i

Lcia Maria Garcia

Avaliao do desempenho da pesquisa de anticorpos IgG anti-

Leishmania chagasi por citometria de fluxo no diagnstico da

leishmaniose visceral humana

Montes Claros Minas GeraisAbril / 2009

U UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROSPROGRAMA DE PS-GRADUAO

EM CINCIAS DA SADEMESTRADO ACADMICO EM CINCIAS DA SADE

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ii

Lcia Maria Garcia

Avaliao do desempenho da pesquisa de anticorpos IgG anti-Leishmania chagasi por citometria de fluxo no diagnstico da

leishmaniose visceral humana

Orientador: Dr. Olindo Assis Martins FilhoCo-orientadora: Dra. Marilia Chaves Andrade

Montes Claros Minas GeraisAbril / 2009

U UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROSPROGRAMA DE PS-GRADUAO

EM CINCIAS DA SADEMESTRADO ACADMICO EM CINCIAS DA SADE

Dissertao apresentada aoPrograma de Ps Graduao emCincias da Sade, PPGCS, daUniversidade Estadual de MontesClaros/Unimontes, como parte dasexigncias para a obteno doTtulo de Mestre em Cincias daSade.

Garcia, Lcia Maria.G216a Avaliao do desempenho de pesquisa de anticorpos IgG anti-

Leishmania chagasi por citometria de fluxo no diagnstico daleishmaniose visceral humana [manuscrito] / Lcia Maria Garcia. 2009.

146 f. : il.

Inclui bibliografia. Dissertao (mestrado) - Universidade Estadual de Montes Claros Unimontes, Programa de Ps-Graduao em Cincias da Sade/PPGCS, 2009. Orientador: prof. Dr. Olindo de Assis Martins Filho. Co-orientadora: profa. Dra. Marilia Chaves Andrade.

1. Leishmaniose visceral. 2. Diagnstico sorolgico. 3. Citometriade fluxo. I. Martins Filho, Olindo de Assis. II. Andrade, MariliaChaves. III. Universidade Estadual de Montes Claros. IV. Ttulo.

Catalogao Biblioteca Central Prof. Antonio Jorge

iii

AGRADECIMENTOS

minha me Geralda, que em sua simplicidade possui a sabedoria

necessria para incentivar as conquistas dos filhos e se alegrar genuinamente com

elas;

minha filha Jlia, pelo amor, carinho e companheirismo sempre

demonstrados, mesmo distncia;

Aos amigos do mestrado com quem compartilhei momentos de cumplicidade

durante os crditos, na prazerosa atividade de voltar a sentar em cadeiras de

alunos;

s colegas de mestrado e amigas Luciara Leo e Simone Melo Costa, pela

companhia, carinho e colaborao com que estiveram sempre presentes;

colega de mestrado e do Laboratrio de Anlises Clnicas do Hospital

Universitrio, Luandra Ramos Esprito Santo, pelo incentivo, amizade e

tranqilidade com que solucionou as questes de minha relativa ausncia do

laboratrio;

Aos colegas do Laboratrio de Anlises Clnicas do Hospital Universitrio -

UNIMONTES, pelo incentivo e apoio, substituindo com seu trabalho atividades que

deixei de exercer durante o perodo do mestrado;

Ao Dr. Olindo Assis Martins Filho, orientador deste trabalho, por possibilitar a

realizao desse estudo junto ao seu grupo de pesquisa no Centro de Pesquisas

Ren Rachou;

Dra. Marilia Chaves Andrade, co-orientadora deste trabalho, pela presteza,

disponibilidade e tranqilidade transmitidas;

iv

Jordana Alves Coelho dos Reis e Dra. Vanessa Perhuype-Magalhes

pela gentileza, profissionalismo e colaborao na escrita da dissertao e do artigo;

Cristiane Santos Matos e Dra. Danielle Vitelli Avelar, do Centro de

Pesquisas Ren Rachou, pelo auxlio em importantes etapas da conduo desse

trabalho;

Izabelle Teixeira Gomes, ao Dr. Slvio Fernando Guimares de Carvalho,

Dra. Elenice Lemos e ao Dr. Reynaldo Dietze por disponibilizarem seus dados

originais para a realizao desse trabalho;

Mauro Jos Guedes Roque, Shirlene Barbosa Pimentel Ferreira e Marise

Fagundes, pelas valiosas colaboraes;

diretoria administrativa do HUCF, pela carga horria liberada de minhas

atividades no Laboratrio de Anlises Clnicas para a realizao desse mestrado;

s secretrias e professores do Programa de Ps-Graduao em Cincias da

Sade (PPGCS) pela convivncia durante esse perodo, e aos coordenadores, pela

iniciativa em introduzir esse Programa de Mestrado, possibilitando a realizao por

profissionais aqui residentes;

Enfim, a todos que de alguma forma contriburam para a realizao deste

trabalho.

v

DEDICATRIA

Dedico este trabalho aos pacientes de leishmaniose visceral,na esperana de que, com a contribuio da cincia,

seu sofrimento possa ser minorado.

vi

LISTA DE ABREVIATURAS

AAPF-IgG: Anticorpos IgG Anti-formas Promastigotas Fixadas

ALT: Alanina Aminotransferase

ASC: rea Sob a Curva

AST: Aspartato Amino Transferase

B.O. D: Estufa com demanda bioqumica de oxignio

CDC: Centro de Controle de Doenas

CH: grupo de amostras de indivduos com doena de Chagas

CPqRR: Centro de Pesquisas Ren Rachou

CUR: grupo de amostras de indivduos tratados e curados

DAT: Teste de Aglutinao Direta

ELISA: Imunoensaio Enzimtico

Esp: Especificidade

FC-AFPA-IgG: Flow Cytometry Anti-Fixed Promastigotes Antibodies-G

FC-AFEA-IgG: Flow Cytometry Anti-Fixed Epimastigotes Antibodies-G

FC-ALPA-IgG: Flow Cytometry Anti-Live Promastigotes Antibodies-G

FC-ALTA-IgG: Flow Cytometry Anti-Live Trypomastigotes Antibodies-G

FIOCRUZ: Fundao Oswaldo Cruz

FITC: isotiocianato de fluorescena, do ingls Fluorescein Isothiocyanate

FNeg: Falso Negativo

FPos: Falso Positivo

FSC: tamanho, do ingls Forward Scatter

FUNASA: Fundao Nacional de Sade

HAN: grupo de amostras de indivduos com hansenase

vii

IC: Intervalo de Confiana

IM: Intramuscular

IR: faixa intermediria do teste, do ingls Intermediate Range

LC: grupo de amostras de indivduos com leishmaniose cutnea

L. chagasi: Leishmania chagasi

LIT: Liver Infusion Tryptose medium

LOG: Logartimica

LM: Leishmaniose Mucocutnea

LV: Leishmaniose Visceral

LV+: indivduos positivos para leishmaniose visceral

LV-: indivduos negativos para leishmaniose visceral

MAL: grupo de amostras de indivduos com malria

MR: faixa mensurvel do teste, do ingls Measurement Range

MS: Ministrio da Sade

NI: grupo de amostras de indivduos no infectados

NNN: Nicole, Novy & Neal medium

NNN/LIT: Nicole, Novy & Neal / Liver Infusion Tryptose medium (Meio de cultivobifsico)

OMS: Organizao Mundial da Sade

OPD: Orto-fenilenediamino

PBS: Soluo tampo de fosfato e salina, do ingls Phosphate Buffered Saline

PC: Ponto de Corte

PCR: Polymerase Chain Reaction

Pe: Proporo de concordncia esperada

Po: Proporo de concordncia observada

PPFP: Percentual de Parasitos Fluorescentes Positivos

viii

RIFI: Reao de Imunofluorescncia Indireta

ROC: Receiver Operating Characteristic Curve

RV+: Razo de Verossimilhana positiva

RV-: Razo de Verossimilhana negativa

Sb+5: antimoniais pentavalentes

Sens: Sensibilidade

SES: Secretaria de Estado da Sade

SER: Sistema Retculo-Endotelial

SFB: Soro Fetal Bovino

SSC: granulosidade, do ingls Side Scatter

TB: grupo de amostras de indivduos com tuberculose

TG-ROC: Two-Graph-ROC

UFES: Universidade Federal do Esprito Santo

VPP: Valor Preditivo Positivo

VPN: Valor Preditivo Negativo

VNeg: Verdadeiro Negativo

VPos: Verdadeiro Positivo

VRP: faixa vlida do teste, do ingls Valid Range Proportion

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Esquema de Transmisso da Leishmaniose Visceral..6

Figura 2- Representao esquemtica da seqncia das anlises da pesquisa deAAPF-IgG...................................................................................................................35

Figura 3- Representao esquemtica da escolha da diluio atravs da amplitudede segregao entre os valores individuais de PPFP de pacientes portadores de LV

e indivduos no infectados (NI) ................................................................................41

Figura 4- Curvas ROC dos testes 1 (linha verde) e 2 (linha azul), construdas a partirdos ndices de desempenho, sensibilidade e 100 especificidade dos testes

avaliados.......44

Figura 5 - Representao esquemtica da Two Graph ROC..................................44

Figura 6 - Curvas de titulao de imunoglobulinas G anti-formas promastigotasfixadas de L.chagasi presentes em soros de pacientes com leishmaniose visceral e

de indivduos no infectados.....51

Figura 7- Sobreposio das curvas de titulao de imunoglobulinas G anti-formaspromastigotas fixadas de L. chagasi presentes em soros de pacientes com

leishmaniose visceral e de indivduos no infectados.....52

Figura 8- Avaliao da amplitude (delta - ) de segregao entre as reatividadesmdias dos soros de pacientes com leishmaniose visceral e de indivduos no

infectados, com os respectivos valores de (PPFP LV PPFP

NI)........52

x

Figura 9- Curvas ROC da AAPF-IgG construda a partir dos ndices de desempenho,Sensibilidade e 100 - Especificidade, dos grupos LV e NI nas diluies 1:2000,

1:4000, 1:8000, 1:16000 e

1:32000.......................................................................................................................54

Figura 10- Anlise da reatividade das diluies-candidatas (selecionadas porvalores de de PPFP maiores que 70% + ndices de desempenho) dos grupos NI e

LV atravs do perfil de disperso individual das

amostras.....................................................................................................................55

Figura 11 Curvas de titulao de imunoglobulina G anti-formas promastigotasfixadas de L. chagasi presentes em (A) soros de pacientes infectados com

Leishmania (e (B) soros de indivduos tratados e curados........................................57

