UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS

AVALIAÇÃO DA DIGESTIBILIDADE IN VITRO DE ALIMENTOSPARA RUMINANTES

Barbara Juliana Martins Lemos

Orientador: Juliano José de Resende Fernandes

Goiânia

2011

ii

BARBARA JULIANA MARTINS LEMOS

AVALIAÇÃO DA DIGESTIBILIDADE IN VITRO DE ALIMENTOS PARARUMINANTES

Seminário apresentado junto à DisciplinaSeminários Aplicados do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escola deVeterinária da Universidade Federal deGoiás.

Nível: Mestrado

Área de Concentração:

Produção Animal

Linha de pesquisa:

Metabolismo nutricional, alimentação e forragicultura na produção animal

Orientador:

Prof. Dr. Juliano José de Resende Fernandes - UFG

Comitê de orientação:

Prof. Dr. Emmanuel Arnhold - UFG

Prof. Dr. Edemilson Cardoso da Conceição - UFG

GOIÂNIA

2011

iii

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS ....................................................................................................................... iv

LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................................v

LISTA DE ABREVIATURAS ..........................................................................................................vi

1 INTRODUÇÃO...............................................................................................................................1

2 REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................................................3

2.1 Sistemas in vitro para avaliar a fermentação ruminal ..........................................................3

2.1.1 Culturas batch .........................................................................................................................3

2.1.2 Culturas contínuas .................................................................................................................4

2.2 Metodologias para estimar a digestibilidade in vitro dos alimentos...................................6

2.2.1 Métodos usando líquido ruminal ..........................................................................................8

2.2.1.1 Importância do líquido ruminal ..........................................................................................8

2.2.2. Saliva artificial de McDOUGALL (1948) ............................................................................9

2.2.3 Método tradicional de TILLEY & TERRY (1963) .............................................................10

2.2.3.1 Modificação proposta por GOERING & VAN SOEST (1970) ....................................11

2.2.4 Método filter bags (Ankom) .................................................................................................12

2.2.5 Método proposto por HOOVER et al. (1976) ...................................................................17

3 CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................................................21

REFERÊNCIAS ..............................................................................................................................22

iv

LISTA DE TABELAS

TABELA 1- Métodos para avaliar a digestibilidade dos alimentos para

ruminantes............................................................................... 7

TABELA 2 - Composição sugerida para saliva sintética............................. 10

TABELA 3 - Composição das soluções tampão para o método de filter

bags ........................................................................................ 14

TABELA 4 - Médias de digestibilidade in vitro da MS (%) para dez

diferentes alimentos pelo método tradicional (TM), DAISYII

com alimentos iguais no mesmo frasco (DS), ou DAISYII

com alimentos diferentes no mesmo frasco (DD) .................. 16

TABELA 5 - Médias da digestibilidade in vitro da matéria seca (DIVMS) e

da matéria orgânica (DIVMO) de cultivares de Cynodon,

obtidos pelos métodos TILLEY e TERRY e DAISYII............... 17

v

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Fermentador de cultura contínua de fluxo duplo: “A”

reservatório do tamponante, “B” bureta, “C” bomba peristáltica,

“D” frasco fermentador, “E” agitador magnético, “F” filtro, “G”

bomba peristáltica, “H” reservatório de efluentes filtrados; “I”

porta de transbordamento, “J” reservatório do excesso de

efluentes, “K” anel do spray de água aquecida, “L” porta de

alimentação mecânica, “M” sonda termistor, “N” porta de

entrada de gás............................................................................. 19

vi

LISTA DE ABREVIATURAS

AGCC Ácidos graxos de cadeia curta

g Gramas

FDA Fibra em detergente ácido

FDN Fibra em detergente neutro

h Horas

mm Milímetros

MS Matéria seca

DVIV Digestibilidade verdadeira in vitro

DIVMS Digestibilidade in vitro da matéria seca

TMR Ração Total (mistura de volumoso e concentrado)

