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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Centro de Ciências da Saúde

Faculdade de Odontologia

Rio de Janeiro 2016

Andréa Vaz Braga Pintor

AVALIAÇÃO MULTIPARAMÉTRICA COMPARATIVA DA

CITOTOXICIDADE DE DIFERENTES MATERIAIS OBTURADORES

UTILIZADOS EM PULPECTOMIAS EM DENTES DECÍDUOS

ATRAVÉS DE MODELO DE SIMULAÇÃO DE CANAL RADICULAR

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Centro de Ciências da Saúde

Faculdade de Odontologia

Rio de Janeiro 2016

AVALIAÇÃO MULTIPARAMÉTRICA COMPARATIVA DA CITOTOXICIDADE DE DIFERENTES MATERIAIS OBTURADORES

UTILIZADOS EM PULPECTOMIAS EM DENTES DECÍDUOS ATRAVÉS DE MODELO DE SIMULAÇÃO DE CANAL RADICULAR

Andréa Vaz Braga Pintor

Tese de Doutorado submetida ao Programa de

Pós-graduação em Odontologia (Área de Concentração:

Odontopediatria) da Faculdade de Odontologia da

Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos

requisitos para obtenção do título de Doutor em

Odontologia (Área de Concentração: Odontopediatria).

Orientadores:

Prof.a Dra. Laura Salignac de Souza Guimarães Primo

Prof.a Adjunta da Disciplina de Odontopediatria da FO/UFRJ

Prof.a Dra. Roberta Barcelos

Profa Adjunta da Disciplina de Odontopediatria da FO/UFF-NF

Prof. Gutemberg Gomes Alves

Prof. Adjunto da Disciplina de Biologia Celular e Molecular

Unidade de Pesquisa Clínica HUAP/UFF

FICHA CATALOGRÁFICA

Pintor, Andréa Vaz Braga

Avaliação multiparamétrica comparativa da citotoxicidade de diferentes materiais obturadores

utilizados em pulpectomias em dentes decíduos através de modelo de simulação de canal radicular /

Andréa Vaz Braga Pintor. – Rio de Janeiro: UFRJ/Faculdade de Odontologia, 2016.

158 f. : il. ; 31 cm.

Orientadores: Laura Salignac de Souza Guimarães Primo, Roberta Barcelos, Gutemberg Gomes Alves.

Tese (doutorado) -- UFRJ, Faculdade de Odontologia, Programa de Pós-graduação em

Odontologia, Odontopediatria, 2016.

Referências bibliográficas: f. 136-149.

1. Materiais Restauradores do Canal Radicular – toxicidade. 2. Obturação do Canal Radicular. 3. Dente

Decíduo. 4. Sais de Tetrazólio - toxicidade. 5. Pulpectomia. 6. Sobrevivência Celular. 7. Odontopediatria -

Tese. I. Primo, Laura Salignac de Souza Guimarães. II. Barcelos, Roberta. III. Alves, Gutemberg Gomes. IV.

Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Odontologia, Programa de Pós-graduação em

Odontologia, Odontopediatria. V. Título.

FOLHA DE APROVAÇÃO

ANDRÉA VAZ BRAGA PINTOR

AVALIAÇÃO MULTIPARAMÉTRICA COMPARATIVA DA CITOTOXICIDADE DE DIFERENTES MATERIAIS OBTURADORES UTILIZADOS EM PULPECTOMIAS EM DENTES DECÍDUOS ATRAVÉS DE MODELO DE SIMULAÇÃO DE CANAL

RADICULAR

Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em

Odontologia (Área de Concentração: Odontopediatria) da Faculdade de

Odontologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos

para obtenção do título de Doutor em Odontologia (Área de Concentração:

Odontopediatria).

Rio de Janeiro, ___/___/___

DEDICATÓRIA

Aos meus amores Sergio, Bruna e Paula Pintor,

Aos meus pais Nilson e Sandra,

Á minha irmã Adriana

AGRADECIMENTOS

À Deus por me conceder a oportunidade e a dádiva da vida. Por guiar-me,

cega que sou, sigo confiante em seu projeto. Creio.

Ao meu esposo, filhas, pais, irmã, sobrinhos e sogros, meu amparo e

minha responsabilidade. Sergio Pintor, Bruna e Paula Pintor, Nilson e Sandra

Braga, Adriana Braga, Isadora Braga e Thiago Pintor, José (in memoriam) e Júlia

Pintor. Por todo o amor que recebo.

À Vânia, amiga de todos os dias, que cuida de mim e da minha família.

Aos meus generosos orientadores pelos seus conhecimentos, paciência e

tempo disponibilizados. Por terem me recebido como orientanda, agradeço pela

confiança em mim depositada. À Profa. Laura Salignac de Souza Guimarães

Primo pela orientação objetiva e pelo convívio tão rico, produtivo e agradável. À

Profa. Roberta Barcelos pela orientação eficiente e pelas inúmeras sugestões e

incentivos recebidos. Ao Prof. Gutemberg Gomes Alves pela orientação

competente na área da Biologia, desde o desenvolvimento do modelo de

simulação até a execução dos procedimentos experimentais.

Aos professores da Disciplina de Odontopediatria do Departamento de

Odontopediatria e Ortodontia da Faculdade de Odontologia da Universidade

Federal do Rio de Janeiro por terem me recebido como aluna e como professora

substituta. Professores: Ivete Pomarico, Marcelo Costa, Rogério Gleiser, Lucianne

Cople Maia, Glória Castro, Andréa Antônio, Luciana Pomarico e Aline de Almeida

Neves. Agradeço pelos ensinamentos recebidos e por propiciarem um ambiente

de estudo e trabalho de cooperação produtiva e harmoniosa. Tenho orgulho de

fazer parte desse projeto.

Às professoras Andréa Antônio e Márcia Thomas que compuseram a

Banca de Qualificação, pela leitura cuidadosa e por todas as alterações sugeridas

para a versão final desta tese.

Aos colegas de Doutorado pela troca proveitosa de conhecimentos, boas

conversas e amizade. À minha turma querida: Michelle Ammari, Michele Lenzi,

Adílis Alexandria e Marcelo Roter. Aos que me receberam com carinho e

generosidade: Tatiana Fidalgo, Ticiana Saboia, Márcia Thomas e Marlus

Cajazeira. Aos que reuniram suas forças e se agruparam: Adrielle Mangabeira,

Thaís Soares, Cláudia Tavares, Clarissa Avelar, Christiane Cruz, Thiago Isidro e

João Farinhas. Cada qual com seus talentos e interesses, unidos através da

Odontopediatria.

Aos mestrandos advindos de diferentes regiões do Brasil, que enriquecem

o programa com sua diversidade e mostram que uma boa Odontologia é ensinada

e praticada de Norte a Sul. Com carinho especial para Queila Braga, Marina

Siqueira, Nashalie Alencar, Helena Romanos, Daniele Cassol, Paula Pires,

Roberta Jorge e Raquel Carvalho.

Aos colegas Cirurgiões-dentistas do Departamento de Odontopediatria e

Ortodontia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio de

Janeiro: Nena Perez, Bárbara Guimarães, Andréa Quirino, Vanessa Silva e

Fernanda Barja. É muito bom contar com a experiência e amizade de vocês na

clínica.

Às queridas Mere de Assis, Andréa Seraphim e Kátia Seixas que com sua

eficiência tornam o atendimento dos pacientes pediátricos sempre mais fácil. Pela

alegria que irradiam.

Aos técnicos-administrativos: Maria Izabel do Amaral, Rosemere Roza,

Luiza Queiroz, Maria José Chagas, João Carlos Monteiro e Robson Azevedo.

Agradeço pela convivência agradável, amizade e pela eficiência com qual cuidam

do funcionamento do departamento.

À equipe do Laboratório de Cultura Celular da Unidade de Pesquisa Clínica

do Hospital Universitário Antônio Pedro/UFF. Em especial à Adriana Brandão

Linhares e Luciana Domênico Queiroz, pelo treinamento em cultivo celular e toda

a ajuda que me deram. À Ângela, Fátima e Sharlene pelo suporte e amizade.

Aos amigos de uma vida inteira pelo acolhimento, partilha e amizade:

Cláudia Souza, Vânia Nabuco, Mônica e José Calasans Maia, Lucienne Simões,

Roberto Prado, Tânia e João Bonnassis, Andréa e Renato Rocha, Patrícia

Vasconcellos e Paulo Prazeres, Ilka e Luís Henrique Pessanha, Luísa e Fernando

Carijó, Fernando Brumano, Cristina e Carlos Cunha.

Às alunas de Iniciação científica Clara Antunes e Juliana Kluft de Almeida

pela confiança na minha orientação.

Aos meus queridos alunos, que trazem um propósito aos conhecimentos

que recebi e à experiência que acumulei.

Aos pacientes, pela confiança e pelos desafios que representam, fazendo

com que busquemos o conhecimento e as soluções.

“Nós dizemos que estes tempos são difíceis. Nós devemos pensar que os

tempos são como nós somos; e temos de concluir que se nos comprometermos a

ser melhores, seremos capazes, juntos, de fazer tempos e mundo melhores”

(Santo Agostinho – Confissões 80,8)

RESUMO

PINTOR, Andréa Vaz Braga. Avaliação multiparamétrica comparativa da citotoxicidade de diferentes materiais obturadores utilizados em pulpectomias em dentes decíduos através de modelo de simulação de canal radicular. Rio de Janeiro, 2016. Tese (Doutorado em Odontologia – Área de concentração: Odontopediatria) – Faculdade de Odontologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2016.

O objetivo do estudo foi avaliar a citotoxicidade de pastas obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos através de um modelo de simulação de obturação de canal radicular de dente decíduo. A fim de orientar a escolha dos materiais, foi realizada uma revisão da literatura sobre as pastas utilizadas em estudos de Odontopediatria entre 2006 a 2016. Foram incluídos 21 artigos e concluiu-se que as pastas mais estudadas foram à base de óxido de zinco e eugenol (OZE) (n = 12), iodofórmio com hidróxido de cálcio (n = 8) e à base de hidróxido de cálcio (n = 3). Também foi executada uma revisão sistemática da literatura para a comparação dos resultados de efeito citotóxico (EC) de materiais obturadores de canais radiculares (MOCR) obtidos através de testes a base de sais de tetrazólio (TBST) e aqueles obtidos através de outro parâmetro de viabilidade celular nas mesmas células. O objetivo foi observar se os resultados de EC através das diferentes metodologias implicariam em tendências concordantes ou não de avaliação da citotoxicidade desses materiais. Foram incluídos 29 artigos e realizadas 279 comparações entre os resultados de avaliação do EC. Observou-se que 86,02% das comparações (n = 240) mostraram tendências similares de EC. Dentre os TBST, o MTT (n = 166) e o XTT (n = 81) apontaram tendências similares de EC em 87,95% e 92,59% das comparações. Os resultados sustentam a importância dos TBST para o rastreio da citotoxicidade de MOCR. Para a avaliação do EC das pastas selecionadas, foi desenvolvido um modelo de simulação de canal radicular que mimetizou as condições clínicas de obturação de canal radicular de dente decíduo limitando a exposição apical e a quantidade de material obturador usada. Através do modelo foi realizada a avaliação multiparamétrica da citotoxicidade das pastas: à base de OZE, Vitapex®, Guedes-Pinto, pasta de Guedes, Calcicur®, Calen® espessada com óxido de zinco (Calen/OZ), pasta UFRJ e Endoflas® (n = 3) frente a células primárias semelhantes a osteoblastos humanos. O estudo foi executado através dos ensaios de redução do XTT, da incorporação do Vermelho neutro (VN) e da densidade de células aderidas pela eluição do corante Cristal violeta (CVDE). Ademais, as pastas foram avaliadas na proporção material: veículo da ISO 10993-5 (2009) através do teste do XTT (n = 5). Quando avaliadas pelo modelo e o teste do XTT, mostraram EC leve: Calcicur®, UFRJ, Endoflas®, Calen/OZ, Guedes-Pinto e à base de OZE. Vitapex® e Guedes apresentaram EC moderado e forte. Através do VN o EC foi leve para Calcicur®, Endoflas®, Calen®/OZ, Guedes-Pinto e à base de OZE; moderado para Vitapex® e UFRJ e forte para Guedes. Os resultados do CVDE foram similares aos do VN, com exceção da pasta Calen®/OZ, não citotóxica. Segundo a proporção da ISO, a pasta Calcicur® mostrou EC moderado e as demais EC forte. Concluiu-se que as pastas apresentaram resultados de EC menores quando avaliadas através do modelo proposto comparados aos obtidos com a proporção ISO. A exceção foi a pasta de Guedes pronta para uso considerada fortemente citotóxica em todas as avaliações.

Palavras-chave: Dente decíduo, Obturação do canal radicular, Teste de materiais, Endodontia, Citotoxicidade. In vitro

ABSTRACT


The aim of this study was to evaluate, comparatively, the cytotoxicity of different root canal filling pastes for primary teeth through a root canal simulating model. Aiming the selection of the pastes, a narrative literature review was performed with regard to the mostly evaluated root canal filling materials in Pediatric dentistry studies (2006-2016). In the review 21 papers were included and the most evaluated pastes were: zinc oxide and eugenol based (n = 11), iodoform with calcium hydroxide (n = 8) and calcium hydroxide-based (n = 3). Also a systematic review was peformed aiming to compare the cytotoxic effect (CE) results of root canal flling materials (RCFM), obtained through the tetrazolium salt-based tests (TSBT), and those obtained through other cell viability parameters assays. The objective was to observe if the results of CE through the different methodologies would imply in concordant or not trends of the cytotoxicity for such materials. We included 29 studies and performed 279 comparisons between the CE results. It was noted that 86.02% (n = 240) of such comparisons showed similar CE trends. Among the TSBT, MTT (n = 166) and XTT tests (n = 81) pointed to similar trends of CE in 87.95% and 92.59% of the comparisons. These review results support the value of the TSBT for the cytotoxicity screening of RCFM. Aiming the evaluation of CE of the selected pastes, a root canal simulating model was developed, which mimetized the clinical conditions of root canal filling for primary teeth through the controll of the the apical exposure and the amount of filling paste used. Through the model a multiparametric evaluation of the cytotoxicity was performed of the pastes for: zinc oxide and eugenol (ZOE) based, Vitapex®, Guedes-Pinto, Guedes, Calcicur®, Calen® thickened with zinc oxide (Calen/ZO), UFRJ paste and Endoflas® (n = 3) to human osteoblast-like primary cells. The study was performed through the assays of: the XTT reduction, the Neutral red (NR) up-take dye and adhered cell density evaluation through the Crystal violet dye elution (CVDE). Furthermore, the pastes were evaluated according to the material: vehicle ratio recommended by the ISO 10993-5 (2009) through the XTT reduction assay (n = 5). When the pastes were evaluated through the model and the XTT assay, a slight CE was observed for Calcicur®, UFRJ, Endoflas®, Calen/ZO, Guedes-Pinto and ZOE. Vitapex® and Guede showed moderate cytotoxic and strong CE. Through the NR the CE was slight for Calcicur®, Endoflas®, Calen/ZO, Guedes-Pinto and ZOE; moderate for Vitapex® and UFRJ and strong for Guedes. The CVDE results were similar to those of NR, with exception for the Calen/ZO, not cytotoxic. According to the ISO proportion, the Calcicur® showed moderate CE and the others strong CE. It was concluded that the CE results through the model were lower than those obtained through the ISO proportion. The exception was the ready-to-use Guedes paste, considered strongly cytotoxic in all evaluations .

Key-words: Tooth, deciduous; Root canal obturation, Materials testing, Endodontics; Cytotoxicity, in vitro

RESUMEN


El objetivo del estudio fue comparar la citotoxicidad de materiales de obturación de conductos radiculares de los dientes primarios a través de un modelo de simulación del conducto radicular de los dientes primários. Con el objetivo de la selección da las pastas, una revisión de la literatura se realizó con respecto a los materiales de obturación de conductos radiculares de los dientes primarios más estudiados en Odontología pediátrica (2006-2016). En la revisión 21 trabajos fueron incluidos y las pastas más evaluadas fueron: a base de óxido de zinc y eugenol (OZE) (n=12), yodoformo con hidróxido de calcio (n = 8) y a base de hidróxido de calcio (n=3). También se realizó una revisión sistemática con el objetivo de comparar los resultados de la evaluación del efecto citotóxico (EC) in vitro de materiales de obturación de conducto radicular (MOCR) obtenidos mediante ensayos con base de sales de tetrazolio (EBST) y los obtenidos por medio de otros parámetros de viabilidad celular. Se incluyeron 29 artículos y se hicieron 279 comparaciones entre los resultados de EC. Se observó que 86,02% (n=240) de esas comparaciones mostraron tendencias similares de EC teniendo en cuenta las diferentes pruebas. Entre los TBST, el MTT (n =166) y el XTT (n =81) mostraron tendencias similares de el EC en 87,95% y 92,59% de las comparaciones. Los resultados de esa revisión respaldan el valor de los EBST para el rastrero de la citotoxicidad de los MOCR. Con el objetivo de la evaluación de el EC de las pastas selecionadas, un modelo de simulación del conducto radicular se ha desarrollado, que simuló las condiciones clínicas de obturación del canal radicular de los dientes primários a través de la controll de la exposición apical y de la cantidade de pasta utilizada. A través del modelo se realizo una evaluación de múltiples parámetros de citotoxicidad de las pastas: a base de OZE, Vitapex®, Guedes-Pinto, Guedes, Calcicur®, Calen® con óxido de zinc (Calen/OZ), UFRJ y Endoflas® (n=3) a las células similares a osteoblastos humanos primarios. El estudio se realizó a través de pruebas de la reducción de XTT, de la inclusión de colorante Rojo neutro (RN) y mediante la evaluación de la densidad de células adheridas por elución de el colorante Cristal violeta (CVDE). Además, las pastas fueron evaluadas por el proporción material: vehículo recomendado por ISO 10993-5 (2009) por el ensayo de reducción XTT (n = 5). Cuando se evaluaron las pastas por el modelo y el ensayo de XTT se observó ligeiro EC para Calcicur®, UFRJ, Endoflas®, Calen/ZO, Guedes-Pinto y OZE. Vitapex® y la Guedes mostraran citotóxicidade moderada y fuerte. A través de la RN, el EC fue ligero para Calcicur®, Endoflas®, Calen/ZO, Guedes-Pinto y OZE; moderado para Vitapex® y UFRJ y flerte para Guedes. Los resultados CVDE fueron similares a los RN, con excepción de la Calen/ZO, no citotóxica. De acuerdo con la proporción de la ISO, Calcicur® mostro moderado EC y las otras fuerte. Se concluyó que los resultados de EC a través del modelo eran más bajos que los obtenidos a través de la proporción ISO. La excepción de la carpeta Guedes listo para usar, considerada fuertemente citotóxica en todas las evaluaciones.

Palabras-clave: Diente primario, Obturación del conducto radicular, Ensayo de Materiales, Endodoncia, Citotoxicidad, in vitro

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Exemplo de identificação dos resultados de efeito citotóxico em gráfico

de artigo, através do programa xScope 4.0® ........................................................ 45

Figura 2. A) Componentes do dispositivo modelo de simulação in vitro da

obturação de canal radicular de dente decíduo, B) Dispositivo montado. ........... 51

Figura 3. A) Pesagem de pasta obturadora (0,037g), B) Dispositivo modelo de

simulação de obturação com 185μl de meio de cultura Dulbecco’s Modified

Eagle’s media (DMEM) sem soro para obtenção do extrato do material (Vitapex®).

............................................................................................................................. 55

Artigo 2

Figure 1. Study selection flow diagram (Moher et al., 2015)................................. 90

Artigo 3

Figure 1. A) Components of the root canal simulating model; B) Filled root canal

simulating model ........................................................................................................ 125

Figure 2. Cytotoxicity assay results through the root canal simulating model (A, B,

C) and through the ISO 10993-5 (2009) material / vehicle standard (D). Cytotoxic

effects of the positive control (C+), negative control (C-), Calcicur®, Vitapex®,

Guedes paste (Fórmula & Ação) (GD), UFRJ paste, Endoflas®, Calen® thickened

with zinc oxide (CALEN/ZO), Guedes-Pinto paste (GP), and ZOE paste on primary

human osteoblast-like cells measured by Crystal violet dye elution (A), NRU (B)

and XTT tests (C, D) and expressed as a percentage of experimental control (cells

exposed to unconditioned medium) cell viability. *Statistically significant

differences between groups relative to the control (p < 0.05)................................ 126

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Principais características de diferentes ensaios de citotoxicidade

utilizados na avaliação de materiais obturadores de canais radiculares .............. 33

Tabela 2. Delineamento da pergunta segundo a estratégia (PECO) população,

exposição, comparação e resultados (outcomes) ................................................ 40

Tabela 3. Estratégia de busca .............................................................................. 41

Tabela 4. Classificação de efeito citotóxico com base nos resultados de

viabilidade celular relativa aos controles, adaptado de DAHL et al., 2006) .......... 46

Tabela 5. Classificação morfológica qualitativa da citotoxicidade dos extratos .... 47

Tabela 6 Resultados das comparações executadas entre as diferentes

metodologias de avaliação da citotoxicidade e os ensaios à bse de sais de

tetrazólio ............................................................................................................... 49

Tabela 7: Pastas obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos .......... 52

Artigo 1

Table 1: Characteristics of included studies .............................................................. 70

Artigo 2

Table 1. Outlines the populations, exposition, comparisons, and outcomes (PECO format).

................................................................................................................................. 91

Table 2. Electronic database and search strategy ........................................................... 91

Table 3. Characteristics of the included studies .............................................................. 92

Table 4. Root canal filling materials brands / compositions ............................................. 97

Table 5. Results of the cytotoxic effect evaluation and comparisons ............................. 100

Table 6. Comparisons results considering the different assays parameters .................. 106

Artigo 3

Table 1. Components of the root canal pastes tested ............................................ 127

LISTA DE SIGLAS

ADA American Dental Association

CA50 Concentração de Atividade 50

CO2 Dióxido de carbono

CSEO Concentração Sem Efeito Observado

DCFH-DA Teste de diacetato de diclorofluoresceína

DeCS Descritores em Ciências da Saúde

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s media

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucleico

DO densidade ótica

ECVAM European Centre for the Validation of Alternative Methods

EUA Estados Unidos da América

FO-UFF/NF Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, Nova Friburgo

FO-UFRJ Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro

HO-1 Heme oxygenase-1

HUAP/UFF Hospital Universitário Antônio Pedro/Universidade Federal

ISO International Standard Organization

LDH Lactato desidrogenase

LILACS Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciências da Saúde

MCCEO Menor Concentração Com Efeito Observável

MEV Microscopia eletrônica de varredura

ml Mililitro

MOCR Material obturador de canal radicular

MTS 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio

MTT brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio

NAC Conteúdo de ácido nucleico

OHAT Office of Health Assessment and Translation

OZE Óxido de zinco e eugenol

PARP Poli(ADP-ribose) polimerase

Pasta UFRJ Pasta Universidade Federal do Rio de Janeiro

PECO População, exposição, comparação e resultados (outcomes)

ROS Espécies reativas de oxigênio

TBARS Teste de ácido tiobarbitúrico substâncias reativas

TBST Testes à base de sal de tetrazólio

ToxRTool® Toxicological data Reliability Assessment Tool

UPC Unidade de Pesquisa Clínica

WST-1 Sal de tetrazólio solúvel em água

xScope 4.0® The Iconfactory and ARTIS software (Greensboro, EUA)

XTT 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazólio-5-carboxanilida

μl Microlitro

LISTA DE SÍMBOLOS

= Igual

± Mais ou menos

> Maior que

< Menor que

°C Graus Celsius

-- não citotóxico

- levemente citotóxico

+ moderadamente citotóxico

++ fortemente citotóxico

SUMÁRIO

1. Introdução .............................................................................................................. 21

1.1 Considerações sobre a avaliação da citotoxicidade ..................................... 28

2. Objetivo geral ......................................................................................................... 36

3. Objetivos específicos ............................................................................................ 36

4. Delineamento da pesquisa ................................................................................... 37

4.1 Tipo de estudo .............................................................................................. 37

4.2 Locais de execução do estudo ..................................................................... 37

4.3 Avaliação da citotoxicidade ........................................................................... 38

4.3.1 Revisão da literatura recente sobre as pastas obturadoras de canais

radiculares de dentes decíduos mais utilizadas e avaliadas em estudos de

Odontopediatria. ................................................................................................... 38

4.3.2 Revisão sistemática: comparação dos resultados de efeito citotóxico de

materiais obturadores de canais radiculares obtidos através dos testes a base de

sais de tetrazólio com os logrados através de outros ensaios de avaliação de

citotoxicidade ........................................................................................................ 39

4.3.3 Avaliação da citotoxicidade de pastas obturadoras de canais radiculares de

dentes decíduos através de modelo de simulação in vitro da obturação de canal

radicular de dente decíduo, limitando-se a quantidade de pasta obturadora

empregada e a exposição apical .......................................................................... 50


dentes decíduos através do ensaio do XTT com a proporção veículo/material

recomendada pela ISO 10993-5 (2009) ............................................................... 58

5. Resultados ............................................................................................................. 60

5.1 Artigo 1: A critical review of the root canal filling materials mostly used in the

recent pediatric studies ........................................................................................ 60

5.2 Artigo 2: Are the results of the cytotoxicity of the root canal filling materials

evaluated through the tetrazolium salt-based tests and other cell viability

parameters conflitant? A systematic review ......................................................... 72

5.3 Artigo 3: Multiparametric evaluation of the cytotoxicity of selected root canal

filling materials for primary teeth through a root canal simulating model ............ 107

6. Considerações finais ........................................................................................... 128

7. Referências .......................................................................................................... 137

Anexos ........................................................................................................................ 151

Apêndice ..................................................................................................................... 159

21

1. Introdução

1.1 Considerações sobre pastas obturadoras de canais radiculares de

dentes decíduos

A manutenção da integridade da dentição decídua até sua completa

substituição pela dentição permanente constitui o principal objetivo da

Odontopediatria e também seu maior desafio (AAPD, 2014). Os dentes decíduos

apresentam dimensões menores que os correspondentes permanentes e,

consequentemente, as camadas de esmalte e dentina que protegem o tecido

pulpar são mais delgadas, o que facilita a instalação e a progressão dos

processos patológicos (IMPARATO, 2013). Os dentes decíduos expostos a

doenças como a cárie dentária ou a traumatismos, frequentemente necessitam de

intervenção, que além das restaurações coronárias, incluem a terapia pulpar.

Entre estas terapias o capeamento pulpar indireto e a pulpotomia visam preservar

a vitalidade pulpar, enquanto a pulpectomia é indicada para o tratamento de

condições inflamatórias irreversíveis e necrose da polpa dentária (FUKS, 2002;

RODD et al., 2006, AAPD, 2014, AHMED, 2014). Tais procedimentos apresentam

níveis satisfatórios de evidência científica (RODD et al., 2006).

Uma das principais metas clínicas da pulpectomia ou tratamento

endodôntico convencional é remover o tecido necrótico ou a polpa vital e

minimizar a quantidade de substâncias irritantes que possam estar presentes no

interior do sistema de canais radiculares, sendo a limpeza e a desinfecção desses

essenciais para o sucesso do tratamento endodôntico (HAAPASALO et al., 2005).

Devido a variabilidade morfológica e grande complexidade do sistema de canais

radiculares dos dentes decíduos posteriores, a pulpectomia em molares decíduos

ainda constitui um desafio na prática clínica Odontopediátrica (AHMED, 2013).

Dessa forma, o controle microbiano deve sustentar-se em um preparo químico-

mecânico eficiente associado à utilização de materiais obturadores que propiciem

selamento do sistema de canais radiculares (ROSA et al., 2010), e que

22

apresentem propriedades antimicrobianas e biocompatibilidade com os tecidos

periapicais (AMORIM et al., 2006).

