AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE FORMIGAS … · em um hospital da rede pública de saúde, no...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE FORMIGAS

(HYMENOPTERA: FORMICIDAE) COMO VETORES MECÂNICOS DE BACTÉRIAS DO GÊNERO Staphylococcus NO

AMBIENTE HOSPITALAR.

EUTÁLIA ELIZABETH NOVAES FERREIRA DA SILVA

NATAL/ RN 2009

EUTÁLIA ELIZABETH NOVAES FERREIRA DA SILVA

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE FORMIGAS

(HYMENOPTERA: FORMICIDAE) COMO VETORES MECÂNICOS DE BACTÉRIAS DO GÊNERO Staphylococcus NO

AMBIENTE HOSPITALAR.

Orientadora: Drª. Maria de Fátima Freire de Melo Ximenes. CB/DMP/UFRN.

Co-orientadora: Drª Maria Celeste Nunes de Melo. CB/DMP/UFRN.

NATAL/ RN Dezembro de 2009

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, do Centro de Biociências, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como pré-requisito para a obtenção do Grau de Mestre.

Dedico este trabalho aos meus pais Carlos e Márcia, aos meus irmãos Camilo e Abigail e ao meu namorado André, presentes de Deus na minha vida.

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo dom da vida, pela força e esperança, pela iluminação e também por ter

colocado em meu caminho todos os anjos em pessoa que cito abaixo, que me ajudaram

desde uma breve palavra até os mais altos esforços.

À Drª. Maria de Fátima Freire de Melo Ximenes que acreditou no meu trabalho, um

tema bem diferente, e me deu todo apoio como minha orientadora e amiga em todos os

momentos em que precisei. Aprendi muito com ela como pessoa, como pesquisadora, como

professora. Obrigada pelos conselhos e pelo carinho.

À Drª. Maria Celeste Nunes de Melo que me acolheu em seu Laboratório, me

apoiou e me ensinou com muita paciência, “vestiu à camisa” e dedicou-se ao sucesso do

trabalho. A ela devo tudo o que aprendi sobre os estafilococos. Agradeço também por todos

os conselhos, as orientações, às vezes que dispôs dos seus fins de semana pelo nosso

trabalho, pelas amizades que fiz através dela, enfim, por tudo de bom que aconteceu desde

que Deus a colocou no meu caminho, muito obrigada. À ela toda a minha admiração e

agradecimento.

À Drª. Lenise Arneiro Teixeira por ter me recebido muito bem em seu Laboratório,

na Universidade Federal Fluminense - UFF, por ter aceitado participar do nosso trabalho e

nos apoiado nas análises moleculares. Agradeço pela disposição, conselhos e idéias acerca

de propostas futuras para nossas pesquisas.

Ao Dr. Jacques Hubert Charles Delabie pela participação em nosso trabalho

auxiliando na identificação de nossas formigas.

À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, que nos concede estrutura e

professores de qualidade, fundamental na minha formação.

À Coordenação do Programa de Pós-gradução em Ciências Biológicas, aos

professores do Programa e os funcionários, que auxiliaram e orientaram a mim e aos meus

colegas do Mestrado.

À FAPERN – Fundo de Apoio à Pesquisa do Rio Grande do Norte, que me

concedeu uma bolsa de Mestrado, através do edital 002/2008, muito importante na

manutenção dos meus estudos.

Á Jannyce Guedes da Costa, aluna de Biomedicina, que não só me auxiliou na

análise dos nossos estafilococos, como também foi minha amiga, conselheira, companheira,

pessoa leal que me ensinou muito e com ela pude contar em todos os momentos, obrigada.

À André Luiz Bezerra Falcão Freire, aluno de Ciências Biológicas, que fotografou e

me auxiliou a identificar mais de 400 formigas, me ajudou na organização do trabalho.

Além disso, como meu namorado, me deu todo apoio, entendeu a minha ausência muitas

vezes, fez todos os esforços para me ajudar em todos os momentos, não me deixou

esmorecer, me fazendo sempre acreditar que tudo ia dar certo. Meu muito obrigada a esse

meu companheiro e amigo, presente de Deus na minha vida.

À Carolina Garnica Pérez Taco López, aluna da UFF, que nos ajudou nas análises

moleculares de nossas amostras.

Á Carlos Alberto Ferreira da Silva, meu pai, que me auxiliou no transporte do

material em todas as coletas, sempre disponível e paciente.

Aos professores da disciplina de Entomologia: Dr. Herbet Tadeu Almeida Andrade

e MSc. Adalberto Antônio Varela Freire, que me deram todo apoio, ainda na graduação,

para começar um trabalho a respeito das formigas urbanas e ao Dr. Ricardo Andreazze, que

me acolheu na sua disciplina, para o Estágio à Docência, por todo apoio e por tudo que me

ensinou sobre a carreira acadêmica.

À Drª. Cecília Maria de Carvalho Xavier Holanda pelo auxílio no uso do

Laboratório de Microbiologia do Hospital Universitário Onofre Lopes- HUOL; à Drª.

Maria Tereza Barreto de Oliveira pelo empréstimo de muitos dos seus meios de cultura

para execução do nosso trabalho; à professora Maria José de Britto Costa Fernandes e a

Francisco Canindé de Sousa, Farmacêutico, pelo apoio e ensinamentos quando comecei a

trabalhar no LabMed com os estafilococos; ao professor Ermeton Duarte do Nascimento,

meu amigo e colega no Mestrado, pelo apoio e carinho; a Drª. Magnólia Fernandes

Florêncio de Araújo, pela boa vontade em nos ajudar na aquisição de materiais; ao Dr. José

Veríssimo Fernandes, chefe do Departamento de Microbiologia e Parasitologia, com quem

sempre contamos e aos demais funcionários desse departamento Srª Otani, Sr. Edson e

Srª.Olívia.

Agradeço à minha mãe, Marcia Maria de Freitas Novaes Ferreira da Silva, que

muito me apoiou com o seu carinho, a sua dedicação como mãe, por me dar seu consolo de

mãe e por me fazer sempre acreditar que posso vencer as barreiras dessa vida.

Ao meu Pai mais uma vez, Carlos Alberto Ferreira da Silva, por me apoiar nesse

trabalho, e pela educação, apoio e carinho que me deu, junto com minha mãe, ao longo de

toda a minha vida, me permitindo estudar e crescer como pessoa. Amo vocês!

Agradeço aos meus irmãos Abigail e Camilo, que sempre demonstraram toda a

paciência comigo, carinho e nunca me deixaram desanimar. São pessoas de bem que muito

me orgulha tê-los como meus irmãos, amo vocês!

Agradeço ao meu namorado André Luiz e aos pais dele Sr. Alcindo e Srª. Dulce por

estarem sempre dispostos a me ajudar, pela amizade, pelo carinho e pela alegria que

trouxeram à minha vida. Á Cecília, tia Fátima e tia Lázara, Dona Lourdinha,... e a todos

que fazem essa família linda de pessoas maravilhosas que conheci através de André.

Aos meus amigos Joseane, Bueno, Glauce, Rayssa, Mara Fernanda, Jailma, Suely,

Álvaro e a todos que me auxiliaram com uma palavra de carinho, compreensão e gestos de

generosidade. Aos amigos do LabMed e do LabEnt: Jannyce, Leonardo, Luanda, Pedro,

Cláudio, Francisco, Glauce, Rodrigo, Hilário, Vanessa, Virgínia, Marcos.

Aos professores que aceitaram contribuir com o nosso trabalho fazendo parte das

bancas de Pré-qualificação e Qualificação: Drª Sathyabama Chellapa, Dr. Herbet Tadeu

Almeida Andrade e Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto.

A todos os meus colegas da Pós Graduação em Ciências Biológicas, que

enfrentaram as dificuldades e aprenderam bastante como eu.

RESUMO

No ambiente hospitalar, bactérias podem ser disseminadas por insetos, tais como as formigas,

que se destacam pela alta adaptabilidade ao ambiente urbano. As bactérias do gênero

Staphylococcus são uma das principais causas de infecção hospitalar. Em países da Europa,

América Latina, Estados Unidos e Canadá, o grupo dos estafilococos coagulase-negativos

(ECN) representa a segunda maior causa dessas infecções, segundo o SENTRY (Programa de

vigilância antimicrobiana- EUA). No presente estudo foi analisado o potencial de formigas

(Hymenoptera: Formicidae) como veículos mecânicos de bactérias do gênero Staphylococcus

em um hospital da rede pública de saúde, no município de Natal-RN. As formigas capturadas

em coletas diurnas e noturnas, entre junho de 2007 e maio de 2008, nos seguintes setores:

enfermarias, lavanderia, cozinha, banco de sangue. Esses insetos foram identificados segundo a

chave de identificação de Bolton, 1997. Para a análise da presença de estafilococos, as formigas

foram incubadas em caldo de caseína de soja (TSB) por 24h, a 35ºC para posterior semeadura

em Agar Manitol Salgado. As colônias características de estafilococos incubadas por 24h a

35ºC, em Tryptic Soy Agar, para testes de caracterização do gênero (coloração de Gram,

catalase, susceptibilidade à bacitracina e coagulase livre). A identificação dos ECN foi

realizada através das provas bioquímicas: susceptibilidade à novobiocina, crescimento em

anaerobiose, presença de urease, descarboxilação da ornitina e produção de ácidos a partir dos

açúcares manose, maltose, trealose, manitol e xilose. A susceptibilidade aos antimicrobianos

analisada através da técnica disco-difusão. Para confirmar a presença do gene mecA foi

utilizada a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase e a capacidade de produção de biofilme

foi verificada através de ensaio in vitro usando superfície inerte de poliestireno, em amostras de

estafilococos resistentes. Entre 440 formigas, 85 (19,1%) estavam transportando os ECN das

espécies Staphylococcus saprophyticus (17), Staphylococcus epidermidis (15), Staphylococcus

xylosus (13), Staphylococcus hominis hominis (10), Staphylococcus lugdunensis (10),

Staphylococcus warneri (6), Staphylococcus cohnii urealyticum (5), Staphylococcus

haemolyticus (3), Staphylococcus simulans (3), Staphylococcus cohnii cohnii (2), e

Staphylococcus capitis (1 ). Nenhum Staphylococcus aureus foi encontrado. Entre os isolados,

30,58% apresentaram resistência à eritromicina. Duas amostras de ECN (2,35%), obtidas a

partir da formiga Tapinoma melanocephalum coletadas na enfermaria feminina pós-cirúrgica,

S. hominis hominis e S. lugdunensis albergavam o gene mecA e foram resistentes a múltiplos

antibióticos. Além disso, a espécie S. hominis hominis ainda mostrou ser um produtor de

biofilme. Este estudo demonstra que as formigas podem agir como veiculadoras de ECN multi-

resistentes aos antimicrobianos e produtores de biofilme, e, ainda, aponta para o risco da

disseminação de microrganismos patogênicos por esse inseto no ambiente hospitalar.

PALAVRAS-CHAVE: Formigas, Ambiente Hospitalar, Estafilococos coagulase-negativos

(ECN).

ABSTRACT In a hospital environment, these bacteria can be spread by insects such as ants, which are

characterized by high adaptability to the urban environment. Staphylococcus is a leading

cause of hospital infection. In Europe, Latin America, USA and Canada, the group of

coagulase negative staphylococci (CoNS) is the second leading cause of these infections,

according to SENTRY (antimicrobial surveillance program- EUA). In this study, we

investigated the potential of ants (Hymenoptera: Formicidae) as vehicle mechanics of

Staphylococcus bacteria in a public hospital, in Natal-RN. The ants were collected, day and

night, from June 2007 to may 2008, in the following sectors: hospitals, laundry, kitchen,

blood bank. The ants were identified according to the identification key of Bolton, 1997.

For the analysis of staphylococci, the ants were incubated in broth Tryptic Soy Broth (TSB)

for 24 hours at 35 º C and then incubated on Mannitol Salt Agar. The typical colonies of

staphylococci incubated for 24 hours at 35 ° C in Tryptic Soy Agar for the characterization

tests (Gram stain, catalase, susceptibility to bacitracin and free coagulase). The

identification of CoNS was performed through biochemical tests: susceptibility to

novobiocin, growth under anaerobic conditions, presence of urease, the ornithine

decarboxylation and acid production from the sugars mannose, maltose, trehalose, mannitol

and xylose. The antimicrobial susceptibility examined by disk-diffusion technique. The

technique of Polymerase Chain Reaction was used to confirm the presence of mecA gene

and the ability to produce biofilm was verified by testing in vitro using polystyrene inert

surface, in samples of resistant staphylococci. Among 440 ants, 85 (19.1%) were carrying

coagulase-negative staphylococci (CoNS) of the species Staphylococcus saprophyticus

(17), Staphylococcus epidermidis (15), Staphylococcus xylosus (13), Staphylococcus

hominis hominis (10), Staphylococcus lugdunensis (10), Staphylococcus warneri (6),

Staphylococcus cohnii urealyticum (5), Staphylococcus haemolyticus (3), Staphylococcus

simulans (3), Staphylococcus cohnii cohnii (2), and Staphylococcus capitis (1). No

Staphylococcus aureus was found. Among the isolates, 30.58% showed resistance to

erythromycin. Two samples of CoNS (2.35%), obtained from the ant Tapinoma

melanocephalum collected in the post-surgical female ward, S. Hominis hominis and S.

lugdunensis harbored the mecA gene and were resistant to multiple antibiotics, and the

specie S. hominis hominis even showed to be a biofilm producer. This study proves that

ants act as carriers of multidrug-resistant coagulase-negative Staphylococci and biofilm

producers and points to the risk of the spreading of pathogenic microorganisms by this

insect in the hospital environment.

KEY WORDS: Ants, Hospital enfironment, Coagulase-negative staphylococci (CoNS).

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Espécies de formigas (Formicidae) presentes nas coletas. A) Tapinoma

melanocephalum (Fabricius); B) Paratrechina longicornis (Latrielle);

C) Crematogaster victima (Smith); D) Solenopsis globularia (Smith) e

E) Camponotus vittatus Forel.

9

FIGURA 2 Distribuição das espécies de formigas segundo os meses pesquisados. 53

FIGURA 3 Distribuição das espécies de formigas segundo os turnos 54

FIGURA 4 Distribuição das espécies de formigas por setor do hospital. 55

FIGURA 5 Amostras de Staphylococcus coagulase negativos resistentes aos

antibióticos, oxacilina (1µg) e cefoxitina (30µg). A) Amostra 3ES4D

apresentando halo de inibição de 5mm para oxacilina e 16mm para

cefoxitina. B) Amostra 11ES2D apresentando halo de inibição de

11mm para cefoxitina e nenhuma formação de halo de inibição para

oxacilina.

57

FIGURA 6 Produção da proteína PBP2a nas amostras de S. hominis hominis

(3ES4D) e S. lugdunensis (11ES2D).

58

FIGURA 7 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para as amostras de ECN

multirresistentes. Coluna 1: Marcador de peso molecular; Coluna 2:

Controle + (S. aureus 9393); Coluna 3: S. hominis hominis (3ES4D); S.

lugdunensis (11ES2D); Coluna 5: Controle negativo (S. epidermidis

ATCC12228).

59

FIGURA 8 Produção de Biofilme. 1A,B,C - ausência de amostras; 1D,E,F -

Staphylococcus pyogenes 75194 (amostra controle não produtora de

biofilme); 2A,B - S. epidermidis 70d (amostra controle produtora de

biofilme); 2C,D - Staphylococcus hominis hominis (amostra 3ES4D);

2E,F – Staphylococcus lugdunensis (amostra 11ES2D).

59

FIGURA 9 Distribuição dos tipos de bactérias segundo os meses pesquisados. 60

FIGURA 10 Distribuição dos tipos de bactérias por setor do hospital. 61

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Modelo para identificação de Staphylococcus coagulase-

negativo segundo Kloos & Bannerman (1999).

42

TABELA 2 Distribuição das espécies de formigas no hospital. 52

TABELA 3 Distribuição das espécies de formigas segundo os meses

pesquisados.

53

LISTA DE ABREVIATURAS

ECN Estafilococos Coagulase-Negativo

SENTRY Programa de vigilância antimicrobiana- EUA

MRSA Staphylococcus aureus resistente à meticilina

PBP Proteína de ligação à penicilina

PBP2a Proteína de ligação à penicilina 2a

SSP1 e SSP2 Proteína da superfície de Staphylococcus1 e 2.