Figura 12 - Sobreposio das curvas de titulao de IgG anti-formas promastigotasfixadas de L. chagasi presentes em soros de pacientes com leishmaniose visceral e

de indivduos tratados curados ..................................................................................58

Figura 13 - Avaliao da amplitude (delta - ) de segregao entre as reatividadesmdias dos soros de pacientes com leishmaniose visceral e de indivduos tratados

curados com os respectivos valores de (PPFP LV PPFP

CUR)...........................................................................................................................58

Figura 14 Curva ROC da AAPF-IgG construda a partir dos ndices dedesempenho, Sensibilidade e 100 Especificidade, dos grupos LV e CUR na

diluio 32000............................................................................................................59

Figura 15 - Anlise da reatividade da diluio-candidata (selecionada por valores de de PPFP maiores que 70% + ndices de desempenho) dos grupos LV e CUR

atravs do perfil de disperso individual das amostras..............................................59

Figura 16 Curvas de titulao de imunoglobulina G anti-formas promastigotasfixadas de L. chagasi presentes em (A) soros de pacientes infectados com

xi

Leishmania e (B) soros de indivduos no infectados + tratados

curados.......................................................................................................................62

Figura 17 - Sobreposio das curvas de titulao de IgG anti-formas promastigotasfixadas de L. chagasi presentes em soros de pacientes com leishmaniose visceral e

de indivduos no infectados + tratados curados ......................................................63

Figura 18 - Avaliao da amplitude (delta - ) de segregao entre as reatividadesmdias dos soros de pacientes com leishmaniose visceral e de indivduos no

infectados + tratados curados , com os respectivos valores de (PPFP LV PPFP

CUR)...........................................................................................................................63

Figura 19 - Curva ROC da AAPF-IgG construda a partir dos ndices dedesempenho, Sensibilidade e 100 Especificidade, dos grupos LV e (NI+CUR) nas

diluies 1:16000 e 1:32000.......................................................................................64

Figura 20 - Anlise da reatividade da diluio-candidata (selecionada por valores de de PPFP maiores que 70% + ndices de desempenho) dos grupos LV e no

infectados + tratados curados, atravs do perfil de disperso individual em diferentes

pontos de corte sugeridos pela curva

ROC............................................................................................................................65

Figura 21 Anlise do desempenho TG-ROC na diluio selecionada (1:32000) empopulao constituda pelos grupos LV e (NI+CUR) para definio do ponto de

corte............................................................................................................................66

Figura 22 Determinao da razo de verossimilhana em funo da amplitude doponto de corte de trabalho da tcnica FC-AAPF IgG pela anlise fornecida pela TG -

ROC............................................................................................................................67

Figura 23 - Determinao da Eficincia e J de Youden em funo da amplitude doponto de corte de trabalho da tcnica FC-AAPF IgG pela anlise fornecida pela TG -

ROC............................................................................................................................68

xii

Figura 24 - Anlise da reatividade de IgG anti-formas promastigotas fixadas de L.chagasi em soros de pacientes dos grupos LV e de Outras Doenas, empregando-

se como ponto de corte o valor de 25% (linha pontilhada) entre resultados positivos

(PPFP>25%) e negativos (PPFP25%).....................................................................70

Figura 25 Anlise da reatividade de IgG anti-formas promastigotas fixadas de L.chagasi em soros de indivduos com leishmaniose visceral e portadores de outras

doenas infecto-parasitrias: doena de Chagas, leishmaniose cutnea ,

tuberculose, malria e hansenase, na diluio do soro

1:32000.......................................................................................................................72

Figura 26 - Correlaes entre os resultados de dois diferentes analistas emamostras aleatrias de pacientes da populao estudada na pesquisa de AAPF-IgG

anti-L.chagasi. (A) Correlao de Pearson e (B) Bland e

Altman........................................................................................................................74

Figura 27- Reatividade de IgG anti-antgeno solvel de L. (L.) chagasi por ELISA,em soros individuais de pacientes com leishmaniose visceral e outras doenas

infecto-parasitrias: doena de Chagas , leishmaniose cutnea,, tuberculose,

malria e hansenase ..............................................................................................78

Figura 28- Reatividade comparativa de IgG anti-L. chagasi por ELISA e por CF-AAPF-IgG em amostras de pacientes LV e indivduos

CUR............................................................................................................................80

Figura 29- Correlao de Sperman (A), anlise de Bland e Altman (B) e tabela deContingncia (C) entre os resultados obtidos da sorologia anti-L.chagasi por ELISA e

pela CF-AAPF-IgG nas amostras da populao estudada (LV+NI+CUR+Outras

doenas).....................................................................................................................81

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Distribuio do grupo de indivduos com leishmaniose visceral (LV)segundo idade, incio dos sintomas e sexo29

Tabela 2- Categorias de resultados do teste diagnstico em uma populao queinclui portadores de leishmaniose visceral (LV+) e indivduos sem leishmaniose

visceral (LV-)..37

Tabela 3 - Categorias de resultados da AAPF-IgG (VPos, FPos, FNeg e VNeg) parapacientes portadores de LV e indivduos portadores de outras doenas infecciosas

de interesse em sade pblica...................................................................................69

Tabela 4 - ndices de Desempenho da Pesquisa de AAPF-IgG por Citometria deFluxo, utilizando-se amostras diludas 1:32000, de pacientes com leishmaniose

visceral e pacientes sem leishmaniose, porm com outras doenas infecto-

parasitrias.....71

Tabela 5 - Dados para clculo do ndice Kappa..75

Tabela 6- Classificao do ndice Kappa, segundo Landis & Koch (1977)........76

Tabela 7- ndices de desempenho do ELISA e da pesquisa de AAPF-IgG, expressosem porcentagem, no diagnstico sorolgico de leishmaniose visceral, numa

populao que inclui indivduos portadores de outras doenas infecto- parasitrias

de interesse mdico...................................................................................................78

xiv

RESUMO

A leishmaniose visceral (LV) uma doena sistmica, causada por protozorio

intracelular pertencente ao complexo donovani. Por ser uma doena de notificao

compulsria e com caractersticas clnicas de evoluo grave, o diagnstico deve ser

realizado de forma precisa e o mais precocemente possvel. Embora vrios estudos

busquem avanos no diagnstico sorolgico da LV, at o momento nenhum dos

testes diagnsticos disponveis apresenta-se totalmente satisfatrio. Este estudo

objetivou avaliar a performance da imunofluorescncia indireta por citometria de

fluxo para pesquisa de anticorpos IgG anti- formas promastigotas de Leishmania

chagasi (AAPF-IgG) no sorodiagnstico da LV e sua aplicabilidade na avaliao da

cura ps-teraputica. Foram analisadas amostras de soro de pacientes com LV,

indivduos no infectados, indivduos tratados e curados e indivduos com outras

doenas infecciosas de interesse mdico. A reatividade dos soros foi reportada

como percentual de parasitos fluorescentes positivos (PPFP), usando o PPFP de

25% como ponto de corte para segregar resultados positivos e negativos. A diluio

das amostras de 1:32000 foi a de escolha tanto para o diagnstico como para a

avaliao de cura. A metodologia apresentou elevados ndices de sensibilidade,

especificidade, valores preditivos, acurcia e razo de verossimilhana tanto para o

diagnstico da LV como para a avaliao de cura. A reprodutibilidade da tcnica foi

verificada atravs da comparao entre diferentes analistas, com correlao

significativa (p

xv

pesquisa de imunoglobulinas G anti- L. chagasi, por citometria de fluxo, como uma

importante ferramenta para o diagnstico e para avaliao de cura ps-teraputica

da LV.

Palavras-chave: Leishmaniose visceral, diagnstico sorolgico, citometria de fluxo

xvi

ABSTRACT

Visceral leishmaniasis (VL) is a systemic infection caused by an intracellular

protozoan parasite belonging to the donovani complex. As a disease of compulsory

notification and clinical characteristics of major developments, the diagnosis should

be performed accurately and early as possible. Although several studies seek

advances in serological diagnosis of VL, so far none of the diagnostic tests available

is entirely satisfactory. This study intended to evaluate the performance of an indirect

immunofluorescence assay based on flow cytometry to quantify the reactivity of Anti-

Fixed Leishmania chagasi immunoglobulin G (FC-AFPA) for serodiagnosis of human

visceral leishmaniasis and also to verify its applicability in the posttherapeutic cure

assessment. Serum samples have been analyzed from patients with visceral

leishmaniasis, individuals not infected, treated and cured individuals and individuals

with other infectious diseases of medical interest. The sera reactivities were reported

as the percentage of positive fluorescent parasite (PPFP), using a PPFP of 25% as a

cut off to segregate positive and negative results. The sera dilution of 1,32000 was

the choice for both diagnosis and cure posttherapeutic assessment purposes. The

FC-AFPA presented elevated sensitivity, specificity, predictive values, accuracy and

likelihood ratio of both in the diagnosis of VL and for the evaluation of cure. The

reproducibility of FC-AFPA was verified through comparison between different

analysts, with significant correlation (p

xvii

tool in both diagnoses of LV cases and also for the posttherapeutic LV cure

assessment.

