AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA FERNANDA MARQUES DE AZEVEDO NATAL/RN 2013 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE COMPOSTO TIPO HEPARINA (cCTH) EXTRAÍDO DO CARANGUEJO Goniopsis cruentata EM MODELO EXPERIMENTAL DE PERITONITE

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

FERNANDA MARQUES DE AZEVEDO

NATAL/RN

2013

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE COMPOSTO TIPO

HEPARINA (cCTH) EXTRAÍDO DO CARANGUEJO Goniopsis cruentata EM

MODELO EXPERIMENTAL DE PERITONITE

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Fernanda Marques de Azevedo

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE COMPOSTO TIPO

HEPARINA (cCTH) EXTRAÍDO DO CARANGUEJO Goniopsis cruentata EM

MODELO EXPERIMENTAL DE PERITONITE

Dissertação de mestrado apresentada ao

programa de Pós-graduação do Departamento

de Bioquímica da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre em Bioquímica.

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Suely Ferreira Chavante

Co-orientadora: Prof.ª Dr.ª Giulianna Paiva Viana

de Andrade Souza

NATAL/RN

2013

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DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Tânia e Augusto, por sempre se fazerem presentes e me ajudarem

em todos os momentos que precisei.

Às minhas irmãs, Flaviana e Fabrisia, por fazer meus dias mais agradáveis sempre

que possível.

À minha co-orientadora, Giulianna Paiva Viana de Andrade Souza, por acreditar no

meu potencial e me ajudar a continuar nos momentos de dificuldades.

“Cada pessoa que passa em nossa vida passa

sozinha, é porque cada pessoa é única e

nenhuma substitui a outra. Cada pessoa que

passa em nossa vida passa sozinha, e não nos

deixa só, porque deixa um pouco de si e leva

um pouco de nós...”.

Charles Chaplin.

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AGRADECIMENTOS

A Deus, por me ajudar a superar todos os obstáculos;

A meus pais, Tânia e Augusto e minhas irmãs, Flaviana e Fabrisia,

simplesmente por existirem e estarem presentes na minha vida, por acordar de

madrugada e me buscar na UFRN várias vezes, por me ajudar a comprar

caranguejo, manter o foco em meus objetivos e sempre acreditar em mim. Obrigada

pelo carinho e compreensão;

À minha co-orientadora, Giulianna Andrade Souza, por me aceitar como

aluna, por partilhar comigo a construção desse trabalho e me ajudar a concluí-lo,

sempre pronta a me socorrer em todos os momentos de dúvidas. Com certeza você

foi imprescindível na minha vida acadêmica;

À minha orientadora, Suely Chavante, por me receber no laboratório como IC

e me aceitar como mestranda, me ajudando a descobrir a pesquisa;

À Professora Fernanda Wanderley, por me auxiliar na iniciação à docência e

sempre ser tão simpática com todos no laboratório;

À Ana Katarina Menezes, por ser sempre prestativa em tudo que eu precisei

no laboratório, principalmente a me ensinar os procedimentos de cultura, e pela sua

amizade;

À Raquel Brito, minha companheira de aventuras desde a graduação.

Obrigada pela companhia alegre, por estar sempre disposta a me ajudar dentro e

fora do laboratório, seja quebrando caranguejo ou escutando meus problemas. Sua

amizade é muito preciosa para mim;

À Dayse Santos, por me ajudar em tudo que precisei no laboratório, sempre

disposta a tirar minhas dúvidas, mesmo quando eu insistia e tirava sua paciência.

Obrigada pela sua amizade, por partilhar as coisas “nerds” comigo e me incentivar a

deixar de ser sedentária. Você sempre será minha mestre Jedi;

À Luciana Coelho, minha companheira de bancada, que dividiu comigo todas

as dificuldades e todas as alegrias na elaboração desse trabalho, todas as noites

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mal dormidas e dias no laboratório, seja organizando e testando um protocolo novo

ou contando lâminas de células que pareciam não ter fim. Sem você eu não teria

conseguido terminar, disso eu tenho certeza;

À Eliene, por me ajudar nos momentos de necessidade e por sempre

transmitir esse bom humor e alegria contagiantes;

Aos meus companheiros do Laboratório de Glicoconjugados Bioativos I, os

“GAGuinhos”: Ingrid, Lívia, Lais, Rômulo, Jefferson, Manuela, Marlyane, Ramayana,

Iglesias, Adriana, Vanessa, Airton que de uma forma ou de outra estavam sempre

prontos a me ajudar em tudo que eu precisasse. A presença de vocês com certeza

fez meus dias mais divertidos no laboratório! Obrigada por tudo, de coração;

A meus amigos da graduação: Bruno Mattos, Érika Galvão e Hebert Costa,

que tinham paciência de me ajudar e discutir sobre meu trabalho mesmo se

encontrando rapidamente nos corredores. Obrigada pela amizade de vocês;

Às meninas do Laboratório de Imunofarmacologia do DMP: Alessandra

Marinho, Jéssica Jales, Hylarina Diniz. Vocês foram imprescindíveis na etapa final

desse trabalho, não tenho palavras para agradecer toda a ajuda que vocês me

deram, sou muito grata a todas! Obrigada pela amizade de vocês dentro e fora da

UFRN;

À minha turma de mestrado, que partilharam dos momentos de agonia e

mesmo assim conseguiam deixar as coisas mais divertidas;

Aos professores que fizeram parte da minha pré-qualificação, Elizeu Antunes

e Daniella Martins, obrigada pelas contribuições nesse trabalho;

Às professoras da minha qualificação: Janeusa Souto, Celina Dore e Luciana

Guimarães. Obrigada pelas observações, isso me ajudou a juntar forças e seguir

adiante;

À Margarita Mavromatis, por ser tão solícita e conseguir resolver os

problemas de forma muito eficiente;

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Aos funcionários do DBq: Rogério, Ricardo, Jonas, Ângela, Creuza, Marcos,

por estarem sempre dispostos a ajudar nos momentos de necessidade, obrigada

pela cordialidade e prestatividade;

A todos os professores do DBq, pelas aulas, pela colaboração em permitir a

utilização de equipamentos e reagentes, por transmitir seus conhecimentos sem

esforço sempre que necessário. Obrigada a todos;

Aos doutorandos, mestrandos e ICs do DBq que me ajudaram em diversos

momentos de dúvidas, partilharam dos finais de semana de trabalho e que, apesar

de todas as dificuldades em se fazer pesquisa, sempre estavam dispostos a ajudar e

transmitir bom humor. Obrigada;

À CAPES pela bolsa concedida;

E a todos que de alguma forma me ajudaram a concluir esse trabalho, meu

muito obrigada!

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"Ambição sem conhecimento é como um

barco em terra firme".

Provérbio chinês.

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RESUMO

A heparina, um polissacarídeo sulfatado, foi o primeiro composto utilizado

como anticoagulante e agente antitrombótico. Devido às suas características

estruturais, possui ainda um grande potencial anti-inflamatório, entretanto tal uso na

inflamação é limitado em razão de seus efeitos acentuados na coagulação. A

ocorrência de compostos semelhantes à heparina que apresentam atividade

anticoagulante diminuída em invertebrados aquáticos, como o caranguejo Goniopsis

cruentata, despertou o interesse para o estudo de tais compostos como fármacos

anti-inflamatórios. Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial

modulador do composto semelhante à heparina extraído do Goniopsis cruentata em

eventos inflamatórios, coagulação, além de avaliar alguns aspectos de sua estrutura.

O composto tipo heparina apresentou alto grau de N-sulfatação em sua estrutura,

sendo capaz de reduzir a migração leucocitária para a cavidade peritoneal em doses

mais baixas em relação à heparina e ao diclofenaco de sódio (anti-inflamatório

comercial). Além disso, foi capaz ainda de inibir a produção de óxido nítrico e fator

de necrose tumoral alfa por macrófagos ativados, inibiu a ativação da enzima

neutrofílica elastase em concentrações baixas e apresentou um menor efeito

anticoagulante em doses altas em comparação com a heparina de mucosa suína.

Devido a essas observações, o composto extraído do caranguejo Goniopsis

cruentata pode ser utilizado como um modelo estrutural para futuros agentes anti-

inflamatórios.

Palavras-chave: Inflamação. cCTH. Heparina. Invertebrados aquáticos. Goniopsis

cruentata. Leucócitos.

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ABSTRACT

Heparin, a sulfated polysaccharide, was the first compound used as an

anticoagulant and antithrombotic agent. Due to their structural characteristics, also

has great potential anti-inflammatory, though such use is limited in inflammation

because of their marked effects on coagulation. The occurrence of heparin-like

compounds that exhibit anticoagulant activity decreased in aquatic invertebrates,

such as crab Goniopsis cruentata, sparked interest for the study of such compounds

as anti-inflammatory drugs. Therefore, the objective of this study was to evaluate the

potential modulator of heparin-like compound extracted from Goniopsis cruentata in

inflammatory events, coagulation, and to evaluate some aspects of its structure. The

heparin-type compound had a high degree of N-sulphation in its structure, being able

to reduce leukocyte migration into the peritoneal cavity at lower doses compared to

heparin and diclofenac sodium (anti-inflammatory commercial). Furthermore, it was

also able to inhibit the production of nitric oxide and tumor necrosis factor alpha by

activated macrophages, inhibited the activation of the enzyme neutrophil elastase in

low concentrations and showed a lower anticoagulant effect in high doses as

compared to porcine mucosal heparin. Because of these observations, the

compound extracted from crab Goniopsis cruentata can be used as a structural

model for future anti-inflammatory agents.

Keywords: Inflammation. cCTH. Heparin. Aquatic invertebrates. Goniopsis cruentata.

Leukocytes.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Unidades dissacarídicas constituintes dos glicosaminoglicanos sulfatados18

Figura 2. Estrutura e localização do heparam sulfato e heparina no organismo ...... 19

Figura 3. Cascata de Coagulação ............................................................................ 21

Figura 4. Inibidores naturais da cascata de coagulação ........................................... 22

Figura 5. Recrutamento de Leucócitos ..................................................................... 24

Figura 6. Goniopsis cruentata ................................................................................... 30

Figura 7. Esquema extração dos GAGs do caranguejo Goniopsis cruentata ........... 34

Figura 8. Esquema do fracionamento com acetona ................................................. 34

Figura 9. Comportamento eletroforético no sistema de tampão PDA das frações

obtidas da cromatografia de troca iônica (Lewatit) .................................................... 41

Figura 10. Comportamento eletroforético no sistema PDA das frações após

fracionamento com volumes crescentes de acetona ................................................. 42

Figura 11. Comportamento eletroforético no sistema descontínuo Ba-PDA das

frações após fracionamento com volumes crescentes de acetona ........................... 43

Figura 12. Porcentagem do infiltrado leucocitário para a cavidade peritoneal em 3 e

6 horas ...................................................................................................................... 47

Figura 13. Biodisponibilidade sistêmica dos compostos dos animais submetidos à

peritonite com indução da inflamação de três e seis horas ....................................... 49

Figura 14. Efeito do cCTH e heparina na produção de NO por macrófagos ativados

in vitro ........................................................................................................................ 50

Figura 15. Efeito do cCTH e heparina na produção de IL-1β por macrófagos

ativados in vitro ......................................................................................................... 51

Figura 16. Efeito do cCTH e heparina na produção de TNF-α por macrófagos

ativados in vitro ......................................................................................................... 52

Figura 17. Efeito do cCTH e heparina na inibição da elastase neutrofílica in vitro ... 53

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Massa molecular média do Composto Tipo Heparina do Goniopsis

cruentata, heparina e heparam sulfato de mamíferos. .............................................. 44

Tabela 2. Composição relativa dos dissacarídeos presentes no cCTH extraído do

Goniopsis cruentata em comparação com outros compostos. .................................. 45

Tabela 3. Porcentagem de inibição do infiltrado leucocitário da contagem total e de

polimorfonucleares para cavidade peritoneal nos diferentes tempos. ....................... 47

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Δ Presença de insaturação entre C-4 e C-5 do resíduo de