1

1 INTRODUÇÃO

Com o rápido avanço tecnológico e globalização dos mercados, o setor

agropecuário exige eficiência nos sistemas produtivos para manter a

competitividade nos diferentes segmentos. Para o desenvolvimento da criação

racional de bovinos é fundamental gerar alternativas aplicáveis a campo e que

somem ao conhecimento científico da nutrição de ruminantes. A avaliação dos

alimentos tem importância nutricional, econômica e social, uma vez que é uma

ferramenta imprescindível para otimizar o desempenho animal, minimizando os

custos de produção, bem como pode contribuir para a redução de impactos sobre

o ambiente.

Sistemas de alimentação modernos e eficientes precisam ser

fundamentados em mecanismos que determinam a resposta dos animais aos

nutrientes, lidando com aspectos quantitativos da digestão e do metabolismo do

ruminante (MERTENS, 2005). Estudos da concentração e digestibilidade dos

componentes dos alimentos são essenciais para adotar práticas de alimentação

eficazes, mas estes estudos exigem recursos consideráveis em termos de

trabalho, alimentação, animais e tempo. É consenso que, para a descrição

quantitativa apropriada dos processos digestivos e metabólicos, são necessários

dados biológicos que podem ser obtidos usando técnicas in vitro (MOULD et al.,

2005), precedentes ou em substituição aos ensaios in vivo e in situ.

Teoricamente, os sistemas in vitro, devem ser capazes de representar

o processo de digestão que ocorre no rúmen, abomaso ou intestino para estimar

quantitativamente a taxa e o grau de digestão similarmente aos obtidos in vivo

(BERCHIELLI et al., 2006). Estes sistemas podem ser usados para estudar

processos individuais fornecendo informações sobre sua natureza e sensibilidade

a vários fatores (LÓPEZ, 2005). A capacidade de controlar mais precisamente o

ambiente in vitro tem levado ao desenvolvimento de técnicas alternativas,

aumentando substancialmente a capacidade de pesquisa e o conhecimento da

microbiologia do rúmen e dos processos bioquímicos envolvidos na fermentação

ruminal.

2

Dentre as principais vantagens dos métodos de digestiblidade in vitro,

citam-se o custo reduzido, a rapidez na obtenção de resultados, o satisfatório

controle ambiental, além da possibilidade de trabalhar com número elevado de

tratamentos e baixas quantidades de amostra (ARAÚJO, 2010). Alguns autores

os consideram como procedimentos mais práticos e precisos, visto que quase

todo o processo é desenvolvido em laboratório simulando as condições naturais

da digestão (ALCALDE, 2001). Desta forma, tem-se observado na literatura um

incremento no uso destas metodologias, geralmente muito empregadas nas fases

iniciais de pesquisas para desenvolvimento de novos produtos alimentares para

ruminantes.

O estudo direto da fermentação ruminal é difícil e diferentes sistemas

tem sido projetados para permitir que o conteúdo ruminal continue a fermentação

em condições controladas de laboratório seguindo padrões normais do organismo

animal (LÓPEZ, 2005), notadamente a metodologia descrita por TILLEY &

TERRY (1963) modificada por GOERING & VAN SOEST (1970), aplicada nos

modelos de fermentadores propostos por HOOVER et al. (1976) e HOLDEN

(1999).

Inicialmente os sistemas in vitro eram utilizados para avaliação da

degradação de forragens e outros alimentos volumosos. O aperfeiçoamento

destes métodos tem permitido a avaliação de diversos alimentos, bem como

investigar os mecanismos de fermentação microbiana e estudar o modo de ação

de fatores antinutricionais, aditivos e suplementos alimentares. A estimativa dos

parâmetros de digestibilidade de um alimento constitui um fator determinante para

a disponibilidade de seus nutrientes aos animais, permitindo o balanceamento

adequado de dietas para suprir as demandas de mantença e produção dos

mesmos (DETMANN et al., 2006).