AtlE Autolisina E

BAP Proteína Biofilme Associada

PS/A Polissacarídeo capsular/adesina

AAP Proteína Associada de Acumulação

PIA Adesina Polissacarídica Intercelular

HUOL Hospital Universitário Onofre Lopes

SUS Sistema Único de Saúde

UFC Unidade Formadora de Colônia

TSB Caldo tríptico de soja

TSA Agar tríptico de soja

ATCC Coleção Norte-Americana de Culturas

CLSI Instituto de Padronização Clínica e Laboratorial

DNA Ácido Desoxirribonucléico

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

EDTA Ácido Etilodiaminotetracético Dissódico

TBE Tris-borato-EDTA

DOc Densidade óptica do Crescimento bacteriano

CoNS Staphylococcus coagulase-negativo

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1 1.1 Caracterização das formigas urbanas 4 1.1.1 Tapinoma melanocephalum (Fabricius, 1793) 5 1.1.2 Paratrechina longicornis (Latreille, 1802) 6 1.1.3 Outras formigas urbanas 7 1.2 Formigas como disseminadoras de bactérias 10 1.3 Caracterização do gênero Staphylococcus 12 1.3.1 Estafilococos coagulase-negativo (ECN) 15 1.3.1.1 Caracterização da espécie Staphylococcus epidermidis 16 1.3.1.2 Caracterização da espécie Staphylococcus lugdunensis 18 1.3.1.3 Caracterização da espécie Staphylococcus saprophyticus 21 1.3.1.4 Outras espécies de Estafilococos coagulase-negativo (ECN) 23 1.3.2 Resistência aos antimicrobianos 26 1.3.3 Produção de Biofilme 30 2. OBJETIVOS 35 2.1 Objetivo Geral 35 2.2 Objetivos Específicos 35 3. METODOLOGIA 36 3.1 Locais de coleta e realização do estudo 36 3.2 Coleta e armazenamento das formigas 37 3.2.1 Identificação das formigas 38 3.3 Análise da presença de bactérias do gênero Staphylococcus 38 3.3.1 Caracterização do Gênero Staphylococcus 40 3.3.1.1 Susceptibilidade à Bacitracina 40 3.3.1.2 Prova da Catalase 41 3.3.1.3 Prova da Coagulase Livre 41 3.3.2 Caracterização das espécies do grupo Staphylococcus coagulase-negativo 42 3.3.2.1 Resistência à novobiocina 43 3.3.2.2 Produção da enzima urease 43 3.3.2.3 Descarboxilação da Ornitina 44 3.3.2.4 Crescimento em anaerobiose 44 3.3.2.5 Teste da hidrólise de L-pirrolidonil-β-naftilamida (PYR) 45 3.3.2.6 Produção de ácidos a partir da utilização de açúcares 45

3.4 Perfil de Susceptibilidade aos antimicrobianos 46 3.4.1 Teste de difusão de meticilina em agar 46 3.5 Detecção da produção de PBP2a (proteína de ligação à penicilina 2a) 47 3.6 Detecção do gene Meca 48 3.6.1 Extração do DNA total 48 3.6.2 Reação da PCR 49 3.6.3 Eletroforese 50 3.7 Detecção da produção de Biofilme 50 3.8 Análise dos dados 51 4. RESULTADOS 52 4.1 Coleta e identificação das formigas 52 4.2 Fatores abióticos e a ocorrência de formigas 53 4.3 Identificação dos Staphylococcus coletados 56 5. DISCUSSÃO 62 6. CONCLUSÃO 67 7. REFERÊNCIAS 69 Artigo 1 92

1. INTRODUÇÃO:

Segundo o IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística), 81,19% da

população brasileira está localizada no meio urbano (IBGE, 2000), e a falta de políticas

públicas que venham a mitigar os problemas de saúde e ambientais faz com que as pragas

urbanas venham crescendo nas grandes cidades. A disponibilidade de abrigo e alimento

gera proliferação de diversas espécies sinantrópicas (OLIVEIRA & CAMPOS-FARINHA,

2005; PRADO et al., 2002).

Dentre os insetos sinantrópicos, as formigas se caracterizam como eussociais,

pertencentes à ordem Hymenoptera, família Formicidae, com mais de 11.000 espécies

identificadas em todo o mundo (BROWN JUNIOR et al., 2000), sendo mais de 2.000

presentes no Brasil. Em geral, as formigas são benéficas, contribuindo para ciclagem de

nutrientes, aeração do solo, polinização, dispersão de sementes de algumas plantas e

também participam da cadeia alimentar (BUENO et al., 2004), porém, das espécies que

ocorrem no Brasil, 20 a 30 são consideradas pragas urbanas (BUENO, 2003).

Os problemas ocasionados pelas formigas no meio urbano vão desde a sua

proliferação em prédios recém construídos, em construção ou mal conservados, com falhas

na estrutura arquitetônica, permitindo que possam nidificar e procurar o alimento nas áreas

externas (ZARZUELA et al., 2002); infestações em aparelhos eletrônicos, devido ao

tamanho reduzido, têm o acesso facilitado, construindo ninhos onde ficam protegidas e

aquecidas, além da grande atração à corrente elétrica, cujo motivo não se sabe. Os prejuízos

se agravam quando da ocorrência em centrais telefônicas, sistemas elétricos, escritórios,

museus, fábricas de alimentos, restaurantes, entre outras (SILVA & LOECK, 1999;

SOARES et al., 2006)

Além de todos esses possíveis danos, no que se refere aos problemas de saúde

pública e relação com o meio ambiente, alguns gêneros de formigas, tais como Wasmannia,

Labidus, Eciton, Crematogaster e subfamíla Ponerinae, podem picar dolorosamente

(MALASPINA, 2002). A espécie Solenopsis invicta possui um aguilhão no abdome no

qual injeta um veneno que pode ocasionar o aparecimento de lesões purulentas,

acompanhadas de prurido ou até mesmo reações sistêmicas, tais como edema laringeal e

hipotensão (KEMP, 2000).

As formigas ainda podem atuar como vetoras de microrganismos prejudiciais ao

homem, o que pode ser agravado em um ambiente hospitalar, devido aos riscos de

transmissão desses microrganismos a diversos setores do hospital, contaminando

instrumentos cirúrgicos, aparelhos, roupas de cama, como lençóis, além de alimentos e

medicamentos (BEATSON, 1972; ZARZUELA et al., 2002; LISE et al., 2006; PEÇANHA,

2000).

Esses insetos podem veicular mecanicamente mais de 20 espécies de fungos,

incluindo os gêneros Aspergillus e Candida, causadores de infecção nos pulmões, pele e

mucosas (PANTOJA et al., 2009), podem carrear ovos de nematódeos, como Ascaris

lumbricoides (VILLANI et al., 2008) e também bactérias. Um estudo realizado na região

sudeste mostrou que as formigas podem carrear mais de 80 bactérias potencialmente

patogênicas (PEÇANHA, 2000), alguns dos gêneros mais encontrados são: Staphylococcus,

ao qual dependendo da espécie, pode causar desde faringites e infecções urinárias, até

septicemia; Enterococcus, sendo um dos principais agentes causadores de infecções nas

vias urinárias, nos pulmões, no sistema nervoso central, na pele e tecido celular subcutâneo,

sendo comuns em ambientes domiciliares e hospitalares; e a espécie Pseudomonas

aeruginosa que se caracteriza como um agente causador de infecções no trato respiratório

inferior, em feridas superficiais na pele e no trato urinário (TRABULSI & ALTERTHUM,

2005).

1.1 Caracterização das formigas urbanas:

O sucesso na adaptação e colonização do meio urbano por algumas espécies de

formigas tem sido bastante documentado e visto com preocupação por setores de vigilância

e controle de pragas de alguns países (AKRE & HANSEN, 1990; COLLINGWOOD et al.,

1997; CHOE et al., 2009). Essas espécies fazem parte de um grupo de formigas chamadas

“andarilhas” (“tramp ants”), as quais possuem uma série de características ecológicas e

biológicas que favorecem sua dispersão no meio urbano (HÖLLDOBLER & WILSON,

1990). Essas características incluem a formação de sociedades unicoloniais, as quais não há

limites bem definidos entre suas colônias; ninhos propensos à migração; operárias

monomórficas e de tamanho reduzido; os ninhos contêm múltiplas rainhas funcionais e não

apresentam agressão intraespecífica, porém são agressivas frente a outras espécies de

formigas (HÖLLDOBLER & WILSON, 1990).

Em estudo publicado recentemente na Colômbia, Tapinoma melanocephalum

(Fabricius) e Paratrechina longicornis (Latreille) são apontadas como as formigas urbanas

mais importantes (ULLOA-CHACÓN & JARAMILLO, 2003). No Brasil, essas duas

espécies também são bastante citadas, juntamente às espécies do gênero Camponotus,

Crematogaster, Solenopsis (BUENO, 2003; LUNA et al., 2004; SOARES et al., 2006).

1.1.1 Tapinoma melanocephalum (Fabricius, 1793):

Tapinoma melanocephalum (Fabricius, 1793), conhecida como formiga fantasma, é

mundialmente distribuída, sendo difícil determinar precisamente sua origem, porém os

pesquisadores acreditam que tenha vindo das regiões tropicais do continente africano

(OSBORNE et al., 1995). É uma espécie que necessita de umidade e altas temperaturas,

estando espalhada nas regiões tropicais e mesmo nas subtropicais, onde provavelmente foi

levada pelo comércio e migração, e encontrou em cozinhas, banheiros, hospitais e

restaurantes as condições climáticas ideais para o seu estabelecimento (ESPADALER &

ESPEJO, 2002).

É uma espécie de tamanho pequeno, quando comparada às demais formigas

distribuídas no ambiente urbano, possui entre 1,3-1,5 mm, possui duas tonalidades de cor,

com o gaster, antenas e pernas na tonalidade amarelada à transparente, contrastando com a

cabeça e tórax bem escuros (Figura 1.A). Quanto ao forrageio, T. melanocephalum se

adapta com facilidade aos itens da alimentação humana, no entanto foi observada uma

preferência por doces (SMITH, 1965). Alimenta-se de larvas de besouros (Coleoptera),

borboletas (Lepidoptera) e, na Venezuela, verificou-se que essa espécie é um predador

primário dos ovos do barbeiro Rhodnius prolixus, causador da doença de Chagas

(OSBORNE et al., 1995; GOMEZ-NUNEZ, 1971).

As colônias são altamente adaptadas e com múltiplas rainhas e se caracterizam pela

mobilidade, se instalando em ambientes transitórios tais como, embaixo de escombros,

restos de madeira apodrecida, azulejos ou dentro de outras estruturas. Oster & Wilson

(1978) observaram que as colônias podem se partir em subunidades, ocupando diferentes

lugares, mas mantendo suas operárias movendo-se entre elas.

Dois relatos do avanço dessa espécie foram descritos (ESPADALER & ESPEJO,

2002; CHOE et al., 2009). A primeira coleta dessa espécie em Barcelona ocorreu em 2002,

T. melanocephalum foi encontrada em apartamentos de vários andares, próximos a uma

indústria de processamento de alimentos. Foram achados ninhos principalmente nas

cozinhas e nos banheiros e desde 1999, os moradores relatavam a presença dessa espécie

nesses locais. Em uma investigação acerca dos hábitos dos moradores, verificou-se que

alguns deles costumavam viajar para países de clima tropical do continente africano, o que

poderia explicar a origem dessa infestação (ESPADALER & ESPEJO, 2002). Choe et al.

(2009), relataram pela primeira vez a presença de T. melanocephalum em Seul, também em

residências.

1.1.2 Paratrechina longicornis (Latreille, 1802):

Paratrechina longicornis (Latreille, 1802) é conhecida como formiga louca, devido

a sua trajetória aparentemente sem senso de direção. É mundialmente distribuída e tem sua

origem desconhecida, entretanto acredita-se que pode ser asiática ou africana (SMITH,

1965). Está presente em regiões tropicais e subtropicais, onde se instalam em lugares

aquecidos como estufas e residências. Embora seja uma espécie relevante no contexto dos

insetos urbanos, existem ainda poucos estudos acerca da biologia dessa espécie nas regiões

tropicais (FOX et al., 2007).

Possui todo o corpo com coloração marrom escuro, quase preto, com pernas

alongadas e possui cerca de 3,5 mm (Figura 1.B). São poligínicas e podem construir ninhos

tanto em ambientes secos, quanto úmidos, como por exemplo, caixas de inspeção de

esgoto, gás e rede elétrica, em cavidades de paredes e telhados, sob piso e em jardins. Além

das residências, já foram encontradas infestações em hospitais e indústrias de

medicamentos (SOLIS et al., 2007). Alimentam-se de aracnídeos e insetos (dípteros,

himenópteros e ortópteros) mortos, além de itens da alimentação humana, principalmente

líquidos adocicados (SOLIS et al., 2008). Nessa espécie também já foi observada a

associação com homópteros, no qual as operárias coletavam o líquido adocicado produzido

por este inseto (TRAGER, 1984).

1.1.3 Outras formigas urbanas:

As espécies do gênero Crematogaster são caracterizadas por apresentar um gáster

pontiagudo posteriormente, em formato cordiforme e de coloração entre amarelo e marrom

(LONGINO, 2003). As espécies desse gênero são cosmopolitas e amplamente distribuídas

na região neotropical. Um estudo recentemente realizado no Brasil encontrou 27 espécies

espalhadas por vários estados brasileiros, no Nordeste foram encontradas quatro espécies

desse gênero, uma delas a Crematogaster victima (Smith, 1858) (Figura 1.C)

(FELIZARDO & HARADA, 2007).

O gênero Solenopsis possui duas espécies bastante conhecidas, uma delas é a

Solenopsis invicta Buren, 1972, conhecida como formiga de fogo, que possui um aguilhão

no final do gáster no qual injeta uma substância que pode causar sérias reações alérgicas e a

outra espécie bastante conhecida é a formiga “lava-pés”, Solenopsis saevissima (Smith,

1855), cujas operárias possuem de 3-6 mm (PITTS, et al., 2005) (Figura 1.D).

As espécies do gênero Camponotus são conhecidas como formigas carpinteiras, são

maiores que as formigas anteriormente descritas, as operárias possuem entre 6-15 mm e sua

coloração varia do amarelo ao marrom (Figura 1.E). Algumas espécies desse gênero têm o

hábito de fazer ninhos em edificações em reforma ou em construção, forros e até aparelhos

eletrônicos (BICHO et al., 2007). Estima-se que esse gênero, juntamente com o gênero

Solenopsis contempla várias espécies presentes no ambiente urbano, porém são pouco

estudados nos países neotropicais (CHÁCON DE ULLOA, 2003).

FIGURA 1: Espécies de formigas (Formicidae) presentes nas coletas. A) Tapinoma

melanocephalum (Fabricius); B) Paratrechina longicornis (Latrielle); C)

Crematogaster victima (Smith); D) Solenopsis globularia (Smith) e E)

Camponotus vittatus Forel.

1.2 Formigas como disseminadoras de bactérias:

O primeiro relato de formigas carreando bactérias no ambiente hospitalar foi

descrito ainda nos anos 70 por Beatson (1972), em uma pesquisa em hospitais da Inglaterra,

onde encontrou mais de 15 espécies de bactérias sendo disseminadas por uma única espécie

de formiga, Monomorium pharaonis. Dentre os patógenos encontrados, houve ocorrência

de bactérias do gênero Staphylococcus, sendo carreadas em cozinhas e Unidades de Terapia

Intensiva (UTIs) dos hospitais pesquisados.

Desde então, o fato despertou o interesse pela investigação das infestações por

formigas e seu potencial veiculador de patógenos no ambiente hospitalar. Outros estudos

foram realizados em seguida, em hospitais na Inglaterra, no Chile e no Brasil (EDWARDS

& BACKER, 1981; IPINZA-REGLA et al., 1981; FOWLER et al., 1993). Nesses

trabalhos, algumas espécies de formigas se destacam na atuação como veiculadoras de

bactérias, tais como as espécies Monomorium pharaonis, Tapinoma melanocephalum,

Paratrechina longicornis, Brachymyrmex sp, Camponotus sp., Solenopsis saevissima e

Crematogaster sp.

No início dos anos 90, houve um relato da ocorrência de formigas carregando

bactérias em unidades pediátricas em hospitais em Trinidad (CHADEE & MAITRE, 1990).

Nessa pesquisa foram encontradas quatro espécies de formigas: Monomorium pharaonis,

Tapinoma sessile, Solenopsis sp. e Solenopsis molestus carreando sete tipos de agentes

conhecidos como patógenos humanos.

No Brasil, o primeiro estudo foi realizado em hospitais da região sudeste (FOWLER

et al., 1993), onde foram encontradas 14 espécies de formigas, carreando várias espécies

conhecidas como patógenos humanos, incluindo o gênero Staphylococcus. Nesse estudo, os

autores destacam a alta prevalência de Tapinoma melanocephalum no ambiente hospitalar e

o potencial da espécie como carreadora de bactérias.

Em outro estudo, realizado por Peçanha (2000), no conjunto hospitalar de Sorocaba,

estado de São Paulo, as bactérias carreadas pelas formigas das espécies Tapinoma

melanocephalum, Paratrechina longicornis, Monomorium pharaonis, Brachymyrmex sp.,

Monomorium floricola, Camponotus sp. e Crematogaster sp. apresentaram níveis de

resistência quantitativamente e qualitativamente mais elevados que as bactérias recuperadas

do ambiente e ainda 66,7% das cepas isoladas eram Gram-negativas, indicando as formigas

como possíveis vias de dispersão de patógenos e de bactérias contendo genes de resistência,

dentro do ambiente hospitalar.

Recentemente, dois estudos realizados no Brasil também analisaram o perfil de

sensibilidade aos antimicrobianos de bactérias carreadas por formigas (MOREIRA et al.,

2005; RODOVALHO et al., 2007). No primeiro estudo, realizado no Rio de Janeiro, os

autores encontraram quatro espécies de formigas, sendo T. melanocephalum a mais

prevalente, carreando 21 espécies diferentes patógenos humanos, dentre esses

Acinetobacter, Streptococcus, Gemella e Klebsiella foram os gêneros de bactérias que

apresentaram resistência aos antibióticos testados. Em um segundo estudo, mais recente,

Rodovalho e colaboradores (2007), encontraram até mesmo Staphylococcus aureus

resistente a meticilina (MRSA), sendo carreados por formigas. Ainda não foram realizados

estudos que comprovem por meio de testes moleculares a presença de genes de resistência a

antimicrobianos ou responsáveis pela capacidade de formação de biofilmes nessas bactérias

carreadas por formigas, o que poderia dificultar o combate desses agentes causadores de

doenças no ambiente hospitalar.

