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ESTHER DO LAGO E PRETTI

AVALIAÇÃO DOS EFEITOS GENOTÓXICOS E NEUROTÓXICOS DA FRAÇÃO SOLÚVEL DA

GASOLINA PARA Prochilodus lineatus

Londrina – Paraná

2007

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ESTHER DO LAGO E PRETTI

AVALIAÇÃO DOS EFEITOS GENOTÓXICOS E NEUROTÓXICOS DA FRAÇÃO SOLÚVEL DA

GASOLINA PARA Prochilodus lineatus

Supervisor de Estágio Cláudia Bueno Dos Reis Martinez

Londrina – Paraná 2007

Monografia apresentada ao Curso de Graduação em Ciências Biológicas da

Universidade Estadual de Londrina como um dos requisitos à obtenção do

título de Bacharel em Ciências Biológicas.

8

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Cláudia Bueno dos Reis Martinez

Profa. Dra. Silvia Helena Sofia

Ms. Juliana Delatim Simonato

Londrina, 23 de novembro de 2007

9

AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha orientadora Profa. Dra. Cláudia Bueno dos Reis Martinez pela

oportunidade, confiança, paciência e verdadeira orientação num turbulento último ano

de graduação.

Agradeço à amiga Dalita Cavalcante pelos ensinamentos e paciente cooperação a

cada experimento realizado.

Agradeço aos meus pais Humberto e Esther por todos os anos de suporte e apoio,

mesmo que à distância. Aos meus irmãos, Giselle, Gerson e Humberto por fazerem

de mim, tudo o que sou hoje.

Agradeço aos meus grandes amigos pelos anos de estudos desesperados, favores

de última hora, jantares experimentais, reflexões científicas e filosóficas e

divertidíssima companhia: Júnior, Kenia, Jeanne Marie e especialmente à Cibele, por

me surpreender e acompanhar todos os dias.

Agradeço a Universidade Estadual de Londrina pelos grandes professores e

ensinamentos adquiridos dentro e fora de aula.

10

SUMÁRIO

PÁG.

1. RESUMO 01

2. INTRODUÇÃO 02

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 04

3.1 ENSAIO DO COMETA EM MEIO ALCALINO 08

3.2 TESTE DO MICRONÚCLEO 09

3.3 ANÁLISE DA AÇÃO DA ACETILCOLINESTERASE 11

4. ARTIGO 14

RESUMO 15

INTRODUÇÃO 16

MATERIAL E MÉTODOS 18

ACLIMATAÇÃO 18

PREPARO DA FSG 19

AMOSTRAGEM – COLETA DE SANGUE, CÉREBRO E MÚSCULO 19

ENSAIO DO COMETA 20

TESTE DO MICRONÚCLEO 21

ANÁLISE DA ATIVIDADE DA ACETILCOLINESTERASE 22

ANÁLISE ESTATÍSTICA 23

5. RESULTADOS 23

5. DISCUSSÃO 29

7. CONCLUSÃO 33

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 34

1

1. RESUMO

Os possíveis efeitos genótoxicos, mutagênicos e neurotóxicos da gasolina

foram avaliados para espécimes jovens de Prochilodus lineatus (Characiformes,

Prochilodontidae), usando-se o ensaio do cometa, teste do micronúcleo, (ambos

utilizando sangue periférico) e análise da atividade da enzima acetilcolinesterase

(AchE) em cérebro e musculatura axial. Outras anormalidades eritrocíticas nucleares

(AENs) também foram analisadas além do micronúcleo, como indicativo de dano

genético. Como controle positivo foi utilizado ciclofosfamida na concentração de

0,04mg/g de animal. A FSG foi obtida simulando-se um vazamento desse poluente

em águas neotropicais durante 24 horas (6 horas de exposição solar direta) e os

peixes expostos a FSG na concentração de 5% durante os tempos experimentais de

6, 24 e 96 horas (exposição aguda). Os resultados mostraram um efeito mutagênico

desse poluente sobre os animais em todos os tempos experimentais como mostrado

pelos escores significativamente maiores obtidos com o ensaio do cometa nos

peixes expostos a FSG comparados aos animais expostos somente à água limpa

(controle negativo). Nossos resultados também indicam aumento significativo de

AENs, como núcleo lobulado, segmentado e em forma de rim em todos os tempos

experimentais em relação ao controle negativo, indicando também, dano genotóxico.

A atividade da Acetilcolinesterase (AchE) não foi significativamente diferente nos

peixes expostos a FSG comparados aos respectivos controles negativos em nenhum

dos tempos experimentais.

2

2. INTRODUÇÃO

O petróleo, seus produtos refinados e seus hidrocarbonetos

aromáticos policíclicos (PAHs – do inglês: polycyclic aromatic hydrocarbons) são

encontrados como poluentes acidentais em rios, mares e águas subterrâneas com

ocorrências detectadas nos componentes vivos e não vivos do ecossistema

(ALBERS, 2002). O petróleo pode ser refinado em diversos produtos, como óleo

diesel, gasolina, gás natural e durante esse processo de destilação e transporte,

freqüentemente há vazamentos e derrames, contaminando solos e água. A

toxicidade do petróleo é, em sua maioria, atribuída à sua parte solúvel (ALMEIDA-

VAL et al., 2002) e seus hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, encontrados em

efluentes de refinarias de petróleo, são descritos como os principais componentes

capazes de causar danos no DNA (HAMOUTENE et al. 2002).

A escolha pelo peixe Neotropical Prochilodus lineatus se deu

principalmente por ser um animal de biologia e fisiologia conhecidas, além de ser

sensível aos efeitos de poluentes como a gasolina e pelo fato dos peixes serem

capazes de bio-acumulação devido à exposição direta a produtos químicos e

ingestão de alimento contaminado (RAND & PETROCELLI, 1984). Além de esses

animais incorporarem os poluentes presentes na água pela respiração, o fato de

serem detritívoros também permite que eles incorporem os mesmos poluentes pela

ingestão de sedimentos.

Nesse trabalho serão avaliadas as respostas à exposição aguda de

P. lineatus à fração solúvel da gasolina (FSG) através dos seguintes parâmetros

biológicos: i) avaliação da ação da acetilcolinesterase em cérebro e músculo e ii)

dano no DNA através dos testes do cometa e micronúcleo e presença de

anormalidades eritrocíticas nucleares. Esse estudo foi delineado para detectar as

3

possíveis mudanças bioquímicas e fisiológicas em um peixe de água doce exposto a

uma concentração subletal da FSG, como forma de se ter um alerta precoce em

casos de verdadeiros derrames antes que comunidades inteiras e até todo o

ecossistema seja comprometido permanentemente.

