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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Avaliação farmacológica das atividades anti-inflamatória e antiulcerogênica do extrato seco obtido por aspersão de Kalanchoe brasiliensis Cambess e sua toxicidade reprodutiva em ratas Wistar Luana Janine Lopes da Costa Recife – PE 2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Avaliação farmacológica das atividades anti-inflamatória e antiulcerogênica
do extrato seco obtido por aspersão de Kalanchoe brasiliensis Cambess e
sua toxicidade reprodutiva em ratas Wistar
Luana Janine Lopes da Costa
Recife – PE
2010
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LUANA JANINE LOPES DA COSTA
Avaliação farmacológica das atividades anti-inflamatória e antiulcerogênica
do extrato seco obtido por aspersão de Kalanchoe brasiliensis Cambess e
sua toxicidade reprodutiva em ratas Wistar
Recife – PE
2010
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Almir Gonçalves Wanderley
Co-orientador: Prof. Dr. Luiz Alberto Lira Soares
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
3
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
Reitor
Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins
Vice-Reitor
Prof. Dr. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva
Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação
Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
Diretor do Centro de Ciências da Saúde
Prof. Dr. José Thadeu Pinheiro
Vice-Diretor do Centro do Ciências da Saúde
Prof. Dr. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros
Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Prof. Dr. Dalci Brondani
Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Prof. Dr. Rodolfo de Faria
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto
Vice-Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Profª. Drª. Beate Saegesser Santos
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AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida, sabedoria e por sempre iluminar meu caminho;
Aos meus pais pelo amor, carinho e incentivo em todos os momentos de minha vida; por
desde o início terem apoiado o meu processo educativo e minha viagem à Recife;
Ao Prof. Dr. Almir Gonçalves Wanderley que me recebeu com tanto carinho, aceitou
orientar-me, acreditou em mim e me apoiou em todos os momentos do trabalho. Os incentivos
e orientações recebidas foram essenciais para o meu crescimento acadêmico. Por tudo o que
me ensinou, a minha eterna gratidão, respeito e admiração;
Ao Prof. Dr. Luiz Alberto Lira Soares pela orientação e amizade desde a graduação,
incentivando-me a enveredar pelo mundo acadêmico. Por ter tornado possível a realização
desse trabalho. Ao seu apoio e ajuda em momentos importantes da minha vida acadêmica e
pessoal;
A Profª. Drª. Aline Schwarz pelo estímulo acadêmico, pela orientação e disposição em ajudar-
me a concluir o mestrado, não poupando esforços para conseguir todo o material de trabalho
que eu precisava. E pela amizade que se construiu para além dos espaços da universidade;
A todos os amigos do Laboratório de Farmacologia e Toxicologia, Vanessa, Jamilka, Liliane,
Hélida, Giovana, Rafaela, Germana, Juciene, Iggor, Pablo, Carlos, Cristiano, Eduardo, que a
todo o momento estavam dispostos a me ajudar nos trabalhos;
A Murilo Facin Pegorin pelo seu carinho e compreensão. Nos momentos em que as
dificuldades pareciam grandes demais, ele esteve presente para me incentivar e encorajar. Sua
disponibilidade, sugestões e paciência em ouvir minhas dúvidas foram indispensáveis para o
término deste trabalho;
A FACEPE, pelo financiamento desta pesquisa.
5
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess. 17 ARTIGO 1: Evaluation of the antiulcerogenic activity of spray dry extract of
Kalanchoe brasiliensis Cambess
Figure 1. Effect of oral administration of pantoprazole (P) and the dry extract of
Kalanchoe brasiliensis on the area of ethanol-induced gastric damage in rats. 39
Figure 2. Effect of oral administration of pantoprazole (P) and the dry extract of K.
brasiliensis on the area of gastric lesions induced by indomethacin in rats. 39
ARTIGO 2: Evaluation of the toxicologicals effects of dry extract Kalanchoe
brasiliensis in pregnant Wistar rats
Figure 1. Effect of the oral administration of Kalanchoe braziliensis (Kb, 0.1, 0.2
and 0.4 g/kg) on the maternal body mass gain during pregnancy in Wistar rats. 46
Figure 2. Effect of the oral administration of Kalanchoe brasiliensis (Kb, 0.1, 0.2
and 0.4 g/kg) on the maternal food intake (g/day/rat) during pregnancy in Wistar
rats.
47
Figure 3. Effect of the oral administration of Kalanchoe brasiliensis (Kb, 0.1, 0.2
and 0.4 g/kg) on the maternal water intake (mL/day/rat) during pregnancy in Wistar
rats.
47
ANEXO I: Avaliação da atividade anti-inflamatória do extrato seco obtido por
aspersão de Kalanchoe brasiliensis Cambess
Figura 1. Efeito da administração oral nos grupos controle e extrato seco de K.
brasiliensis (Kb) no edema de pata de rato induzido por carragenina 1%. 55
6
LISTA DE TABELAS
ARTIGO 2: Evaluation of the toxicologicals effects of dry extract Kalanchoe
brasiliensis in pregnant Wistar rats
Table 1: Effect of the oral administration of K. brasiliensis Cambess on
reproductive parameters during the preimplantation period (1st to 6th day) in
pregnant Wistar rats.
50
Table 2: Effect of the oral administration of K. brasiliensis Cambess on
reproductive parameters during organogenesis period (7th to 14th day) in
pregnant Wistar rats.
51
7
RESUMO
Kalanchoe brasiliensis Cambess é uma das espécies pertencentes à família Crassulaceae.
Pode ser encontrada com freqüência em regiões tropicais. No Brasil encontra-se
predominantemente na zona litorânea. Sua sinonímia popular é vasta, sendo conhecida como
saião, coirama branca, folha da costa e folha grossa. O uso medicinal de Kalanchoe
brasiliensis é relevante em várias partes do mundo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o
potencial farmacológico do extrato seco de K. brasiliensis, obtido através da tecnologia spray-
drying, frente às atividades anti-inflamatória e antiulcerogênica e avaliar sua toxicidade
durante a gestação em ratas Wistar. Para tanto, os efeitos do extrato seco foram investigados
em modelos de inflamação aguda (edema de pata induzido por carragenina) e de úlcera
induzida por etanol a 70% e indometacina, utilizando as doses de 100, 200 e 400 mg/Kg. A
toxicidade reprodutiva foi realizada durante as fases de pré-implantação (1º ao 6º dia de
gestação) e organogênese (7º ao 14º dia de gestação), administrando-se as mesmas doses
farmacológicas. No 20º dia as ratas foram sacrificadas para avaliação dos parâmetros
reprodutivos. Os resultados confirmaram a ausência de atividade anti-inflamatória durante a
época de floração da K. brasiliensis. Ocorreu uma redução significativa da área da lesão
gástrica induzida por etanol em cerca de 40; 47 e 71%, respectivamente, em relação ao grupo
controle; e proteção de 25, 29 e 32% nas lesões induzidas por indometacina. A análise
estatística empregada (ANOVA) revelou não haver alterações no peso, ganho de peso,
consumo de ração e na ingestão hídrica das ratas durante o tratamento, em relação ao grupo
controle, que receberam apenas água. Da mesma forma, não houve diferenças significativas
no número de filhotes vivos e mortos, relação feto/mãe, peso dos filhotes, ovários e placenta,
número de sítios de implantações, reabsorções, corpos lúteos e taxas de perda de pré e pós-
implantação. Assim, pode-se concluir que o extrato seco de K. brasiliensis possui atividade
antiulcerogênica e não apresenta efeito antiinflamatório na floração, assim como, não
promove efeitos tóxicos durante a gestação em ratas Wistar.
Palavras-chaves: Kalanchoe brasiliensis, spray-drying, antiinflamatória, antiulcerogênica,
toxicidade reprodutiva.
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ABSTRACT
Kalanchoe brasiliensis Cambess is a species belonging to the family Crassulaceae. It is often
found in tropical regions. In Brazil is predominantly found in the coastal zone. This species is
popularly known as saião, coirama branca, folha da costa and folha grossa. The medicinal use
of K. brasiliensis is relevant in several parts of the world. The objective of this study was to
evaluate the potential pharmacological of dry extract of K. brasiliensis, obtained by spray-
drying technology. Evaluated the anti-inflammatory and antiulcerogenic activities and their
toxicity during pregnancy in rats Wistar. Therefore, the effects of dry extract were
investigated in models acute inflammation (carrageenin-induced paw edema) and ulcer
(ethanol and indomethacin-induced), using doses of. The reproductive toxicity was carried out
in pregnant rats during the periods: pre-implantation (1 st to 6 th day) and organogenesis (7th
to 14th day) in doses of 100, 200 and 400 mg / kg. In 20 th day the rats were sacrificed for
evaluation of parameters reproductive. The results confirmed the absence of inflammatory
activity during the flowering time of K. brasiliensis. Occurred significant reduction in the area
of gastric lesions ethanol-induced in about 40.1, 47 and 71.1%, respectively in relation of the
control group; and protection of 25.2, 28.9 and 32.1% in lesions indomethacin-induced. No
changes were observed in weight, weight gain, feed intake and water intake of rats during
treatment in relation of the control group. Similarly, no significant differences in the number
of alive and dead pups, relation fetus / mother, weight of pups, ovaries and placenta, number
of implantation sites, resorptions, corpora lutea and pre-and post-deployment loss rates. In
conclusion, the dry extract of K. brasiliensis is safe in the concentrations used because it did
not affect the reproductive performance in rats Wistar.
Keywords: Kalanchoe brasiliensis Cambess, spray-drying, anti-inflammatory,
antiulcerogenic, reproductive toxicity.