Este trabalho foi realizado com o objetivo de revisar aspectos

importantes relacionados ás principais metodologias aplicadas em sistemas in

vitro utilizando líquido ruminal para determinação da digestibilidade dos alimentos

fornecidos a ruminantes.

3

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Sistemas in vitro para avaliar a fermentação ruminal

Diversos sistemas têm sido desenvolvidos com o objetivo de atingir

condições próximas às observadas no rúmen. Os sistemas podem ser

diferenciados de acordo com o tipo de população microbiana a ser cultivada,

podendo ser culturas puras de espécies isoladas ou um grupo de microrganismos,

ou ainda a incubação no próprio conteúdo ruminal, que é mais comum.

LÓPEZ (2005) classifica os sistemas in vitro em dois tipos principais:

culturas batch (também chamadas de incubações em massa) e culturas

contínuas.

2.1.1 Culturas batch

Culturas batch são simples e muito comumente usadas em sistemas de

fermentação in vitro, sendo muito úteis em experimentos em que um grande

número de amostras ou tratamentos experimentais devem ser testados, ou ainda

quando a quantidade de amostra disponível é muito pequena.

A principal aplicação destes sistemas é estimar a digestibilidade ou a

extensão da degradação no rúmen por meio de medições em um único ponto

final, através da cinética gravimétrica de desaparecimento do substrato ou

produtos finais da fermentação, como, por exemplo, a produção de ácidos graxos

de cadeia curta (AGCC) pode ser medida facilmente devido ao seu acúmulo

quando o substrato é incubado (LÓPEZ, 2005).

O método de filter bags (ANKOM) assim como a metodologia

tradicional de TILLEY & TERRY (1963) empregam incubações em massa. A

principal desvantagem desse tipo de cultura para estudar a fermentação ruminal é

que os experimentos são possíveis apenas a curto (horas) e médio prazo (dias) e

o estado de equilíbrio (fermentação normal dentro do rúmen animal) não pode ser

alcançado devido ao padrão de crescimento microbiano, uma vez que, a

população microbiana tende a diminuir devido á redução da disponibilidade de

4

substrato e o acúmulo de resíduos da fermentação, resultando em lise das células

microbianas (LÓPEZ, 2005).

2.1.2 Culturas contínuas

Em sistemas de cultura contínua acontece a adição regular de tampão

e de nutrientes e remoção contínua de produtos da fermentação, atingindo

condições de equilíbrio que permitem o estabelecimento de uma população

microbiana estável, podendo ser mantida por longos períodos (HOOVER et al.,

1976). Os sistemas permitem a medição de parâmetros de fermentação, a

extensão da degradação da MS, a produção de produtos finais e síntese de

proteína microbiana (LÓPEZ, 2005).

Esses sistemas simulam o ambiente ruminal de maneira mais

representativa que culturas batch e permitem o estudo por longo prazo (semanas)

dos efeitos de fatores que afetam a população microbiana e a digestão de

nutrientes em condições controladas de pH, taxa de rotatividade e ingestão de

nutrientes (LÓPEZ, 2005). No entanto, é necessário um tempo de colonização

após a inoculação da cultura para alcançar as condições do estado de equilíbrio.

Na literatura são relatados três tipos de culturas ruminais contínuas, sendo

semipermeável, de cultura contínua e semicontínua.

O tipo semipermeável consiste em um sistema de diálise contínua em

que a cultura microbiana é colocada dentro de uma membrana semipermeável, é

um sistema muito complexo que não pode ser alimentado com substratos sólidos

(SCHULTZ & GERHARD, 1969; ABE & KUMENO, 1973), portanto, inadequado

para uso rotineiro.