O uso de exemplares de espécies nativas de peixes para a

avaliação da mutagenicidade de xenobióticos é relevante, visto que há uma

necessidade de preservar tais espécies, além do que, através da alimentação,

muitos deles são agentes de transferência de contaminantes ao homem (AL-SABTI

& METCALFE, 1995).

O objetivo desse trabalho é avaliar o potencial genotóxico de um

derivado de petróleo, a gasolina, através de testes como o ensaio do cometa e do

micronúcleo, além de quantificação da atividade da acetilcolinesterase em cérebro e

músculo usando como instrumento o peixe neotropical Prochilodus lineatus.

Esse estudo vem então de encontro a uma necessidade de

monitoramento através da utilização de biomarcadores, da contaminação por

hidrocarbonetos, no caso, da gasolina, evidenciando necessidades de maior

fiscalização e monitoramento de estações de abastecimento e distribuição de

derivados de petróleo em nosso país.

4

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

O ambiente aquático é um habitat para grande número de plantas,

animais e espécies microbianas e sua composição influencia diretamente estes

organismos (ALLOWAY & AYRES, 1997). Poluentes orgânicos como os pesticidas,

compostos químicos industriais (como é o caso das bifenilas policloradas - BPCs),

solventes, detergentes e os derivados de petróleo são prejudiciais para o

ecossistema aquático (WRIGHT & NEBEL, 2000).

A liberação proposital ou acidental de compostos químicos danosos

para o ambiente tem o potencial de perturbar a estrutura e o funcionamento dos

ecossistemas naturais. Conforme a tecnologia industrial avança, as características

das fontes de dejetos industriais se tornam um grande problema e a toxicidade da

água residual de uso industrial também pode se tornar mais perigosa. Uma vez que

o ambiente aquático é o destinatário final dos poluentes produzidos por fontes

naturais ou antropogênicas, o acúmulo e persistência de efluentes industriais no

ambiente aquático constituem-se em uma ameaça à vida biológica (FLEEGER et al.,

2003).

O processamento do petróleo pelas indústrias necessita de grande

quantidade de água e os resíduos gerados e descartados pela indústria de petróleo

tipicamente contém uma vasta gama de poluentes orgânicos e metálicos, incluindo

fenóis, óleos e graxas, sulfetos, nitrato de amônia e hidrocarbonetos policíclicos

aromáticos (BROWN & DONELLY, 1986; DASGUPTA & ZDUNEK, 1992).

O petróleo pode ser destilado em diversos produtos, como óleo

diesel, gasolina, óleo cru, gás natural dentre outros. A toxicidade do petróleo é, em

sua maioria, atribuída à sua parte solúvel (ALMEIDA-VAL et al., 2002). Os

hidrocarbonetos aromáticos policíclicos presentes em efluentes de refinarias de

5

petróleo são descritos como os principais componentes capazes de causar danos no

DNA (HAMOUTENE et al., 2002), além de conhecidamente afetarem a

neurotransmissão e a locomoção nos animais.

Após um derrame de petróleo ou de seus derivados em águas

naturais, ocorre uma variedade de efeitos físicos, químicos e biológicos. Processos

de intemperismo iniciam-se com a evaporação, seguida de fotodegradação, a qual

favorece o processo de degradação biológica (NICODEM et al., 1998).

Os peixes são geralmente usados como organismos sentinela por

que eles têm uma série de papéis na rede trófica, acumulando substâncias tóxicas e

respondendo a baixas concentrações de mutagênicos (ÇAVAS & ERGENE-

GOZUKARA, 2005). Assim, o uso de peixes como indício de efeitos da poluição

através da biomarcação é de grande importância e pode permitir a detecção de

problemas aquáticos ambientais no início dos mesmos (LÓPZ-BAREA, 1996; VAN

DER OOST et al., 2003).

O peixe de água doce neotropical Prochilodus lineatus

(VALENCIENNES, 1847) é uma escolha adequada para testes de toxicidade, por ser

sensível a agentes tóxicos (MAZON & FERNANDES, 1999; MARTINEZ & SOUZA,

2002; DA SILVA et al., 2004; MARTINEZ et al., 2004; ALMEIDA et al., 2005) e,

portanto, ser considerado um potencial vertebrado para monitoramento ambiental

(CERQUEIRA & FERNANDES, 2002; CAMARGO & MARTINEZ, 2006).

Biomarcadores são quaisquer alterações biológicas relacionadas à

presença de um composto químico no ambiente no nível sub-individual, medida

dentro do organismo ou em seus produtos (urina, fezes, pêlos e penas) que indica

um desvio do estado normal e que não pode ser detectada no organismo intacto

(RIBEIRO et al., 2003).

6

Os biomarcadores em peixes são excelentes ferramentas para

monitorar a saúde do ecossistema aquático e têm sido incluídos em vários

programas de monitoramento ambiental modernos (WALKER et al., 1996). A

principal razão para a sua utilização é o fato de fornecerem informações sobre os

efeitos biológicos dos poluentes, bem como pistas sobre os mecanismos de ação

dos contaminantes, e não correspondem apenas à quantificação desses poluentes

no ambiente. Assim, os biomarcadores podem ser usados para identificar sinais

iniciais de danos aos peixes, sugerir as relações de causa-efeito entre exposição aos

contaminantes e os efeitos observados e documentar os efeitos integrados do

estresse químico nos animais. Considerando-se ainda que muitos biomarcadores

são indicadores rápidos de efeitos adversos crônicos, eles podem permitir uma

intervenção antes que efeitos prejudiciais irreversíveis tornem-se inevitáveis

(RIBEIRO et al., 2003).

A maioria dos xenobióticos que entra no organismo é lipofílica, uma

propriedade que permite que esses compostos exógenos penetrem as membranas

lipídicas e sejam transportados por lipoproteínas nos fluidos corpóreos (HODGSON

& GOLDSTEIN, 2001). Embora uma seqüência de processos de detoxificação ocorra

após a entrada do xenobiótico, em alguns casos os produtos intermediários ou finais

podem ser ainda mais tóxicos que os compostos originais, e a seqüência, nesse

caso, pode ser denominada de bioativação. Os efeitos tóxicos de um xenobiótico ou

seus metabólitos podem se manifestar quando o composto se liga a macromoléculas

celulares, levando à ruptura da membrana, a danos celulares ou efeitos genotóxicos,

que por sua vez, podem levar ao desenvolvimento ou progressão de doenças (VAN

DER OOST et al., 2003).

7

A biotransformação de xenobióticos é uma importante fonte de

espécies reativas de oxigênio (EROs), que correspondem aos produtos da redução

do oxigênio molecular, como o ânion radical superóxido (O2-), o radical hidroxil (OH˙)

e o peróxido de hidrogênio (H2O2) (STEGEMAN et al., 1992) Essas espécies

reativas de oxigênio são oxidantes extremamente potentes, capazes de reagir com

macromoléculas celulares críticas, causando diferentes tipos de danos biológicos

que podem levar à morte celular (MARTINEZ, 2004).