Diferentes protocolos de tratamento envolvendo o procedimento da

pulpectomia em dentes decíduos têm sido apresentados e avaliados

(MORTAZAVI e MESBAHI, 2004; TRAIRATVORAKUL e CHUNLASIKAIWAN,

2008; AZEVEDO et al., 2009; BARCELOS et al., 2012). Entretanto, dentro do

conceito de decisão e prática clínica alicerçada pela Odontologia Baseada em

Evidências Científicas, o tópico ainda necessita da atenção e dedicação dos

pesquisadores. Em uma busca na base da ADA (American Dental Association),

em seu Centro de Odontologia Baseada em Evidências (EBD), três Revisões

Sistemáticas relacionadas ao tema foram identificadas (NADIN et al., 2003,

BARCELOS et al., 2011, BARJA-FIDALGO et al., 2011). Em todas, foi constatada

a falta de estudos clínicos randomizados controlados de longo prazo de

acompanhamento com forte evidência de comprovação para a determinação de

uma técnica e material obturador ideais.

Um material obturador ideal para o preenchimento do sistema de canais

radiculares de dentes decíduos deve apresentar propriedades e características

adequadas ao seu curto ciclo biológico e a proximidade com os dentes

permanentes em desenvolvimento. Assim, o material deve apresentar: (i)

reabsorção compatível com a aquela que ocorre nas raízes dos dentes decíduos,

(ii) rápida reabsorção, se extravasado através do forame apical durante a

obturação dos canais radiculares, (iii) biocompatibilidade com os tecidos

periapicais e os dentes permanentes em desenvolvimento, (iv) adesão às paredes

dos canais radiculares promovendo selamento do sistema de canais e (v) alto

poder antimicrobiano (HOLAN e FUKS, 1993, SARIGOL et al., 2010). Um

material obturador de canais radiculares biocompatível deve auxiliar ou estimular

o reparo tecidual (HUANG et al., 2002). Entretanto nenhum material obturador de

canais radiculares para dentes decíduos apresenta todas estas características.

Na literatura não há consenso sobre qual o melhor material (BARCELOS et al.,

2011, Al-OSTWANI et al., 2016), porém há evidência moderada para o uso das

pastas de óxido de zinco e eugenol (OZE), e de hidróxido de cálcio com

iodofórmio (BARJA-FIDALGO et al., 2011). Atualmente são recomendadas para a

23

obturação de canais radiculares de dentes decíduos as pastas, materiais que não

tomam presa, à base de hidróxido de cálcio (RODD et al., 2006), iodofórmio com

hidróxido de cálcio e à base de óxido de zinco e eugenol (RODD et al., 2006;

AAPD, 2014).

Estudo recente identificou na literatura os materiais obturadores de canais

radiculares de dentes decíduos mais usados, estudados e avaliados em

Odontopediatria e revelou que a pasta de óxido de zinco e eugenol ainda é a mais

utilizada nos estudos clínicos (ALMEIDA et al., 2013). Entretanto, as pastas

iodoformadas apresentaram uma tendência de aumento na sua utilização, sendo

empregadas inclusive, como material controle em estudos comparativos

(NAKORNCHAI et al., 2010; HOWLEY et al., 2012; ALMEIDA et al., 2013).

As pastas a base de iodofórmio apresentam frequência de sucesso clínico

entre 65 a 100% e foram introduzidas como materiais obturadores de canais

radiculares de dentes decíduos com base em suas propriedades desinfetantes

(BARCELOS et al., 2011) e pela maior facilidade de reabsorção, comparada à

pasta de óxido de zinco e eugenol (BARJA-FIDALGO et al., 2011). No Brasil, foi

proposta uma pasta composta por partes visualmente iguais de iodofórmio,

paramonoclorofenolcanforado e pomada Rifocort® (1,5mg rifamicina SV sódica,

5,0mg acetato de prednisolona e excipientes: metabissulfito de sódio,

propilenoglicol, ascorbato de sódio, macrogol) (Medley, Campinas, Brasil)

(GUEDES-PINTO et al., 1981), denominada Pasta Guedes-Pinto, a qual é

amplamente utilizada nas faculdades de Odontologia brasileiras (LEAL et al.,

2004; CERQUEIRA et al., 2008). Recentemente o efeito citotóxico da pasta

Guedes-Pinto sobre células mononucleares do sangue periférico foi avaliado

através do ensaio MTT, a base de sal de tetrazólio, o qual avaliou a atividade

mitocondrial dessas células após a exposição à pasta. No período de observação

de 24 horas, não houve diferença estatística significativa entre a pasta de

Guedes-Pinto e o controle experimental constituído de células não expostas a

material (PIRES et al. 2015). Estudos microbiológicos demonstraram o amplo

potencial antimicrobiano dessa pasta (AMORIM et al., 2006), sendo comprovada

sua ação contra quase todos os microrganismos encontrados em infecções

endodônticas de dentes decíduos (VARGAS-FERREIRA et al., 2010). Entretanto,

24

um de seus componentes, a pomada Rifocort® foi retirada do mercado, sendo

necessária sua manipulação em farmácia para a utilização na pasta. Dessa

forma, Antoniazzi et al. (2015) avaliaram a substituição da pomada Rifocort® por

outras associações com potencial antimicrobiano, como por exemplo o

digluconato de clorexidina, passíveis de serem empregadas no tratamento

endodôntico de dentes decíduos. Porém, ainda são necessários estudos que

avaliem a compatibilidade dos fármacos com os tecidos para possibilitar seu

emprego clínico. Em consideração aos seus aspectos citotóxicos, microbiológicos,

histopatológicos, e ao sucesso clínico, a Pasta Guedes-Pinto pode ser utilizada

como material de escolha para a terapia pulpar de dentes decíduos (CERQUEIRA

et al., 2008).

Na literatura há uma pasta que apresenta como componentes os materiais:

óxido de zinco, eugenol, hidróxido de cálcio, tri-iodometano e iodo

dibutilortocresol; acrescida de sulfato de bário e paramonoclorofenol (Endoflas®),

a qual tem sido empregada como material obturador dos canais radiculares de

dentes decíduos com alta frequência de sucesso clínico e radiográfico (RAMAR e

MUNGARA, 2010; MOSKOWITZ et al., 2010; MOSKOWITZ et al., 2012; REWAL

et al., 2014). Esta pasta apresentou alta citotoxicidade para fibroblastos gengivais

humanos (BRISEÑO e WILLERSHAUSEN, 1992), reduziu a viabilidade celular de

macrófagos e células epiteliais de forma dose-dependente, tanto por contato

direto, quanto pela sua diluição em meio de cultura, quando em altas doses

(PETEL et al., 2013) e apresentou alta toxicidade tecidual (MITTAL et al., 1995).

Em estudo que avaliou o grau de reabsorção radicular após o tratamento

endodôntico de molares decíduos com esse material, comparado à reabsorção

dos molares decíduos homólogos sem tratamento dos canais radiculares,

concluiu-se que o material acelerou a reabsorção radicular (MOSKOWITZ et al.,

2012). Moskowitz et al. (2010) observaram que 3,3% dos 242 molares decíduos

tratados com esse material apresentaram aumento da área de lesão periapical

durante o acompanhamento radiográfico. Os autores relataram que tal aumento

pode estar relacionado a uma irritação dos tecidos periapicais e dos folículos de

desenvolvimento dos dentes permanentes sucessores, causada por algum

componente da fórmula. A análise histológica executada em um destes dentes

25

evidenciou um cisto radicular (PETEL et al., 2013). Outros relatos de formação de

cistos radiculares associados ao tratamento endodôntico de dentes decíduos são

encontrados na literatura para pastas contendo hidróxido de cálcio e iodofórmio

(TAKIGUCHI et al., 2001; NAGATA et al., 2008), contudo esta associação entre o

aparecimento de cistos radiculares em molares decíduos e o tratamento

endodôntico não está esclarecida. A literatura sugere que os materiais

obturadores de canais radiculares de dentes decíduos podem causar irritação aos

tecidos periapicais, a qual pode estar relacionada à formação dos cistos (PETEL

et al., 2013).

A pasta de óxido de zinco e eugenol (OZE), desde sua primeira descrição

como material obturador dos canais radiculares de dentes decíduos (SWEET,

1930) tem sido o material mais utilizado em estudos científicos (BARJA-FIDALGO

et al., 2011, BARCELOS et al., 2012, ALMEIDA et al., 2013) e nos programas de

Odontopediatria das faculdades de Odontologia norte-americanas (PRIMOSH,

1997; DUNSTON et al., 2008). Em estudo recente, observou-se que o OZE e o

hidróxido de cálcio foram os materiais obturadores para dentes decíduos

preferidos nas Universidades Colombianas (HINCAPIÉ et al., 2014). A pasta de

OZE apresenta desempenho clínico satisfatório (OZALP et al., 2005;

TRAIRATVORAKUL E CHUNLASIKAIWAN, 2008; BARCELOS et al., 2012),

embora apresente velocidade de reabsorção lenta, sendo associado à erupção

ectópica de dentes permanentes (TANNURE et al., 2011). Em estudo executado

no município do Rio de Janeiro (RJ) observou-se a preferência pelo OZE

acrescido de formocresol como material para obturação de canais radiculares de

dentes decíduos em situações clínicas propostas através de questionário

(BARJA-FIDALGO et al., 2010). Entretanto, o eugenol, bem como os derivados

fenólicos e o formaldeído, foram considerados inapropriados como componentes

de materiais obturadores de canais radiculares pelo potencial risco de injúria

tecidual como resultado de toxicidade celular (BARBOSA et al., 1993). Outros

estudos também observaram que o OZE reduziu a viabilidade celular (HUME et

al., 1993; HUANG et al., 2002). Este material reduziu a viabilidade de fibroblastos

gengivais humanos em ensaio com o teste do Vermelho Neutro e foi considerado

citotóxico (AZAR et al., 2000). Considerando a avaliação da atividade

26

antimicrobiana da pasta a base de óxido de zinco e eugenol, foi observado que

essa produziu inibição do crescimento bacteriano de cepas encontradas em

infecções endodônticas (QUEIROZ et al., 2009). Além disso a atividade

antibacteriana apresentada pela pasta a base de óxido de zinco e eugenol foi

superior a pasta de hidróxido de cálcio (Calen) espessada com óxido de zinco; a

pasta Sealapex, composta por material a base de óxido de cálcio, trióxido de

bismuto e óxido de zinco e a pasta EndoREZ - à base de óxido de zinco e matriz

resinosa (QUEIROZ et al., 2009).

Com o propósito de superar as limitações da pasta de OZE como material

obturador de canais radiculares de dentes decíduos, outros materiais têm sido

investigados, dentre eles as pastas de hidróxido de cálcio (CHAWLA et al., 1998;

NADKARNI e DAMLE, 2000; OZALP et al., 2005; COSER et al., 2008; SARI et al.,

2008). As pastas de hidróxido de cálcio têm sido empregadas com diferentes

formulações apresentando bons resultados clínicos (OZALP et al., 2005; COSER

et al., 2008; SARI et al., 2008; MASSARA et al., 2012), com índices de sucesso

que variam entre 86,7% a 100% (BARCELOS et al., 2011). O hidróxido de cálcio

apresenta propriedades antimicrobianas (PIVA et al., 2009) contra cepas

comumente encontradas em infecções endodônticas, quando avaliadas com e

sem espessamento com óxido de zinco (QUEIROZ et al., 2009). E em relação à

biocompatibilidade, foram encontrados resultados satisfatórios na literatura

(SILVA et al., 2010; QUEIROZ et al., 2011). Huang et al. (2002) observaram

menor citotoxicidade para um cimento à base de hidróxido de cálcio quando

comparada a materiais obturadores de canais radiculares que continham OZE.

Entretanto, Leonardo et al. (2000) observaram resultado contrário.

Todavia, foi observado que o hidróxido de cálcio apresenta uma tendência

a ser solubilizado no interior dos canais radiculares de dentes decíduos, antes da

reabsorção fisiológica destes dentes (CHAWLA et al., 1998). Assim, algumas

pastas foram espessadas com óxido de zinco (CHAWLA et al., 2001) ou com

óxido de zinco e fluoreto de sódio (CHAWLA et al., 2008) com a finalidade de

reduzir a velocidade de reabsorção intracanal e facilitar a visualização

radiográfica. A dificuldade no espessamento das pastas para uso clínico está na

dependência do operador e das condições de manipulação das pastas, levando a

27

uma falha de padronização do material. Dessa forma uma formulação espessada

com óxido de zinco de fabricação nacional e pronta para uso, tem sido objeto de

interesse dos pesquisadores da linha de pesquisa de terapia pulpar do

Departamento de Odontpediatria e Ortodontia da UFRJ. Assim, uma formulação

foi desenvolvida em parceria com a indústria de materiais odontológicos e

denominada pasta UFRJ, a qual apresenta como característica ser facilmente

inserida em canais radiculares por técnica de obturação com broca lentulo. No

presente estudo, a pasta UFRJ foi primeiramente avaliada quanto ao potencial de

redução da viabilidade celular.

Altos níveis de citotoxicidade foram observados nos representantes dos

principais grupos de materiais utilizados na prática odontológica em um estudo

que avaliou materiais obturadores para os sistemas de canais radiculares de

dentes permanentes através de testes de avaliação multiparamétrica da

viabilidade celular de células humanas primárias. Estes resultados indicaram que

devem ser realizados esforços para a formulação de materiais mais

biocompatíveis e uma reavaliação das metodologias in vitro para a determinação

da viabilidade celular (SCELZA et al., 2012).

Nos dentes decíduos, a proximidade das áreas receptoras de pasta

obturadora com os dentes sucessores permanentes em desenvolvimento gera um

ambiente biofísico e bioquímico onde a ação ou liberação de possíveis produtos,

a partir desses materiais, podem ter efeitos indesejáveis. Além disso, como as

pastas obturadoras não tomam presa, as mesmas poderiam apresentar maior

solubilidade comparadas a cimentos de obturação de canais radiculares utilizados

em dentes permanentes. Dessa forma, testes de avaliação da citotoxicidade de

materiais obturadores têm sido executados (HUANG et al., 2007; SARIGOL et al.,

2010, PIRES et al., 2015). Contudo, a utilização de diferentes metodologias e

linhagens celulares dificulta a interpretação e a comparação dos dados (HUANG

et al., 2007; SARIGOL et al., 2010; SCELZA et al., 2012; PIRES et al., 2015).

Na literatura, a avaliação da citotoxicidade de pastas obturadoras de canais

radiculares de dentes decíduos a base de óxido de zinco e eugenol, de hidróxido

de cálcio e de iodofórmio frente a diferentes linhagens celulares, mostra

28

resultados de efeito citotóxico diversos que variam de moderado a grave

(BRISEÑO e WILLERSHAUSEN, 1990; BRISEÑO e WILLERSHAUSEN, 1992;

AZAR et al., 2000; HUANG et al., 2002; SARIGOL et al., 2010; PETEL et al.,

2013; POGGIO et al., 2014). Sendo observado que a utilização de células

primárias semelhantes a osteoblastos humanos para a avaliação da

biocompatibilidade in vitro de materiais com finalidade endodôntica já foi testada

com sucesso (ZHU et al., 2000; HUANG e CHANG 2002; WANG et al., 2007;

DEUS et al., 2012; SCELZA et al., 2012). Contudo, são encontradas frequências

de sucesso clínico e radiográfico moderadas e altas para as pastas obturadoras

de canais radiculares de dentes decíduos a base de óxido de zinco e eugenol, de

hidróxido de cálcio e de iodofórmio (OZALP et al., 2005; MOSKOWITZ et al.,

2005; TRAIRATVORAKUL e CHUNLASIKAIWAN, 2008; BARCELOS et al., 2012;

REWAL et al., 2014). Assim, com a finalidade de mimetizar as condições clínicas

de obturação de canal radicular de dente decíduo, este estudo propôs o

desenvolvimento de um modelo de simulação in vitro da obturação de canal

radicular desses dentes, limitando-se a quantidade de pasta obturadora

empregada e a exposição apical. Tal modelo destinou-se a avaliação da

biocompatibilidade in vitro de pastas obturadoras de canais radiculares de dentes

decíduos à base de óxido de zinco e eugenol, de hidróxido de cálcio e de

iodofórmio frente a uma linhagem celular de interesse relacionada com o

processo de reparo ósseo, células semelhantes a osteoblastos.

1.2 Considerações sobre a avaliação da citotoxicidade

A avaliação da citotoxicidade de determinada substância ou material requer

a utilização de células em cultivo como modelo de função fisiológica. As células

obtidas diretamente de um explante, por desagregação enzimática ou mecânica,

são denominadas células primárias, apresentam características genotípicas e

fenotípicas do tecido de origem e crescem em cultura por um período de tempo

limitado. Algumas células podem dar origem a uma linhagem celular contínua,

que embora não tenham perdido as características do tecido de origem,

apresentam alta taxa de proliferação. A alteração em uma cultura que acarreta o

aparecimento de linhagem de células contínua é chamada transformação in vitro.

29

As células que apresentam uma capacidade infinita de crescimento são

denominadas imortalizadas (FRESHNEY, 2005)

A viabilidade celular é caracterizada pela mensuração da capacidade das

células para executar determinadas funções como metabolismo, crescimento,

reprodução, alguma forma de responsividade e adaptabilidade (DESCRITORES

EM CIÊNCIAS DA SAÚDE, 2016).

Em relação à biocompatibilidade, pode-se afirmar que um material é

considerado biocompatível quando, aplicado com finalidade específica e correta,

comporta-se adequadamente em um tecido receptor (DOROZHKIN, 2010), de tal

forma que a interação entre ambos não resulte em irritação, lesão, inflamação,

pirogenicidade, mutagenicidade, carcinogenicidade, imunogenicidade ou

toxicidade (CALASANS-MAIA, 2009). Ou seja, sem gerar efeitos locais ou

sistêmicos ao hospedeiro, proporcionando uma resposta benéfica (GRANJEIRO e

SOARES, 2011). Contrariamente, o termo toxicidade refere-se a capacidade de

uma substância produzir efeito danoso ou nocivo através de sua interação com

organismo vivo. Quando o efeito nocivo é avaliado em nível celular através de

testes in vitro, observa-se a citotoxicidade ou efeito citotóxico de determinada

substância (GRANJEIRO e SOARES, 2011). Segundo Eisenbrand et al. (2002) o

termo citotoxicidade refere-se ao potencial apresentado por um composto de

induzir morte celular.

Assim, os testes para avaliação in vitro da citotoxicidade são importantes

para definição da citotoxicidade basal, ou seja, do potencial de um composto ou

substância em causar morte celular como consequência de um dano celular ou

desequilíbrio de funções celulares básicas em determinado número de células.

Ademais, os ensaios de citotoxicidade auxiliam na avaliação do comportamento

de uma cultura de células expostas a diferentes concentrações da substância ou

composto investigado (EISENBRAND et al., 2002).

O desenvolvimento de ensaios para a avaliação de efeito citotóxico ou

citotoxicidade in vitro com base na detecção de células viáveis, objetivou

idealmente a possibilidade de utilização desses testes em amostras de tamanho

grande, com a avaliação específica de células viáveis em uma mistura contendo

30

também células mortas (GREEN et al., 1984). Em 1983, Mosman (1983) propôs

um teste colorimétrico rápido a base de sal de tetrazólio (brometo de 3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) MTT com aplicabilidade para a avaliação da

viabilidade/proliferação celular. Desde então, o ensaio de redução do MTT e de

outros à base de sais de tetrazólio como o 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-

2H-tetrazólio-5-carboxanilida), XTT (SCUDIERO et al., 1988); o (3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio) MTS

(BARLTROP e OWEN, 1991); e o sal de tetrazólio solúvel em água, WST-1 (TAN

e BERRIDGE, 2000), têm sido utilizados na avaliação da citotoxicidade in vitro de

diferentes substâncias (VRBOVÁ et al., 2016; TAO et al., 2016) e materiais

(SCELZA et al., 2012). Esses testes baseiam-se na capacidade de células

viáveis, metabolicamente ativas, em reduzirem um sal de tetrazólio, através de

oxidorredutases, em um sal de formazan (BERRIDGE e TAN, 1993; BERNAS e

DOBRUCKI, 2002). Formazanos são sais geralmente sólidos de colorações

intensas que variam do vermelho ao azul escuro/púrpura e apresentam uma

cadeia atômica característica (-N=N-C=N-NH-) (JAWAD e SHMEINE, 2015). A

redução do MTT, de cor amarelo pálido, resulta em um sal insolúvel de formazan,

de coloração azul escuro/púrpura, que requer uma etapa de solubilização, com

isopropanol (MOSMAN, 1983; WANG et al., 2007) a fim de viabilizar a sua

quantificação através de leitura da discrepância ótica em leitor de microplaca

espectrofotométrico. Na literatura também se encontra descrita a utilização de

outros solventes para a solubilização do sal de formazan como o etanol (SILVA et

al., 2015) e o dimetilsulfóxido (DMSO) (VALOIS et al., 2008; ZAMBUZZI et al.,

2009; CHANG SW et al., 2014). Entretanto, para o solvente DMSO foi relatado

risco potencial ao pessoal quando expostos à grandes quantidades, além de

efeitos deletérios sobre os equipamentos de laboratório (SCUDIERO et al., 1988).

Assim foram desenvolvidos sais de tetrazólio XTT, MTS e WST-1, geradores de

produtos de formazan solúveis em água, após a bioredução por células viáveis,

dispensando o procedimento de solubilização.

Os ensaios de avaliação da viabilidade/proliferação celular à base de sais

de tetrazólio constituem uma abordagem amplamente utilizada como rastreio do

efeito citotóxico em toxicologia. Entretanto, a literatura descreve fatores

31

experimentais como capazes de alterar a redução do MTT e assim os resultados

de efeito citotóxico (STEPANENKO e DMITRENKO, 2015), como condições do

meio de cultura (JABBAR et al., 1989), o estado de crescimento das células (LIU

e DALGLEISH, 2009) e o uso de concentrações diferentes de soro fetal de vitelo

(ZHANG e COX, 1996). Ademais, os resultados originados pela redução do MTT

frente a algumas drogas anticancerígenas (MAIOLI et al., 2009; YANG et al.,

2014; STEPANENKO e DMITRENKO, 2015) e material nanoparticulado

(FISICHELLA et al., 2009) também foram reportados como sobrestimados e/ou

subestimados quando comparados aos resultados obtidos por outras

metodologias como a contagem celular direta ou ensaio de lactato desidrogenase

(LDH) (STEPANENKO e DMITRENKO, 2015). Tais observações levaram esses

autores a recomendar a suplementação dos testes a base de sais de tetrazólio

com outros ensaios não-metabólicos, a fim de evitar conclusões a partir de

resultados de efeito citotóxico enviesados (STEPANENKO e DMITRENKO, 2015).

Considerando a avaliação do efeito citotóxico de materiais obturadores de

canais radiculares, alguns pesquisadores recomendam a execução de testes com

diferentes parâmetros de ensaio, para a obtenção de observações (“endpoints”)

variadas, a fim de aumentar a chance de detecção dos possíveis efeitos danosos,

bem como apresentar indícios para a investigação das vias de citotoxicidade (DE

DEUS et al., 2009; SCELZA et al., 2012; SILVA et al., 2015).

Diferentes testes de avaliação da citotoxicidade de materiais obturadores

de canais radiculares correlacionando o parâmetro de ensaio, a lógica envolvida e

a principal referência estão descritas na Tabela 1.

Com base nas considerações iniciais aqui apresentadas, no presente

estudo foram executados: 1) uma revisão narrativa da literatura sobre as pastas

obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos mais estudadas e

avaliadas nos estudos clínicos de Odontopediatria dos últimos dez anos; 2) uma

revisão sistemática que investigou a comparação entre os resultados de efeito

citotóxico de materiais obturadores de canais radiculares obtidos por testes à

base de sais de tetrazólio com aqueles logrados através de outros parâmetros de

citotoxicidade e 3) a avaliação da citotoxicidade de pastas obturadoras de canais

32

radiculares de dentes decíduos selecionadas por meio de um modelo de

simulação de canal radicular e através da proporção material / veículo

recomendada pela ISO 10993-5.

33

Tabela 1. Principais características de diferentes ensaios de citotoxicidade utilizados na avaliação de materiais obturadores de canais radiculares

Ensaio Parâmetro Fundamento Referência

MTT Viabilidade celular – marcador

metabólico

Avaliação da atividade metabólica de células viáveis através da redução do sal de tetrazólio (amarelo) em sal insolúvel

de formazan (azul escuro/púrpura).

Mosmann, 1983 (J of lmmunol Methods 1983;65: 55-63)

WST-1 Viabilidade celular – marcador

metabólico

Avaliação da atividade metabólica de células viáveis através da redução do sal de tetrazólio em sal de formazan (púrpura

ou laranja) solúvel em água.

Tan and Berridge, 2000 (J of lmmunol Methods

2000;238: 59-68)

MTS Viabilidade celular – marcador

metabólico

Em células metabolicamente ativas, o sal de tetrazólio é reduzido em um sal de

formazan solúvel na presença de fenazina metasulfato, aceptor de elétron

intermediário, o qual acelera a bioredução.

Barltrop et al., 1991 (Biorganic & Medical

Chemistry Letters 1991;11(1):611-614

XTT Viabilidade celular – marcador

metabólico

Avaliação da atividade metabólica de células viáveis através da redução do sal de tetrazólio em sal de formazan (laranja)

solúvel.

Scudiero et al., 1988 (Cancer Res

1988;48(17):4827-33.)

Vermelho neutro Redução da viabilidade celular

– marcador membranar

Células viáveis incorporam o corante vermelho neutro através de transporte ativo pela membrana e o acumulam preferencialmente nos lisossomos.

Borenfreund and Puerner, 1985 (Toxicol Lett 1985;24:119-124).

Eluição do corante cristal violeta

Redução da viabilidade celular – marcador de DNA

O corante cristal violeta cora o DNA nuclear. Útil para células aderentes.

Gentry and Dalrymple, 1980 (J Clin Microbiol 1980;Sept:361-366)

Exclusão do corante azul tripan

Redução da viabilidade celular – marcador membranar

Células viáveis com membranas intactas, não permitem a penetração do corante,

corando somente células mortas.

Krause et al., 1984 (The Journal of Histochemistry

and Cytochemistry

34

1984;2(10):1084-1090).

Azul de alamar Viabilidade celular – marcador

metabólico

A forma oxidada do corante resazurina (azul escuro) entra no citoplasma celular

e é convertido a nível mitocondrial, através de enzimas, em sua forma

reduzida resofurin de coloração vermelha.

Nakayama et al. 1997 (J Immunol Methods 1997 May 26;204(2):205-8)

Citometria de fluxo Marcador de apotose/necrose

Permite a discriminação entre células vivas e mortas com base nas

propriedades de dispersão, ou através do uso de corantes de DNA fluorescentes

que passam pela membrana celular danificada e se ligam ao DNA.

Hoppner et al., 2002. (Journal of Immunol

Methods 2002;267(2):157–163)

Microscopia de Fluorescência:

Apoptose/necrose com dupla coloração

acridina laranja/brometo de

etídio

Marcador de apotose/necrose

Permite a discriminação entre células vivas, em fases inicial ou final de

apoptose e necrose através de corantes fluorescentes. E ainda observar a morfologia celular e nuclear, e a

desintegração da cromatina.

Baskic et al., 2006 (Cell Biol Int 2006;30(11):924-

932)

Indução de apoptose detectada através do

corante Hoechst 33258 e

ativação da poli (ADP-ribose) polymerase

(PARP)

Marcador de apotose

A PARP é responsável pela modificação pós translacional de proteínas em resposta a agentes genotóxicos, é

importante no mecanismo de reparo do DNA, morte celular e estabilidade

genômica. A ativação da PARP é um marcador de resposta ao dano ao DNA.