Em sistemas de cultura contínua o conteúdo do fermentador é

composto por uma mistura do líquido ruminal e solução tampão injetada

continuamente, partículas de alimento são administradas regularmente dentro do

recipiente, sendo que parte da mistura homogênea de sólidos, líquidos, produtos

da fermentação e microorganismos, contendo partículas em suspensão é

bombeada para fora ou simplesmente transborda (LÓPEZ, 2005). Como a

entrada e saída de soluções líquidas e alimentos sólidos são contínuos, estes

5

sistemas são considerados sistemas de fluxo contínuo. Vários fermentadores

deste tipo têm sido descritos na literatura.

Os sistemas de fluxo duplo incorporam um sistema duplo de remoção

de efluentes, simulando o diferencial para os fluxos de líquidos e sólidos, não

prejudicando a manutenção da quantidade de protozoários no sistema em

comparação aos sistemas de fluxo simples (HOOVER et al., 1976).

O Rusitec (Rumen Simulation Technique) é um fermentador

desenvolvido por CZERKAWSKI & BRECKENRIDGE (1977) que possui apenas

uma única saída para controlar a diluição. A infusão da solução tampão para o

recipiente e a remoção de efluentes por transbordamento são contínuas. No

entanto, não existem disposições para o fornecimento de alimentação contínua e

saída de partículas sólidas do recipiente, de modo que o Rusitec é considerado

um sistema de fluxo semi-contínuo (LÓPEZ, 2005).

Com um levantamento simples feito no indexador SCIENCEDIRECT

(2011) nota-se que somente a partir de 2005 o sistema Rusitec passou a ser mais

utilizado. O Rusitec e culturas contínuas de fluxo duplo são capazes de simular as

condições e a cinética do rúmen, sendo modelos biológicos amplamente

empregados para estudar a fermentação microbiana ruminal.

A modelagem da produção e da passagem de substâncias em

sistemas de cultura contínua é mais simples do que no rúmen, porque as

condições são estáveis, sem efeitos de matéria endógena, a absorção e

passagem são um único processo (remoção ou saída) e a entrada da

alimentação, bem como as taxas de saída são constantes, reguladas e medidas

diretamente (LÓPEZ, 2005).

O primeiro trabalho publicado com método de filter bags (DaisyII,

Ankom) data de 1999, bastante recente se comparado aos fermentadores de fluxo

duplo propostos em 1976, o que justifica seu menor emprego em trabalhos

científicos. No entanto, a praticidade do método de cultura batch pode colocá-lo

na mesma importância das culturas contínuas.

6

2.2 Metodologias para estimar a digestibilidade in vitro dos alimentos

A digestibilidade do alimento se refere á proporção de um componente

nutricional que foi absorvido pelo organismo animal, podendo fornecer a

estimativa aparente e verdadeira. A digestibilidade aparente é baseada na

diferença entre a quantidade de matéria seca ou nutriente ingerido e respectiva

quantidade nas fezes, enquanto a digestibilidade verdadeira considera no cálculo

a matéria metabólica fecal como perdas endógenas, descamações do epitélio e

contaminação por microrganismos (SILVA & QUEIROZ, 2002). A digestibilidade

verdadeira sempre será maior que digestibilidade aparente, exceto no caso da

fração fibrosa do alimento para a qual os valores de digestibilidade verdadeira e

aparente são iguais, uma vez que não há produção endógena desse composto no

organismo animal (BERCHIELLI et al., 2006).

Uma série de técnicas in vitro tem sido descritas para estimar a

digestibilidade de alimentos no rúmen, representando modelos biológicos que

simulam os processos de digestão que acontecem no animal vivo. Estas técnicas

permitem a manipulação de parâmetros que definem o estado do animal e, se

devidamente avaliadas em relação a observações in vivo, podem ser apropriadas

para estudar a resposta do animal quando um fator é controlado sem a interação

de outros fatores relacionados, evidenciando seu principal efeito.