ácido urônico

ΔUA, 2S-GlcNS Dissacarídeo Insaturado Dissulfatado

ΔUA, 2S-GlcNS,6S Dissacarídeo Insaturado Trissulfatado

ΔUA-GlcNAc Dissacarídeo Insaturado N-acetilado

ΔUA-GlcNAc,6S Dissacarídeo Insaturado N-acetilado-6-sulfatado

ΔUA-GlcNS Dissacarídeo Insaturado N-sulfatado

ΔUA-GlcNS,6S Dissacarídeo Insaturado N,6-dissulfatado

AINEs Anti-inflamatórios não esteroidais

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AT Antitrombina

Ba/PDA Tampão acetato de bário e tampão 1,3 diaminopropano

acetato

cCTH Composto Tipo Heparina do caranguejo Goniopsis

cruentata

CETAVLON Brometo de Cetiltrimetilamônio

CN Controle Negativo

CP Controle Positivo

CXCL8/IL-8 Fator Quimiotático de Neutrófilos/Interleucina 8

DMSO Dimetilsulfóxido

EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-acético

ELISA Ensaio de Ligação Imunoenzimática

E-selectina Selectina Endotelial

F 0,6v Fração 0,6 volume de acetona

F 0,7v Fração 0,7 volume de acetona

F 0,8v Fração 0,8 volume de acetona

F 1,0v Fração 1,0 volume de acetona

F 2,0v Fração2,0 volume de acetona

F-0,5v Fração 0,5 volume de acetona

F-1,0M Fração 1,0 Molar

F-3,0M Fração 3,0 Molar

GAGs Glicosaminoglicanos

G-CSF Fator Estimulador de Colônia Granulocítica

GlcA Ácido Glucurônico

GlcN Glucosamina

GM-CSF Fator Estimulador de Colônia Macrofágica-Granulocítica

HCII Cofator II de Heparina

Hep Heparina

HPLC Cromatografia Líquida de Alta Performance

HS Heparam Sulfato

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i.p. Intra-peritoneal

IdoA Ácido Idurônico

IFN-γ Interferon gama

II a XIII Fatores Inativos da Cascata de Coagulação

IIa a XIIIa Fatores Ativos da Cascata de Coagulação

IL- 1β Interleucina 1 beta

IL-12 Interleucina 12

IL-6 Interleucina 6

LP Liquido Peritoneal

LPS Lipopolissacarídeo

L-selectina Selectina de Linfócito

MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio

NO Óxido Nítrico

NOS-3 Óxido Nítrico Sintase 3

PBS Tampão Fosfato Salino

PDA 1,3-diaminopropano acetato

PMN Leucócitos Polimorfonucleares

P-selectina Selectina de Plaquetas

ROS Espécies Reativas de Oxigênio

RPM Rotações por minuto

RPMI Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute

SFB Soro Fetal Bovino

TFPI Inibidor da Via do Fator Tecidual

TNF Fator de Necrose Tumoral

TNFα Fator de Necrose Tumoral alfa

TTPa Tempo de Tromboplastina Parcial ativada

UV Ultravioleta

x g RCF – Força centrífuga relativa

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 18

1.1 GLICOSAMINOGLICANOS ............................................................................. 18

1.2 AÇÃO DE HEPARINA E HEPARAM SULFATO NA COAGULAÇÃO .............. 20

1.3 AÇÃO DA HEPARINA E HEPARAM SULFATO NA INFLAMAÇÃO ................ 23

1.4 GLICOSAMINOGLICANOS DE ORGANISMOS AQUÁTICOS COMO FONTE

DE BIOMOLÉCULAS ATIVAS ............................................................................... 27

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 29

2.1 Objetivos Gerais ............................................................................................... 29

2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 29

3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 30

3.1 MATERIAIS BIOLÓGICOS .............................................................................. 30

3.1.1 Caranguejo ................................................................................................ 30

3.1.2 Animais ...................................................................................................... 30

3.2 GLICOSAMINOGLICANOS PADRÕES ........................................................... 31

3.3 ENZIMAS ......................................................................................................... 31

3.4 REAGENTES ................................................................................................... 31

3.5 EQUIPAMENTOS ............................................................................................ 32

3.6 OBTENÇÃO E PURIFICAÇÃO DO COMPOSTO TIPO HEPARINA DO

CARANGUEJO ...................................................................................................... 33

3.7 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE ..................................................... 35

3.7.1 Sistema 1,3 diaminopropano acetato (PDA) .............................................. 35

3.7.2 Sistema descontínuo de Ba/PDA ............................................................... 35

3.8 DEGRADAÇÃO COM ENZIMAS DE Flavobacterium heparinum .................... 36

3.9 DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR.................................................. 36

3.10 PERITONITE AGUDA INDUZIDA POR TIOGLICOLATO .............................. 36

3.11 OBTENÇÃO, CONTAGEM TOTAL E DIFERENCIAL DAS CÉLULAS DO

LÍQUIDO PERITONEAL ......................................................................................... 37

Page 17: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

3.12 TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADA .................................. 38

3.13 COLETA DE MACRÓFAGOS ........................................................................ 38

3.14 CULTURA DE MACRÓFAGOS ..................................................................... 39

3.15 DOSAGEM DE ÓXIDO NÍTRICO ................................................................... 39

3.16 DOSAGEM DE CITOCINAS (IL-1β e TNF-α) ................................................. 39

3.17 TESTE DE INIBIÇÃO DA ELASTASE ........................................................... 39

3.18 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................ 40

4 RESULTADOS ....................................................................................................... 41

4.1 PERFIL ELETROFORÉTICO DOS GAGS DO CARANGUEJO Goniopsis

cruentata ................................................................................................................ 41

4.2 MASSA MOLECULAR E ANÁLISES QUÍMICAS ............................................. 43

4.3 DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA ......................................................................... 44

4.4 EFEITO DO CCTH EXTRAÍDO DO CARANGUEJO Gonipsis cruentata

SOBRE A INIBIÇÃO DO INFLUXO DE CÉLULAS EM MODELO DE PERITONITE

AGUDA .................................................................................................................. 45

4.5 AVALIAÇÃO DA BIODISPONIBILIDADE SISTÊMICA DOS COMPOSTOS NO

MODELO DE PERITONITE AGUDA. .................................................................... 49

4.6 EFEITO DO cCTH NA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO E CITOCINAS POR

MACRÓFAGOS ATIVADOS .................................................................................. 50

4.6.1 Dosagem de Óxido Nítrico ......................................................................... 50

4.6.2 Dosagem de IL-1β e TNF-α ....................................................................... 51

4.7 EFEITO DO cCTH DO CARANGUEJO Goniopsis cruentata SOBRE A

INIBIÇÃO DA ELASTASE NEUTROFÍLICA in vitro ............................................... 52

5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 54

6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 61

7 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 62

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Introdução 18

1 INTRODUÇÃO

1.1 GLICOSAMINOGLICANOS

Os glicosaminoglicanos (GAGs) são heteropolissacarídeos constituídos por

unidades dissacarídicas repetitivas formadas por uma hexosamina (glucosamina ou

galactosamina) e por um açúcar não-nitrogenado (galactose ou ácido urônico –

glucurônico ou idurônico), unidos por ligações glicosídicas. Existem seis principais

tipos de GAGs encontrados em tecidos animais: ácido hialurônico, condroitim 4, 6-

sulfato, dermatam sulfato, queratam sulfato, heparam sulfato e heparina, cujas

unidades estruturais estão esquematizadas na Figura 1. Estes compostos são

diferenciados pelos tipos de açúcares constituintes, proporções das unidades

dissacarídicas, presença e grau de sulfatação, tipo de ligação glicosídica e tamanho

molecular das cadeias de dissacarídeos (DIETRICH, 1984).

Figura 1. Unidades dissacarídicas constituintes dos glicosaminoglicanos sulfatados.

Adaptada de VOLPI & MACCARI, 2006.

Page 19: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Introdução 19

Heparina (Hep) e heparam sulfato (HS) são expressos na forma de

proteoglicanos: glicoconjugados compostos de um core protéico ligados

covalentemente a polímeros de carboidratos (LI & VLODAVSKY, 2009). Tanto o HS

quanto a Hep consistem de unidades alternadas de glucosamina (GlcN) com ácido

glucurônico (GlcA) e/ou ácido idurônico (IdoA). HS contém uma proporção maior de

GlcA, enquanto que a Hep contém mais IdoA. Ambas as moléculas são sulfatadas,

entretanto a Hep apresenta uma maior quantidade de sulfatação, o que proporciona

um elevado grau de eletronegatividade (LEVER & PAGE, 2002). Células do tecido

conjuntivo de mastócitos degranuladores produzem proteoglicanos de Hep (LI &

VLODAVSKY, 2009) que são liberados juntamente com histamina e capazes de se

dissociar como cadeias de GAGs livres (LEVER & PAGE, 2002). Proteoglicanos de

HS são ubiquamente encontrados na superfície de diversas células, como as do

endotélio vascular e leucócitos circulantes, matriz extracelular e membranas basais

(LI & VLODAVSKY, 2009) (Figura 2).

Figura 2. Estrutura e localização do heparam sulfato e heparina no organismo. a. Heparam

sulfato. b. Heparina. Ver texto para maiores explicações. Adaptado de LEVER & PAGE, 2002.

Page 20: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Introdução 20

A Hep é encontrada em algumas espécies de vertebrados e invertebrados

(NADER et. al., 1999a; 2004) na forma do proteoglicano serglicin (LI &

VLODAVSKY, 2009), enquanto que o HS é ubíquo na superfície celular de diversas

espécies tanto de vertebrados quanto invertebrados (CASSARO et al., 1977;

DIETRICH et al., 1977; 1980; NADER et al., 1984) e expresso na forma de

diferentes tipos de proteoglicanos, como sindecans e glipicans, além de

proteoglicanos da matriz extracelular, como perlecan, agrina e colágeno tipo XVIII (LI

& VLODAVSKY, 2009; PARISH, 2006). Apesar dessas diferentes formas e locais de

expressão, o padrão característico das unidades sulfatadas e não sulfatadas nessas

moléculas possibilita o reconhecimento por uma variedade de proteínas ligantes que

se associam, eletrostaticamente, com esses carboidratos. Devido a tal fato, vários

estudos demonstram a atuação desses compostos em diversos processos

biológicos, como coagulação e inflamação.

1.2 AÇÃO DE HEPARINA E HEPARAM SULFATO NA COAGULAÇÃO

O fluxo sanguíneo normal do organismo depende da existência de um

equilíbrio preciso entre vários processos fisiológicos, como a coagulação e fibrinólise

(e seus inibidores naturais), a inflamação, a integridade da monocamada de células

endoteliais, entre outros (BOUÇAS et al., 2006), e esse equilíbrio é denominado

hemostasia. O sistema de coagulação é o principal agente na hemostasia contra

estímulos prejudiciais e invasores no organismo (CHOI et al., 2006). A coagulação

tem como objetivo converter fibrinogênio em fibrina para formar uma malha dentro

do agregado de plaquetas, estabilizando o coágulo no local da lesão (Figura 3).

Embora o objetivo final da coagulação seja a polimerização de fibrina, a

característica mais crucial da via de coagulação é a geração de trombina (ou fator

IIa) (RAU et al., 2007). Esse processo ocorre por meio da amplificação de uma série

de reações enzimáticas em que o produto de cada reação converte uma proteína

plasmática inativa em um produto de protease ativa. Assim, os fatores circulam em

uma forma inativa, quer como zimogênios (por exemplo, XII, XIII, II, etc.) ou pró-

fatores (V e VIII), que são ativados por uma proteólise limitada (BOUÇAS et al.,

2006). A cascata de reações consiste de duas vias principais. A primeira é a via

extrínseca, iniciada pela reação da tromboplastina tissular (fator III ou tecidual),

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Introdução 21

seguida pelos fatores VII e X. A outra, a via intrínseca, iniciada pelo fator XII é

seguida da ativação dos fatores XI, IX e VIII. Os fatores extrínsecos VII ativado (VIIa)

e intrínseco IX ativado (IXa) ativam o fator X na presença de fosfolipídeos, cálcio e

fator V (proacelerin). O fator Xa catalisa a reação de protrombina (fator II) em

trombina (fator IIa), resultando na clivagem da fibrina (KURATA & HORII, 2004).