1.3 Caracterização do gênero Staphylococcus:

Staphylococcus é derivado do grego, staphylé, que significa cacho de uva, referente

ao aspecto do grupo, quando visto ao microscópio. O gênero Staphylococcus pertence à

família Staphylococcaceae e compreende bactérias Gram-positivas, que apesar de não

apresentarem uma membrana externa, como as bactérias Gram-negativas, o qual confere

proteção contra o sistema imune e constitui uma barreira à entrada de algumas substâncias,

são compostas por uma parede formada por peptidoglicano mais espessa, quando

comparada às bactérias Gram-negativas, sendo essa parede menos susceptível a quebras

(TRABULSI & ALTERTHUM, 2005), permitindo uma maior proteção à impactos físicos

do ambiente. Possuem forma de cocos, com cerca de 1µm de diâmetro, são imóveis e

anaeróbias facultativas, ou seja, sobrevivem bem em presença de oxigênio, no ambiente ou

na pele do indivíduo colonizado e, ainda em regiões onde a concentração desse gás é

menor, como no interior do indivíduo. Crescem bem em elevadas concentrações de cloreto

de sódio (10%), resistindo à dessecação, podem conservar-se no ambiente por um período

maior. Crescem bem em temperaturas entre 35-37°C, semelhantes às condições do

organismo humano, também podem crescer em temperaturas entre 18°C a 40°C, o que

permite que também sobrevivam bem no ambiente. Produzem a enzima catalase, o que

confere a capacidade de degradação do peróxido de hidrogênio produzido pelo sistema

imune do hospedeiro contra as bactérias, facilitando a sobrevivência no indivíduo, e são

resistentes à bacitracina (0,04). Segundo Kloss & Bannerman (1999), o gênero possui 33

espécies descritas e entre estas, Staphylococcus aureus e as várias espécies do grupo dos

estafilococos coagulase-negativos (ECN).

Os estafilococos estão presentes na microbiota de indivíduos saudáveis e são

encontradas na pele, em diversas partes do corpo, fossas nasais e orofaringe de humanos

(LECLERCQ, 2009), são também encontrados em animais (STEPANOVÌC et al., 2001;

VAN DUIJKEREN et al., 2004). Os Staphylococcus são divididos em dois grupos

conforme a produção da enzima coagulase. Quando positivos podem ser identificados como

S. aureus, se provenientes de isolados clínicos humanos, e quando negativos como

pertencentes ao grupo dos ECN (KLOOS & BANNERMAN, 1999).

S. aureus é reconhecida como um dos patógenos humanos mais importantes,

responsável desde infecções na pele, até bacteremias, infecções no sistema nervoso central

e respiratório, trato urinário e infecções relacionadas a dispositivos implantáveis e

procedimentos cirúrgicos. A maioria das amostras de S. aureus é considerada patógeno

oportunista, que pode colonizar indivíduos sem sintomas, por curto ou longo período,

causando doenças quando da diminuição da resposta imune do indivíduo (OLIVEIRA et

al., 2002).

Os estafilococos coagulase-negativos (ECN) estão presentes normalmente na pele

humana e em mucosas que inclui boca e garganta e algumas espécies habitam locais

específicos, como trato urinário, região inguinal e perianal. As manifestações clínicas das

infecções por ECN são geralmente mais sutis e sem fulminantes sinais de infecção, quando

comparadas às provocadas por S. aureus. Essas infecções estão sempre relacionadas ao

comprometimento do sistema imune do hospedeiro, uso de dispositivos médicos ou

procedimentos invasivos e à capacidade de formação de biofilme, que permite à instalação

e permanência dessas bactérias em polímeros (PIETTE & VERSCHARAEGEN, 2009).

Esta prova, para a produção da coagulase, é rotineiramente usada para a

identificação dos Staphylococcus, todavia para a distinção entre as espécies do grupo dos

ECN é necessária uma série de provas bioquímicas, quase sempre não realizadas, que

poderiam direcionar melhor o tratamento quando envolvidas em infecções. Na realidade,

apesar de vários artigos tratarem da combinação de métodos para a identificação dos ECN,

esses métodos ainda são muito difíceis de executar, pelo grande número de provas e

representam um custo maior ao laboratório, devido aos vários reagentes requeridos para os

testes (ANTUNES et al., 2008; DE PAULIS et al, 2003; IEVEN et al., 1995).

Estão disponíveis comercialmente alguns testes para a identificação dos ECN, como

por exemplo o API ID 32 Staph, Vitek GPICard e o Vitek 2 System (bioMérieux, França),

American Microscan Pos Combo (Dade Behring, Alemanha) e Staph-Zym (Rosco,

Dinamarca). Esses testes possuem a vantagem de diminuir o tempo de identificação desses

microrganismos e a necessidade de preparo e execução de inúmeras baterias de testes, mas

além de representarem um alto custo financeiro, apresentam muitas vezes falhas na

identificação precisa das espécies de ECN (LIGOZZI et al., 2002).

As espécies de ECN mais freqüentemente isoladas de material clínico humano são

Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus saprophyticus,

Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus warneri,

Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus simulans,

Staphylococcus capitis e Staphylococcus xylosus (KLOOS & BANNERMAN, 1999).

ECN são os patógenos mais comumente relatados em infecções na corrente

sangüínea em pacientes em unidades de terapia intensiva nos EUA, representando 37,3%

das infecções e S. aureus 12,6% (NNIS, 1999). No Brasil, os ECN são o segundo patógeno

presente em infecções na corrente sangüínea (SADER et al., 2001). Essas taxas ilustram a

necessidade de pesquisas envolvendo esse grupo dos Staphylococcus, bem menos estudado

que a espécie S. aureus, para que se possa melhorar o conhecimento acerca da biologia,

mecanismos de patogenicidade e transmissão dessas bactérias, a fim de se desenvolver

formas mais eficientes de identificação e combate desses microrganismos.

1.3.1 Estafilococos coagulase-negativos (ECN):

Os ECN são identificados na rotina laboratorial pela não produção da enzima

coagulase, diferentemente dos S. aureus. Essa enzima confere a capacidade de coagulação

do plasma, protegendo a célula bacteriana contra o sistema imune do hospedeiro

(TRABULSI & ALTERTHUM, 2005). O grupo dos ECN possui várias espécies

causadoras de infecções em humanos e a variedade de espécies encontradas em amostras de

pacientes vem crescendo. As principais espécies causadoras de infecções em humanos

serão descritas nos itens a seguir.

1.3.1.1 Caracterização da espécie Staphylococcus epidermidis:

Staphylococcus epidermidis é o mais freqüente membro do grupo dos estafilococos

coagulase-negativo (ECN). Evans (1916) descreveu a espécie a partir de uma amostra

isolada do leite. Hugh & Ellis, em 1968, já recomendavam a prova da coagulase para a

diferenciação entre S. aureus e essa espécie. S. epidermidis é uma espécie muito relatada,

devido à alta prevalência em infecções em humanos. São responsáveis por 50% a 70% das

infecções em indivíduos fazendo uso de cateter e outros processos invasivos, acredita-se

que tal fato se deva a capacidade de formação de biofilme (ROGERS et al., 2009).

Na formação do biofilme, S. epidermidis tem nos genes icaADBC o potencial de

produção do polissacarídeo PIA (Polysaccharide Intercellular Adhesin), que protege às

células bacterianas da ação do sistema imune do hospedeiro e na proteína associada de

acumulação (Aap) o auxílio na fase de acumulação das células. Em acréscimo, as adesinas

conferem a aderência às proteínas do hospedeiro e aos biomateriais. As principais adesinas

encontradas em S. epidermidis são a Fbe(SdrG), ligante de fibrinogênio; a GehD e SdrF,

que se ligam ao colágeno; Ebp, que se liga à elastina e AtlE, que se liga a vitronectina na

matriz extracelular. Outras adesinas são capazes de se ligar a poliestireno (Ssp-1 e Ssp-2)

(ROGERS et al., 2009).

S. epidermidis também possui outros fatores de virulência como a produção de

peptidoglicanas, ácidos lipoteicóicos e modulinas fenol-solúveis que atuam na modulação

do sistema imune propiciando a dispersão do biofilme; a produção de exoenzimas e

proteases que provocam injúrias e destruição dos tecidos do hospedeiro; lipases que

auxiliam na colonização da pele e de lesões e algumas amostras também podem apresentar

δ-toxina, uma hemolisina que forma poros na membrana dos eritrócitos e outras células do

hospedeiro, levando à lise celular (ROGERS et al., 2009).

A maioria das infecções relacionadas a procedimentos invasivos em pacientes

submetidos à hemodiálise está relacionada ao gênero Staphylococcus e bacteremias

representam a maior causa de mortalidade em pacientes renais crônicos submetidos à

hemodiálise (HOEN et al., 1998). Abdulrahman et al. (2002) em estudo na Arábia Saudita,

com 109 infecções caudadas por cateter vascular em pacientes submetidos à hemodiálise,

encontrou que 49,5% das infecções foram causadas por S. epidermidis, já S. aureus,

sensíveis e resistentes à meticilina, somaram 18,4% das infecções. A maioria desses

pacientes apresentou, entre outras condições de risco, diabetes mellitus, lúpus eritematoso

sistêmico, doença crônica no fígado, recente ou longo período de terapia com esteróides e

pacientes com múltiplos mielomas.

A literatura relata ECN tradicionalmente como causadores de endocardites pela

implantação de prótese valvular, resultando em abscessos cardíacos, insuficiência cardíaca

e morte, mostrando-se tão agressiva quanto em endocardites causadas por S. aureus

(LALANI et al., 2006). Karchmer e colaboradores (1983) analisaram 75 episódios de

endocardites causadas por S. epidermidis e em 70,6% as cepas apresentaram resistência à

meticilina e em 55 pacientes provocaram invasão de tecidos e destruição da válvula. S.

epidermidis é também o maior causador de endocardites por implante de marca-passo e na

maioria dessas amostras são encontrados genes que mediam a formação de biofilme, como

fbe, atlE e ica (KLUG et al., 2003). Endocardite em válvula nativa também pode ser

causada por essa espécie. Chu et al. (2004) encontrou que dentre os 99 casos desse tipo de

endocardite causada por ECN, 85% das amostras foram identificadas como S. epidermidis.

A maioria das sepses de início tardio em neonatos é atribuída à S. epidermidis

(EFTEKHAR & SPEERT, 2009). A produção de biofilme é um importante fator na

ocorrência desse quadro. Em três estudos feitos em unidades de terapia intensiva (UTI)

neonatais na Inglaterra, no Canadá e na Noruega respectivamente, 40% das amostras foram

positivas para a presença do operon ica, 68,3% dos S. epidermidis também albergavam esse

operon e 71,09% o gene icaD (EFTEKHAR & SPEERT, 2009; KLINGENBERG et al.,

2007; DE SILVA et al., 2002).

Infecções na corrente sanguínea em pacientes adultos podem ser provocadas por

essa espécie. Estudos realizados com amostras de sangue de pacientes com septicemias

causadas por ECN apresentam S. epidermidis com prevalência entre 40% e 75% das

amostras isoladas (KOKSAL et al., 2007; BOISSON et al., 2002).

A endoftalmite pós-operatória é comumente associada à infecção por S.

epidermidis, que é a bactéria normalmente encontrada nos olhos e nos sacos conjuntivais

(ABU EL-ASRAR et al., 2000). Na implantação de lentes intraoculares ocorre infecção,

mesmo com o uso de soluções de antibióticos durante o procedimento cirúrgico. Nesses

casos, geralmente são cepas resistentes sendo necessária a remoção do implante, antes da

erradicação da infecção (KADRY et al., 2009).

1.3.1.2 Caracterização da espécie Staphylococcus lugdunensis:

A espécie Staphylococcus lugdunensis surgiu como nova espécie do grupo

estafilococos coagulase-negativos (ECN) em 1988, quando foi pela primeira vez descrita, a

partir de isolados clínicos humanos. Nesse estudo, S. lugdunensis foi isolada de onze

amostras de diversas origens, como abscessos, nódulo linfático, dreno torácico, intra-

uterina e a maioria de sangue (FRENEY et al., 1988). No nome da espécie S. lugdunensis,

“lugdunensis” significa, aquele que nasceu em “Lugdunum”, que é o nome em latim dado à

cidade de Lyon, na França, onde os primeiros organismos dessa espécie foram isolados.

Assim como outras espécies do grupo dos estafilococos coagulase-negativos (ECN),

essa espécie também faz parte da flora da pele de indivíduos saudáveis (HERCHLINE et

al., 1991). Estudos mostram que essa espécie é preferencialmente uma colonizadora da

região inguinal (VAN DER MEE-MARQUET et al., 2003; LUDLAM & PHILLIPS, 1989)

e é raramente encontrada na cavidade nasal de pacientes submetidos à hemodiálise

(KOZIOL-MONTEWKA et al., 2006).

Apesar de pertencer ao grupo dos ECN, S. lugdunensis possui um alto grau de

virulência e as infecções causadas por essa espécie se assemelham à severidade das

infecções causadas por S. aureus (FRANK et al., 2008). Esse fato acontece devido aos

diversos fatores de virulência que possui, tais como a produção de nuclease termoestável

(DNase), um glicocálix extracelular, lipases, hemolisinas e também são capazes de se ligar

à proteínas humanas como o colágeno e a fibronectina (ROGERS et al., 2009; HEBERT,

1990; MITCHELL et al., 2004). A produção de fator Clumping em S. lugdunensis, também

presente em S. aureus, que provoca a aglutinação das células bacterianas quando

mergulhadas em plasma, é questionada em estudos que mostram que nem todos os isolados

em plasma humano dessa espécie são fator Clumping positivo e algumas amostras, mesmo

quando testadas em plasma humano e em diferentes kits comerciais ainda continuam

apresentando resultado negativo para produção de fator Clumping (FLEURETTE et al.,

1989; PAULSSON et al., 1993).

Outra particularidade ao qual também pode se atribuir a virulência dessa espécie, é a

capacidade de produção da proteína de ligação ao fator de von Willebrand. O fator de von

Willebrand evita a degradação do fator VIII da coagulação e age na adesão das plaquetas ao

endotélio. A proteína de ligação a esse fator não permite a ligação entre às plaquetas e o

endotélio lesado (NILSSON et al., 2004).

S. lugdunensis possui características bioquímicas que permitem sua identificação,

como a susceptibilidade à novobiocina, a descarboxilação da ornitina, o crescimento em

anaerobiose e a produção de ácidos a partir da manose, maltose e trealose, porém não

produção de ácidos em meio contendo xilose (BANNERMAN & PEACOCK, 2007).

A endocardite por essa espécie é bastante agressiva. Os relatos ocorridos quase

sempre são seguidos de procedimentos cirúrgicos ou lesão na região pélvica (PATEL et al.,

2000). Dentre os ECN, S. lugdunensis é a segunda espécie que mais causa endocardite de

válvula nativa, sendo responsável por 44% dos casos (JONES et al., 2002). Em estudo feito

por Anguera et al. (2005), com amostras de S. lugdunensis, as taxas de mortalidade por

endocardite em prótese valvular foram de 78%, o índice por endocardite de válvula nativa

foi de 42% dos casos e de 14% entre as endocardites associadas a implantes de marcapasso.

Infecções em ossos e articulações, sobretudo relacionadas a próteses têm sido

relatadas em S. lugdunensis (SAMPATHKUMAR et al., 2000; WEIGHTMAN et al., 2000;

ARCIOLA et al., 2006). Sampathkumar et al. (2000) constatou que infecções em próteses

localizadas em articulações podem ocorrer a partir de 6 semanas e em até 4 anos após o

implante.

Outros tipos de infecções por S. lugdunensis também já foram relatadas, porém bem

menos freqüentes, como meningites, infecções no sistema nervoso central, infecções no

trato urinário, peritonites, bacteremia, infecções na corrente sangüínea e na cavidade oral

(KAABIA et al., 2002;GIANELLA et al., 2006; CASANOVA-ROMAN et al., 2004;

SCHNITZLER et al., 1998; EBRIGHT et al., 2004; PFALLER et al., 1999; YOU et al.,

1999).

1.3.1.3 Caracterização da espécie Staphylococcus saprophyticus:

Fairbrother (1940) sugeriu o termo Staphylococcus saprophyticus para designar

alguns isolados de humanos e animais, coagulase negativos e não fermentadores de

manitol. Shaw et al. (1951), após análise de amostras de estafilococos das mais variadas

origens (humana, animal, alimento e coleções de culturas de laboratórios), reclassificou

como S. saprophyticus algumas amostras com características semelhantes às amostras do

estudo anterior, corroborando com àquele trabalho.

Essa espécie é resistente à novobiocina (5µg), produz a enzima urease, cresce em

anaerobiose e produz ácidos a partir da maltose e da trealose. São parte da flora comensal

da pele e mucosa urogenital humana (ISHIHARA et al., 2001). Sendo uma freqüente causa

de infecções no trato urinário, principalmente em mulheres (WIDERSTRÖM et al., 2007;

JORDAN et al., 1980; LATHAM et al., 1983; HOVELIUS & MARDH, 1984).