As técnicas propostas para avaliar a digestibilidade dos componentes

alimentares sofreram alterações ao longo do tempo conforme as necessidades e

resultados das pesquisas. O método convencional de BAUMGARDT et al. (1962)

que consistia em 24 horas de incubação em inóculo ruminal, foi modificado por

TILLEY e TERRY (1963) para simular a digestão no abomaso e GOERING & VAN

SOEST (1970) propuseram o uso de solução de detergente neutro como

alternativa para a pepsina ácida na segunda fase desta última técnica. A extração

com o detergente neutro remove as paredes celulares de bactérias e produtos

endógenos, além de proteínas e, portanto, esta modificação prevê a

digestibilidade verdadeira, em vez da digestibilidade aparente, além disso, o

segundo estágio é substancialmente reduzido permitindo a operação em larga

escala (SILVA & QUEIROZ, 2002).

7

As principais técnicas descritas na literatura para determinar a

digestibilidade dos alimentos fornecidos a ruminantes são apresentadas na

Tabela 1.

TABELA 1- Métodos para avaliar a digestibilidade dos alimentos para ruminantes

Métodos Referências

1. Usando líquido ruminal

Desaparecimento do substrato

Incubação em líquido ruminal 24–48 h

BENTLEY et al. (1955); DEHORITY

et al., (1957); JOHNSON et al.,

(1958)

Método convencional 24 h BAUMGARDT et al. (1962)

Incubação em líquido ruminal 48 h +

incubação em HCl e pepsina 48 hTILLEY & TERRY (1963)

Incubação em líquido ruminal 48 h +

extração em detergente neutroGOERING & VAN SOEST (1970)

Técnica in vitro filter bag HOLDEN, 1999

Formação de produtos finais da fermentação

Produção de gás após 24 h de

incubação em líquido ruminalMENKE et al. (1979)

Usando inóculo fecal em vez de líquido

ruminalEL SHAER et al. (1987)

2. Usando enzimas

Celulase JONES & THEODOROU (2000)

Ácido pepsina + celulase JONES & HAYWARD (1975)

Amilase + celulase DOWMAN & COLLINS (1982)

Extração de detergente neutro +

celulaseROUGHAN & HOLLAND (1977)

Ácido + celulase DE BOEVER et al. (1988)

3. Solubilidade

Extração em detergente neutro VAN SOEST et al. (1991)

Fonte: Adaptado de LÓPEZ (2005)

8

Recentemente uma alternativa promissora é a técnica in vitro usando

sacos de filtro (filter bags). Pequenas quantidades de amostras são pesadas em

sacos de poliéster, que são inoculados dentro de um recipiente de fermentação

em incubadoras rotativas, permitindo a análise de um grande número de amostras

de uma só vez, e determinações de matéria seca (MS), fibra em detergente

neutro (FDN) e fibra em detergente ácido (FDA) podem ser realizadas no resíduo

contido nos filter bags (LÓPEZ, 2005). O sistema permite investigar os efeitos de

mudanças no ambiente ruminal sobre a digestibilidade dos alimentos, com a

adição de uma substância por exemplo.

2.2.1 Métodos usando líquido ruminal

A digestibilidade é medida por gravimetria de desaparecimento do

substrato quando o alimento é incubado na presença de conteúdo ruminal diluído

em uma solução tampão, sendo que um período de incubação de 48 horas tem

sido sugerido para as técnicas gravimétricas como o tempo total ideal para uma

melhor precisão das estimativas de digestibilidade (LÓPEZ, 2005).

O primeiro relato do uso destas técnicas foi em 1919, mas o progresso

chave nesta metodologia ocorreu quando soluções tampão, como a saliva artificial

proposta por McDOUGALL (1948), capazes de manter um pH adequado

passaram a ser usadas, permitindo assim incubações in vitro durante um longo

tempo (LÓPEZ, 2005). Inicialmente muitos sistemas in vitro para medir a

digestibilidade eram constituídos de apenas um estágio de digestão no líquido

ruminal (BAUMGARDT et al., 1962).