9
SUMÁRIO
1. Introdução 12
2. Revisão bibliográfica 15
2.1 Plantas medicinais 15
2.2 Kalanchoe brasiliensis Cambess 16
2.2.1 Aspectos botânicos e etnofarmacológicos 16
2.2.2 Aspectos fitoquímicos 17
2.2.3 Principais atividades biológicas 18
2.3 Tecnologia Spray-drying 20
2.4 Fisiopatologia da Inflamação 21
2.5 Fisiopatologia da úlcera péptica 23
2.6 Toxicidade de plantas medicinais 24
2.6.1 Toxicidade durante o desenvolvimento 24
2.6.2 Toxicidade da Kalanchoe brasiliensis 26
3. Objetivos 28
3.1. Objetivo geral 28
3.2. Objetivo específivos 28
4. Artigo I: Avaliação da atividade anti-ulcerogênica do extrato seco por
aspersão de Kalanchoe brasiliensis Cambess 30
Abstract 30
Introduction 30
Materials and Methods 31
Results and Discussion 33
References 34
5. Artigo II: Evaluation of the toxicologicals effects of dry extract Kalanchoe
brasiliensis in pregnant Wistar rats 41
Abstract 41
Introduction 42
Materials and Methods 43
Results 44
Discussion 45
References 47
10
6. Anexo I: Avaliação da atividade anti-inflamatória do extrato seco obtido
por aspersão de Kalanchoe brasiliensis Cambess
53
6.1 Introdução 53
6.2 Metodologia 53
6.2.1 Avaliação da atividade anti-inflamatória induzida por carragenina 53
6.2.2 Análise estatística 54
6.3 Resultados e Discussão 54
7. Conclusão 57
8. Referências Bibliográficas 59
1 Introdução
12
1 INTRODUÇÃO
Fitoterápico, de acordo com a legislação sanitária brasileira, é o medicamento obtido
empregando-se exclusivamente matérias-primas ativas vegetais. É caracterizado pelo
conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e
constância de sua qualidade (CARVALHO et al., 2008).
Atualmente têm-se observado o aumento na procura de plantas medicinais devido a
fatores como a crise econômica, o alto custo dos medicamentos industrializados e, ainda, ao
difícil acesso à assistência médica e farmacêutica (CARRARA, 1994).
Estima-se que aproximadamente 25% de todos os medicamentos modernos são
derivados, direta ou indiretamente de plantas. Somente no período de 1983-1994, das 520
novas drogas aprovadas pela Agência Americana de Controle de Medicamentos e Alimentos
(FDA), 220 (39%) foram desenvolvidas a partir de produtos naturais (CALIXTO, 2003).
Entre os países da América Latina, somente o Brasil detêm cerca de 20-22% das
plantas e micro-organismos do planeta (CALIXTO, 2005). Porém, apesar de toda diversidade
natural, até por volta do ano 1996, cerca de 84% das drogas presentes no mercado brasileiro
eram importadas e 60% de todas as drogas processadas eram consumidas por somente 23% da
população, fazendo com que os remédios caseiros a base de plantas medicinais se mantivesse
como a principal fonte de medicamentos para a maioria da população (ELIZABETSKY,
COSTA-CAMPOS, 1996; ELISABETSKY, 1999).
Apesar do Brasil não ter uma indústria farmacêutica forte, o comércio interno de
medicamentos registrado no país atinge hoje a casa dos 10 bilhões de dólares, sendo o sétimo
mercado mundial em termos de vendas. Dentro desse contexto, as plantas medicinais e em
especial o uso dos medicamentos fitoterápicos adquirem importância como agentes
terapêuticos e, por isso, devem ser prioritariamente analisados segundo os métodos modernos
disponíveis (CALIXTO, 2001).
Os produtos naturais são tão eficazes quanto os produzidos pela síntese química.
Contudo, a transformação de uma planta em um medicamento deve visar à preservação da
integridade química e farmacológica do vegetal, garantindo a constância de sua ação biológica
e sua segurança de uso, além de valorizar seu potencial terapêutico. Para atingir esse objetivo,
a produção de um fitoterápico requer, necessariamente, estudos prévios relativos aos aspectos
botânicos, agronômicos, fitoquímicos, farmacológicos, toxicológicos, de desenvolvimento de
metodologias analíticas e tecnológicas (TOLEDO et al., 2003).
13
Além disso, não se deve esquecer que apenas o uso tradicional e o elevado consumo
de plantas medicinais para uma determinada enfermidade não comprovam a sua efetividade,
nem a ausência de toxicidade. É necessário conhecer a dose eficaz e aquela que pode
ocasionar efeitos tóxicos. Portanto, é fundamental a realização de estudos farmacodinâmicos e
toxicológicos padronizados.
14
2 Revisão Bibliográfica
15
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Plantas medicinais
A OMS (1998) define planta medicinal como sendo todo e qualquer vegetal que
possui, em um ou mais órgãos, substâncias que podem ser utilizadas com fins terapêuticos ou
que sejam precursoras de fármacos semi-sintéticos (VEIGA-JÚNIOR et al., 2005). No Brasil,
o principal órgão responsável pela regulamentação de plantas medicinais e seus derivados é a
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa), autarquia do Ministério da Saúde, que
tem como papel proteger e promover a saúde da população garantindo a segurança sanitária
de produtos e serviços, participando da construção de seu acesso (BRASIL, 1999).
Mesmo com o desenvolvimento de grandes laboratórios farmacêuticos e dos fármacos
sintéticos, as plantas medicinais permaneceram como forma alternativa de tratamento em
várias partes do mundo. De acordo com a WHO (World Health Organization), devido à
pobreza e pouco acesso à medicina moderna, cerca de 65 a 80% da população mundial
dependem essencialmente das plantas como forma primária de cuidar da saúde (CALIXTO,
2005). É nesse contexto social que as plantas medicinais e os fitoterápicos adquirem
importância como agentes terapêuticos.
No Brasil, a legislação para medicamentos fitoterápicos vem sofrendo modificações
nos últimos anos. A ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) vem elaborando
normas para a regulamentação destes medicamentos, desde a Portaria nº 6 de 1995, que
estabeleceu prazos para que as indústrias farmacêuticas apresentassem dados de eficácia e
segurança dos medicamentos fitoterápicos, passando pela RDC (Resolução da Diretoria
Colegiada) nº 17 de 2000, e a RDC nº 48 de 16 de março de 2004, atualmente em vigor, que
dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos (ANVISA, 2000, 2004).
Esta preocupação das autoridades reguladoras com a normatização dos medicamentos
fitoterápicos propicia a avaliação de aspectos importantes, como a eficácia e segurança do uso
destes medicamentos. O uso tradicional de diversas plantas medicinais baseado em
conhecimentos populares, aliado à crença de que por serem naturais não causam reações
adversas, fez com que poucas plantas medicinais fossem avaliadas através de estudos pré-
clínicos e clínicos, a fim de comprovar sua eficácia e segurança (TUROLLA,
NASCIMENTO, 2006).
16
Agra, Freitas e Barbosa-Filho (2007) registram o uso de 483 plantas com potentes
propriedades bioativas no Nordeste brasileiro, sendo muitas destas espécies não estudadas
quanto aos seus constituintes químicos e/ou atividades biológicas, embora os seus usos
populares tenham sido relatados.
O uso popular e mesmo o tradicional, não são suficientes para validar eticamente as
plantas medicinais como medicamentos eficazes e seguros. Nesse sentido, as plantas
medicinais não se diferenciam de qualquer outro xenobiótico sintético e sua preconização ou
autorização oficial do seu uso medicamentoso, deve ser fundamentada em evidências
experimentais.
Segundo Bacchi (1995), grande parte das espécies vegetais utilizadas pela população
brasileira não possui ação farmacológica comprovada, nem estudos toxicológicos e não se
conhece 99,6% sobre a composição química de nossa flora.
A avaliação do potencial terapêutico de plantas medicinais e constituintes, tais como
flavonóides, alcalóides, triterpenos, sesquiterpenos, taninos, lignanas, tem sido objeto de
estudos, avaliando-se as ações farmacológicas através de testes pré-clínicos com animais,
visando possibilidades de futuramente virem a ser aproveitadas como agentes medicinais.
2.2 Kalanchoe brasiliensis Cambess
2.2.1 Aspectos botânicos e etnofarmacológicos
Kalanchoe brasiliensis Cambess é uma das espécies pertencentes à família
Crassulaceae. Pode ser encontrada com freqüência em regiões tropicais. No Brasil encontra-se
predominantemente na zona litorânea (IBRAHIM et al., 2002; FORTES et al., 2006;
TREVISAN et al., 2006).
Sua sinonímia popular é vasta, sendo conhecida como saião, coirama branca, folha da
costa e folha grossa (CORREA, 1984; SILVA, 2006).
K. brasiliensis apresenta-se como um vegetal herbáceo ou sublenhoso; pouco
ramificado; perene; com crescimento de até 150 cm de altura, especialmente durante a
floração; presença de folhas ovais, simples, lanceoladas no meio, redondas na parte inferior,
serrilhadas na extremidade dos ramos, alternas, opostas ou verticiladas, sem estípulas,
carnosas e glabras (Figura 1).
Flores hermafroditas, gamopétalas, com corola amarelo-laranja mais comprida que o
17
cálice, presença de carpelos escamosos que se tornam folículos polispermos e cálice
intumescido e glabro.
O fruto possui semente com endosperma (CORREA, 1984; BARROSO, 1991).
Figura 1. Folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess.
Fonte: http://picasaweb.google.com/monitoriafito/PlantasMedicinais#5223830045128161122
2.2.2 Aspectos fitoquímicos
Pertencente ao gênero Kalanchoe (syn. Bryophyllum), que compreende
aproximadamente 100 espécies. Diversas classes de substâncias químicas tais como os
bufadienolídeos, terpenóides e flavonóides, têm sido relatadas (COSTA et al., 1994).
Flavonóides glicosilados contendo a 3,3',4',5,7-pentaidroxi-6-metoxiflavona
(patuletina) como aglicona foram isolados da espécie K. brasiliensis, coletada durante a
primavera de 1992 no Rio de Janeiro-RJ, em estudo realizado por Trevisan (2006).