Com o objetivo de elucidar a uropatogênese dessa espécie, em 2005 foi seqüenciado

o genoma completo de S. saprophyticus (ATCC 15305). Os resultados revelaram que é

muito menor a presença de fatores de virulência, quando comparadas à S. epidermidis e S.

aureus, porém o genoma de S. saprophyticus revela dois mecanismos principais de

virulência: a presença de proteínas que se aderem à parede das células e um sistema de

transporte relacionado à concentração de íons na urina (KURODA et al., 2005). Uma

dessas proteínas é uma adesina específica UafA (uro-adherence factor A adesin), que está

associada a aderência às células do trato urinário, proteínas da família dos NRAMP

(natural-resistance-associated macrophage protein), que estão envolvidas no transporte de

metais divalentes, outras famílias de proteínas envolvidas na tolerância alcalina, captando

prótons que auxiliam na homeostasia do pH intracelular (KURODA et al., 2005).

A formação de biofilme também é um fator de virulência dessa espécie. Hjelm &

Lundell-Etherden (1991) constataram a produção de slime em 30% das amostras de S.

saprophyticus coletadas da urina de pacientes com infecção. Também relataram que quanto

maior a concentração de uréia na urina, maior a produção de slime, porém fatores como a

concentração de ferro, pH ou a presença de hormônios sexuais não exerceram efeito nessa

produção.

A razão pela qual ocorre um grande número de infecções no trato urinário de

mulheres é desconhecida. Acredita-se que por S. saprophyticus estar muito distribuído no

ecossistema, a contaminação de diversos gêneros alimentícios possa propiciar a

colonização do trato gastrointestinal, que por sua vez parece estar associada à colonização

retal, vaginal e uretral (ORDEN-MARTINÉZ et al., 2008). Infecções no trato urinário em

mulheres têm sido mais documentadas no hemisfério norte, onde a prevalência de

colonização e infecção é freqüente durante o final do verão e no outono (WIDERSTRÖM

et al., 2007). Não há um consenso entre a média de idade das mulheres infectadas, porém a

maioria dos estudos relata o intervalo entre 13 e 40 anos (GUPTA et al., 1999;

SCHNEIDER & RILEY, 1996). Infecções no trato urinário também podem ocorrer em

crianças e em homens de todas as idades (ABRAHAMSSON et al., 1993; HOVELIUS et

al., 1984), além de pacientes com insuficiência renal crônica (GILBERT, 2006).

Embora menos freqüente, quando comparada a outras espécies de estafilococos

coagulase-negativo, pode ser encontrada em amostras de sangue de pacientes com

septicemia (KOKSAL et al., 2007). Choi et al. (2006), em estudo com S. saprophyticus

encontrados em amostras de sangue, observou que 30% dos isolados provocaram

bacteremia, resultando em morte de um dos pacientes que já apresentava leucemia mielóide

crônica.

S. saprophyticus pode, em casos mais raros, causar septicemia, pielonefrite e

endocardite (GLIMAKER et al., 1988; HEDMAN & RINGERTZ, 1991; GARDUNO et

al., 2005).

1.3.1.4. Outras espécies de ECN:

Staphylococcus hominis, juntamente com as espécies Staphylococcus warneri,

Staphylococcus capitis e Staphylococcus simulans foram descritas em 1975, a partir de

amostras da pele de indivíduos saudáveis na América do norte (KLOOS & SCHLEIFER,

1975). Essa espécie possui duas subsespécies de importância médica: Staphylococcus

hominis subespécie hominis e S. hominis subespécie novobiosepticus. As duas espécies

podem ser diferenciadas pela resistência à novobiocina apresentada somente por S. hominis

novobiosepticus e a produção de ácidos a partir da trealose apresentada somente por S.

hominis hominis. Não são espécies comumente implicadas em infecções graves, S. hominis

novobiosepticos já foi isolada da corrente sanguínea (KLOSS et al., 1998; PALAZZO et al.,

2008). Chaves et al. (2005) encontrou bacteremia causada por S. hominis novobiosepticos

em 13 neonatos em unidade de terapia intensiva (UTI), porém com nenhuma morte

relacionada à essa bactéria. A espécie S. hominis hominis é citada como presente em

amostras de cultura de sangue (KOKSAL et al., 2007; DE SILVA et al., 2002) e em

pacientes em contínua diálise peritonial (MONSEN et al., 2000). Em 2005, houve o

primeiro relato, nos EUA, dessa espécie causando endoftalmite (IYER et al., 2005). No ano

seguinte, apareceu, na Espanha, uma paciente de 73 anos, sem histórico de internação

hospitalar, apresentando dor na parte dorsal da área glútea esquerda, onde se constataram

piomiosite, sacroleíte e espondilodiscite, três inflamações que acometem a coluna vertebral

(RODRÍGUÉZ & MUÑOZ, 2006). Apesar de não ser freqüente, um estudo com 99 casos

de endocardites de válvula nativa, relatou apenas 4 desses casos como sendo provocados

por S. hominis (CHU et al., 2004). Em outro relato de endocardite por S. hominis foi

descrito recentemente, em uma paciente de meia idade que se recuperou, sendo tratada com

vancomicina (CUNHA et al., 2007).

S. haemolyticus é a segunda espécie dentre os ECN de maior importância clínica,

atrás apenas dos S. epidermidis (RODRÍGUEZ-ARANDA et al., 2009). O genoma dessa

espécie foi completamente seqüenciado em 2005, foram encontradas algumas seqüências

específicas de genes que conferem adaptação ao organismo do hospedeiro e a variações

ambientais, como, por exemplo, regiões no genoma responsáveis pelo transporte em

cápsula de aminotransferases e reguladores transcricionais (TAKEUCHI et al., 2005). Foi a

primeira espécie dentre os ECN a apresentar resistência à glicopeptídeos e à nova classe de

antibióticos oxazolidinonas (linezolide), sendo descrita como uma espécie associada à

resistência aos antimicrobianos (BIVASCO et al., 2000; TARAZONA et al., 2007; NUNES

et al., 2005). Causam bacteremias, sendo encontradas no sangue de indivíduos

imunocomprometidos que fizeram uso de cateter (NUNES et al., 2005; RODRÍGUEZ-

ARANDA et al., 2009). Foram isoladas de infecções no trato urinário e de endocardites por

prótese de válvula, porém sempre associados à pacientes hospitalizados ou indivíduos de

idade avançada (SHIGEMURA et al., 2009; SENINING et al., 2000).

O nome da espécie S. schleiferi é uma homenagem ao pesquisador Karl Heinz

Schleifer, pela contribuição dada à taxonomia dos organismos Gram-positivos. No primeiro

relato que descreveu a espécie, em 1988, S. schleiferi foi encontrada em doze amostras

clínicas de humanos isoladas de cateter jugular, dreno cranial, urina, lesões na pele e a

maioria do sangue (FRENEY et al., 1988). Dentre outras características, são produtoras da

enzima catalase, resistentes à bacitratina, sensíveis à novobiocina, não descarboxilam a

ornitina, não hidrolisa uréia, produzem ácidos a partir da manose e não produzem ácidos a

partir da maltose, manitol e xilose (BANNERMAN & PEACOCK, 2007). Ainda nesse

primeiro relato foram encontrados S. schleiferi possuindo antígenos, a4a5 e i1i2, presentes

também em S. aureus (FRENEY et al., 1988). É citada em muitos estudos de interesse

veterinário, como causador de otitis e pioderma (MAY et al., 2005). Em humanos, essa

espécie pode estar presente na flora periaxilar (CÉLARD et al., 1997). O primeiro relato de

endocardite ocorreu somente em 1999 (LEUNG et al., 1999), osteomielites, em sangue de

pacientes com septicemia, infecções no trato urinário e em implantes ortopédicos, causadas

por essa espécie tem sido relatadas (CALVO et al., 2000; KOKSAL et al., 2007).

S. warneri, S. capitis e S. simulans são espécies que podem ser a causa de

endocardites (STÖLLBERGER et al., 2006; NALMAS et al., 2008; LAMAS & EYKYN,

2000). Em 2004, foram publicados dois relados de discite e spondilodiscite, doenças que

geram inflamações na coluna vertebral, tendo como causa infecção por S. warneri

(ANNOUN et al., 2004). Cone et al. (2005) relata um caso de endocardite causada por S.

capitis e compara-os com mais 13 casos anteriores acometendo pacientes entre 35 e 80

anos, dois deles resultaram em morte por complicações neurológicas e por falência múltipla

dos órgãos.

S. cohnii é uma espécie pouco relatada na literatura relacionada a infecções em

humanos. Szewczyk et al. (2004) encontrou S. cohnii ssp. cohnii e S. cohnii ssp. urealyticus

com múltipla resistência à antibióticos colonizando o ambiente de uma unidade de terapia

intensiva (UTI) de um hospital pediátrico, porém não foi relatado nenhum caso de infecção

por essa espécie. Recentemente, houve o relato de quatro pacientes na Grécia com

bacteremia, no qual a cultura de sangue apresentou resultado positivo para S. cohnii

resistente à linezolide, porém nenhum deles com morte relacionada à infecção por essa

espécie (PETINAKI et al., 2009).

Apesar de já ter sido relatada em cultura de sangue de pacientes com bacteremia

(KOKSAL et al., 2007), S. xylosus não tem sido documentada em infecções humanas

graves, sendo uma espécie mais estudada por suas contribuições na indústria de alimentos

(SØNDERGAARD & STAHNKE, 2002).

1.3.2. Resistência aos antimicrobianos:

O primeiro experimento usando penicilina como agente antimicrobiano aconteceu

ainda em 1940, quando um indivíduo acometido por uma celulite foi tratado com uma

preparação experimental de penicilina, porém essa não promoveu um efeito de cura como

esperado, o paciente faleceu e nas amostras foram encontrados S. aureus e Streptococcus

pyogenes (ABRAHAM et al., 1941). Após esse fato, em 1944 a penicilina foi difundida

para o combate às infecções, porém já em 1946, entre os S. aureus, 6% já apresentavam

resistência ao antibiótico, pela produção de β-lactamase. Essa resistência aumentou e hoje

entre 80-90% das amostras de infecções por S. aureus são resistentes à penicilina

(HENWOOD et al., 2000).

As penicilinas são antibióticos β-lactâmicos, que interferem nas ligações cruzadas

entre as cadeias de peptidoglicano, que acontece na região externa à membrana

citoplasmática. Além disso, as penicilinas ao se ligarem à PBP (proteína de ligação à

penicilina), na parede externa da membrana citoplasmática, também são capazes de

provocar um aumento na atividade das autolisinas, gerando um desequilíbrio na síntese da

camada de peptidoglicano, resultando na lise da célula bacteriana (TRABULSI &

ALTERTHUM, 2005). O gene blaZ codifica uma enzima, a β-lactamase, que é capaz de

hidrolisar o anel β-lactâmico da penicilina, tornando-a inativa. Essa enzima confere a

resistência à penicilina, que pode ter sido adquirida através da aquisição de um plasmídio

albergando o gene blaZ. Na síntese da β-lactamase atuam dois reguladores, o anti-repressor

blaR1 e o repressor blaI, que codificam as respectivas proteínas BlaR1 e BlaI. Na ausência

do antibiótico, BlaI está ligada a região operadora impedindo a expressão de blaZ. Já na

presença de penicilina, a proteína transmembrânica BlaR1 sofre autoclivagem e atua como

protease, clivando BlaI em fragmentos inativos permitindo a transcrição de blaZ e a

produção da enzima β-lactamase (LOWRY, 2003).

Outros antibióticos naturais foram desenvolvidos após a penicilina, como a

eritromicina, a tetraciclina e o cloranfenicol, porém todos seguidos da emergência da

resistência a essas novas alternativas, sempre mediadas por plasmídeos e transposons

(LACEY, 1984). No início dos anos 60 surgiram as cefalosporinas, desenvolvidas pela

estabilidade à β-lactamase dos estafilococos e essa descoberta promoveu o surgimento de

outros antibióticos por via sintética, como a meticilina, nafcilina e oxacilinas, que por

possuírem uma maior quantidade do grupo 6’acetil, impedem estericamente o ataque ao

anel β-lactâmico (LIVERMORE, 2000).

Apesar do sucesso no uso dos antibióticos sintéticos, ainda no início dos anos 60

surgiu o primeiro caso de resistência à meticilina (JEVONS, 1961) e no final dos anos 60 a

expansão dessa resistência já era uma preocupação (BENNER & KAYSER, 1968). A

resistência à meticilina é condicionada à expressão do gene mecA, esse gene faz parte de

um elemento genético SCCmec (Staphylococcal Chromosome Cassette mec), cassete

cromossômico estafilocócico mec, que é um elemento genético móvel que pode conter

estruturas genéticas que conferem resistência à antibióticos que não β-lactâmicos, como por

exemplo os elementos Tn554 e pT181 que codificam respectivamente resistência à

ampicilina e à tetraciclina (WIELDERS et al., 2002; ITO & HIRAMATSU, 1998). O gene

mecA codifica a proteína PBP2a, que é determinante na resistência à meticilina. Os

Staphylococcus normalmente sintetizam proteínas que possuem afinidade à β-lactâmicos,

conhecidas como PBP, proteína de ligação à penicilina, sendo essas a PBP1, PBP2, PBP3,

PBP3’ e PBP4, que exercem função de transpeptidases na fase final da síntese do

peptidoglicano. As amostras resistentes à meticilina possuem uma proteína a mais, a PBP2a

que tem baixa afinidade aos β-lactâmicos e permitem que a bactéria sobreviva em meio à

esse agente antimicrobiano. A regulação da expressão do gene do gene mecA é semelhante

a regulação do gene blaZ, que confere resistência à penicilina, porém seus genes

reguladores são mecR1 e mecI, que codificam as proteínas MecR1 e MecI (CHAMBERS,

1997).

O antibióticos oxacilina e cefoxitina são dois antibióticos recomendados pelo CLSI

(Clinical and Laboratory Standards Institute), que padroniza procedimentos clínicos e

laboratoriais, como indicadores fenotípicos da resistência mediada pelo gene mecA

(SWENSON et al., 2005). Em estudo realizado pelo SENTRY-USA (Antimicrobial

Surveillance Program), programa de vigilância antimicrobiana, com amostras oriundas de

diversos sítios de infecção e coletadas em hospitais brasileiros, a taxa de resistência à

oxacilina em S. aureus foi de 34% e em Staphylococcus do grupo coagulase-negativo foi de

80.1% (SADER et al., 2001).

Logo após o surgimento da resistência à penicilina, nos anos 50, foi isolado o

primeiro antibiótico glicopeptídeo, a vancomicina (BIVASCO et al., 2000). Esse antibiótico

surgiu como uma alternativa à terapia contra os Staphylococcus, porém seu uso foi

desencorajado devido à toxicidade e reações adversas por sua administração, sendo

substituída pela meticilina e pelas cefalosporinas (WOODLEY & HALL, 1961).

O interesse no uso da vancomicina voltou no final da década de 70 quando da

emergência de infecções hospitalares em pacientes imunocomprometidos e o crescimento

das infecções causadas por bactérias gram-positivas, aliadas à melhoria na formulação da

vancomicina, tornando-a menos tóxica (BIVASCO et al., 2000). Também nesse mesmo

período, a indústria farmacêutica desenvolveu um novo antibiótico glicopeptídeo, a

teicoplanina (PARENTI et al., 1978). Entretanto, no final da década seguinte houve o

primeiro caso de resistência à classe dos glicopeptídeos, foi uma resistência à teicoplanina,

em uma amostra de Staphylococcus haemolyticus (WILSON & O’HARE, 1986). No final

da década de 90, a primeira cepa de S. aureus com susceptibilidade reduzida à vancomicina

foi encontrada no Japão (HIRAMATSU et al., 1997).

Em Staphylococcus, a resistência a glicopeptídeos é condicionada principalmente

pela presença do gene vanA, que induz a resistência em várias concentrações de

vancomicina e teicoplanina e do gene vanB, que induz a resistência em várias

concentrações apenas de vancomicina. Essa resistência é gerada pela modificação na

síntese do dipeptídeo D-Ala D-Ala para D-Ala D-Lac, na qual o aminoácido terminal D-

alanina é modificado para D-lactato, o que gera a síntese de peptidioglicano com baixa

afinidade por glicopeptídeos (PÉRICHON & COURVALIN, 2004; SRINIVASAN et al.,

2002).

O percentual de susceptibilidade do grupo ECN a diversos antibióticos foi

recentemente analisada em um estudo que fez um comparativo entre as pesquisas mais

recentes sobre esses índices, realizadas em diversos continentes (PIETTE &

VERSCHRAEGEN, 2009). Na Espanha, por exemplo, houve um aumento progressivo da

resistência à ciprofloxacina e à eritromicina, que aumentaram de 1% e 41% em 1986, para

45% e 63% em 2002 (CUEVAS et al., 2004). Por outro lado, na Europa em geral, Ásia,

Austrália e América Latina, as taxas de susceptibilidade à fluoquinolonas estão entre 42-

47%, à eritromicina entre 30-34%, à clindamicina entre 60-61%, à sulfametoxazol-

trimetoprim entre 59-62% e a gentamicina entre 71-58% (JONES et al., 2007a; JONES et

al., 2007b). Todos os estudos exibiram índices entre 65-100% de susceptibilidade à

teicoplanina e entre 98-100% de susceptibilidade à vancomicina e linezolide (PIETTE &

VERSCHRAEGEN, 2009).

1.3.3. Produção de Biofilme:

Eiff e colaboradores (2002) definem a produção de biofilme como a habilidade de

uma espécie de colonizar a superfície de um polímero pela formação de várias camadas de

células. Mah & O’Toole (2001) definem o biofilme como a união de microrganismos

unicelulares na formação de uma comunidade aderida à superfície de um sólido e revestida

de uma matriz polissacarídica. Essa capacidade de colonização de materiais poliméricos

pode originar a instalação de patógenos em instrumentos médicos dos mais diversos, como

cateteres e dispositivos implantáveis, que por sua vez podem contaminar pacientes que se

submetem a procedimentos invasivos (ARAÚJO et al., 2006).