Os organismos aeróbicos apresentam diferentes mecanismos,

enzimáticos e não enzimáticos, de defesa antioxidante que podem prevenir a

formação das EROs, reagir com esses intermediários reativos, bem como reparar os

danos causados pelos mesmos (STOREY, 1996). Caso o sistema de defesa

antioxidante esteja comprometido, pode ser estabelecido um desequilíbrio pró-

oxidante celular, denominado estresse oxidativo, que, por sua vez, está associado a

vários processos patológicos e pode comprometer a sobrevivência dos peixes.

Muitos poluentes ou seus metabólitos podem exercer sua toxicidade gerando

estresse oxidativo (MARTINEZ, 2004). No decorrer da vida, o DNA sofre alterações

denominadas mutações, que podem ser causadas por erros durante a sua

duplicação ou durante a divisão celular (RIBEIRO & MARQUES, 2003). Danos na

desoxirribose, que usualmente resultam em quebra nas fitas, também pode ocorrer

em conseqüência da oxidação do DNA. A detecção de quebras nas cadeias de DNA

representa uma técnica valiosa da ecotoxicologia, uma vez que tem revelado

sensibilidade maior do que outros métodos comumente empregados na avaliação de

danos no material genético (LEE & STEINERT, 2003).

O ensaio do cometa é extremamente sensível e bastante útil para a

detecção de danos no DNA (SINGH et al., 1998) e tem sido amplamente utilizado

8

para avaliação de possíveis danos mediados por EROs causados por contaminantes

ambientais (MARTINEZ & CÓLUS, 2002).

3.1 Ensaio do cometa em meio alcalino

O teste do cometa não é utilizado para detectar mutações, mas sim

lesões genômicas, que, após serem processadas, podem resultar em mutação.

Diferente das mutações, as lesões detectadas pelo teste do cometa são passíveis de

correção. Uma vez que danos no DNA são freqüentemente célula e tecido

específicos, uma metodologia como o teste do cometa que permite a detecção de

danos e seu reparo em uma única célula, e conseqüentemente, em determinada

subpopulação celular, é de extrema relevância para a avaliação de compostos

genotóxicos (TICE, 1995).

O ensaio do cometa tem sido proposto para estudos de

toxicogenética devido às suas vantagens e peculiaridades quando comparado a

outros testes que detectam substâncias genotóxicas, sendo uma ferramenta

fundamental de investigação em estudos de reparo de DNA, biomonitoramento

ambiental e teste de genotoxicidade (ROSS et al., 1995). As vantagens de se

empregar o ensaio do cometa para avaliar danos no DNA incluem: mensuração de

danos em células individuais; o baixo número de células necessário para a

realização do teste; possibilidade de ser realizado em qualquer tipo de célula

eucariótica nucleada e ser um método muito sensível para detectar danos no DNA

(LEE & STEINERT, 2003).

Deve-se ter em mente que não existe célula sem dano no DNA, visto

que o próprio metabolismo celular pode gerar em torno de 1000 lesões diárias no

DNA/célula. O que se faz, rotineiramente é modular as condições técnicas (tempo de

9

relaxamento e eletroforese) para que um mínimo de DNA migre da cabeça para a

cauda do cometa nos controles negativos (TICE, 1995). O ensaio do cometa tem

sido amplamente aplicado em eritrócitos e linfócitos do sangue periférico porque

estes tipos celulares podem ser facilmente amostrados e a dissociação celular não é

necessária (BELPAEME et al., 1996).

O ensaio do Cometa, por suas diversas vantagens já citadas e por

ser rápido, relativamente econômico, preciso e reproduzível, torna-se um sistema-

teste adequado para o biomonitoramento ambiental e na genética toxicológica

(TICE, 1995).

3.2 Teste do micronúcleo

O Teste do micronúcleo serve como o primeiro passo no estudo de

qualquer substância mutagênica. É um teste rápido e sensível, tanto para detectar

alterações cromossômicas estruturais como numéricas (HEDDLE et al., 1983).

Também é um ensaio citogenético comumente usado em vários sistemas biológicos

para o monitoramento de genotoxicidade ambiental (MERSCH & BEAUVAIS, 1997).

O teste do micronúcleo é amplamente utilizado para estimar o dano

citogenético induzido por agentes químicos ou físicos. Embora a maior parte dos

estudos com empregando o teste do micronúcleo tenha sido realizada com

mamíferos (especialmente roedores), este teste tem também se mostrado uma

ferramenta muito útil também em estudos com outros animais. Particularmente, em

ambientes em aquáticos, ele permite por meio de estudos da biota aquática, detectar

as propriedades genotóxicas de compostos presentes no ambiente (UDROIU, 2006).

Como peixes aparentemente respondem a xenobióticos da mesma maneira que os

10

mamíferos, eles podem ser usados para testar as possíveis propriedades

genotóxicas de agentes químicos e físicos (UDROIU, 2006).

Micronúcleos são massas de cromatina citoplasmática com a

aparência de pequenos núcleos que emergem de fragmentos cromossômicos ou são

cromossomos inteiros deixados para trás na anáfase, durante a divisão celular. Sua

presença na célula é um reflexo de aberração cromossômica estrutural ou numérica

durante a mitose (FENECH et al., 1999).

Micronúcleos aparecem quando todo um cromossomo ou um

fragmento dele falha durante migração juntamente com um dos dois novos núcleos

formados durante a mitose. O primeiro caso (perda do cromossomo) se deve a um

evento aneugênico, enquanto o segundo caso se deve a quebra de um

cromossomo. Essas inclusões podem ocorrer em todo tipo de célula, tanto somática

quanto germinativa. Assim, o teste do micronúcleo pode ser aplicado em qualquer

tecido do animal (UDROIU, 2006).

Segundo BRUNETTI et al. (1988), a freqüência de micronúcleos na

avaliação da poluição ambiental é um marcador sensível da presença de

contaminantes genotóxicos. Monitorar efeitos clastogênicos de poluentes é um dos

primeiros interesses da mutagênese ambiental aquática para determinar a relação

da poluição com o estresse em organismos vivos (KIM & HYUM, in press).

A aplicação desse teste em eritrócitos é muito popular, em particular

com amostras sanguíneas onde há centenas de células disponíveis para o escore

(UDROIU, 2006). Enquanto eritrócitos micronucleados de órgãos hematopoiéticos

refletem um dano que ocorreu durante um tempo equivalente ao ciclo celular,

aqueles da circulação periférica refletem eventos que ocorreram num tempo

equivalente à vida do eritrócito na circulação (SCHLEGEL & McGREGOR, 1982).