O método de dois estágios descrito por TILLEY & TERRY (1963) foi

considerado o mais amplamente utilizado para determinar a digestibilidade in vitro

até o desenvolvimento do método de filter bags (HOLDEN, 1999) que permite

maior rendimento de trabalho. No entanto, existe uma tendência de disseminação

dos fermentadores contínuos de fluxo duplo conforme metodologia descrita por

HOOVER et al. (1976).

2.2.1.1 Importância do líquido ruminal

9

Muitas variáveis interferem nos sistemas in vitro. A população

microbiana pode ser afetada, entre outros fatores, pela dieta do animal doador e

pelo preparo do líquido ruminal. Podem ocorrer variações devido ao

processamento das amostras envolvendo principalmente a granulometria e peso.

Também estão sujeitos a diferenças atribuídas ao meio de cultura, quanto ao

volume de líquido ruminal em relação à solução tampão, ajuste adequado do pH

da saliva artificial e disponibilidade de substratos. As variações nos

procedimentos experimentais se referem ao tempo de incubação das amostras,

manutenção da anaerobiose do meio de cultura, bem como erros laboratoriais.

O fluido de rúmen representa a maior fonte de variação que não pode

ser controlada nestas técnicas (LÓPEZ, 2005). A atividade microbiana e a

quantidade de micorganismos presentes no líquido ruminal podem apresentar

diferenças significativas para diferentes espécies animais, raças, indivíduos, e

dentro do mesmo animal ao longo do tempo, bem como para a dieta dos animais

doadores (MOULD et al., 2005).

No trabalho desenvolvido por HOLDEN (1999) a fonte de líquido

ruminal afetou significativamente a DIVMS de seis dos dez alimentos testados,

para capim (pastagem) e TMR (P <0,05) e para o feno de alfafa, feno de capim,

milho floculado, e milho seco moído (P <0,10), sendo que os valores de DIVMS

foram maiores quando a dieta do animal doador foi TMR em relação ao feno de

gramínea. Apesar da diferença nos valores de DIVMS, o ranking de alimentos de

maior para menor digestibilidade era o mesmo entre as duas fontes de fluído

ruminal, exceto quando a pastagem foi incluída no ranking. A coleta e o preparo

do líquido ruminal podem ser determinantes sobre os resultados observados.

2.2.2. Saliva artificial de McDOUGALL (1948)

Os resultados obtidos no trabalho de McDOUGALL (1948) realizado

com ovinos permitiram que o pesquisador sugerisse uma fórmula para saliva

sintética, e esta tem sido amplamente empregada para estudar a digestão dos

ruminantes em ensaios que pretendem simular as condições do rúmen.

A Tabela 2 apresenta a proposta do autor para as concentrações dos

componentes da saliva artificial.

10

TABELA 2 - Composição sugerida para saliva sintética

Sal g/L

NaHCO3 9,80

Na2HPO4. 12H20 9,30

NaCl 0,47

KCl 0,57

CaCl2 anhyd. 0,04

MgCl2 anhyd. 0,06

Fonte: McDOUGALL (1948)

Para a maior parte dos animais domésticos a função principal da saliva

é de lubrificante para ajudar a mastigação e deglutição, em ruminantes, no

entanto, a saliva tem um papel ainda mais importante, uma vez que forma um

meio fluido para o transporte da ingesta de volta à boca para a ruminação e

também adiante através do estômago para o intestino delgado, além de tamponar

o meio para que os microrganismos do rúmen possam se desenvolver

(McDOUGALL, 1948).

2.2.3 Método tradicional de TILLEY & TERRY (1963)

Usando vários tipos de forrageiras, TILLEY & TERRY (1963)

confirmaram a alta correlação entre as digestibilidades in vitro e in vivo

determinada com ovelhas. A metodologia desenvolvida por estes autores consiste

em um procedimento realizado em duas fases. Com esta técnica uma segunda

etapa foi introduzida; após a incubação em líquido ruminal tamponado por 48 h o

resíduo é digerido em pepsina ácida para simular a digestão no abomaso. SILVA

& QUEIROZ (2002) relatam que o segundo estágio, com solução ácida de

pepsina, é utilizado para desdobrar as proteínas dos microrganismos que se

desenvolveram no processo fermentativo do substrato, no entanto, deixa no

resíduo, a parede celular indigerível das bactérias.