Extratos de três espécies de Kalanchoe (K. brasiliensis, K. pinnata e K. gastonis -
bornieri) mostraram efeitos inibidores da acetilcolinaesterase e efeito tóxico sobre as larvas
de Aedes egypti. Este bioensaio encaminhou para o fracionamento dos extratos mais ativos,
que resultou no isolamento de uma mistura de flavonóides: 8-metóxiquercetina-3-O-a-L-
raminopiranosil-7-O-a-L-raminopiranosídeo, 8-metóxicanferol-3-O-a-L-raminosídeo-7-O-a-
L-raminopiranosídeo, b-sitosterol, 3’, 4’, 5, 7-tetrahidroxi-8-metoxiflavona-3-O-a-
18
Lraminopiranosídeo, glicosídeo do b-sitosterol, 8-metóxiquercetina e 8-metóxiquercetina-7-
O-a-L-raminopiranosídeo. Estes flavonóides mostraram um efeito inibitório sobre a
acetilcolinesterase (TREVISAN et al., 2006).
2.2.3 Principais atividades biológicas
O uso medicinal da Kalanchoe brasiliensis é relevante em várias partes do mundo.
Estudos científicos acumulados até os dias atuais têm revelado e confirmado algumas
atividades biológicas da Kalanchoe brasiliensis como: atividade antiinflamatória, analgésica,
imunomoduladora, antibacteriana, antiulcerogênica, entre outras.
Nas regiões da África, o sumo das folhas frescas é utilizado contra otite, asma, dores
de cabeça e convulsões (NGUELEFACK et al., 2006). Em território brasileiro é comumente
utilizado contra tecidos injuriados, abscessos, processos inflamatórios crônicos, doenças
reumáticas (FERREIRA, ROSENTHAL, CARVALHO, 2000; IBRAHIM et al., 2002;
FONSECA-KRUEL, PEIXOTO, 2004) e, também, contra infecções genito-urinárias
(CUNHA et al., 1995; ALBUQUERQUE, ANDRADE, 2002).
No Nordeste é utilizada como emoliente (para furúnculos), cicatrizante (em
queimaduras), indicada para coqueluche e demais afecções das vias respiratórias, e conhecida
também por ter ação contra úlceras e gastrites, ação esta já atribuída a outras espécies do
gênero Kalanchoe em outras partes do mundo como China e África (TREVISAN et al.,
2006). No Sudeste a planta tem apreciável ação contra bronquites (MEDEIROS, FONSECA,
ANDREATA, 2004).
Silva e Oliveira (1994) revelaram em seus trabalhos a ação anti-inflamatória,
analgésica e antibacteriana da Kalanchoe brasiliensis Cambess, devido à presença de
briofilina.
O extrato hidroalcoólico das folhas frescas da espécie K. brasiliensis demonstrou
propriedade inibitória sobre a enzima acetilcolinesterase em experimentos in vitro realizados
com o músculo reto abdominal isolado de sapo. Nestes experimentos, as respostas contráteis
induzidas por acetilcolina foram inibidas pelo bloqueador neuromuscular d-tubocurarina e
pelo extrato. A observação destes efeitos possibilitou aos autores atribuírem ao extrato da
planta uma atividade anticolinesterásica e, considerar que flavonóides glicosilados, revelados
através de uma abordagem fitoquímica do extrato hidroalcoólico, poderiam ser os
responsáveis por este efeito inibitório sobre a colinesterase (TREVISAN et al., 2006).
19
Em um estudo realizado por Costa et al. (1994), o efeito direto do suco das folhas
frescas do K. brasiliensis na ativação humana dos linfócitos foi investigado a fim de avaliar se
as propriedades curativas desta planta poderiam estar associadas com uma ação não específica
sobre o sistema imune. Observou-se que o suco extraído da planta e posteriormente liofilizado
inibiu a resposta proliferativa do linfócito.
Os flavonóides são conhecidos como inibidores da tireóide peroxidase (TPO). Devido
às propriedades destes tipos de compostos e ao grande uso do extrato do K. brasiliensis, um
estudo foi realizado para avaliar os efeitos deste extrato aquoso na atividade de TPO.
Demonstrou-se que a atividade iodo-oxidativa da TPO foi inibida significativamente pelo
extrato aquoso do K. brasiliensis e que tal inibição parece ser do tipo competitiva, já que a
velocidade máxima da enzima foi inalterada e a afinidade (Km) para o iodo foi aumentada
significativamente na presença do extrato da planta. Além disso, a atividade inibitória de TPO
produzida pelo extrato do K. brasiliensis foi inalterada após fervura ou pela incubação com
enzimas hepáticas, sugerindo que pelo menos o componente antitireóide desta infusão da
planta poderia provavelmente alcançar a circulação sistêmica (FERREIRA et al., 2000).
Uma substância antifúngica produzida por cepas de Paenibacillus brasilensis Sa3
isolada da rizosfera do Kalanchoe brasiliensis foi caracterizada e mostrou ser estável após
tratamento com diferentes enzimas e solventes orgânicos em uma larga escala de pH. O
antagonismo in vitro desta cepa para o Cryptococcus neoformans foi investigado por análise
óptica e por microscopia eletrônica e um efeito fungicida sob o Cryptococcus neoformans foi
observado. A análise ultraestrutural mostrou mudanças intensas no fungo quando comparado
com a cepa Sa3, principalmente o destacamento da cápsula da parede da célula e a presença
de organelas alteradas no citoplasma. Esta substância antifúngica produzida pelo P.
brasilensis Sa3 pode representar uma introspecção nova na terapia antifúngica. Também, os
estudos em perspectiva sobre rizosfera de plantas como o Kalanchoe brasiliensis podem
oferecer uma fonte potencial para a descoberta de compostos bioativos com valor clínico
(FORTES et al., 2006).
Cunha et al. (1995) também detectaram na K. brasiliensis, atividade bactericida e
fungicida.
Foi realizado um estudo utilizando o extrato aquoso bruto das folhas de Kalanchoe
brasiliensis, nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg. E o mesmo produziu uma inibição de 57,7;
67,57 e 64,50, respectivamente, nas lesões ulcerativas induzidas por álcool, em relação ao
controle (SILVA et al., 2006).
20
O efeito imunomodulador do suco obtido das folhas da Kalanchoe brasiliensis na
inflamação zimogênio induzido foi investigado. Zimogênios induzem uma infiltração severa
dos leucócitos nos tecidos articulares e um aumento de 13 vezes no peso do linfonodo
poplíteo adjacente (PLN). Ratos receberam uma injeção subcutânea de 150 µg de zimogênio
na pata. Dois dias após a injeção, os ratos foram tratados por via intraperitoneal com o extrato
liofilizado de K. brasiliensis na dose de 480 mg/Kg dissolvido na água ou 3 mg/Kg de
indometacina, durante 5 dias. O tratamento com o extrato reduziu a espessura da pata de 236
± 9 para 193 ± 5 x 10-2 mm. Além disso, o peso de PLN reduziu de forma similar à obtida
após o tratamento com o anti-inflamatório indometacina, onde ambos foram de 70%. O
tratamento no período de 10 dias foi também eficaz em reduzir a inflamação zimogênio
induzido, mesmo quando iniciado 7 dias após a administração. Ratos também foram tratados
por via oral nas doses de 160, 320, 480 ou 960 mg/Kg do extrato; e verificou-se que a dose de
960 mg/Kg reduziu o peso de PLN induzida por zimogênio em 50%. Estes dados sugerem que
os efeitos anti-inflamatórios e imunossupressores do K. brasiliensis podem esclarecer sua
popularidade na medicina popular contra as doenças reumáticas (IBRAHIM et al., 2002).
Para a sociedade dos países em desenvolvimento, a produção e utilização de
fitoterápicos padronizados, com seus benefícios comprovados e de alta qualidade, podem
facilitar o acesso da população a medicamentos seguros e de baixo custo, facilitando, ainda, o
crescimento da fitomedicina nacional e, desta forma, apresentando impacto na economia local
(ELIZABETSKY, COSTA-CAMPOS, 1996).
2.3 Tecnologia Spray-drying
A técnica de secagem por aspersão baseia-se na secagem de líquidos e suspensões, por
divisão destes em finas gotículas, dentro de uma torre de secagem munida de ar quente
circulante (WENDEL, ÇELIK, 1998). Esta técnica apresenta diversas vantagens. Dentre elas,
a minimização do efeito térmico sobre o material tratado, devido ao tempo extremamente
curto de contato do líquido com a fonte de calor, versatilidade na obtenção de pós e
granulados, baixo custo operacional, quando comparado à liofilização e pouco destrutiva
quando comparada com outros métodos de secagem que empregam calor (WENDEL, ÇELIK,
1998; LIST, SCHMIDT, 1998). Além disso, o produto seco reúne uma série de características
de interesse tecnológico, como uniformidade no tamanho da partícula e melhores
propriedades de fluxo (GONZÁLEZ, SCHMIDT, 1995).
21
A necessidade de utilizar adjuvantes tecnológicos foi colocada em evidência por
diversos autores, tanto como fator decisivo no aumento do rendimento do processo, como por
proporcionar uma melhoria nas propriedades físico-químicas, além de influir positivamente
sobre a recomposição em água do produto e sua estabilidade frente à umidade (SOARES,
1997; HERBERLÉ, 1999; DE SOUZA et al., 2000; LINDEN et al., 2000; SOARES, 2002).
Por isso, é de extrema importância a padronização de métodos para a caracterização física e
físico-química dos extratos secos obtidos nos processos de secagem.
Os adjuvantes tecnológicos mais utilizados e citados na literatura são o dióxido de
silício coloidal, fosfato tricálcico e β-ciclodextrinas.
Todos os trabalhos encontrados na literatura sobre a K. brasiliensis até o presente
momento utilizam a mesma na forma de extrato bruto líquido, seja aquoso ou por extração
com outros solventes.
Em virtude da elevada instabilidade das soluções extrativas, buscou-se desenvolver
um produto tecnologicamente processado e padronizado a partir do extrato vegetal bruto da K.
brasiliensis, visando uma posterior produção em larga escala e comercialização do produto
industrializado.