Yu MK et al., 2010 (J Endod 2010;36:1967–

1971) Hoechst 33258 (Begg and

Mooken, 1989)

Lactato desidrogenase (LDH)/

Marcador de componente intracelular liberado

LDH é uma oxiredutase que catalisa a conversão do piruvato. É liberada para o citosol após dano a membrana celular,

sua detecção indica morte celular.

Decker and Lohmann-Matthes, 1988. (Journal of

Immunol Methods 1988;115:61-69)

35

Análise de heme oxygenase-1 (HO-1)

Marcador de componente intracelular

A HO-1 é uma isoforma da heme oxigenase que cataboliza a hematina celular em biliverdina, monóxido de

carbono e ferro. A expressão aumentada é indicadora de estresse oxidativo

Yoshida and Migita, 2000 (Journal of Inorganic

Biochemistry 2000;82:33–41)

Conteúdo de ácido nucleico (NAC)

Marcador de componente intracelular

Usa a quantidade total de macromoléculas celulares extraídas para

estimar a densidade celular.

Cingi et al., 1991 (Toxic. in Vitro 1991;5(2):119-

125)

Teste de diacetato de diclorofluoresceína

(DCFH-DA)

Marcador de componente intracelular liberado

Uma célula submetida a estresse oxidativo apresenta níveis elevados de

espécies reativas de oxigênio (ROS) que causam dano aos lipídios, proteínas e

DNA.

Schieber and Chandel, 2014 (Current Biology 2014;24(10):453–462)

Microscopia electrônica de

varredura (MEV)

Alterações morfológicas gerais

Imagens em alta resolução da superfície da amostra, resultando aparência

tridimensional

Bell et al., 1979. (Scan Electron Microsc 1979;(3):11-121)

36

2. Objetivo geral

Avaliar a citotoxicidade de diferentes pastas obturadoras de canais

radiculares de dentes decíduos através de um modelo de simulação de canal

radicular.

3. Objetivos específicos

Avaliar a frequência de sucesso clínico/radiográfico das pastas obturadoras de

canais radiculares de dentes decíduos mais estudadas e avaliadas em

estudos de Odontopediatria nos últimos dez anos.

Comparar através de uma revisão sistemática da literatura, os resultados da

citotoxicidade de materiais obturadores de canais radiculares obtidos através

de ensaios a base de sais de tetrazólio e os obtidos através de outros

parâmetros de viabilidade celular nas mesmas células/linhagens celulares.

Desenvolver modelo de simulação de canal radicular de dente decíduo.

Avaliar quanto a citotoxicidade as pastas obturadoras de canais radiculares de

dentes decíduos selecionadas através de metodologia multiparamétrica.

Avaliar quanto a citotoxicidade as pastas obturadoras de canais radiculares de

dentes decíduos selecionadas através da proporção material veículo

recomendada pela ISO 10993-5 (2009).

37

4. Delineamento da pesquisa

4.1 Tipo de estudo

Estudo observacional, com documentação indireta, documentação direta

laboratorial e abordagem indutiva. O presente estudo consistiu de: i) uma revisão

da literatura recente que pesquisou as frequências de sucesso clínico/radiográfico

das pastas obturadoras de canais radiculares de dentes decíduo mais utilizadas e

avaliadas em estudos de Odontopediatria, ii) uma revisão sistemática que

comparou os resultados de efeito citotóxico de materiais obturadores de canais

radiculares obtidos através dos testes a base de sais de tetrazólio com os obtidos

através de outros testes de avaliação de citotoxicidade nas mesma

células/linhagens celulares e iii) um estudo para avaliação da citotoxicidade de

pastas obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos através de modelo

de simulação in vitro da obturação de canal radicular de dente decíduo, limitando-

se a quantidade de pasta obturadora empregada e a exposição apical.

4.2 Locais de execução do estudo

A revisão da literatura foi executada no Departamento de Odontopediatria e


Janeiro (FO/UFRJ, Rio de Janeiro, Brasil).

A revisão sistemática foi executada no Departamento de Odontopediatria e


Janeiro (FO/UFRJ, Rio de Janeiro, Brasil) e na Unidade de Pesquisa Clínica

(UPC, Niterói, RJ) do Hospital Universitário Antônio Pedro – Universidade Federal

Fluminense (UFF, Niterói, RJ).

Os testes de avaliação da citotoxicidade foram executados no Laboratório

de Cultura Celular da Unidade de Pesquisa Clínica (UPC, Niterói, RJ) do Hospital

Universitário Antônio Pedro – Universidade Federal Fluminense (UFF, Niterói,

RJ).

38

4.3 Avaliação da citotoxicidade

4.3.1 Revisão da literatura recente sobre as pastas obturadoras de canais

radiculares de dentes decíduos mais utilizadas e avaliadas em

estudos de Odontopediatria.

4.3.1.1 Método

Esse estudo foi executado segundo as orientações de Green et al. (2006)

para revisão narrativa da literatura.

4.3.1.1.1 Fontes de informação e estratégia de busca

As bases de dados Pubmed (Title/Abstract field), Cochrane Library e

LILACS foram pesquisados em janeiro de 2013, os termos em inglês para

pulpectomia e dentes decíduos, pulpectomy e primary teeth, com limite de

publicação de dez anos. A busca foi executada independentemente por dois

revisores (AVBP, QOB) e na lista de referências nos artigos dos dois últimos anos

(2011 - 2013).

4.3.1.1.2 Critérios de elegibilidade

Foram incluídos, nessa revisão, os estudos clínicos controlados não

aleatorizados e controlados aleatorizados conduzidos em pacientes pediátricos

tratados com o procedimento de pulpectomia e obturação dos canais radiculares

de dentes decíduos, com acompanhamento clínico e radiográfico mínimo de 6

meses, publicados entre 2002 e janeiro de 2013. Não houve restrição quanto a

idade, gênero e etnia dos pacientes, dentes tratados ou diagnóstico pulpar inicial.

4.3.1.1.3 Seleção dos estudos e extração de dados

Os títulos e resumos dos artigos recuperados na busca foram lidos e

avaliados segundo os critérios de elegibilidade, independentemente por dois

revisores (AVBP e QOB). Os casos de discordância entre esses foram resolvidos

por consenso através da avaliação de um terceiro revisor (RB).

39

A extração de dados executada pelos revisores incluiu: referências (título,

autores, ano de publicação, localização geográfica), material obturador de canais

radiculares utilizado, tamanho da amostra, tempo de acompanhamento clínico e

radiográfico e, frequências de sucesso.

4.3.1.1.4 Análise descritiva dos dados

Os artigos identificados nas três bases de dados e na busca manual foram

compilados em um único acervo e as referências duplicadas removidas. Os

artigos que atenderam aos critérios de elegibilidade foram incluídos nessa

revisão. As principais características dos estudos selecionados foram tabuladas e

avaliadas segundo uma análise descritiva.

4.3.2 Revisão sistemática: comparação dos resultados de efeito citotóxico

de materiais obturadores de canais radiculares obtidos através dos

testes a base de sais de tetrazólio com os logrados através de

outros ensaios de avaliação de citotoxicidade

4.3.2.1 Método

Essa revisão sistemática foi executada com base na abordagem para

revisão sistemática e integração de evidências descrita no Handbook for

conducting a literature-based health assessment using OHAT (Office of Health

Assessment and Translation) approach for systematic review and evidence

integration, Division of the National Toxicology Program, National Institute of

Environmental Health Sciences, U. S. Department of Health and Human Services,

Estados Unidos da América (OHAT, 2015).

4.3.2.1.1 Critério de elegibilidade

Segundo os critérios estabelecidos na estratégia PECO (Tabela 2) foram

incluídos nessa revisão estudos in vitro que avaliaram o efeito citotóxico de

materiais obturadores de canais radiculares não sólidos (MOCR) em células

animais e/ou humanas, através de testes a base de sais de tetrazólio e outros

testes de avaliação da citotoxicidade.

40

Os critérios de exclusão aplicados foram relacionados aos diferentes tipos

de publicação: estudos clínicos, relatos de caso, revisões, editoriais, opiniões,

artigos técnicos, levantamentos, diretrizes, conferências, comentários e estudos

em animais. Os estudos executados em organismos não-animais foram excluídos.

Também o foram, os estudos que avaliaram outros materiais, outros materiais

dentários ou MOCR com outros objetivos.

Tabela 2. Delineamento da pergunta segundo a estratégia (PECO) população, exposição, comparação e resultados (outcomes)

PECO

População Células animais e/ou humanas

Exposição

Expostas a materiais obturadores de canais radiculares (MOCR) com avaliação da

citotoxicidade por meio de diferentes testes de avaliação da citotoxicidade

Comparação

Expostas a materiais obturadores de canais radiculares (MOCR) com avaliação da

citotoxicidade por meio de testes à base de sais de tetrazólio

Outcome Efeito citotóxico

4.3.2.1.2 Fontes de informação

Foram executadas buscas eletrônicas nas bases de dados Pubmed,

Scopus e Web of Science até setembro de 2015.

4.3.2.1.3 Estratégia de busca

O processo de busca eletrônica nas bases de dados foi executado

independentemente por dois revisores (AVBP e RB). Foram identificados termos

MeSH e palavras-chave na base de vocabulário estruturado do Descritores em

Ciências da Saúde (DeCS) e em artigos publicados, serviram como base para a

preparação da estratégia de busca, que incluiu alterações nos termos e seguiu as

regras de sintaxe próprias de cada base de dados (Tabela 3). Não foram

aplicados filtros ou limites nas buscas. Os artigos presentes em mais de uma

base de dados foram considerados uma única vez. Os títulos e, quando

41

necessário, resumos e metodologias dos artigos, foram lidos e avaliados visando

a identificação daqueles potencialmente elegíveis. Os casos de discordância entre

os revisores foram resolvidos em consenso com um revisor sênior (GGA).

Tabela 3. Estratégia de busca

Base de dados Estratégia de busca

Pubmed cytotox*[Title/Abstract] OR biocompat*[Title/Abstract] AND endod*[Title/Abstract] OR root canal filling[Title/Abstract]

Scopus “cytotox*” OR “biocompat*” AND “endod*“ OR “root canal

filling”

Web of Science cytotox* OR biocompat* AND endod* OR root canal filling

Os artigos potencialmente elegíveis foram lidos integralmente para

determinação da elegibilidade de acordo com o PECO, avaliação da qualidade

metodológica e extração de dados. Em caso de dúvida, as justificativas foram

resumidas e discutidas em reuniões de consenso com o revisor sênior (GGA).

4.3.2.1.4 Avaliação da qualidade metodológica

O Handbook for conducting a literature-based health assessment using

OHAT (Office of Health Assessment and Translation) approach for systematic

review and evidence integration não provê uma avaliação de qualidade

metodológica para estudos in vitro. Sugere que os autores da revisão sistemática

elaborem seu próprio esquema de avaliação. Assim, foi pesquisada uma

metodologia para a avaliação de estudos in vitro. Foi selecionada a planilha para

estudos in vitro da ferramenta ToxRTool® (Toxicological data Reliability

Assessment Tool, Institute for Health and Consumer Protection, In vitro Methods

Unit, European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM))

disponível no site https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/about-ecvam/archive-

publications/toxrtool para avaliar a qualidade metodológica intrínseca de cada

artigo ou a confiabilidade dos dados apresentados (Anexos 1 e 2). A ferramenta

inclui cinco grupos de critérios: I) identificação da substância testada, II)

https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/about-ecvam/archive-publications/toxrtool

https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/about-ecvam/archive-publications/toxrtool

42

caracterização do sistema teste, III) descrição do deseho do estudo, IV)

documentação dos resultados dos estudos e V) confiabilidade do desenho do

estudo e dos dados; totalizando 18 critérios de avaliação para estudos in vitro. À

cada critério pode ser conferido os valores “1”ou 0”, considerando que o critério foi

preenchido ou não. Existem alguns requisitos mínimos, indispensáveis, para que

o estudo seja considerado confiável. Os critérios cruciais são destacados em

vermelho (“critérios vermelhos”). Somente se os critérios vermelhos são

assinalados como “1”, o programa classifica a confiabilidade dos dados do estudo

como Categoria 1 (confiável sem restrições) ou Categoria 2 (confiável com

restrições), independentemente do escore obtido. A Categoria 3 (não confiável) é

assegurada aos dados dos estudos que obtiveram pontuação inferior a 11 ou não

preencheram todos os critérios vermelhos. Ao final da avaliação o software

classifica os dados dos estudos de acordo com a pontuação inicial, confronta os

critérios vermelhos e classifica novamente. Então, em casos de discordância

entre o avaliador e o programa, o avaliador pode propor uma nova categoria para

os dados avaliados, quando há uma justificativa plausível. Em nosso estudo, os

artigos avaliados e classificados na categoria 1 (máxima) de confiabilidade na

avaliação da qualidade metodológica através da ferramenta ToxRTool® foram

incluídos. Os artigos que apresentaram classificação inicial igual a categoria 1,

com posterior avaliação do programa para os critérios fundamentais (“vermelhos”)

como categoria 3 (“não confiável”), em que a única falha metodológica foi a

ausência de relato de utilização de controle positivo durante os experimentos,

foram reclassificados como categoria 1 pelos revisores em reunião de consenso

com o revisor sênior (GGA). Na planilha está descrito que : “O relato de utilização

de controle positivo embora importante nos ensaios in vitro, estará geralmente

ausente nos ensaios de avaliação do metabolismo”, caso dos testes de

citotoxicidade à base de sais de tetrazólio. A ferramenta ToxRTool® prevê a

ocorrência dessa alteração de categoria justificada pelos revisores. Com base

nessas considerações, os estudos selecionados foram avaliados quanto ao

protocolo metodológico utilizado, avaliando a extensão segundo a qual os autores

conduziram seus estudos em concordância com os melhores padrões

metodológicos possíveis.

43

A extração de dados foi executada com base no Handbook for conducting a

literature-based health assessment using OHAT (Office of Health Assessment and

Translation) approach for systematic review and evidence integration,

considerando seis blocos: i) identificação do estudo: referência bibliográfica; ii)

financiamento: fonte, relato de conflito de interesse; iii) modelo de célula/tecido:

linhagem celular ou tipo celular, gênero do animal ou humano de origem, espécie,

variedade; iv) tratamento: MOCR quanto à composição, marca comercial,

preparo, veículo utilizado nas condições experimentais/controle; v) métodos:

cumprimento de diretrizes, procedimentos de aleatorização, alocação sigilosa,

cegamento durante a avaliação dos resultados, número de réplicas por grupo,

parâmetro de ensaio (endpoint) ou categoria do ensaio, nome e fonte do kit de

ensaio, análise estatística; vi) resultados: Concentração Sem Efeito Observado

(CSEO), Menor Concentração Com Efeito Observável (MCCEO), significância

estatística, Concentração de Atividade 50 (CA50), ou outras estimativas de efeito

relatadas no artigo (Apêndice 1).

4.3.2.1.5 Extração dos dados dos artigos e avaliação dos resultados

As principais características dos artigos foram tabuladas: i) referência

bibliográfica, ii) financiamento/conflito de interesse, iii) linhagem ou tipo celular, iv)

composição/marca comercial MOCR, veículo utilizado nas condições

experimentais/controle, proporção veículo: material, número de réplicas por grupo,

tempo de exposição, percentual de soro/plasma no meio, identificação do sal de

tetrazólio utilizado e resultados, identificação do outro (s) teste (s) utilizado (s) e

resultados.

Os resultados dos testes de citotoxicidade foram expressos

quantitativamente e qualitativamente através de diferentes formas (ISO 10993-5,

2009). Assim, nas avaliações quantitativas as mensurações foram apresentadas

em valores médios com desvio padrão expressando valores percentuais de

vitalidade celular em relação ao controle experimental (somente meio de cultura)

ou ao controle negativo (material reconhecidamente não citotóxico e meio de

cultura); ou em valores percentuais de citotoxicidade celular em relação ao

controle experimental ou ao controle negativo; ou em valores de discrepância

44

ótica (DO). Qualitativamente os resultados referiram-se às alterações

morfológicas das células; ou à detecção de apoptose ou necrose celular.

Os dados quantitativos, expressos em valores percentuais de citotoxicidade

celular em relação ao controle experimental ou ao controle negativo, foram

transformados em valores de vitalidade celular em relação ao controle

experimental ou ao controle negativo, através da subtração 1- valor de

citotoxicidade. Os valores de densidade ótica foram tratados considerando o valor

de DO do controle experimental ou negativo como correspondente a 100% de

vitalidade celular.

Com a finalidade de garantir exatidão na interpretação dos resultados

quantitativos expressos nos gráficos dos artigos incluídos no estudo, foi utilizado o

programa xScope 4.0® (The Iconfactory and ARTIS software, Greensboro, EUA)

(Figura 1) através das ferramentas Rulers e Guides. Um paquímetro virtual

(Rulers) foi adicionado ao eixo vertical e através desse foram mensurados os

milímetros correspondentes à faixa percentual de interesse demarcada. Através

da ferramenta Guides foi projetada no eixo horizontal do gráfico uma linha

referente ao resultado apresentado. Através de cálculo por regra de três simples,

o valor do resultado foi identificado. Os resultados foram então avaliados

segundo a Classificação de efeito citotóxico com base nos resultados de

viabilidade celular relativa aos controles, adaptado de DAHL et al., 2006. (Tabela

4). Para facilitar a descrição foram incluídos à classificação original os símbolos (-

-), (-), (+) e (++), referentes aos termos não citotóxico, levemente citotóxico,

moderadamente citotóxico e fortemente citotóxico.

Sob o ponto de vista regulatório de acordo com a ISO 10993-5 (2009), os

materiais que causarem redução da viabilidade celular superior a 30% são

considerados citotóxicos. Assim, considerando-se a classificação de efeito

citotóxico com base nos resultados de viabilidade celular relativa aos controles,

adaptado de DAHL et al., 2006, os materiais classificados como não citotóxicos e

levemente citotóxicos com redução da viabilidade celular até 30% estão em

conformidade com a avaliação da norma ISO.

45

É importante ressaltar que de acordo com a ISO 10993-5 (2009), a

observação de efeito citotóxico é um importante indicativo para potencial efeito

tóxico in vivo, entretanto os materiais não devem ser classificados como

impróprios para o uso clínico com base unicamente nos resultados de avaliação

da citotoxicidade.

Figura 1. Exemplo de identificação dos resultados de efeito citotóxico em gráfico de artigo, através do programa xScope 4.0®

46

Tabela 4. Classificação de efeito citotóxico com base nos resultados de viabilidade celular relativa aos controles, adaptado de DAHL et al., 2006)

Efeito citotóxico Viabilidade celular em relação aos controles

Não citotóxico (--) > 90%

Levemente citotóxico (-) Entre 60 to 90%

Moderadamente citotóxico (+) Entre 30 to 59%

Fortemente citotóxico (++) < 30%

As avaliações qualitativas morfológicas descritivas foram consideradas em

comparação com a seção 8.5.1 da ISO 10993-5 (2009) (Tabela 5). As avaliações

qualitativas descritivas referentes à detecção de apoptose e necrose celular foram

consideradas como descritas pelos autores quanto a presença ou ausência.

47

Tabela 5. Classificação morfológica qualitativa da citotoxicidade dos extratos

Classificação Reatividade Condições das culturas

0 Ausente Grânulos intracitoplasmáticos discretos, sem

lise celular, sem redução do crescimento celular.

1 Leve

Não mais que 20% das células estão arredondadas, descoladas e sem grânulos

intracitoplasmáticos, ou mostram alterações morfológicas, presença de células com lise

ocasionais, somente observável leve inibição do crescimento celular.

2 Suave

Não mais que 50% das células estão arredondadas, sem grânulos

intracitoplasmáticos, sem extensiva lise celular, não mais que 50% de inibição do

crescimento celular observável.

3 Moderada

Não mais que 70% das camadas celulares contêm células arredondadas ou lisadas; camadas celulares não completamente

destruídas, porém a inibição do crescimento celular observável é superior a 50%.

4 Severa Destruição das camadas celulares quase

completa ou completa.

Iso 10993-5 (2009)

4.3.2.1.6 Análise dos dados

A comparação entre os resultados obtidos através dos testes a base de

sais de tetrazólio e através de outros testes de citotoxicidade foi executada

considerando a tendência desses ensaios em indicarem nível semelhante de

efeito citotóxico para cada material investigado. Assim foram considerados

semelhantes entre si as classificações “Não citotóxico (--) “ e “Levemente

citotóxico (-)”; “Moderadamente citotóxico (+)” e “Fortemente citotóxico (++)”.

Foram calculadas as quantidades de: i) comparações possíveis em cada

estudo, ii) o número total de comparações e iii) o número de comparações

48

concordantes (Tabela 6). Em relação a origem das células, foram calculados: o

número total de comparações executadas e o número de comparações

concordantes. A razão entre o número total de comparações executadas e o

número de comparações concordantes foi expressa percentualmente.

A avaliação quantitativa dos resultados de geração de espécies reativas de

oxigênio (ROS) através da expressão da heme oxigenase (HO-1), ou através do

teste de diacetato de diclorofloresceína (DCFH-HA), ou pelo teste de ácido

tiobarbitúrico substâncias reativas (TBARS) foi comparada aos resultados dos

testes a base de sais de tetrazólio usando-se um fold change biológico de 1,5

(WITTEN e TISHIRANI, 2007). Em outras palavras, as alterações médias de

expressão de ROS do grupo tratado superiores a 50% em relação a média de

expressão de ROS do grupo controle foram consideradas como indicativas de

citotoxicidade.

49

Tabela 6 Resultados das comparações executadas entre as diferentes metodologias de avaliação da citotoxicidade e os ensaios à bse de sais de tetrazólio

Variáveis Comparações

(n)

Comparações com tendências similares de

efeito citotóxico

(n / percentual)

Diferentes parâmetros de ensaio

Apoptose /necrose detecção

Marcadores membranares

Marcadores de DNA

Marcadores de NAC

Marcadores de components

intracelulares liberados

Marcadores de alterações morfológicas

celulares

Diferentes marcadores metabólicos

Ensaios à base de sais de tetrazólio

MTT

XTT

WST-1

MTS

50

4.3.3 Avaliação da citotoxicidade de pastas obturadoras de canais

radiculares de dentes decíduos através de modelo de simulação in

vitro da obturação de canal radicular de dente decíduo, limitando-se

a quantidade de pasta obturadora empregada e a exposição apical

4.3.3.1 Desenvolvimento do modelo de simulação in vitro da

obturação de canal radicular de dente decíduo, limitando-se

a quantidade de pasta obturadora empregada e a exposição

“apical”

No protocolo de pulpectomia desenvolvido e utilizado na Disciplina de

Odontopediatria da Faculdade de Odontologia da UFRJ a instrumentação

mecânica de canal radicular de dentes decíduos é executada com limas do tipo

Kerr para realização do avanço apical. A primeira lima a executar a

instrumentação deve ser aquela cujo calibre melhor se acoplar ao forame apical,

seguida das duas limas seguintes da série até, no mínimo, a lima número 45 em

dentes anteriores e 35 em dentes posteriores (BARCELOS et al. 2009).

O modelo de simulação in vitro da obturação de canal radicular de dente

decíduo foi desenvolvido de tal forma que atendesse aos seguintes requisitos: i)

apresentasse conicidade, ii) que o diâmetro da extremidade “do canal radicular do

modelo” fosse compatível com o diâmetro de uma lima do tipo Kerr #45, iii)

permitisse a manipulação asséptica das pastas obturadoras e controles, iv)

permitisse a manipulação asséptica do modelo durante os procedimentos

experimentais de avaliação da citotoxicidade das pastas e v) “o canal radicular do

modelo” comportasse em seu interior uma massa padronizada de pasta

obturadora de canais radiculares. A massa média (0,037g) de pasta obturadora

pesada em balança analítica, após a obturação de canais radiculares de dentes

decíduos foi a encontrada por XIMENES e CARDOSO (2012).

Foi selecionada a ponteira de pipeta de polipropileno de 0,5-10 µl (T-300,

0,5-10µl, Axygen®, California, EUA) (Anexo 3) como “modelo de canal radicular”,

dentre as várias ponteiras testadas. O dispositivo de modelo de simulação in vitro

51

da obturação de canal radicular de dente decíduo foi constituído dos seguintes

materiais estéreis: uma ponteira de pipeta de polipropileno de 0,5-10 µl (T-300,

0,5-10µl, Axygen®, Califórnia, EUA), suporte composto de tampa de microtubo

plástico de 0,5ml (Easypath, São Paulo, Brasil) recortada e perfurada para

receber alça em fio de aço (Morelli, Sorocaba, Brasil) de 0,5mm de espessura e

10mm de comprimento, e tubo eppendorf de 2ml (Alfa, Ipiranga, Brasil) (Figura

2).

Figura 2. A) Componentes do dispositivo modelo de simulação in vitro da obturação de

canal radicular de dente decíduo, B) Dispositivo montado.

4.3.3.2 Seleção das pastas obturadoras de canais radiculares de

dentes decíduos

A revisão da literatura executada (Artigo 1) embasou a seleção das pastas

obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos investigadas nesse estudo

in vitro de avaliação da citotoxicidade (Tabela 7).

A pasta UFRJ a base de hidróxido de cálcio pronta para uso foi

desenvolvida em parceria, pelos pesquisadores da linha de pesquisa em terapia

pulpar em Odontopediatria do Departamento de Odontopediatria (FO/UFRJ) e a

indústria de materiais dentários S.S.White (Rio de Janeiro, Brasil) e avaliada pela

primeira vez quanto a citotoxicidade.

52

Tabela 7: Pastas obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos

Produto e fabricante Composição Modo de preparo

Endoflas® (Sanlor Lab, Bogotá, Colômbia)

Iodofórmio, hidróxido de cálcio, óxido de zinco, sulfato de bário, eugenol e paramonoclorofenol canforado

Espatulação de 0,5g de pó e 5 gotas de líquido

Vitapex® (Neo DenProducts Co Ltd, Tokyo, Japan)

Iodofórmio e hidróxido de cálcio

Pasta pronta comercialmente

Calcicur® (VOCO, Cuxhaven, Alemanha)

Hidróxido de cálcio Pasta pronta comercialmente

Calen® espessada com óxido de zinco (S.S.White, Rio de Janeiro, Brasil)

Calen® - Hidróxido de Cálcio 49,77%

Espatulação de 1g de Calen® acrescida de 0,65g de óxido de zinco

Pasta Guedes-Pinto (USP) (Laboratórios Buenos Ayres, São Paulo, Brasil) (Biodinâmica, Ibiporã, Brasil)

Pomada (1g de pomada carbowax,5mg de acetato de prednisolona, 1,5mg de rifamicina sódica) paramonoclorofenol canforado iodofórmio

Manipulação de partes visualmente iguais de pomada, paramonoclorofenol canforado e iodofórmio.