Os inibidores naturais da cascata de coagulação desempenham um papel

fundamental no controle da hemostasia, exercido através da inibição específica de

serino proteinases que são formadas na cascata, bem como pela degradação de

fatores. Serpinas como antitrombina (AT), co-fator II de heparina (HCII) e inibidor da

via do fator tecidual (TFPI) pertencem a essa classe de compostos (Figura 4)

(BOUÇAS et al., 2006). A trombina (ou fator II) pode ser inibida por duas serpinas, a

antitrombina (AT) e o co-fator II da heparina (HCII). Ambas as serpinas aceleram a

inibição da trombina pelo menos mil vezes mais mediante a interação com certos

glicosaminoglicanos (HE et al., 2008). A aceleração da inibição da proteinase é

Figura 3. Cascata de Coagulação. II a XIII, diferentes zimogênios e pró-fatores; IIa a XIIIa, diferentes fatores ativados; III, fator tecidual; HK, calicreína; HMWK, quininogênio de alto peso molecular; PL, fosfolipídeos (fosfatidil serino e fosfatidil etanolamina). Adaptado de Bouças e colaboradores (2006).

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Introdução 22

conferida através de um modelo de efeito onde a proteinase (trombina) e a serpina

(AT ou HCII) ligam-se a mesma cadeia de heparina. Uma hipótese é que esta co-

ocupação irá limitar a liberdade de difusão aumentando a probabilidade de encontro

entre essas duas moléculas (RAU et al., 2007). Sabe-se também que ocorre uma

mudança conformacional na AT que acelera a inibição do fator Xa (outra serino

proteinase) graças à ligação da heparina ou HS com essa serpina (WANG &

DALLAS, 2006; LIU et al., 2007), diminuindo a amplificação da coagulação (van

DOORMAAL et al., 2008). Numa menor proporção também atua nos fatores XIIa,

XIa e IXa (ALSAYEGH et al., 2009).

A interação da AT com HS sobre o endotélio e subendotélio concentra a

atividade da AT à parede do vaso mantendo a normalidade do fluxo sanguíneo, não

apresentando caráter trombogênico (RAU et al., 2007), sugerindo um papel

fisiológico relevante nos níveis de atividade anticoagulante dentro do vaso

sanguíneo (LIU et al. 2007). A inibição da cascata de coagulação é utilizada na

terapia de anticoagulação em várias especialidades médicas, com indicações

incluindo a prevenção e tratamento de eventos tromboembólicos, tanto venosos

Figura 4. Inibidores naturais da cascata de coagulação. II a XII, diferentes zimogênios e pro-fatores; IIa a XIIa, diferentes fatores ativados; TF, fator tecidual ou fator III; AT, antitrombina, HC II, co-fator II de heparina; TFPI, inibidor da via do fator tecidual; tPA, ativador plasminogênio tecidual; PC, proteína C; PS, proteína S. Adaptado de Bouças e colaboradores (2006).

Page 23: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Introdução 23

quanto arteriais. As heparinas de administração parenteral, incluindo heparina não

fracionada e seus derivados, como a heparina de baixo peso molecular, tem sido os

anticoagulantes mais utilizados por mais de 60 anos (LAUX et al., 2009;

SUNDARAM et al., 2003).

O sistema de coagulação pode ser considerado como uma parte essencial da

imunidade inata, pois a ativação da cascata de coagulação também promove a

ativação da resposta inflamatória, devido ao fato de ambos possuírem serino-

proteases como fatores de ativação, assim como o fator XIIa que é capaz de ativar a

proteína C1q que promove a ativação da via clássica do Sistema Complemento

(AMARA et al., 2008).

1.3 AÇÃO DA HEPARINA E HEPARAM SULFATO NA INFLAMAÇÃO

A imunidade natural é a primeira linha de defesa do organismo, ocorrendo o

recrutamento de leucócitos que impede, controla ou elimina a invasão por patógenos

e/ou danos teciduais no hospedeiro (WANG et al., 2002). A reação da imunidade

natural, ou inflamação, é uma resposta do organismo a estímulos nocivos. Esta ação

protetora é obtida principalmente pelo recrutamento de leucócitos, seguida por uma

cascata de reações bioquímicas que se propagam e iniciam a resposta inflamatória

(LI & VLODAVSKY, 2009). Uma característica essencial de qualquer resposta

inflamatória é o recrutamento rápido de leucócitos do sangue para o local da

inflamação (MULLER, 2003; YADAV et al., 2003). Esse processo requer a migração

de leucócitos através o endotélio vascular, sendo um mecanismo conhecido como

extravasamento ou diapedese (PARISH, 2006).

O recrutamento de leucócitos para locais de inflamação é um processo

complexo que envolve diversas moléculas. Com o estímulo inflamatório, mastócitos

residentes liberam histamina e macrófagos residentes, citocinas pró-inflamatórias,

como o fator de necrose tumoral (TNF) e interleucina 1 (IL-1), e quimiocinas que

ativam as etapas da migração leucocitária (NATHAN, 2002). A aderência e o

rolamento de leucócitos no endotélio ativado pelo estímulo inflamatório envolvem

selectinas de linfócitos, plaquetas e células endoteliais (L-, P-, e E-selectinas,

respectivamente) e seus ligantes. A L-selectina é expressa constitutivamente por

leucócitos e se liga ao endotélio inflamado através das cadeias de heparam sulfato

Page 24: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Introdução 24

(HS). P- e E-selectina são expressos nas células endoteliais após ativação por

citocinas pró-inflamatórias (LOWE, 2003).

Os neutrófilos são parcialmente ativados pelo TNF levando a liberação de

pequenas quantidades de elastase, clivando o revestimento e expondo integrinas

(moléculas transitórias de adesão presentes nos leucócitos) que permitem uma

ligação mais forte a matriz extracelular (NATHAN, 1993). Após a aderência, os

leucócitos ativados atravessam a superfície vascular (NOURSHARGH & MARELLI-

BERG, 2005; MULLER, 2003), utilizando a ação de enzimas que degradam a

membrana basal, como metaloproteinases, heparanase e elastase (SHERWOOD &

TOLIVER-KINSKY, 2004; YADAV et al., 2003; DELCAUX et al., 1996) e na presença

de quimioatraentes, moléculas solúveis como produtos bacterianos

(lipopolissacarídeos - LPS, por exemplo) e citocinas (quimiocinas, como a CXCL8/IL-

8) (SHERWOOD & TOLIVER-KINSKY, 2004), migram até o local da inflamação

(Figura 5).

Figura 5. Recrutamento de Leucócitos. Em locais de infecção, a produção de citocinas (tais como TNF e IL-1), por macrófagos residentes, ativa as células endoteliais e leva à expressão de selectinas, ligantes de integrinas e quimiocinas. As selectinas medeiam os eventos iniciais de interação com o endotélio; as integrinas medeiam a forte a adesão dos leucócitos por meio de interações com moléculas ligantes de integrinas tais como a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM1); as quimiocinas aumentam a afinidade das integrinas dos leucócitos e estimulam a migração das células para os locais de infecção. Todos os leucócitos ativados utilizam essencialmente os mesmos mecanismos de migração. (Adaptado de PARISH, 2006).

Page 25: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Introdução 25

O HS, por ser intensamente expresso na superfície celular, possui efeitos

variados no organismo. Ele afeta a conformação de proteínas (SKINNER et al.,

1997), aumenta interações proteína-proteína, atua como co-receptor para fatores de

crescimento e captura ligantes de proteínas na superfície celular e na matriz

extracelular (WHITELOCK & IOZZO, 2005). Acredita-se ainda que o HS esteja

envolvido em diversas etapas do processo de migração leucocitária, característica

essencial da resposta inflamatória, pois ele interage com uma ampla gama de

proteínas funcionais, como fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas,

proteases, lipases e moléculas de adesão celular (PARISH, 2006). Uma das

hipóteses para atuação do HS na inflamação, é que sua ligação às citocinas (como o

IFN- -las da degradação proteolítica, prevenindo sua rápida

remoção da circulação e resultando no aumento de sua biodisponibilidade

(LORTAT-JACOB et al., 1996). Outra forma de atuação poderia ser a habilidade de

estabilizar e concentrar citocinas e quimiocinas nos locais de inflamação, onde elas

podem direcionar e promover a migração e ativação leucocitária, assim aumentando

a ligação aos receptores expressos na inflamação (YOUNG, 2008). Foi observado

que o HS é o ligante expresso das células endoteliais para a L-selectina

(NORGARD-SUMNICHT et al., 1993), interagindo diretamente com L- e P-selectina

in vitro e interferindo com proteínas que medeiam o rolamento de leucócitos (VARKI,

1998; GIUFFRE et al., 1997).

A Hep pode competir com o HS ou aumentar as interações realizadas por ele,

interferindo com a função desse glicosaminoglicano (LINDAHL, 2007; LINDAHL & LI,

2009). Propõe-se que a heparina, por ser fortemente negativa, possa se ligar as

células endoteliais (HIEBERT & JAQUES, 1976) e diminuir as propriedades de

adesão ao endotélio quando liberados pelos mastócitos durante uma resposta

inflamatória (DAY et. al., 2004; GIUFFRE et al., 1997). Foi demonstrado que a Hep

possui atividade anti-inflamatória in vivo bloqueando a ação da L- e P-selectina

(NELSON et al., 1993; WANG et al., 2002; XIE et al., 2000), um efeito que é

independente da sua atividade anticoagulante (XIE et al., 2000). Além disso, a Hep

inibe interações leucócitos-endotélio tanto in vitro (BAZZONI et al., 1992; LEVER et

al., 2000; SILVESTRO et al., 1994) quanto in vivo (LEY et al., 1991; SALAS et al.,

2000; XIE et al., 1997), além de inibirem o acúmulo de leucócitos em tecidos

específicos, como o pulmão, pele e cavidade peritoneal (SASAKI et al, 1993; SEEDS

et al., 1993; TEIXEIRA & HELLEWELL, 1993; NELSON et al, 1993). A heparina atua

Page 26: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Introdução 26

ainda na ligação e inativação de diversas proteínas inflamatórias, incluindo

componentes do Complemento (MATZNER et al., 1984; STRUNK & COLTEN,

1976), quimiocinas (MILLER & KRANGEL, 1992), citocinas, tais como IFN-

(LORTAT-JACOB et al., 1995), IL-12 (HASAM et al., 1999) e TNF-α (SALAS et al.,

2000).

Um processo importante para a inflamação é a fagocitose dos patógenos

através da ativação dos monócitos em macrófagos. Quando a ativação é obtida

através do IFN- γ, é conhecida como via clássica da ativação de macrófagos e

promove a expressão de altos níveis de citocinas pró-inflamatórias como, por

exemplo, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12 (LACY-HULBERT & MOORE, 2006). O processo

de fagocitose culmina com o evento denominado explosão respiratória, ao qual

induz a formação de espécies reativas de oxigênio (do inglês, Reactive Oxigen

Species – ROS) e nitrogênio (principalmente óxido nítrico – NO, um vasodilatador

endógeno) a fim de se eliminar o patógeno fagocitado. Devido ao fato de induzir

reações tóxicas no hospedeiro e ser altamente produzido durante a inflamação, NO

tem sido considerado um agente pró-inflamatório. NO pode ainda atuar através de

efeitos inibitórios ou apoptóticos nas células (COLEMAN, 2001) atuando como

agente anti-inflamatório. Por exemplo, o papel do NO como indutor da inflamação na

pele pode ser pró-inflamatório em baixas concentrações através da indução da

vasodilatação e recrutamento de neutrófilos, enquanto que em altas concentrações

ele regula negativamente moléculas de adesão, suprime a ativação e induz

apoptose de células inflamatórias, ou seja, inibindo a inflamação (ROSS & RESKE-

KUNZ, 2001).