11

Pesquisas com micronúcleos em peixes têm sido conduzidas principalmente

analisando eritrócitos de sangue periférico, mas a sensibilidade e facilidade de obter

células epiteliais de brânquias como alternativa têm sido mostrado em vários

estudos (TAKAI et al., 2004; ÇAVAS & ERGENE-GÖZÜKARA, 2005).

Recentemente, vários estudos descreveram a presença de

anormalidades eritrocíticas nucleares (AENs) além do micronúcleo, em células de

peixe expostas a substâncias genotóxicas (AYLLON & GARCIA-VAZQUEZ, 2000;

ÇAVAS & ERGENE-GOZUKARA, 2005). Em geral essa anormalidades são

consideradas indicadoras de dano genotóxico e, portanto, podem complementar o

escore de micronúcleo em pesquisas de genotoxicidade (ÇAVAS & ERGENE-

GOZUKARA, 2005). As anormalidades eritrocíticas nucleares (AENs) podem ser

classificadas da seguinte forma: núcleo lobado (L), segmentado (S) e em forma de

rim (K).

Nos últimos anos, a expressão simultânea de anormalidades

nucleares juntamente com micronúcleos recebeu atenção considerável. Embora os

mecanismos responsáveis pela formação das anormalidades nucleares não tenham

sido completamente esclarecida, muitos estudos indicam que ENAs são induzidas

em resposta à exposição a agentes genotóxicos (TOLBERT et al., 1992; SERRANO-

GARCIA & MONTERO-MONTOYA, 2001).

3.3 Atividade da acetilcolinesterase

A acetilcolina é um neurotransmissor encontrado no cérebro e nas

junções neuromusculares, compondo parte do sistema nervoso parassimpático.

Seus efeitos incluem a contração dos músculos lisos, dilatação dos vasos

sanguíneos e regulação da taxa de batimentos cardíacos; no cérebro está envolvido

12

nas sinapses associadas ao controle motor, memória e cognição. Sua atividade e

permanência na fenda sináptica são reguladas por hidrólise catalisada pela

acetilcolinesterase (AChE), que regenera a colina, seu precursor (VIEGAS JUNIOR

et al., 2004).

A acetilcolina é o principal neurotransmissor nos sistemas sensorial

e neuromuscular em peixes; seus níveis são regulados pela acetilcolinesterase

(AChE) a partir de hidrólises da acetilcolina em ácido acético e seu produto ativo, a

colina. Esses são reabsorvidos e usados como substrato para a produção contínua

de acetilcolina. A síntese initerrupta ou a inabilidade de hidrolisar a acetilcolina é

responsável pela estimulação contínua ou excessiva das fibras musculares ou

nervosas (KIRBY, 2000).

A atividade da acetilcolinesterase (AChE) é um biomarcador muito

usado em estudos de ecotoxicologia aquática (KIRBY, 2000), visto que é uma

enzima bastante sensível a baixas concentrações de poluentes (ALMEIDA, 2005).

Inseticidas, como o metil paration inibem a atividade da AChE em peixes, resultando

num bloqueio do sistema neuronal. Nesse caso, o sistema muscular pode continuar

se movimentando sem controle até a paralisia, convulsão e morte (AGUIAR et al.,

2004). A maioria dos estudos com AChE são feitos a partir de cérebros de peixes,

pois os efeitos mais evidentes são observados em tecidos nervosos (ALMEIDA et

al., 2005).

Num estudo realizado por AGUIAR (2002), o peixe conhecido

popularmente como matrinxã (Brycon cephalus) foi exposto a concentrações de 2

ppm de metil paration por 24 horas. O cérebro do matrinxã mostrou a maior taxa de

inibição de AChE, como esperado. A inibição no cérebro foi seguida pelos músculos,

13

brânquias e fígado. A inibição da AChE está muito relacionada com o nível de

enervação de tecidos, portanto pode ser dito que quanto maior a concentração de

AchE, maior a susceptibilidade a inibição (ALMEIDA et al., 2005).

14

4. ARTIGO

AVALIAÇÃO DOS EFEITOS GENOTÓXICOS E NEUROTÓXICOS DA FRAÇÃO SOLÚVEL DA GASOLINA PARA Prochilodus lineatus

Esther L. Pretti e Cláudia B.R.Martinez

15

RESUMO

Os possíveis efeitos genótoxicos, mutagênicos e neurotóxicos da gasolina

foram avaliados para espécimes jovens de Prochilodus lineatus (Characiformes,

Prochilodontidae), usando-se o ensaio do cometa, teste do micronúcleo, (ambos

utilizando sangue periférico) e análise da atividade da enzima acetilcolinesterase

(AchE) em cérebro e musculatura axial. Outras anormalidades eritrocíticas nucleares

(AENs) também foram analisadas além do micronúcleo, como indicativo de dano

genético. Como controle positivo foi utilizado ciclofosfamida na concentração de

0,04mg/g de animal. A FSG foi obtida simulando-se um vazamento desse poluente

em águas neotropicais durante 24 horas (6 horas de exposição solar direta) e os

peixes expostos a FSG na concentração de 5% durante os tempos experimentais de

6, 24 e 96 horas (exposição aguda). Os resultados mostraram um efeito mutagênico

desse poluente sobre os animais em todos os tempos experimentais como mostrado

pelos escores significativamente maiores obtidos com o ensaio do cometa nos

peixes expostos a FSG comparados aos animais expostos somente à água limpa

(controle negativo). Nossos resultados também indicam aumento significativo de

AENs, como núcleo lobulado, segmentado e em forma de rim em todos os tempos

experimentais em relação ao controle negativo, indicando também, dano genotóxico.

A atividade da Acetilcolinesterase (AchE) não foi significativamente diferente nos

peixes expostos a FSG comparados aos respectivos controles negativos em nenhum

dos tempos experimentais.

16

INTRODUÇÃO

Dentre os diferentes tipos de poluentes, os derivados de petróleo

são dos mais relevantes para a toxicologia aquática (PACHECO e SANTOS, 2001).

O petróleo pode ser destilado em diversos produtos, como óleo

diesel, gasolina, gás natural e durante esse processo de destilação e transporte,

freqüentemente há vazamentos e derrames, contaminando solos e água sendo a

toxicidade do petróleo, em sua maioria, atribuída à sua parte solúvel (ALMEIDA-VAL

et al., 2002) que contém compostos de baixo peso molecular, como hidrocarbonetos

monoaromáticos (benzeno, tolueno e xileno – BTX) e hidrocarbonetos aromáticos

policíclicos (PAHs) (PACHECO e SANTOS, 2001), encontrados em efluentes de

refinarias de petróleo, que são descritos como os principais componentes capazes

de causar danos no DNA (HAMOUTENE et al., 2002).