KEY-WORDS: Visceral leishmaniasis, serodiagnostic, flow cytometry

xviii

SUMRIO

AGRADECIMENTOS........................................................................................... iii

DEDICATRIA.................................................................................................... v

LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................... vi

LISTA DE FIGURAS............................................................................................ ix

LISTA DE TABELAS.......................................................................................... xiii

RESUMO............................................................................................................ xiv

ABSTRACT.......................................................................................................... xvi

1. INTRODUO................................................................................................ 1

1.1 Leishmaniose Visceral.................................................................................. 2

1.2 Aspectos Clnicos.......................................................................................... 7

1.3 Diagnstico Clnico........................................................................................ 10

1.4 Diagnstico Laboratorial................................................................................. 11

1.5 Tratamento..................................................................................................... 18

1.6 Justificativa..................................................................................................... 21

2. OBJETIVOS..................................................................................................... 24

2.1 Objetivo Geral................................................................................................ 25

2.2 Objetivos Especficos..................................................................................... 25

3. METODOLOGIA....................................................................................................... 27

3.1 Populao e local da Pesquisa.................................................................... 28

3.2 Aspectos ticos.............................................................................................. 30

3.3 Preservao e processamento das amostras de soros................................. 30

3.4 Preparo das formas promastigotas de L. chagasi para os ensaios de

xix

imunofluorescncia por citometria de fluxo.......................................................... 31

3.5 Reao de imunofluorescncia indireta por citometria de fluxo (AAPF-

IgG)...................................................................................................................... 32

3.6 Aquisio e anlise dos dados....................................................................... 33

3.7 Ensaio Imunoenzimtico (ELISA in house).................................................. 35

3.8 Anlise de desempenho da metodologia de citometria de fluxo na

pesquisa de AAPF-IgG........................................................................................ 37

3.8.1 Escolha da diluio do soro, atravs da amplitude de segregao

das diluies individuais................................................................................. 40

3.8.2 Definio de Ponto de Corte com utilizao da Curva ROC................... 42

3.9 Aplicabilidade da metodologia de pesquisa de AAPF-IgG na

segregao sorolgica de pacientes com LV e de pacientes portadores de

outras doenas infecto-parasitrias de interesse mdico e anlise

comparativa com o teste ELISA........................................................................... 46

3.10 Verificao da reprodutibilidade da tcnica de AAPF- IgG......................... 47

3.11 Intervalos de confiana IC......................................................................... 47

4. RESULTADOS................................................................................................. 48

4.1 Estabelecimento dos critrios de interpretao da AAPF-IgG aplicada

isoladamente no diagnstico e na excluso de sorologia residual ps-

teraputica da LV................................................................................................. 49

4.1.1 Determinao da diluio empregada na AAPF-IgG aplicada ao

diagnstico sorolgico da LV............................................................................ 49

4.1.2 Determinao da diluio empregada na AAPF-IgG aplicada

excluso de reatividade residual ps-teraputica da LV..................................... 53

4.2 Unificao dos critrios de interpretao da AAPF-IgG aplicada

xx

simultaneamente no diagnstico e na excluso de sorologia residual ps-

teraputica da LV................................................................................................. 60

4.3 Avaliao da aplicabilidade da AAPF-IgG na segregao sorolgica de

pacientes com LV e de pacientes portadores de outras doenas infecto-

parasitrias de interesse mdico.......................................................................... 68

4.4 Verificao da reprodutibilidade da tcnica de AAPF-

IgG........................................................................................................................ 73

4.5 Anlise comparativa do desempenho da AAPF-IgG e do ELISA na

identificao de casos de LV numa amostragem que inclui indivduos

portadores de leishmaniose cutnea, doena de Chagas, tuberculose,

hansenase e malria.......................................................................................... 76

5. DISCUSSO................................................................................................... 82

6. CONCLUSES................................................................................................ 99

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS................................................................ 103

8. PRODUTO ALCANADO (ARTIGO).............................................................. 115

1

1 INTRODUO

2

As leishmanioses so um conjunto de doenas causadas por um parasito

intracelular obrigatrio pertencente ao gnero Leishmania e naturalmente transmitido

por fmeas de insetos dpteros do gnero Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomia

no Novo Mundo, conhecidos genericamente por flebotomnios. As leishmanioses

acometem milhares de pessoas a cada ano no mundo, sendo endmicas em 88

pases, 72 deles em desenvolvimento e 13 considerados subdesenvolvidos (1).

As apresentaes clnicas mais comuns da doena so a leishmaniose

cutnea (LC), manifestando-se como lceras cutneas crnicas principalmente na

face ou em partes expostas do corpo; a leishmaniose mucocutnea (LM), com

parcial ou total destruio das membranas mucosas do nariz, boca e cavidades da

garganta e tecidos circundantes, causando leses desfigurantes e a leishmaniose

visceral (LV), a forma mais grave da doena (2), podendo progredir para a morte em

at 100% dos casos no tratados, dentro de dois anos, em pases em

desenvolvimento (1). Por se tratar do objeto de estudo do nosso trabalho, faremos

em seguida uma caracterizao mais detalhada da LV.

1.1Leishmaniose Visceral

A LV uma doena sistmica causada por parasito intracelular obrigatrio

pertencente famlia Trypanosomatidae, gnero Leishmania, subgnero Leishmania

do complexo donovani que compreende as espcies L.(L.) donovani e L.(L.)

infantum no Velho Mundo e L. (L.) chagasi nas Amricas (3). Caracteriza-se pelo

comprometimento do sistema retculo-endotelial (SER), onde os parasitos

permanecem, multiplicam-se e disseminam-se. Desse modo, as reaes patolgicas

3

conseqentes infeco so mais pronunciadas naqueles rgos cujo SER mais

proeminente, como o fgado, bao e medula ssea.

A LV conhecida tambm por outras terminologias como calazar, calazar

mediterrneo ou leishmaniose visceral mediterrnea e calazar americano ou

leishmaniose visceral americana (4).

Endmica em 65 paises, principalmente em regies tropicais e subtropicais da

sia, Oriente Mdio, frica, e Amricas, a LV apresenta incidncia de 500.000 casos

a cada ano e um total estimado de 200 milhes de pessoas sob risco de adquirirem

a infeco. Aproximadamente 90% dos casos ocorrem em 5 pases: ndia,

Bangladesh, Nepal, Sudo e Brasil, atingindo principalmente suas populaes

pobres (1).

A primeira evidncia de LV na Amrica do Sul surgiu com Carlos Chagas que,

percorrendo o vale do Amazonas e os seus afluentes em 1911 e 1912, observou a

existncia de esplenomegalia em crianas, concomitante ausncia de

hematozorios e antecedentes de malria (5). Em 1913, Migone descreve um caso

em Assuno (Paraguai) de paciente oriundo de Boa Esperana em Mato Grosso

(6). O primeiro relato de calazar no Brasil foi feito em 1934 por Penna, que, ao

rastrear a febre amarela examinou 47.000 lminas de cortes histolgicos de fgado

obtidas por viscerotomia post-mortem, encontrando formas amastigotas de

Leishmania em 41 delas (7). A infeco canina foi primeiramente documentada por

Evandro Chagas e colaboradores, entre 1936 e 1939, quando encontraram 4,1% de

ces infectados nas localidades de Moju e Abaetetuba, no estado do Par (8). Ainda

em 1936, Evandro Chagas descreveu o primeiro caso humano de calazar

diagnosticado em vida, no Brasil, em um jovem de 16 anos residente em Aracaju, SE

4

(9). Somente 20 anos depois que se registrou o primeiro surto da doena em

Sobral, no Cear (10).

Nas Amricas, a LV humana ocorre desde o sul do Mxico at o norte da

Argentina, sendo que 90% dos casos registrados ocorrem no Brasil onde se distribui

em 20 estados atingindo quatro das cinco regies brasileiras. A maior incidncia

encontra-se no Nordeste (56% dos casos), seguido pela regio Sudeste (19%),

regio Norte (18%) e Centro-Oeste (7%). Tem-se registrado cerca de 3.500 casos

por ano com o coeficiente de incidncia de 2,0 casos/100.000 habitantes. Nos

ltimos anos, a letalidade vem aumentando gradativamente, passando de 3,2% em

2000 para 7,7% em 2006 (11). Na regio sudeste, Minas Gerais o estado com

maior incidncia do agravo e predominncia de ocorrncia em quatro regies

geogrficas: norte, centro, noroeste e nordeste de Minas Gerais. Os primeiros casos

humanos no estado foram registrados na regio norte, a partir de 1940 (12), sendo o

primeiro caso autctone de paciente oriundo de Montes Claros cuja doena foi

diagnosticada em So Paulo (13).

Em meados dos anos 80, constatou-se uma transformao drstica na

distribuio geogrfica da LV. A doena, antes restrita s reas rurais do nordeste

brasileiro, avanou para outras regies indenes alcanando inclusive a periferia de

grandes centros urbanos. Importantes epidemias ocorreram em vrias cidades da

regio Nordeste (So Lus, Natal e Aracaju), Norte (Boa Vista e Santarm), Sudeste

(Belo Horizonte e Montes Claros) e Centro Oeste (Cuiab e Campo Grande) (14).

At ento, aproximadamente noventa por cento (90%) dos casos notificados de LV

ocorriam na Regio Nordeste. medida que a doena se expande para as outras

regies e atinge reas urbanas e periurbanas, esta situao se modifica e, no

5

perodo de 2000 a 2002, a Regio Nordeste j representava uma reduo para 77%

dos casos do Pas (15), e em 2005, uma reduo para 56% dos casos (16).

As transformaes no ambiente, provocadas pelo desmatamento e intenso

processo migratrio, a pauperizao conseqente de distores na distribuio de

renda, o processo de urbanizao crescente, o esvaziamento rural e as secas

peridicas so fatores responsveis pela expanso das reas endmicas e

aparecimento de novos focos (15). Dentro desse processo de transformao no

ambiente, credita-se grande relevncia participao do co como reservatrio

domstico da LV, dos marsupiais (Didelphis albiventris) como elo de ligao entre o

meio urbano e o rural, adaptao do hospedeiro invertebrado, Lutzomyia

longipalpis, ao ambiente peridomiciliar, alm do aumento dos casos de co-infeco

HIV-Leishmania (14). Com a expanso da rea de abrangncia da doena e o

aumento significativo no nmero de casos, a LV passou a ser considerada pela

Organizao Mundial da Sade uma das prioridades dentre as doenas tropicais,

pertencente categoria 1, que enquadra as doenas em expanso e para as quais

no h instrumentos efetivos de controle (17).

A doena mais freqente em crianas menores de 10 anos (54,4%), sendo

41% dos casos registrados em menores de cinco anos. O sexo masculino

proporcionalmente o mais afetado (60%). A razo da maior susceptibilidade das

crianas explicada pelo estado de relativa imaturidade imunolgica celular, alm

de uma maior exposio ao vetor no peridomiclio. Por outro lado, o envolvimento do

adulto tem repercusso significativa na epidemiologia da LV, pelas formas frustras

(oligossintomticas) ou assintomticas, alm das formas com expresso clnica (15).