A heparina também atua na fagocitose de microorganismos, através da

produção de ROS e NO, mas existem estudos controversos acerca de seus efeitos

na produção de NO (BELTRÁN et al., 1999). Utilizando células endoteliais da aorta

de bovinos, a heparina diminuiu a produção de NO através da diminuição da

expressão do mRNA da NOS-3 (UPCHURCH et al., 1997), além de diminuir a

produção de NO estimulada por N-formilmetionina em leucócitos polimorfonucleares

(neutrófilos, eosinófilos e basófilos) (BELTRÁN et al., 1999). Entretanto, a produção

de NO mensurada através dos níveis plasmáticos de nitrito/nitrato foi aumentada

pela administração de heparina em pacientes submetidos à circulação extracorpórea

(LI et. al., 1996). Estudo in vivo mostrou efeito vasodilatador da heparina em

indivíduos saudáveis (HAWARI et al., 1998) e também foi demonstrado que a

Page 27: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Introdução 27

heparina pode causar liberação de NO das células endoteliais (YOKOKAWA et al.,

1993).

1.4 GLICOSAMINOGLICANOS DE ORGANISMOS AQUÁTICOS COMO FONTE DE

BIOMOLÉCULAS ATIVAS

Apesar de ser um processo fisiológico imprescindível para a defesa do

organismo, a inflamação, quando em excesso, pode trazer prejuízos para o

indivíduo. Por esse motivo, a busca por substâncias que possam atuar na

modulação desse processo é tão intensa. Nesse sentido, há estudos que indicam a

participação de glicosaminoglicanos, como Hep e HS, no processo inflamatório

(WANG et al., 2002; XIE et al., 2000; PARISH, 2006). Apesar dos diversos efeitos na

resposta inflamatória, o uso da heparina na prática clínica é dificultado devido aos

diversos efeitos colaterais promovidos por essas moléculas (BREDDIN, 1999), como

trombocitopenia (FABRIS et al., 2000) e desequilíbrio hemostático (BOUÇAS et al.,

2006) resultantes de sua potente atividade anticoagulante. Diante disso, muitos

estudos procuram análogos da heparina com efeitos na hemostasia reduzidos, com

a finalidade de serem utilizados em atividades nas quais tais efeitos sejam

indesejáveis, como em processos inflamatórios exacerbados. Sabendo que a

ocorrência de Hep e HS não é restrita aos mamíferos (SANTOS et al., 2007), muitos

estudos buscam fontes alternativas desses compostos em organismos aquáticos,

pois eles são uma fonte rica de produtos naturais com alto potencial farmacológico

(HERENCIA et al., 1998).

A variedade de organismos aquáticos representa uma grande fonte de

compostos bioativos, principalmente devido à diversidade estrutural de compostos

presentes nesses animais com potencial terapêutico (BERTEAU & MULLOY, 2003).

No subfilo Crustacea, compostos isolados dos camarões Litopenaeus vannamei,

Penaeus brasiliensis e Litopenaeus schimitti apresentaram baixa influência na

hemostasia (BRITO et al., 2008; DIETRICH et al., 1999; SANTOS, 2006). Além

disso, o composto extraído do Litopenaeus vannamei apresentou efeito anti-

inflamatório sendo capaz de reduzir infiltrado leucocitário em modelo de peritonite

aguda em ratos (BRITO et al., 2008). Em caranguejos, como Ucides cordatus, foram

encontrados compostos com baixa atuação na inibição da coagulação (MEDEIROS

et al., 2000). Também foi demonstrada a presença de compostos com semelhança

Page 28: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Introdução 28

estrutural à heparina e HS no caranguejo Goniopsis cruentata por Andrade e

colaboradores (2013). Esses compostos mostraram ainda serem agentes

anticoagulantes in vitro menos potentes que a heparina não fracionada de

mamíferos e heparinas de baixo peso molecular, além de apresentarem menor risco

hemorrágico quando comparado à heparina (ANDRADE et al, 2013).

Diante disso, a proposta do presente trabalho é avaliar o potencial modulador

do composto extraído do caranguejo Goniopsis cruentata (cCTH) em eventos

inflamatórios, como a migração leucocitária, atuação na coagulação e atuação em

enzimas relacionadas com inflamação.

Page 29: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Objetivos 29

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVOS GERAIS

Avaliar o potencial de composto tipo heparina extraído do caranguejo

Goniopsis cruentata como modulador de eventos da inflamação.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Caracterizar a estrutura do composto extraído e comparar com obtido no

estudo descrito por Andrade e colaboradores (2013)

Analisar a capacidade do composto em interferir na infiltração leucocitária na

cavidade peritoneal dos animais em diferentes tempos após a indução da

inflamação em modelo de peritonite aguda;

Avaliar o efeito sobre as populações de leucócitos no líquido peritoneal dos

animais em diferentes tempos após indução da inflamação;

Analisar a biodisponibilidade sistêmica do composto nos animais submetidos

ao modelo de peritonite;

Avaliar a atuação do composto na produção de óxido nítrico e citocinas pró-

inflamatórias;

Analisar o efeito do composto tipo heparina sobre a ação na enzima elastase.

Page 30: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Materiais e Métodos 30

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 MATERIAIS BIOLÓGICOS

3.1.1 Caranguejo

Os espécimes do caranguejo Goniopsis cruentata (Latreille, 1803) (Figura 6),

popularmente denominado de maria-mulata ou aratu, foram coletados no mangue do

Rio Potengi, no município de São Gonçalo do Amarante/RN e adquiridos em feiras

livres (Natal/RN). Os animais foram mantidos congelados (-20º C) até o

processamento.

3.1.2 Animais

Para avaliação da migração leucocitária, foram utilizados camundongos da

linhagem Swiss (entre 8-10 semanas de idade e massa de 25-40g), provenientes do

Departamento de Bioquímica na Universidade Federal do Rio Grande do Norte

(UFRN). Todos os animais foram submetidos à dieta e água ad libitum. O manejo

experimental realizado nesse trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso

de Animais (CEUA) da mesma Universidade (Protocolo Nº: 044/2010).

Superfilo: Arthropoda

Filo: Crustacea

Subordem: Pleocyemata

Infraordem: Brachyura

Família: Grapsidae

Gênero: Goniopsis

Espécie: Goniopsis cruentata

Figura 6. Goniopsis cruentata. Espécie de crustáceo utilizada.

Page 31: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Materiais e Métodos 31

3.2 GLICOSAMINOGLICANOS PADRÕES

Heparina sódica de mucosa suína foi obtida do Laboratório Derivati Organici

(Trino Vercellese, Itália);

Heparam sulfato purificado de pâncreas bovino gentilmente doado ao nosso

laboratório pela Prof.a Dr.a Helena Bonciani Nader;

Condroitim 4-sulfato, extraído de cartilagem de baleia e condroitim 6-sulfato,

extraído de cartilagem de tubarão, assim como dermatam sulfato extraído de

mucosa intestinal bovina, foram obtidos da Seikagaku Kogyo Co. (Tóquio,

Japão).

3.3 ENZIMAS

Heparina liases I, II e III de Flavobacterium heparinum adquiridas da Sigma-

Aldrich (Sigma Aldrich, USA).

3.4 REAGENTES

1,3-diaminopropano acetato (PDA), acetato de bário, brometo de

cetiltrimetilamônio (CETAVLON), e tolueno fornecida pela Aldrich Chemical

Co. Inc. (Milwaukee,WI, EUA);

Acetona, metanol e benzina fornecida pela Cromato Produtos Químicos Ltda.

(Diadema – SP);

Agarose (standard-Low-Mr) adquirida fornecida pela BioRad Laboratories

(Richmond, CA, EUA);

Azul de toluidina e vermelho de cresol, fornecida pela Sigma Chemical

Company (St.Louis, MO, EUA);

Cloreto de Sódio, fornecida pela Vetec Química Fina Ltda (Rio de Janeiro, RJ,

Brasil);

Corante Panóptico (LB, Laborclin®);

Page 32: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Materiais e Métodos 32

Diclofenaco de sódio (Voltaren®, Novartis);

Enzima Superase fornecida pela Prozyn Indústria e Comércio Ltda.;

Kits comerciais para determinação de tempo de tromboplastina parcial ativada

(TTPa) Labtest (São Paulo, SP, Brasil);

Meios de cultura RPMI (Roswell Park Memorial Institute), Estreptomicina,

Penicilina, Soro fetal bovino (Campinas, SP, Brasil);

Reagente Coomassie Blue Brilliant G (Sigma Aldrich, USA);

Reagente de Griess (Sigma Aldrich, USA).

Resina de troca-iônica LEWATIT da Bayer S/A (São Paulo);

Solução salina 0,9% (estéril);

Os demais reagentes e materiais utilizados foram da melhor qualidade disponível.

3.5 EQUIPAMENTOS

Além dos equipamentos usuais de laboratório, utilizou-se:

Balança eletrônica, B-tec 2200, Tecnal

Bancada de Fluxo Laminar, Pa300, Pachane;

Banho Maria, Tecnal;

Câmara de Neubauer, Loptik Labor;

Câmara para eletroforese horizontal em gel de agarose, modelo desenvolvido

por Jaques e colaboradores (1968), (Técnica Permatron Ltda., São Paulo, SP,

Brasil);

Centrífuga 5804, Eppendorf;

Centrífuga refrigerada 5804 R, Eppendorf;

Centrífuga refrigerada CR 21, Hitachi Koki Co. Ltda (Tóquio, Japão);

Cito Centrífuga Presvac CT-12 (Presvac do Brasil, Ltda)

Coagulômetro QuickTimer, Drake Eletrônica Comércio Ltda. (São José do Rio

Preto, SP);

Contador manual de volumes HTC-4D, Digitimer;

Espectrofotômetro de Microplacas Epoch, Biotek;

Page 33: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Materiais e Métodos 33

Fontes de corrente contínua regulável, desenvolvidas pelo Dr. H. Rzeppa,

Técnica Permatron Ltda. (São Paulo, SP, Brasil);

GPC-HPLC em coluna 5mm 11S-2000, tamanho 300 x 7,8mm (BioSep

SEC™);

Incubadora Thermoforma Serie II Water CO2 Incubator HEPA Filter Model

3110;

Medidor de pH FTP 125, IMPRINT do Brasil Ltda. (Campinas, SP);

Microscópio invertido Eclipse TE300, Nikon;

Microscópio óptico CX 25, Olympus;

Purificador de água Milli-Q® Water System (Millipore Corp.).

SAX-HPLC em coluna 5µm SAX-80ÅLC, tamanho 150 x 4.6 mm

(PhenoSphere™);

3.6 OBTENÇÃO E PURIFICAÇÃO DO COMPOSTO TIPO HEPARINA DO

CARANGUEJO

A obtenção do composto tipo heparina do caranguejo foi realizada com a

trituração do animal, seguida da proteólise e complexação com resina de troca-

iônica (Lewatit). Os compostos obtidos por eluição com NaCl foram precipitados com

metanol e em seguida centrifugados e secos (Figura 7). As frações 3MI e 3MII foram

reunidas, dialisadas, liofilizadas e submetidas ao fracionamento com volumes

crescentes de acetona, gerando frações denominadas F 0,5v; F 0,6v; F 0,7v; F 0,8v;

F 0,9v; F 1,0v e F 2,0v (Figura 8). Uma etapa de branqueamento foi realizada para

eliminar os pigmentos presentes nas frações. Em seguida, o material foi

centrifugado, o sobrenadante dialisado e liofilizado, para então serem submetidos às

análises subsequentes.

Page 34: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Materiais e Métodos 34

Figura 8. Esquema do fracionamento com acetona.

Figura 7. Esquema extração dos GAGs do caranguejo Goniopsis cruentata.

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Materiais e Métodos 35

3.7 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

A identificação parcial e a quantificação dos GAGs extraídos dos tecidos do

crustáceo foram realizadas através do método de eletroforese em gel de agarose,

desenvolvido por Jaques e colaboradores (1968) e modificado por Dietrich & Dietrich

(1976), utilizando diferentes sistemas de tampões.

3.7.1 Sistema 1,3 diaminopropano acetato (PDA)

O material foi aplicado em gel de agarose (0,6%) no tampão PDA, 0,05M, pH

9.0 (DIETRICH, McDUFFIE, SAMPAIO, 1977) no qual a diamina interage com os

GAGs em diferentes graus, resultando na ordem decrescente de mobilidade

eletroforética: condroitim 4- e 6-sulfatos (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam

sulfato (HS) juntamente com a heparina (Hep), ou seja, os compostos que mais

interagem com a diamina apresentam menor mobilidade eletroforética. O vermelho

de cresol foi utilizado como indicador de migração.