Pasta Guedes (Fórmula & Ação, São Paulo, Brasil)

Iodofórmio 33,33%, paramonoclorofenol 33,33%,rifamicina 0,05%, prednisolona 0,1666%

Pasta pronta para uso

Pasta UFRJ (S.S.White, Rio de Janeiro, Brasil)

Hidróxido de Cálcio, Oxido de Zinco, Polietilenoglicol Breu WW

Pasta pronta para uso

Óxido de zinco eugenol (Biodinâmica, Ibiporã, Brasil)

Óxido de zinco, eugenol e ácido acético glacial

0,5 grama de pó acrescido por espatulação a 9 gotas de líquido

53

4.3.3.3 Preparo das amostras para os testes de avaliação

multiparamétrica da citotoxicidade das pastas obturadoras

de canais radiculares de dentes decíduos através de modelo

de simulação in vitro da obturação de canal radicular de

dente decíduo, limitando-se a quantidade de pasta

obturadora empregada e a exposição apical

Os fabricantes das pastas à base de óxido de zinco e eugenol e Endoflas®

(Sanlor Lab, Bogotá, Colômbia) não diponibilizam proporções de pó e líquido fixas

para a manipulação com finalidade de obturação de canal radicular de dente

decíduo. A fim de garantir a reprodutibilidade na execução dos testes de

citotoxicidade foram padronizadas as proporções 0,5 grama de pó de óxido de

zinco para 9 gotas de eugenol para a pasta a base de óxido de zinco e eugenol

(PINTOR et al., 2015 – resumo SBPqO) e 0,5g de pó e 5 gotas de líquido para a

pasta Endoflas® (Sanlor Lab, Bogotá, Colômbia). As proporções foram

determinadas em testes de espatulação com 0,5g de pó e diferentes proporções

de líquido dispensadas gota a gota até que fosse obtida a consistência ideal para

permitir a utilização de técnica de obturação de canal radicular através de broca

lentulo em baixa rotação (BAWAZIR e SALAMA 2006), utilizada no protocolo de

obturação de canal radicular de dente decíduo na Disciplina de Odontopediatria

(FO/UFRJ). Os testes de espatulação foram executados na Disciplina de

Odontopediatria (FO/UFRJ) em duplicata pela doutoranda (AVBP), dois

mestrandos (TIV e ALM) e uma auxiliar de consultório dentário experiente (KS).

A pasta Calen® espessada com óxido de zinco foi preparada na proporção

1,0g de pasta Calen® para 0,65g de óxido de zinco (QUEIROZ et al., 2011). A

pasta de Guedes-Pinto foi preparada pela manipulação de 0,30g de cada um de

seus componentes. As pastas foram abertas e manipuladas de forma asséptica

em capela de fluxo laminar vertical (Labconco, Kansas City, USA) em placas de

vidro estéreis, com espátulas para cimento (24F, Duflex, Rio de Janeiro, RJ)

exclusivas para cada pasta. As pastas manipuladas de Guedes-Pinto, Endoflas® e

a base de óxido de zinco e eugenol, e a pasta UFRJ foram inseridas em seringas

descartáveis estéreis de 3ml com agulha 0,70 x 25mm (BD SoloMedTM, Curitiba,

Brasil) a fim de permitir a inserção de cada pasta nas ponteiras “modelo de canal

54

radicular”. A pasta Calen® espessada com óxido de zinco foi inserida com auxílio

de agulha 0,80 x 40mm (Becton Dickinson, Curitiba, Brasil) sem seringa,

simulando um calcador, devido a sua consistência. As pastas Calcicur, Vitapex®

e pasta de Guedes, as quais são prontas para uso e embaladas em seringas,

permitiram a dispensa dos materiais diretamente da embalagem. Cada pasta foi

inserida em uma ponteira de pipeta de polipropileno de 0,5-10 µl (T-300, 0,5-10µl,

Axygen®, California, EUA) em um tubo eppendorf de 2ml (Alfa, Ipiranga, Brasil) e

a massa igual a 0,037g (XIMENES e CARDOSO, 2012) foi pesada por diferença

em balança de precisão (Sartorius CP225D, Goetting, Germany). Após a

pesagem, a ponteira foi adaptada ao suporte e o conjunto inserido em um tubo

eppendorf de 2ml (Alfa, Ipiranga, Brasil). Como o processo total de pesagem dos

materiais teve longa duração, as pastas foram manipuladas e pesadas na

seguinte ordem: Calcicur, Vitapex®, de Guedes, UFRJ, Calen® espessada, de

Guedes-Pinto, Endoflas® e a base de óxido de zinco e eugenol. Após a pesagem,

à cada dispositivo modelo de simulação de obturação, no tubo eppendorf de 2ml

(Alfa, Ipiranga, Brasil), foi dispensado 185μl de meio de cultura Dulbecco’s

Modified Eagle’s media (DMEM) (Cultilab, Campinas, Brasil) com 1% de penicilina

e estreptomicina (Sima-Aldrich, St Loius, EUA) e bicarbonato de sódio (Sima-

Aldrich, St Loius, EUA) a 3,7g/l , sem soro fetal bovino para obtenção dos extratos

dos materiais (Figura 3). Todos os procedimentos foram executados de forma

asséptica e n = 3 para cada pasta (ISO 10993-5, 2009).

Além das pastas foram preparados também os controles para os ensaios

de avaliação da citotoxicidade: controles experimentais (somente meio de

cultura), negativo (pérolas de poliestireno) positivo (látex). Os controles negativo e

positivo foram preparados na proporção 0,2g de material para 1ml de meio de

cultura (LOURENÇO et al., 2015), proporção material: veículo já testada para

esses controles.

Todos os 33 dispositivos referentes às amostras e aos controles foram

encubados a 37°C, com 95% de humidade e 5% CO2, durante 24 horas. Após

esse período, a exposição às pastas e aos controles foi interrompida pela

remoção do “modelo de canal radicular”, de forma asséptica.

55

Figura 3. A) Pesagem de pasta obturadora (0,037g), B) Dispositivo modelo de simulação de obturação com 185μl de meio de cultura Dulbecco’s Modified Eagle’s media (DMEM) sem soro para obtenção do extrato do material (Vitapex®).

4.3.3.4 Cultura celular

Células semelhantes a osteoblastos humanos em passagem #4

provenientes do Laboratório de Cultura Celular da Unidade de Pesquisa Clínica

do Hospital Universitário Antônio Pedro – UFF (Niterói, RJ), foram semeados em

uma placa de cultura celular de 96 poços (Corning®, Tewskbury, USA), na

densidade de 1x104 células/poço, preenchendo 33 poços. Três outros poços

foram destinados ao controle branco. Ao redor dos poços semeados e brancos

foram dispensados 200μl de solução tampão fosfato (STF) estéril, a fim de reduzir

a evaporação do meio de cultura. As células foram mantidas em meio de cultura

DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado (Cultilab,

Campinas, Brasil) e em estufa a 37ºC, com 95% de humidade e 5% de CO2 por

24 horas. Após 24 horas, o meio de cultura de cada poço foi cuidadosamente

retirado por aspiração e reposto por 180μl de extrato dos materiais e controles e

então acrescido de 20μl de soro fetal bovino inativado. As células foram

novamente encubadas por 24h em estufa a 37ºC com 95% de humidade e 5% de

CO2 previamente aos ensaios de avaliação da citotoxicidade.

56

4.3.3.5 Avaliação multiparamétrica da citotoxicidade das pastas

obturadoras de canais de dentes decíduos

A citotoxicidade dos materiais e controles foi avaliada através do kit de

ensaios mutiparamétricos In Cytotox XTT-NR-CVDE (Xenomatrix, Alschwil,

Suíça), o qual avaliou sequencialmente na mesma cultura de células, três

parâmetros de viabilidade e integridade celular em relação às amostras (DE

DEUS et al., 2009; SCELZA et al., 2012; YADLAPATI et al., 2014). Através do

ensaio do XTT (2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazolio-5-carboxianilida)

foi avaliada a capacidade de células viáveis, com cadeia respiratória intacta, em

reduzirem pela ação da enzima succinato desidrogenase, as moléculas de XTT

em um sal solúvel de formazano, detectável a uma absorbância de 480nm e

quantificado espectrofotometricamente em leitor de microplaca (PowerWave MS2,

BioTek, Rio de Janeiro, Brasil). O ensaio do Vermelho Neutro avaliou a

integridade membranar e a capacidade das células viáveis em incorporar, através

de endocitose, o corante Vermelho Neutro e acumulá-lo preferencialmente nos

lisossomos. A discrepância ótica (DO) obtida a uma absorbância igual a 540nm

em leitor de microplaca (PowerWave MS2, BioTek, Rio de Janeiro, Brasil) permitiu

a quantificação das células viáveis. O teste de eluição do corante Cristal Violeta

avaliou a densidade celular através da coloração do DNA celular; após o descarte

do excesso de corante, o valor da discrepância ótica mensurada em cada poço, a

uma absorbância de 540nm foi considerado proporcional ao número de células

viáveis.

4.3.3.5.1 Teste do XTT

Após 24h de exposição das células aos extratos das pastas e controles,

esses foram cuidadosamente removidos por aspiração e os poços lavados com

solução tampão fosfato. Os extratos foram substituídos por 200μl de meio de

cultura DMEM.

A avaliação da citotoxicidade foi iniciada com o teste do XTT. As soluções

dos reagentes XTT II e XTT I foram misturadas na proporção de 1:100 e 50μl da

mistura foi acrescentado a cada poço. A placa foi coberta com papel alumínio e

encubada em estufa a 37ºC com 95% de humidade e 5% de CO2 por 2 horas e a

57

DO referente a cada poço de interesse lida, à absorbância de 480nm em leitor de

microplaca (PowerWave MS2, BioTek, Rio de Janeiro, Brasil).

4.3.3.5.2 Teste do Vermelho Neutro

Sequencialmente ao teste do XTT, as células e controle branco foram

submetidas ao teste do Vermelho Neutro. A solução remanescente do teste XTT

foi removida e os poços lavados com 300μl de solução NR I. A solução NR II

previamente diluída na proporção (1:100) em meio de cultura DMEM a 37ºC, foi

acrescentada a cada poço (200μl), e a placa de cultura foi encubada em estufa a

37ºC com 95% de humidade e 5% de CO2 por 3 horas. A solução foi removida e

200μl de solução NR III foi acrescentada a cada poço e após 1 minuto, 200μl da

solução NR IV foi dispensada a cada poço, e a placa encubada a 37ºC com 95%

de humidade e 5% de CO2 por 15 minutos. A DO referente a cada poço de

interesse lida a absorbância de 540nm em leitor de microplaca (PowerWave MS2,

BioTek, Rio de Janeiro, Brasil).

4.3.3.5.3 Teste de eluição do corante Cristal Violeta

Após a execução do teste do Vermelho Neutro, a placa de cultura foi

vertida para remoção da solução remanescente, e as células e branco lavados

duas vezes com 200μl de solução CVDE I. A solução CVDE II (100μl/poço) foi

acrescentada e a placa de cultura encubada a temperatura ambiente por 10

minutos. A solução foi removida e cada poço lavado com 200μl de água

deionizada. A placa de cultura foi seca e foi dispensada 100μl/poço de solução

CVDE III. A DO de cada poço de interesse foi registrada a uma absorbância de

540nm.

4.3.3.5.4 Análise estatística

Os resultados foram expressos como valores percentuais de células viáveis

para cada material, comparados ao controle experimental. A média e desvio

padrão foram calculados. Os dados de viabilidade celular foram analisados pelo

teste de não paramétrico de Kurskal-Wallis com pós-teste de Dunn com nível de

significância de 5% (p < 0,05).

58


dentes decíduos através do ensaio do XTT com a proporção

veículo/material recomendada pela ISO 10993-5 (2009)

Com a finalidade de comparar os resultados de efeito citotóxico obtidos por

meio do modelo de simulação de canal radicular com os resultados obtidos

através da proporção recomendada pela ISO 10993-5 (2009), foi executado um

novo experimento. Baseado nos resultados da revisão sistemática executada em

2015 (Artigo 2) foi selecionado o teste de redução do XTT para a investigação da

avaliação da citotoxicidade das pastas obturadoras selecionadas.

4.3.1.1 Preparo das amostras

As pastas obturadoras foram manipuladas de forma asséptica e nas

proporções previamente descritas na seção 5.3.3.3. Foram pesados em balança

de precisão (Sartorius CP225D, Goetting, Germany) 200mg de cada pasta, em

tubos eppendorfs de 2,0ml (Alfa, Ipiranga, Brasil), em duplicata. A cada um dos 16

tubos eppendorfs foi acrescentado 1000μl de meio de cultura DMEM com

antibiótico e sem soro fetal bovino. Além das pastas foram preparados também

em duplicata, os controles experimental (meio de cultura), negativo (pérolas de

poliestireno) e positivo (látex) (LOURENÇO et al., 2015). Os 22 tubos eppendorfs

foram encubados a 37ºC com 95% de humidade e 5% de CO2 por 24h. Após esse

tempo, os tubos eppendorfs foram centrifugados (Alfa, Ipiranga, Brasi) a 3000

r.p.m., por 15 minutos, a temperatura ambiente. Foram então retirados 1500μl de

extrato sobrenadante e dispensados em dois tubos eppendorfs, garantindo a

interrupção do preparo dos extratos.

4.3.1.2 Cultura de células

Células semelhantes a osteoblastos humanos em passagem #4

provenientes do Laboratório de Cultura Celular da Unidade de Pesquisa Clínica

do Hospital Universitário Antônio Pedro – UFF (Niterói, RJ), foram semeados em

uma placa de cultura celular de 96 poços (Corning®, Tewskbury, USA), na

densidade de 1x104 células/poço, preenchendo 55 poços. Cinco outros poços

foram destinados ao controle branco. Ao redor dos poços semeados e brancos

59

foram dispensados 200μl de solução tampão fosfato (STF) estéril, a fim de reduzir

a evaporação do meio de cultura. As células foram mantidas em meio de cultura

DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado (Cultilab, campinas,

Brasil) e em estufa a 37ºC com 95% de humidade e 5% de CO2 por 24 horas.

Após 24 horas, o meio de cultura de cada poço foi cuidadosamente retirado por

aspiração e reposto por 180μl de extrato dos materiais e controles e então

acrescido de 20μl de soro fetal bovino inativado. As células foram novamente

encubadas por 24h em estufa a 37ºC com 95% de humidade e 5% de CO2

previamente ao ensaio de avaliação da citotoxicidade.

4.3.1.3 Teste do XTT

Após 24h de exposição das células aos extratos das pastas e controles,

esses foram cuidadosamente removidos por aspiração e os poços lavados com

solução tampão fosfato. Os extratos foram substituídos por 200μl de meio de

cultura DMEM. A avaliação da citotoxicidade foi executada através do teste do

XTT. As soluções dos reagentes XTT II e XTT I foram misturadas na proporção de

1:100 e 50μl da mistura foi acrescentado a cada poço. A placa foi coberta com

papel alumínio e encubada em estufa a 37ºC com 95% de humidade e 5% de

CO2 por 2 horas e a discrepância ótica referente a cada poço de interesse lida à

absorbância de 480nm em leitor de microplaca (PowerWave MS2, BioTek, Rio de

Janeiro, Brasil).

60

5. Resultados

5.1 Artigo 1: A critical review of the root canal filling materials mostly

used in the recent pediatric studies

Andréa Vaz Braga Pintora

Queila Braga Oliveirab

Roberta Barcelosc

Rogério Gleiser d

Laura Salignac Guimarães Primoe

ª PhD student, Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil

b MSc student, Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil

c Professor, Department of Pediatric Dentistry, Institute of Health, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.

d Associate Professor, Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil

e Adjunct Professor, Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil

Corresponding author: Dr. Laura S. Guimarães Primo

Disciplina de Odontopediatria da FO-UFRJ

Caixa postal: 68066

21941—971 Cidade Universitária CCS RJ Brazil

Phone: + (55) 21 2562-2098 Fax: + (55) 21 2590-2771

email:[email protected]

61

Generic heading: Pediatric Dentistry

Title of article: A critical review of the root canal filling materials mostly used in

the recent pediatric dentistry studies

Abstract: The aim of this study was to describe the mostly used and evaluated

root canal filling materials in clinical pediatric dentistry research. A search was

performed on May 2016, in Pubmed, Cochrane and LILACS databases

considering the terms “pulpectomy “and “primary teeth”, limited to the last 10

years. A total of 21 papers were included in this review. ZOE paste is still the most

used root canal filling material for primary teeth in pediatric clinical research,

although a tendency in the use of iodoform with calcium hydroxide pastes was

observed.

Clinical Relevance: The aim of this study was to review in literature, the root

canal filling materials mostly used, and evaluated in recent clinical pediatric

dentistry research

Objective statements: The reader should understand which root canal filling

materials are considered of interest and confidence.

Introduction

Pulpectomy is the treatment indicated for primary teeth diagnosed with

irreversible pulpitis, with minimal physiological or pathological root resorption, not

exceeding 1/3 of the root length, which could receive a final restoration. This

procedure rationale is based on the cleaning, disinfecting and filling the root canal

with a resorbable paste. However, the morphology of the root canal system of the

primary molars is complex and turns the ideal cleanliness hard to achieve. Thus,

the root canal filling materials with antibacterial and anti-inflammatory properties

are recommended. Until now, there is no consensus in literature concerning the

best root canal filling material for primary teeth (1,2), although there is a moderate

62

evidence for zinc oxide and eugenol (ZOE) based paste, and iodoform with

calcium hydroxide based pastes (2).

Since the first described root canal therapy in 1930 by Sweet with a final

procedure of canal filling with ZOE based paste, this material has been used in

primary teeth (3). High success rate have been described for ZOE (4–6) although

this material presents a low resorbing rate, which has been associated to ectopic

eruption of permanent successors teeth (7) and cytotoxicity (8). Aiming to

overcome such drawbacks, alternative pastes have been proposed for the root

canal filling of primary teeth; among them the iodoform with calcium hydroxide

based pastes. These pastes have been used with reported high rates of clinical

and radiographic success (5,9), show antibacterial properties and are easily

resorbed compared to ZOE based pastes (2).

The aim of this study was to review in literature, the root canal filling

materials mostly used, and evaluated in recent clinical pediatric dentistry research,

including the clinical and radiographic success rates reported. The result could

give an overview for both pediatric dentists and researchers of which root canal

filling materials are considered of interest and confidence.

Methods

We searched the terms pulpectomy and primary teeth in the databases

Pubmed (Title/abstract field), Cochrane Library and LILACS. The 10 years

publication limit was applied in the search performed on May 2016, by two review

authors (AVBP, OQB). A hand search was performed in the last four years (2012 -

2016) papers.

This narrative literature review included clinical and randomized controlled

trials conducted on children, who undergone pulpectomy as root canal therapy,

with at least 6 months of clinical and radiographic follow-up. There were no

restrictions regarding patients’ age, gender, ethnicity, tooth type or initial pulpal

diagnostic condition.

The titles and abstracts of articles obtained in the electronic search were

read and evaluated independently by two review authors, following the eligibility

63

criteria described. Papers appearing in more than one database search were

considered only once. Any differences between the two readers were solved by

consensus or by a third reviewer (RB).

Data extraction included: references (title, authors, year of publication,

geographic location), type of study (clinical, clinical controlled, randomized

controlled trial), filling materials used, sample size, radiographic and clinical follow-

up period, and outcomes with success percentage rate.

Results

We identified 108 articles. One hundred were screened after duplicates

removal and 17 papers were assessed for eligibility. After a manual search on the

last 4 years selected papers, 4 more studies were included for eligibility. A total of

21 studies were included in this review according to the established inclusion and

exclusion criteria.

The main characteristics of the selected studies were compiled (Table 1).

The zinc oxide and eugenol based paste was the most used root canal filling

material (n=12). ZOE was the control material for the evaluation of pulpectomies

performed with other filling materials (5,10–13). Also, ZOE was the filling material

chosen when the evaluation of other endodontic technique parameters was the

main objective (14–17). In the selected studies, the frequency of overall clinical

and radiographic success ranged from 63.3% (11) to 93.3% (18), however, no

statistically significant variation was observed between the ZOE based paste

groups and the other root canal filling materials evaluated (5,11–13,18). Likewise,

ZOE was used in a study that evaluated restorative techniques (19).

Iodoform based with calcium hydroxide (I/CH) pastes were the canal root

filling material used in 8 studies (5,6,9,10,13,20,21). Such material was considered

as the control material in the evaluation of the pulpotomy procedure performed

with other materials (20). And in the evaluation of a biologic approach, lesion

sterilization and tissue repair technique, in the treatment of carious lesions with

pulpal and periapical involvement using a mixture of three antibiotics (ciprofloxacin

200mg, metronidazole 500mg, minocycline 100mg, mixed in a 1:1:1 ratio) (9).

64

Furthermore, an I/CH paste was the root canal filling material used in a study that

evaluated different irrigant solutions (21). The frequency of overall success

reported ranged from 89% (5) to 100% (18).

Calcium hydroxide was the root canal filling material used in 3 studies (22–

24). One study evaluated different restorative techniques (22) and another

compared pulpotomies with formocresol and ZOE paste as filling material, with

pulpectomies with calcium hydroxide a root canal filling material (23). Only one

study (24) evaluated the frequency of success of a calcium hydroxide based

material in a long-term follow-up.

Discussion

For many years, ZOE paste has been the first choice material for the filling

of primary teeth with pulpectomy indication (15). Furthermore, the ZOE based

paste remained as the preferred material aiming to the root canal filling of primary

teeth (85%) of the Pediatric Dentistry Programs of the U.S. Dental Schools,

although the iodoform paste with calcium hydroxide has its use increased (25).

However, the ZOE based paste present as some drawbacks the limited

antibacterial effect, lower resorbing pace compared to the physiologic exfoliation of

the primary teeth and irritation to the periapical tissues caused by eugenol (2,11)

Alternatively, to ZOE based pastes, other vehicles have been added to the

zinc oxide powder, which is a mild astringent and topical protectant with a relative

antiseptic property. The combination of ozonated oil to zinc oxide, aiming to a long

lasting of antibacterial action, showed clinical and radiographic overall result of

93.3% compared to the 70% result obtained with ZOE based paste (11). When

aloe vera, an anti-inflammatory, antibacterial and pain relieving substance, was

associated, the success rates observed were 100% and 73.34% for the clinical

and radiographic parameters (26). Likewise, the association of propolis, a natural

antibacterial product, showed a high frequency of clinical success (93.8%)

compared to other materials, although the radiographic success rate was lower

(62.5%) (13).

65

On the basis of this literature review, the most used root canal filling

material of primary teeth was the ZOE based paste. From the 21 articles of our

literature search, 12 used ZOE as filling material. Our result corroborates the

interest of two systematic reviews of the literature on the ZOE based paste for root

canal filling of primary teeth. Barcelos et al. (1) compared the clinical and

radiographic performance of ZOE based paste with other root canal filling

materials for primary on a long-term follow-up. The overall success for the

pulpectomies performed with the ZOE based paste, the iodoform based with

calcium hydroxide and calcium hydroxide were respectively 85-100%, 89-100%

and 80%. Barja-Fidalgo et al. (2) evaluated the effectiveness of other root canal

filling materials for primary teeth with the ZOE based paste and concluded that

both the latter and the iodoform based with calcium hydroxide were suitable

materials.

The iodoform based pastes have several favorable characteristics: i) are

effective in removing remaining infections, ii) resorb quickly when extruded beyond

the root canal apex and iii) are easily applied (5). Different formulations of root

canal filling materials containing iodoform are available and were identified on our

search: i) iodoform, camphor, menthol, and parachlorophenol (27); ii) iodoform,

zinc oxide, calcium hydroxide, barium sulfate, eugenol, and

paramonochlorophenol (18); iii) ZOE with iodorform (6) and iv) calcium hydroxide

and iodoform (5). In recent studies, an I/CH was used as control material for

pulpotomies (20) and for the evaluation of pulpectomies that used the antibiotic

paste (9). Nakornchai et al. (9) found a frequency of radiographic success similar

between the I/CH and antibiotic based pastes groups in the initial 6 months of

follow-up. However, after 12 months, only 56% of the evaluated teeth were still

filled in with the I/CH paste. Trairatvorakul and Chunlasikauan (5) also observed

the resorption of the material inside the root canals of primary teeth. Despite this

I/CH drawback, the comparison of the overall success rates of the ZOE based

paste and iodoform based with calcium hydroxide was 89% and 85% (5) and 89 to

100% (1).

It is worth of mentioning that the clinical and radiographic frequencies of

success should be carefully analyzed and compared, since there is not a

66

consensus with regard to an ideal standard protocol for the pulpectomy procedure

(2). However, we observed the reporting of high clinical and radiographic success

rates on the selected studies, for the proposed treatments.

The diversity of root canal filling materials identified in this study show that

the search for an ideal material for primary teeth is still an object of concern of the

pediatric dentistry researchers. Although the use of the iodoform based with

calcium hydroxide pastes as root canal filling material has increased, the ZOE

based paste is still the mostly used endodontic filler for primary teeth, as control

material for other materials and for the evaluation of different technique

parameters.

Conclusions

In the light of this literature search, ZOE paste is still the most used root

canal filling material for primary teeth with an overall frequency of success from

63.3% to 93.3%, although a tendency in the use of iodoform based with calcium

hydroxide pastes was observed, which showed success rates from 89 % to 100%.

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23. Coser RM, Gondim JO, Aparecida Giro EM. Evaluation of 2

endodontic techniques used to treat human primary molars with

furcation radiolucency area: A 48-month radiographic study.

Quintessence Int. 2008; 39: 549–57.

24. Sari S, Okte Z. Success rate of Sealapex in root canal treatment for

primary teeth: 3-year follow-up. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral

Radiol Endod. 2008; 105: e93–6.

25. Dunston B, Coll JA. A survey of primary tooth pulp therapy as taught

in US dental schools and practiced by diplomates of the American

Board Of Pediatric Dentistry. Pediatr Dent. 2008; 30: 42–8.

26. Khairwa A, Bhat M, Sharma R, Satish V, Maganur P, Goyal AK.

Clinical and radiographic evaluation of zinc oxide with aloe vera as

an obturating material in pulpectomy: An in vivo study. J Indian Soc

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27. Holan G. Long-term effect of different treatment modalities for

traumatized primary incisors presenting dark coronal discoloration

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28. Aminabadi NA, Huang B, Sciences H, Samiei M, Agheli S, Student

P, et al. A Randomized Trial Using 3Mixtatin Compared to MTA in

Primary Molars with Inflammatory Root Resorption: A Novel

Endodontic Biomaterial. 2016; 40: 95–102.

70

Table 1: Characteristics of included studies

Reference Geographic

location Filling material Sample size

Follow up (months)

Outcome (success rate)

Overall success

Clinical success

Radiographic success

Aminabadi et al.