A formação do biofilme é um fator de virulência que tem um enorme impacto nas

infecções hospitalares. Uma pesquisa realizada em hospitais dos EUA mostrou que os

biofilmes estão associados a 65% das infecções nosocomiais e que o tratamento dessas

infecções pela formação do biofilme gera um ônus de mais de um bilhão de dólares

anualmente a esse país (MAH & O’TOOLE, 2001; ARCHIBALD & GAYNES, 1997).

A produção de biofilme por estafilococos coagulase-negativo (ECN) tem sido

bastante pesquisada, sobretudo em Staphylococcus epidermidis e todos os estudos definem

duas etapas de formação: a primeira é a etapa de adesão das células bacterianas à superfície

do polímero e a segunda a etapa de acumulação, onde ocorre a formação de múltiplas

camadas de células bacterianas (HEILMANN et al., 1996; GÖTZ, 2002; HALL-

STOODLEY & STOODLEY, 2005).

Na fase inicial, a aderência do microrganismo envolve interações físico-químicas,

como as forças de van der Waal’s e as interações hidrofóbicas, condicionadas às

características da superfície da célula bacteriana e à natureza do material polimérico.

Proteínas bacterianas da superfície auxiliam nessa fase inicial de aderência (EIFF et al.,

2002). SSP-1, proteína da superfície de Staphylococcus, (280kDa) e o produto de sua

degradação SSP-2 (250kDa), formam saliências na superfície da célula bacteriana e estão

relacionadas à adesão de S. epidermidis à poliestireno (VEENSTRA et al., 1996). AtlE é

uma proteína capaz de se conectar às superfícies inertes e apesar de seus mecanismos ainda

não estarem esclarecidos. Entretanto, uma mutação nesse proteína gera uma redução na

aderência primária ao poliestireno e uma redução in vitro da ligação à vitronectina,

glicoproteína humana presente no plasma e na matriz extracelular, e em adição a bactéria

não é capaz de produzir biofilme (HEILMANN et al., 1997).

Além dessas proteínas, ainda atuam na fase inicial de aderência a Bap, proteína

biofilme-associada, e o PS/A, polissacarídeo adesina-capsular. Em estafilococos que

albergam o gene bap (proteína Bap) é observada uma alta capacidade de aderência e forte

produção de biofilme e em um experimento realizado com ratos, a proteína Bap foi

importante na persistência da infecção (CUCARELLA et al., 2001). PS/A também tem sido

associada à aderência inicial, em um estudo realizado com endocardites em coelhos, foi

observado que um mutante deficiente para a produção de PS/A foi menos virulento

(SHIRO et al., 1994).

A segunda etapa de formação do biofilme envolve a multiplicação, adesão

intercelular e a formação de um material viscoso protetor. Nessa etapa, AAP (proteína

associada à acumulação) e a PIA (adesina polissacarídica intercelular) se destacam. A PIA

é um componente mais presente na composição do slime (do inglês, substância viscosa),

que é uma substância amorfa que realiza uma frouxa ligação entre as células de

estafilococos e as envolve, tendo como função a proteção daquelas células contra as

mudanças do ambiente (GÖTZ, 2002; CAFISO et al., 2004).

A PIA consiste em duas formas de polissacarídeos, um maior composto de linear β-

1,6- glucosaminoglicanas contendo resíduos N-acetilados, que formam 80% da estrutura da

PIA e um composto menor estruturalmente relacionado ao polissacarídeo maior, porém

com baixo conteúdo de resíduos N-acetilados (MACK et al., 1996). O operon ica codifica

as proteínas da biossíntese da PIA e é formado pelo gene icaR (regulatório) e pelos genes

icaADBC (biossíntese). As proteínas icaA, C e D estão localizadas em uma fração da

membrana, enquanto icaB está localizada no sobrenadante, no meio extracelular. Na

biossíntese da PIA, icaA e icaD sintetizam oligômeros derivados de N-acetilglicosamina até

alcançar um tamanho de 10 à 20 resíduos, icaC alonga a cadeia de oligômeros formados e

icaB está provavelmente relacionada às reações de desacetilação (GÖTZ, 2002).

Na etapa de acumulação do biofilme também é essencial a proteína extracelular

AAP (proteína associada à acumulação), essa proteína ancora a PIA à superfície das células

bacterianas. Em estudo feito com mutantes de S. epidermidis negativos para a produção de

AAP, verificou-se uma diminuição no crescimento acumulativo das células na superfície de

um polímero (HUSSIAN et al., 1997).

Outros componentes se configuram como importantes no processo de interação às

substâncias do hospedeiro. O ácido teicóico está envolvido na aderência de S. epidermidis à

fibronectina (HUSSAIN et al., 2001), assim como a proteína Aas que também se liga à

fibronectina e à células uroepiteliais em S. saprophyticus, a proteína Fbe atua na ligação de

S. epidermidis à β cadeia de fibrinogênio e outras substâncias, muitas delas ainda com

função desconhecida (EIFF et al., 2002).

No estágio final da formação do biofilme, as múltiplas células bacterianas são

capazes de escapar ou pela interrupção na produção do slime ou pela falta de condições do

ambiente que permitam a manutenção dessa estrutura, o que possibilita a migração dessas

células a novos sítios de colonização (MAH & O’TOOLE, 2001).

A adaptabilidade e resistência do biofilme às diversas condições do ambiente tem

sido alvo de pesquisas. Os mecanismos de resistência incluem barreiras físicas e químicas à

difusão e penetração dos antimicrobianos no biofilme e, a ativação de diferentes respostas à

presença de algumas substâncias no ambiente (MAH & O’TOOLE, 2001).

A limitação do transporte de antibióticos gerada por componentes do biofilme é

variável. Dunne et al. (1993), verificou que o biofilme formado S. epidermidis permitiu a

difusão de rifampicina e vancomicina, mostrando que esses antibióticos podiam penetrar

eficientemente. Recentemente, um estudo avaliou o impacto de 6 diferentes antibióticos, na

aderência de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis à dispositivos médicos.

Rifampicina, daptomicina e linezolida foram eficazes na velocidade de erradicação da

aderência dos estafilococos, quando comparadas com vancomicina, gentamicina e

ceftriazona (EDMISTON et al., 2006).

A influência de diversas substâncias na formação de biofilme também tem sido

avaliada. Em pesquisa realizada com S. saprophyticus, foi constatado que quanto maior a

presença de uréia, maior a produção de slime (HJELM & LUNDELL-ETHERDEN, 1991).

Knoblock et al. (2001), observou que em S. epidermidis, o estresse gerado pela presença de

etanol no ambiente, induz a síntese de PIA (adesina polissacarídica intercelular), porém o

estresse gerado por NaCl, nem sempre estimula a síntese desse polissacarídeo, estando

condicionado à presença de alguns genes. Em 2009, em amostras de S. epidermidis isoladas

de neonatos, foi verificado um pico na formação de biofilme quando do acréscimo de 1%

de glicose no meio de cultura, mostrando que a glicose pode estimular esse processo

(EFTEKHAR & SPEERT, 2009).

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar a presença de formigas no Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL), na

Cidade do Natal /RN, e verificar o seu potencial como veiculadoras mecânicas de

bactérias do gênero Staphylococcus.

2.2 Objetivos Específicos

Determinar os gêneros e espécies de formigas presentes em ambiente do hospital

pesquisado;

Correlacionar a ocorrência das espécies de formigas com fatores abióticos locais ao

longo do ano, tais como temperatura, umidade do ar e pluviosidade;

Isolar e identificar bactérias do gênero Staphylococcus carreadas por formigas;

Analisar o perfil de sensibilidade dos Staphylococcus encontrados à diferentes

antibióticos.

Analisar as amostras que apresentarem resistência a múltiplos antimicrobianos

quanto à capacidade de produção de biofilme.

3 METODOLOGIA

3.1. Locais de coleta e realização do estudo:

O estudo foi realizado na Cidade do Natal, no Hospital Universitário Onofre Lopes

(HUOL) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, onde as formigas foram

coletadas e armazenadas. O HUOL é um hospital geral de referência terciária no Estado do

Rio Grande do Norte que se integrou ao Sistema Único de Saúde (SUS) em 1988. Desde

então, além de suas funções típicas de Hospital Escola, desenvolve ações relevantes na

saúde pública estadual. Possui 200 leitos com diversas especialidades e uma UTI. Em 2008,

obteve em torno de 4.000 pacientes internados ao longo do ano. Os setores do hospital

avaliados nessa pesquisa foram: enfermarias (masculina e feminina), banco de sangue,

cozinha e lavanderia.

A análise entomológica dos exemplares coletados foi realizada no Laboratório de

Entomologia (LABENT), do Departamento de Microbiologia e Parasitologia - UFRN, com

a colaboração do Laboratório de Mirmecologia, localizado no Centro de Pesquisa do

Cacau, Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira - CEPEC/CEPLAC, Itabuna-

BA.

No LabMed, Laboratório de Bacteriologia Médica, localizado no Departamento de

Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN,

foram realizadas as análises microbiológicas. Este laboratório trabalhou em colaboração

com o Laboratório de Controle Biológico, da Faculdade de Farmácia, da Universidade

Federal Fluminense – UFF, Niterói-RJ.

3.2. Coleta e armazenamento das formigas:

As coletas ocorreram entre junho de 2007 e maio de 2008, a cada quinze dias, sendo

duas coletas por mês, uma coleta diurna no horário de 12h às 14h (SILVA & LOECK,

1999) e outra noturna, entre 18h e 30min e 20h, no intuito de se coletar espécies outras que

não estivessem presentes na coleta diurna.

Essas coletas foram manuais, com o uso de pedaços de algodão, pinças e luvas

estéreis. Nós adaptamos pedaços de algodão de aproximadamente 4 cm de diâmetro, que

foram embalados individualmente e esterilizados em autoclave, 15 min à 120°C,

juntamente com pinças. Após encontrar uma formiga, um pedaço de algodão era

desembalado e manuseado com uso de luvas estéreis. A captura foi realizada através de um

leve toque do algodão sobre o dorso da formiga, ao qual ficava aprisionada às fibras do

algodão, que era cuidadosamente dobrado e colocado em uma placa de Petri, previamente

esterilizada e identificada de acordo com o setor do hospital onde ocorreu a coleta. As

pinças estéreis também foram utilizadas em algumas situações onde o algodão não foi tão

eficiente. (BEATSON, 1972; MOREIRA et al., 2005). Ao serem coletadas, as formigas

eram levadas ao Laboratório de Microbiologia do HUOL, para que, com auxílio de um bico

de Bunsen e pinça estéril, fossem imersas em tubos contendo 3 mL de Caldo de caseína de

soja (TSB) (Difco, Sparks, MD, USA) suplementado com 7,5% de NaCl, que eram

tampados e levados ao Laboratório de Bacteriologia Médica (LabMed-UFRN), para as

análises microbiológicas.

A fim de se analisar a existência de alguma relação entre a presença de

determinadas espécies de formigas e variáveis climáticas, foram feitas, a cada coleta,

medições da temperatura e da umidade relativa do ar, por local de coleta do hospital

pesquisado.

3.2.1. Identificação das formigas:

Após 24h da coleta, as formigas foram removidas e armazenadas em álcool 70%

para posterior identificação.

No Laboratório de Entomologia (LABENT-UFRN), as formigas foram identificadas

com o auxílio de estereomicroscópio (Olympus®), em aumento de 40X. As chaves

sistemáticas utilizadas foram as de Bolton (1994) e Loureiro & Queiroz (1990).

Alguns exemplares foram enviados ao Laboratório de Mirmecologia

(CEPEC/CEPLAC) para a identificação ou confirmação da identificação em nível de

espécie.

3.3. Análise da presença de bactérias do gênero Staphylococcus:

Depois de imersas em caldo TSB (Difco, Sparks, MD, USA), suplementado com

7,5% de NaCl, as formigas foram levadas ao Laboratório de Bacteriologia Médica

(LabMed-UFRN) e colocadas em estufa bacteriológica por 24h à 35°C. Após esse período,

o crescimento bacteriano foi analisado como positivo pela presença de turvação no caldo, já

os tubos que não apresentaram turvação durante esse período permaneceram na estufa por

mais 24h, para confirmação do resultado e, quando da ausência de turvação após mais esse

período, descarte da amostra.

As amostras que apresentaram turvação, com auxílio de alça bacteriológica, tiveram

uma alçada retirada do caldo e semeada por esgotamento em placas de Petri contendo meio

seletivo Ágar Manitol Salgado (Merck, Germany), que é um meio seletivo utilizado no

isolamento de bactérias do gênero Staphylococcus, devido à quantidade elevada de sal em

sua composição. Essas placas foram incubadas em estufa bacteriológica por 24h em

temperatura de 35°C.

Havendo crescimento bacteriano no meio seletivo, retirou-se uma unidade

formadora de colônia (UFC) que, por esgotamento, foi semeada em placas de Petri

contendo Agar de caseína de soja (TSA) (Difco, Sparks, MD, USA) e foram incubadas por

24h, em estufa bacteriologia a 35°C. Após esse período, foram realizados esfregaços

corados pela técnica de coloração de Gram para análise do aspecto morfotintorial das

amostras. Aquelas que se apresentaram como cocos Gram-positivos, foram submetidas a

testes para a caracterização do gênero Staphylococcus.

3.3.1. Caracterização do Gênero Staphylococcus:

As amostras presuntivas do gênero Staphylococcus, foram submetidas a testes para

a diferenciação dessas amostras dos gêneros Micrococcus e Streptococcus, que consiste na

análise da susceptibilidade à bacitracina (0,04 UI) e na prova para a produção da enzima

catalase. A produção da enzima coagulase livre também foi analisada para diferenciação

entre Staphylococcus aureus e o grupo dos ECN (JANDA et al., 2001).

3.3.1.1. Susceptibilidade à Bacitracina:

Uma suspensão de 24 horas do microrganismo foi padronizada para uma turvação

equivalente a 0,5 da escala de MacFarland e, então, semeada de forma confluente sobre a

superfície de placas contendo ágar Mueller Hinton (Difco, Sparks, MD, USA), com o

auxílio de um “swab” estéril. Em seguida, aplicou-se um disco impregnado com bacitracina

(0,04 UI) sobre o inóculo. Após incubação por 24 horas a 35°C, foi verificada a presença

ou não de halo de inibição. Os estafilococos resistentes à bacitracina não apresentam halo

de inibição ou produzem um halo ≤ 10 mm (HOLT et al., 1994). A cepa de Staphylococcus

aureus ATCC 25923 foi utilizada como padrão para esta prova.

3.3.1.2. Prova da Catalase:

Este teste consiste em por sobre uma lâmina de microscopia uma gota de peróxido

de hidrogênio (água oxigenada a 3%) e algumas colônias do cultivo de 24 h em TSA

(Difco, Sparks, MD, USA). Os cultivos que demonstraram uma rápida e sustentada

produção de bolhas de gás ou efervescência foram considerados positivos para essa prova.

O controle positivo desse teste foi feito através de uma cepa padrão de Staphylococcus

aureus ATCC 25923.

3.3.1.3. Prova da Coagulase Livre:

Para a realização deste teste, uma porção de um cultivo de 24 horas em TSA (Difco,

Sparks, MD, USA) foi inoculada em tubo de ensaio contendo 0,4 mL (400 microlitros) de

plasma de coelho (Newprov Produtos para Laboratório Ltda, Paraná, Brasil) diluído em

solução salina estéril a 0,85%, de acordo com as orientações do fabricante. A seguir o tubo

foi incubado a 35°C em estufa bacteriológica e, durante os intervalos de 2, 4, 6, 8 e 24

horas foram feitas leituras deste teste. As amostras que apresentaram formação de coágulo

durante esse intervalo são presuntivas da espécie Staphylococcus aureus, já aquelas que

apresentaram resultados negativos para o teste são identificadas como estafilococos

coagulase-negativo (ECN) (JANDA et al., 2001). A cepa padrão de Staphylococcus aureus

ATCC 25923 foi utilizada como controle positivo e a cepa Staphylococcus epidermidis

ATCC 12228 como controle negativo para essa prova.

3.3.2. Caracterização das espécies do grupo dos estafilococos coagulase-negativo:

A caracterização das amostras de ECN foi realizada conforme o modelo

simplificado empregado por Kloss & Bannerman (1999) (Tabela 1). Essa caracterização

fisiológica consiste nos testes mencionados abaixo.

TABELA 1: Modelo para identificação de Staphylococcus coagulase-negativo segundo

Kloos & Bannerman (1999).

Produção de ácidos a partir

de: ESPÉCIES NOV URE ORN ANAER PYR

MAL MAN XIL TM

S. epidermidis S + V + - + (+) - -

S. saprophyticus R + - + - + - - +

S. capitis capitis S - - (+) - - + - +

S. saccharolyticus S ND ND + V - (+) - -

S. capitis urealyticus S + - (+) (d) + + - +

S. warneri S ND - + - (+) - - +

S. hominis hominis S + - - - + - - V

S. hominis novobiosepticus R + - - - + - - -

S. schleiferi S - - + + - + - V

S. haemolyticus S - - (+) + + - - +

S. lugdunensis S d + + + + + - +

S. cohnii cohnii R - - (+) - (d) (d) - V

S. cohnii urealiticum R + - (+) d (+) + - +

S. xylosus R + - + d + + + +

S. simulans S + - + + (±) d - +

NOV: susceptibilidade a novobiocina; URE: produção de urease; ORN: descaboxilação da ornitina; ANAER:

crescimento em anaerobiose; PYR: produção de pirrolidonilaril-amilase; MAL: maltose; MAN: manose; TM:

trealose-manitol. +: reação positiva; (+): reação positiva tardia; - reação negativa; V: reação variável; ND: não

determinado; R: resistente; S: sensível; (d): 11% a 89% das amostras positivas. Adaptado de Kloos &

Bannerman, 1999.