3.7.2 Sistema descontínuo de Ba/PDA

O sistema descontínuo de Ba/PDA (BIANCHINI et al., 1980) permite o

fracionamento da heparina em 3 componentes: migração lenta (S), intermediária (I)

e rápida (F); assim melhor caracterizando-a e diferenciando-a dos outros GAGs.

Após a corrida eletroforética os GAGs foram precipitados no gel pela imersão

em uma solução de Brometo de Cetiltrimetilamônio (CETAVLON) 0,1% por 2 horas.

A seguir, o gel foi seco sob uma corrente de ar quente e corado com uma solução de

azul de toluidina 0,1% em ácido acético 1% e etanol 50%. O excesso de corante foi

removido com solução descorante (ácido acético 1% e etanol 50%) e o gel seco à

temperatura ambiente. Os GAGs interagem com o azul de toluidina e desenvolvem

atividade metacromática característica, permitindo a visualização de suas

características.

Page 36: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Materiais e Métodos 36

3.8 DEGRADAÇÃO COM ENZIMAS DE Flavobacterium heparinum

Cerca de 100 g do composto foram digeridas por uma mistura de enzimas

específicas preparadas de Flavobacterium heparinum (heparinases I, II, III) (2.5 mIU)

e analisadas por SAX-HPLC (item 3.5). Os Δ-dissacarídeos foram eluídos com um

gradiente linear de NaCl (0 - 1M) num período de 30 minutos com fluxo de 1mL.min-1

e detectados por UV a 232 nm.

3.9 DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR

Para a determinação da massa molecular, 300 μg do composto obtido e dos

padrões de calibração (1,7 kDa, 4 kDa, 10 kDa, 16 kDa e 20 kDa) foram submetidos

a análise por GPC-HPLC (item 3.5). Em seguida, a amostra foi recuperada por

eluição isocrática (Eluente 0,3M Na2SO4) a 1mL.min-1 e detectados por UV a 205

nm.

3.10 PERITONITE AGUDA INDUZIDA POR TIOGLICOLATO

O ensaio de peritonite foi realizado com grupos formados por seis

camundongos. Os animais receberam injeção subcutânea de solução salina estéril e

apirogênica pura (grupos controles positivo e negativo) ou contendo diferentes

concentrações de heparina ou do Composto Tipo Heparina extraído do caranguejo

em diferentes concentrações: 0,01 µg/Kg; 0,1 µg/Kg; 1 µg/Kg e 10 µg/Kg. Além

disso, grupos tratados com diclofenaco de sódio (Voltaren®, Novartis) e heparina,

tiveram suas doses estabelecidas segundo o método de extrapolação alométrica

interespecífica (PACHALY & BRITO, 2000). A extrapolação alométrica permite,

através do conhecimento das taxas metabólicas de dois diferentes vertebrados,

extrapolar matematicamente para cada um deles, doses de medicamentos indicadas

para o outro, para o qual já foram feitos estudos laboratoriais de experimentação

farmacocinética e farmacodinâmica (PACHALY & BRITO, 2000). Para os cálculos,

utilizaram-se doses normalmente aplicadas em humanos: diclofenaco (1,07 mg/Kg)

e heparina (3 mg/Kg), empregada na circulação extracorpórea (SOUZA & ELIAS

Page 37: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Materiais e Métodos 37

2006; MELO et al., 2008), resultando em doses médias para os animais de 7 mg/Kg

e 20 mg/Kg, respectivamente. Igualmente, foi preparado um grupo com o Composto

Tipo Heparina utilizando o mesmo critério estabelecido para heparina.

Após trinta minutos, 1 mL de solução salina estéril e apirogênica (grupo

salina) ou tioglicolato de sódio 3% (demais grupos) foram injetados

intraperitonealmente em cada animal. A peritonite foi induzida nos grupos tratados

após dois intervalos de tempos de 3 e 6 horas, sendo para cada intervalo feitos

grupos controles positivos (tioglicolato), negativos (salina) e padrão (diclofenaco de

sódio). O modelo de peritonite aguda realizado nesse trabalho foi adaptado a partir

de metodologia proposta por Xie e colaboradores (2000).

3.11 OBTENÇÃO, CONTAGEM TOTAL E DIFERENCIAL DAS CÉLULAS DO

LÍQUIDO PERITONEAL

A contagem do número total de células presentes no líquido peritoneal (LP) foi

utilizada como uma indicação do grau de inflamação. Após os tempos descritos

anteriormente, os animais foram sacrificados por injeção em dose letal de tiopental

sódico intraperitoneal. Em seguida, foi feita a lavagem da cavidade peritoneal dos

animais, com 4 mL de solução salina, no intuito de se coletar as células presentes. O

LP foi armazenado em tubos contendo EDTA e transferido para tubos do tipo

Falcon® com capacidade para 15 mL e centrifugado a 405 x g, 4°C por 3 minutos.

Em seguida, o sobrenadante foi removido e as células ressuspensas em 500 μL de

solução salina, onde 20 μL de cada amostra foram diluídos em 380 μL (1: 20) de

solução de Turk (ácido acético a 3%) e a contagem do número total de leucócitos

presentes no peritônio foi realizada em hemocitômetro (câmara de Neubauer) com

microscopia de luz e objetiva de 40x. Após essa contagem, foram preparadas duas

lâminas de microscopia para a contagem diferencial do LP utilizando o CytoSpin

(137,5 x g; temperatura ambiente por 3 minutos). As lâminas foram coradas com

Panóptico (LB, Laborclin®), de acordo com as recomendações do fabricante e a

leitura foi feita com microscopia de luz e objetiva de 100x utilizando um contador

manual de células sanguíneas para contagem diferencial de polimorfonucleares

(PMN). Um número total de 100 células em duplicata foi lido em diferentes campos

para cada animal. Obteve-se um resultado baseado na média das duas lâminas

Page 38: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Materiais e Métodos 38

lidas, sendo o resultado final para cada população expresso como a média dos

percentuais obtidos individualmente nos animais componentes do grupo.

3.12 TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADA

Foram retiradas alíquotas de sangue dos animais submetidos a peritonite

para avaliação da atividade anticoagulante através do ensaio do Tempo de

Tromboplastina Parcial Ativada (TTPa) que analisa a via intrínseca da cascata de

coagulação. O sangue citratado foi centrifugado a temperatura ambiente durante 20

minutos a 1157 x g para separação do plasma. Em seguida, 100 l de plasma

citratado de cada animal foram incubados a 37°C durante três minutos. A seguir, 100

l de cefalina foram adicionados e a mistura incubada a 37ºC por mais três minutos.

Após esse tempo, 100 l de cloreto de cálcio (CaCl2) 0,025 mol/L pré-aquecido a

mesma temperatura foram adicionados e o tempo de coagulação medido no

coagulômetro QuickTimer. Os testes foram feitos em duplicata e o valor de cada

animal representa a média desses valores, sendo a média dos grupos os

percentuais obtidos individualmente.

3.13 COLETA DE MACRÓFAGOS

Os animais tratados com tioglicolato a 3% foram sacrificados após 3 dias por

injeção em dose letal de tiopental sódico intraperitoneal. Em fluxo laminar, foi feita a

exposição do peritônio seguida da administração de solução salina estéril e

apirogênica. Após 30 segundos de massagem abdominal, o lavado peritoneal foi

recuperado. As células do lavado peritoneal foram centrifugadas a 405 x g a 4°C por

5 minutos, contadas em hemocitômetro e posteriormente utilizadas para a cultura de

macrófagos.

Page 39: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Materiais e Métodos 39

3.14 CULTURA DE MACRÓFAGOS

Foram incubadas 1,0 x 106 células/mL em placas de 24 poços (1000 µL em

cada poço) durante 3 horas a 37°C e 5% CO2. A seguir, as células não aderentes

foram descartadas, o meio trocado e cCTH ou heparina, foram adicionados ao meio

de cultura em concentrações de 0,1; 1; 10; 100 μg/mL. A seguir, as células foram

novamente incubadas durante 48 horas. Após esse período, os sobrenadantes

foram retirados para análises posteriores.

3.15 DOSAGEM DE ÓXIDO NÍTRICO

A produção de óxido nítrico foi mensurada através da concentração de nitrato

(com ou sem nitrito) presente no sobrenadante do meio de cultura utilizando

Reagente de Griess. A absorbância foi medida utilizando um espectrofotômetro

(leitor de microplaca) com um filtro de 540 nm. Os resultados foram expressos em

μM de NO3, baseado em curva padrão de NaNO3 de concentrações conhecidas.

3.16 DOSAGEM DE CITOCINAS (IL-1Β E TNF-Α)

Os níveis de IL-1β e TNF-α foram medidos a partir do meio de cultura obtido

após o estímulo das células aderentes, utilizando kits de ELISA, seguindo protocolo

fornecido pelo fabricante.

3.17 TESTE DE INIBIÇÃO DA ELASTASE

Para determinação da atividade anti-elastática de neutrófilos, foi utilizada uma

placa de 96 poços. Inicialmente, 5µL da elastase leucocitária (0,2 µM) obtida

comercialmente foi pré-incubada com PBS 0,1 M, pH 7,4 e 25 µL de Composto Tipo

Heparina ou heparina em diferentes concentrações (5, 20, 50 e 100 nM) por 10

minutos. A reação foi iniciada após adição de 25 µL do substrato Meo-SucAAPvp (5

mM). O tempo de reação do ensaio foi de 1 hora, a temperatura de 37°C. A reação

Page 40: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Materiais e Métodos 40

foi interrompida com adição de 30 µL de solução de ácido acético 30%. Os produtos

de reação foram lidos a 405 nm. Os ensaios foram realizados em triplicata. A

quantidade de PBS pipetado em cada poço foi o suficiente para atingir o volume final

de 200 µL.

3.18 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para a peritonite e tempo de tromboplastina parcial ativada, os resultados

menos dispersos entre si foram escolhidos para cada grupo. Os resultados foram

expressos como média ± DP e analisados utilizando-se a análise de variância

(ANOVA). A diferença entre grupos foi realizada pelo pós-teste de Tukey-Kramer.

Para as dosagens de óxido nítrico e citocinas, como para o teste de inibição da

elastase, os resultados foram expressos como média ± DP e analisados utilizando o

Teste t bicaudal não pareado confrontando os grupos tratados com o grupo não

tratado. O nível de significância atribuído em todos os testes foi de 5% e os dados

foram analisados utilizando-se o software GraphPad InStat (versão 3.05; GraphPad

Software Inc.).

Page 41: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Resultados 41

4 RESULTADOS

4.1 PERFIL ELETROFORÉTICO DOS GAGS DO CARANGUEJO Goniopsis

cruentata

Após extração e purificação dos glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no

caranguejo Goniopsis cruentata, as frações obtidas foram analisadas por

eletroforeses em gel de agarose em tampão PDA (Figura 9).

As frações 1M de NaCl (1MI e 1MII) apresentaram compostos de migração

semelhantes ao condroitim sulfato. Já as frações 3M de NaCl (3MI e II)

apresentaram predominantemente compostos semelhantes a heparina/heparam

sulfato e dermatam sulfato. Por esse motivo, e por possuírem constituição

semelhante, essas frações foram reunidas e utilizadas nas etapas posteriores do

processo de purificação.

As frações reunidas foram submetidas ao fracionamento com volumes

crescentes de acetona, como descrito na metodologia. A composição das frações foi

Figura 9. Comportamento eletroforético no sistema de tampão PDA das frações obtidas da

cromatografia de troca iônica (Lewatit). Cerca de 5-20g de cada fração foram submetidas à eletroforese em gel de agarose no tampão PDA 0,05M, pH 9,0. Os compostos foram fixados com CETAVLON 0,1% e corados com solução de azul de toluidina. (OR)- Origem, (+) – polo positivo,

respectivamente; (P)- Padrão contendo 5g de condroitim 4/6 sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS), (Hep) – Heparina LAOB 1mg/mL, (1MI, 1MII, 3MI, 3MII) – Frações após eluição com Cloreto de Sódio (NaCl).

CS

OR

DS

HS

P Hep 1MI 1MII 3MI 3MII

(+)

Page 42: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Resultados 42

novamente analisada por eletroforeses em gel de agarose em dois sistemas de

tampões (Figuras 10 e 11).