2.4 Fisiopatologia da Inflamação
A inflamação é uma resposta complexa do tecido vivo e vascularizado à estímulo
irrritante, sendo freqüentemente associado com dor e envolvendo eventos como retração de
células endoteliais; aumento da permeabilidade vascular e do fluxo sanguíneo local, aumento
da migração de granulócitos e células mononucleares, assim com proliferação de tecido
granulomatoso (ANDRADE et al., 2007).
À agressão tecidual se seguem imediatamente fenômenos vasculares mediados
principalmente pela histamina. O resultado é um aumento localizado e imediato da irrigação
sangüínea, que se traduz em um halo avermelhado em torno da lesão. Em seguida, tem-se
início a produção local de mediadores inflamatórios que promovem um aumento da
permeabilidade capilar e quimiotaxia, processo químico pelo qual células polimorfonucleares,
neutrófilos e macrófagos são atraídos para o foco da lesão. Estas células, por sua vez,
realizam a fagocitose dos elementos que estão na origem da inflamação e produzem mais
mediadores químicos, dentre os quais estão as citocinas, quimiocinas, bradicinina,
prostaglandinas e leucotrienos. As plaquetas e o sistema de coagulação do sangue são
22
ativados visando conter possíveis sangramentos. Fatores de adesão são expressos na
superfície das células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos internamente. Estes
fatores irão mediar a adesão e a diapedese de monócitos circulantes e outras células
inflamatórias para o local da lesão.
Todos estes fatores atuam em conjunto, levando a um aumento do calibre de capilares
responsáveis pela irrigação sanguínea local, produzindo mais hiperemia e aumento da
temperatura local. O edema ocorre a partir do aumento da permeabilidade vascular aos
componentes do sangue, o que leva ao extravasamento do líquido intravascular para o espaço
intersticial extracelular. A dor, outro sintoma característico da inflamação, é causada
primariamente pela estimulação das terminações nervosas por algumas destas substâncias
liberadas durante o processo inflamatório, por hiperalgesia (aumento da sensibilidade
dolorosa) promovida pelas prostaglandinas e pela bradicinina, mas também em parte por
compressão relacionada ao edema.
Dentre as diversas metodologias empregadas para pesquisas de novas drogas com
potencial anti-inflamatório (como por exemplo, pleurisia induzida por carragenina, ensaio da
mieloperoxidase neutrófilo, indução de granuloma por pellets de algodão) os agentes
flogísticos, indutores do processo inflamatório, como carragenina, dextrana e histamina são
bastante usados em triagem farmacológica para avaliação de substâncias com potencial anti-
inflamatório (WINTER et al., 1962).
A carragenina, um polissacarídeo sulfatado de origem vegetal, isolado da alga
Chondrus crispus, é amplamente utilizado como agente edematogênico (EMIM, 1996). O
edema de pata induzido pela administração intraplantar de carragenina é considerado um
modelo padrão de inflamação aguda (KALE et al., 2007), apresentando característica bifásica:
na fase inicial (90-180 min após a indução) observa-se liberação de mediadores como
histamina, serotonina, bradicinina; a segunda fase é mantida pela liberação de
prostaglandinas, PAF, substância P, proteases, citocinas (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8) e
lisossomos do tecido inflamado (ORHAN et al., 2007), observando-se um pico máximo 3-4h
após da injeção do agente flogístico (EMIM, 1996).
Flavonóides e alguns compostos triterpênicos têm sido relatados por possuir efeito
inibitório na enzima lipoxigenase ou ciclooxigenase (NARAYANA et al., 2001; KIM et al.,
2004; ORHAN et al., 2006; KUPELI et al., 2006). Dessa forma, é bastante provável o efeito
anti-inflamatório da K. brasiliensis.
23
2.5 Fisiopatologia da úlcera péptica
A proteção pré-epitelial é realizada pela barreira muco-bicarbonato que cria um
gradiente de pH favorável a manter neutra a superfície das células epiteliais. A proteção
epitelial é dada pelos surfactantes (fosfolípides anfóteros) que aumentam a hidrofobicidade
das membranas biológicas tornando-as resistentes aos agentes hidrofílicos agressores (como
por ex. aspirina). Juntamente com os surfactantes, os compostos sulfidrílicos não-protéicos
constituem fatores importantes da proteção epitelial contra radicais livres.
A proteção subepitelial é dada pelo fluxo sangüíneo que suplementa nutriente e
oxigênio, remove íons hidrogênio e outros agentes nocivos.
Atribui-se o controle do fluxo sanguíneo da mucosa gástrica às prostaglandinas
(FORSELL, 1988). Desta forma, a úlcera gástrica decorre de um desequilíbrio entre os fatores
agressivos e defensivos, responsáveis em manter a integridade da mucosa gástrica (HOLZER,
2000; SCHUBERT, 2000; BATISTA et al., 2004).
A atividade antiulcerogênica de uma substância pode ser determinada em animais de
experimentação por vários modelos: indução de lesões gástricas por álcool, indução de lesões
gástricas por estresse ou indução de lesões gástricas por medicamentos (ácido acetilsalicílico
ou indometacina) (HIRUMA-LIMA et al., 2006). Tais modelos são os mais utilizados porque
representam os agentes etiológicos mais comuns envolvidos na patologia da úlcera gástrica
humana.
No modelo de indução de lesões gástricas, observa-se que o álcool, em concentrações
elevadas (70-80%), induz uma proporção significativa de lesões ou úlceras independentes da
secreção ácida, lesando a mucosa gástrica, por uma ação direta sobre o epitélio gástrico
causando peroxidação lipídica. O tratamento agudo oral com álcool causa hiperemia, edema,
necrose, hemorragia da submucosa, bem como distúrbios circulatórios (BATISTA et al.,
2004).
Os anti-inflamatórios não-esteroidais, como aspirina® e indometacina, induzem lesões
gástricas por inibirem a biossíntese de prostaglandinhas (PGE2), as quais, uma vez presentes,
aumentam a secreção de muco no estômago e intestinos e inibem a secreção ácida estimulada
por alimentos, histamina ou gastrina. Já o modelo de úlcera por estresse envolve mecanismos
nervosos centrais, principalmente hipotalâmicos (GLAVIN, SZABO, 1992).
Em todos esses modelos, além de se contar o número de úlceras e medir o seu
tamanho, são avaliadas também, de forma semi-quantitativa, as lesões da mucosa gástrica que
24
precedem à ulceração. Essas lesões, por não permitirem mensuração direta fácil, são avaliadas
subjetivamente e pontuadas segundo o grau aparente de intensidade e comprometimento da
mucosa. A somatória da pontuação atribuída aos diferentes tipos de lesão fornece um índice
(índice de lesão) que reflete a gravidade da injúria à mucosa gástrica.
2.6 Toxicidade de plantas medicinais
A tradição popular é a origem de valiosos conhecimentos acerca das plantas, porém o
uso indevido de determinadas espécies como medicinais é muito perigoso, podendo acarretar
desde leves efeitos colaterais até a morte do indivíduo.
No Brasil, o estudo toxicológico pré-clínico de plantas medicinais é regulamentado
pela RDC nº 90 de 16 de Março de 2004 que norteia alguns ensaios de toxicidade aguda,
toxicidade de doses repetidas e de longa duração (trinta dias a um ano, a depender da
freqüência de uso do produto) (BRASIL, 2004).
A legislação em vigor visa regulamentar e oficializar o desenvolvimento e o uso de
fitoterápicos, de modo a contrapor a expressão que comumente se ouve tanto dos usuários
quanto dos profissionais da saúde que, no momento da prescrição e dispensação, referem “o
que é natural não possui efeitos colaterais”. Tal afirmação é enganosa e remete a inúmeros
riscos à saúde da população, pois diversos autores têm demonstrado que as plantas medicinais
possuem efeitos indesejáveis e muitas vezes tóxicos (BRASIL, 1996; BRASIL, 2000).
No Brasil, as pesquisas realizadas para avaliação do uso seguro de fitoterápicos ainda
são incipientes.
A obtenção de dados toxicológicos a partir de seres humanos é bastante limitada,
sobretudo por motivos éticos, morais e legais. Assim, a obtenção destas informações dá-se,
inicialmente, através de testes toxicológicos pré-clínicos empregando-se espécies animais.
Apesar das diferenças existentes entre qualquer das espécies utilizadas e o homem, no
que diz respeito à absorção, distribuição, biotransformação, eliminação e da variabilidade
inter-espécie, é sempre preferível a resposta de um modelo vivo do que de qualquer outro, a
fim de avaliar o risco no ser humano.
2.6.1 Toxicidade durante o desenvolvimento
A toxicologia do desenvolvimento engloba a teratologia e a toxicologia da reprodução.
A teratologia estuda as alterações induzidas durante o desenvolvimento, entre a concepção e o
25
nascimento; enquanto que a toxicologia da reprodução avalia os efeitos adversos que ocorrem
nos sistemas reprodutores masculino e feminino resultantes da exposição a agentes químicos
(BARROS, DAVINO, 1996).
A realidade brasileira quanto ao padrão de uso de medicamentos na gravidez foi
avaliada em 2002 pelo Collaborative group on Drug use in Pregnancy (CGDUP) dentro de
um estudo cooperativo intercontinental, mas são poucos os trabalhos brasileiros existentes
sobre esse tema na literatura médica. No entanto, observa-se que o consumo de medicamentos
durante a gravidez é bastante comum em nosso país. (FONSECA, FONSECA, BERGSTEN-
MENDES, 2002).
Os efeitos tóxicos das drogas durante o desenvolvimento podem promover a morte do
concepto, malformações congênitas, retardo no desenvolvimento intra-uterino e deficiências
funcionais. Além disso, as drogas podem provocar efeitos deletérios nos sistemas
reprodutores de indivíduos adultos, bloqueando a gametogênese, evitando a ovulação,
fertilização ou implantação do embrião (SCHWETZ et al., 1991; BECKMAN, 1997).