(28) Iran ZOE

40 M previous perforation repair with antibiotics and simvastatin

24

96.8 %

40 M previous perforation repair with MTA

0%

Al-Ostwani et al. (13)

Syria

ZO + propolis 16 M

12

93.5% 62.5%

ZOE + I + CH (Endoflas®-chlorphenol-free)

16 M 87.5% 81.3%

I + CH (Metapex®) 16 M 87.5% 75%

ZOE 16 M 87.5% 56.3%

Pramilla et al. (10)

India

ZOE + I (RC Fill) 35 mandibular M

30

94%

I + CH (Vitapex®) 35 mandibular M 90%

ZOE (Pulpdent) 36 mandibular M 97%

Rewal et al. (12) India ZOE 24 M

9 83% 100%

ZOE + I + CH (Endoflas®) 26 M 100% 100%

Khairwa et al. (26)

India ZO + aloe vera gel 15 mandibular M 9 86.67% 73.34%

Chandra et al. (11)

India ZOE 30 M

12 63.31%

ZO + ozonated sesame oil 30 M 93.3 %

Howley et al. (20)

USA I + CH (Vitapex®) 74 I 23 73%

Barcelos et al. (15)

Brazil

ZOE 40 T (G1=smear layer removal)

24

91.2%

ZOE 42 T (G2=smear layer not removal)

70.0%

Louwakul & Prucksathamrongkul. (21)

Thailand I + CH (Vitapex®)

32 mandibular M (irrigated with saline solution)

18

97%

32 mandibular M (irrigated with 2% chlorhexidine solution)

93%

Tannure et al. (16)

Brazil ZOE 47 T 60 91.5%

Tannure et al. (17)

Brazil ZOE 18 I (G1=smear layer removal)

36 82.3%

ZOE 18 I (G2=smear layer not removal) 88.2%

71

Subramaniam et al. (18)

India

ZOE 15 M

18

93.3%

ZOE +I + CH (Endoflas®) 15 M 93.3%

I + CH (Metapex®) 15 M 100%

Ramar & Mungara (6)

India

I + CH (Metapex®) 30 M

9

90.5%

ZOE + I (RC Fill) 34 M 84.7%

ZOE + I + CH (Endoflas®) 32 M 95.1%

Nakornchai et al. (9)

Thailland I + CH (Vitapex®) 25 M

12 96% 56%

Antibiotics 25 M 100% 76%

Aminabadi & Farahani (19)

Iran ZOE 144 T 24 81,5%

Zulfikaroglu et al. (22)

Turkey CH (Calcicur®)

15 T amalgam

12

73%

15 T TPH resin / Prime & Bond NT 93%

15 T Dyract / Prime & Bond NT 73%

15 T Dyract NRC / Prime & Bond NT

80.0%

15 T F-2000 / Prompt L-loop 87 %

Coser et al. (23) Brazil CH (Calen®) 23 M 48 90%

Traitratvorakul & Chunlasikauan (5)

Thailland ZOE 27 M

12 85%

I + CH (Vitapex®) 27 M 89%

Sari et al., 2008

(24) Turkey CH (Sealapex®) 62 T 36 92.3%

Holan (27) Israel I + camphor+ menthol +PCFC (Kri paste)

25 I

Until permanent teeth eruption

72%

Bawazir & Salama (14)

Saudi Arabia ZOE

25 M (obturation with mounted lentullo spiral)

6

96% 81.8%

25 M obturation with hand-held lentullo spiral)

92% 72%

Note: ZOE = zinc oxide and eugenol; I = iodoform; CH = calcium hydroxide; PCFC = parachlorophenol; M = molars; I = Incisors; T = teeth

72

5.2 Artigo 2: Are the results of the cytotoxicity of the root canal filling materials

evaluated through the tetrazolium salt-based tests and other cell viability

parameters conflitant? A systematic review

Authors:


Luciana Domênicob

Gutemberg Alves c

Juliana Côrtesd

Roberta Barcelose

Laura Salignac Guimarães Primof

ª PhD student, Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.

b Underdraduate student, Biomedicine, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.

c Adjunct Professor, Department of Molecular and Cellular Biology , Biology Institute, Fluminense Federal University, Niterói, Brazil.

d PhD student, Clinical Research Unit, Antonio Pedro Hospital, Fluminense Federal University, Niterói, Brazil.

e Adjunct Professor, Department of Pediatric Dentistry, Institute of Health, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil..

fAdjunct Professor, Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.



Caixa postal: 68066


Phone: + (55) 21 2562-2098 Fax: + (55) 21 2590-2771


73

SUMMARY

The diversity of methodologies for evaluating the cytotoxic effect of root

canal filling materials hinders the comparison of the studies results and the search

for evidences. The aim of this systematic review was to compare the cytotoxicity

results for root canal filling materials (RCFM), obtained through MTT and other

tetrazolium salt-based tests (TSBT) with those obtained through other cell viability

(CV) assays. A search was performed on Pubmed, Scopus and Web of Science.

No limits or filters were applied. According to the PECO criteria were included in

vitro studies, which evaluated the cytotoxic effect of RCFM on animal and/or

human cells, through TSBT and at least one different CV parameter. The inner

methodological quality of selected papers was assessed through the ToxRTool®. A

total of 4051 articles were found, after removal of duplicates, 3054 remained. After

applying the eligibility criteria, 42 studies were selected for data extraction and

methodological evaluation, 29 papers were included in this review. A total of 279

comparisons were performed and 86.02% of them (n = 240) showed similar trends

of CE results using different assays. The TSBT and the Neutral Red uptake dye

assay results pointed to similar trends of CE in 86.95% (n = 17) of the

comparisons. Among TSBT, MTT (n = 166) and XTT tests (n = 81) pointed to

similar trends of CE in 87.95% and 92.59% of the comparisons. This review

results support the value of the XTT and MTT for the cytotoxicity screening of root

canal filling materials, since these assays do not present conflicting results

compared to other cell viability parameters assays.

Keywords: root canal filling materials, MTT, tetrazolium salt-based tests,

biocompatibility, cytotoxicity

1. Introduction

The root canal filling procedure aims, ultimately, the filling and the sealing of

the root canal complex (Orstavik, 2005) with the complete three-dimensional

obturation of the main and the accessories root canals (Schilder, 1967). For this

purpose, different materials have been designed for the primary teeth (Barcelos et

al., 2011) and the permanent teeth (Hauman and Love, 2003). Whether pastes for

74

the primary teeth, sealers or cements for the permanent, these materials contact

intimately the dentinal tissue of the root canal walls and may contact the

periradicular tissues if accidentally extruded from the apices or through the

eluents. Furthermore, the root-end-filling materials used in periapical surgery

endodontic therapy are kept in close contact with both dental and periapical

tissues (Yanez et al., 2008). For such reasons, the root canal filling materials were

classified as permanent-contact implant devices and therefore this category

candidate materials must be submitted to a flow of investigation assays aiming to

determine whether these are too toxic to be therapeutically used (ISO 7405,

2008). The first in vitro cell-based assays approach or cytotoxic basal screening is

widely used to determine if the tested materials have effects on the cell viability

and/or cell proliferation or toxic effects that could lead to cell death (Eisenbrand et

al., 2002; Riss et al., 2015).

There are a variety of assays methodologies applied in the toxicological

screening for the measurement of the cell viability or the cell proliferation after the

direct or indirect exposure to different materials (Riss et al., 2015). Among the cell

viability assays, the tetrazolium salt-based tests are widely used both as a single

strategy (Schwarze et al., 2002; Silva et al., 2013) or associated to other

parameter assays in a multiparametric approach (Osorio et al., 1998; Scelza et al.,

2012; Silva et al., 2015) for the evaluation of root canal filling materials. The

associated strategy is advocated for the possible increase in the chances of

detection of the cytotoxic effect of such materials and the observing of the feasible

different cytotoxic pathways (De Deus et al., 2009; Scelza et al., 2012). Moreover,

the comparison of the metabolic activity of the exposed cells, with the results

obtained through other cell viability parameters, would enable a proper

interpretation of the results (Wang et al., 2007).

Among the tetrazolium salt-based tests, the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-

yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) is the most used tetrazolium compound, and

the MTT reducing assay is considered as the “gold standard” for cytotoxic testing

(van Tonder et al., 2015). However, this assay has been criticized for the

possibility of over/underestimation of the cell viability results for different

75

substances (van Tonder et al., 2015) and in anti-cancer drugs screening studies

performed with tumor cells (Stepanenko and Dimitrenko, 2015).

Considering the root canal filling materials, the diversity of methodologies

for the cytotoxic screening hinders the comparison of the studies results, and any

possible impairment on the cytotoxic effects results for these materials obtained

through the MTT assay compared to those obtained through other cell viability

parameters has not been accessed yet. Therefore the purpose of this systematic

review was to compare the results of the cytotoxic effect of root canal filling

materials obtained through the tetrazolium salt-based tests with those obtained

through, at least, one different cell viability assay performed on the same cell

types/lineages in order to observe if the results of the different methodologies

would imply a concordant or not concordant trend of cytotoxicity.

2. Methods

This systematic review was performed based on the Handbook for

conducting a literature-based health assessment using OHAT (Office of Health

Assessment and Translation) approach for systematic review and evidence

integration.

2.1. Eligibility criteria

According to the PECO criteria (Table 1) we included in this review in vitro

studies, which evaluated the cytotoxic effect of non-solid root canal filling materials

(RCFM) on animal and/or human cells, through tetrazolium salt-based tests and at

least one different cell viability parameter.

The exclusion criteria were applied to the following studies designs and

publication types: clinical studies, case reports, review articles, retrospective,

editorials, opinions, technique articles, surveys, guidelines, conferences,

commentary articles and animal studies. Studies conducted in non-animal

organisms, or those, which evaluated other materials or other dental materials or

evaluated RCFM with other objectives, were also excluded.

76

2.2. Information source

We conducted electronic searches up to September 2015 using the

following electronic bibliography databases: PubMed, Scopus and Web of

Science. No filters were applied to the language or year of the publications.

2.3. Search strategy

Two review authors performed the search process independently

(AVBP/RB). MesH (Medical Subject Headings) Terms and keywords identified on

the Health Science Descriptors site and in the published papers served as the

basis for preparing the search strategy, which included appropriate changes in the

terms and followed the syntax rules of each database (Table 2). No filters or limits

were applied in the searches. Papers appearing in more than one database

search were considered only once. The title and, when needed, title, abstract and

methodology of selected studies were read and evaluated for the identification of

eligible studies. Any doubts were solved by consensus meeting with the senior

reviewer (GGA).

The selected articles (Figure 1) were read for quality assessment and data

extraction. The full texts of the studies were assessed for eligibility, and a form

was filled to guarantee eligibility according to the PECO criteria. In case of doubt,

this was summarized and discussed the reasons in the consensus meetings.

2.4. Quality assessment of the selected studies and data extraction

Each selected study was evaluated for inner methodological protocol

aiming to evaluate the extent to which study authors conducted their research in

accordance to the higher possible standards. The ToxRTool® (Toxicological data

Reliability Assessment Tool, Institute for Health and Consumer Protection, In vitro

Methods Unit, European Centre for the Validation of Alternative Methods

(ECVAM)) was used to assess the inherent quality, or reliability of the reported

data. The tool comprises 18 criteria for in vitro studies. Each criterion can be

assigned either a “1” or “0” whether the criterion was met or not met. There are

some minimmum requirement criteria indispensable for a study to be considered

77

as reliable. Those crucial criteria are highlighted in red (red criteria). Only if the red

criteria are rated as “1”, the software ToxRTool® assigns a data reliability of

Category 1 (reliable without restrictions) or Category 2 (reliable with restrictions),

irrespective to the total score obtained. The Category 3 (not reliable) is assigned to

the data that sores less than 11 points or not all the red criteria are met. As a

summary, the tool rates the data according to the numerical score and checks the

red criteria and rates the data again. Then, in cases of disagreement, the

evaluator can propose a Category for the data, since there is a plausible

justification for such change. (Supplementary material)

Data extraction was performed according to six domains: i) study

identification: paper reference; ii) funding: source, reporting of conflict of interest;

iii) cell/tissue model: cell line or cell type, source of cells, sex of human or animal

of origin, species, strain; iv) treatment: RCFM chemical composition, brand,

prepare, vehicle used in experimental/control conditions; v) methods: guideline

compliance, randomization procedure, allocation concealment, blinding during

outcome, number of replicates per group, percent serum/plasma in medium, use

of negative control, report of data from positive controls, endpoint or assay

category, name and source of assay kit, statistical methods; vi) results: No

Observed Effect Concentration (NOEC), Lowest Observed Effect Concentration

(LOEC), statistical significance, AC50 or other estimates of effect reported in the

paper.

The results of the cytotoxic effect evaluations were expressed quantitatively

and qualitatively through different forms (ISO 109993-5, 2009). Seen in these

terms, quantitative measurements were reported as mean values and standard

deviations expressing percent values of cell viability in relation to the experimental

or to the negative control; or percent values of cell toxicity in relation to the

experimental or to the negative control; or as optical density (OD) values.

Qualitatively, the results reported cell morphological overall changes; or the

detection of cell apoptosis or necrosis.

The quantitative results reported as cell toxicity values were transformed

into cell viability results through the subtraction 1- cell toxicity value. The optical

78

density values were dealt with considering the OD values of the experimental or

negative controls as correspondent to 100% cell viability.

Aiming the correct interpretation of the quantitative values reported on the

graphs of the selected studies, the software xScope 4.0® (The Iconfactory and

ARTIS software, Greensboro, USA) was used through the tools Rulers and Guides

to obtain the precise values. The cytotoxic effect results were evaluated based on

cell viability relative to controls as not cytoyoxic – >90% cell viability, slightly

cytotoxic – 60-90% cell viability, moderately cytotoxic – 30-59% cell viability and

strongly cytotoxic – <30% cell viability (Dahl et al., 2006).

The qualitative morphological descriptive evaluations were considered for

comparison with the descriptions of the “Qualitative morphological grading of

cytotoxicity of extracts”, section 8.5.1 from ISO 10993-5 (2009). The qualitative

descriptive evaluations regarding the detection of cell apoptosis or cell necrosis

were considered as reported by the authors for the presence or absence.

Data analysis consisted of the comparisons between the results obtained

through the tetrazolium salt-based tests and those obtained through at least one

different cell viability parameter, considering the trend of such assays to indicate

similar cytotoxic effect level for each investigated root canal filling material. Thus

the classifications “Not cytotoxic” and “Slight cytotoxic” have been defined as

similar to each other and therefore concordant, as well as “Moderately cytotoxic”

and “Strongly cytotoxic” (Dahl et al., 2006). The comparisons enabled the

performing of the following measurements: i) comparisons in each study, ii) total

number of comparisons and iii) number of concordant comparisons. The number

of total and concordant comparisons were evaluated to different variables: i) origin

of cells, whether animal or human; ii) assays parameters and iii) type of

tetrazolium salt-based test.

The quantitative results reported for the generation of reactive oxidative

species (ROS) through the expression of heme oxygenase-1 (HO-1), or through

the dichlorofluorescein diacetate test (DCFH-DA) or through the thiobarbituric acid

reactive substances (TBARS) were compared to the tetrazolium salt-based tests

results using a biological fold change of 1.5 (Witten and Tibshirani, 2007). That is

79

to say the changes in the mean of ROS expression of the treated group higher

than 50% in relation to the mean of ROS expression of the control group were

considered as indicative of cytotoxicity.

3. Results

We exported all the articles (4051) found to End Note Web software® in

database groups (1442 from Pubmed, 1728 from Scopus and 881 from Web of

Science. We removed the duplicates, leaving 3054 papers. Based on the

exclusion criteria, we excluded: 412 animal studies; 4 book chapters; 199 case

reports, 101 clinical studies; 25 conference abstracts; 4 guidelines; 7 letters; 79

patents; 305 reviews; 41 retrospective studies; 154 studies which evaluated RCFM

through other cytotoxic tests; 502 studies which evaluated other dental materials;

356 studies which evaluated other materials; 650 studies which evaluated RCFM

with other objectives; and 79 studies which evaluated the cytotoxic effect of RCFM

only through tetrazolium salt-based tests (Figure 1). Finally, we retrieved 136

papers as potentially eligible and selected 38 for the inner methodological

assessment.

The papers evaluated through the ToxRTool® and classified as category 1

(higher), reliable without restrictions, were include in this review (n = 5). The

studies initially classified as Category 1, with posterior re-evaluation by the

software against the major importance red criteria as Category 3 (not reliable),

which the only methodological failure was the absence of reporting the use of

positive control during the experiments (n = 24), were re-classified as category 1

by the reviewers in a consensus meeting with the senior reviewer (GGA). One

paper classified as Category 2 and eight articles rated as Category 3 were

excluded after the methodological assessment. A total of 29 papers evaluated as

performed in accordance with the highest standards possible, were included in this

review.

The studies characteristics are compiled in Table 3. Different root canal

filling materials were evaluated in the selected studies: MTA (n = 26), resin-based

(n = 18), zinc-oxide and eugenol based (n = 14), Portland cement (n = 8), calcium

hydroxide based (n = 8), silicon-based (n = 4), glass ionomer cement (n = 5),

80

partially stabilized cement (n = 4), flowable resins (n = 3), antibiotic based (n = 2),

chrohexidine based (n = 1), iodoform based (n = 1) and bioceramic particulate

cement (n = 2). The compositions or brands of the root canal filling materials were

described in Table 4.

The cytotoxic effect results data and the number of comparisons were

tabulated (Table 5). Among the tetrazolium salt-based compounds, the MTT and

the XTT (2,3-bis(2-methoxi-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-

tetrazolium hydroxide) reducing assays were the most used for the cytotoxicity

screening of the root canal filling materials (n = 19) and (n = 6), respectively.

Followed by the WST-1 (2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-

2H-tetrazolium, monosodium salt) (n = 2) and the MTS (5-(3-

carboximethoxyphenyl)-2-(4,5-dimethyltiazolyl)-3-(4-sulphonyl) tetrazolium, inner

salt) (n = 1) reducing assays. The total number of comparisons performed was

279 and 86.02% (n = 240) of them showed similar trends of cytotoxic effect.

Considering the origin of the cells used in the each evaluated comparison, animal

cells were used in 106 comparisons with 88.67% (n = 94) of them pointing to

similar trends of cytotoxicity, while human cells were used in 173, with similar

trends observed in 84.39% (n = 146) of the comparisons. Considering the different

cell viability parameters used in each comparison evaluated, the data results were

described in Table 6.

4. Discussion

The ideal root canal filling materials should present some properties and

characteristics relative to their functions and location: i) be easily inserted in the

root canal complex and easily removed if necessary ii) promote proper three-

dimensional sealing of the main and accessories root canals, iii) not shrink after

being inserted, iv) be bacteriostatic or not allow bacterial growth, v) be impervious

to moisture, vi) be radiopaque, vii) not stain the dental structure, viii) be

biocompatible and ix) be sterile (Orstavik, 2005). Furthermore, considering the

pastes for the primary teeth, other ideal characteristic should be added: i)

resorbing rate compatible to the physiologic ryzolisis process, ii) be rapidly

resorbed if extruded from the apices and iii) be antimicrobial (Holan and Fuks,

81

1993). Finally, a biocompatible root canal filling material should assist or stimulate

the tissues healing (Huang et al., 2002). Currently existing materials do not fulfill

all the ideal characteristics, but we can say that there is a great interest in the

development and evaluation of materials with higher biocompatibility.

Seen in these terms, the development of the root canal filling materials aims

to reach the ideal proposals and, ultimately, the healing of the involved tissues. In

opposition to the anti-cancer drugs, which are formulated and designed focusing

specific cell killing (Stepanenko and Dmitrenko 2015), with desirable negative

effects on the cell viability or cell proliferation of a target cell population through

different pathways (Freshney, 2005). For such reason, results of

under/overestimation of the cell viability, as reported for the anti-cancer drugs,

evaluated through the tetrazolium salt-based tests compared to other cell viability

parameters would not be expected for the root canal filling materials. Although,

these materials could present cytotoxic effects, which could potentially generate a

struggle or effort of the exposed cell population to overcome the cell imbalance

(Fulda et al., 2010; Stepanenko and Dmitrenko, 2015). This adaptive metabolism

effort could be detected by the biocompatibility metabolic assays, as a higher cell

metabolism and quantified as cellular viability, not really reflecting the material

cytotoxic effect.

Therefore, the cytotoxic screening of the root canal filling materials based

on a multi-parametric approach including metabolic and non-metabolic assays

present advantages over a single cell viability parameter strategy (De-Deus 2009;

Scelza 2012). However, our review results showed that, among the tetrazolium

salt-based tests, the MTT and XTT reducing assays showed similar trends of

cytotoxic effect in 87.95% and 92.59% of the comparisons with other cell viability

parameters. The MTS reducing assay showed 75% of similar trends of cytotoxic

effect between the assays. The WST-1 showed a lower frequency of similar

results (50%). Nonetheless, in one study the comparisons were performed

between the WST-1 and the observation of the overall cellular morphological

changes parameter, which showed the lower number of concordant results with

the tetrazolium salt-based tests (65.62%). It is worth of notice that the MTT

reducing assay showed a 100% of similar trends of cytotoxic effect compared to

82

the Alamar blue test, another metabolic marker (Camilleri et al., 2005).

Furthermore, the Neutral Red uptake dye assay results performed with murine

Balb 3T3 cells, validated for the estimative of starting doses of Acute Oral Toxicity

(OECD, 2010) showed similar trends of cytotoxicity in 100% of the comparisons (n

= 4) with the XTT reducing assay (Silva et al., 2014). Despite the high number of

concordant comparisons pointing to similar trends of in vitro biocompatibility

between the MTT and XTT reducing assays results and those obtained through

other cell viability parameters, we cannot recommend the use of such tetrazolium

salt-based tests as a single strategy for the evaluation of the root canal filling

materials. Since, the multi-parametric approach could possibly increase the

chances of detection of the cytotoxic effects. Although, we can say that these

assays do not present conflicting results considering the evaluation of the root

canal filling materials, compared to other cell viability parameters.

Considering the experimental conditions of the included papers, we

observed a diversity of methodologies. Nonetheless, the rate of comparisons that

showed similar trends of cytotoxicity was not affected while using animal or human

cells. We observed that most of the studies conducted with human cells used

primary cells, meanwhile those performed with animal cells, used continuous cell

lines. The use of primary human cells, as well as mammalian cell lines is admitted

by the current literature, provided these cells cultures present enough quality to

allow cell reproducibility over the time and maintained the phenotypic

characteristics (NIH, 2001, Freshney, 2005). Aiming to the extrapolation of the in

vitro biocompatibility results to the in vivo human studies and to add the data

obtained to the human toxicity databases, the use of human cells would be more

interesting (NIH, 2001).

According to Gstraunthaler (2003) the fetal bovine serum (FBS), is the most

widely used animal serum supplement in cell culture. Our findings corroborated

this statement, since the FBS applied in the concentration of 10% related to the

culture medium, was the most used animal serum supplement. However, different

concentrations of FBS, animal serum supplements and serum-free methodologies

were also reported. We did not observe differences relating the use of the

83

different animal serum supplements methodologies with the number of concordant

comparisons.

The present study included papers that evaluated different materials

representative of the main groups of the root canal filling materials indicated both

for the permanent (Hauman and Love, 2003) and some for the primary teeth

(Barcelos et al., 2011). Even though it was not the objective of this study, our

results of the cytotoxic effect reported in the selected articles, allowed an overview

of the cytotoxicityity of such materials. Moreover, the studies were evaluated

through the ToxRTool® in vitro studies assessment, which considered the

reporting of the information related to the five groups of criteria: i) test substance

identification, ii) test system characterization, iii) study design description, iv) study

results documentation and v) plausibility of the study design and results. We

observed as some methodological failures of the potentially eligible studies the

lack of reporting of: the number of cells used, the vehicle/material ratio, the

number of replicates, a complete methodology description and the use of a

positive control. Based on our experience acquired with this systematic review,

we suggest the use of this tool as one possible guide for the design and reporting

of the in vitro studies aiming to achieve the higher methodological and reliability

standards. Finally, our review results unpretentiously assessed the root canal

filling materials through an evidence-based toxicology view (Silbergeld and

Scherer, 2012). Therefore, considered the number of the included studies, the

assessment pointed to good in vitro cell-based biocompatibility for the Mineral

trioxide aggregate.

5. Conclusion

In the light of the findings of this systematic review, we can say that the

tetrazolium salt-based tests concerning the XTT and the MTT reduction assays do

not present conflicting results compared to other cell viability parameters assays

for the in vitro biocompatibility of the root canal filling materials.

84

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90

Figure 1. Study selection flow diagram (Moher et al., 2015)

91

Table 1. Outlines the populations, exposition, comparisons, and outcomes (PECO format).

PECO format

Population Animal and/or human cells

Exposition Exposed to root canal filling materials (RCFM) with cytotoxicity evaluation through different tests

Comparison Exposed to root canal filling materials (RCFM) with cytotoxicity evaluation through tetrazolium salt-based tests

Outcome Cytotoxic effects results

Table 2. Electronic database and search strategy

Database Search strategy

Pubmed cytotox*[Title/Abstract] OR biocompat*[Title/Abstract] AND endod*[Title/Abstract] OR root canal filling[Title/Abstract]

Scopus “cytotox*” OR “biocompat*” AND “endod* “OR “root canal filling”

Web of Science

cytotox* OR biocompat* AND endod* OR root canal filling

92

Table 3. Characteristics of the included studies

Reference Cell line or cell type RCFM chemical composition/brand

Vehicle used in experimental/control conditions Vehicle/material ratio Number of replicates per group Exposition time Percent serum/plasma in medium

Camilleri et al., 2005.

Human osteoblast cell line

(HOS TE 85)

GOPC, WOPC, GMTA ProRoot MTA,WMTA ProRoot MTA,

Proto A, Proto B

DMEM with antibiotics 10mm discs:10ml, 3 ml test sample/ replaced with fresh medium at each time interval (ISO

10993 (1992)) Technical: 8 for MTT and 3 for Alamar Blue (AB)

1,3,7,days/at 24h (MTT); 1,3,7, days (AB) 10% FCS

Chang et al., 2014

Primary Human dental pulp

PSC with 3 different 3 Ca sulfate ratio (9/1, 7/3, 5/5),

White MTA.

DMEM 0.2 g:1 mL (ISO 10993-5)

Technical: 6 24 and 72h 10% FBS

De-Deus et al., 2009.

Adhered mesenchymal cells from human bone

marrow

BioAggregate and White Pro-Root MTA.

Alpha-MEM Not applicable/root model

Technical: 3 for each experimental period 24, 48 and 72h

10% FCS


Human osteoblasts iRoot and White Pro-Root MTA.

DMEM with antibiotics Not applicable/root model

Technical: 3 for each experimental period 24 and 48 h 10% FCS

Diomede et al., 2014

Human dental pulp stem cells, human periodontal ligament stem cells, human gingival fibroblasts, human osteoblastsh

EndoRez

DMEM with antibiotics 200 μL medium: rings (4 mm x 3mm)

Biological: 2 / Technical: 6 for each time point 24,48,72h and 1 week

5%FCS in DMEM used for HGF

93

Huang and Chang, 2007

Humna gingival fibroblasts

N2 and Topseal

DMEM with antibiotics Cylinder 35 mm x 2 mm:40 mL medium in 5% CO2 and 95% air at 37°C for 72 h. Final

dilution: 1:2, 1:4, and 1:8) Biological: 3 / Technical: 3 for each concentration

24h for MTT, 0,1,2,4 and 8hs for HO-1 analysis 10%FCS

Trichaiyapon et al., 2012

Human periodontal ligament cells

Tetric Flow, Filtek Flow, Aeliteflo,White ProRoot MTA

DMEM with antibiotics Discs (6-mm x 1.5-mm):200μl of medium

Biological: 3 /Technical: 3 for MTT (direct and indirect), Technical 2 for SEM1 to 4 days 10% heat-inactivated FCS

Karimjee et al., 2006

Human periodontal ligament cells

Contour, Fuji II LC, MTA mixed with sterile distilled water, MTA

mixed with KY jelly

Alpha-MEM with antibiotics Cylinder (4 mm x 6 mm):1 mL medium

Technical: 3 for each time point 24, 48 and 72h

0.2%FBS

Kim Ryan et al., 2014

MG-63 cells and Human gingival

fibroblasts EndoSeal, AH Plus ,Sealapex

DMEM sealer (0.1 cc):200 μL medium. 100 μL of eluate/replenished with fresh 100 μL DMEM every two days, to obtain the eluates containing any toxic substances released from the sealers at

1, 3, 7 days. 100 μL of the eluate:to the cells Technical: 3 for each time point

1,3 and 7 days Not reported

Lee et al., 2012 MG-63 GIC (Fuji II); IRM, Ortho MTA,

ProRoot MTA Dentsply

6 discs (5 mm x 3 mm): 0.5 mL serum-free DMEM with 1% antibiotics. After 1/4/7 days, the extracts were collected and diluted with DMEM with 10% FBS and 1% antibiotics such that

the extracts would contain 2% FBS. All extracts were sterilized by filtration. Biological: 2 / Techinical: 3

1, 4 and 7 days (XTT), 24,48 and 72 hs (SEM) 2%FBS

Pires et al., 2015

Peripheral blood mononuclear cells

(CHX); (MAX); (NEB); Guedes-Pinto; Calen thickened with zinc

oxide, calcium hydroxide thickened with zinc oxide

(CH/ZO), UltraCal XS paste

RPMI 1640 with 10% FBS and antibiotics. Each extract (1 : 1) (1000 lL) was mixed with a suspension of the previously plated cells

(1000 lL). The final concentration was 1:2. Technical: 3 24 and 48h 10%FBS

Scelza et al., 2012

Human osteoblasts

Sealapex, Real Seal SE, Pulp Canal Sealer EWT, MTA

Fillapex

serum free Alpha-MEM 0.1 g: 1 mL

Biological:3 / Technical: 3 24h

Serum free medium

94

Testarelli et al., 2012.