Embora grandes vazamentos de óleo sejam mais conhecidos,

acredita-se que a principal fonte de contaminação de águas continentais por petróleo

e seus derivados se deva a pequenos e contínuos vazamentos de tanques de

armazenagem de combustível subterrâneos, atingindo, portanto, corpos de água

subterrânea e finalmente, rios (TIBURTIUS et al., 2005). A exposição ao óleo cru e

seus derivados pode induzir uma variedade de sintomas devido à toxicidade em

animais experimentais. Os hidrocarbonetos do petróleo podem atuar como

mediadores na geração de radicais livres em peixes (ACHUBA e OSAKWE, 2003).

Apesar de alguns experimentos prévios com peixes sobre os

efeitos e respostas toxicológicas de derivados de petróleo, algumas respostas

toxicológicas permanecem pouco esclarecidas revelando a falta de informações

sobre mecanismos de estresse bem como biotransformação e respostas

genotóxicas (PACHECO e SANTOS, 2001), mostrando assim a grande necessidade

17

por informação relacionada à contaminação por derivados de petróleo em peixes

neotropicais.

Os peixes são geralmente usados como organismos sentinela por

que eles têm uma série de papéis na rede trófica, acumulando substâncias tóxicas e

respondendo a baixas concentrações de mutagênicos (ÇAVAS e ERGENE-

GOZUKARA, 2005). Assim, o uso de peixes como indício de efeitos da poluição

através da biomarcação é de crescente importância e pode permitir a detecção de

problemas aquáticos ambientais no início dos mesmos (LÓPZ-BAREA, 1996; VAN

DER OOST et al.2003).

O peixe de água doce Prochilodus lineatus (VALENCIENNES, 1847)

é uma escolha adequada para testes de toxicidade, por ser um animal de biologia

bastante conhecida, sensível a agentes tóxicos (MAZON e FERNANDES, 1999;

MARTINEZ e SOUZA, 2002; DA SILVA et al., 2004; MARTINEZ et al., 2004;

ALMEIDA et al., 2005) e detritívoro, portanto, sendo considerado um potencial

vertebrado para monitoramento ambiental (CERQUEIRA & FERNANDES, 2002;

CAMARGO & MARTINEZ, 2006).

Os organismos aeróbicos apresentam diferentes mecanismos,

enzimáticos e não enzimáticos, de defesa antioxidante que podem prevenir a

formação das espécies reativas de oxigênio (EROs), reagir com esses intermediários

reativos, bem como reparar os danos causados pelos mesmos (STOREY, 1996). Em

peixes, caso o sistema de defesa antioxidante esteja comprometido, pode ser

estabelecido um desequilíbrio pró-oxidante celular, denominado estresse oxidativo,

que, por sua vez, está associado a vários processos patológicos e pode

comprometer a sobrevivência desses animais. Muitos poluentes ou seus metabólitos

podem exercer sua toxicidade gerando estresse oxidativo (MARTINEZ, 2004).

18

No decorrer da vida, o DNA sofre alterações denominadas

mutações, que podem ser causadas por erros durante a sua duplicação ou durante a

divisão celular (RIBEIRO & MARQUES, 2003). Danos na desoxirribose, que

usualmente resultam em quebra nas fitas, também pode ocorrer em conseqüência

da oxidação do DNA. A detecção de quebras nas cadeias de DNA representa uma

técnica valiosa de ecotoxicologia, uma vez que tem revelado sensibilidade maior do

que outros métodos comumente empregados na avaliação de danos no material

genético (LEE & STEINERT, 2003).

Assim, tendo em vistao grande número de acidentes e vazamentos

de derivados de petróleo, como a gasolina, em águas neotropicais, torna-se evidente

a necessidade de levantamento de informações a respeito de seus efeitos na cadeia

trófica. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial genotóxico,

mutagênico e neurotóxico de um derivado de petróleo, a gasolina, através do ensaio

do cometa e teste do micronúcleo, além de avaliação da atividade da enzima

acetilcolinesterase em cérebro e músculo usando como parâmetro o peixe

neotropical Prochilodus lineatus.

MATERIAL E MÉTODOS

Aclimatação

Espécimes jovens do peixe neotropical Prochilodus lineatus

(Characifomes, Prochilodontidae) conhecido popularmente como curimba, pesando

aproximadamente 10 g (8 - 12 g), foram fornecidos pela estação de piscicultura da

Universidade Estadual de Londrina (EPUEL) e aclimatados durante

aproximadamente sete dias em tanques de 300L, contendo água desclorada no

19

laboratório de Bioensaios do Laboratório de Ecofisiologia Animal (LEFA-UEL).

Durante esse período os animais foram alimentados com ração comercial a cada 48

horas. Buscando melhorar a condição de vida dos peixes durante a aclimatação e

assim aumentar a confiabilidade dos experimentos realizados, foi utilizada uma

metodologia para o combate a patógenos aplicando-se no tanque 100mg de gesso

para cada litro de água e 100mg de sal por litro de água. Essa metodologia se

mostrou efetiva uma vez que a mortalidade e acometimento por patógenos foram

sensivelmente reduzidos.

Preparo da FSG

Para obter a fração solúvel da gasolina (FSG) a gasolina foi diluída

em água na proporção do 1:4 em um aquário de vidro e exposta a luz solar durante

o fotoperíodo de 6 horas com o intuito de simular um derrame verdadeiro de gasolina

em ambiente tropical, havendo assim fotodegradação e evaporação. Foi coletada

então somente a fração solúvel da gasolina e descartada a gasolina sobrenadante.

Essa fração solúvel foi então diluída para obtenção de concentração final de 5% da

FSG na água.

Amostragem

Os peixes foram submetidos a testes de toxicidade agudos (6, 24 e

96h) em aquários de 100L, cada um contendo oito peixes. Um grupo controle,

também contendo oito animais, exposto somente à água desclorada também foi

amostrado a cada experimento dos grupos expostos a FSG. Foram feitas réplicas

para cada tempo experimental bem como grupos controle negativos. Durante o

período de experimentação (6, 24 ou 96 horas) os valores de pH, oxigênio

20

dissolvido, temperatura e condutividade da água. foram monitorados diariamente

Imediatamente após serem retirados da água, os animais foram

anestesiados com benzocaína (0,1g/L) e amostras de sangue retiradas através da

veia caudal por seringas plásticas de 1mL previamente heparinizadas. A seguir os

peixes foram sacrificados por secção medular e amostras de cérebro e músculo

imediatamente removidos e congelados a – 80ºC para análises posteriores.