No sistema de tampão 1,3-diaminopropano-acetato (PDA) (Figura 10), as

frações 0,6v e 0,7v apresentaram uma banda metacromática de migração

eletroforética intermediária entre dermatam sulfato e heparina/heparam sulfato,

semelhante ao perfil descrito por Andrade e colaboradores (2013).

Entretanto, no sistema descontínuo acetato de bário/ 1,3-diaminopropano-

acetato (Ba-PDA) (Figura 11), apenas a fração 0,6v apresentou uma banda

metacromática semelhante a fração de migração rápida da heparina/heparam

sulfato, descrita em Andrade e colaboradores (2013). A fração 0,7v, apresentou um

perfil de duas bandas metacromáticas, uma semelhante ao heparam sulfato e outra,

sendo a mais predominante, intermediária entre dermatam sulfato e heparam

sulfato. Por isso, apenas a fração 0,6V foi usada para caracterização estrutural e

ensaios posteriores.

Figura 10. Comportamento eletroforético no sistema PDA das frações após fracionamento com

volumes crescentes de acetona. Cerca de 5-20g de cada fração foram submetidas à eletroforese em gel de agarose no tampão PDA 0,05M, pH 9,0. Os compostos foram fixados com CETAVLON 0,1% e corados com solução de azul de toluidina. (OR)- Origem, (+) – polo positivo, respectivamente; (P)-

Padrão contendo 5g de condroitim 4/6 sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS), (Hep) – Heparina LAOB 1mg/mL, (0,5v -2,0v) – Frações obtidas após fracionamento com concentrações crescentes de acetona.

0,6v 2,0v

CS

OR

DS

HS

P Hep 0,5v 0,7v 0,8v 1,0v

(+)

Page 43: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Resultados 43

4.2 MASSA MOLECULAR E ANÁLISES QUÍMICAS

A massa molecular do composto da fração 0,6v de acetona obtido nesse

estudo foi determinada e comparada com a massa do composto tipo heparina

descrito por Andrade e colaboradores (2013). Dessa forma, o Composto Tipo

Heparina apresentou massa molecular média de aproximadamente 17 kDa (Tabela

1). Esse valor é muito semelhante ao encontrado para o composto extraído do

Goniopsis cruentata por Andrade e colaboradores (2013) e semelhante ao valor

descrito para heparinas não fracionadas (12-16kDa) (DIETRICH et al., 1985),

entretanto menor do que os observados para heparam sulfatos (DIETRICH &

NADER, 1974) (Tabela 1).

Figura 11. Comportamento eletroforético no sistema descontínuo Ba-PDA das frações após

fracionamento com volumes crescentes de acetona. Cerca de 5-20g de cada fração foram submetidas à eletroforese em gel de agarose no tampão PDA 0,05M, pH 9,0. Os compostos foram fixados com CETAVLON 0,1% e corados com solução de azul de toluidina. (OR)- Origem, (+) – polo

positivo, respectivamente; (P)- Padrão contendo 5g de condroitim 4/6 sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS), (Hep) – Heparina LAOB 1mg/mL, (0,5v -2,0v) – Frações obtidas após fracionamento com concentrações crescentes de acetona.

F

S

I Hep

0,6v 2,0v

CS

OR

DS

HS

P Hep 0,5v 0,7v 0,8v 1,0v

(+)

Page 44: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Resultados 44

4.3 DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA

A mistura das enzimas heparinases I, II e III de Flavobacterium heparinum

foram empregadas na caracterização estrutural do composto obtido do caranguejo

Goniopsis cruentata. Os dissacarídeos resultantes da degradação estão mostrados

na Tabela 2. O composto do caranguejo apresentou uma proporção de 12% do

dissacarídeo trissulfatado [∆UA(2S)-GlcNS(6S)] , alto teor de dissacarídeos N-

sulfatados e 0,5% do dissacarídeo N-acetilado (∆UA-GlcNac). Essas características

estruturais normalmente encontradas na estrutura de heparinas de mamíferos e

semelhantes aos descritos por Andrade e colaboradores (2013) fizeram com que o

composto em estudo fosse identificado como o mesmo composto tipo heparina

previamente descrito. Devido a essas semelhanças, o Composto Tipo Heparina

obtido no presente estudo compartilhou da denominação cCTH do composto

relatado por Andrade e colaboradores (2013).

Compostos MM média (KDa)

cCTH ~17

Hepa 12,0-16,0

HSb 25,0

MM, massa molecular; cCTH, Composto Tipo Heparina do Goniopsis cruentata; HS, heparam sulfato; Hep, heparina de pulmão bovino.

aDietrich et al., 1985.

bDietrich & Nader, 1974.

TTabela 1. Massa molecular média do Composto Tipo Heparina do Goniopsis

cruentata, heparina e heparam sulfato de mamíferos.

Page 45: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Resultados 45

Dissacarídeos Porcentagem (%)

cCTH Hepn a Hep HS

∆UA-Nac 0,5 ≤1 3,42 45,77

∆UA-NS 46 45,9 2,75 17,03

∆UA-Nac(6S) 8 8,1 3,71 11,08

∆UA(2S)-Nac 7,5 7,5 2,20 3,89

∆UA-NS(6S) 5 5,1 9,25 7,19

∆UA(2S)-NS 18 18 8,10 8,79

∆UA(2S)-Nac(6S) 3 3 1,51 ND

∆UA(2S)-NS(6S) 12 12 69,06 6,23

4.4 EFEITO DO cCTH EXTRAÍDO DO CARANGUEJO Gonipsis cruentata SOBRE A

INIBIÇÃO DO INFLUXO DE CÉLULAS EM MODELO DE PERITONITE AGUDA

Contagem Total e Diferencial de Leucócitos no Líquido Peritoneal

Os valores do infiltrado de leucócitos para a cavidade peritoneal nos

diferentes tempos foram obtidos em relação ao grupo tioglicolato, subtraindo os

valores do grupo salina de todos os grupos. Dessa forma, o controle positivo (grupo

tioglicolato) foi considerado como 100% de infiltração e o negativo (grupo salina) 0%

(Figura 12). A diferença entre os grupos controles nos dois tempos testados foi

significativa (p < 0,001), evidenciando intensa infiltração celular na cavidade

peritoneal.

No tempo de 3 horas, o pré-tratamento dos animais com heparina em todas

as doses testadas ocasionou redução significativa no influxo de células para a

cavidade peritoneal, quando comparada ao grupo tioglicolato, não apresentando

diferença estatística significativa com relação ao grupo salina e ao grupo tratado

com diclofenaco – anti-inflamatório usado na prática clínica (Figura 12). De fato, as

doses de heparina e diclofenaco apresentaram uma porcentagem de inibição na

Tabela 2. Composição relativa dos dissacarídeos presentes no cCTH extraído do Goniopsis cruentata em comparação com outros compostos.

ND – não detectado; cCTH – composto extraído do Goniopsis cruentata; Hep - Heparina de mucosa suína; HS - Heparam Sulfato de pâncreas bovino. a composto extraído do Goniopsis cruentata por Andrade e colaboradores (2013).

Page 46: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Resultados 46

contagem total de mais de 90% quando comparadas ao grupo tioglicolato (Tabela 3).

Para os grupos tratados com o cCTH, todas as doses testadas também reduziram

significativamente o influxo de células em relação ao grupo tioglicolato (p < 0,001),

entretanto apenas as doses de 1 e 10µg/Kg apresentaram o mesmo efeito de

redução na migração das células obtidas para a heparina e diclofenaco (Figura 12),

com um percentual de inibição de mais de 50% para ambas as doses (Tabela 3).

Ao extrapolarmos para camundongos a dosagem de heparina utilizada na

circulação extracorpórea em humanos, foi observado, no grupo tratado com

heparina, hemólise em todos os animais não sendo possível a contagem do número

total e diferencial de leucócitos do líquido peritoneal (dados não mostrados). Já o

grupo tratado com o cCTH, na mesma dose, apresentou efeito na redução do influxo

de células para a cavidade peritoneal, sem diferença estatística significativa com

relação ao grupo tratado com diclofenaco e ao controle negativo (Figura 12),

apresentando uma porcentagem de inibição de 50,49%.

Em 6 horas, o grupo diclofenaco manteve o mesmo efeito na redução do

influxo de células para a cavidade peritoneal apresentado em 3 horas quando

comparado ao grupo tioglicolato (p < 0,001), não apresentando diferença em relação

ao grupo salina (Figura 12), entretanto, o percentual de inibição diminuiu para

55,61% (Tabela 3). Para o pré-tratamento com heparina, a redução do infiltrado

leucocitário para a cavidade peritoneal só foi mantida nas doses de 0,1 e 1µg/Kg,

não apresentando diferença estatística significativa entre o grupo salina e o

diclofenaco, contudo, a porcentagem de inibição diminuiu para 89,84 e 68,28%,

respectivamente (Tabela 3). Para o pré-tratamento com o cCTH, a redução na

inibição do infiltrado foi observada nas doses de 0,01 e 10µg/Kg também não

apresentando diferenças entre os grupos salina e diclofenaco. A dose de 0,01µg/Kg

aumentou a porcentagem de inibição de 31,47 para 58,5%, enquanto que a de

10µg/Kg se manteve aproximadamente igual ao tempo de 3 horas, com 54,14%

(Tabela 3). A dose de 0,1µg/Kg do cCTH diferiu estatisticamente tanto do grupo

tioglicolato quanto do grupo salina. As demais doses não apresentaram diferença

estatística significativa em relação ao grupo tioglicolato (Figura 12).

Page 47: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Resultados 47

INIBIÇÃO DO INFILTRADO LEUCOCITÁRIO PARA CAVIDADE PERITONEAL (%) *

HEPARINA cCTH DICLOFENACO

Doses

3h 6h 3h 6h 3h 6h

CT PMN CT PMN CT PMN CT PMN CT PMN CT PMN

µg/Kg

0,01 92,51 35,02 28,08 41,25 31,47 12,68 58,5 16,14 .. .. .. .. 0,1 99,5 57,84 89,84 46,22 23,88 3,01 40,53 12,82 .. .. .. .. 1 99,64 61,65 68,28 84,13 50,99 37,56 36,94 4,53 .. .. .. .. 10 90,5 28,37 14,99 40,77 55,72 43,58 54,14 54,28 .. .. .. ..

mg/Kg 1,07 .. .. .. .. .. .. .. .. 98,92 55,94 55,61 90,52

3 .. .. .. .. 50,49 36,93 .. .. .. .. .. ..

*diminuição da migração de leucócitos totais e de polimorfonucleares em relação ao grupo tioglicolato (+). Doses de 1,07 mg/Kg e 3 mg/Kg (humanos) extrapoladas para 7 mg/Kg e 20 mg/Kg (animais), respectivamente. CT: contagem total de leucócitos; PMN: polimorfonucleares.

Tabela 3. Porcentagem de inibição do infiltrado leucocitário da contagem total e de polimorfonucleares para cavidade peritoneal nos diferentes tempos.

Figura 12. Porcentagem do infiltrado leucocitário para a cavidade peritoneal em 3 e 6 horas. Cada coluna representa a porcentagem média de inibição em relação ao grupo tioglicolato ± DP em grupos de seis animais. Os valores médios das porcentagens indicados com letras diferentes são estatisticamente diferentes de acordo com ANOVA (p < 0,0001). Doses de 1,07 mg/Kg e 3 mg/Kg (humanos) extrapoladas para 7 mg/Kg e 20 mg/Kg (animais), respectivamente.

Page 48: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Resultados 48

Os principais leucócitos observados na contagem diferencial foram neutrófilos

e eosinófilos. Não foram obtidos valores significativos de basófilos, dessa forma, não

foram contabilizados nos polimorfonucleares. Os valores para inibição do influxo de

polimorfonucleares (PMN) para a cavidade peritoneal também foram obtidos em

relação ao grupo tioglicolato, subtraindo o grupo salina (Tabela 3). Entre os grupos

tratados, houve um aumento da porcentagem de inibição de 3 para 6 horas na

maioria das doses, em 3 horas houve uma diminuição média de aproximadamente

37% e em 6 horas, 43% (Tabela 3). A doses de 1µg/Kg de heparina e 10µg/Kg de

cCTH foram as únicas capazes de manter a redução da migração de leucócitos para

a cavidade peritoneal e aumentar a porcentagem de inibição de PMN nos dois

tempos estudados (Figura 12 e Tabela 3).