De acordo com a sensibilidade aos agentes teratogênicos e embriofetotóxicos, a
gestação pode ser dividida em três fases: pré-implantação, organogênese e fetal.
A fase de pré-implantação compreende o período que vai desde a fecundação até a
implantação do blastocisto no útero (até o 6º dia em ratos e até o 17º em humanos) (FRITZ,
GIESE, 1990).
A fase de organogênese (7º ao 14º dia de gestação em ratos, e 18º ao 40º dia em
humanos) é caracterizada por intensa proliferação e migração celular, remodelamento tissular
e formação rudimentar das estruturas do corpo. É o período de maior susceptibilidade à ação
de agentes teratogênicos e embriofetotóxicos (BRENT et al., 1993)
Ao final da organogênese tem início o período fetal, caracterizado por diferenciação e
crescimento tissular, maturação fisiológica dos diferentes sistemas e crescimento ponderal do
feto (FRITZ, GIESE, 1990). Nesse período, a sensibilidade frente a malformações anatômicas
é baixa, porém a exposição a agentes químicos pode produzir morte celular, inibição da
diferenciação e inibição da divisão celular. Essas alterações podem interferir com a formação
dos sistemas nervoso, endócrino e imunológico, promovendo desordens funcionais e de
comportamento (AUROUX, 1997).
26
2.6.2 Toxicidade da Kalanchoe brasiliensis
A determinação da dose letal 50% (DL50) é um pré-requisito a ser atendido na
avaliação tóxica de novos fármacos, pois a partir desse valor podem ser estabelecidas doses
terapêuticas que poderão ser utilizadas na forma acabada (MELO et al., 2004).
Estudo realizado por Silva et al. (2007) determinou o valor da DL50 para o extrato
hidroetanólico da K. brasiliensis em 1950 mg/Kg de peso corpóreo. Este valor torna o extrato
moderadamente tóxico, pois segundo Schuartsman (1980) pertencem a esta categoria as
substâncias com dose letal para 50% de uma dada população entre 0,5 e 5 g.
Em levantamento de literatura não se registrou a presença de trabalhos relativos à
toxicidade reprodutiva da K. brasiliensis. Por outro lado, dados da medicina popular contra-
indicam o uso da mesma durante a gravidez, uma vez que a mesma usada durante o trabalho
de parto pode estimular a motilidade uterina (MENGUE, 2001).
Neste contexto, faz-se necessária a avaliação toxicológica da K. brasiliensis a fim de
promover o desenvolvimento de formulações fitoterápicas eficazes e seguras, especialmente
durante os períodos de gestação, através de protocolos experimentais estabelecidos por
agências reguladoras.
A avaliação da toxicidade do extrato seco padronizado das folhas de K. brasiliensis,
baseada em uma investigação farmacológica detalhada, constitui uma hipótese de pesquisa
atraente e necessária para a obtenção de um potencial fitomedicamento.
27
3 Objetivos
28
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
■ Confirmar o potencial farmacológico do extrato seco obtido por aspersão de Kalanchoe
brasiliensis Cambess frente às atividades anti-inflamatória e antiulcerogênica e avaliar sua
toxicidade durante a gestação em ratas Wistar.
3.2 Objetivos específicos
■ Preparar e caracterizar o produto seco por aspersão a partir de solução extrativa de
Kalanchoe brasiliensis, utilizando a tecnologia Spray-drying.
■ Avaliar o efeito anti-inflamatório do extrato seco de Kalanchoe brasiliensis através do
modelo de edema de pata induzido pelo agente flogístico carragenina.
■ Analisar a atividade antiulcerogênica do extrato seco de Kalanchoe brasiliensis pelos
modelos de úlcera induzida por álcool e indometacina.
■ Investigar o efeito do extrato seco de Kalanchoe brasiliensis durante as fases (pré-
implantação e organogênica) da gestação em ratas Wistar.
29
4 Artigo I
Evaluation of the antiulcerogenic activity of spray dry extract of
Kalanchoe brasiliensis Cambess
30
Evaluation of the antiulcerogenic activity of spray dry extract of Kalanchoe
brasiliensis Cambess
Luana J. L. da Costa1, Livia L. Matos2; Magda R. A. Ferreira2; Germana F. R. Caldas1, Luiz A. L.
Soares2; Almir G. Wanderley1 * 1 Programa de Pós-graduação – UFPE, Av. Prof. Moraes Rego, s/n CEP 50670-901, Recife-PE, Brasil 2 Programa de Pós-graduação – UFRN, Av. Gal Cordeiro de Farias, s/n, 59010-180, Natal-RN, Brasil
ABSTRACT
Kalanchoe brasiliensis Cambess is a species to the family Crassulaceae. It is frequently found
in tropical regions. In Brazil is predominantly found in the coastal zone. Its popular synonymy
is vast, being known as saião, coirama, folha da costa and folha grossa. Its medicinal use is
relevant in many parts of the world. The aim of this study was to evaluate the
pharmacological potential of the dry extract of K. brasiliensis obtained by spray-drying
technology compared to the anti-ulcerogenic activity. To this, the effects of dry extract were
investigated in models of ulcer induced by 70% ethanol and indomethacin, using doses of 0,1;
0,2 and 0,4 g/kg. The determination of flavonoids in the extractive solution and the dry extract
showed that there was a recovery in flavonoids content above 85% after the drying process.
The results showed a significant reduction in the area of gastric lesions induced by ethanol at
about 40, 47 and 71% respectively in the control group, and protection of 25, 29 and 32% in
lesions induced by indomethacin. Thus, it can be concluded that the dry extract of K.
brasiliensis when administered orally in Wistar rats has antiulcer activity at the doses
employed.
Keywords: Kalanchoe brasiliensis, flavonoids, antiulcerogenic activity.
INTRODUCTION
Kalanchoe brasiliensis Cambess popularly known as the saião, coirama, folha da costa
and folha grossa is a medicinal herb belonging to the family Crassulaceae found along the
southeastern coast of Brazil (Ibrahim et al., 2002; Fortes et al., 2008; Trevisan et al., 2006). It
is commonly used in folk medicine to treat wounds, abscesses, inflammation and peptic ulcer
31
(Liu et al. 1989; Costa et al., 1994, Ferreira et al., 2000; Costa et al., 2006; Trevisan et al.,
2006). Some of the properties the hydroalcoholic extract of leaves of Kalanchoe brasiliensis
are anticholinesterase properties (Trevisan et al., 2006), immunomodulatory (Ibrahim et al.,
2002) and inhibiting thyroid peroxidase (Ferreira et al., 2000). Furthermore, a study by Silva
et al. (2006) reports the anti-ulcerogenic effect of crude aqueous extract of its leaves at doses
of 0,1; 0,2 and 0,4 g/kg.
The use of K. brasiliensis in traditional medicine, as well as studies on their
pharmacological effects, takes place through the use of crude extracts. However, when
dealing with development and production of herbal medicines, the quality parameters must be
predefined and the preparation procedures must be standardized. It is essential to ensure
uniformity and reproducibility in terms of efficacy, safety and product quality.
In this context, the use of plant extracts dry sprinkler has received special attention in
the last decade. The technology based on the drying of liquids and suspensions sprayed into
the atmosphere low pressure steam (Wendel & Çelik, 1998) presents several advantages
among which stands the small thermal effect on the sample (Wendel & Çelik, 1998; List,
Schmidt, 1998). Additionally the dry product combines a number of characteristics of
technological interest, among which stand out content uniformity, narrow particle size
distribution, as well as the increase in flow properties and compressibility (Heberle et al.,
2000, Couto et al., 2001). The behavior of these particulate systems has been extensively
studied and its use with solid forms of intermediate technology is widely reported in the
literature (Gonzaléz & Schimidt, 1995, Linden et al., 2000, Soares et al. 2003a; 2005a,b
Souza et al., 2005, 2006, 2007; Spaniol et al., 2009)
Thus, the purpose of this study was to evaluate the anti-ulcerogenic activity of dry
extract of the leaves of Kalanchoe brasiliensis Cambess.
MATERIALS AND METHODS
Animals
Wistar rats (Rattus norvegicus), adult male, weighing between 250 and 300 g were obtained
from the vivarium of the Department of Physiology and Pharmacology, Universidade Federal
de Pernambuco (UFPE). The animals received water and diet (Labina®) ad libitum and were
kept under controlled lighting (12h cycle light / dark) and temperature (22 ± 2ºC). All
32
experimental protocols using animals were approved by the Institutional Committee of Ethics
in the number of 006859/2008-18 UFPE.
Plant Material and Preparation of the extractive solution
The leaves of Kalanchoe brasiliensis Cambess (Crasulaceae) were grown and supplied by
ASMARANA Industry and Trade of Natural Products Ltd. (Macaíba - RN). The plant
material was identified by botanists of the Center for Biological Sciences, Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) and herbarium specimens were deposited in the
herbarium UFRN under number 5468. The extractive solution was obtained by turbo-
extraction for 15 minutes, using fresh leaves of Kalanchoe brasiliensis 1:1 (w / v), using 50%
ethanol as solvent.
Preparation of spray dried extract
After filtration the extractive solution containing colloidal silicon dioxide, Aerosil ® 200 at
the rate of 30% over its dry weight, was subjected to drying in Mini-Spray Dryer B-191
(Büchi, Switzerland).
Total flavonoids in dry extract of K. brasiliensis (Silva et al., 2009).
The dry extract was reconstituted in water-alcohol solution 50% (v / v) and, after appropriate
dilution, was added AlCl3 solution. The reading in a spectrophotometer at 410 nm.
Determination of the antiulcerogenic activity of dry extract of K. brasiliensis
Male rats were randomly divided into five groups (n = 6/group). The first group (negative
control) received orally water (0.5 mL/100 g body weight). The second group received
pantoprazole 40 mg/kg (positive control). The third, fourth and fifth groups received
respectively the dried extract of Kalanchoe brasiliensis in doses of 0,1; 0,2 and 0,4 g/kg.