SILVA & QUEIROZ (2002) descrevem o procedimento tradicional de

avaliação da digestibilidade in vitro dos alimentos de TILLEY & TERRY (1963):

para executar a primeira fase pesa-se 0,5 g de amostra seca ao ar e acondiciona-

se em tubos de vidro com capacidade de 100 mL, previamente secos em estufa a

11

105 ºC, por duas horas; em cada tubo adiciona-se 40 mL da solução tampão

descrita por McDOUGALL (1948) que simula a saliva do ruminante; em seguida

adiciona-se 10 mL de líquido ruminal e injeta-se CO2 nos tubos, fechando-os com

rolhas de borracha providas de válvulas de Bunsen; os tubos devem ser

incubados na estufa a 39 ºC, em banho Maria durante 48 horas e devem ser

levemente agitados em 2, 4, 20 e 28 horas após a incubação, para dispersar as

partículas da amostra e eliminar os gases formados.

Na segunda fase do método, após a remoção das rolhas, devem ser

adicionados em cada tubo 2 mL de solução de HCl 6N e 5 mL de solução de

pepsina (5%); devem ser incubados novamente a 39 ºC, durante 24 horas

destampados, sendo eventualmente agitados; após a incubação, o material no

interior dos tubos deve ser filtrado com água quente destilada (25 mL para

arrastar partículas remanescentes no tubo e 15 mL para o enxágüe da parte

interna do cadinho filtrante, previamente seco a 105 ºC por duas horas); os pesos

devem ser registrados, posteriormente os cadinhos filtrantes devem ser secos em

estufa a 105 ºC, e novamente registrados os pesos; dois tubos controle “brancos”

devem ser introduzidos em cada corrida para determinar a matéria seca residual

do líquido ruminal, além de dois tubos “índices” com alimentos de alta e baixa

digestibilidade (conhecidas) para validar os resultados da corrida (SILVA &

QUEIROZ, 2002).

Apesar das limitações esta metodologia tradicional ainda vem sendo

bastante empregada em trabalhos atuais como de CASTILLEJOS et al. (2008) e

BUSQUET et al. (2006).

2.2.3.1 Modificação proposta por GOERING & VAN SOEST (1970)

A metodologia in vitro proposta por GOERING & VAN SOEST (1970)

tem sido utilizada para estimar a degradabilidade no rúmen, em que o

desaparecimento do substrato após a incubação em líquido ruminal tamponado

seguida de extração em detergente neutro é medido em vários tempos de

12

incubação, e a curva de degradação instalada em vários modelos matemáticos

para estimar a taxa fracional de degradação.

Com a modificação da metodologia tradicional de TILLEY & TERRY

(1963), usando solução em detergente neutro no segundo estágio do

procedimento, todo o material oriundo do desenvolvimento de microrganismos é

dissolvido, tanto a proteína como também os componentes da parede celular

indigerível dos microrganismos ruminais, portanto, esta modificação prevê a

digestibilidade verdadeira, em vez da digestibilidade aparente, além de reduzir o

período para executar o segundo estágio, aumentado o rendimento de trabalho

(SILVA & QUEIROZ, 2002).