3.3.2.1. Susceptibilidade à novobiocina:

Uma suspensão de 24 horas da amostra, padronizada para uma turvação equivalente

a 0,5 da escala de MacFarland em solução salina estéril a 0,85%, foi semeada de forma

confluente sobre a superfície de uma placa de Petri contendo Ágar Mueller Hinton (Difco,

Sparks, MD, USA), com auxílio de um “swab” estéril. Em seguida, foi depositado sobre o

meio de cultura um disco impregnado com 5µg de novobiocina, permanecendo incubado

por 24h, à 35ºC em estufa bacteriológica. Os microrganismos resistentes apresentaram

halos de inibição ≤ 16 mm. Como controles para esse teste foram utilizadas amostras

padrão das espécies Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305 (resistente à novobiocina)

e Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (sensível à novobiocina).

3.3.2.2. Produção da enzima urease:

Em tubos contendo 2 mL de Caldo de Uréia (Difco, Sparks, MD, USA) foram

inoculadas algumas colônias bacterianas, mantidas em aerobiose, à 35ºC, por 24h em estufa

bacteriológica. A mudança na coloração do meio de tom alaranjado para rosado é indicativo

da liberação de amônia, com alteração de pH. A amostra padrão Staphylococcus

epidermidis ATCC 12228 foi utilizada como controle positivo para o teste.

3.3.2.3. Descarboxilação da Ornitina:

Nesse teste foi adicionado à 3 mL do meio Möeller Descarboxilase (Difco, Sparks,

MD, USA) acrescido de 1% de L-ornitina, um inoculo denso da amostra. Amostras dos

estafilococos também foram inoculadas em meio Möeller Descarboxilase sem o acréscimo

do aminoácido. Esses tubos foram cobertos por uma camada de 4 mm de óleo mineral

estéril e incubados à 35ºC, por um período entre 18h e 24h. Os resultados foram

considerados positivos, quando da mudança de coloração para violeta no meio em que

continha L-ornitina. A cepa Shigella sonnei BAC 447 foi usada como controle positivo e a

cepa Staphylococcus saprophyticcus ATCC 15305 como controle negativo para o teste.

3.3.2.4. Crescimento em anaerobiose:

Amostras em suspensão de 24h foram padronizadas para uma turvação equivalente

a 0,5 da escala de MacFarland em solução salina estéril a 0,85%, sendo uma alíquota de 0,1

mL inoculada em meio Tioglicolato (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), à 35ºC, por

24h em estufa bacteriológica. Em até 5 dias, havendo crescimento bacteriano no terço

inferior da coluna de meio, a amostra é considerada como positiva para o teste. A cepa

Staphylococcus epidermidis ATCC 122280 foi usada como controle positivo para o teste.

3.3.2.5. Teste da hidrólise de L-pirrolidonil-β-naftilamida (PYR):

Discos contendo substrato PYR (Probac do Brasil, São Paulo, SP, Brasil) foram

colocados sobre um crescimento recente em Agar de caseína de soja (TSA). Após

incubação por 4h, à 35ºC uma gota do reagente PYR (fornecido pelo fabricante) foi

instilada sobre o disco. Após o intervalo de um minuto as amostras positivas apresentaram

coloração vermelho-cereja no disco e amostras negativas para hidrólise do PYR exibiram

coloração amarela. Esse teste se faz necessário na diferenciação das espécies

Staphylococcus warneri, que é negativa para o teste e Staphylococcus simulans, que é

positiva.

3.3.2.6. Produção de ácidos a partir da utilização de açúcares:

As amostras bacterianas foram inoculadas em 3 mL do meio Purple Broth (Difco,

Sparks, MD, USA) contendo 1% de maltose, manose ou xilose. Os tubos foram incubados

em banho maria à 36ºC, por 18-24h. Paralelamente, foi realizada outra prova contendo 2%

de trealose e manitol em um mesmo teste. Os testes foram considerados positivos quando

da mudança de coloração de púrpura para amarelo, devido à alteração de pH, em

conseqüência da degradação dos açúcares adicionados no meio. As cepas Staphylococcus

xylosus ATCC 25591, Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305 e Staphylococcus

epidermidis ATCC 12228 foram os controles positivos dos testes da degradação de xilose,

manose, trealose-manitol e maltose, respectivamente.

3.4. Perfil de Susceptibilidade aos antimicrobianos:

As amostras de Staphylococcus foram submetidas a testes de susceptibilidade aos

antimicrobianos. Foram testados 12 antimicrobianos através da técnica de disco-difusão,

que consiste na coleta de uma suspensão de 24 horas do microrganismo, padronizada para

uma turvação equivalente a 0,5 da escala de MacFarland em solução salina estéril a 0,85%

e, semeio de forma confluente com o auxílio de um “swab” estéril, sobre a superfície de

placas de Petri contendo Ágar Mueller Hinton (Difco, Sparks, MD, USA) que, em seguida,

recebe discos impregnados com antibióticos aplicados sobre o semeio. Após a incubação

por 24 horas a 35°C, verificou-se a presença ou não de halo de inibição e foi feita a medida

do mesmo, se presente, para posterior comparação com os parâmetros do CLSI (2008). Os

antibióticos utilizados foram: penicilina G (10U), oxalicina (1µg), cefoxitina (30µg),

vancomicina (30µg), ciprofloxacina (5µg), eritromicina (15µg), sulfametoxazol-trimetoprin

(23,75µg-1,25µg), clorafenicol (30µg), gentamicina (10µg), tetraciclina (30µg),

rifampicina (5µg) e clindamicina (2µg).

3.4.1. Teste de difusão de meticilina em agar:

As amostras que apresentaram resistência à oxalicina (1µg) e cefoxitina (30µg)

foram submetidas ao teste fenotípico para a detecção da resistência à meticilina. Nesse

teste, colônias da amostra foram inoculadas em 2 mL de TSB (Difco, Sparks, MD, USA) e

submetidas à agitação de 200 rpm, em um aparelho “shaker”, por 18h a 35°C. Após esse

período 100 µL do inóculo foram espalhados de forma confluente, com um “swab” estéril,

sob a superfície de uma placa de Petri contendo TSA acrescido de 25mg/L de meticilina.

Qualquer crescimento, após incubação entre 24h à 48h, a 35°C, foi interpretado como uma

indicação da resistência à meticilina, sendo a amostra possível portadora do gene mecA.

3.5. Detecção da produção de PBP2a (proteína de ligação à penicilina 2a):

As amostras que apresentaram resistência à meticilina, no teste fenotípico de

difusão da meticilina em agar, foram submetidas ao teste para a detecção da proteína

PBP2a, que também é produto da expressão do gene mecA, que confere resistência a esse

antibiótico. Esse teste foi realizado através do Kit Slidex MRSA detection (bioMérieux,

Marcy l'Etoile, France) e se baseia na aglutinação de partículas de látex sintéticas contendo

articorpos monoclonais contra a PBP2a.

O teste consiste nos seguintes procedimentos, como indicado pelo fabricante: Em

cultivo de 24h, a 35°C em TSA (Difco, Sparks, MD, USA), retira-se 3 alçadas contendo

várias colônias isoladas até formar uma placa que cubra todo o orifício da alça de platina

com volume de 1µL, coloca-se essas três alçadas dentro de um tubo do tipo Eppendorff,

contendo 4 gotas do reagente de extração1. Esse tubo é levado à temperatura entre 95°C e

100°C por 3 minutos e depois é retirado e deixado arrefecer em temperatura ambiente.

Após o resfriamento, é adicionada uma gota do reagente de extração 2 e o tubo é levado à

centrífuga à 3000 rpm, durante 5 minutos. Em uma placa de fundo escuro são postas 50µL

do centrifugado e adiciona-se uma gota do látex sensibilizado, após leve mistura por alguns

minutos, pode-se visualizar a formação de grumos esbranquiçados, que indica a

aglutinação, sendo a amostra positiva para a presença da PBP2a. Foi utilizada uma amostra

padrão de Staphylococcus aureus resistente à meticilina 9393.

3.6. Detecção do gene mecA:

A detecção do gene mecA foi feita através da técnica de reação em cadeia da

polimerase – PCR (OLIVEIRA & DE LENCASTRE, 2002).

3.6.1. Extração do DNA total

A extração do DNA total foi realizada como descrito por Pacheco et al., 1997 . As

amostras estocadas foram semeadas em caldo TSB e incubadas por 18 h, sob agitação, a

37ºC. A seguir, 100µL dessa cultura foi semeada, através da técnica de esgotamento, na

superfície de uma placa com TSA. Após incubação por 24 h, a 37ºC, algumas colônias

isoladas foram removidas e diluídas em 3 mL de TE para lise (1,0mL de Tris 1mM pH 7,4;

0,2mL de EDTA 1mM pH 8,0; 98,8mL de água bidestilada). A seguir, 400 µL desta

suspensão foram adicionados a 3,6 mL de água bidestilada (diluição 1:10), mediu-se o

comprimento de onda (600nm) e obteve-se o volume necessário da suspensão celular para a

fervura. O volume calculado foi transferido para um tubo para microcentrifugação e

centrifugado por 2 min a 12.000xg. O sobrenadante foi removido e o conteúdo ressuspenso

em 200µL de TE. A amostra foi fervida por 10 min e, em seguida, centrifugada por 1 min

para obtenção de sobrenadante límpido.

3.6.2. Reação da PCR:

Após a extração do DNA, foram postos em uma solução: tampão para PCR (1X)

suplementado com cloreto de magnésio (MgCl2) para uma concentração final de 4 mM, 30

pmol de cada oligonucleotídeo indiciador, 200µM de cada desoxirribonucleotídeo

trifosfatado (dNTPs), água MilliQ estéril e 5µL da preparação do DNA molde para um

volume final de 50µL. As misturas de reação foram colocadas em aparelho termociclador e

submetidas a um ciclo de 50ºC por 10min e a outro de 94ºC por 10min. A reação foi então

interrompida para a adição de 2U da Taq DNA polimerase. Após adição da enzima, foram

realizados 35 ciclos de 94ºC por 1min, 55ºC por 30 segundos e 72ºC por 30 segundos.

Os oligonucleotídeos iniciadores usados foram: 5’-AAA ATC GAT GGT AAA

GGT TGG C-3’ e 5’-AGT TCT GCA GTA CCG GAT TTG C-3’.

3.6.3. Eletroforese:

Os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a

2,0% em cuba horizontal, contendo solução tampão TBE 1X (Tris base 0,2M, ácido bórico

0,2M, e EDTA 0,5M – pH 8,0), por 30 minutos em uma corrente constante de 125V. Sendo

visualizados através de trasilumidador de luz UV, no qual a presença do gene mecA foi

visualizada pela observação de uma banda correspondente a amplificação de um

seguimento de 160pb.

3.7. Detecção da produção de Biofilme:

As amostras que apresentaram multi-resistência aos antibióticos testados foram

analisadas qualitativamente, quanto à capacidade de formação de biofilme (ARAÚJO et al.,

2006). Foram utilizadas placas para microtitulação de fundo plano, compostas de

poliestireno inerte, contendo 96 poços (Nunclon, Delta, Nunc. InterMed, Denmark). As

cepas analisadas foram semeadas por esgotamento em meio TSA e incubadas por 24h a

37ºC. Após esse período, colônias foram repicadas para tubos contendo TSB e incubadas

por 18h a 35°C com agitação. Em seguida, as culturas foram diluídas em TSB

suplementado com 1% (p/v) de glicose e em cada 4 poços aplica-se 200µL de uma mesma

cultura. Posteriormente, as placas foram incubadas por 24h a 37ºC. A densidade ótica

provocada pelo crescimento bacteriano (DOc) foi determinada em leitor ELISA a 540 nm.

Após essa leitura, a placa foi lavada 4 vezes com solução salina e as bactérias fixadas à

placa a 65ºC por 1h. Em seguida, 200µL de solução de cristal violeta para Gram foi

adicionado a cada poço, por 1 min. A placa foi lavada 2 vezes com água destilada estéril e a

água evaporada a 45ºC. Foi possível visualizar uma forte coloração lilás nos poços onde

havia amostras produtoras de biofilme, do contrário, a amostra foi considerada negativa

para a produção de biofilme.

3.8. Análise dos Dados:

Para fazer a análise dos dados desta pesquisa utilizou-se algumas técnicas

estatísticas como: cruzamentos de variáveis visando determinar informações camufladas na

pesquisa, bem como, tabelas de distribuição de freqüência, que determinam coleções de

objetos classificados de modo a mostrar o número existente em cada classe.

A correlação de Spearman, também foi utilizada para medir a intensidade da relação

entre variáveis, que neste caso, usou-se o valor observado na ordem das observações, pois

deste modo, o coeficiente da correlação não seria sensível a assimetrias na distribuição, não

exigindo, portanto, que os dados provenham de duas populações normais; também foi

utilizado o teste de Kruskal-Wallis, que incidi na comparação de grupos através de

variáveis independentes, onde a variáveis devem ser de mensuração ordinal/intervalar ou

razão e, finalizando, também houve a necessidade da utilização da técnica de análise de

correspondência, onde esta, permite explorar associações entre variáveis categóricas que

geram tabelas de contingência. E o interesse estar em verificar independência às categorias

das variáveis que formam as linhas e colunas da tabela de contingência bidimensional.

4 RESULTADOS:

4.1 Coleta e Identificação das formigas:

Foram coletadas 471 formigas nas instalações do hospital pesquisado, no período de

um ano, entre junho de 2007 e maio de 2008, sendo todas as fomigas identificadas em nível

de espécie, com exceção de 2 formigas que só puderam ser identificadas em gênero. As

formigas encontradas foram: Dorymyrmex sp. (0,4%); Camponotus vittatus Forel (3,6%);

Crematogaster victima Smith (27,8%); Paratrechina longicornis (Latreille) (21,7%);

Pheidole diligens (Smith) (6,4%); Pheidole radoszkowskii Mayr (1,3%); Solenopsis

globularia (Smith) (8,7%); Tapinoma melanocephalum (Fabricius) (30,1%).

Através de uma distribuição de freqüência verificamos que houve predominância

das espécies Crematogaster victima Smith e Paratrechina longicornis (Latreille), nas quais

corresponderam a mais que 50% do total das formigas, conforme demonstra a Tabela 2:

TABELA 2: Distribuição das espécies de formigas no hospital.

ESPÉCIES DE FORMIGAS QTD % Dorymyrmex sp. 2 0,42 Camponotus vittatus Forel 17 3,61 Crematogaster victima Smith 131 27,81 Paratrechina longicornis (Latreille) 102 21,66 Pheidole diligens (Smith) 30 6,37 Pheidole radoszkowskii Mayr 6 1,27 Solenopsis globularia (Smith) 41 8,70 Tapinoma melanocephalum (Fabricius) 142 30,15 TOTAL 471 100

4.2 Fatores abióticos e a ocorrência de formigas

Como o p-valor para as espécies de formigas foi p = 0,000, podemos concluir que

existem evidências estatísticas significantivas de uma relação entre a abundância e a

espécie de formiga com os meses pesquisados. Esse resultado mostra que existe uma

relação direta entre os meses do ano e a espécie e o números de formigas que se encontram

no hospital. A relação entre formigas e meses do ano pode ser visualizada na Tabela 3 e na

Figura 2.

TABELA 3: Distribuição das espécies de formigas segundo os meses pesquisados.

Figura 2: Distribuição das espécies de formigas segundo os meses pesquisados.

MESES ESPÉCIES DE FORMIGAS jun/07 jul/07 ago/07 Set/07 out/07 nov/07 dez/07 jan/08 fev/08 mar/08 abr/08 mai/08

TOTAL %

Dorymyrmex sp. 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 2 0,4 Camponotus vittatus Forel 3 2 4 0 1 0 1 3 0 0 3 0 17 3,6 Crematogaster victima Smith 6 7 0 11 9 12 14 25 15 8 13 11 131 27,8 Paratrechina longicornis (Latreille) 12 12 3 5 17 16 18 4 2 6 3 4 102 21,7 Pheidole diligens (Smith) 7 9 7 4 0 0 0 2 0 0 1 0 30 6,4 Pheidole radoszkowskii Mayr 0 0 0 2 2 0 1 0 0 0 1 0 6 1,3 Solenopsis globularia (Smith) 0 0 1 2 1 6 6 2 4 6 6 7 41 8,7 Tapinoma melanocephalum (Fabricius) 8 11 7 14 6 7 5 8 20 17 18 21 142 30,1 TOTAL 36 41 22 38 37 41 45 44 41 37 46 43 471 100,0 % 7,6 8,7 4,7 8,1 7,9 8,7 9,6 9,3 8,7 7,9 9,8 9,1 100,0

Número de Espécies

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

jun/07 jul/07 ag o/07 s et/07 out/07 nov/07 dez/07 jan/08 fev/08 mar/08 abr/08 mai/08

Dorymyrmex s p. C amponotus vittatus F orelC rematog as ter vic tima S mith P aratrec hina long ic ornis (L atreille)Pheidole dilig ens (S mith) P heidole rados zkows kii MayrS olenops is g lobularia (S mith) Tapinoma melanoc ephalum (F abric ius )

QUANTIDADE

Contatou-se que há diferença significativa no aparecimento de determinadas

espécies de formigas entre os turnos noturno e diurno. Isso significa que algumas espécies

possuem maior atividade em determinado período do dia (ver Figura 3).