A transmisso do parasito para o homem e outros hospedeiros mamferos, de

maior importncia epidemiolgica ocorre por via vetorial, quando as formas

6

infectantes do parasito (promastigotas metacclicas) so inoculadas no tecido

subcutneo dos hospedeiros. Nos hospedeiros vertebrados, durante o repasto

sangneo ou hematofagismo, as fmeas do flebtomo inoculam formas

promastigotas metacclicas do parasito, que esto amplamente distribudas no

aparelho bucal do inseto vetor. Juntamente com as formas promastigotas

metacclicas, ocorre inoculao de saliva contendo peptdeos inflamatrios potentes,

responsveis por uma reao inflamatria imediata e atrao de clulas fagocticas

residentes para o local de entrada do parasito (18). Neste momento, os parasitos

Fonte: www.unilavras.edu.br/~palmieri/Leishmaniose.pdf

1.Promastigotas metacclicos noaparelho bucal do inseto vetor soinoculados no tecido subcutneodos hospedeiros

Fagocitose dosparasitos pormacrfagosresidentes etransformao emamastigotas.

vertebrados

1. Promastigotas metacclicos noaparelho bucal do inseto vetor

inoculados no tecido subcutneodos mamferos

2. Fagocitose dosparasitos por macrfagos

residentes etransformao em

amastigotas.

vertebrados3. Multiplicao das

amastigotas nos macrfagos

4. Ingesto demacrfagos parasitados

pelo flebotomneodurante repasto

sanguneo

5. Amastigotaslivres no intestinodo flebtomo queiro se diferenciarem promastigotas

Figura 1- Esquema de Transmisso da Leishmaniose Visceral.

so fagocitados, principalmente por macrfagos, onde perdem o flagelo,

transformando-se em formas amastigotas (arredondadas ou ovides), que residem

no interior dos fagolisossomos, onde sobrevivem e se multiplicam. Eventualmente,

www.unilavras.edu.br/~palmieri/Leishmaniose.pdf

7

macrfagos infectados se rompem e liberam as amastigotas, que so ento

fagocitadas por macrfagos vizinhos. Durante um novo repasto sangneo, o inseto

vetor ingere macrfagos infectados com amastigotas de Leishmania, e, no intestino

estas se transformam em paramastigotas, se multiplicam e posteriormente iniciam

um processo de transformao em promastigotas metacclicas, aps a produo do

LPG (Lipofosfoglicano) na membrana, processo denominado metaciclognese.

Essas formas promastigotas metacclicas migram em direo ao aparelho bucal do

inseto, local onde os parasitos se instalam. Quando o inseto exerce novo

hematofagismo, formas infectantes so novamente transferidas, reiniciando assim o

ciclo no hospedeiro vertebrado (19).

1.2Aspectos clnicos

A LV pode ocorrer em diferentes formas clnicas, determinadas por aspectos

relativos multiplicao dos parasitos nas clulas do sistema fagoctico

mononuclear, resposta imune do indivduo e s alteraes degenerativas

resultantes desse processo.

As formas assintomtica e subclnica foram apontadas inicialmente por

Leishman em 1906 (20). No Brasil, a caracterizao da LV em formas clnicas foi

identificada por Badar e colaboradores (21), em 1986, em um estudo clnico e

epidemiolgico com crianas sorologicamente positivas, residentes em Jacobina

(BA). Na ocasio, as formas receberam a seguinte categorizao:

(1) Assintomtica

No apresenta manifestaes clnicas (sinais e sintomas) na anamnese e no

exame fsico, e o teste de hipersensibilidade tardia (teste de Montenegro) positivo

8

na maioria dos casos. Nas anlises de parmetros laboratoriais, observa-se

hemograma normal, provas de funo heptica (dosagem das enzimas alanina

aminotransferase -ALT e aspartato aminotransferase -AST) normais e eletroforese

de protenas do soro dentro dos padres de normalidade. Entretanto, detecta-se

atravs da tcnica de PCR, a presena de DNA de parasito em amostras de sangue

de indivduos assintomticos. Em geral, a forma clnica mais freqente em

indivduos provenientes de reas endmicas, onde h evidncia epidemiolgica e

imunolgica da infeco. A ttulo de esclarecimento, pacientes assintomticos no

so notificados e no devem ser tratados (15). Entretanto, mais recentemente, a

possibilidade desses indivduos atuarem como reservatrios do parasito vem sendo

sugerida por vrios pesquisadores, em estudos realizados em pases onde a doena

causada pela Leishmania donovani (22, 23, 24, 25).

(2) Subclnica ou Oligossintomtica com progresso para cura

A sintomatologia clnica discreta com febre baixa, palidez cutneo-mucosa

leve, diarria e/ou tosse no produtiva e pequena hepatoesplenomegalia. Pode

ocorrer positividade do teste de Montenegro em muitos casos. Nas anlises de

parmetros laboratoriais, observa-se hemograma normal, provas de funo heptica

pouco alteradas e eletroforese de protenas normal. Quadro de curta durao

(aproximadamente 15 dias) encontrado em rea endmica numa pequena proporo

de indivduos, geralmente crianas.

(3) Subclnica ou Oligossintomtica com progresso para a forma Clssica

Quadro clnico caracterizado por febre, tosse seca, diarria e mal estar. Tpica

visceromegalia do bao e do fgado. Teste de Montenegro negativo e freqente

deteco do parasito em aspirados de medula ssea. Nas anlises de parmetros

laboratoriais, observa-se discreta leucopenia. ALT permanece normal e os valores

9

de AST encontram-se um pouco elevados. A eletroforese de protenas apresenta

discreta inverso na relao albumina/gama-globulinas.

(4) Clssica

Em rea endmica, a forma clssica da LV ocorre em pequeno percentual dos

indivduos infectados, geralmente inferior a 20% e varivel de acordo com a regio.

No Brasil, a relao entre casos clnicos de LV e infeco assintomtica foi apontada

como sendo de 1:8 (26, 27) e 1:18 (27, 28). Trata-se de doena de instalao

insidiosa e evoluo prolongada, caracterizada por febre baixa recorrente, com dois

ou trs picos dirios, que persiste durante todo o curso da doena. O abdmem

aparece muito protuso em decorrncia da hepatoesplenomegalia. A pele mostra-se

de colorao pardacenta. Ocorre desnutrio protico-calrica e os cabelos ficam

quebradios. H emagrecimento progressivo levando o indivduo caquexia. O teste

de Montenegro encontra-se negativo. Nas anlises de parmetros laboratoriais,

observa-se completa inverso na relao albumina/gama-globulinas, pancitoponenia

e provas de funo heptica bastante alteradas.

A classificao descrita apresenta um valor histrico. Atualmente, grande

parte dos casos apresentam-se na forma aguda, com rpida evoluo (16).

Dentre os fatores relacionados ao hospedeiro que contribuem para o tipo de

evoluo do quadro patolgico, destacam-se o estado nutricional e a idade.

Indivduos desnutridos e com idade inferior a cinco anos so os mais acometidos

pela LV clssica (21, 22, 29). Alm disso, infeces secundrias podem contribuir

para o agravamento do quadro patolgico. Idade, desnutrio, anemia, leucopenia,

possveis alteraes na funo de neutrfilos (reduo de quimiotaxia e capacidade

bactericida) ou na produo de anticorpos contra novos antgenos, so alguns dos

10

fatores associados elevada incidncia de infeces bacterianas e virais (29, 30,

31).

1.3 Diagnstico da LV

1.3.1 Diagnstico Clnico

A apresentao clnica habitual da leishmaniose visceral caracteriza-se por

febre prolongada, perda de peso, hepato-esplenomegalia e pancitopenia. No

entanto, outros sinais e sintomas que tambm podem estar presentes, como tosse,

diarria, ictercia e sangramentos, so comuns a outras patologias presentes nas

reas onde incide a LV e tornam o diagnstico clnico complexo. Portanto, o

diagnstico seguro da LV segue caractersticas clnico-epidemiolgicas em

associao com dados laboratoriais, que ajudam na concluso diagnstica pela

excluso da possibilidade de outras patologias com sintomas semelhantes (14, 32).

Os pacientes podem se apresentar ao servio mdico em diferentes fases de

evoluo da doena, mas o diagnstico clnico da leishmaniose visceral deve ser

suspeitado sempre que o paciente apresentar febre concomitante com uma

esplenomegalia aparente associada ou no hepatomegalia (15).

Em pacientes sem diagnstico e tratamento, a doena evolui

progressivamente para o perodo final, com febre contnua e comprometimento mais

intenso do estado geral. Instala-se a desnutrio (cabelos quebradios, clios

alongados e pele seca) e edema dos membros inferiores. Outras manifestaes

importantes incluem hemorragias (epistaxe, gengivorragia e petquias), ictercia e

ascite. Nestes pacientes, o bito geralmente determinado por infeces

bacterianas e/ou sangramentos (15).

11

1.3.2 Diagnstico Laboratorial

O diagnstico precoce da LV representa importante passo, tendo em vista o

agravamento com a demora em instituir a teraputica, a toxicidade das drogas

utilizadas para tratamento e a alta letalidade causada pela doena nos casos no

tratados.

As dificuldades relativas do diagnstico clnico-epidemiolgico ocorrem pelo

fato dos sinais e sintomas clnicos precoces como febre, anemia, diarria, tosse,

perda de peso, entre outros, estarem tambm presentes em outras patologias

infeccto-parasitrias. Nesse aspecto, ressalta-se a importncia do diagnstico

laboratorial diferencial.

O diagnstico laboratorial baseia-se, principalmente em trs tipos de

abordagem: mtodos parasitolgicos, moleculares e imunolgicos (32).

Nos mtodos parasitolgicos procura-se evidenciar o parasito colhendo-se

material atravs de bipsia ou puno aspirativa da medula ssea, bao, fgado ou

linfonodos. O material colhido utilizado para obteno de esfregaos em lmina

para pesquisa direta do parasito (formas amastigotas) e para cultura onde num

perodo de at 21 dias observa-se a multiplicao ou no das formas promastigotas.

O aspirado esplnico o mtodo de maior sensibilidade (cerca de 95%), seguido do

aspirado de medula ssea, biopsia heptica e aspirado de linfonodos. Apesar da

maior sensibilidade da puno esplnica, esta apresenta grandes riscos de

complicaes, como a hemorragia, devendo ser realizada somente por profissional

treinado e em hospitais com retaguarda cirrgica e banco de sangue (32, 33). Na

prtica, recomenda-se o aspirado de medula ssea, por ser este um local de coleta

com menor possibilidade de complicaes. Esfregaos corados desse material para

12

visualizao microscpica das formas amastigotas apresentam baixa e varivel

sensibilidade (52 a 89%) em funo da distribuio no homognea dos parasitos

nos tecidos (34).

O cultivo dos parasitos aumenta a sensibilidade da pesquisa em esfregaos

corados (acima de 80%), mas pode retardar o diagnstico em semanas. realizado

por inoculao do material das punes aspirativas em meios especiais de cultura,

podendo-se utilizar uma interface lquida sobre o NNN (Novy-MacNeal-Nicolle),

como o meio LIT (Liver Infusion Tryptose) ou Schneider. Amostras clnicas obtidas

da puno aspirativa de medula ssea ou bao dos pacientes podem ainda ser

inoculadas em hamsters (Mesocricetus auratus). Porm, devido ao longo tempo de

positivao, em torno de um a trs meses, essa tcnica no tem valor prtico no

diagnstico da doena (35).