Ensaio do Cometa

O ensaio do cometa empregado no presente trabalho teve como

base a metodologia descrita por Tice (1990). Lâminas foram preparadas com

agarose a ponto de fusão normal a 1,5% cinco dias antes da amostragem. Após a

amostragem 10µL de sangue foram adicionado a 1mL de solução salina (17mM

NaCl, 4.8mM KCl, 1.5mM CaCl2, 1.2mM NaHCO3, 4.5mM Na2HPO4, 2.9mM

NaH2PO4). Em uma sala escura 50µL da mistura de sangue e solução salina foram

adicionados a 120 µL de agarose a baixo ponto de fusão. Essa mistura foi então

depositada sobre a lâmina com cobertura de agarose 1,5% e a mesma coberta com

lamínula e as lâminas mantidas em temperatura de 4-8ºC por cerca de trinta

minutos. Após esse período a lamínula foi retirada e as lâminas acondicionadas em

uma cuba com solução de uso de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10mM Tris, 10%

DMSO e 1 mL Triton X-100), pH 10,0 em escuro em temperatura de 4-8ºC por pelo

menos uma hora. As lâminas então passaram pelo processo de desnaturação com

solução de eletroforese por 30 minutos e então por eletroforese a 25V, 300mA por

20 minutos.

As lâminas foram então neutralizadas com solução de neutralização

(0,4 M Tris, pH 7,5) por cinco minutos. Esse procedimento foi realizado três vezes e

21

após as lâminas foram fixadas em álcool 100% por 10 minutos. A coloração foi feita

em sala escura com brometo de etídeo (agente intercalante) e as lâminas foram

analisadas em microscópio de fluorescência. Foram contados 100 nucleóides por

animal e classificados quando ao dano apresentado (classes 0, 1, 2 e 3). O cálculo

do escore foi feito multiplicando-se o número de nucleóides de uma dada classe pelo

número correspondente a essa classe, sendo: (no. nucleóides classe 0 X 0) + (no.

céls classe 1 X 1) + (no. céls classe 2 X 2) + (no. céls classe 3 X 3) (Figura 1).

Figura1. Classificação dos nucleóides de sangue de peixes submetidos ao ensaio do

cometa.

Teste do Micronúcleo

O procedimento para o teste do micronúcleo foi seguindo a

metodologia de AL-SABTI; METCALFE, 1995. Do sangue extraído 5µL foram

usados para fazer um esfregaço sobre uma lâmina limpa. Após secarem por 24

22

horas em temperatura ambiente as lâminas foram fixadas em metanol 100% por 10

minutos. A coloração foi feita com corante Giemsa a 5% em tampão fosfato 0,1M em

pH 6,8 por 20 minutos. O preparo das lâminas permanentes foi feito com Entellan e

a análise feita em microscópio de luz comum. Foram contadas 3000 células por

animal e analisadas quanto à presença de micronúcleos e de anormalidades

eritrocíticas nucleares sendo elas núcleo Lobulado (L) núcleo segmentado (S) e

núcleo em forma de rim (K) (CARRASCO et al., 1990).

Como controle positivo foi utilizado ciclofosfamida na concentração

de 0,04mg/g (concentração padronizada) de animal injetada intraperitonialmente em

cada animal. Essa substância é conhecidamente mutagênica, servindo assim de

comparação para os resultados obtidos com os animais expostos a FSG.

Atividade da acetilcolinesterase

A Atividade da Acetilcolinesterase (AchE) foi quantificada de acordo

com o ensaio de Ellmann em leitora de microplaca e o procedimento para

quantificação da atividade da enzima e dosagem de proteínas foi o mesmo para o

cérebro e para o músculo.

Amostras do tecido muscular e cerebral (cerca de 50mg) foram

homogeneizadas em tampão fosfato 0,1M pH 7,5 na proporção de 1:10. As amostras

foram centrifugadas a 10000 rpm a 4ºC durante 20 minutos. Após a centrifugação o

sobrenadante foi retirado. Numa microplaca limpa foram colocados nas primeiras

duas cavidades da placa somente 300µL de tampão fosfato. Nas demais foram

aplicados, em réplicas, 50 µL de sobrenadante (amostra) 200µL de DTNB e 50µL de

ATC (tiocolina) com a ATC sendo aplicada imediatamente antes da leitura. A

microplaca foi então submetida à leitura na leitora de microplaca a 415 nm no tempo

23

zero (adição de ATC) e após três e seis minutos. Para a dosagem da proteína foi

empregado o método de dosagem de Lowry et al. (1951), usando se as seguintes

concentrações de BSA (proteína bovina) para a confecção da curva de calibração:

10, 20, 40, 80 e 100 µL. Ao final do procedimento do método de Lowry et al. (1951)

foi feita a leitura em espectrofotômetro a 700 nm.

Análise estatística

Diferenças entre os grupos controle negativos e animais

expostos a FSG quanto ao escore do ensaio do cometa, teste do micronúcleo, AENs

e atividade da enzima AChE, para cada tempo experimental foram determinadas

usando-se o teste estatístico paramétrico t de Student. Para se comparar esses

resultados ao grupo controle positivo foi utilizado o teste estatístico não paramétrico

de Tukey. Foram considerados significativos valores de P ≤ 0,05.

RESULTADOS

Os resultados obtidos usando o ensaio do cometa em eritrócitos de

Prochilodus lineatus expostos a FSG e seus respectivos controle negativo e controle

positivo estão apresentados na Tabela 1.

Os resultados obtidos mostraram diferença significativa nos escores

de peixes expostos à FSG nos tempos: 6h (P≤ 0,019), 24h (P≤0,001) e 96h

(P≤0,001) em relação aos seus respectivos controles negativos (CTR). Animais

expostos a FSG nos tempos experimentais de 24 (P ≤ ,001) e 96 (P≤0,001) horas

mostraram um aumento significativo no número de nucleóides danificados em

relação ao seu respectivo controle negativo (Tabela 2).

24

Tabela 1. Escores de eritrócitos de Prochilodus lineatus submetidos ao teste do cometa de acordo com o dano apresentado.

Escore de dano em teste do cometa Tempo CTR - FSG CTR +

6 h 38,00± 2,89 42,00± 2,00 * 86,50 ± 5,24 *

24 h 38,25± 9,25 103,83± 8,96 * 133,30 ± 7,68 *

96 h 33,88±13,02 125,58±13,89 * 81,00 ± 1,34 *

Os valores referem-se à média±D.P. * Valores significativamente diferentes de seus respectivos controles (P ≤ 0,05). Tabela 2. Média de nucleóides danificados por animais ± D.P. em cada tempo experimental.

Teste do Cometa Tempo (h)

Tratamento N 0 1 2 3 Média de nucleóides danificados por animal ± D.P.

CTR - 6 391 191 17 1 34,83 ± 1,33

FSG 6 380 187 29 3 36,50 ± 1,87 *

6

CTR + 8 150 321 61 6 74,30 ± 2,88 *

CTR - 10 536 222 42 0 33,00 ± 8,28

FSG 12 189 742 246 19 83,92 ± 7,76 *

24

CTR + 6 46 318 206 20 90,67 ± 3,78 *

CTR - 8 570 191 38 0 28,75 ± 9,59

FSG 12 128 709 276 87 89,33 ± 6,56 *

96

CTR + 8 202 552 42 2 74,87 ± 0,97 *

Os valores referem-se à média±D.P. * Valores significativamente diferentes de seus respectivos controles (P ≤ 0,05).