I - Etanol-induced gastric lesions
One hour after treatment, we administered ethanol (70%, 1.0 mL/100 g body weight) orally in
all groups to induce the formation of gastric lesions (Robert et al., 1979). After 1h, the
33
animals were euthanized by cervical dislocation. Then the stomachs were removed, kept in
petri dishes on ice and opened along the lesser curvature. Gastric content was discarded and
the stomach lining washed with NaCl 0.9%. We determined the total area of the body and
gastric lesion area by planimetry (Sartori et al., 1999).
II - Indomethacin-induced gastric lesions (Djahanguiri, 1969)
After 60 minutes of treatment was administered subcutaneously, indomethacin (20mg/kg) in
all groups and 3h after administration of the injurious agent was repeated treatment with
water, and dry extract of pantoprazole K. brasiliensis. Six hours after administration of
indomethacin, animals were sacrificed by cervical dislocation, the stomachs removed and kept
in Petri dishes on ice, opened along the lesser curvature. Scorned is the gastric contents,
washed the stomach lining with NaCl 0.9% and were determined indices of injury and
numbers of ulcers second Lapa et al. (2003).
Statistical analysis
Values are expressed as mean ± standard error of mean (SEM). Differences between groups
were analyzed using analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey-Kramer. The
significance level for rejection of the null hypothesis was ≥ 5%.
RESULTS AND DISCUSSION
Mourão et al. (1999) described that the chemical composition of the extract of K.
brasiliensis is composed of flavonoids, ascorbic acid, polysaccharides and other compounds.
Rossi-Bergmann et al. (1997) confirmed the presence of quercetin (quercetin-3-L-
rhamnoside) and isoquercetina (quercetin-3-glucoside) in the extract of K. brasiliensis.
Furthermore, studies show that flavonoids are substances capable of capturing free radicals,
recognized as one of the factors harmful gastric mucosal injury by alcohol (Bezerra et al.,
2006). Knowing this, the content of total flavonoids in the extractive solution and dry extract
of K. brasiliensis were determined and compared.
According to the results, the recovery of flavonoids in dry matter was higher than 85%
compared to the extractive solution, indicating that the spray drying procedure does not
provide significant interference in the chemical profile of the product. Thus, the
pharmacological properties of the extract were being preserved in satisfactory quantities. Oral
34
administration of dry extract of K. brasiliensis in doses of 0,1; 0,2 and 0,4 g/kg provided a
statistically significant reduction in the area of gastric lesions induced by ethanol at about 40,
47 and 71% respectively in the control group. And this effect was dose-dependent, unlike
what was found by Silva et al. (2006) using solution mining. Pantoprazole is a reducing agent
of peptic acid secretion belonging to the group of proton pump inhibitors. This was used as
positive control and as expected, reduced the gastric lesions in 78.6%. The area of gastric
lesions in different groups is shown in Figure 1.
The gastric damage by ethanol arises from a direct damage in the cells of the gastric
mucosa resulting in the development of oxygen free radicals (Pihan et al., 1987) and lipid
hiperoxidação (Puurunen et al., 1980). Possibly, the flavonoids in dried extract have worked
in inhibition of gastric lesions due to a mechanism for cytoprotection.
To rule out the possibility that the extract was acting only as a physical barrier,
exerting a mechanical action to form a film on the mucosa and preventing the ethanol
removed the layer of mucus, gastric lesions were produced by administration of indomethacin
subcutaneously which requires the absorption of active ingredients present in the extract to
prevent or mitigate injuries caused by the indomethacin.
The administration of dry extract of K. brasiliensis orally at doses of 0.1, 0.2 and 0.4 g
/ kg provided a protection at about 25.2, 28.9 and 32.1% respectively in the control group,
with action dose-dependent at the doses administered.
As the gastric protective effect exerted by the solids obtained by spraying the lesions
induced by ethanol was slightly larger than the lesions induced by indomethacin, suggesting
the presence of a greater protective action as a physical barrier.
Thus we cannot ignore the absorption of active principles involved in this activity.
However, the mechanism of action remains to be established.
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was supported by PPGCF-UFRN FAPERN / MCT / CT-INFRA / CNPq (PPP
2007), CNPq (477131/2007-7) and FACEPE (0712-4.03/08).
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39
0
20
40
60
* *
**
Áre
a d
e le
são
gás
tric
a (%
)
0 100 200 400 40 (mg/kg)K. brasiliensis P
Figure 1. Effect of oral administration of pantoprazole (P) and the dry extract of Kalanchoe
brasiliensis on the area of ethanol-induced gastric damage in rats. Mean ± e. p. m. (N =
6/group). *Statistically significant ANOVA followed by Tukey-Kramer (P <0.05).
0
20
40
60
* * *
*
0 100 200 400 40 (mg/kg)K. brasiliensis P
Áre
a d
e le
são
gás
tric
a (%
)
Figure 2. Effect of oral administration of pantoprazole (P) and the dry extract of K.
brasiliensis on the area of gastric lesions induced by indomethacin in rats. Mean ± e. p. m. (N
= 6/group). *Statistically significant ANOVA followed by Tukey-Kramer (P <0.05).
40
5 Artigo II
Evaluation of the toxicologicals effects of dry extract Kalanchoe
brasiliensis in pregnant Wistar rats
41
Evaluation of the toxicologicals effects of dry extract Kalanchoe brasiliensis in
pregnant Wistar rats
L. J. L. da Costaa, A. Schwarzb, L. A. L. Soaresa, A. G. Wanderleya,c*
a Department of Pharmaceutical Sciences, Federal University of Pernambuco, Recife, 50740-521,
Brazil. b Department of Clinical and Toxicological Analyses, Federal University of Rio Grande do Norte,
Natal, 59010-180, Brazil. c Department of Physiology and Pharmacology, Federal University of Pernambuco, Recife, 50760-
901, Brazil.
* Corresponding author. Almir Gonçalves Wanderley, Departamento de Fisiologia e Farmacologia,
CCB, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, CEP: 50670-901- Cidade
Universitária, Recife, PE, Brasil - Email address: [email protected]
_______________________________________________________________
Abstract
Ethnopharmacological relevance: Kalanchoe brasiliensis Cambess (Crassulaceae) is a
medicinal plant commonly found in the Northeast of Brazil, frequently employed in folk
medicine for many affections due to it antiinflammatory, antiulcerogenic, immunomodulatory
and other effects. This species is popularly known as saião, coirama branca, folha da costa
and folha grossa. Aim of the study: The objective of this study was to evaluate the toxicity of
the oral administration of K. brasiliensis during pregnancy in rats Wistar. Materials and
Methods: The dry extract was dissolved in water and administrated to four groups of pregnant
rats randomly formed (n = 8/group). The group 1 (control group) received distilled water,
while the others were treated orally with K. brasiliensis at doses 0.1, 0.2 and 0.4 g/kg. In the
first phase, the treatment was administered from days 1st to 6th of pregnancy (preimplantation
period) and the second, from 7th to 14th (organogenesis period). On day 20th pregnancy, the
rats were laparotomized for evaluation of maternal and fetal parameters. Results: The
administration of dry extract of K. brasiliensis in the preimplantation and organogenesis
period did not induce death or visible signs of maternal toxicity during pregnancy. There was
no significant difference in the body mass gain maternal and the consumption of food and
water between the groups treated and the control group. The reproductive parameters
evaluated were not statistically different in both groups. Conclusion: The oral administration
of the dry extract obtained from the leaves of K. brasiliensis during the preimplantation and
42
organogenesis periods in Wistar rats is safe at doses up to 400 mg/kg/day of body weight.
However, further studies are needed to ensure the safe use of this plant during human
gestation.
Keywords: .Kalanchoe brasiliensis Cambess, reproductive toxicity, pregnancy
1. Introduction
Kalanchoe brasiliensis Cambess is a species belonging to the family Crassulaceae. It
is often found in tropical regions. In Brazil is predominantly found in the coast (Trevisan et
al., 2006). It is popular synonymy is vast, being known as full saião, coirama branca, folha da
costa e folha grossa (Correa, 1984; Silva, 2006).
The medicinal use of Kalanchoe brasiliensis is relevant in several parts of the world.
It’s commonly used in abscesses, chronic inflammation, rheumatic diseases (Ferreira;
Rosenthal, Carvalho, 2000; Fonseca-Kruel and Peixoto, 2004; Ibrahim et al., 2002) and
genito-urinary infections (Albuquerque and Andrade, 2002). It has action against ulcers and
gastritis, action already attributed to other species of the genus Kalanchoe in other parts of the
world as China and Africa (Trevisan et al., 2006). Scientific studies revealed that Kalanchoe
brasiliensis has actions anti-inflammatory, analgesic and antibiotic due to the presence of
briofilina (Silva, Oliveira, 1994).
In Brazil, the research conducted to assess of safe use of herbal medicines are still
incipient. There are few studies on the Brazilian regarding the pattern of drug use in
pregnancy. However, it is observed that the consumption of drugs during this phase is
common. (Fonseca, Fonseca and Bergsten-Mendes, 2002).
The toxicology of development includes the teratology and reproduction toxicology. A
teratology study the changes induced during development, from conception to birth, while the
reproduction toxicology assesses the adverse effects that occur in reproductive systems and
females resulting from exposure to chemical agents (Barros and Davin, 1996). The
preimplantation period includes from fertilization to deployment blastocyst in the uterus (up
to 6 days in rats and up to 17 days in humans) (Fritz and Giese, 1990). The organogenesis
period (7th to 14th day of gestation in rats, and 18 to 40 days in humans) is characterized by
intense proliferation and cell migration, tissue remodeling and formation rudimentary
structures of the body. It is the period of highest susceptibility the action of teratogenic agents
43
(Brent et al., 1993). In literature did not register the presence of reproductive studies toxicity
of K. brasiliensis. However, in folk medicine is not recommended for use during pregnancy
because it can stimulate uterine motility (Menge, 2001). In this context, it is necessary to
evaluate the toxicological potential of K. brasiliensis in order to promote the development of
herbal formulations effective and safe.