A especificidade dos mtodos parasitolgicos de 100%, sendo a pesquisa

do parasito em esfregaos de medula ssea considerada mtodo referncia para a

confirmao da presena da leishmaniose visceral. Sabe-se, no entanto, que um

mtodo padro-ouro para diagnstico aquele que melhor determina a presena

ou a ausncia da doena sob avaliao (36) e inconvenientes como a baixa

sensibilidade dos mtodos parasitolgicos no garantem a negatividade dos

resultados. Alm disso, outra desvantagem desses mtodos consiste no fato de

serem invasivos (32, 33).

O diagnstico molecular possibilita a deteco do DNA do parasito mediante

reao de polimerizao em cadeia [polymerase chain reaction (PCR)], com

sensibilidade superior a 90%. Para tal avaliao, pode-se fazer uso de diversas

amostras biolgicas, tais como sangue e aspirado de medula. Entretanto, os seus

resultados dependem de algumas variveis envolvidas, como a rea endmica, o

13

tipo de amostra, o alvo do DNA utilizado para amplificao e o mtodo de extrao

do DNA, sendo uma metodologia complexa e de custo elevado (19). Devido ao fato

da PCR detectar o DNA, uma molcula estvel e que no indica necessariamente a

presena de parasitos vivos na amostra, questiona-se a sua importncia como

mtodo diagnstico, levando-se em conta a positividade observada em pacientes

assintomticos e pacientes aparentemente curados aps tratamento especfico (32).

No entanto, em pacientes com co-infeco Leishmania-HIV, a deteco de DNA em

sangue perifrico constitui mtodo no-invasivo para o diagnstico da LV, com

sensibilidade de 94% e especificidade de 100%, devendo ser considerado como

mtodo de primeira linha, em servios cuja infra-estrutura permita a execuo da

tcnica (19).

O diagnstico imunolgico (ou sorolgico) da LV favorecido pelas altas

taxas de anticorpos encontradas no curso da infeco por L. chagasi devido a uma

marcada estimulao policlonal de linfcitos B. A elevada produo de anticorpos

anti-Leishmania, principalmente da classe IgG, em indivduos com suspeita clnica,

representa um importante dado laboratorial para identificar casos de LV em

indivduos com infeco ativa (17).

Vrias tcnicas sorolgicas, de mesmo fundamento, so utilizadas na

deteco de anticorpos, entretanto apresentando diferenas no que diz respeito ao

desempenho metodolgico, em parmetros como sensibilidade e especificidade. A

sensibilidade de um teste sorolgico refere-se porcentagem de resultados positivos

pelo teste na populao de doentes, ou seja, a proporo de resultados

verdadeiramente positivos. J a especificidade definida pela porcentagem de

resultados negativos pelo teste nos indivduos no-doentes, ou seja, a proporo

dos verdadeiros negativos (37).

14

A variao na sensibilidade das tcnicas est em funo, principalmente, do

tipo de procedimento sorolgico empregado. J as diferenas na especificidade so

determinadas pelo tipo de antgeno utilizado (antgenos brutos ou solveis,

antgenos purificados ou antgenos recombinantes), pois os anticorpos formados no

curso da infeco podero mostrar reaes cruzadas com antgenos semelhantes

encontrados em outras condies infecciosas como a doena de Chagas, malria,

tuberculose, leishmaniose tegumentar, hansenase e outras (32).

Outra limitao dos testes sorolgicos a possibilidade de permanecerem

positivos durante longo tempo aps o tratamento (17). Ainda assim, os mtodos

sorolgicos, devido sua praticidade e por serem menos invasivos, devem preceder

sempre que possvel, os mtodos parasitolgicos, podendo at em algumas

situaes, substitu-los (38, 39).

A tcnica primeiramente indicada para diagnstico sorolgico foi a de

Wadsworth e Maltaner, em 1958, baseada numa reao de fixao do complemento

(6). Atualmente os mtodos imunolgicos ou sorolgicos incluem o Teste de

Aglutinao Direta (DAT), a Reao de Imunofluorescncia Indireta- RIFI, o teste

imunoenzimtico ELISA e mais recentemente o Teste Rpido utilizando o antgeno

recombinante K39 (40, 41, 42, 43, 44).

O teste DAT (Teste de Aglutinao Direta), muito utilizado em reas

endmicas da ndia (42, 45), utiliza formas promastigotas de Leishmania como

antgeno e apresenta sensibilidade de 91 a 100% e especificidade de 72 a 100%

(32). Seu resultado inferido atravs de interpretao visual, no necessitando de

equipamentos especiais para tal. Utilizado principalmente para aplicao no campo

em reas endmicas, apresenta, no entanto, alguns fatores limitantes como o longo

perodo de incubao antes da leitura (18 horas), a necessidade de vrias diluies

15

da amostra (46), a fragilidade do antgeno aquoso, a falta de padronizao na leitura

e de reprodutibilidade entre centros (32).

Com relao ao Teste Rpido, trata-se de um mtodo simples, baseado na

reao do soro ou sangue do paciente com o antgeno purificado recombinante

(protena rK39) fixado em papel. Diferenas na resposta imunolgica em diferentes

grupos tnicos e entre sub-espcies do complexo donovani podem explicar a

variabilidade geogrfica na sensibilidade e especificidade da tcnica, sendo

descritas como 67 a 100% e 59 a 100%, respectivamente. No Brasil, Carvalho e

colaboradores, em 2003 (40), obtiveram sensibilidade de 90% e especificidade de

100%. Por sua facilidade de execuo e rpida leitura, parece ser promissor para

uso em programas de sade pblica, podendo ser aplicado em condies de campo

(17).

No Brasil, as tcnicas mais usadas so a RIFI (Reao de Imunofluorescncia

Indireta) e o ELISA (Imunoensaio Enzimtico). A reao de imunofluorescncia

indireta tem sido amplamente usada no diagnstico da LV desde 1964. Os

resultados normalmente so expressos em diluies, sendo reagentes os ttulos

iguais ou superiores a 1:80. A RIFI, com sensibilidade de 82 a 95% e especificidade

de 78 a 92%, mais utilizada por estar disponvel gratuitamente na maioria das

regies endmicas, atravs do Programa de Leishmanioses do Ministrio da Sade

(34). No entanto, as dificuldades quanto padronizao da leitura por diferentes

analistas, devido a certa subjetividade da visualizao de fluorescncia, so

algumas das limitaes importantes. Uma rigorosa padronizao dessa metodologia

deve ser mantida para a obteno de resultados confiveis, j que a qualidade da

microscopia de fluorescncia e dos antgenos, a diluio correta do conjugado e o

16

critrio de leitura das lminas apresentam valiosa contribuio para o desempenho

da RIFI (37).

O teste imunoenzimtico ELISA tem sido uma importante ferramenta utilizada

no diagnstico imunolgico de vrias doenas infecciosas. No diagnstico de LV tem

sido avaliado desde 1971. mais usado na rede privada de atendimento, com

resultado expresso em unidades de absorbncia em uma reao que pode utilizar

resultado quantitativo (por diluies da amostra) ou apenas qualitativo (reagente ou

no) (35). Embora os valores de sensibilidade apresentem reprodutibilidade,

variando entre 90 e 100%, os valores de especificidade so bastante inconsistentes,

variando de 71 a 100%, dependendo do tipo de antgeno utilizado (34). O ELISA

tradicional emprega antgenos solveis, que apresentam facilidade de preparao

em larga escala e grande estabilidade antignica, com o inconveniente de baixa

especificidade causada pela reatividade cruzada e persistncia de anticorpos aps a

cura (32, 34). Para tentar contornar esse problema, outros antgenos com diferentes

massas moleculares tm sido testados, como o complexo antignico fucose-manose

ligante (100% de sensibilidade e 96% de especificidade), o antgeno recombinante

rK39, uma seqncia de 39 aminocidos clonada da regio quinase de Leishmania

chagasi, complexo donovani-especfico (98% de sensibilidade e 100% de

especificidade), entre outros (17). O elevado custo dessas preparaes antignicas

tem restringido seu uso na rotina laboratorial.

Diante desse quadro de desafios scio-econmicos associados s

dificuldades metodolgicas, o estabelecimento de novas abordagens para o estudo

sorolgico da LV revela-se como um campo valioso na pesquisa clnico-laboratorial,

principalmente no Brasil, onde se observa o aumento da incidncia da infeco e

mudana no seu perfil, passando a atingir uma maior extenso geogrfica do pas.

17

A introduo da citometria de fluxo por Martins-Filho e colaboradores (1995)

(47) como um mtodo sensvel para a deteco de anticorpos, trouxe uma nova

perspectiva para os estudos de diversas doenas parasitrias como a leishmaniose

cutnea (48), babesiose (49), erliquiose canina (50), doena de Chagas (51) e

tambm doenas causadas por vrus (52, 53).

A citometria de fluxo uma tcnica de anlise automatizada atravs da qual

uma nica partcula pode ser caracterizada fsica e bioquimicamente, em meio

lquido. A caracterizao inclui o tamanho, granulosidade (ou complexidade interna)

e a intensidade de fluorescncia. Todos esses parmetros podem ser detectados

simultaneamente, medidos, armazenados e analisados em programas de

computador. Esse mtodo apresenta uma grande versatilidade, uma vez que permite

o desenvolvimento de estudos que empregam tanto formas promastigotas vivas

quanto formas fixadas, ou mesmo, antgenos adsorvidos em partculas slidas (54).

Uma linha de pesquisa que vem sendo desenvolvida desde 1995 pelo

Laboratrio de Biomarcadores de Diagnstico e Monitorao do Centro de

Pesquisas Ren Rachou/FIOCRUZ, liderada pelo pesquisador Dr. Olindo Assis

Martins-Filho, tem trabalhado na elaborao de questes no campo da propedutica

sorolgica laboratorial, especialmente utilizando a citometria de fluxo como

ferramenta metodolgica. Inicialmente, nos trabalhos com doena de Chagas, em

1995, Martins-Filho e colaboradores desenvolveram uma metodologia baseada na

citometria de fluxo capaz de detectar anticorpos anti-formas tripomastigotas vivas de

Trypanosoma cruzi, denominada Flow Cytometry Anti-Live Trypomastigotes

Antibodies-G (FC-ALTA-IgG) (47). Apesar do bom desempenho dessa metodologia

no diagnstico e monitorao de cura ps-teraputica, problemas com a obteno

das formas tripomastigotas, como o carter lbil das preparaes antignicas e o

18

risco inerente da manipulao de formas infectantes do parasito, consistiam

importantes limitaes da tcnica.