Peripheral blood monocytes

Thermafil, Auroseal, Superseal, Realseal1™

DMEM with antibiotics Surface:volume medium (0.5 cm2/mL) Technical: 6 for MTT and 3 for ROS

2h 10%FCS

Xu P et al, 2010.

Human osteoblast-like MG63

RealSeal sealer and core material, AH Plus, gutta-percha

Eagle basal medium 1.25 cm2/mL Technical: 3 1 and 3 days

10%FBS

Lin et al., 2004. Human periodontal ligament fibroblasts

MTA, Fuji II SC GIC, Amalgam Valiant Ph.D., IRM, Super EBA

DMEM with antibiotics 3mm in a transwell insert : 1ml DMEM

Technical: 6 for Trypan blue 1, 3, 5 days

10%FCS

Eldeniz et al., 2007

Human gingival fibroblasts and L929

AH Plus, EndoREZ, Epiphany, RC Sealer, Acroseal, Apexit,

GuttaFlow, RoekoSeal

DMEM with antibiotics for HGF/ MEM for L929 with antibiotics 1.25 cm2/mL between the surface

of the samples and the volume of medium Biological: 2/ Technical: 6 24h for MTT; 4h for SEM

5%FCS

Osorio et al., 1998

L929 mouse fibroblasts and human gingival

fibroblasts

Endomet, CRCS, AH26, Amalgam, Gallium, GF2, Ketac

Silver, MTA, and Super-EBA

MEM for L929 and DMEM for HGF Extraction medium was added to each sample at 1:5(wt/vol) ratio (i.e. 1g of test material/5ml

of medium) Technical: 5

72h 10%FBS

Eid et al., 2014

Rat odontoblsast-like cells derived from the apical papilla (MDPC-

23)

MTA Plus (WMTAP, GMTAP), ProRoot MTA (WMTA, GMTA),

IRM

DMEM direct test, disks (5-mm diameter and

3-mm thick) in Transwell inserts with additional 2ml DMEM. Indirect test (1 disk/2 mL) for 4 days to collect the eluents.

Technical: 3 3 days for direct contact , 4 days for indirect contact, in 1,2 and 3 cycles (weeks), , for flow

cytometry (2 cycles, weeks) 10%FBS

Gomes Cornélio et al., 2011

Immortalized murine periodontal ligament

cells and rat osteosarcoma (ROS)

White PC, PCBi, PCZir, PCCa, ZOE

RPMI 1640 medium (500 mg of prepared cement/mL of RPMI). Other dilutions of those cement elutes were

prepared: (stock solution, 1/ 5, 1/50, 1/500, 1/5000). At morphologic and apoptosis/necrosis experiments, 3 elute concentrations were selected: 1, 10, and 100 mg/mL.

Technical: 3 24h

10% FBS

95

Wei Wei et al., 2012

Murine dental papila-derived odontoblast-like cells (MDPC-23)

Quick-Set,ProRoot MTA (WMTA)

DMEM direct test, disks (5-mm x 3-mm) in Transwell inserts with additional 2ml DMEM. Indirect test (1 disk/2 mL) for 4 days to collect the eluents. Each eluent concentrate collected after the 2-week aging period was diluted with fresh growth medium to 1:1, 1:10, and 1:102 of its original

concentration to achieve a final volume of 2 mL Technical: 12 for MTT and flow cytometry.

3 days for direct contact , 4 days for indirect contact, in 1,2 and 3 cycles (weeks), for flow cytometry (2 cycles, weeks)

10% FBS

Dartar Oztan et al., 2003.

L929 AHPlus and Roeko Seal

DMEM area 1cm diameter to 6ml DMEMBiological: 10 for each material and time period

0, 24, 48, 72h 10%FBS

Souza et al. 2006

Cell line derived from Chinese hamster lung

fibroblasts (V79)

N-Rickert (F&A), N-Rickert, SuperEBATM, MTA ProRootTM ,MTA Angelus, Amalgam GS-

80TM and gutta-percha

DMEM with antibiotics 1g/5ml of medium

Biological: 3 / Technical: 3 1 and 3 days Not reported

Lee DH et al., 2007

Rat clonal dental pulp cells RPC-C2A

AH26

DMEM/ DMSO for AHPlus AHPlus (1,2,3,4,5mg/ml). The initial vehicle/material ratio was reported only for AHplus

(5mg/ml) Technical: 3

24h 10%FBS

Lessa et al., 2010

Immortalized MDPC-23

White-MTA, MTA-Bio

DMEM (2 mm x 2 thick): 1 mL of DMEM (without FBS)

Technical: 3 replicates 24h and 7 days

10% FBS

Silva et al., 2014

Fibroblasts cells 3T3 EndoBinder,

WMTA

DMEM 1.25 cm2/mL ratio between the sample surfaces and the medium volume.

Technical: 3 24 and 48h 10% FBS

Pelliccioni et al., 2004

MG-63

ProRoot MTA cement, Super EBA, Valiant PhD Amalgam

DMEM with antibiotics 1g/5ml medium

Biological: 3 / Technical: 3 24h

10%FBS

96

Valois e Azevedo, 2008

Fibroblasts cells 3T3 AH Plus, Endofill Sealer 26

DMEM with antibiotics 300 mg in a round plastic mold (10 mm diameter): 3 mL of serum-free culture medium.

Eluates were sterilized by filtering with a 0.2- mm-pore filter and then were diluted in culture medium.

Biological: 2/ Technical: 3 24h

10%FCS

Yu MK et al., 2010

Mouse osteoblast-like cell line MC3T3-E1

AH26

Alpha-MEM with antibiotics Rings (6-mm x15-mm) :30 mL medium

Eluates were collected with a sterile filter (0.22 m m). Dilutions (10%-50%) of extraction media were tested. The extraction sample of 30% of 1-day elution was tested to confirm the

apoptosis pathway and signal regulation. Biological: 3

1 day 10% heat-inactivated FBS

Wang et al., 2007

Rat primary osteoblasts

PSC, PSC with 5% of CoO, PSC with 5% of Cr2O3, and PSC with

5% of ZnO. MTA as control.

DMEM with antibiotics 0.1g/1ml of serum free medium

Technical: 6 1, 3 and 7 days

10%FBS

Human cells

97

Table 4. Root canal filling materials brands / compositions

Reference RCFM chemical composition/brand

Camilleri et al., 2005.

Grey Portland Cement - GOPC (Italcementi SPA, Bergamo, Italy); White Portland cement -WOPC (Lafarge Asland, Valencia, Spain), Grey MTA (ProRoot MTA),White MTA (ProRoot MTA), White Portland cement clinker inter-ground without gypsum -Proto A (Aalborg White, Aalborg, Denmark), White Portland cement clinker inter-ground without gypsum and mixed with 4:1 bismuth oxide - Proto B (Aalborg White, Aalborg, Denmark) (Sigma –Aldrich, Dorset, UK)

Chang et al., 2014 PSC (partially stabilized cement) with 3 different 3Ca sulfate: 3 Ca aluminate (9/1, 7/3, 5/5), and White MTA (Dentsply, Tulsa Dental Products Tulsa, OK, USA).

De-Deus et al., 2009 BioAggregate (Innovative, BioCeramix Inc, Vancouver, BC, Canada) and White Pro-Root MTA (Dentsply, Tulsa Dental Products Tulsa, OK, USA)

De-Deus et al., 2012 iRoot BP Plus (Innovative, BioCeramix Inc, Vancouver, BC, Canada) and White Pro-Root MTA (Dentsply, Tulsa Dental Products Tulsa, OK, USA)

Diomede et al., 2014 EndoRez (Ultradent Corp, South Jordan, USA)

Huang and Chang, 2007

N2 (Indrag-Agsa, Losone, Switzerland) and Topseal (Dentsply/Maillefer, Ballaigures, Switzerland)

Trichaiyapon et al., 2012

Tetric Flow (Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein), Filtek Flow flowable resin composite, (3M ESPE, St Paul, MN, USA), and Aeliteflo (Bisco, Schaumburg, IL, USA). And white ProRoot MTA

Karimjee et al., 2006 Contour (Kerr Manufacturing Co, Romulus, MI); 2) Fuji II LC (GC America, Alsip, IL); 3) MTA mixed with sterile distilled water; and 4) MTA mixed with KY jelly (Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ).

Kim Ryan et al., 2014 EndoSeal (MTA ,Maruchi, Seoul, Korea), AH Plus Epoxy resin, (Dentsply DeTrey Konstanz, Germany), Sealapex (Calcium hydroxide, SybronEndo, Romulus, MI, USA)

Lee et al., 2012 GIC (Fuji II) (GC Corp, Tokyo, Japan); IRM (Dentsply Tulsa Dental, Tulsa, OK); Ortho MTA (BioMTA, Seoul,

98

Republic of Korea); ProRoot MTA (Dentsply Tulsa Dental, Tulsa, OK)

Pires et al., 2015

Chlorhexidine (Nova Derme, Santa Maria, Brazil) (CHX); Maxitrol (Alcon, São Paulo, Brazil) (MAX); neomycin sulphate + bacitracin (EMS, Hortolândia, Brazil) (NEB) Guedes-Pinto; Calen (S.S. White, Rio de Janeiro, Brazil) thickened with zinc oxide (Calen/ZO) (1g:0.65g); calcium hydroxide thickened with zinc oxide (CH/ZO) in a 3 : 1 ratio; UltraCal XS paste (Ultradent, Indaiatuba, Brazil)

Scelza et al., 2012 Sealapex (Kerr, Romulus, MI, USA), Real Seal SE (SybronEndo, Orange, CA, USA), Pulp Canal Sealer EWT (Sybron Endo, Orange, CA, USA); MTA Fillapex (Angelus, Curitiba, Brazil)

Testarelli et al., 2012. Thermafil (Tulsa Dental, Tulsa, OK, USA) AUROSEAL (Giovanni OGNA S.p.A., Milan, Italy), SUPERSEAL (Giovanni OGNA S.p.A., Milan, Italy), REALSEAL 1™ (SybronEndo, Orange, CA, USA)

Xu P et al, 2010. RealSeal sealer and core material (SybronEndo, Orange, CA), AH Plus (Dentsply,DeTrey, Konstanz, Germany), and gutta-percha (Dentsply DeTrey)

Lin et al., 2004. MTA (Dentsply, Maillefer, Switzerland), Fuji II SC GIC (GC Corp., Tokyo, Japan), Amalgam, Valiant Ph.D. (Dentsply Caulk, Milford, DE), IRM (Dentsply Caulk, Milford, DE), Super EBA (Bosworth, Skokie, IL).

Eldeniz et al., 2007 AH Plus (De Trey/Dentsply, Konstanz, Germany); EndoREZ (Ultradent/USA); Epiphany (Pentron, Wallingford, CT, USA); RC Sealer (Sun Medical/Japan); Acroseal (Septodont, France); Apexit (Vivadent, Schaan, Liechtenstein); GuttaFlow (Colthane/Whaleden, Langenau/Germany); RoekoSeal (Colthane/Whaledent, Langenau/Germany)

Osorio et al., 1998

Endomet (Septodont, France), CRCS (Hygenic Corp, Ohio, USA), AH26 (De trey Dentsply, Weybridge, UK), Amalgam (Vallium PhD, Vivadent, Amherst, USA), Gallium (Tohuriki , Honten Co, Japan), GF2 (Tohuriki , Honten Co, Japan), Ketac Silver (Espe-Premier, St Paul, USA), MTA (Loma Linda, University of California, USA), and Super-EBA (Harry J. Bosworth Co. Gibbstown, USA)

Eid et al., 2014 MTA Plus (White MTAP, Grey MTAP) (Avalon Biomed Inc, Bradenton, USA), ProRoot MTA (White MTA, Grey MTA) (Dentsply, Tulsa Dental Products Tulsa, OK, USA) , IRM (Dentsply CaulK, Milforf, USA)


White Portland cement (PC) (Votorantin, São Paulo, Brazil) alone or associated with bismuth oxide (PCBi), zirconium oxide (PCZir), and calcium tungstate (PCCa), added in 20% in weigth. Radiopacifying agents (Sigma Aldrich, St Louis, MO) ZOE

99

Wei Wei et al., 2012 (Quick-Set; Primus Consulting, Bradenton, FL), ProRoot MTA (WMTA)

Dartar Oztan et al., 2003.

AHPlus (Dentsply, De Trey, UK) and Roeko Seal (Roeko, Langenau, Germany)

Souza et al. 2006 N-Rickert (F&ATM, São Paulo, SP, Brazil), N-Rickert (InodonTM, São Paulo,SP, Brazil), SuperEBATM (Bosworth Company, Skokie, IL, USA), MTA ProRootTM ,MTA Angelus (AngelusTM, Londrina, PR, Brazil), Amalgam GS-80TM (SDI, Bayswater, Victoria, Australia) and gutta-percha (TanariTM, Manacapuru, AM, Brazil)

Lee DH et al., 2007 AH26 (Detrey Dentsply, Switzerland)

Lessa et al., 2010 White-MTA, MTA-Bio (AngelusTM, Londrina, PR, Brazil)

Silva et al., 2014 EndoBinder (Binderware, São Carlos, SP, Brazil), WMTA (Angelus (Londrina, PR, Brazil)

Pelliccioni et al., 2004 ProRoot MTA cement (Dentsply Tulsa Dental, Tulsa , OK); Super EBA (Harry J. Bosworth Co, Skokie, Ill); Valiant PhD Amalgam (Dentsply Caulk, Dentsply International Inc, Milford, DE)

Valois e Azevedo, 2008

AH Plus (DeTrey Dentsply, Konstanz, Germany), Endofill (Dentsply, Brazil), Sealer 26 (Dentsply, Brazil)

Yu MK et al., 2010 AH26 (Dentsply [Lot:0906000950] Detrey [Lot:0907001187] GmbH, Konstanz, Germany

Wang et al., 2007 Partial-stabilized cement (PSC) was prepared at the temperature of 1400C as described in the 2003 study. PSC with 5% of CoO addition, PSC with 5% of Cr2O3 addition, and PSC with 5% of ZnO addition, respectively. MTA as control.

100

Table 5. Results of the cytotoxic effect evaluation and comparisons

Reference Tetrazolium salt-based test used/result trend

Other cytotoxic test used/result trend

Number of comparisons/ concordant comparisons

Camilleri et al., 2005. MTT/ (24h) 1 and 3 days all materials (--), 7 daysGOPC, WOPC, Proto A (--), Proto B (-), WMTA (-), GMTA (--)

Alamar Blue (AB)/ 1 day GOPC and GMTA (--), WOPC, Proto A , Proto B and WMTA (-), at 3 and 7 days all materials (-).

18 comparisons other metabolic maker 18 concordant

Chang et al., 2014 WST-1/All materials (--) at days 1 and 3.

Lactate dehydrogenase (LDH)/All materials (-) at day 3. PSC-91, PSC-73, MTA (-) and PSC-55(+) at day 1.

8 comparisons Released intracellular component marker 7 concordant


XTT/(MTA not cytotoxic at 24h (--); slightly cytotoxic at 48 and 72h (-))/ (Bioaggregate slightly cytotoxic at 24,48 and 72h(-))

Neutral Red (NR), Crystal violet dye elution (CVDE)/ (NR) (MTA at 24,48 and 72h (-); Bioaggregate at 24 and 48h (-) and at 72h (+))//(CVDE) (MTA at 24, 48h and 72h (-); Bioaggregate at 24,48 and 72h(-))*

6 comparisons Membrane marker (NR) + 6 comparisons ( DNA marker, CVDE) 11 concordant

De-Deus et al., 2012. XTT/(MTA at 24 and 48h (--))/ iRoot at 24h (--) and at 48h (-)

Neutral Red (NR), Crystal violet dye elution (CVDE)/ (NR) and (CVDE) (MTA at 24h and 48h (--)/ iRoot at 24h and at 48h (--)

4 comparisons Membrane marker (NR) + 4 comparisons DNA marker, (CVDE) 8 concordant

Diomede et al., 2014

MTT/(hDPSCs, hPDLSCs and HGF: At 24h (+), at 48, 72hand 1 week (-))//(hOSTs: At 24 and 48h (+), at 72h and 1 week (-))

Trypan blue staining//(hDPSCs, hPDLSCs and HGF: At 24h (+), at 48, 72hand 1 week (-))//(hOSTs: At 24 and 48h (+), at 72h and 1 week (-))

16 comparisons Membrane marker (TB) 16 concordant

Huang and Chang, 2007 MTT/ (N2, dilutions 1:8 (-), 1:4 (+), at 1:2 dilution (++)) (Topseal dilutions 1:8 and 1:4 (-) and 1:2 (+)

Heme oxygenase-1 (HO-1) analysis/ Topseal 1:4 showed a HO-1 expression 148% higher than the control; N2 1:8, was 58% higher.

2 comparisons Released intracellular Component marker (HO-1) 0 concordant

101

Trichaiyapon et al., 2012 MTT/(At 1, 2, 3 and 4 days all materials were (--), except Filtex Flow, at 1 day (+))

SEM/ Overall morphological changes were rated as “mild”by authors according ISO.

4 comparisons (SEM) marker cellular morphological changes) 3 concordant

Karimjee et al., 2006 (70)

MTS/ At 24 and 48h, Amalgam, MTA/water, MTA/KY were (+), GIC (++); and at 72h all materials were (++))

Lactate dehydrogenase (LDH) At 24h Amalgam, MTA/KY, GIC (-) and MTA/water (+) at 48h all materials (+), 72h Amalgam, MTA/KY, GIC (+) MTA/water (++))

12 comparisons Released intracelular component marker (LDH) 9 concordant

Kim Ryan et al., 2014

WST-1/ MG-63, EndoSeal at days 1 and 3 (++), at day 7 (-); AHPlus at day 1 (++), day 3 (+) and day 7 (-)// HGF, EndoSeal at day 1 (++), day 3 (+), at day 7 (-); AHPlus at days 1,3 and 7 (++)

SEM/at MG-63 and HGF, the overall morphological changes “slight” (overnight), and “none” (7 days) on both AHPlus and EndoSeal.

4 comparisons (1 and 7 days) marker (SEM) cellular morphological changes 3 concordant

Lee et al., 2012

XTT/at 1,4 days GIC (-), Ortho MTA at day 1 (--), at day 4 (+), ProRoot MTA at day 1 (--), day 4 (-), IRM at days 1 and 4 (++)

SEM/ at 24, 48 and 72 h, reactivity considered as “None” for GIC (Fuji II) Ortho MTA and ProRoot MTA. At the same time points the reactivity was moderate for IRM.

12 comparison cellular morphological changes marker (SEM) 11 concordant

Pires et al., 2015 XTT/ At 72h all materials (--), at 24h CHX, GP< Calen/ZO, CH/ZO,Ultracal (--), MAX and NEB (-)

Oxidative stress (ROS)/ (DCFH-DA) ROS expression compared to control. At 72h and 24 h respectively: CHX 94%, 33% higher; MAX 68%, 13% higher; NEB 56% higher, 7% lower; GP 37%, 18% higher; Calen/ZO 13%, 29% higher; CH/ZO 16% lower, 39% higher; Ultracal 4% lower, 20% higher. // (TBARS) ROS expression compared to control. At 72h and 24 h respectively: CHX 11%, 5% lower; MAX 9% higher, 20% lower; NEB 12% and 16% lower; GP no difference, 5% lower; Calen/ZO 19%,

14 comparisons ROS expression. ( DCFH-DA) 11 concordant + 14 comparisons TBARS 13 concordant

102

50% higher; CH/ZO 50% and 36% higher; Ultracal 39% and 58% higher.

Scelza et al., 2012 XTT/ at day 1 all materials (++), at day 7 MTA, Real Seal, Sealapex (++) and PCSealer (--)

NR/CVDE/ at day 1 all materials (++), at day 7 MTA, Real Seal, Sealapex (++) and PCSealer (--)*

4 comparisons Membrane marker + 4 comparisons CVDE 8 concordant

Testarelli et al., 2012. MTT/4 all materials (-)

Oxidative stress (ROS)/ SS showed ROS expression 64% lower than control; AUS showed ROS expression 76% lower than control; RS showed ROS expression 8% lower; RS1 increased ROS expression 92% to the control.

4 comparisons ROS expression 3 concordant

Xu P et al, 2010. MTT/ At 3 days, Real Seal 100% (++), AHPlus 100% - 12,5% (-), Real Seal Core (--)

FC/At 3 days, (100%) Real Seal (++), AHPlus (+), Real Seal Core (-)

3 comparisons apoptosis/Necrosis 2 concordant

Lin et al., 2004.

MTT(1day, all materials were (--); 3 days, MTA and GIC (--), Amalgam was (+) and IRM and SEBA were (++); 5 days, MTA was (--), GIC (+), IRM and SEBA (--))

Trypan blue exclusion dye/ (1 day, MTA, GIC and SEBA were (--), Amalgam was (-), IRM (++); 3 days MTA (--), Amalgam and GIC were (-) , SEBA (+), IRM (++))

10 comparisons membrane marker 8 concordant

Eldeniz et al., 2007

MTT/ (HGF) AHPlus (--); RCSealer, GuttaFlow and RoekoSeal were (-); EndoREZ, Epiphaby, Acroseal and Apexit were (++))//(L929)(AH Plus, GuttaFlow and RoekoSeal were (-); RC Sealer (+); EndoRez, Ephiphany, Acroseal, Apexit were (++))

Trypan blue exclusion dye/ SEM (HGF)/ AHPlus, Gutta Flow and RoekoSeal cells showed typical appearance; RC Sealer cells showed atypical morphology;Epiphany, EndoRez, Apexit and Acroseal cells exhibited changes in shape and lost their structure, most could not exclude Trypan blue)

8 comparisons membrane marker /SEM 8 concordant

103

Osorio et al., 1998

MTT/(hGF//AH26, CRGS and Endomet were (++), Ketac,SEBA and Amalgam (++); GF2 (-); and MTA was not cytotoxic (--))// (L929//, AHPlus, CRCS, Endomet, Ketac Silver, SuperEBA (++), Gallium (+), Amalgam (-), MTA (--)

Crystal Violet/(hGF// AH26, CRGS and Endomet were (+), MTA s (-), GF2 (--), Ketac (--), SEBA (+), Amalgam (++)// (L929)/ Endomet, Ketac Silver (++), AHPlus SuperEBA (+), CRCS, Gallium (-), MTA (-), Amalgam (--)

16 comparisons 8 (HGF) 7 concordant + 8 (L929) 6 concordant

Eid et al., 2014 XTT/2 cycle (WMTA,GMTA ,WMTAP,GMTAP (-)// IRM (+) *

Flow cytometry/2cycle (WMTA,GMTA, WMTAP,GMTAP (-)// IRM(++)

5 comparisons Apoptosis/necrosis marker 5 concordant


MTT/(mPDL/at the dilutions 0.1mg/ml, 1mg/ml all materials (--); at 10mg/ml all materials (--) except ZOE (-); at 100mg/ml all materials (++), except PC (--); at 500mg/ml all materials (++)). (ROS similar to the mPDL results, except that at 10mg/ml ZOE (-)

Apoptosis/necrosis/ mPDL/ PC 1mg/ml (--), 10mg/ml, 100mg/ml (-); PCBi 1mg/ml (--), 10mg/ml (-), 100mg/ml (+); PCZir 1mg/ml (--), 10mg/ml, 100mg/ml (-); PCCa at 1mg/ml (--), 10mg/ml, 100mg/ml (-); ZOE 1mg/ml (-), 10mg/ml, 100mg/ml (++);/ ROS 17/2.8/ PC1mg/ml (--), 10mg/ml (-), 100mg/ml (+); PCBi 1mg/ml (--), 10mg/ml (-), 100mg/ml (+); PCZir 1mg/ml (--), 10mg/ml (--), 100mg/ml (+); PCCa at 1mg/ml,10mg/ml(--),100mg/ml (-); ZOE 1mg/ml (--), 10mg/ml(-), 100mg/ml (+)

15 comparisons Apoptosis/necrosis marker 12 concordants + 15 ROS 14 concordants 26 concordant

Wei Wei et al., 2012 MTT/Quick-Set at 1st and 2nd weeks (--); Pro Root MTA at 1 week (-) and at 2 weeks (--).

Flow cytometry (FC) Quick-Set 1st week (-) and at 2nd week (--); ProRoot MTA at 1st week (-) and at 2nd week (--).

4 comparisons Apoptosis/necrosis marker 4 concordant

Dartar Oztan et al., 2003. MTT/(AHPlus 24h (--), and at 48 and 72h (-))/ RSA at 24,48 and 72h(--).

Cell counting assay (Trypan blue)/(AHPlus 24h (--) and at 48 and 72h (-)/ (RSA 24h (--) and at 48 and 72h (-))

6 comparisons Membrane marker 6 concordant

104

Souza et al. 2006 MTT(SEBA,MTA ProRoot, MTA Angelus, Amalgam and N-Rickert (Inodon) were (-); N-Rickert (F&A) (+)

NR//NAC/(NR) (MTA Pro Root, MTA Angelus and Amalgam were (--); SEBA and N-Rickert Inodon) were (-); N-Rickert(F&A)(+))//(NAC)( SEBA,MTA ProRoot, MTA Angelus, Amalgam and N-Rickert (Inodon) were (-), N-Rickert (F&A)(+))

12 comparisons 6 comparisons Membrane marker+ 6 comparisons NAC (nucleic acid content) 12 concordant

Lee DH et al., 2007 MTT/AHPlus (++) Apoptosis (Flow cytometry)/ Induction of apoptosis detected.

1 comparisons Apoptosis necrosis1 concordant

Lessa et al., 2010 MTT/ at 24h and 7days White MTA (-), MTA Bio at 24h (--), 7 days (-)

SEM/ The control cells reactivity was “None”, and for the MTA extracts exposed cells “Slight”

4 comparisons cellular morphological changes marker (SEM) 4 concordant

Silva et al., 2014 XTT/ (24h, MTA (-) and EndoBinder (--); 48h, MTA and EndoBinder (--))

NR/CVDE//(NR) (24h MTA and EndoBinder (-); 48h MTA and EndoBinder (--))// (CVDE)/(at 24 and 48h, MTA and EndoBinder (--))

4 comparisons Membrane Marker + 4 comparisons CVDE 8 concordant

Pelliccioni et al., 2004 MTT/ (MG-63) MTA (--); SEBA (++); Amalgam (--).

NR/ (MG-63) MTA (-); SEBA (-); Amalgam (+).

3 comparisons Membrane marker 1 concordant

Valois et al., 2008 MTT/ All materials at eluates 5% (--), 10% (-), 20% (+)

Flow cytometry// All materials compared to control: at eluates 5% (no differences were found in the proportion of cells in different cell-cycle phases and for sub-G1 population. At 10% decrease in G1 population and increase in S/G2/M phases. At 20% decrease in G1 and S/G2/M phases and increase in sub-G1.

9 comparisons Apoptosis/Necrosis 9 concordant

Yu MK et al., 2010 MTT/ At 24h AH Plus (+) Induction of apoptosis was detected by

1 comparison Apotosis/necrosis detection

105

NR = Neutral red, CVDE = Crystal violet dye elution/ Not concordant comparisons

Hoechst33258 staining and poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) activation.