Figura 3: Distribuição das espécies de formigas segundo os turnos

A análise estatística revela que a espécie Crematogaster victima Smith é uma

formiga de hábitos noturnos (Figura 3), pois mesmo sendo encontrada durante o dia, sua

aparição noturna é significativamente maior demonstrando uma atividade preferencial da

espécie durante a noite.

Para temperatura, o coeficiente de Spearman foi 0,096, para umidade, foi 0,118 e

para pluviosidade, foi 0,109, portanto, apesar de todos os coeficientes serem positivos,

nenhuma espécie de formiga estabeleceu correlação (relação de intensidade) com

temperatura, umidade ou pluviosidade.


2 0

14

3

108

23

39

63

16 14

4 2

17

24

45

97

0

20

40

60

80

100

120

NOTUR NO DIUR NO

Dorymyrmex s p. C amponotus vittatus F orel

C rematog as ter vic tima S mith P aratrec hina long ic ornis (L atreille)P heidole dilig ens (S mith) P heidole rados zkows kii MayrS olenops is g lobularia (S mith) Tapinoma melanoc ephalum (F abric ius )

Q UANTIDADE

Através de cruzamento de variáveis podemos observar que algumas espécies de

formigas predominaram em determinados setores do hospital: nas enfermarias masculina e

feminina predominaram a formiga Tapinoma melanocephalum (Fabricius); na cozinha

houve prevalência da Paratrechina longicornis (Latreille); na lavanderia predominou a

espécie Crematogaster victima Smith; e no banco de sangue houve maior presença da

Crematogaster victima Smith (Figura 4).

Figura 4: Distribuição das espécies de formigas por setor do hospital.

Verificou-se que a cozinha associa-se a espécie Paratrechina longicornis

(Latreille), na enfermaria feminina, a Tapinoma melanocephalum (Fabricius) e no banco de

sangue a Crematogaster victima Smith, nos demais setores não existem outras associações

significantes.


0 0 1 1 00 0

5

9

3

27

10

16

32

46

14

29

32

15

12

0 1 1

4

24

1 0 0 1

4

0

5

1

20

15

46

54

21

16

5

0

10

20

30

40

50

60

E nfermaria mas c . E nfermaria fem. C oz inha L avanderia B anc o de s ang ue

Dorymyrmex s p.

C amponotus vittatus F orel

C rematog as ter vic tima S mith

P aratrec hina long ic ornis (L atreille)

P heidole dilig ens (S mith)

P heidole rados zkows kii Mayr

S olenops is g lobularia (S mith)

Tapinoma melanoc ephalum(F abric ius )

Q UANTIDADE

4.3 Identificação dos Staphylococcus coletados:

Foram encontradas 85 amostras de Staphylococcus. Os estafilococos encontrados

pertenciam todos ao grupo dos ECN e nenhuma amostra de Staphylococcus aureus foi

encontrada neste estudo. A identificação através das provas bioquímicas (KLOSS &

BANNERMAN, 1999) revelou a presença das seguintes espécies de ECN: 17 amostras de

Staphylococcus saprophyticus, 15 amostras de Staphylococcus epidermidis, 13 amostras de

Staphylococcus xylosus, 10 amostras de Staphylococcus hominis hominis, 10 amostras de

Staphylococcus lugdunensis, 6 amostras de Staphylococcus warneri, 5 amostras de

Staphylococcus cohnii urealyticum, 3 amostras de Staphylococcus haemolyticus, 3 amostras

de Staphylococcus simulans, 2 amostras de Staphylococcus cohnii cohnii e uma amostra de

Staphylococcus capitis.

Essas amostras também já foram analisadas quanto ao perfil de susceptibilidade às

duas principais drogas de triagem para resistência aos antibióticos em estafilococos,

segundo recomendado pelo CLSI (2008). As drogas testadas foram a cefoxitina (30µg) e a

oxacilina (1µg), onde duas amostras apresentaram resistência. Além desses antibióticos,

também foram testados 10 antimicrobianos, no qual as duas amostras que apresentaram

resistência à oxaxilina (1µg) e a cefoxitina (30µg), também apresentaram perfil de

multirresistência aos seguintes antimicrobianos: ciprofloxacina (5µg), clindamicina (2µg),

eritromicina (15µg), gentamicina (10µg), penicilina G (10U), sulfametoxazol-trimetoprin

(23,75µg-1,25µg), oxalicina (1µg) e cefoxitina (30µg). A primeira amostra foi detectada na

coleta diurna do mês de agosto de 2007 e foi identificada como S. hominis hominis (código

da amostra: 3ES4D), apresentando halos de inibição de 5 mm para oxacilina e 16 mm para

cefoxitina e a segunda amostra de estafilococos resistente foi encontrada na coleta diurna

do mês de abril de 2008 e foi identificada como S. lugdunensis (código da amostra:

11ES2D) não apresentando halo de inibição para oxacilina e apresentando halo de inibição

de 11mm para cefoxitina (Figura 5). As duas amostras resistentes estavam sendo carreadas

por formigas da espécie Tapinoma melanocephalum (Fabricius).

Figura 5: Amostras de Staphylococcus coagulase negativos resistentes aos antibióticos,

oxacilina (1µg) e cefoxitina (30µg). A) Amostra 3ES4D apresentando halo de

inibição de 5mm para oxacilina e 16mm para cefoxitina. B) Amostra 11ES2D

apresentando halo de inibição de 11mm para cefoxitina e nenhuma formação de

halo de inibição para oxacilina.

A análise da produção da proteína PBP2a, que é o produto da expressão do gene

mecA, conferindo a bactéria a capacidade de sobreviver em presença de antibióticos β-

lactâmicos, foi analisada nas duas amostras com perfil de multirresistência: S. hominis

hominis e S. lugdunensis (amostras: 3ES4D e 11ES2D) e nelas houve reação, sendo as

amostras produtoras dessa proteína (Figura 6).

Figura 6: Produção da proteína PBP2a nas amostras de S. hominis hominis (3ES4D) e S.

lugdunensis (11ES2D).

Nas amostras de S. hominis hominis e S. lugdunensis com perfil de multirresistência

ainda foram realizadas análises do perfil de susceptibilidade à meticilina (25 mg/L), com

este antibiótico diluído em TSA. Houve crescimento das amostras, mostrando uma

resistência ao antibiótico e indicando a presença do gene mecA, que foi confirmada através

de uma Reação em Cadeia da Polimerase-PCR (Figura 7).

As duas amostras multirresistentes, S. hominis hominis (3ES4D) e S. lugdunensis

(11ES2D), foram testadas quanto à produção de biofilme e apenas a amostra da espécie S.

hominis hominis apresentou-se como forte produtora de biofilme (Figura 8).

O total das amostras de ECN ainda apresentou um percentual de 30.58% de

resistência à eritromicina (15µg) e todas as amostras foram susceptíveis à vancomicina

(30µg).

Figura 7: Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para as amostras de ECN

multirresistentes. Coluna 1: Marcador de peso molecular; Coluna 2: Controle +

(S. aureus 9393); Coluna 3: S. hominis hominis (3ES4D); S. lugdunensis

(11ES2D); Coluna 5: Controle negativo (S. epidermidis ATCC12228).

Figura 8: Produção de Biofilme. 1A,B,C - ausência de amostras; 1D,E,F - Staphylococcus

pyogenes 75194 (amostra controle não produtora de biofilme); 2A,B - S.

epidermidis 70d (amostra controle produtora de biofilme); 2C,D -

Staphylococcus hominis hominis (amostra 3ES4D); 2E,F - Staphylococcus

lugdunensis (amostra 11ES2D).

Para testar se houve diferença significativa nas espécies de bactérias ao longo dos

meses pesquisados (Figura 9), com o p-valor ≤ 0,05, utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis.

Mas, o p-valor foi de 0,0697, assim, podemos dizer que não houve diferença da presença

das bactérias ao longo dos meses.

Figura 9: Distribuição dos tipos de bactérias segundo os meses pesquisados.

Através de cruzamento de variáveis podemos observar que algumas espécies de

bactérias predominaram em determinados setores do hospital: nas enfermarias masculina e

feminina predominou a S. epidermidis; na cozinha a S. lugdunensis; na lavanderia a S.

xylosus; e no banco de sangue as espícies S. epidermidis e S. saprophyticus (ver Figura 10).

Foi observado que a lavanderia tem mais chance de apresentar a bactéria S. xylosus, bem

como, na enfermaria feminina é mais provável se encontrar as bactérias S. epidermidis e S.

hominis.

Figura 10: Distribuição dos tipos de bactérias por setor do hospital.

5. DISCUSSÃO

Em nosso estudo foram encontradas espécies distintas de formigas nidificando e,

por conseguinte, infestando o hospital pesquisado. Entre as espécies de formigas urbanas

encontradas, duas são consideradas exóticas, Tapinoma melanocephalum (Fabricius) e

Paratrechina longicornis (Latreille), originárias da região tropical da África. Em outros

estudos conduzidos na região sudeste do Brasil, a presença dos gêneros de formigas

Tapinoma, Paratrechina, Camponotus e Solenopsis são sempre citados (FOWLER et al.,

1993; MOREIRA et al., 2005; RODOVALHO et al., 2007). O número de espécies de P.

longicornis esteve presente de forma distribuída dentre os locais coletados. Tal fato

confirma outro estudo que cita a espécie como bem adaptada à construção de ninhos sob as

mais diversas condições, além de apresentar uma preferência alimentar variada (SOLIS et

al., 2008).

Apesar da espécie Crematogaster victima Smith ter sido encontrada em maior

número no turno noturno e a espécie Tapinoma melanocephalum (Fabricius) no turno

diurno, todas as espécies de formiga coletas puderam ser capturadas nos dois turnos, o que

demonstra uma plasticidade comportamental por parte de todas as espécies encontradas.

O presente estudo não encontrou relações significativas entre fatores abióticos e a

quantidade de formigas coletadas, o que sugere uma adaptação desses insetos ao ambiente

independentemente das variações de temperatura, pluviosidade e umidade. Nosso resultado

corrobora com HÖLLDOBLER & WILSON (1990) que identificam, entre outras, as

espécies de formigas encontradas em nosso trabalho como integrantes de um grupo de

formigas chamadas “andarilhas” (“tramp ants”), as quais possuem uma série de

características adaptativas que favorecem a colonização do ambiente urbano. Tapinoma

melanocephalum (Fabricius) e Paratrechina longicornis (Latreille) são apontadas como

importantes exemplos de sucesso nessa adaptação (ULLOA-CHACÓN & JARAMILLO,

2003). Outros trabalhos encontraram plasticidade de comportamento em formigas (MORI e

LE MOLI, 1988; KELLER e KENNETH, 1993; SEID e TRANIELLO, 2006). Segundo

SEID e TRANIELLO (2006), a variação individual e a plasticidade comportamental de

formigas são uma forma de expansão do seu repertório comportamental, ecológico e

fisiológico.

Nosso trabalho concluiu que a presença de T. melanocephalum no ambiente

hospitalar eleva o risco de veiculação dos ECN e de contaminação do ambiente hospitalar.

Na ausência de trabalhos relacionando formigas com ECN, podemos supor que o fato de T.

melanocephalum ser uma das menores em tamanho dentre as espécies de formigas

adaptadas ao ambiente urbano propicie sua capacidade de carrear ECN. O tamanho

reduzido facilita o acesso das formigas a locais estreitos que as demais não alcançam. Em

nossa pesquisa, essa mesma espécie de formiga, T. melanocephalum, foi encontrada em

maior número nas enfermarias, o que representa um risco devido ao potencial de veiculação

de bactérias com perfil de resistência aos antibióticos demostrado nesse trabalho. O seu

pequeno tamanho pode ter sido mais uma vez a causa dessa infestação, já que pode

dificultar a detecção dessa espécie pela equipe de limpeza, fazendo com que ela colonizasse

facilmente o hospital. Assim como em nossos resultados, outros autores (FOWLER et al.,

1993; MOREIRA et al., 2005; CHACÓN DE ULLOA, 2003) encontraram em pesquisas

realizadas no Brasil e na América do Sul a espécie T. melanocephalum como a mais

presente no ambiente hospitalar. Um fato novo do nosso estudo foi encontrar T.

melanocephalum carreando amostras de ECN resistentes a meticilina, sendo uma delas

produtora de biofilme. Isso aponta para o risco de transmissão de patógenos importantes

por essa espécie no ambiente hospitalar.

O fato de formigas terem sido encontradas veiculando ECN em um hospital é algo

preocupante, pois ECN são uma importante causa de bacteremias nosocomiais e septicemia

(KOKSAL et al., 2007). Além disso, todas as espécies de ECN que encontramos sendo

carreadas por formigas no hospital são descritas como presentes em isolados clínicos

(CUEVAS et al., 2004). Duas de nossas amostras, S. hominis hominis e S. lugdunensis,

eram multirresistentes e estavam albergando o gene mec A, sendo a primeira vez que ECN

com essas características foram isoladas de formigas presentes no ambiente hospitalar, o

que representa um risco de contaminação dos pacientes, que por imunocomprometimento,

podem adquirir uma infecção causada por esses patógenos.

Nossos resultados indicam que a presença de espécies de ECN com

multirresistência aos antibióticos na enfermaria feminina de pós-operatório pode significar

a formação de um reservatório de genes de resistência nesse setor. A literatura relata a

transmissão de genes de resistência de uma espécie de ECN, S. epidermidis, para S. aureus

(WIELDERS et al., 2001), reforçando o fato de, em nosso estudo, duas espécies diferentes

de ECN, terem sido coletadas em um mesmo setor, a enfermaria feminina pós-cirúrgica,

albergando o gene de resistência a meticilina e possuindo perfis de multiresistência a

drogas similares.

S. hominis hominis é citada na literatura como causa de endocardites e bacteremias

(PIETTE & VERSCHRAEGEN, 2009). S. lugdunensis, ao contrário das demais espécies de

ECN, exibem um alto grau de virulência, pois expressam fatores de virulência também

presentes em S. aureus (FRANK et al.,2008). São freqüentemente encontrados em

infecções no trato urinário e relacionada a dispositivos implantáveis, e ainda, infecções na

pele e corrente sanguínea, peritonites e endocardites (FRANK et al.,2008).

ECN tem se tornado um motivo de preocupação pela comunidade médica devido ao

fato dessas bactérias apresentarem a habilidade de rápida adaptação ao stress causado por

antibióticos (LIVERMORE, 2000). A maioria dos ECN isolados de infecções nosocomiais

são resistentes à meticilina e à outras drogas (PIETTE & VERSCHRAEGEN, 2009). Em

nosso estudo, 30.58% dos ECN foram resistentes à eritromicina, o que corrobora com outro

estudo com isolados clínicos (CUEVAS et al., 2004).

A produção do biofilme pode propiciar a permanência de cepas multirresistentes,

atuando como um determinante nas infecções por ECN. Alguns autores relatam que a

produção do biofilme é mais comumente encontrada em isolados associados à sepse,

incluindo bacteremias associadas à cateteres intravenosos e outros dispositivos

implantáveis (GOTZ, 2002; DE SILVA et al., 2002). Nosso estudo relata pela primeira vez

uma espécie de ECN, S. hominis hominis, produtora de biofilme sendo veiculada por

formigas presentes no ambiente hospitalar. Em estudos feitos com ECN isolados de

culturas de sangue, respectivamente 26% e 44% dos S. hominis hominis isolados, eram

produtores de biofilme (KOKSAL et al., 2007; DE SILVA et al., 2002). Em nossos

isolados de S. hominis hominis (n=10), apenas 1 (10%) apresentou produção de biofilme.

Após quatro décadas do primeiro relato de bactérias patogênicas sendo veiculadas

por formigas em instituições de saúde, nosso estudo demonstra que mesmo com o avanço

das medidas de higiene do ambiente hospitalar, esse fato ainda acontece e é agravado pela

aquisição de fatores de virulência por essas bactérias, tais como aumento da resistência aos

antimicrobianos e a produção de biofilme. Há uma necessidade de um periódico

monitoramento das infestações por insetos no ambiente hospitalar, para que se evite a

disseminação de bactérias importantes em infecções nosocomiais.

6. CONCLUSÃO

Espécies distintas de formigas estavam nidificando e, por conseguinte, infestando o

hospital pesquisado;

Formigas podem veicular Staphylococcus coagulase-negativos com perfil de multi-

resistência aos antimicrobianos em ambiente hospitalar;

Formigas podem veicular ECN com potencial de produção de biofilme;

A presença de espécies de ECN com multirresistência aos antibióticos na

enfermaria feminina de pós-operatório pode significar a formação de um

reservatório de genes de resistência nesse setor;

A presença de T. melanocephalum no ambiente hospitalar eleva o risco de

veiculação dos ECN e de contaminação do ambiente hospitalar.

A espécie de formiga T. melanocephalum foi encontrada em maior número nas

enfermarias, o que representa um risco devido ao potencial de veiculação de

bactérias com perfil de resistência aos antibióticos demostrado nesse trabalho.

