do conhecimento : Estética Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Impresso, ISBN: 9788577281091

Apresentação de trabalho e palestra 1. RODRIGUES, P. A. Influência da administração do extrato orgânico obtido de Abarema Auriculata sobre a concentração de testosterona sérica em camundongos, 2012. (Congresso,Apresentação de Trabalho)

Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Outro; Cidade: Bento Gonçalves; Evento: XXII Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil

Orientações e Supervisões

Orientações e supervisões Orientações e supervisões concluídas Trabalhos de conclusão de curso de graduação 1. Andressa Karoline Bicudo dos Santos. Tratamento de Estrias com uso de Eletrolifting. 2011. Curso (Fisioterapia) - Universidade Paulista

Referências adicionais : Brasil/Português.

2. Bruna Tanzillo Gomes Nogueira. ESTUDO COMPARATIVO DA DRENAGEM LINFÁTICA ASSOCIADA AO PRINCÍPIO ATIVO SILOXANETRIOL ALGINATO DE CAFEÍNA. 2010. Curso (fisioterapia) - Universidade Paulista Palavras-chave: drenagem linfática manual Áreas do conhecimento : Fisioterapia e Terapia Ocupacional Setores de atividade : Atividades profissionais, científicas e técnicas, Saúde humana e serviços sociais Referências adicionais : Brasil/Português.

Iniciação científica 1. Analu Ribeiro da Silva. Tratamentos estéticos em fissuras em região de calcâneo. 2012. Iniciação científica (Estética e Cosmética) - Universidade Paulista

Referências adicionais : Brasil/Português.

60

Eventos

Eventos Participação em eventos 1. Apresentação Oral no(a) I Congresso New Wstic, 2008. (Congresso) Ciclotermia para redução de gordura localizada. Organização de evento 1. RODRIGUES, P. A. Encontro Acadêmico de Estética e Cosmética, 2012. (Outro, Organização de evento)

Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Vários

2. RODRIGUES, P. A. Encontro Prático de Estética - Dia de Vênus, 2012. (Outro, Organização de evento)


3. RODRIGUES, P. A. Encontro Acadêmico de Estética e Cosmética, 2011. (Outro, Organização de evento)




5. RODRIGUES, P. A. A Semana da Mulher na UNIP, 2010. (Outro, Organização de evento)


6. RODRIGUES, P. A. Encontro Acadêmico de Estética e Cosmética, 2010. (Outro, Organização de evento)




8. RODRIGUES, P. A. A Estética na Primavera, 2009. (Outro, Organização de evento)


9. GUSMAO, D. F., MACRINI, D. J., RODRIGUES, P. A. Encontro De Estética e Cosmética, 2009. (Outro, Organização de evento)

Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Outro

10. RODRIGUES, P. A. Encontro de Estética e Cosmética (Cosmetologia e Estética) - Dia de Vênus, 2009. (Outro, Organização de evento) Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Vários

11. RODRIGUES, P. A. Encontro Acadêmico de Cosmetologia e Estética da UNIP, 2008. (Outro, Organização de evento) Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Vários

12. GUSMAO, D. F., RODRIGUES, P. A., MACRINI, D. J. I Encontro Acadêmico de Prática em Estética da UNIP, 2008. (Outro, Organização de evento) Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Outro

61

______________________________________________________________________________________

Totais de produção

Produção bibliográfica

Livros

publicados......................................................................... 1

Apresentações de trabalhos

(Congresso).................................................... 1

Orientações

Orientação concluída (trabalho de conclusão de curso de

graduação)........................ 2

Orientação concluída (iniciação

científica)............................................... 1

Eventos

Participações em eventos

(congresso)...................................................... 1

Organização de evento

(outro)............................................................. 12

62

Anexo III – Normas para publicação na revista Memórias do Instituto

Oswaldo Cruz

INSTRUCTIONS TO AUTHORS

The manuscript should be prepared using standard word processing software and should be printed (font size 12) double-

spaced throughout the text, figure captions, and references, with margins of at least 3 cm. The figures should come in the

extension tiff, with a minimum resolution of 300 dpi. Tables and legends to figures must be submitted all together in a single file.

Figures, must be uploaded separately as supplementary file.

The manuscript should be arranged in the following order:

Running title: with up to 40 characters (letters and spaces)

Title: with up to 250 characters

Author's names: without titles or graduations

Institutional affiliations: full address of the corresponding author only

Summary: up to 200 words (100 words in case of short communications). It should emphasize new and important aspects of

the study or observations.

Key words: 3-6 items must be provided. Terms from the Medical Subject Headings (Mesh) list of Index Medicus should be

used.