Page 49: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Resultados 49

4.5 AVALIAÇÃO DA BIODISPONIBILIDADE SISTÊMICA DOS COMPOSTOS NO

MODELO DE PERITONITE AGUDA.

No intuito de monitorar os compostos na circulação sistêmica dos animais

durante o modelo de peritonite aguda, foi realizado o ensaio do Tempo de

tromboplastina Parcial Ativada (TTPa) do plasma citratado dos animais. No tempo de

três horas, somente as doses extrapoladas de heparina e do cCTH (ambas, 3mg/Kg)

apresentaram diferença estatística extremamente significativa (p < 0,001) em

relação a todos os grupos (Figura 13a).

No tempo de seis horas, apenas a dose de 10µg/Kg de heparina e do cCTH

apresentaram diferença estatística significativa (p < 0,05) em relação ao controle

negativo (salina). As demais doses não apresentaram diferença estatística entre si

(Figura 13b).

Figura 13. Biodisponibilidade sistêmica dos compostos dos animais submetidos à peritonite com indução da inflamação de três (a) e seis horas (b). Cada coluna representa os valores expressos como a média do tempo em segundos ± DP em grupos de seis animais (n=6). Os valores médios de tempos que não compartilham letras iguais são estatisticamente diferentes de acordo com ANOVA (p < 0,0001). Doses de 1,07 e 3mg/Kg (humanos) extrapolada para 7 e 20mg/Kg (animais).

b a

Page 50: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Resultados 50

4.6 EFEITO DO cCTH NA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO E CITOCINAS POR

MACRÓFAGOS ATIVADOS

Uma vez que após estímulo inflamatório ocorre a ativação de macrófagos e a

liberação de espécies reativas de nitrogênio, como óxido nítrico (NO) e citocinas, tais

como IL-1β e TNF-α, a ocorrência de um efeito anti-inflamatório suscita a ideia de

verificar a ação dos compostos na produção desses compostos. No intuito de se

avaliar um possível mecanismo, o efeito do cCTH e Hep foram observados após

incubação por 48 horas.

4.6.1 Dosagem de Óxido Nítrico

A adição cCTH e Hep aos macrófagos ativados inibiu a produção basal de

NO. Nas concentrações de 10 e 100µg/mL de Hep e 0,1 e 100µg/mL do cCTH, as

concentrações reduziram totalmente a produção de NO, não sendo possível a

detecção pelo método de dosagem utilizado. Exceto a concentração de 0,1µg/mL de

Hep, as demais concentrações tanto de Hep quanto do cCTH, apresentaram

diferença em relação ao grupo não tratado (Figura 14).

Figura 14. Efeito do cCTH e heparina na produção de NO por macrófagos ativados in vitro. NT: grupo não tratado – controle RPMI (Roswell Park Memorial Institute); LPS – lipopolissacarídeos (Controle positivo); Hep – Heparina; cCTH – composto tipo heparina do caranguejo Goniopsis cruentata. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão vs

controle (n=3). ***p<0,001 e *p<0,05.

Page 51: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Resultados 51

4.6.2 Dosagem de IL-1β e TNF-α

O cCTH e Hep não foram capazes de inibir ou ativar a produção de IL-1β em

todas as concentrações testadas, não apresentando diferença em relação ao grupo

não tratado. Somente o grupo de LPS (controle positivo) apresentou diferença em

relação ao grupo não tratado (Figura 15).

Entretanto, os compostos apresentaram efeito na produção de TNF-α. A Hep

diminuiu a produção de basal de TNF-α somente na concentração de 1µg/mL, já o

cCTH foi capaz de inibir nas concentrações mais baixas de 0,1 e 1µg/mL. As

concentrações mais altas (10 e 100µg/mL) do cCTH promoveram um aumento da

concentração de TNF-α. As demais concentrações não apresentaram diferença em

relação ao grupo não tratado (Figura 16).

Figura 15. Efeito do cCTH e heparina na produção de IL-1β por macrófagos ativados in vitro. NT: grupo não tratado – controle RPMI (Roswell Park Memorial Institute); LPS – lipopolissacarídeos (controle positivo); Hep – Heparina; cCTH – composto tipo heparina do caranguejo Goniopsis cruentata. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão vs

controle (n=3). ***p<0,001.

Page 52: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Resultados 52

4.7 EFEITO DO cCTH DO CARANGUEJO Goniopsis cruentata SOBRE A INIBIÇÃO

DA ELASTASE NEUTROFÍLICA in vitro

Como a quimiotaxia de leucócitos, função importante para a inflamação,

ocorre através de diversos tecidos vasculares com a liberação de diversos

componentes, entre eles a enzima de neutrófilos elastase, é interessante verificar a

atuação do composto nessa enzima utilizando ensaio in vitro descrito na

metodologia. A heparina foi capaz de inibir a ação da elastase em todas as

concentrações testadas, exceto na concentração de 20nM, não apresentando

diferença em relação ao grupo controle. Já o cCTH foi capaz de inibir a elastase nas

concentrações de 5nM e 20nM (p<0,01 e p< 0,05, respectivamente), apresentando

uma porcentagem de inibição maior que a apresentada pela heparina nas mesmas

Figura 16. Efeito do cCTH e heparina na produção de TNF-α por macrófagos ativados in vitro. NT: grupo não tratado – controle RPMI (Roswell Park Memorial Institute); LPS – lipopolissacarídeos (controle positivo); Hep – Heparina; cCTH – composto tipo heparina do caranguejo Goniopsis cruentata. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão vs

controle (n=3). ***p<0,001 e *p<0,05.

Page 53: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Resultados 53

concentrações. As concentrações mais altas do cCTH promoveram a atuação da

elastase, entretanto somente a concentração de 100nM apresentou diferença

estatística em relação ao grupo controle (p< 0,05) (Figura 17).

Figura 17. Efeito do cCTH e heparina na inibição da elastase neutrofílica in vitro. Controle Positivo (+) Os valores são expressos como a porcentagem média ± desvio padrão vs controle (n=3). **p<0,01 e *p<0,05.

Page 54: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Discussão 54

5 DISCUSSÃO

A variedade de organismos invertebrados aquáticos representa uma grande

fonte para obtenção ou desenvolvimento de moléculas com amplo potencial

terapêutico, devido principalmente à diversidade estrutural de compostos presentes

nesses animais, como, por exemplo, GAGs sulfatados (MEDEIROS et al., 2000).

GAGs de invertebrados aquáticos apresentaram efeitos na coagulação e hemostasia

diminuídos em relação à heparina comercial, como foram observados nos

crustáceos Penaeus brasiliensis, Litopenaeus vannamei, Litopenaeus schimitti,

Ucides cordatus (BRITO et al., 2008; SANTOS, 2006; DIETRICH et al., 1999;

MEDEIROS et al., 2000), incluindo também o caranguejo Goniopsis cruentata

(ANDRADE et al., 2013). Por esse motivo, no presente trabalho foi avaliado o efeito

anti-inflamatório in vivo do composto tipo heparina isolado do caranguejo Goniopsis

cruentata (cCTH). Para isso, o cCTH foi obtido utilizando a mesma metodologia

descrita em Andrade e colaboradores, 2013. Também foi necessário analisar alguns

aspectos estruturais, como também a atuação em ensaios in vitro relacionados a

eventos inflamatórios. O cCTH obtido nesse estudo mostrou o mesmo padrão de

migração eletroforética no sistema de tampão PDA descrito em Andrade e

colaboradores (2013). Por apresentar uma banda única e intermediária ao dermatam

e heparina/heparam sulfato de mamíferos, Andrade e colaboradores (2013)

mostraram que o cCTH possui um grau de sulfatação diferente daqueles descritos

para heparam sulfato e heparina isolados e caracterizados de tecidos de

vertebrados e invertebrados (DIETRICH, NADER E STRAUS, 1983; DIETRICH et

al., 1989; NADER & DIETRICH, 1989; FERREIRA et al., 1993; TERSARIOL et al.,

1994). Entretanto, no sistema de tampão Ba/PDA, no qual a heparina de mamíferos

é fracionada em seus componentes de migração rápida, intermediária e lenta,

observa-se a predominância de uma banda metacromática com perfil de migração

semelhante ao componente de migração rápida da heparina, indicando que o cCTH

é composto principalmente por dissacarídeos dissulfatados (ANDRADE et al., 2013;

VOLPI, 1993). Esse comportamento eletroforético semelhante ao componente de

migração rápida da heparina foi observado também nas heparinas de baixo peso

molecular isoladas do camarão Penaeus brasilienses (DIETRICH et al., 1999),

Litopenaeus vannamei (BRITO et al., 2008), Penaeus schimit (SANTOS, 2006), na

Page 55: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Discussão 55

lagosta Panulirus laevicauda (SILVA, 2003) e no microcrustáceo Artemia franciscana

(CHAVANTE et al., 2000).

O padrão de sulfatação é considerado um parâmetro importante para a

caracterização estrutural dos glicosaminoglicanos. Por esse motivo, enzimas

específicas que atuam em dissacarídeos com teor de sulfatação característicos são

utilizadas para caracterizar tais polímeros. Heparinases são enzimas comumente

utilizadas para avaliar a composição dissacarídica de compostos tipo

heparina/heparam sulfato. Cada enzima atua em regiões específicas e geram

dissacarídeos com padrão de sulfatação definidos. A heparinase I identifica resíduos

contendo ácido α-L-idurônico obrigatoriamente sulfatado na posição C-2 e

glucosamina N-sulfatada, liberando dissacarídeo trissulfatado (UA-2S, GlcNS,6S) e

o tetrassacarídeo pentassulfatado (SILVA & DIETRICH, 1975; NADER et al. 1999b;

DESAI, WANG & LINHARDT, 1993b; DIETRICH, SILVA & MICHELACCI, 1973). A

heparinase III é específica para ligações glicosídicas do tipo α(14) entre o resíduo

de D-glucosamina (N-acetilada ou N-sulfatada) — que não apresenta sulfatação em

C-6 — e ácido D-glucurônico (SILVA & DIETRICH, 1974; DESAI, WANG,

LINHARDT, 1993a; NADER et al., 1999b). A heparinase II atua nas ligações do tipo

α(14) entre D-glucosamina (N-acetilada ou N-sulfatada) preferencialmente

sulfatada na posição C-6, e ácido α-L-idurônico ou α-D-glucurônico, mas não age

nas sequências contendo α-D-glucurônico ligado a glucosamina N-acetilada ou α-L-

idurônico 2-sulfatado ligado a glucosamina N,6-dissulfatada. Entretanto, sabe-se

que o uso das enzimas individualmente gera muitos oligossacarídeos. Por isso, uma

mistura das três enzimas foi usada para determinar a composição dissacarídica total

do composto em estudo. Embora apresente alto grau de N-sulfatação e

insignificante teor de dissacarídeos N-acetilados, a composição dissacarídica do

cCTH difere da estrutura da heparina, onde aproximadamente 80% dos

dissacarídeos são ∆UA,2S-GlcNS,6S, tão bem como para heparam sulfatos que

apresentam 50-60% de dissacarídeos ∆UA-GlcNAc/∆UA-GlcNS (DIETRICH et al.,

1998; DESAI, WANG, LINHARDT, 1993a). Entretanto, o cCTH apresentou

proporção 24 vezes maior de dissacarídeos trissulfatados em relação a

dissacarídeos N-acetilados (Tabela 02). Essa relação entre dissacarídeos evidencia

que o cCTH compartilha mais características com a heparina do que com o

heparam sulfato.

Page 56: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Discussão 56

A presença concomitante e em proporções diferenciadas de dissacarídeos

normalmente encontrados no heparam sulfato e na heparina também foi observada

em outras espécies de caranguejos, como o Ucides cordatus e Chaceon fenneri

(MEDEIROS et al., 2000). Essas mesmas características estruturais foram

encontradas por Andrade e colaboradores (2013) em compostos também extraídos

do caranguejo Goniopsis cruentata. Tal fato é um indicativo de que o cCTH possa

se tratar do mesmo composto obtido por Andrade e colaboradores (2013), visto que

os dois trabalhos utilizam o mesmo caranguejo como objeto de estudo. Além disso,

o peso molecular dos compostos obtidos em ambos os trabalhos foi uma média de

17KDa, assim, podemos concluir que se tratam da mesma molécula extraída do

Goniopsis cruentata.