Não há evidencias no presente estudo de relações significativas entre fatores

abióticos e a quantidade de formigas coletadas, o que sugere uma adaptação desses

insetos ao ambiente independentemente das variações de temperatura, pluviosidade

e umidade.

Apesar da espécie Crematogaster victima Smith ter sido encontrada em maior

número no turno noturno e a espécie Tapinoma melanocephalum (Fabricius) no

turno diurno, todas as espécies de formiga coletas puderam ser capturadas nos dois

turnos, o que demonstra uma plasticidade comportamental por parte de todas as

espécies encontradas.

7. REFERÊNCIAS

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ARTIGO 1

TÍTULO: STAPHYLOCOCCUS COAGULASE-NEGATIVO, MECA POSITIVO E

PRODUTOR DE BIOFILME VEICULADO POR FORMIGAS ((HYMENOPTERA:

FORMICIDAE) NA REGIÃO NORDESTE DO BRASIL.

AUTORES: E.E.N.F. SILVA, J.G. COSTA, C.G.P.T. LÓPEZ, J.H.C. DELABIE, L.A.

TEIXEIRA, M.C.N. MELO, M.F.F.M. XIMENES.

REVISTA: Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene.

SITUAÇÃO: Enviado.

mecA positive and biofilm producer coagulase-negative Staphylococci

carried by ants (Hymenoptera: Formicidae) in a hospital in northeastern

Brazil.

Eutália Elizabeth Novaes Ferreira da Silvaa, Jannyce Guedes da Costaa, Carolina

Garnica Pérez Taco Lópezb, Jacques Hubert Charles Delabiec, Lenise Arneiro

Teixeirab, Maria Celeste Nunes de Meloa, Maria de Fátima Freire de Melo

Ximenesa,*

aPrograma de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Departamento de

Microbiologia e Parasitologia, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio

Grande do Norte. Av. Senador Salgado Filho, S/N, Campus Universitário, Lagoa

Nova, 59072-970, Natal, RN, Brasil.

bLaboratório de Controle Microbiológico, Faculdade de Farmácia, Universidade

Federal Fluminense. Rua Dr. Mário Vianna, 523, Santa Rosa, 24241002, Niterói,

RJ, Brasil.

c Laboratório de Mirmecologia, Centro de Pesquisas do Cacau, CEPLAC, Caixa

postal 7, 45600-000, Itabuna, BA, Brasil.

*Corresponding author: +55 84 3215 3437; Fax: +55 84 3211 9212.

E-mail address: [email protected] (MFFM Ximenes)

Summary

This study evaluated the potential of ants as carriers of Staphylococcus resistant to

antibiotics and biofilm-producing in a hospital in Natal, in northeastern Brazil. Ants

were caught with sterile tweezers in the following hospital areas: the blood bank,

post-surgical wards, the kitchen, and the laundry. Among 440 ants, 85 (19.1%)

were carrying coagulase-negative staphylococci (CoNS) of the species

Staphylococcus saprophyticus (17), Staphylococcus epidermidis (15),

Staphylococcus xylosus (13), Staphylococcus hominis hominis (10),

Staphylococcus lugdunensis (10), Staphylococcus warneri (6), Staphylococcus

cohnii urealyticum (5), Staphylococcus haemolyticus (3), Staphylococcus simulans

(3), Staphylococcus cohnii cohnii (2), and Staphylococcus capitis (1). No S. aureus

was found. Among the isolates, 30.58% showed resistance to erythromycin. Two

samples of CoNS (2.35%), obtained from the ant Tapinoma melanocephalum

(Fabricius) collected in the post-surgical female ward, S. hominis hominis and S.

lugdunensis, harbored the mecA gene and were resistant to multiple antibiotics,

and the specie S. hominis hominis even showed to be a biofilm producer. This

study proves that ants act as carriers of multidrug-resistant coagulase-negative

Staphylococci and biofilm producers and points to the risk of the spreading of

pathogenic microorganisms by this insect in the hospital environment.

Keywords: coagulase-negative Staphylococci; mecA gene; biofilm; ants; hospital

environment.

1. Introduction:

Among animals, insects form the most successful group in the world in

terms of number of species, richness, and abundance. The adaptability of insects

to the urban environment has led to the expansion of species that affect the quality

of human life. Within this group, the ants are noted for their evolutionary success,

their ability to form complex social systems and establish mutualistic or symbiotic

interactions with microorganisms. About 11,000 species were identified around the

world and approximately 2,000 in Brazil.1

About 30 species of ants can be considered urban pests. These species are

known as the “tramp” species, the workers are monomorphic and small, form nests

prone to migration, and do not show intraspecific aggression. These characteristics

have allowed some ants of tropical origin, mainly due to the commerce, to colonize

in temperate countries. In these countries, their presence in buildings with

controlled temperature favors the establishment of these species. Problems result

from the infestation of these urban ants in offices, museums, libraries, telephone

exchanges and homes and hospitals, where the latter can act as vehicles of the

mechanical spread of pathogens.2,3

The potential of ants as carriers of pathogenic microorganisms has been

investigated. Some studies have reported ants as carriers of many species of fungi

and also as intermediate hosts of helminthes. 4,5

The first report of ants carrying pathogenic bacteria in hospitals was

described in the 70s.6 In the following decades, other studies has shown the

potential for the mechanical vectoring of species of Acinetobacter, Klebsiella,

Enterococcus, Proteus, Pseudomonas and Staphylococcus by ants7,8, and still

others have tried to understand the epidemiological role of this insect. 9,10

The free access of the ants-vehicle in the hospital environment allows the

contamination of surfaces that can provide support for bacterial growth, such as

food, therapeutic solutions, catheters, and respirators.9 The establishment of

pathogens in the hospital environment is compounded by the potential for antibiotic

resistance.11

The coagulase-negative staphylococci (CoNS) are inhabitants of human

skin and mucous membranes of healthy individuals but are increasingly recognized

as a cause of clinically important infections.12 CoNS represent the third cause of

bloodstream infections around the world and in Brazil, CoNS are the second cause

of bloodstream infection.13

CoNS may be associated with bacteremia as a result of previous use of

antibiotics, and also there is an increase in resistance to commonly used

antimicrobial.14 Resistance to methicillin, caused by the expression of the penicillin-

binding protein 2a (PBP2a), encoded by the mecA gene, has been a concern,

because this gene is included in a genetic element called staphylococcal cassette

chromosome (SCCmec), which also harbors other genes that confer resistance to

other antibiotics.15 In clinical isolates of CoNS, rates of meticillin resistance

(MRCoNS) are 55-77% and even more than 80% in intensive care unit (ICU).12

CoNS are also the most common cause of infections related to medical

devices.13 This is due mainly to the ability of biofilm formation, which occurs by the

association of bacteria with polymers. In Staphylococcus, this process seems to

occur in basically two steps: adherence to inert surface and biofilm accumulation.

The first step include the AtlE protein, teichoic acid and also staphylococcal

adhesins, proteins which play an important role in plasma-coated biomaterial. The

second step consists of the accumulation of bacterial cells and the production of a

matrix composed primarily of polysaccharide intercellular adhesin (PIA), which is

essential for the biofilm production.16 Following the establishment of biofilm on a

device implanted in the patient, a chronic infection is generally established and, in

most cases, surgery is required for implant removal.17

The spread of clones of CoNS with a profile of multiresistance to drugs have

been recently documented.18,19 Although other studies have reported the potential

of ants as carriers of pathogens, no study has demonstrated the presence of genes

of resistance to drugs in Staphylococcus nor assessed the potential of biofilm

production by these bacteria carried by ants. The aim of this study was to evaluate

the potential of ants as a mechanics vehicle to drug resistant Staphylococcus and

also the potential of these strains to produce biofilm in a hospital in northeastern

Brazil.

2. Materials and methods

2.1. Ants collection and CoNS identification

The study was conducted in a public hospital in Natal, the capital of Rio

Grande do Norte State, with the capacity for 200 beds and 4000 patients

hospitalized annually. In the hospital, five sectors were analyzed: the blood bank,

two post-surgical wards (female and male), the kitchen, and the laundry. From May

2007 to June 2008, ants were collected fortnightly, in the daytime and the

nighttime. They were caught with sterile tweezers and placed in sterile tubes

containing Trypticase Soy Broth (Oxoid, UK) supplemented with NaCl (7.5%), at

35°C for 24-48h. After incubation, the ants were stored in alcohol (70%) for later

identification, examined under a stereoscopic microscope, using identification

keys.20 The tubes showing growth were streaked on Manitol Salt Agar (Oxoid, UK)

to 35°C for 24h, recultured in Trypticase Soy Agar (Oxoid, UK) for 24h to 35ºC and

the isolated colonies were subjected to Gram staining, susceptibility to bacitracin

(>9 mm), and tests that determine the production of catalase and coagulase.

Subsequently, CoNS at species level were identified by the conventional method21,

which consists of a set of biochemical tests that determine the production ornithine

descarboxylase, urease, PYR (pirrolidonyl arylamidase), anaerobic growth in

thioglycolate, susceptibility to novobiocin (0.5 U) (>16 mm) and acid production

from carbohydrates (trehalose, manitol, mannose, maltose, xylose). Test readings

were obtained after 24, 48 and 72h of incubation at 37°C.

2.2. Antimicrobial Susceptibility test

Antimicrobic susceptibilities of the CoNS strains were determined by the

disk diffusion method on Mueller-Hinton Agar (bioMérieux, Marcy L’Etoile, France),

according to the Clinical and Laboratory Standards Institute.22 In our study,

penicillin 10U, clindamycin 2µg, erytromycin 15µg, ciprofoxacin 5µg,

trimethoprim/sulfamethoxazole 1.25/23.75 µg, gentamicin 10 µg, oxacillin 1 µg,

cefoxitin µg, and vancomycin 30 µg (Newprov Ltda, Paraná, Brazil) disks were

used.

2.3. mecA and PBP2a analysis

The mecA gene was amplified by PCR with the primers mecA-F 5’-

TCCAGATTACAACTTCACCAGG-3’ and mecA-R 5’-CCACTTCATATCTTGTAAC-

3’. These primers were designed on the basis of the mecA sequence (Genbank

accession n°YO68000). The program used for standard PCR was as follows: initial

denaturation at 94°C for 4 min, 30 cycles of amplification of 94°C for 30s, 53°C for

30s, annealing at 55°C for 1min, DNA extension at 72°C for 1 min, and a final

extension at 72°C for 4 min. The PCR product was visualized on a 1.5% agarose

gel by using ethidium bromide and a UV transilluminator.15

The PBP2a (penicillin-binding protein 2a) was also investigated by testing

Slidex MRSA Detection (bioMérieux SA, Paris, France), according to the

manufacturer's instructions.

2.4. Biofilm production

CoNS strains were submitted to biofilm assays. They were performed in

TSB supplemented with 1% (w/v) glucose using 96-well polystyrene flat-bottom

tissue culture plates (Nunclon; Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA). All

the procedures were performed as described previously.23 The optical densities of

the culture (ODg) and of the stained biofilm (ODb) were measured at 570 nm.24

Strains of S. epidermidis 70D (a strong biofilm producer) and Staphylococcus

pyogenes 75194 (a biofilm non-producer) were used as positive and negative

controls, respectively.23

3. Results

A total of 440 ants were collected, belonging to five species: Tapinoma

melanocephalum (Fabricius), Paratrechina longicornis (Latreille), Camponotus

vittatus (Forel), Crematogaster victima Smith and Solenopsis Globularia (Smith).

The majority of ants belonged to the specie T. melanocephalum (30.22%) and this

specie presented the highest level of contamination by coagulase-negative

staphylococci, 31.76%, among the ant species that were carrying bacteria.

CoNS were obtained from 85 (19.31%) ants. Identified among the CoNS

were the following: 17 Staphylococcus saprophyticus, 15 Staphylococcus

epidermidis, 13 Staphylococcus xylosus, 10 Staphylococcus hominis hominis, 10

Staphylococcus lugdunensis, 6 Staphylococcus warneri, 5 Staphylococcus cohnii

urealyticum, 3 Staphylococcus haemolyticus, 3 Staphylococcus simulans, 2

Staphylococcus cohnii cohnii, and 1 Staphylococcus capitis. No S. aureus was

detected.

Two strains, obtained from the T. melanocephalum collected in the female

post-surgical ward, belonging to the species S. hominis hominis and S.

lugdunensis, were methicillin resistant and also showed resistance to ciprofloxacin,

clindamycin, erythromycin, gentamicin, penicillin, trimethoprim/sulfamethoxazole,

cefoxitin, and oxacillin. These strains were positive for the production of PBP2a

and harbored the mecA gene (Figure 1). The sample of multidrug resistant S.

hominis hominis was also classified as biofilm-producing (Figure 2). Among the

isolates of CoNS, 30.58% showed resistance to erythromycin and all isolates were

susceptible to vancomycin.

4. Discussion

One of the problems arising from urbanization is the adaptation of invasive

species to new habitats. Among the ant species found in this study, two are

considered exotic, Tapinoma melanocephalum (Fabricius) and Paratrechina

longicornis (Latreille), originating in the tropics of Africa.2 Studies conducted in the

southeastern region of Brazil reveal the presence of the genera of ants: Tapinoma,

Paratrechina, Camponotus e Solenopsis.7,11,3 T. melanocephalum was the ant

species collected the most (30.22%) in the hospital, corroborating studies in Brazil

and other countries in South America, where T. melanocephalum is cited as the

most abundant in hospitals.7,11,2 The factors that contributed to the abundance of

this species in the hospital are not yet understood. However, the fact that T.

melanocephalum carried two samples of methicillin-resistant CoNS and one of

them a biofilm producer, points to the risk of the transmission of important

pathogens in the hospital.

The dispersion of CoNS by ants collected in the hospital has resulted in

concern about the risk of causing nosocomial bacteremia and even sepsis.14 All

species of CoNS that we found are present in clinical isolates.25 S. hominis hominis

is cited in the literature as a cause of endocarditis and bacteremia.12 S.

lugdunensis, unlike the other species of CoNS, displays a high degree of virulence,

it expresses virulence factors also present in S. aureus.26 These bacteria are often

found in urinary tract infections, related to implantable devices such as prostheses

and pacemakers, and, skin infections and bloodstream infection, peritonitis, and

endocarditis.26

In addition, CoNS have a great capacity for adaptation to stress caused by

antibiotics.27 Most of the CoNS isolated from nosocomial infections are resistant to

methicillin and other drugs.12 In our study, 30.58% of CoNS were resistant to

erythromycin; similar results were also found in another study with clinical

isolates.25

Two samples of CoNS, S. hominis hominis and S. lugdunensis, multidrug-

resistant and harboring the mecA gene, were for the first time isolated from ants in

the hospital environment, which poses a risk of contamination to the patient, who, if

immunocompromised, may acquire an infection caused by these pathogens.

Furthermore, these strains can act as a reservoir of resistance genes. The transfer

of resistance genes from S. epidermidis, to S. aureus, was reported.28 This may

explain the fact that in our study, two different species of CoNS were collected in

the same sector, the female post-surgical ward, harboring the gene of methicillin

resistance, and have similar profiles of multidrug resistance.

The production of biofilm by S. hominis hominis, resistant to drugs, can lead

to the persistence of multidrug-resistant strains, acting as a determining factor in

infections caused by CoNS. Some authors report that the production of the biofilm

is more commonly found in isolates associated with sepsis, including bacteremia

associated with intravenous catheters and other implantable devices.16,29 Our study

reports for the first time a species of CoNS producing biofilm being carried by ants

in the hospital environment, an ability that was found in one sample among the 10

samples of S. hominis hominis collected. Found in other studies with CoNS

isolated from blood cultures were respectively 26% and 44% of S. hominis hominis

biofilm producers.14,29

After four decades of the first report of pathogenic bacteria carried by ants in

health institutions, we demonstrated that despite the advances in hygiene in the

hospital environment this problem still occurs and is exacerbated by the acquisition

of virulence factors by these bacteria, such as increased resistance to antibiotics

and production of biofilm. These findings indicate the need for permanent

surveillance and monitoring of insect infestations in hospitals, to avoid the spread

of serious bacterial infections.

Author’s contributions: MCNM, MFFMX, and EENFS conceived and designed

the study; EENFS collected and identified the ants; EENFS e JGC carried out the

bacteria identification; and LAT e CGPTL helped with PCR and biofilm production

assays. JHCD helped to identify the ants. All authors read and approved the final

manuscript. MFFMX and MCNM are guarantors of the paper.

Acknowledgements: We extend our appreciation to Dr. J.R. Lagreca for allowing

the collection of ants in the hospital studied.

Funding: This study was supported by FAPERN (Fundo de Apoio à Pesquisa do

Rio Grande do Norte), Natal, RN, Brazil.

Conflicts of interest: None declared.

Ethical approval: Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN,

Brazil.

Figure 1. Gel image of PCR mecA gene products (160pb) to the S. hominis

hominis (3ES4D) and S. lugdunensis (11ES2D) strains. Lane 1, 100 molecular size

marker; Lane 2, meticillin-resistant S. epidermidis (mecA +); Lane 3, S. hominis

hominis (3ES4D strain); Lane 4, S. lugdunensis (11ES2D strain); Lane 5, S.

epidermidis (mecA -).

Figure 2. Biofilm assays. 1A,B,C - absence of strains. 1D,E,F - Staphylococcus

pyogenes 75194 (a biofilm non-producer). 2A,B - S. epidermidis 70d (a biofilm

producer). 2 C,D- Staphylococcus hominis hominis (3ES4D strain). 2E,F -

Staphylococcus lugdunensis (11ES2D strain).

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