1 concordant

Wang et al., 2007

MTT/ MTA at days 1 and 3 (--), day 7 (-); PSC at days 1 and 7 (--), day 3 (-); PSC-Co at days 1 and 3 (--), day 7 (-); PSC-Cr at days 1, 3 and 7 (--); PSC-Zn at days 1, 3 and 7 (--)

LDH/ MTA at days 1, 3 and 7 (--), PSC at day 1 (--), day 3 and 7 (-); PSC-Co at days 1 and 7 (-) and at day 3 (+); PSC-Cr at days 1, 3 (+) and 7 (-) PSC-Zn at days 1 and 7 (-) and at day 3 (+).

15 comparisons Released Intracellular component marker. 11 concordant

106

Table 6. Comparisons results considering the different assays parameters

Variables Comparisons

(n)

Comparisons with similar trends of cytotoxic effect

(n / percentage)

Different assays

parameters

Apoptosis/necrosis detection

38 34 / 89.47%

Membrane markers 67 62 / 92.53%

DNA markers 34 31 /91.17%

NAC marker 6 6 / 100%

Released intracellular component marker

84 68 / 80.95%

Cellular morphological changes marker

32 21 / 65.62%

Other metabolic marker 18 18 / 100%

Tetrazolium salt-based

tests

MTT 166 146 / 87.95%

XTT 81 75 / 92.59

WST-1 20 10 / 50%

MTS 12 9 / 75%

107

5.3 Artigo 3: Multiparametric evaluation of the cytotoxicity of selected root

canal filling materials for primary teeth through a root canal simulating model

Authors:


Luciana Domênicob

Gutemberg Alves c

Adriana Brandão Ribeiro Linharesd

Roberta Barcelose

Laura Salignac Guimarães Primof

ª PhD student, Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.

b Underdraduate student, Biomedicine, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.

c Adjunct Professor, Department of Molecular and Cellular Biology , Biology Institute, Fluminense Federal University, Niterói, Brazil.

d MsC, PhD,,Clinical Research Unit, Antonio Pedro Hospital, Fluminense Federal University, Niterói, Brazil.

e Adjunct Professor, Department of Pediatric Dentistry, Institute of Health, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.

fAdjunct Professor, Department of Pediatric Dentistry and Orthodontics, School of Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil



Caixa postal: 68066


Phone: + (55) 21 2562-2098 Fax: + (55) 21 2590-2771


108

Summary

Background: Although most of the root canal filling materials for primary

teeth such as zinc oxide and eugenol (ZOE), calcium hydroxide and iodoform

based pastes present cytotoxic effects in in vitro studies, they show high success

clinical frequencies. Aim: To evaluate the cytotoxicity of eight pastes through a

model simulating in vitro the clinical conditions of root canal filling of such teeth, by

controlling the apical exposure and the amount of pastes used. Pippete tips (5-

10μL) (n = 3) with a final diameter compatible to the apical diameter of a #45 K file,

were filled with 0,037g of each paste. Extracts of the pastes were prepared by

exposing the pippete tips to culture medium for 24hs. Primary human osteoblast-

like cells were exposed to extracts and controls for 24 h, at 37 °C with 5% CO2.

Cell viability was analyzed sequentially through a multi-parametric approach (XTT,

NR, CVDE). The pastes biocompatibility was also assessed using 0.2g to 1ml ratio

(ISO 10993-5, 2009), through the XTT assay (n = 5). Results: Through the model,

Calcicur, Endoflas, Guedes-Pinto and ZOE were considered slightly cytotoxic and

Vitapex as moderately cytotoxic by all three assays. Calen thickened with zinc

oxide was considered non-cytotoxic through the XTT and slightly cytotoxic by the

NR and CVDE tests. A new calcium hydroxide with zinc oxide paste (UFRJ) was

evaluated as slightly cytotoxic through the XTT and moderately cytotoxic by the

NR and CVDE assays. The Guedes paste was considered as strongly cytotoxic by

all the assays. Through the XTT reducing assay, using the 0.2g to 1ml ratio,

Calcicur was considered moderately cytotoxic while the other pastes were

evaluated as strongly cytotoxic. Conclusions: It can be concluded that within the

proposed model, the pastes presented lower cytotoxic effects, compared to those

obtained through the ISO approach. The exception was the Guedes paste

considered as strongly cytotoxic by all the evaluations.

Keywords: root canal filling materials; tooth, deciduous; osteoblasts,

cytotoxicity, biocompatibility

109

1. Introduction

Pulpectomy is the recommended endodontic treatment for primary teeth

diagnosed with an irreversibly inflamed or necrotic pulpal condition. The final

endodontic procedure is the root canal filling of the treated teeth with a resorbable

paste (1-3). The ideal root canal filling material should present some

characteristics and properties that would be compatible to these teeth short life

span due to the physiological root resorption, and the close proximity to the

successor permanent teeth. Thus the ideal paste should: (i) resorb at a similar rate

to that of the root resorbing process, (ii) be biocompatible to the periodontal

tissues and permanent developing teeth, (iii) be resorbable when extruded beyond

the apex, (iv) adapt to the canal walls, (v) be antiseptic, (vi) be radiopaque (vii) and

not cause teeth discoloration (4). Until present, no existing root canal filling

material for the primary teeth fulfills all the ideal requirements (5).

The most used root canal filling paste for primary teeth is zinc-oxide and

eugenol based paste (ZOE) (3,4), although recently a trend in the use of the

iodoform with calcium hydroxide pastes was observed (6). In the literature, the

pulpectomies performed with the ZOE based paste present high frequencies of

success (5,7-11), although this material has been associated to ectopic eruption of

the permanent successor teeth (12) and cytotoxicity (13-15). Therefore, aiming to

overcome such drawbacks, alternative materials have been proposed for the root

canal filling of the primary teeth. At the present, the materials recommended by the

international pulp therapy guidelines are the calcium hydroxide (2), the iodoform-

based (1), the iodoform with calcium hydroxide pastes and the zinc oxide and

eugenol based pastes (1,2).

The calcium hydroxide based pastes present antimicrobial properties due to

its ionic dissociation into Ca2+ and OH- ions, and alkaline pH (16,17). Aiming the

root canal filling of primary teeth, the compound has been associated to different

vehicles, water (Calcicur®, VOCO, Cuxhaven, Germany) (7) and viscous (Calen®,

S.S.White, Rio de Janeiro, Brazil) (18). The use of a polymeric paste was also

reported (Sealapex, Kerr, Romulus, USA) (7,20). Moreover, the addition of zinc

110

oxide to the Calen® paste was advocated aiming to reduce the velocity of paste

phagocytosis (19). The clinical and radiographic success rates reported for

pulpectomies performed with Calcicur® and Sealapex® were lower compared to the

results obtained with zinc oxide and eugenol based paste (7), although a high

overall success frequency was reported for Sealapex® (20). Considering the in

vitro biocompatibility, the calcium hydroxide based sealers present lower cytotoxic

effect compared to the ZOE containing materials (15).

Iodoform, which presents disinfectant and resorbability properties (9), has

been associated to different materials, among them: calcium hydroxide (Vitapex®,

Neo DenProducts Co Ltd, Tokyo, Japan) (7,8,21,22); prednilosone acetate,

ryfamicin sodium salt and canphorated parachlorophenol (Guedes-Pinto paste)

(23) and calcium hydroxide, zinc oxide, barium sulfate, eugenol and

paramonochlorophenol (Endoflas®, Sanlor Lab, Bogota, Colombia) (24). Recent

randomized clinical controlled trials showed high clinical and radiographic success

frequencies for the pulpectomies performed with Vitapex® (7,8) and Endoflas®

(11). However, cytotoxic effects were reported for Endoflas® (24) and Vitapex®,

which showed lower cytotoxicity result compared to ZOE based and calcium

hydroxide based materials added with formocresol (25).

The aim of this study was to compare the cytotoxicity of eight root canal

filling pastes for primary teeth, including a new calcium hydroxide with zinc oxide

material, through a multi-parametric assay employing human primary cells related

to the periapical region, simulating in vitro the clinical root canal filling of primary

teeth, by controlling the amount of paste used and the apical exposure.

Furthermore this study evaluated the cytotoxicity of such pastes using the material

/ vehicle ratio recommended by the ISO 10993-5 (2009), through the XTT reducing

assay.

2. Material and methods

This work is part of a project approved by the Antonio Pedro Hospital /

Fluminense Federal University Committee of Research Ethics (CCM/HUAP

232/08). This paper was reported considering the eighteen methodological

111

parameters of the in vitro sheet of the ToxRTool® (Toxicological data Reliability

Assessment Tool, Institute for Health and Consumer Protection, In vitro Methods

Unit, European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).

2.1. Root canal filling materials

Eight root canal filling materials for primary teeth were evaluated: ZOE

paste, Calcicur®, Vitapex®, Endoflas®, calcium hydroxide/zinc oxide, Calen®

thickened with zinc oxide (Calen/ZO), Guedes-Pinto paste (GP), and a ready-

made Guedes paste (GD). The tested materials, manufacturers and components

are listed in Table1.

2.2. Dispositive simulating in vitro the clinical root canal filling of primary

teeth

A 5-10 μL pippete tip (T-300, 0,5-10µl, Axygen®, California, USA) was

selected for it’s inner final diameter, which was compatible to the root canal apex

diameter following root canal preparation up to K-file 45 on primary teeth. The

pippete tip also showed a conical design, similar to root canal morphology. The

pippete tip was attached to a 0.5ml eppendorf tube lid (Easypath, São Paulo,

Brazil). The eppendorf lid was perforated with a 330 bur mounted in a high-speed

handpiece, and a 1.5mm of a 0.5mm wire (Dentaurum, Ispringen, Germany) was

attached and bended to form a handle. The lid was also cut to fit inside a 2.0ml

eppendorf tube (Alfa, Ipiranga, Brazil). The system was closed (Figure 1).

2.3. Samples preparation

Considering the prepare of the root canal filling pastes for primary teeth that

required mixing of the components, we observed that the manufacturers did not

recommend a fixed powder to liquid ratio for the zinc oxide and eugenol based

paste and Endoflas® for the root canal filling. Therefore, we proposed a powder to

liquid ratio for these materials to provide a consistency compatible to the technique

of root canal filling for pimary teeth using a lentulo spiral mounted at a hand-piece

(26).

112

The ZOE paste was prepared by manipulation of 0.5g of zinc oxide

(powder) with 9 drops (280µl) of eugenol. Endoflas® was prepared in a rate of 0.5g

of powder with 5 drops of liquid (160µl). Calen® was prepared mixing 1.0g of

Calen® to 0.65g of zinc oxide.(19) Guedes-Pinto paste was prepared by mixing of

0.30g of each component. The materials were manipulated in sterile glass plates

with proper spatulas, exclusive for each one. Calcicur®, Vitapex®, Guedes paste

and calcium hydroxide/zinc oxide were ready-made. The filling materials were

only opened and manipulated in aseptic conditions in vertical laminar flow cabin

(Labconco, Kansas City, USA). Each material was inserted in 3 pippete tips and

2.0ml eppendorfs tubes (Alfa, Ipiranga, Brazil), closed and weighted 0.037g (27)

on a high precision balance (Sartorius CP225D, Goetting, Germany). Then each

filled pippete tip was attached to the dispositive that simulated in vitro the clinical

root canal filling.

The test samples (n = 3) consisted of conditioned culture media obtained as

follows. The filled pippete tips were immersed at least 3mm in 185μL of

Dulbecco’s Modified Eagle’s media (DMEM) without serum, with 1% penicillin-

streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) and sodium bicarbonate (Sigma-

Aldrich, St. Louis, USA) at 3.7g/l (Figure 1). The samples were incubated at 37°C,

95% of humidity and 5% CO2 for 24 hours. Positive (latex) and negative

(polystyrene pearls) controls were prepared (28) and exposed in the model

conditions (n = 3). After 24 hours, the pippete tips were removed and discarded.

2.4. Cell viability evaluation through a multi-parametric in vitro approach

Cytotoxic of controls and tested materials was assessed in vitro with a

multiparametric assay kit (In Cytotox, XTT-NR-CVDE kit, Xenomatrix, Alschwil,

Switzerland) which evaluated sequentially in the same cell culture, three different

cell viability parameters of cell survival and integrity, on the same sample (29-31).

The XTT (2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny]-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide

inner salt) reducing assay evaluated the ability of metabolic active cells to reduce

the XTT molecules to a soluble salt of formazan, detectable by its absorbance at

480nm, by a microplate UV/Vis spectrophotometer (PowerWave MS2, BioTek, Rio

de Janeiro, Brazil). The same cells submitted to the XTT reducing assay were

113

washed and then assayed through the Neutral red uptake dye (NR) assay, which

evaluated the membrane integrity and the ability of viable cells to actively

incorporate the NR dye and to accumulate it preferentially on the lysosomes. The

amount of dye incorporated was measured at 540nm absorbance. Sequentially the

Crystal violet dye elution (CVDE) test evaluated the cell density, by DNA staining;

after discarding the excess of dye, the optical discrepancy measured at the

absorbance of 540nm was proportional to the amount of cells in each microplate

well.

Human primary osteoblast-like cells were obtained from the Biobank at the

Clinical Research Unit of the Antônio Pedro Hospital, Fluminense Federal

University, Niterói, Brazil. The cells on the fourth passage were seeded at a

density of 1 × 104 cells/well, filling in 33 wells of a 96-well plate (Corning®,

Tewskbury, USA). Three wells were assigned for experimental blank control, and

all border wells were filled in with 200μl of sterile phosphate buffered saline (PBS)

to reduce the medium evaporation. The cells were sub cultured for 24 h at 37°C,

95% humidity and 5% CO2. After 24 h, the medium (DMEM) was aspirated from

each well and replaced with 180μL of the materials and controls extracts, and

20μL of 10% fetal bovine serum (FBS) (Cultilab, Campinas, Brazil) was added to

each well, for further incubation at 37°C, 95% of humidity and 5% CO2 for 24 h.

After 24 the extracts were aspirated, and the cells washed with PBS. The extracts

were replaced with 200μL of culture medium (DMEM).

Then, the cell viability was initially assessed through the XTT assay. XTT II

and XTT I reagents solutions were mixed in a rate of 1:100, and 50μl of the

mixture were added to each well. The plate was covered and incubated at 37°C,

95% of humidity and 5% CO2 for 2 h and optical discrepancy (OD) was read at

480nm. Sequentially the cells and blank control were submitted to the NR assay.

The XTT identification solution was removed, and the cells were washed with

300μl of NR I solution, which was removed. NR II solution diluted in cultured

media at 37°C (1:100), was added (200μl) to each well, and the plate was

incubated at 37°C, 95% of humidity and 5% CO2 for 3 h. The solution was

removed, and 200μl of NR III was added to each well, after 1 minute, 200μl of NR

IV was added to each well, and the plate was incubated at 37°C, 95% of humidity

114

and 5% CO2 for 15 minutes. The OD was read at 540nm. After NR measurement,

the liquid was removed, the cells were washed twice with 200μL of CVDE I

solution. CVDE II solution was added, 100μl/well, and the plate was incubated at

room temperature for 10 minutes. The solution was removed, and each well

washed with 200μl of deionized water. The plate was dried and 100μl/well of

CVDE III solution was added. The OD was read at 540nm.

Cytotoxicity was rated based on the cell viability relative to the control as

not cytotoxic – > 90% cell viability, slightly cytotoxic – 60% - 90% cell viability,

moderately cytotoxic – 30% -59% cell viability and strongly cytotoxic – < 30% cell

viability (32).

2.4.1. Statistical analysis

The results were expressed as a percentage of viable cells for each

material, compared to the control group. The mean values and standard deviations

were calculated. Cell viability data was analyzed using nonparametric test of

Kruskal-Wallis and Dunn’s multi comparisons test, with a confidence interval of

95%.

2.5. Cell viability evaluation through the ISO 10993-5 (2009) material /

vehicle recommendation

Test samples (n = 5) consisting of conditioned medium were obtained

according to the International Standardization Organization (ISO 10993-5, 2009)

material / vehicle ratio for the evaluation of the cell viability of irregular materials.

The pastes were prepared as previously described in aseptic conditions, and

200mg of each paste was immersed in 1000μl of the culture medium (DMEM) in

sterile microtubes (Alfa, Ipiranga, Brazil), twice for each paste. The samples were

incubated at 37°C, 95% of humidity and 5% CO2 for 24 hours. Positive (latex) and

negative (polystyrene pearls) controls were prepared (28) and exposed in the

model conditions. After 24 h, the extracts were centrifuged for 15 min at 3000 rpm

(Sorvall ST 6R, Thermo Fischer Scientific, Kalkberg, Germany). The supernatant

was aspirated (1500μL).

115

The cell seeding and cultivation was performed as previously described.

After 24 h, the medium (DMEM) was carefully removed from each well and

replaced with 180μl of the materials and controls extracts, and 20μl of 10% fetal

bovine serum (FBS) was added to each well, for further incubation at 37°C, 95% of

humidity and 5% CO2 for 24 h. After 24 the extracts were aspirated, and the cells

washed with PBS. The extracts were replaced with 200μl of culture medium

(DMEM), and the XTT reducing assay was performed as previously described.

3. Results

Figure 2 shows cell viability as evaluated by the multiparametric assay,

after the exposure of the root canal filling materials extracts for 24 h, through the in

vitro root canal filled simulating model (A, B and C) and through the XTT reducing

assay, using the 0.2g to 1ml ratio of the ISO 10993-5 (2009) (D). The results were

expressed as a percentage of the experimental control (cells exposed to

unconditioned medium).

Considering the cytotoxic rating (32) and through the model, Calcicur®,

Endoflas®, Guedes-Pinto and ZOE were considered slightly cytotoxic and Vitapex®

as moderately cytotoxic by all three assays. Calen® thickened with zinc oxide was

considered non-cytotoxic through the XTT and slightly cytotoxic by the NRU and

CVDE tests. The new calcium hydroxide paste (UFRJ) was evaluated as slightly

cytotoxic through the XTT and moderately cytotoxic by the NRU and CVDE

assays. The Guedes paste was considered as strongly cytotoxic by all the assays.

Considering the ISO 10993-5 (2009) regulatory cytotoxicity limit, Calcicur®,

Vitapex® , ZOE, UFRJ and Guedes paste (GD FA) reduced the cell viability more

than 30% relative to the control and were considered cytotoxic, through the XTT

reducing assay.

When the cell viability was measured by the XTT reducing assay, after 24h

cells exposure to the investigated pastes, through the 0.2g to 1ml material /

vehicle recommended by the ISO 10993-5 (2009), Calcicur® was considered

116

moderately cytotoxic while the other pastes were evaluated as strongly cytotoxic

(D).

4. Discussion

The diversity of methodologies for evaluating the in vitro biocompatibility of

root canal filling materials hinders the comparison of the studies results and the

search for evidences. Therefore, in our study we evaluated the cytotoxicity of eight

root canal filling materials for primary teeth, including one new developed calcium

hydroxide with zinc oxide material through a multi-parametric approach on the

same cell samples. The cell viability assays, XTT reducing, Neutral red uptake dye

and the Crystal violet dye elution, evaluated three different parameters

respectively: the ability of metabolic viable cells in reducing a tetrazolium salt

(XTT) into soluble formazan, the cells membrane integrity and the cell density.

Furthermore, this is the first multi-parametric evaluation of these materials,

simulating in vitro the clinical root canal filling of primary teeth, by controlling the

amount of paste (27) used and the apical exposure. It is worth to notice that we

used primary human osteoblast-like cells, which are intimately related to bone

tissue repair and regeneration (30,33). Bone repair is one of the objectives of the

pulpectomy treatment, since the common radiographic criteria for success applied

in the clinical studies are the observation of solving or a reduction in the size of the

pre-existing radiolucent areas and no newly formed radiolucent areas associated

to the treated teeth during the follow-up period (8,10,22).

Aiming the evaluation of the in vitro cell-based biocompatibility, some

studies were performed with root models using extracted permanent roots for the

evaluation of root canal filling materials for permanent teeth (34-36). Extracted

permanent roots were also used for an in situ root-end model (29) and a root-end

using a three-dimensional cell culture model aiming to the investigation of the

biocompatibility of root-end filling materials (37). Yadlapati et al. (2015) (31)

developed a simulating root canal model for the evaluation of an antibiotic

intracanal medication used for regenerative endodontic procedure in the treatment

of immature permanent teeth with necrotic pulpal diagnostic. These root canal

117

models aimed the evaluation of materials designed for the endodontic therapy of

permanent teeth, simulating the clinical conditions. Otherwise, our root canal

model was designed for simulating in vitro the clinical conditions of the primary

teeth root canal filling without the need of primary teeth extracted roots, since

these are difficult to be obtained due to the physiological root resorption. We

understand that the lack of interaction between the investigated pastes with the

dentine tissue would possibly represent a limitation of our model.

Camps et al. (2003) (35) and Susini et al. (2005) (36) compared the results

of the sealers cytotoxicity obtained through the root-dipping technique with those

obtained through the ISO 10993-5 (1994) protocol. The ISO standards cytotoxic

results were higher than those obtained through the root models (35,36).

According to them, the root-dipping model corresponded to a classical root filling,

while the ISO standards may clinically correspond to a large overfilling condition.

Our results of the in vitro biocompatibility of the investigated pastes expressed as

cell viability relative to the control, through the simulating model, were higher than

those obtained with the material / vehicle ratio recommended by the ISO 10993-5

(2009) through the XTT reducing assay. The higher material concentration

proposed in the latter approach possibly exaggerated the clinical use conditions,

aiming to determine the potential toxicological hazard. Our model, as well as the

proposed root models (29,31,34-37) aimed to simulate the clinical conditions, for

the same purpose. Although different, both strategies are mentioned at the

extracting conditions section of the ISO 10993-5 (2009).

Through the XTT reducing test, the zinc oxide and eugenol based paste

was considered slightly cytotoxic by the simulating model, while strongly cytotoxic

through the ISO 10993-5 (2009) material / vehicle ratio, with the cell viability

ranging from 65.8% (model) to 1% (ISO). Our results were similar to those

obtained by Camps et al. (2003) (35) for a ZOE based sealer assayed through the

MTT reducing test, another tetrazolium salt-based assay, with reported 15% of cell

mortality for the root model group and 95% for the ISO standards group. In the

present study, the zinc oxide and eugenol based paste was considered slightly

cytotoxic by the simulating model, through the membrane integrity and the cell

density evaluation assays, with 61% and 76% of cell viability. Considering the ISO

118

10993-5 (2009) 70% cell survival cut-off for cytotoxicity, the paste would be rated

as not cytotoxic only according to the Crystal violet dye elution assay result.

The other investigated root canal filling materials for primary teeth were for

the first time evaluated through a root canal simulating model. We observed that

most of the pastes showed higher results of cytotoxic effect when evaluated

through the ISO material / vehicle ratio, compared to model, except the Guedes

paste (Fómula & Ação, São Paulo, Brazil). This paste was considered strongly

cytotoxic through both strategies and all the assays. Among the calcium hydroxide

based pastes, the Calen® thickened with zinc oxide and Calcicur® showed the

higher cell viability results, with the lowest result obtained through the XTT assay,

indicating a possible metabolic pathway of cytotoxicity. Its worth of notice that the

Calen® thickened with zinc oxide was the less flowable paste, due to the viscous

vehicle and the adding of zinc oxide in a 65% w/w ratio. Therefore, the paste

would probably be more self-contained inside the pippete tip and/or released fewer

components to the medium. The new calcium hydroxide based with zinc oxide

(UFRJ) paste although presents a viscous vehicle, the zinc oxide adding was

lower compared to the Calen® thickened with zinc oxide paste. The UFRJ paste

showed moderately cytotoxicity with results around 55%-58% of cell viability,

which were similar to those obtained with the iodoform based with calcium

hydroxide paste (Vitapex®). Endoflas® liquid is mainly composed by eugenol, and

parachlorophenol, both considered cytotoxic. However, our results showed a

slightly cytotoxicity, with the higher cell viability result obtained through the XTT,

suggesting a non-metabolic toxicity pathway. The Guedes-Pinto paste was

considered slightly cytotoxic, indicating a non-metabolic cytotoxicity pathway. It

should be highlighted that from a regulatory point of view, considering the ISO

10993-5 (2009) 70% cell survival cut-off for cytotoxicity, only the Calen® thickened

with zinc oxide and the Guedes-Pinto pastes were rated as not cytotoxic through

the evaluation of the three assays endpoints. Considering the XTT reducing assay

results, the rank of the pastes according to the cell viability was Guedes-Pinto >

Calen® thickened with zinc oxide > Endoflas® > ZOE > Calcicur® > Vitapex® >

UFRJ > Guedes paste.

119

Considering the results obtained through the ISO approach, all the pastes

were considered strongly cytotoxic, except Calcicur®, which was rated as

moderately cytotoxic. It was also observed that the calcium hydroxide based and

the iodoform-based with calcium hydroxide pastes showed the better results of cell

viability. The rank of the pastes according to the cell viability was Calcicur® >

Vitapex® > UFRJ > Calen® thickened with zinc oxide > Guedes-Pinto > Endoflas®

> ZOE > Guedes paste.

Recently, a study evaluated the Guedes-Pinto and the Calen® thickened

with zinc oxide pastes for the cytotoxicity through the MTT reducing assay, the

generation of reactive oxygen species (ROS) and the potential damage to the

deoxyribonucleic acid (DNA) of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) (38).

Both pastes increased the cell viability and the generation of ROS at the 24 h

period of exposure. However, the Guedes-Pinto paste did not cause DNA

damage, while the Calen® thickened with zinc oxide paste led to a higher DNA

damage at the 24 h period. According to the authors the Guedes-Pinto paste was

associated to a better biocompatibility. The conclusion is in accordance with our

root-simulating model results obtained through the XTT reducing assay for those

pastes.

Considering the Endoflas® paste our results obtained through the model

and the ISO standards are similar to the observations of Petel et al. (2013) (24) for

the evaluation of the in vitro biocompatibility of such material to macrophages and

epithelial cells. While high concentrations of Endoflas® showed a cytotoxic effect

with a decrease in cell viability by approximately 70%, lower concentrations led to

cell viability increase up to 60% relative to the control.

The present study demonstrated the cytotoxic effects of eight root canal

filling materials through a root canal simulating model and the ISO 10993-5 (2009)

material / vehicle ratio. Based on our results, we would suggest for future

investigations the evaluation of the potential of DNA damage of these pastes, as

well as the release of intracellular component markers and the detection of

apoptosis and necrosis of the exposed cells. Furthermore, the evaluation of the

120

leached components to the culture medium on the same conditions of the root

canal simulating model, would assist the elucidation of the cytotoxic pathways.

5. Conclusion

It can be concluded that within the proposed model the pastes presented

lower cytotoxic effects, compared to those obtained through the ISO approach.

The exception was the Guedes paste considered as strongly cytotoxic by all the

evaluations.

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125

Figure 1. A) Components of the root canal simulating model; B) Filled root canal simulating

model.

A B

126

Figure 2. Cytotoxicity assay results through the root canal simulating model (A, B, C) and through the ISO 10993-5 (2009) material / vehicle standard (D). Cytotoxic effects of the positive control (C+), negative control (C-), Calcicur®, Vitapex®, Guedes paste (Fórmula & Ação) (GD), UFRJ paste, Endoflas®, Calen® thickened with zinc oxide (CALEN/ZO), Guedes-Pinto paste (GP), and ZOE paste on primary human osteoblast-like cells measured by Crystal violet dye elution (A), NRU (B) and XTT tests (C, D) and expressed as a percentage of experimental control (cells exposed to unconditioned medium) cell viability. *Statistically significant differences between groups relative to the control (p < 0.05).