Como um desafio tecnolgico, o grupo de pesquisa investiu na adaptao da

metodologia para a pesquisa de anticorpos anti-formas epimastigotas de T. cruzi

pr-fixadas em paraformaldedo, que ficou conhecida como Flow Cytometry Anti-

Fixed Epimastigotes Antibodies-G (FC-AFEA-IgG) (55). Na mesma linha, mtodos

sorolgicos alternativos tm sido desenvolvidos para contribuir com o avano do

diagnstico das leishmanioses. Em 2002 e 2006, trabalhos para diagnstico de

leishmaniose cutnea utilizaram a tcnica de citometria de fluxo com formas

promastigotas vivas de Leishmania brasiliensis (56, 57), sendo denominada FC-

ALPA-IgG (Flow Cytometry Anti-Live Promastigotes Antibodies-G). Posteriormente,

formas promastigotas fixadas de L. chagasi foram utilizadas para as investigaes

sorolgicas de monitorao de cura da leishmaniose visceral (58, 59) e para

diagnstico da leishmaniose cutnea (60) com a denominao de FC-AFPA-IgG

(Flow Cytometry Anti-Fixed Promastigotes Antibodies-G), ou AAPF-IgG (Anticorpos

IgG Anti-Promastigotas Fixadas).

1.4 Tratamento

Os antimoniais pentavalentes (Sb+5) foram introduzidos na dcada de 40 e,

desde ento tm sido considerados como drogas de primeira escolha no tratamento

da LV. Seu mecanismo de ao ainda no est totalmente elucidado, mas sabe-se

que atuam nas formas amastigotas, inibindo sua atividade glicoltica e a via oxidativa

de cidos graxos. Desde a dcada de 70 vrios casos de resistncia primria do

19

parasito a essas drogas tm sido relatados e doses progressivamente maiores

destes medicamentos vem sendo preconizadas pela Organizao Mundial da Sade

(OMS) e pelo Centro de Controle de Doenas (CDC) dos Estados Unidos da

Amrica (15).

No Brasil, a recomendao para pacientes com LV sem sinais de alerta ou de

gravidade o tratamento ambulatorial com antimoniato de N-metil glucamina na

dose de 20mg de Sb+5 kg/dia, com aplicao endovenosa ou intramuscular, por 20

dias consecutivos, utilizando-se o limite mximo de 2 a 3 ampolas/dia do produto

com ndices de cura de 90 a 95% (15).

Entretanto, a relevante toxicidade e os diversos efeitos colaterais no

tratamento com os antimoniais pentavalentes ainda representam aspectos

preocupantes. O principal efeito colateral decorrente de sua ao sobre o aparelho

cardiovascular. Outros efeitos colaterais incluem artralgias, adinamia, anorexia, dor

no local da aplicao (IM) e aumento da diurese por perda transitria da capacidade

de concentrao urinria (15).

A Anfotericina B apresenta-se como droga alternativa para o tratamento da

LV, na dose de 1mg/kg/dia por infuso venosa durante 14 a 20 dias. a droga

leishmanicida mais potente disponvel comercialmente, atuando nas formas

promastigotas e amastigotas, tanto in vitro quanto in vivo e constituem o principal

avano no tratamento anti-Leishmania nas ltimas duas dcadas (61). A experincia

clnica acumulada com seu uso no tratamento da LV vem aumentando ao longo dos

ltimos anos. indicada como droga de primeira escolha em gestantes e em

pacientes com sinais de gravidade idade inferior a 6 meses ou superior a 65 anos,

desnutrio grave, co-morbidades, incluindo infeces bacterianas ou uma das

seguintes manifestaes clnicas: ictercia, fenmenos hemorrgicos (exceto

20

epistaxe), edema generalizado, sinais de toxemia (letargia, m perfuso, cianose,

taquicardia ou bradicardia, hipoventilao ou hiperventilao e instabilidade

hemodinmica) (62). Tambm apresenta efeitos colaterais graves, principalmente

insuficincia renal, que podem ser diminudos com doses menores do medicamento

sem prejuzo de sua eficcia teraputica (63).

Atualmente, duas apresentaes de anfotericina B so disponibilizadas pelo

Ministrio da Sade: o desoxicolato de anfotericina B e a anfotericina B lipossomal,

com eficcias comparveis, sendo que esta ltima apresenta menor toxicidade. A

anfotericina B lipossomal apresenta custo elevado, o que pode dificultar o seu uso

em sade pblica. Por isso, recomenda - se que sua utilizao seja restrita aos

pacientes que tenham apresentado falha teraputica ou toxicidade ao desoxicolato

de anfotericina B, transplantados renais ou pacientes com insuficincia renal (62).

A busca por esquemas teraputicos com menor toxicidade tem guiado

trabalhos, com resultados promissores, como o de Carvalho, 2005 (64), que utilizou

a associao de antimoniais pentavalentes com desoxicolato de anfotericina B no

tratamento de crianas e adolescentes, atingindo ndices de cura de 98,4% com 7

dias de tratamento.

Os critrios de cura so essencialmente clnicos. O retorno do apetite, a

melhora do estado geral e o ganho ponderal so evidentes desde o incio do

tratamento. O desaparecimento da febre acontece por volta do segundo ao quinto

dia de medicao especfica e a reduo do volume do bao e do fgado pode ser

verificada nas primeiras semanas. Os parmetros hematolgicos melhoram a partir

da segunda semana e a normalizao das protenas sricas se d de forma lenta e

pode levar meses. Nessa situao, o controle parasitolgico ao trmino do

tratamento dispensvel, sendo a presena de eosinfilos no sangue perifrico um

21

ndice de bom prognstico. O paciente tratado deve ser acompanhado durante 12

meses e ao final desse perodo, se permanecer estvel, ser considerado

clinicamente curado (62).

1.5 Justificativa

O diagnstico laboratorial da LV ainda apresenta lacunas importantes, uma

vez que at o momento no existe um mtodo laboratorial que possa ser usado

como padro-ouro ideal. Para um diagnstico definitivo seguro, nos casos da

pesquisa direta do parasito se mostrar negativa, necessria a associao de vrios

elementos relacionados aos aspectos clnicos, epidemiolgicos, laboratoriais e, at

mesmo, terapia de prova para a doena.

O desenvolvimento de novos mtodos diagnsticos mais eficientes para

leishmaniose visceral de fundamental importncia, uma vez que a definio do

diagnstico um dos elementos necessrios para a instalao de procedimentos

teraputicos especficos, considerando a alta letalidade dos casos no tratados, a

toxicidade e o alto custo dos medicamentos anti-L. chagasi.

As dificuldades relativas ao diagnstico clnico epidemiolgico pelo fato dos

sinais e sintomas clnicos sugestivos como febre, anemia, diarria, tosse, perda de

peso, entre outros, estarem tambm presentes em outras patologias infecciosas que,

muitas vezes, coexistem com a LV, juntamente com os efeitos potencialmente

txicos da terapia, corroboram a necessidade e importncia do diagnstico

laboratorial.

22

Atualmente o diagnstico confirmatrio ainda o parasitolgico, pela

deteco do parasito em material colhido do paciente. Entretanto, a baixa

sensibilidade no permite que casos negativos sejam descartados da possibilidade

de leishmaniose ativa. Alm disso, as tcnicas de coleta so procedimentos

invasivos e que demandam tempo e dificuldades operacionais. Assim, a

comprovao indireta da infeco atravs da pesquisa de anticorpos uma opo

necessria e vlida em muitos casos. Os clnicos e epidemiologistas solicitam

exames complementares para confirmar o diagnstico e esperam que os resultados

sejam confiveis, sendo a sensibilidade e especificidade dos testes caractersticas

essenciais para isto. No entanto, com relao s tcnicas imunolgicas de

diagnstico de LV, muitos estudos e avanos tm ocorrido nos ltimos anos, mas

apesar do grande nmero de testes diagnsticos disponveis, nenhum deles

apresenta 100% de sensibilidade e de especificidade.

Uma linha de pesquisa que vem sendo desenvolvida desde 1995 pelo

Laboratrio de Biomarcadores de Diagnstico e Monitorao do Centro de

Pesquisas Ren Rachou/FIOCRUZ tem trabalhado na elaborao de questes no

campo da propedutica sorolgica laboratorial, especialmente utilizando a citometria

de fluxo como ferramenta metodolgica. Resultados promissores, com elevados

ndices de sensibilidade e especificidade, j foram obtidos no diagnstico e

monitorao de cura da leishmaniose tegumentar (56, 57), na monitorao de cura

da LV (53) e no diagnstico da doena de Chagas (47, 55, 65).

Nesse contexto, nos propusemos avaliar o desempenho da pesquisa de

anticorpos anti-promastigotas fixados de L. chagasi por citometria de fluxo no

diagnstico sorolgico da LV e na avaliao de cura ps-teraputica especfica. A

possibilidade de avaliar ndices de desempenho da AAPF-IgG, como a sensibilidade,

23

a especificidade, a razo de verossimilhana, os valores preditivos positivo e

negativo e a acurcia, permitem uma interpretao mais segura do teste de acordo

com as particularidades dos casos que se apresentam individualmente para o

clnico.

24

2. OBJETIVOS

25

2.1 Objetivo Geral

Com o intuito de contribuir para o diagnstico sorolgico da infeco por L.

chagasi, excluindo-se casos de sorologia residual ps-teraputica especfica, este

trabalho tem como objetivo geral:

Avaliar o desempenho da pesquisa de anticorpos IgG anti-formas promastigotas

fixadas de L. chagasi (AAPF-IgG) por citometria de fluxo no diagnstico sorolgico

da Leishmaniose Visceral (LV) Humana.

2.2 Objetivos Especficos

I - Estabelecer os critrios de interpretao da AAPF-IgG aplicada isoladamente no

diagnstico e na excluso de sorologia residual ps-teraputica da LV;

II - Unificar os critrios de interpretao da AAPF-IgG aplicada simultaneamente no

diagnstico e na excluso de sorologia residual ps- teraputica da LV;

III - Avaliar a aplicabilidade da AAPF-IgG na segregao sorolgica de pacientes

com LV e de pacientes portadores de outras doenas infecto-parasitrias de

interesse mdico (leishmaniose cutnea, doena de Chagas, hansenase,

tuberculose e malria);

IV - Verificar a reprodutibilidade da tcnica de AAPF-IgG;

26

V- Analisar comparativamente o desempenho da AAPF-IgG com o ELISA na

identificao de casos de LV numa amostragem que inclui indivduos portadores de

leishmaniose cutnea, doena de Chagas, tuberculose, hansenase e malria.

27

3. METODOLOGIA

28

3.1 Populao e Local da Pesquisa

Para a realizao deste estudo, foram selecionadas um total de 115 amostras

de soro. Para a avaliao do desempenho da tcnica AAPF-IgG no diagnstico,

foram utilizadas 35 amostras de soro de pacientes infectados por L. chagasi (grupo

LV) e 10 amostras de soro de indivduos saudveis, no-infectados (grupo NI), como

controle negativo das reaes.