2. Materials and methods
2.1. Plant material
Kalanchoe brasiliensis was provided by Asmarani Industry and Trade Natural
Products Ltd. (Macaíba - RN). Leaves fresh were collected in the period of flowering from
March to September 2008. The extraction was achieved using 50% ethanol in 1:1 (w/v). In the
extraction solution was added dioxide colloidal silicon Aerosil® 200 at the rate of 30% of its
dry weight. A suspension was kept under stirring during the drying process, in spray tower
(Mini Spray Dryer BUCHI B-191), equipped with spray type of tire in the drying chamber co-
current.
2.2. Animals
Pregnant Wistar rats (Rattus norvegicus), aged 3 months and weighing 200–250 g,
were obtained from the Department of Physiology and Pharmacology at the Federal
University of Pernambuco (UFPE). They were maintained in standard environmental
conditions (22 ± 2ºC, 12:12h dark/light cycle). Water and industrialized dry food (Labina®,
Purina, Brazil) were available ad libitum. The experimental protocol was approved by the
Animal Experimentation Ethic Committee of the Biological Science Center of UFPE (Process
no. 006859/2008 - 18), in accordance with the National Institute of Health Guide for the Care
and Use of Laboratory Animals.
2.3. Experimental protocol
Observation of the presence of sperm in the vaginal smear was used to establish the
1st day of pregnancy. The study was conducted in two phases, each one containing four
44
groups of pregnant rats randomly formed (n = 8/group. The group 1 (control group) received
distilled water (1 mL, p.o.), while the others were treated orally with dry extract of K.
brasiliensis at doses 0.1, 0.2 and 0.4 g/kg. In the first phase, the treatment was administered
from days 1st to 6th of pregnancy (preimplantation period) and the second, from 7th to 14th
(organogenesis period). During pregnancy, the rats were evaluated for survival, altered
appearance and any clinical signs of toxicity, such as changes in food and water intake,
piloerection, diarrhea, change of locomotor activity and vaginal bleeding.
In the preimplantation and organogenesis periods, the maternal weight was recorded
on days 1, 7, 14 and 20. On the 20th day of pregnancy, the rats were anesthetized with
Nembutal® 35 mg/kg, i.p., laparotomized and their uterine horns removed. The number of
implants, resorption, live and death fetuses were then recorded. Ovaries and placentae were
weighed and the corpora lutea were counted. The fetuses were weighed, measured and
observed for any visible abnormalities. From these data, the implantation index (total number
of implantation sites/total number of corpora lutea × 100), the preimplantation loss rate
(number of corpora lutea - number of implantations/number of corpora lutea × 100) and the
postimplantation loss rate (number of implantations - number of live fetuses/number of
implantations × 100) were calculated (Costa-Silva et al., 2007).
2.4. Statistical analysis
Values were expressed as mean ± standard error of mean (SEM) or as median. The
differences between treated and control groups were analyzed by variance analysis
(ANOVA), followed, when necessary, by the Tukey test. The implantation index, pre- and
postimplantation loss rates were analyzed using the Kruskal-Wallis test followed by the Dunn
test, when necessary. The significance level was set at p < 0.05. Statistical analyses were
performed with the aid of the computer program GraphPad Prism 5.0.
3. Results
During the treatment with dry extract of K. brasiliensis at doses of 100, 200 and 400
mg/ kg/ day in the preimplantation period were not recorded deaths and not were clinical
signs of maternal toxicity. Maternal weight gain was unaffected by dry extract of K.
45
brasiliensis administration at all dose levels throughout the study (Figure 1). Similarly, there
was no change in food consumption (Figures 2) and water intake of rats (Figure 3).
No death fetuses or fetuses with external malformations were observed. There were
not any statistically differences between the reproductive variables, such as: offspring/dam
relationship, ovary absolute mass and number of corpora lutea. There were also no significant
differences in implantation index, pre and postimplantation losses rates between the groups
treated and their respective control (Table 1).
The administration of dry extract of K. brasiliensis in the organogenesis period did not
induce death or visible signs of maternal toxicity during pregnancy. The body mass gain
maternal and reproductive parameters evaluated were not statistically different (Table 2) and
there was no significant difference in consumption of food and water between the groups
treated and the control group.
4. Discussion
Considering the common use of medical Kalanchoe brasiliensis in the treatment of
various disorders, aimed to evaluate the possible teratogenic potential of K. brasiliensis.
The results suggest that treatment of pregnant rats in preimplantation and
organogenesis periods with dry extract of K. brasiliensis, in doses of 0.1, 0.2 and 0.4
g/Kg/day, was unable to promote maternal toxicity, since there were no changes in weight,
weight gain, feed intake and water intake in these animals.
The ovarian mass and the number of corpora lutea in the treated groups were similar to
those of the control group, indicating normal development of corpora lutea and suggest
production progesterone was not affected by treatment with dry extract of K. brasiliensis.
Both the implantation index and the preimplantation loss rate evaluated blastocyst
implantation in the uterus. These parameters were similar in treated and control groups,
suggesting a normal reproductive capacity.
The postimplantation loss rate establishes correlation between the number of
implanted blastocysts and those who did not develop (Almeida and Lemon, 2000). It is called
as resorption, indicating failure in the development of the embryo. In this study, there were no
statistically differences in this parameter between control and treated groups. Thus, one can
say that was normal development of the implanted blastocysts.
46
In the preimplantation there are stem cells in mitotic division. In rodents, the
implantation of the conceptus commonly occurs around on day 4 and 5 of pregnancy. The
reduction in the number of cells in the embryo during this stage can damage the formation of
the blastocyst (Kola and Folb, 1986) and increase the pre and postimplantation losses (Kvitka
and Gimmler, 1986).
In the period of organogenesis there is an intense proliferation and cell migration,
tissue remodeling and formation of rudimentary structure of the body. This period is
characterized as the most susceptible to the deleterious effects of teratogenic agents, with
higher probability of occurrence of fetal malformations. The type of malformation will
depend, however, the evolutionary stage of the embryo and the affinity of the compound by
the embryonic tissue (Chang et al., 2002).
Based on the obtained data, concluded that oral administration of the dry extract
obtained from the leaves of K. brasiliensis during the pre-implantation and organogenesis
periods in Wistar rats is safe at doses up to 400 mg/kg/day of body weight. However, due to
the high intrinsic variability common to biological organisms, the results often do not fully
reflect the phenomenon that takes place during the determinations. Thus, further studies are
needed to ensure the safe use of this plant during human gestation.
01-03 03-06 06-09 09-12 12-15 15-18 18-21 01-210
20
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80
100 Control
Kb 0.1 g/KgKb 0.2 g/KgKb 0.4 g/Kg
Days
Mat
erna
l bo
dy
mas
s g
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(g)
Figure 1. Effect of the oral administration of Kalanchoe braziliensis (Kb, 0.1, 0.2 and 0.4
g/kg) on the maternal body mass gain during pregnancy in Wistar rats. The values were
expressed as mean ± S.E.M (n=8/group).
47
01 03 06 09 12 15 18 210
5
10
15
20
ControlKb 0.1 g/KgKb 0.2 g/KgKb 0.4 g/Kg
Days
Fo
od
in
take
(g
/day
/rat
)
Figure 2. Effect of the oral administration of Kalanchoe brasiliensis (Kb, 0.1, 0.2 and 0.4
g/kg) on the maternal food intake (g/day/rat) during pregnancy in Wistar rats. The values were
expressed as mean ± S.E.M. (n=8/group).
01 03 06 09 12 15 18 210
10
20
30
40
50
ControlKb 0.1 g/KgKb 0.2 g/KgKb 0.4 g/Kg
Days
Wat
er i
nta
ke (
mL
/day
/rat
)
Figure 3. Effect of the oral administration of Kalanchoe brasiliensis (Kb, 0.1, 0.2 and 0.4 g/kg)
on the maternal water intake (mL/day/rat) during pregnancy in Wistar rats. The values were
expressed as mean ± S.E.M. (n=8/group).
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50
Table 1: Effect of the oral administration of K. brasiliensis on reproductive parameters during the preimplantation period (1st to 6th) in pregnant Wistar rats.
* Statistically different of the water control group (ANOVA, followed by Tukey test, p < 0.05). The values were expressed as mean ± S.E.M1 or median2.
Parameters Control (H2O) 0.1 g/kg 0.2 g/kg 0,4 g/kg
Pregnant rats 08 08 08 08
Mass gain in the pregnancy period (g)1 95,25 ± 5,07 73,58 ± 10,90 88,7 ± 8,82 84,05 ± 10,37
Mass gain in the preimplantation period (g)1 18,50 ± 2,69 11,16 ± 2,63 14,18 ± 1,70 13,24 ± 2,18
Number of live fetuses 90 82 81 85
Number of death fetuses 0 0 0 0
Offspring/dam relationship1 11,25 ± 0,49 10,25 ± 0,79 10,13 ± 0,71 10,63 ± 0,46
Absolute mass of the fetuses (g)1 2,56 ± 0,04 2,81 ± 0,22 2,50 ± 0,05 2,51 ± 0,04
Relative mass of the fetuses (g/100g)1 0,81 ± 0,01 0,96 ± 0,06 0,86 ± 0,03 0,89 ± 0,03
Length of the fetuses (cm)1 2,96 ± 0,01 2,91 ± 0,08 2,86 ± 0,09 2,66 ± 0,09*
Absolute mass of the placentae (g)1 0,49 ± 0,01 0,53 ± 0,02 0,504 ± 0,01 0,51 ± 0,009
Relative mass of the placentae (g/100g)1 0,156 ± 0,007 0,197 ± 0,016 0,171 ± 0,008 0,186 ± 0,008
Absolute mass of the ovary (mg)1 87,38 ± 3,10 87,08 ± 8,71 74,38 ± 7,61 78,39 ± 7,04
Relative mass of the ovary (mg/100g)1 27,69 ± 1,35 29,43 ± 2,57 25,41 ± 2,64 28,40 ± 3,92
Number of implantation 98 106 95 97
Number of viable implantations 94 94 88 91
Number of resorption 04 12 07 06
Number of corpora lutea1 12,25 ± 0,31 12,13 ± 0,54 12,00 ± 0,32 11,75 ± 0,25
Implantation index (%)2 100 100 96.15 100
Preimplantation loss (%)2
Postimplantation loss (%)2
0
3,84
0
10,80
3.84
8,71
0
9,09
51
Table 2: Effect of the oral administration of K. brasiliensis on reproductive parameters during organogenesis period (7th to 14th) in pregnant Wistar rats.