127

Table 1. Components of the root canal pastes tested

Material Presentation Components

Endoflas® (Sanlor & Cia. S. en C.S., Bogotá, Colombia)

Powder Liquid

Tri-iodomethane and iodine dibutilorthocresol (40.6%), zinc oxide (56.5%), calcium hydroxide (1.07%), and barium sulfate (1.63%) Eugenol and paramonochlorophenol

Vitapex® (Neo DenProducts Co Ltd, Tokyo, Japan)

Paste Iodoform (40.4%), calcium hydroxide (30.3%), silicone (22.4%)

Calcicur® (VOCO, Cuxhaven, Germany)

Paste Calcium hydroxide, water, cellulose derivatives, barium sulphate

Calen® thickened with zinc oxide (S.S.White, Rio de Janeiro,Brazil) (S.S.White, Rio de Janeiro,Brazil)

Paste Powder

Calcium hydroxide (30,16%), zinc oxide (45.42%), polyethilene glycol (23,82%), colophony ww (0,60%) Zinc oxide 99% to 100.5%

Guedes-Pinto paste (Laboratórios Buenos Ayres, São Paulo, Brazil) (Biodinâmica, Ibiporã, Brazil) (Biodinâmica, Ibiporã, Brazil)

Ointment Liquid Powder

Pomada (prednisolone acetate 5mg g -1, sodium rifamycin 1.5mg g -1 , carbowax ointment 10g) Camphorated paramonochlorophenol Iodoform

Guedes paste (Fórmula & Ação, São Paulo, Brazil)

Paste

Iodoform (33.33%), paramonochlorophenol (33.33%), rifamycin (0.05%), prednisolone (0.1666%), vehicle 5g)

UFRJ paste(S.S.White, Rio de Janeiro,Brazil)

Paste Calcium hydroxide, zinc oxid, polyethilene glycol, colophony ww

Zinc oxide and eugenol (Biodinâmica, Ibiporã, Brasil) (Biodinâmica, Ibiporã, Brasil)

Powder Liquid

Zinc oxide 99% to100.5% Eugenol and glacial acetic acid

128

6. Considerações finais

Em linhas gerais, no presente estudo executamos uma revisão narrativa da

literatura de forma estruturada, que nos orientou na seleção das pastas

obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos a serem investigadas.

Através da revisão sistemática, concluímos que os ensaios de redução do MTT e

do XTT não apresentaram resultados conflitantes com os determinados através

de outras metodologias para a avaliação da citotoxicidade de materiais

obturadores de canais radiculares. Outrossim, obtivemos um panorama dos

diversos ensaios para a avaliação da citotoxicidade desses materiais. Ademais,

nosso estudo avaliou, pela primeira vez, as pastas obturadoras indicadas para

canais radiculares de dentes decíduos selecionadas através de um modelo inédito

de simulação de canal radicular para dentes decíduos.

A seleção das pastas obturadoras de canais radiculares de dentes

decíduos para o estudo de avaliação da citotoxicidade teve como base uma

revisão da literatura sobre as pastas mais investigadas em estudos clínicos de

Odontopediatria nos últimos dez anos. Inicialmente, fizemos uma revisão em

janeiro de 2013 que incluiu 18 estudos e mostrou que a pasta à base de óxido de

zinco e eugenol (n = 11) era a mais investigada nos estudos clínicos

selecionados, seguida das pastas à base de iodofórmio com hidróxido de cálcio (n

= 7). Enquanto as pastas à base de hidróxido de cálcio foram avaliadas em 4

estudos e a pasta Endoflas® o foi em dois. As pastas antbiótica 3 Mix, Kripaste® e

uma associação de óxido de zinco e óleo ozonizado foram avaliadas em apenas

um estudo cada.

A fim de provermos dados mais atualizados para submissão do nosso

artigo, atualizamos a revisão em maio de 2016 com os resultados apresentados

no primeiro artigo da tese. Nessa revisão, incluímos 21 estudos e observamos

resultados similares para as pastas à base de óxido de zinco e eugenol (n = 12) e

à base de iodofórmio com hidróxido de cálcio (n = 8). Entretanto, observamos um

maior interesse na avaliação da pasta Endoflas® (n = 4), sendo que um estudo

avaliou uma versão sem clorofenol e de pastas compostas de óxido de zinco

129

associadas a outros veículos diferentes do eugenol (n = 3). As associações visam

melhorar as propriedades antimicrobianas, anti-inflamatórias e a

biocompatibilidade das pastas obturadoras de canais radiculares de dentes

decíduos (KHAIRWA et al., 2014; Al-OSTWANI et al., 2016). Os resultados de

avaliação clínica e radiográfica foram considerados satisfatórios: 86,67% e

73,34% para a associação de óxido de zinco com aloe-vera (KHAIRWA et al.,

2014) e 93,5% e 62,5% para a formulação com própolis (Al-OSTWANI et al.,

2016).

Assim, no estudo da avaliação da citotoxicidade incluímos as pastas à base

de óxido de zinco e eugenol, à base de iodofórmio com hidróxido de cálcio

(Vitapex®), a pasta Endoflas® e a pasta Calcicur® à base de hidróxido de cálcio.

Além dessas, incluímos as pastas nacionais de Guedes-Pinto, Calen® espessada

e pasta UFRJ, material novo sem avaliação prévia, com a finalidade de compará-

las aos demais. A comparação é relevante visto que a pasta de Guedes-Pinto, à

base de iodofórmio com preparo através de manipulação imediata dos

componentes (chairside), é amplamente utilizada nas Faculdades de Odontologia

Brasileiras (PAULA et al. 2010; COSTA et al., 2012). Além disso, na literatura

estão descritos resultados favoráveis para a avaliação da biocompatibilidade

tecidual das pastas de Guedes-Pinto (CERQUEIRA et al., 2007) e Calen®

espessada (QUEIROZ et al., 2011). Entretanto, a avaliação multiparamétrica da

biocompatibilidade in vitro dessas pastas foi pouco explorada, contando somente

com o estudo de PIRES et al. (2015).

A citotoxicidade da pasta de Guedes-Pinto quando manipulada e estocada

à temperatura ambiente e em refrigerador por um período de 1, 3 e 5 meses foi

investigada por LOPES-MAROTTI (2003). O autor concluiu que o armazenamento

em ambas as condições aumentou o efeito citotóxico da pasta. Atualmente sob

encomenda, uma pasta que apresenta os mesmos componentes da pasta de

Guedes-Pinto e pronta para uso, denominada pasta de Guedes, é disponibilizada

no mercado nacional. Incluímos esse material no estudo, pois, se o resultado da

avaliação fosse satisfatório, a dispensa de manipulação representaria um passo

clínico a menos na prática Odontopediátrica. Além disso, um dos componentes da

pasta de Guedes-Pinto original, a pomada Rifocort, deixou de ser fabricada.

130

Assim sendo, tornou-se necessária a manipulação de um substituto em uma

farmácia da cidade de São Paulo. Soma-se a essa dificuldade, o prazo de

validade curto de dois meses da pomada manipulada.

Em relação aos métodos de avaliação da citotoxicidade de materiais

obturadores de canais radiculares, investigamos a possibilidade dos resultados

obtidos através de testes a base de sais de tetrazólio, como o de redução do XTT,

em implicar tendências concordantes ou não quando comparados aos obtidos

através de outros parâmetros de viabilidade celular. A execução dessa revisão

sistemática da literatura foi desafiadora, pois trabalhamos com base em uma nova

metodologia (OHAT, 2015) voltada para uma área de estudo em

desenvolvimento: a Toxicologia baseada em evidências (SILBERGELD e

SCHERER, 2012). Através da metodologia aplicada conseguimos construir uma

abordagem para a questão no formato PECO (população, exposição, comparação

e resultados, outcomes) que permitiu definir com clareza os critérios de inclusão e

exclusão. Como possível limitação da metodologia observamos a falta de uma

proposta para a avaliação da qualidade metodológica dos estudos in vitro.

Entretanto, identificamos uma recomendação no site do European Centre for the

Validation of Alternative Methods (ECVAM) que abriga metodologias alternativas

aos estudos em animais: a ferramenta ToxRtool. O software ToxRTool através da

planilha para estudos in vitro, permite a avaliação dos dados relatados pelos

autores em relação a cinco grupos de critérios: identificação da substância

testada, caracterização do sistema teste, descrição do desenho do estudo,

documentação dos resultados dos estudos e plausibilidade do desenho do estudo

e dos resultados. A ferramenta classifica os estudos segundo três categorias de

confiabilidade, mas também permite que o avaliador interfira no resultado final,

mediante uma justificativa prevista na planilha. Nos nossos resultados 24 artigos

potencialmente elegíveis que apresentaram como única falha metodológica

associada aos critérios cruciais (“vermelhos”) a falta de uso de controle positivo,

puderam ser reclassificados como confiáveis sem restrições e incluídos na

revisão. Para os dados de avaliações de atividade metabólica celular, a

possibilidade dessa falha estava prevista na planilha, com autorização para a

mudança de categoria pelo avaliador.

131

Outra dificuldade observada na realização da revisão sistemática foi a

diversidade de formas de apresentação dos resultados de citotoxicidade nos

estudos incluídos. Os resultados quantitativos foram apresentados em valores

médios com desvio padrão expressando valores percentuais de vitalidade celular

em relação ao controle experimental ou ao controle negativo; em valores

percentuais de citotoxicidade celular em relação ao controle experimental ou ao

controle negativo; ou em valores de discrepância ótica. Inicialmente, foi

necessária a identificação dos valores nos gráficos, para tanto, utilizamos um

software e cálculos. A etapa seguinte requereu a transformação dos valores em

resultados de viabilidade celular expressos percentualmente em relação aos

controles experimental ou negativo para todos os estudos incluídos.

Em relação à normalização dos resultados de efeito citotóxico para os

materiais obturadores dos estudos selecionados, optamos pela utilização da

classificação proposta por DAHL et al. (2006). Essa classificação propôs faixas de

efeito citotóxico que variam de não citotóxico até fortemente citotóxico com base

nos resultados de viabilidade celular. Através dela, podemos avaliar melhor o grau

de efeito citotóxico apresentado por um material quando comparado ao único

limite de redução da viabilidade, até 30%, considerado para a determinação do

efeito citotóxico na metodologia da ISO 10993-5 (2009).

Os resultados da revisão sistemática foram compensadores. Concluímos

que os dados de avaliação da citotoxicidade dos materiais obturadores de canais

radiculares obtidos através dos ensaios de redução do XTT e do MTT não foram

conflitantes com os obtidos através de outros parâmetros de viabilidade celular.

Ademais, obtivemos um panorama dos ensaios de viabilidade celular utilizados na

avaliação desses materiais. No entanto, observamos que as pastas obturadoras

de canais radiculares de dentes decíduos à base de óxido de zinco e eugenol e à

base de iodofórmio com hidróxido de cálcio (Vitapex®) não foram consideradas

nos resultados da revisão. Todavia, em nosso estudo multiparamétrico

observamos que os resultados obtidos através do ensaio de redução do XTT não

foram conflitantes com os obtidos através da avaliação da integridade

membranar, tão pouco através da avaliação da densidade de células aderidas.

132

Para a avaliação da citotoxicidade das pastas selecionadas,

desenvolvemos um modelo cujo objetivo foi simular a situação clínica de

obturação de canais radiculares de dentes decíduos. O modelo foi projetado para

permitir a reprodutibilidade e execução dos testes de avaliação da citotoxicidade

sem a utilização de raízes de dentes decíduos, que são de difícil obtenção em

virtude do processo de reabsorção fisiológica própria desses dentes. Entendemos

que a falta de interação da pasta obturadora com a dentina pode representar uma

limitação do modelo. Todavia, o controle da quantidade de pasta utilizada -

avaliada previamente (XIMENES e CARDOSO, 2012) - e da exposição “apical”

podem representar pontos favoráveis ao modelo.

A metodologia multiparamétrica adotada para a avaliação da citotoxicidade

das pastas obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos selecionadas já

foi utilizada em estudos para a avaliação de materiais obturadores de canais

radiculares de dentes permanentes (DE DEUS et al.,2009; SCELZA et al., 2012;

SILVA et al., 2014). A abordagem incluiu a avaliação da viabilidade celular pelos

ensaios do Vermelho neutro, da eluição do corante Cristal violeta e da redução do

XTT. A avaliação através de diferentes parâmetros de viabilidade celular visou

aumentar as chances de detecção de possíveis efeitos citotóxicos, bem como

sugerir indícios para as vias de toxicidade.

Com base nos resultados da revisão sistemática, elegemos o ensaio de

redução do XTT para a avaliação das pastas segundo proporção de material e

veículo (meio de cultura) recomendada pela ISO 10993-5 (2009). Os resultados

da avaliação da citotoxicidade frente as células primárias semelhantes a

osteoblastos humanos mostraram forte efeito citotóxico para a maioria das pastas,

com exceção da pasta Calcicur que se mostrou moderadamente citotóxica. Essa

pasta contém aproximadamente 45% de hidróxido de cálcio em veículo aquoso

sem a adição óxido de zinco. Recentemente, a presença de íons zinco nos

extratos de cimentos à base de óxido de zinco e eugenol foi atribuída a redução

da viabilidade de queratinócitos humanos orais imortalizados, avaliada pelo teste

WST à base de sal de tetrazólio (LEE et al., 2016). A avaliação da citotoxicidade

de cimentos à base de óxido de zinco com e sem eugenol apresentaram

resultados semelhantes de efeito citotóxico (KWON et al., 2014). A presença dos

133

íons zinco poderia explicar a diferença de efeito citotóxico encontrada entre as

pastas UFRJ, Calen espessada com óxido de zinco e Calcicur®. A pasta UFRJ,

que apresenta óxido de zinco em menor proporção comparada à pasta Calen®

espessada, reduziu a viabilidade celular em 74,2%, enquanto a última reduziu em

82,7%.

O estudo da avaliação multiparamétrica da citotoxicidade das pastas

obturadoras selecionadas através do modelo de simulação apresentou algumas

dificuldades associadas ao grande número de pastas testadas ao mesmo tempo.

Assim, o período de pesagem foi longo e para garantir que os materiais fossem

avaliados frescos, isto é, sem tomar presa, os materiais Endoflas e pasta à base

de óxido de zinco e eugenol foram os útimos a serem manipulados e pesados.

Além disso, foi necessário obter um grande número de células para o

plaqueamento, a fim de obter a densidade celular de 1 x 104 por poço. O próprio

plaqueamento das células em tantos poços requereu extrema atenção durante o

processo.

Em relação às pastas, observamos maior facilidade para a inserção das

pastas Calcicur® e Vitapex® nas ponteiras de pipetas. Essas pastas já prontas

para uso, são apresentadas em seringas com ponteira própria angulada. A pasta

de Guedes pronta para uso apresentou aspecto pouco homogêneo, tanto na

própria seringa quanto nas ponteiras de pipetas preenchidas. Inicialmente,

tentamos inserir as pastas que requeriam manipulação usando seringas para

insulina com agulha curta (BD Ultra-FineTM, Curitiba, Brasil), mas observamos um

efeito de filtração associado à diminuta luz da agulha para as pastas à base de

óxido de zinco e eugenol e de Guedes-Pinto. Passamos a utilizar seringas de 3ml

com agulha 0,70 x 25mm (BD SoloMedTM, Curitiba, Brasil) que mostraram-se

adequadas para a maioria das pastas, à exceção da pasta Calen espessada com

óxido de zinco. Essa pasta que apresenta pouca fluidez, foi inserida utilizando-se

uma agulha simulando um calcador estéril.

Na nossa experiência durante a condução dos ensaios de avaliação da

viabilidade celular multiparamétrica nas células primárias semelhantes a

osteoblastos humanos, observamos que em relação à temperatura do ambiente e

134

das soluções, a temperatura ambiente mais quente e das soluções a 37°C

favoreceu a execução do experimento multiparamétrico (NIH, 2003).

Os resultados do estudo multiparamétrico para as pastas selecionadas

mostraram menor efeito citotóxico comparados aos resultados obtidos pela

abordagem da ISO. Os resultados obtidos através do modelo de simulação

mostraram-se mais condizentes com os resultados de frequência de sucesso

clínico e radiográfico identificados para as pastas à base de óxido de zinco e

eugenol, à base de iodofórmio com hidróxido de cálcio e à base de hidróxido de

cálcio identificadas na literatura e apresentadas no primeiro artigo que compõe a

nossa tese. Fato que sugere que o modelo de simulação de obturação de canal

radicular de dente decíduo desenvolvido pode representar uma metodologia mais

fidedigna para avaliação da citotoxicidade inicial dessas pastas.

Considerando o processo de reabsorção fisiológica dos dentes decíduos e

os resultados de avaliação da citotoxicidade das pastas obturadoras obtidos

através do modelo de simulação do canal radicular e da abordagem ISO,

podemos estimar que clinicamente o efeito citotóxico das pastas se manifeste

entre os resultados obtidos pelas duas metodologias. Inicialmente, quando a raiz

do dente decíduo está íntegra ou apresente até um terço de reabsorção, os

tecidos periapicais estarão menos expostos às pastas obturadoras. Ao passo que

a medida que a rizólise progride, possivelmente ocorrerá maior exposição dos

tecidos periapicais às pastas obturadoras. Pensando assim, o desenvolvimento

de pastas obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos mais

biocompatíveis, menos citotóxicas, torna-se ainda mais relevante.

Através do estudo de avaliação multiparamétrica da citotoxicidade in vitro

das pastas obturadoras selecionadas, obtivemos resultados que sugeriram

possíveis vias para o efeito citotóxico observado. Todavia, outros ensaios in vitro

são necessários para a compreensão dos mecanismos envolvidos. Assim,

sugerimos para estudos futuros: a avaliação das pastas selecionadas quanto ao

potencial de dano ao DNA, a liberação componentes intracelulares marcadores de

estresse oxidativo e a detecção de apoptose e/ou necrose. Além dessas

investigações, a avaliação dos componentes das pastas liberados para o meio de

135

cultura nas mesmas condições do experimento de citotoxicidade poderia ajudar

na elucidação dos mecanismos de toxicidade envolvidos. Recentemente, um

modelo de simulação de obturação de canais radiculares a partir de raízes de

dentes permanentes extraídos foi associado à uma cultura de células em

suspensão em agregados celulares ou cultura em três dimensões para avaliação

de materiais obturadores (SILVA et al., 2016). A cultura em três dimensões

apresenta características mais próximas das condições in vivo, de tal forma que a

interação entre as células pode favorecer os estudos de avaliação da viabilidade

celular (RAVI et al., 2015). Assim, a utilização do nosso modelo em associação à

uma cultura de células tridimensional fica como sugestão final para estudos

futuros.

136

Conclusões:

Revisou-se a literatura quanto aos materiais obturadores utilizados em

pulpectomias de dentes decíduos; avaliou-se comparativamente métodos de

avaliação da citotoxicidade à base de sais de tetrazólio com outros parâmetros de

avaliação de viabilidade celular e, finalmente, avaliou-se a citotoxicidade de

diferentes pastas obturadoras de canais radiculares de dentes decíduos através

de um modelo de simulação de canal radicular. Diante da metodologia empregada

pode-se concluir que:

À luz da revisão narrativa da literatura, a pasta obturadora à base de óxido de zinco e eugenol ainda é a pasta obturadora de canais radiculares de dentes decíduos mais estudada e avaliada nos estudos clínicos de Odontopediatria no período de 2006 a 2016, apresentando uma frequência de sucesso total clínico e radiográfico entre 93,3% e 70%. Embora tenha sido observada uma tendência na utilização das pastas à base de iodofórmio e hidróxido de cálcio, que mostraram frequências de sucesso total entre 100% e 89%.

Através da revisão sistemática da literatura, podemos afirmar que os testes de avaliação da citotoxicidade à base na redução dos sais de tetrazólio XTT e MTT não apresentaram resultados de citoxicidade conflitantes com os obtidos através de outros parâmetros de avaliação da viabilidade celular. Os ensaios de redução do XTT e do MTT apontaram tendências similares de efeito citotóxico em 92,59% e 87,95% das comparações executadas.

A avaliação multiparamétrica da citotoxcidade das pastas Calcicur®, UFRJ, Endoflas®, Calen/OZ, Guedes-Pinto, Vitapex®, Guedes e à base de óxido de zinco e euegenol através do modelo de simulação de canal radicular de dentes decíduos mostrou: pelo teste de redução do XTT, efeito citotóxico leve para: Calcicur®, UFRJ, Endoflas®, Calen/OZ, Guedes-Pinto e à base de OZE. Vitapex® e Guedes apresentaram efeito citotóxico moderado e forte, respectivamente. Através do ensaio de incorporação do Vermelho neutro o efeito citotóxico foi leve para Calcicur®, Endoflas®, Calen®/OZ, Guedes-Pinto e à base de OZE; moderado para Vitapex® e UFRJ e forte para Guedes. Os resultados do teste de eluição do corante Cristal violeta (CVDE) foram similares aos do ensaio do Vermelho neutro, com exceção da pasta Calen®/OZ, não citotóxica. Segundo a proporção material / veículo recomendada pela ISO 10993-5 (2009), a pasta Calcicur® mostrou efeito citotóxico moderado e o demais efeito citotóxico forte. Concluiu-se que as pastas apresentaram resultados de efeito citotóxico menores quando avaliadas através do modelo proposto comparados aos obtidos com a proporção da ISO. A exceção foi a pasta de Guedes pronta para uso considerada fortemente citotóxica em todas as avaliações.

137

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151

Anexos

Anexo 1 . Instruções para uso da ferramenta ToxRTool

154

Anexo 2. Planilha para avaliação de estudos in vitro da ferramenta ToxRTool

Explanations to ToxRTool

Objective: ToxRTool is designed to assess the inherent quality, also called reliability, of toxicological data as reported in a publication or a test report.

This tool essentially comprises a list of evaluation criteria. Criteria are subdivided in five groups:

I: Test substance identification, II: Test system characterisation, III: Study design description, IV: Study results documentation, V: Plausibility of study design and data

Per criterion either one ('1') or no ('0') point can be assigned. If a criterion is met, assign '1', if not assign '0'. Please choose from the respective drop-down list. All criteria must be answered!

In total 21 points for in vivo studies, 18 points for in vitro studies can be assigned. A reliability categorisation based on the total number of points is given below.

Criteria written in red have special importance: points for each of the red criteria are necessary to achieve Reliability category 1 or 2. Please evaluate with special care!

Data entry is requested in (and is also restricted to) the fields shaded in green.

Reliability categorisation (definition of categories according to Klimisch et al. 1997) (Proposed) consequence

in vivo in vitro

1 18-21 15-18 reliable without restrictions useful, check relevance for intended purpose

2 13-17 11-14 reliable with restrictions potentially useful, check relevance for intended purpose

3 <13 or not all red criteria met

<11 or not all red criteria met

not reliable generally not to be used as key study, but depending on the shortcomings of the study it may still be useful in weight-of-evidence approaches or as supportive information

4 not assignable: documentation insufficient (reviews, handbooks, other secondary sources)

generally not to be used as key study, but depending on the shortcomings of the study it may still be useful in weight-of-evidence approaches or as supportive information. (This category is not an outcome of this evaluation tool!)

In addition to the criteria for assessing data reliability, at the bottom of the worksheets there are some questions to be answered optionally ("Optional documentation of observations with importance to relevance"). These questions allow to document observations in a non-formalised way, which may be of importance for the further use of the information for regulatory or other purposes.

Reliability assessment of in vitro toxicity studies

Study under evaluation

Authors:

155

Titel:

Testing facility, year, sponsor, study no. or bibliographic reference:

Explanations are available for most criteria and show up, when the cursor is moved over the criteria field. Please read carefully! Red criteria: the maximum score is needed for these criteria to achieve reliability category 1 or 2 (see worksheet Explanations): Please evaluate with special care!

Criteria Evaluator's explanations, comments on criteria, etc.

No. Criteria Group I: Test substance identification Score

1 Was the test substance identified?

2 Is the purity of the substance given?

3 Is information on the source/origin of the substance given?

4 Is all information on the nature and/or physico-chemical properties of the test item given, which you deem indispensable for judging the data (see explanation for examples)?

0

Criteria Group II: Test system characterisation

5 Is the test system described?

6 Is information given on the source/origin of the test system?

7 Are necessary information on test system properties, and on conditions of cultivation and maintenance given?

0

Criteria Group III: Study design description

8 Is the method of administration given (see explanations for details)?

9 Are doses administered or concentrations in application media given?

10 Are frequency and duration of exposure as well as time-points of observations explained?

11 Were negative controls included (give also point, if not necessary, see explanations)?

156

12 Were positive controls included (give also point, if not necessary, see explanations)?

13 Is the number of replicates (or complete repetitions of experiment) given?

0

Criteria Group IV: Study results documentation

14 Are the study endpoint(s) and their method(s) of determination clearly described?

15 Is the description of the study results for all endpoints investigated transparent and complete?

16 Are the statistical methods for data analysis given and applied in a transparent manner (give also point, if not necessary/applicable, see explanations)?

0

Criteria Group V: Plausibility of study design and data

17 Is the study design chosen appropriate for obtaining the substance-specific data aimed at (see explanations for details)?

18 Are the quantitative study results reliable (see explanations for arguments)?

0 WARNING: check for unprocessed

criteria! (for each criterium a score has to be selected)

0

A Numerical result leads to initial Category: 3

B Checking red scores leads to revised Category: 3

C Evaluator's proposal: Category:

D Justification in case evaluator deviates from B:

Optional documentation of observations with importance to relevance (not part of the reliability assessment)

157

During the course of the quality assessment observations may be made which are important for discussing the relevance of the data for specific purposes. The optional possibility is provided here to document these observations for future use.

What is the purpose of this quality evaluation (data documentation for use under REACH, classification activity under GHS, ECVAM validation activities, other)?

Study conducted according to recent OECD or EU guidelines (or other, e.g. national guidelines)? If yes, which ones? Study conducted under GLP conditions?

(If not a guideline study): Does a guideline exist for the study endpoint(s) under investigation?

Are you aware of relevant deviations from the guideline(s) in the study evaluated? If yes, which one?

Did you make observations with importance to the regulatory use of the data (example 1: evaluator may hint that a whole body inhalation study was performed with a substance, for which profound percutaneous absorption is expected or known, leading to substantial percutaneous uptake in addition to inhalation uptake; example 2: an Ames reversion assay was performed with strains able to identify frame-shift mutations only or without external metabolic activation; example 3: evaluator is in possession of positive evidence that the results obtained with the in vitro study under evaluation, in conjunction with known toxicokinetic data, are useful to assess the nephrotoxicity of the substance in humans)?

Would you like to make other/general comments on the usability of the data?

158

Anexo 3. Desenho técnico da ponteira de pipeta T-300 (Axygen)

159

Apêndice

Artigo 2 Tabela de extração de dados

Domain Data extracted

Study identification (Reference)

Funding

Source reporting ( ) Yes ( ) No Conflict of interest reporting ( ) Yes ( ) No

Cell/tissue model

Cell line or cell type: Source of cells: Sex of human or animal of origin: Species:

Treatment

8. RCFM chemical composition: RCFM brand: RCFM prepare: Fresh ( ) yes ( ) no; Set ( ) yes , time _24h___ ( ) no Vehicle used in experimental/control conditions: Vehicle/material ratio:

Methods

Guideline compliance: Randomization procedure, allocation concealment, blinding during outcome: Number of replicates per group: Percent serum/plasma in medium: Exposition time: Use of a negative control: Report of data from positive controls: Endpoint category: Endpoint or assay name and source of assay kit: Statistical methods:

Results:

Tetrazolium- based test result: Other tests results: NOEC: LOEC: Statistical significance: AC50: Other estimates of effect:

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