Observou-se também uma tendência a um aumento nos escores de

danos nos animais expostos a FSG nos tempos de 24 h e 96h quando comparados

aos animais expostos por 6h a FSG. Ainda, o mesmo parece ter acontecido com as

médias dos nucleóides danificados, houve um aumento na média de nucleóides

danificados dos animais expostos a FSG nos tempos de 24 h e 96h quando

comparados aos animais expostos por 6h a FSG (Tabelas 1 e 2).

25

As freqüências de eritrócitos micronúcleados para P. lineatus (Fig 2)

encontrados foi muito baixa, conforme indicado na Tabela 3. Para análise desses

dados foi utilizado o teste de t de Student e os resultados no grupo exposto a FSG

não foram significativos com relação aos respectivos grupos controle negativos nos

três tempos experimentais: 6h (P ≤ 0.497), 24h (P ≤ 0.554) e 96h (P ≤ 0.539). A

comparação entre os grupos controle negativo, FSG e controle positivo foi feita

usando-se o teste estatístico não paramétrico de Tukey.

Figura 2. Micronúcleos em eritrócitos de Prochilodus lineatus.

Tabela 3. Freqüência de MN em eritrócitos de Prochilodus lineatus expostos a Gasolina (FSG) ou apenas à água (CTR) por 6, 24 e 96 h.

Tempo (h)

Freqüência de Micronúcleos

CTR - FSG CTR + 0 1 1 0 2 17

6 24 96 0 3 5

As freqüências médias de micronúcleos por animal também não

diferiu significativamente com relação aos controles negativos em nenhum dos

tempos experimentais (Tabela 4).

26

Tabela 4. Freqüência média de Micronúcleos por animal ± D.P. em cada tempo experimental.

Tempo (h)

Tratamento N Total de Micronúcleos

Freqüência média de Micronúcleos ± D.P.

6

CTR – FSG CTR +

8 10 8

0 1 1

0 ± 0 0,111± 0,333 0,125± 0,354

24

CTR – FSG CTR +

16 16 8

0 2 17

0 ± 0 0.125± 0.342 2.125 ± 1.88 *

96

CTR - FSG CTR +

9 12 8

0 3 5

0 ± 0 0.25± 0.62 0.625 ± 0.744

A presença de anormalidades eritrocíticas nucleares foi marcante

em todos os grupos experimentais, sendo significativa a diferença entre os grupos

experimentais de 6h (P≤0,023), 24h (P≤0,001) e 96h (P≤0,039) e seus respectivos

grupos controle negativo (Tabela 5). Os resultados para a detecção de AENs foi

dado como uma média (‰) das somas das anormalidades: núcleo lobulado (L)

(Figura 3), núcleo segmentado (S) (Figura 4) e núcleo em forma de rim (K) (Figura

5).

Os mecanismos responsáveis pela formação das AENs ainda não

foram completamente elucidados, porém elas são consideradas indicadoras de dano

genotóxico e servem como um complemento ao teste do micronúcleo.

Abaixo, estão representadas, algumas das lesões encontradas,

fotografadas em aumento 1000x.

27

Figura 3. Núcleos lobulados de eritrócitos de Prochilodus lineatus. Tabela 5. Ocorrência de AENs em eritrócitos de Prochilodus lineatus dados como uma média (‰) das somas (L+S+K).

Tempo(h) N Ocorrência de AENs

CTR - FSG CTR +

6 8 3.12± 1,81 5,70 ± 2,41 * 6.85 ± 2.79 *

24 8 2.53± 2.44 7.43± 3.20* 7.00 ± 2.92 *

96 8 1,33±1,00 3,58±2,90 * 12,00 ± 1,00 *

Os valores referem-se à média±D.P. * Valores significativamente diferentes de seus respectivos controles (P ≤ 0,05). Figura 4. Núcleos segmentados de eritrócitos de Prochilodus lineatus.

28

Figura 5. Núcleos em forma de rim de eritrócitos de Prochilodus lineatus.

ACETILCOLINESTERASE

Os dados obtidos de atividade da enzima acetilcolinesterase em cérebro

(Tabela 6) não diferiram significativamente dos seus controles negativos nos tempos

6h (P = 0,459), 24h (P = 0,357) e 96h (P = 0,496).

Tabela 6. A atividade da acetilcolinesterase expressa em nmol. min-1.mg proteína –1

em cérebro de Prochilodus lineatus

Ocorrência de AENs Tempo

(h) CTR - FSG

6 24,91 ± 2,88 26,62 ± 5,03

24 28,08± 1,27 29,24± 3,20

96 34,41±7,76 37,07± 4,57

Os valores referem-se à média±D.P.

29

Assim como em cérebro a atividade da acetilcolinesterase em

músculo não diferiu significativamente dos seus controles negativos nos tempos

experimentais de 6h (P = 0,051), 24h (P = 0,673) e 96h (P = 0,868) (Tabela 7).

Tabela 7. A atividade da acetilcolinesterase expressa em nmol. min-1.mg proteína –1

em músculo de Prochilodus lineatus.

Ocorrência de AENs Tempo (h)

CTR - FSG

6 64,64 ± 19,41 85,77 ± 18,57

24 87,29 ± 21,50 91,87± 17,92

96 57,91 ± 15,19 59,15 ± 5,06

Os valores referem-se à média±D.P. DISCUSSÃO

O presente estudo aponta dano genotóxico em eritrócitos do peixe

neotropical dulcícola Prochilodus lineatus expostos a FSG. No ensaio do cometa, o

alto número de nucleóides danificados (Tabela 2) em peixes expostos a gasolina,

mostram um alto nível de genotoxicidade da FSG, similar aquela vista em peixes

expostos a ciclofosfamida por 96h (controle positivo). Da mesma maneira, o escore

de todos os tempos experimentais foi significativamente superior nos animais

expostos a FSG em relação aos respectivos controles negativos, comprovando a

atividade genotóxica da gasolina. Observou-se também uma tendência a um

aumento nos escores de danos nos animais expostos a FSG nos tempos de 24 h e

96h quando comparados aos animais expostos por 6h a FSG. Ainda, o mesmo

parece ter acontecido com as médias dos nucleóides danificados, havendo um

aumento na média de nucleóides danificados dos animais expostos a FSG nos

tempos de 24 h e 96h quando comparados aos animais expostos por 6h a FSG

30

(Tabelas 1 e 2). Esse aumento é um reflexo principalmente de maior quantidade de

nucleóides classificados em classe 2 e 3 (danos mais severos).