Para a avaliao da AAPF-IgG na excluso de sorologia residual ps-

teraputica especfica, foram analisadas 20 amostras de soro de pacientes tratados

e curados (grupo CUR).

Adicionalmente, foram testadas 50 amostras de soro de indivduos sem LV,

mas portadores de outras doenas infecto-parasitrias de interesse mdico:

leishmaniose cutnea (grupo LC, n=10), doena de Chagas (grupo CH, n=10),

malria (grupo MAL, n=10), tuberculose (grupo TB, n=10) e hansenase (grupo HAN,

n=10).

As amostras de pacientes com leishmaniose visceral (LV, n=35) e de

indivduos tratados e curados (CUR, n=20) foram cedidas pelo professor doutor

Slvio Fernando Guimares de Carvalho, do Hospital Universitrio Clemente de

Farias, em Montes Claros, MG. Para cada paciente do grupo LV foi obtida a histria

clnica e realizado exame fsico completo e os mesmos foram submetidos puno

aspirativa da medula ssea, na rotina do atendimento. O critrio de incluso nesse

grupo foi a presena de histria clnica aliada ao exame parasitolgico positivo, ou

seja, presena do parasito nos esfregaos de medula ssea ou cultura positiva.

29

Todos os indivduos do grupo CUR (n=20) foram acompanhados por 12 meses aps

o tratamento e foram considerados clinicamente curados aps esse perodo.

As amostras de doena de Chagas, tuberculose e hansenase faziam parte da

soroteca do Laboratrio de Leishmanioses do Ncleo de Doenas Infecciosas da

Universidade Federal do Esprito Santo (UFES) e foram cedidas pela Dra. Elenice

Lemos. Da mesma forma as amostras de indivduos saudveis, grupo NI, foram

provenientes do Esprito Santo, UFES, rea no endmica para leishmaniose, para

garantir a negatividade do grupo controle. As amostras de leishmaniose cutnea e

malria foram cedidas pelo Laboratrio de Biomarcadores de Diagnstico e

Monitorao, do Centro de Pesquisas Ren Rachou, CPqRR, FIOCRUZ, Belo

Horizonte, MG.

A tabela 1 mostra alguns dados relacionados aos pacientes do grupo LV.

Tabela 1- Distribuio do grupo de pacientes com LV, segundo idade, durao dos sintomase sexo.

Idade (1)

(variao)

Durao dos

sintomas (1)

(variao)

SexoTotal

Masc Fem

38,6 meses

(5 meses- 12 anos)

24 dias

(6 - 60)20 15 35

Obs: (1) Valores correspondentes s mdias

As amostras foram processadas no Laboratrio de Biomarcadores de Diagnstico e

Monitorao do Centro de Pesquisas Ren Rachou, FIOCRUZ, Belo Horizonte, MG.

Vale ressaltar que os dados experimentais que deram suporte para a realizao

30

desse estudo foram gerados em trabalhos anteriores. O trabalho aqui apresentado

compreendeu, portanto, as anlises estatsticas, interpretaes, discusso e

concluses, alm da escrita da dissertao e artigo.

3.2. Aspectos ticos

Consentimento prvio foi obtido de todos os indivduos, pais ou responsveis,

antes da incluso dos mesmos nesse trabalho. Este projeto foi aprovado pelo

Comit de tica da Universidade Estadual de Montes Claros.

3.3. Preservao e processamento das amostras de soros

As amostras de soros foram inativadas a 56C por 30 minutos e centrifugadas

a 1.000g a 4C por 5 minutos para remoo de partculas. Aps a centrifugao, o

sobrenadante foi aliquotado e estocado a 20C at sua utilizao. No momento do

uso, as amostras foram descongeladas e diludas em tampo apropriado para cada

metodologia empregada. Para a citometria de fluxo, as amostras foram diludas em

tampo fosfato-PBS (0,15M, 8,0g/l de NaCl, 0,2g/l de KCl, 0,24g/l de KH2PO4 e

1,15g/l de Na2PO4, pH 7,2, Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO) suplementado

com 3% de soro fetal bovino - SFB . As amostras diludas foram centrifugadas a 4C,

1.000g por 5 minutos e os sobrenadantes utilizados para o ensaio de citometria de

fluxo. Para os ensaios de ELISA, as amostras de soro foram diludas em PBS

contendo 0.05% de Tween 20 (PBS-T) e 1% de leite Molico desnatado.

31

3.4 Preparo das formas promastigotas de L. chagasi para os ensaios de

imunofluorescncia por citometria de fluxo

As formas promastigotas de L. chagasi (MHOM/BR/74/PP75) foram cultivadas

em meio gar-sangue, Novy-MacNeal-Nicolle-NNN associado ao meio lquido Liver

Infusion Tryptose-LIT. As culturas foram mantidas em estufa B.O.D temperatura 25

1C e reinoculadas a cada quatro dias pela transferncia de 1x106

promastigotas/mL para novo frasco de cultura contendo NNN-LIT. Aps a terceira

passagem, parasitos de quatro dias de cultivo foram transferidos para meio LIT,

numa concentrao inicial de 1x 106 promastigotas/mL. Parasitos com no mximo

dez passagens in vitro foram empregados nos ensaios de pesquisa de anticorpos

anti-L. chagasi por citometria de fluxo, para permitir a obteno das formas

promastigotas com um perfil de tamanho e granulosidade bem homogneo, alm de

garantir a composio antignica dos parasitos, considerando as possveis

alteraes inerentes ao processo de cultivo prolongado in vitro.

As formas promastigotas cultivadas em meio LIT foram transferidas para

tubos de polipropileno de 50mL (Falcon, Becton Dickinson, San Diego) e

homogeneizadas em vrtex a baixa rotao para desfazer possveis agregados

celulares. Em seguida, a suspenso foi submetida a uma centrifugao diferencial a

300g, 18C por 10 minutos, para remoo, no sedimento, de grumos de parasitos

contaminantes remanescentes. Para maximizar a recuperao dos parasitos

individualizados no sobrenadante, a suspenso de promastigotas foi deixada em

repouso por 10 minutos a 25C. O sobrenadante foi ento coletado e transferido

para outro tubo de polipropileno de 50 mL e o sedimento desprezado. Em seguida

os parasitos foram lavados em PBS contendo 10% SFB, por duas vezes, por

32

centrifugao a 1.000g, 4C por 10 minutos. O sedimento formado foi

homogeneizado cuidadosamente. Ao final das etapas de lavagem, os parasitos

foram fixados adicionando-se 20mL de soluo fixadora (10,0g/L de

paraformaldedo, 10,2g/L de cocadilato de sdio e 6,65g/L de cloreto de sdio, pH

7,2) diluda 1:1 em PBS. As formas promastigotas fixadas foram mantidas a 4C por

24 horas. Aps esse perodo, os parasitos fixados foram centrifugados a 1.000g, 4C

durante 10 minutos, o sobrenadante desprezado e o sedimento ressuspendido em

10mL de PBS. Aps essa etapa, foi realizada a contagem do nmero de parasitos e

a suspenso celular ajustada para 5x106 promastigotas/mL.

3.5 Reao de imunofluorescncia indireta por citometria de fluxo (AAPF- IgG)

Os ensaios de citometria de fluxo para o estudo de anticorpos IgG anti-

promastigotas fixadas de L. chagasi foram realizados segundo o protocolo descrito

por Rocha et al, 2002 (56), adaptado como descrito a seguir: alquotas de 50L de

soro diludo (1:2.000 a 1:128.000) em PBS- 3% SFB foram colocadas em

microplacas de 96 poos com fundo em U (Nunc, Dinamarca), juntamente com 50

L da suspenso de parasitos (2,5 x 105/poo) e incubadas a 37C por 30 minutos.

As placas foram lavadas duas vezes com 200L PBS- 3% SFB, por centrifugao a

1.000g, 4C durante 10 minutos, e o sobrenadante desprezado.

Posteriormente, os parasitos foram incubados com 50L de anticorpo

policlonal anti-IgG humano (especfico para poro Fc) marcado com isotiocianato

de fluorescena-FITC (Sigma Chemical Corp., St.Luis, MO), diludo 1:16.000 em

PBS- 3%SFB, a 37C durante 30 minutos, ao abrigo da luz. Aps a incubao com

33

anticorpos reveladores, os parasitos foram lavados duas vezes e fixados com 200L

de soluo fixadora para citometria (10,0g/L de paraformaldedo, 10,2g/L de

cocadilato de sdio e 6,65g/L de cloreto de sdio, pH 7,2). As amostras foram

mantidas pelo menos por 30 minutos, a 4C, ao abrigo de luz, at o momento da

leitura no citmetro de fluxo (FACScan- Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). As

leituras no citmetro de fluxo foram realizadas no mximo de 24 horas aps a

fixao. Os dados coletados foram armazenados e analisados posteriormente.

Para cada ensaio foi feito um controle interno da reao, para avaliar a

ligao inespecfica do anticorpo secundrio. Nesse controle, os parasitos foram

incubados na ausncia de soro humano, porm na presena do anticorpo

secundrio anti-IgG humano conjugado fluorescena. Em todas as baterias de

testes foram includas amostras de soros controles positivos e negativos para LV.

A aquisio dos dados foi realizada no citmetro de fluxo FACScan (Becton

Dickinson) empregando o software Cell-Quest.

3.6 Aquisio e anlise dos dados

A citometria de fluxo uma metodologia que utiliza um sistema ptico

eletrnico, que avalia a emisso de fluorescncia e a disperso de raios laser

incidentes sobre uma clula, permitindo a anlise de trs parmetros celulares:

tamanho (FSC-Forward Scatter), granulosidade ou complexidade interna (SSC-Side

Scatter) e a emisso de fluorescncia. Para cada amostra individual foram

adquiridas informaes relativas aos parmetros: tamanho, granulosidade e

intensidade mdia de fluorescncia de 5.000 parasitos. Nesse estudo foram

empregados anticorpos marcados com FITC (isotiocianato de fluorescena) que,

34

quando excitados emitem sinais luminosos correspondentes s fluorescncias do

tipo1 (FL1-fluorescncia verde).