Sponsorships: indicating the sources of financial support and change of address.

Introduction: should set the purpose of the study, give a brief summary (not a review) of previous relevant works, and state

what new advance has been made in the investigation. It should not include data or conclusions from the work being reported.

Materials and Methods: should briefly give clear and sufficient information to permit the study to be repeated by others.

Standard techniques need only be referenced.

Ethics: when reporting experiments on human subjects, indicate whether the procedures followed were in accordance with the

ethical standards of the responsible committee on human experimentation (institutional or regional) and with the Helsinki

Declaration of 1975, as revised in 1983. When reporting experiments on animals, indicate whether the institution's or a national

research council's guide for, or any national law on the care and use of laboratory animals was followed.

Results: should be a concise account of the new information discovered, with the least personal judgement. Do not repeat in

text all the data in the tables and illustrations.

Discussion: should be limited to the significance of the new information and relate the new findings to existing knowledge. Only

unavoidable citations should be included.

Acknowledgements: should be short and concise, and restricted to those absolutely necessary.

REFERENCES

must be accurate. Only citations that appear in the text should be referenced. Unpublished papers, unless accepted for publication, should not be cited. Work accepted for publication should be referred to as "in press" and a letter of acceptance of the journal must be provided. Unpublished data should only be cited in the text as "unpublished observations", and a letter of permission from the author must be provided. The references at the end of the paper should be arranged in alphabetic order according to the surname of the first author. CLICK HERE [+]

FIGURES AND TABLES MUST BE UNDERSTANDABLE WITHOUT REFERENCE TO THE TEXT

Figures: presented in tiff format with a minimum of 300 dpi and photographs must be sharply focused, well contrasted, and if

mounted onto a plate, the figures should be numbered consecutively with Arabic numbers. Magnification must be indicated by a

line or bar in the figure, and referenced, if necessary in the caption (e.g., bar = 1 mm). Plates and line figures should either fit

one column (8 cm) or the full width (16.5 cm) of the page and should be shorter than the page length to allow inclusion of the

legend. Letters and numbers on figures should be of a legible size upon reduction or printing. A colour photograph illustrates the

http://memorias.ioc.fiocruz.br/instructions-to-authors

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cover of each issue of the Journal and authors are invited to submit illustrations with legends from their manuscript for

consideration for the cover.

Tables: should supplement, not duplicate, the text and should be numbered with Roman numerals. A short descriptive title

should appear above each table, with any explanations or footnotes (identified with a, b, c, etc.) below.

Technical Notes: Technical Notes should communicate rapidly single novel techniques or original technical advances. The

entire note should occupy no more than three printed pages including figures and/or tables (it means around 10 double-spaced

typed Word file maximum). The text must not be not divided into sections. Therefore, the state of art must be very briefly

presented; results must be rapidly presented and discussed at a time. Complementary tables and figures may be published as

supplementary data. References must be limited to few essential ones and cited at the end of the note, using the same format

as in full papers. A brief summary and three key words must be provided.

Short communications: should communicate rapidly single results or techniques. They should occupy no more than three

printed pages including figures and/or tables. They should not contain excessive references. References should be cited at the

end of the paper using the same format as in full papers. A brief summary and three key words must be provided.

Alternative format: manuscripts may be submitted following the "Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to

Biomedical Journals" produced by the International Committee of Medical Journal Editors also known as the Vancouver Style. In

this case, authors should follow the guidelines in the fifth edition (Annals of Internal Medicine 1997; 126: 36-47, or at the website

http://www.acponline.org/journals/resource/unifreqr/htm) and will be responsible for modifying the manuscript where it differs

from the instructions given here, if the manuscript is accepted for publication.

Authors should also follow the Uniform Requirements for any guidelines that are omitted in these Instructions.

In case of clinical trials it’s mandatory to inform the registration number of the REBEC platform.

A statement that the data/results of the manuscript are not plagiarism and have not been published elsewhere.

ONCE A PAPER IS ACCEPTED FOR PUBLICATION, THE AUTHORS MUST PROVIDE:

an affidavit, provided by the Editorial Office, signed by all authors. Authors from different countries or institutions may sign in

different sheets containing the same basic statement;

a copyright assignment form, provided by the Editorial Office, signed by the corresponding author.

Page charges: there will be no page charges.

Proofs: one set of page proofs will be supplied for the author to check for typesetting accuracy, to be returned by the stipulated

date. No changes to the original manuscript will be allowed at this stage.

AVALIAÇÃO DE EXTRATOS VEGETAIS BIOATIVOS DE … · ... niacina, entre outras (Okwu e Aluwuo, ......

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