As características estruturais presentes no cCTH podem estar relacionadas a

seus efeitos menos pronunciados quando comparados à heparina de mamíferos,

como observado por Andrade e colaboradores (2013). A baixa atividade

anticoagulante in vitro, o potente efeito antitrombótico e menor efeito

antihemostático in vivo possibilitaram sua utilização como modelo de pesquisa para

possíveis efeitos sobre a resposta inflamatória. Um parâmetro utilizado para

investigar as propriedades anti-inflamatórias do cCTH foi a avaliação de sua

capacidade de interferir na migração leucocitária em um modelo experimental de

peritonite aguda induzida por tioglicolato de sódio em dois tempos de 3 e 6 horas.

Em estudo prévio realizado em nosso laboratório, utilizando esse modelo em ratos,

foi demonstrado que um composto extraído do camarão Litopenaeus vannamei

reduziu a infiltração leucocitária à cavidade peritoneal após 3 horas de indução da

inflamação (BRITO et al., 2008). Utilizando o mesmo modelo em camundongos, em

3 horas, foi demonstrado que a administração do cCTH, 30 minutos antes da

indução da inflamação, foi capaz de reduzir o influxo de leucócitos para a cavidade

peritoneal nas doses a partir de 1µg/Kg. Já a heparina de mamíferos foi capaz de

reduzir a migração em todas as doses testadas, exceto a dose de 3mg/Kg de

heparina (extrapolada para 20mg/Kg nos animais) que causou sangramento na

cavidade peritoneal de todos os animais testados não sendo possível a contagem

total nem diferencial dos leucócitos peritoneais, como citado anteriormente. A

mesma dose utilizada do cCTH, além de não ocasionar sangramento, reduziu

significativamente o influxo de células para a cavidade peritoneal, sendo semelhante

ao grupo salina (não tratado) e ao grupo tratado com diclofenaco.

Page 57: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Discussão 57

O tempo de 6 horas utilizado foi baseado em trabalhos que demonstram a

ocorrência de aumento no número de neutrófilos na cavidade peritoneal de

camundongos em modelos de peritonite em 6 horas (ZHANG et al. 1992; ALCAMO

et al., 2001). No experimento de 6 horas, o cCTH e a heparina assumem padrões

não monotônicos em seus resultados. A esse padrão não monotônico, dar-se o

nome de “efeito hormesis” ou “hormese”, um tipo específico de dose-resposta cuja

ocorrência tem sido documentada através de uma vasta gama de modelos

biológicos (COOK & CALABRESE, 2006). Refere-se a uma dose-resposta bifásica

(MATTSON, 2008) caracterizada por uma estimulação modesta em doses baixas e

uma inibição em doses altas (CALABRESE & BALDWIN, 2003) que pode resultar na

forma de “U invertido” ou “U”. Os resultados em 6 horas da contagem total de

leucócitos da cavidade peritoneal mostram que a heparina reduziu a migração

leucocitária nas doses de 0,1 e 1µg/Kg, mantendo o resultado obtido para 3 horas,

enquanto que a menor (0,01µg/Kg) e a maior (10µg/Kg) dose não apresentaram tal

efeito, apresentando um padrão de “U” invertido. Já o cCTH apresentou efeito na

redução da migração leucocitária nas doses de 0,01 e 10µg/Kg, não tendo resultado

significativo nas demais doses (0,1 e 1µg/Kg), formando um padrão de “U”. Essa

estimulação em doses baixas é observada algumas vezes após uma resposta inicial

inibitória, parecendo representar uma modesta compensação na ruptura da

homeostase (CALABRESE & BALDWIN, 2003). Tal fenômeno pode representar o

fato da dose de 0,01µg/Kg do cCTH não ter apresentado inibição da migração

leucocitária em 3 horas, mas sim em 6 horas.

As doses do cCTH que apresentaram efeito na redução da migração

leucocitária apresentaram o mesmo comportamento observado para o diclofenaco

de sódio, anti-inflamatório da classe dos AINEs (anti-inflamatórios não esteroidais)

utilizados comercialmente (FILHO et al., 2006) e presente na lista de fármacos de

referência da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Entretanto esse

efeito do cCTH foi alcançado com doses de 700 até 700.000 vezes menores do que

a dose terapêutica utilizada para o diclofenaco. Apesar dos AINEs serem largamente

utilizados na prática clínica, eles possuem efeitos colaterais importantes como

toxicidade renal e hepática (VANE & BOTTING, 1998; SALLUSTIO & HOLBROOK,

2001; BRICKS & SILVA, 2005), justificando a busca por compostos que apresentem

capacidade anti-inflamatória, mas não tais efeitos nocivos, como o cCTH.

Page 58: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Discussão 58

Em 3 e 6 horas, a contagem diferencial de leucócitos no líquido peritoneal

apresentou, para os grupos tratados com tioglicolato, uma porcentagem mais

elevada de polimorfonucleares em relação ao grupo salina, sendo os neutrófilos as

células em maior número encontradas nos dois tempos estudados (dados não

mostrados). Em relação ao grupo tioglicolato, a maioria dos grupos tratados que

apresentaram inibição do influxo de células para a cavidade peritoneal na contagem

total, também reduziram a porcentagem de polimorfonucleares na contagem

diferencial. Em praticamente todos os grupos tratados, a porcentagem de

polimorfonucleares diminuiu entre os tempos de 3 e 6 horas. Essa diferenciação e

proliferação dos leucócitos podem ser reguladas por diversos fatores, entre eles

citocinas, como o fator de necrose tumoral (TNF) e a interleucina 1 (IL-1). Estímulos

inflamatórios liberam TNF e IL-1 (citocinas pró-inflamatórias), os quais estimulam

células do estroma na medula óssea à produção de fatores de crescimento, como os

fatores estimuladores de colônias granulocíticas (G-CSF) e macrofágica-

granulocítica (GM-CSF) (DANIS et al., 1991), consequentemente, promovendo a

formação de polimorfonucleares e macrófagos. Assim, a presença dessas citocinas

poderia explicar o fato dos grupos tratados com tioglicolato apresentarem diferenças

na contagem diferencial em relação ao grupo salina. Nos grupos tratados, a

diminuição na quantidade de polimorfonucleares em relação ao grupo tioglicolato,

principalmente observada no tempo de 3 horas para as doses de 1µg/Kg de

heparina e 3mg/Kg do cCTH, poderia ocorrer devido à inibição dessas citocinas.

Como observado, o cCTH e a Hep foram capazes de interferir somente na produção

de TNF-α. De fato, foi observado que TNF possui afinidade pela heparina (LANTZ et

al., 1991) e, além disso, dissacarídeos sulfatados de heparina foram capazes de

inibir a produção de TNF-α em macrófagos de camundongos (CAHALON et al.,

1997), dessa forma, é possível que o cCTH possa atuar na proliferação de

polimorfonucleares através da inibição dessas citocinas pró-inflamatórias. Os efeitos

fisiológicos da IL-1 são essencialmente idênticos aos do TNF-α, entretanto a IL-1

isolada não é capaz de provocar lesão tecidual ou a morte celular por apoptose, e,

além disso, pode potencializar os efeitos do TNF-α (SHERWOOD & TOLIVER-

KINSKY, 2004). Dessa forma, o fato do cCTH não interferir na produção dessa

citocina pode estar associado a diminuição da resposta inflamatória observada.

Além disso, o efeito anti-migratório nesse estudo pode também ocorrer

através de interferência nos mecanismos de recrutamento leucocitário, como, por

Page 59: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Discussão 59

exemplo, a inibição da enzima elastase liberada por neutrófilos ativados. A elastase

é uma proteinase presente nos grânulos de neutrófilos com atividade microbicida e

com capacidade de degradar diversos componentes da matriz extracelular, tais

como a elastina ou o colágeno tipo IV (FAURSCHOU & BORREGAARD, 2003). Já

foi demonstrado que heparina e heparina de baixo peso molecular inibem a

degranulação neutrofílica por mecanismos dependentes de sulfatação (BROWN et

al., 2003; 2012), dessa forma a presença de dissacarídeos N-sulfatados e

dissulfatados do cCTH poderiam interagir e inibir a elastase, dificultando o processo

de quimiotaxia neutrofílica durante o estímulo inflamatório. Tal fato foi observado nas

concentrações mais baixas testadas para o cCTH, assim, o composto extraído do

Goniopsis cruentata poderia atuar na redução da migração leucocitária através

desse mecanismo de inibição.

Nesse estudo foi demonstrado que o cCTH possui efeito na inibição de NO,

assim como a heparina. Foi observado por Dandona e colaboradores (1999), que a

heparina possui efeito inibitório na geração de ROS pelos leucócitos. Algumas das

ROS se ligam ao NO (MONCADA & HIGGS, 1993), para formar peroxinitrato, que é

toxico e não um vasodilatador como o NO (SZABO et al., 1996), dessa forma, uma

redução na formação de ROS pela heparina permitiria uma grande

biodisponibilidade de NO para vasodilatação. O aumento da biodisponibilidade de

NO pode possuir um efeito adicional na inibição da adesão leucocitária ao endotélio,

inibindo também a inflamação (DE CATERINA et al., 1995).

No intuito de monitorar os compostos na circulação sistêmica dos animais

durante o modelo de peritonite aguda, foi realizado o ensaio do Tempo de

tromboplastina Parcial ativada (TTPa) do plasma citratado. No tempo de 3 horas, o

cCTH na dose de 3mg/kg aumentou o tempo de coagulação em aproximadamente

60% em relação aos grupos controles. A mesma dose de heparina ultrapassou o

tempo máximo de detecção avaliado pelo coagulômetro (>240 segundos),

aumentando o tempo de coagulação em relação aos controles em aproximadamente

600%, não permitindo a coagulação das amostras e promovendo o sangramento

excessivo que impossibilitou a contagem de leucócitos da cavidade peritoneal desse

grupo citado anteriormente. Alguns aspectos estruturais observados para o cCTH,

como a ocorrência de um peculiar ácido glucurônico 2-sulfatado e predominância de

dissacarídeos dissulfatados, podem estar relacionados com a sua reduzida atividade

anticoagulante em relação à heparina no teste de TTPa.

Page 60: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Discussão 60

Quanto mais se conhece a biodiversidade aquática, maior a probabilidade da

descoberta de novas substâncias com potenciais farmacológicos e diante disso, o

conhecimento dos mecanismos de atuação desses compostos se faz necessário,

por isso, esse trabalho fornece uma base para os conhecimentos a respeito dessas

moléculas e seus possíveis alvos envolvidos em sua ação anti-inflamatória. O cCTH,

por apresentar efeitos na coagulação diminuídos, pode servir como um modelo para

estudar os requerimentos estruturais necessários para interferir na resposta

inflamatória.

Page 61: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

Conclusão 61

6 CONCLUSÃO

O cCTH obtido do caranguejo Goniopsis cruentata apresentou alto teor de N-

sulfatação e dissacarídeos dissulfatados, estruturas observadas em outros

compostos extraídos de invertebrados aquáticos, sendo similar ao composto

extraído por Andrade e colaboradores (2013);

O cCTH apresentou efeito na redução do influxo de células para a cavidade

peritoneal nos tempos de 3 e 6 horas de forma semelhante a heparina, mas

não apresentou efeito anticoagulante significativo em doses elevadas;

Em relação a um provável mecanismo anti-inflamatório, o cCTH foi capaz de

interferir na produção de TNF-α e NO, mas não de IL-1β por macrófagos

ativados e ainda inibiu a atuação da enzima elastase, liberada por neutrófilos,

em concentrações mais baixas do que a heparina de mucosa suína em

ensaio in vitro;

Por apresentar efeitos na coagulação e hemostasia reduzidos, o cCTH pode

atuar como modelo de estudo para possíveis compostos anti-inflamatórios.

Page 62: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DE ...

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