A anlise da reatividade de AAPF-IgG foi feita inicialmente pela seleo da

populao celular de interesse (Figura 2A). Por se tratar de uma populao de

pequeno tamanho (cerca de 5-7m) e de pequena complexidade interna

(tripanosomatdeos) os ganhos de tamanho e granulosidade, foram empregados na

escala LOG, com valores E00 e 300, respectivamente, para permitir a identificao

do parasito em grficos bidimensionais do tipo FSC versus SSC. As formas

promastigotas apresentaram uma distribuio caracterstica e homognea em

grficos de tamanho versus granulosidade, o que permitiu o posicionamento de um

marcador sobre a regio correspondente populao de interesse (R1). Utilizando

histogramas de intensidade de fluorescncia em funo do nmero de parasitos, foi

possvel analisar a intensidade mdia de fluorescncia apresentada pela populao

selecionada.

Os resultados das anlises de fluorescncia apresentados pelos parasitos,

aps incubao com soros de pacientes e de indivduos no infectados e o reagente

fluorocromo, foram expressos sob a forma de PERCENTUAL DE PARASITOS

FLUORESCENTES POSITIVOS (PPFP). O PPFP foi determinado para cada

amostra atravs do estabelecimento de um limiar de negatividade em funo da

curva de fluorescncia obtida para o controle da ligao inespecfica do conjugado

(M1). Para cada experimento foi estabelecido um limiar de reatividade de no mximo

2% de PPFP para o controle interno da reao (controle do conjugado) (Figura 2B).

Em seguida, empregando-se o mesmo marcador foram obtidos os valores de PPFP

dos ttulos de cada amostra individual (Figura 2C e 2D). Para cada conjunto de

ensaios, um novo marcador foi posicionado empregando-se o controle do conjugado

35

daquele experimento. Esse tipo de parmetro oferece algumas vantagens, como

facilidade e rapidez para obteno dos resultados e sua reprodutibilidade no que se

refere a dados obtidos em anlises inter-laboratoriais ou em anlises realizadas

repetidas vezes.

B C D

Intensidade de Fluorescncia

B C D

Nm

ero

de

Pa

rasi

tas

Tamanho

Gr a

nu

l osi

dade

Tamanho

Gr a

nu

l osi

dade

A

B C D

Intensidade de Fluorescncia

B C D

Nm

ero

de

Pa

rasi

tas

Tamanho

Gr a

nu

l osi

dade

Tamanho

Gr a

nu

l osi

dade

A

Tamanho

Gr a

nu

l osi

dade

Tamanho

Gr a

nu

l osi

dade

Tamanho

Gr a

nu

l osi

dade

Tamanho

Gr a

nu

l osi

dade

A

Controle doconjugadoPPFP=1,18%

Soro deindivduo noinfectadoPPFP=4,89%

Soro de portador deLV

PPFP=95,05%

Figura 2- Representao esquemtica da seqncia das anlises da pesquisa de AAPF-IgG.(A) Seleo da populao de formas promastigotas de L. chagasi, utilizando-separmetros de tamanho e granulosidade. (B) Histogramas individuais representando opercentual de parasitas fluorescentes (PPFP) obtidos com controle interno da reao, (C)aps a incubao com um soro de um indivduo no infectado e (D) um soro de um pacienteportador de LV. O posicionamento do marcador (M1) segue sempre o critrio de se obter nomximo 2% de PPFP para o controle do conjugado.

3.7 Ensaio Imunoenzimtico (ELISA in house)

O teste imunoenzimtico baseia-se na reao dos antgenos da forma

promastigota de L. chagasi, previamente adsorvidos nas cavidades de microplacas,

com anticorpos contra esses antgenos possivelmente presentes nos soros de

indivduos testados. A revelao da reao ocorre pela ligao de um conjugado

anti-IgG humana marcado com a enzima peroxidase e seu respectivo substrato. A

36

reao final mensurada por um espectrofotmetro que avalia a mudana de cor da

soluo do substrato (44).

Para obteno do antgeno, as formas promastigotas de L. chagasi

(MHON/BR/74/PP75) de fase estacionria de crescimento, cultivadas em meio

NNN/LIT a 25 1C, conforme descrito anteriormente no item 3.4, foram coletadas

por centrifugao, lavadas 3 vezes com tampo salina fosfato (PBS) e lisadas por

processos de congelamento e descongelamento. A suspenso de parasitos foi

homogeneizada usando um triturador de tecidos em banho de gelo. O

homogeneizado foi centrifugado a 10.000g durante 20 minutos a 4C. O

sobrenadante foi coletado e usado como antgeno solvel total. O contedo de

protena foi estimado atravs do mtodo de Bradford.

Brevemente, placas Immulon # 4 (Dynatech, Chantilly, VA, USA) foram

sensibilizadas com 20g de antgeno solvel de L. chagasi por poo e incubadas a

4C por 12 horas. As placas foram aspiradas, bloqueadas com PBS contendo

0.05% de Tween 20 (PBS-T) e 2 % de leite Molico desnatado. Aps 1 hora a 37C,

as placas foram lavadas 4 vezes com PBS-T. Soro diludo 1:200 em PBS-T

contendo 1% de leite Molico desnatado foi adicionado em cada poo e incubado

durante 45 minutos a 37C. As placas foram lavadas 4 vezes e os anticorpos ligados

foram detectados usando anti-IgG marcado com peroxidase, diludo 1:4000

(Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD). Aps incubao durante 45 minutos a

37C as placas foram lavadas novamente e incubadas com 0.005g de O-

fenilenediamino (OPD) em tampo citrato, durante 15 minutos. Transcorrido esse

tempo uma soluo cida foi adicionada para interrupo da reao enzimtica. A

densidade tica foi lida a 492nm. Soros controles positivos e negativos foram

avaliados em cada placa para padronizar as leituras e variaes das placas (58).

37

3.8 Anlise de desempenho da metodologia de citometria de fluxo na pesquisa

de AAPF-IgG

Para avaliar o desempenho da pesquisa de AAPF-IgG por citometria de fluxo,

foram utilizados ndices de validade expressos em porcentagem e em chance,

calculados a partir da classificao dos resultados em quatro categorias de acordo

com os resultados das anlises em pacientes com leishmaniose visceral e indivduos

no infectados (66, 67, 68, 69, 70). Tais categorias esto expressas na Tabela 2 e

foram definidas da seguinte forma: verdadeiro-positivo (VPos) = presena de LV

e teste positivo; falso-positivo (FPos) = ausncia de LV e teste positivo; falso-

negativo (FNeg) = presena de LV e teste negativo e verdadeiro-negativo

(VNeg) = ausncia de LV e teste negativo.

Tabela 2 - Categorias de resultados do teste diagnstico em uma populao que incluiportadores de leishmaniose visceral (LV+) e indivduos sem leishmaniose visceral (LV-)

Resultado do TesteLV

Total(LV+) (LV-)

Positivo VPos (a) FPos (b) (a+b)

Negativo FNeg (c) VNeg (d) (c+d)

Total (a+c) (b+d) (a+b+c+d)

Com base nesses fundamentos, tabelas similares foram preenchidas de

acordo com o modelo da Tabela 2 contendo o nmero de ocorrncias de cada uma

das categorias (a, b, c, e d). A partir dos resultados obtidos, o desempenho do teste

38

sorolgico, foi avaliado segundo diferentes ndices, incluindo: sensibilidade,

especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo, acurcia, ndice J de

Youden e razes de verossimilhana. Os ndices de desempenho foram obtidos

utilizando-se o programa estatstico MedCalc Statistical.

A sensibilidade calculada pela relao a/(a+c) traduzindo, assim, a proporo

de pacientes portadores de LV nos quais o teste, AAPF-IgG ou ELISA, foi positivo.

A especificidade diz respeito proporo de indivduos no infectados cujo teste

negativo sendo, portanto, determinada pela relao d/(b+d). Cabe aqui ressaltar que

a sensibilidade e a especificidade no so afetadas pela variao da proporo

entre doentes e no-doentes e, assim so consideradas propriedades estveis do

teste. O valor preditivo de um resultado positivo - VPP (ou probabilidade de LV ps-

teste positivo) e o valor preditivo de um resultado negativo - VPN (ou probabilidade

da ausncia de LV ps-teste negativo) denominados de forma simplificada, de

valores preditivos, positivo e negativo, so fornecidos, respectivamente, pelas

relaes a/(a+b) e d/(c+d) traduzindo, assim, a proporo de indivduos com teste

positivo que apresentam LV e a proporo de indivduos com teste negativo que no

apresentam LV. Os valores preditivos, ao contrrio da sensibilidade e especificidade,

so definidos a partir do eixo horizontal da tabela, portanto, variam com a proporo

entre pacientes positivos para LV e pacientes sem LV, sendo ento, consideradas

propriedades instveis de um teste (71).

A acurcia, determinada pela relao (a+d)/(a+b+c+d), indica a proporo de

todos os resultados corretos dos teste, ou seja, os verdadeiros-positivos e os

verdadeiros-negativos. Para evitar a superestimativa desse indicador (caso sejam

elevados os valores das categorias a e d) foi tambm calculado o ndice J de

Youden que d pesos iguais aos resultados corretos (verdadeiros positivos e

39

negativos) e incorretos do teste (falsos positivos e negativos), sendo definido pela

razo (axd)-(bxc)/(a+b)x(c+d) (72). Trata-se de ndice interessante como resumo da

qualidade do teste, sendo que valores mais prximos de 1 so os que mais se

associam aos de mtodos padro-ouro.

Outra forma de abordagem do desempenho de testes diagnsticos,

particularmente daqueles cujos resultados so expressos em escala contnua,

consiste na determinao das razes de verossimilhana (RVs) para diferentes

resultados. A RV para um determinado resultado do teste diagnstico expressa em

chance e definida pela razo entre proporo de um referido resultado em

pacientes com LV em relao proporo do mesmo resultado em indivduos sem

LV. As RVs para um resultado positivo ou negativo dos testes diagnsticos foram

determinadas, respectivamente, pelas relaes a/(a+c)/ b/(b+d) e c/(a+c)/

d/(b+d). Desta forma, as RVs expressam quantas vezes mais provvel (ou

menos provvel) se encontrar um determinado resultado do teste em um paciente

com LV em relao a um indivduo no infectado por LV. Essa forma de

abordagem permite ampliar o espectro de informaes teis em relao quelas

fornecidas pelos indicadores calculados a partir de resultado dicotmico

(positivo/negativo), uma vez que permite tambm trabalhar diferentes faixas de

valores de resultados, tambm definidas por pontos de corte. A literatura registra que

valores acima de 10 praticamente confirmam a presena de doena e valores abaixo

de 0,1 praticamente confirmam a ausncia de doena (69).

Para a obteno dos ndices de desempenho e avaliao da aplicabilidade da

AAPF-IgG no diagnstico da LV e na avaliao de cura ps-teraputica foi

necess