ANOVA followed by Tukey test, p < 0.05. The values were expressed as mean ± S.E.M1 or median2.
Parameters Control (H2O) 0.1 g/kg 0.2 g/kg 0,4 g/kg
Pregnant rats 08 08 08 08
Mass gain in the pregnancy period (g)1 94,38 ± 3,84 78,48 ± 7,13 87,8 ± 8,02 85,05 ± 9,22
Mass gain in the organogenesis period (g)1 34,50 ± 4,16 22,88 ± 4,47 28,38 ± 3,21 27,63 ± 4,06
Number of live fetuses 93 80 89 90
Number of death fetuses 0 0 0 0
Offspring/dam relationship1 11,62 ± 1,59 10,00 ± 1,19 11,12 ± 1,64 11,25 ± 1,03
Absolute mass of the fetuses (g)1 2,63 ± 0,05 2,57 ± 0,09 2,42 ± 0,06 2,44 ± 0,05
Relative mass of the fetuses (g/100g)1 0,83 ± 0,02 0,89 ± 0,02 0,83 ± 0,03 0,87 ± 0,03
Length of the fetuses (cm)1 2,56 ± 0,04 2,76 ± 0,05 2,63± 0,09 2,58 ± 0,07
Absolute mass of the placentae (g)1 0,50 ± 0,02 0,52 ± 0,02 0,49 ± 0,01 0,50 ± 0,008
Relative mass of the placentae (g/100g)1 0,16 ± 0,007 0,19 ± 0,01 0,17 ± 0,007 0,18 ± 0,008
Absolute mass of the ovary (mg)1 88,23 ± 2,13 83,80 ± 4,00 75,70 ± 4,90 78,85 ± 4,49
Relative mass of the ovary (mg/100g)1 27,95 ± 1,08 28,93 ± 1,77 25,78 ± 1,83 28,25 ± 2,54
Number of implantation 96 83 92 93
Number of viable implantations 93 80 89 90
Number of resorption 03 03 03 03
Number of corpora lutea1 12,25 ± 0,31 12,13 ± 0,54 12,00 ± 0,32 11,75 ± 0,25
Implantation index (%)2 100 100 100 100
Preimplantation loss (%)2
Postimplantation loss (%)2
0
0
0
0
0
0
0
0
52
6 Anexo I
Avaliação da atividade anti-inflamatória do extrato seco obtido por
aspersão de Kalanchoe brasiliensis Cambess
53
6.1 INTRODUÇÃO
Os produtos naturais apresentam-se como fonte de compostos com potencial
atividade biológica. Assim, a descoberta de protótipos para o desenvolvimento de novos
fármacos ou de novos agentes terapêuticos representa uma possibilidade para o
tratamento de patologias e processos inflamatórios associados à dor, podendo
determinar uma melhor qualidade de vida para os pacientes.
O uso popular e mesmo o tradicional não são suficientes para validar eticamente
as plantas medicinais como medicamentos eficazes e seguros. Nesse sentido, as plantas
medicinais não se diferenciam de qualquer outro xenobiótico sintético e sua
preconização ou autorização oficial do seu uso medicamentoso deve ser fundamentada
em evidências experimentais.
O modelo de inflamação induzido pela injeção intraplantar de carragenina é
considerado um importante teste para pesquisa de drogas anti-inflamatórias
(CRUNKHORN, MEACOCK, 1971; HENRIQUES et al., 1987). A administração de
carragenina na pata promove intensa vasodilação e extravasamento plasmático
mediados pela liberação de substâncias como cininas, taquicininas, óxido nítrico,
prostanóides, bem como a liberação de serotonina e histamina apartir de mastócitos
(ALVES et al., 1999). Além de desencadearem a formação do edema, estes mediadores
contribuem fortemente com a migração celular, principalmente de neutrófilos para o
sítio inflamatório, como demonstrado por Henriques e colaboradores (1987) através da
análise histológica da região subplantar da pata, realizado 4 horas após a administração
de carragenina.
6.2 METODOLOGIA
6.2.1 Avaliação da atividade anti-inflamatória induzida por carragenina
Foram usados três grupos de ratos (n=6/grupo). O primeiro grupo recebeu água
destilada 5 ml/kg (controle); o segundo grupo recebeu indometacina 10mg/kg (padrão
positivo) e o terceiro grupo recebeu o extrato seco de Kalanchoe brasiliensis na maior
dose (400 mg/kg). Todos os grupos foram tratados por via oral.
Decorridos 60 minutos de tratamento dos grupos, foi injetado por via subcutânea
na região subplantar da pata traseira direita (PD) do animal um volume de 0,1ml de
54
carragenina a 1% (diluída em salina) e na pata contralateral (PC) igual volume de
solução de NaCl a 0,9%. O volume da pata foi medido pletismograficamente
imediatamente após a injeção, sendo repetida a medição a cada hora até 3 horas após a
administração da carragenina. As patas foram imersas até o maléolo lateral em um
hidropletismômetro elétrico (Hugo Basile®) que mede o volume líquido deslocado e o
traduz de forma digital. O valor do edema foi determinado pela diferença de volumes
das patas injetadas (PD-PC).
6.2.2 Análise Estatística
Os valores foram expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m). A
homogeneidade das amostras foi avaliada pelo método de Bartlett’s. Quando a variância
mostrou-se homogênea, os dados foram analisados através da Análise de Variância
(ANOVA), seguidos por Tukey-Kramer. Os valores foram considerados significativos
para (p < 0,05). Os valores foram considerados significativos para (p < 0,05). As
análises estatísticas foram realizadas com a ajuda do software GraphPad Prism 5®.
6. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A época de colheita das plantas medicinais deve ser determinada visando não só
o volume de planta a ser coletado, mas, principalmente, buscando um teor mínimo de
princípios ativos, sem o qual o produto não tem valor para a produção de fitoterápicos.
Um exemplo desta afirmativa é o que ocorre com a Kalanchoe brasiliensis, quando são
avaliados os seus efeitos antiinflamatórios, já comprovados (PANIZZA, 1997 e
IBRAHIM et al., 2002).
Apesar de doses orais de 0,25; 0,5 e 1,0 g/kg de extrato obtido a partir das folhas
de Kalanchoe brasiliensis, coletadas antes da floração, inibir significativamente o
edema de pata durante as primeiras 4 horas após injeção de carragenina 2% (MOURÃO
et al., 1999); as mesmas doses por via oral do extrato obtido das folhas coletadas
durante a floração não apresentaram atividade inibitória sobre o edema de pata induzido
por carragenina 1%.
Como referido por Mourão e col. (1999), a atividade anti-inflamatória do K.
brasiliensis é influenciada pela época da coleta. Na floração essa atividade não é
55
observada. Tendo em vista a época da coleta das folhas (março a setembro) procurou-se
confirmar essa ausência de atividade antiedematogênica.
Como esperado, o resultado mostrou que a dose de 400 mg/kg do extrato seco de
K. brasiliensis não inibiu o edema produzido pela carragenina (Figura 1).
0 1 2 3 4
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Controle
Kb 400 mg/Kg
Tempo (h)
Ed
em
a (
mL
)
Figura 1. Efeito da administração oral nos grupos controle e extrato seco de K.
brasiliensis (Kb) no edema de pata de rato induzido por carragenina 1%. Os valores
representam as médias ± e.p.m.
56
7 Conclusão
57
7 CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos, concluiu-se que o extrato seco padronizado
das folhas de Kalanchoe brasiliensis, obtido por aspersão, quando administrado por via
oral em ratos Wistar:
� Protegeu a mucosa gástrica dos ratos contra as lesões induzidas pelo etanol,
sugerindo uma ação citoprotetora eficiente;
� Atenuou as lesões gástricas induzidas pela indometacina, sugerindo uma ação
protetora após absorção dos princípios ativos presentes neste extrato;
� Apresenta ação dose-dependente para atividade anti-ulcerogênica nas doses
administradas;
� Confirmou a ausência de atividade anti-inflamatória durante o período de
floração da referida planta, uma vez que não inibiu o edema produzido pela
carragenina;
� Não produziu morte ou efeitos tóxicos nas ratas durante a gestação em quaisquer
dos experimentos;
� Não demonstrou efeitos tóxicos sobre os parâmetros reprodutivos em ratas
Wistar e em seus conceptos, após tratamento no período de pré-implantação e
organogênese.
� As doses de 100, 200 e 400 mg/Kg de peso corpóreo, utilizadas nos
experimentos, podem ser consideradas seguras, uma vez que não causaram
letalidade ou mudanças adversas no comportamento geral e no estudo de
toxicidade reprodutiva nas ratas.
58
8 Referências Bibliográficas
59
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Avaliação farmacológica das atividades anti-inflamatória e antiulcerogênica do extrato seco obtido por aspersão de Kalanchoe brasiliensis Cambess e sua toxicidade reprodutiva em ratas Wistar / Luana Janine Lopes da Costa. – Recife : O Autor, 2010.
68 folhas: il., fig., tab., gráf.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2010.
Inclui bibliografia e anexo.
1. Kalanchoe brasiliensis Cambess. 2. Atividade antiinflamatória. 3. Atividade antiulcerogênica. 4. Toxicidade reprodutiva. I. Título.
615.322 CDU (2.ed.) UFPE 615.32 CDD (20.ed.) CCS2010-105