Como se sabe, a gasolina contem compostos tóxicos e

hidrocarbonetos de dois grupos relevantes, BTX (benzeno, tolueno, xileno) e

hidrocarbonetos poliaromáticos (PAHs) de baixo peso molecular, como naftaleno e

fluoreno (PACHECO & SANTOS, 2001). A toxicidade do petróleo é, em sua maioria,

atribuída à sua parte solúvel (ALMEIDA-VAL et al., 2002). Os hidrocarbonetos

aromáticos policíclicos presentes em efluentes de refinarias de petróleo são

descritos como os principais componentes capazes de causar danos no DNA

(HAMOUTENE et al., 2002), sendo comumente detectados pelo ensaio do cometa.

O ensaio do cometa tem sido proposto para estudos de toxicogenética devido às

suas vantagens e peculiaridades quando comparado a outros testes que detectam

substâncias genotóxicas, sendo uma ferramenta fundamental de investigação em

estudos de reparo de DNA, biomonitoramento ambiental e teste de genotoxicidade

(ROSS et al., 1995). As vantagens de se empregar o ensaio do cometa para avaliar

danos no DNA incluem: mensuração de danos em células individuais; o baixo

número de células necessário para a realização do teste; possibilidade de ser

realizado em qualquer tipo de célula eucariótica nucleada e ser um método muito

sensível para detectar danos no DNA (LEE & STEINERT, 2003).

Os efeitos que os peixes expostos a FSG sofreram pela presença

desse poluente podem ser ampliados pelo fato dessa espécie possuir grande valor

comercial e representar um importante item alimentar para consumo humano (ORTÍ

et al. 2001), portanto, ela pode atuar como vetor desse contaminante do ambiente

para humanos e outros vertebrados.

31

O processo de biotransformação de PAHs em peixes, ao contrário

do que acontece com a maioria dos compostos químicos, muitas vezes converte o

xenobiótico em substancias intermediárias reativas e de alta toxicidade (MARIA et al.

2002) que podem causar dano oxidativo no DNA. Os efeitos genéticos, como

quebras na fita de DNA e presença de micronúcleos podem causar mutagenicidade,

carcinogenicidade, teratogenicidade e alterações populacionais subseqüentes

(TUVIKENE et al. 1999, VAN DER OOST et al. 2003). O dano celular detectado pelo

ensaio do cometa em P. lineatus expostos a FSG no presente trabalho pode ter

resultado desse processo oxidativo no qual os hidrocarbonetos aromáticos

policiclicos (PAHs) presentes na em associação com a molécula de DNA causaram

as diversas lesões. Dano semelhante foi observado por VANZELLA (2007) para a

mesma espécie de peixe expostos a fração solúvel do diesel (FSD). Além disso,

FRENZELLI (2004) descreve dano significativo no DNA de Zoarces viviparus

expostos a óleo bruto no estuário de Göteborg, Suécia através do ensaio do cometa.

Dentre as técnicas para detecção de efeitos genotóxicos em

peixes, o teste do micronúcleo é muito usado e relativamente fácil de adaptar à

várias espécies (ÇAVAS & ERGENE-GOZUKARA, 2005). A frequência de

micronúcleos encontrados foi muito baixa em todos os tempos experimentais (6, 24

e 96h), não sendo significativamente superior àquela encontrada nos respectivos

controles negativos, conforme indicado pela Tabela 2. Os valores das médias do

número de micronúcleos encontrados por animal também não diferiram

significativamente daquele encontrado nos controles negativos em nenhum dos

tempos experimentais, não havendo assim, nessa concentração, atividade

mutagênica da gasolina para P. lineatus.

32

Recentemente, vários estudos descreveram a presença de

anormalidades nucleares (AENs) além do micronúcleo, em células de peixe

expostas a substâncias genotóxicas (AYLLON e GARCIA-VAZQUEZ, 2000; ÇAVAS

e ERGENE-GOZUKARA, 2003). Em geral essa anormalidades são consideradas

indicadoras de dano genotóxico e, portanto, podem complementar o escore de

micronúcleo em pesquisas de genotoxicidade (ÇAVAS & ERGENE-GOZUKARA,

2005).

Neste estudo a diferença entre a freqüência de todas as

anormalidades eritrocíticas somadas (L+S+K) foi significativamente superior àquela

encontrada em seus respectivos controles negativos em todos os tempos

experimentais, 6h (P=0,015), 24h (P<0.001) e 96h (P = 0,017) como indicado pela

Tabela 5. Sendo assim, fica demonstrado que a gasolina causou danos

permanentes nos núcleos dos eritrócitos de P. lineatus.

A acetilcolina é um importante neurotransmissor presente nos

neurônios colinérgicos. Ela encontra-se armazenada dentro de vesículas nas

terminações das células nervosas, sendo secretada por exocitose na fenda sináptica

ou nas junções neuromusculares. Ao ser liberada, a acetilcolina liga-se a moléculas

específicas da membrana pós-sináptica de um neurônio, ou da placa motora,

abrindo os canais iônicos de sódio e potássio. O fluxo de íons através desses canais

causa uma mudança no potencial de membrana da célula pós-sináptica,

desencadeando o potencial de ação (RANDALL et al., 1994). A enzima

acetilcolinesterase (AChE), é responsável pela hidrólise da acetilcolina em colina e

ácido acético, limitando o tempo de ação desse transmissor na condução do impulso

nervoso (HUGGET et al., 1992; RANDALL et al., 1994).

33

A medida da atividade da enzima acetilcolinesterase em cérebro de

animais expostos a FSG não apresentou diferenças significativas (P>0,05) quanto

aos grupos controles negativos em nenhum dos tempos experimentais 6h (P =

0,459), 24h (P = 0,357) e 96h (P = 0,496). O mesmo padrão ocorreu nas medidas

referentes a atividade da enzima em músculo do peixe. No tempo experimental de

6h P = 0,051, em 24h P = 0,673 e 96h P = 0,868 não havendo diferença significativa

entre o grupo de animais expostos a FSG e grupos controle negativo (Tabelas 6 e

7). Portanto, nessa concentração o poluente gasolina não atuou como agente

anticolinesterásico no peixe neotropical dulcícola Prochilodus lineatus.

CONCLUSÃO

Os dados obtidos corroboram a hipótese de que a gasolina, em

concentração subletal, enquanto contaminante de águas tropicais atua como agente

genotóxico, no peixe neotropical Prochilodus lineatus.

Esses resultados enfatizam a necessidade de monitoramento

através da utilização de biomarcadores, de vazamentos de hidrocarbonetos, no

caso, da gasolina, evidenciando a urgência por efetiva fiscalização e monitoramento

de estações de abastecimento e distribuição de derivados de petróleo em toda

região neotropical.

34

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