SILVA & QUEIROZ (2002) descrevem a metodologia modificada de

determinação da digestibilidade in vitro proposta por GOERING & VAN SOEST

(1970): Após a incubação por 48 horas (TILLEY & TERRY, 1963), os tubos devem

ser removidos com os resíduos para a digestão em solução em detergente neutro

concentrado (os tubos podem ser armazenados em geladeira para serem

analisados posteriormente); o conteúdo dos tubos deve ser transferido para

béquer de 600 mL utilizando 50 mL de solução em detergente neutro

concentrado, totalizando um volume de 100 mL; deve ser feito o ajuste da

temperatura para refluxo do resíduo durante 60 minutos; posteriormente o resíduo

deve ser filtrado, sob vácuo, em cadinhos filtrantes ou papel filtro; os pesos

podem ser registrados a quente ou após esfriar em dessecador; devem ser

lavados no mínimo duas vezes, com água quente (90 a 100 ºC); igualmente

lavados (número de vezes) com acetona; os cadinhos filtrantes ou papel filtro

devem ser colocados com os resíduos na estufa a 105 ºC (durante a noite) e

posteriormente pesados a quente ou após esfriar em dessecador, sendo os pesos

registrados.

2.2.4 Método filter bags (Ankom)

O método conhecido como fermentador ruminal DaisyII (ANKOM

Technology Corp., Fairport, NY) foi introduzido recentemente no Brasil (SANTOS

et al., 2000). Esta técnica baseia-se na inoculação de substratos armazenados

13

em saquinhos filtrantes (filter bags) e possibilita avaliar grande quantidade de

amostras simultaneamente.

O aparelho DAISYII que simula a fermentação ruminal foi desenvolvido

buscando melhorar a eficiência laboratorial da técnica in vitro (ALCADE et al.,

2001). Este fermentador possui quatro frascos de digestão independentes e

mantém o meio de fermentação em agitação contínua a uma temperatura

específica de 39,5 ºC (ARAÚJO, 2010). Permite incubar diferentes alimentos em

filter bags no mesmo recipiente, sendo considerado o material que desaparece

como digerido (MABJEESH et al., 2000). HOLDEN (1999) afirma que o aparelho

DAISYII pode ser utilizado para avaliações in vitro de forragens e grãos.

O procedimento detalhado para realizar a análise da digestibilidade

verdadeira da matéria seca usando a incubadora DAISYII pode ser resgatado no

site da empresa (ANKOM, 2011). Basicamente consiste no preparo dos filter bags

e amostras, da combinação da solução tampão e do inóculo ruminal para a

incubação no aparelho com injeção de CO2 nos frascos, seguida de determinação

de FDN das amostras removidas do fermentador para calcular a digestibilidade

verdadeira da matéria seca.

O preparo dos filter bags e amostras consiste em: pré lavagem dos

filter bags (F57 – produzidos pela empresa fabricante do equipamento) em

acetona por três a cinco minutos para remover um surfactante que inibe a

digestão microbiana, secar completamente os filter bags; pesar cada bag e

registrar o peso (W1); zerar a balança e pesar 0,25 g ou 0,5 g de amostra (W2)

diretamente no filter bag, para ensaios de 24 ou 48 horas, respectivamente; selar

o filter bag e colocar nos frascos de digestão do aparelho DaisyII (até 25 amostras

por frasco), distribuídas uniformemente em ambos os lados da linha divisória;

incluir pelo menos um filter bag selado em branco (sem amostra) para calcular o

fator de correção (C1) (ANKOM, 2011).

O preparo da combinação de soluções tampão (A e B, descritas na

Tabela 3) para cada frasco de digestão é realizado da seguinte maneira: pré

aquecimento a 39 °C de ambas as soluções tampão (A e B); em recipiente

separado adiciona-se 266 mL de solução B a 1.330 mL de solução A (relação de

1:5); a quantidade exata de A para B deve ser ajustada para obter um pH final de

14

6,8 a 39 °C; adicionar 1.600 mL da mistura tamponante A/B em cada frasco de

digestão que devem ser colocados com amostras na incubadora DaisyII, em

seguida ligar interruptores de calor e agitação; permitir que a temperatura dos

frascos de digestão se estabilize durante pelo menos 20 a 30 minutos (ANKOM,

2011).

TABELA 3 - Composição das soluções tampão para o método de filter bags

Reagentes g/Litro

Solução tampão A

KH2PO4 10,0

MgSO4•7H2O 0,5

NaCl 0,5

CaCl2•2H2O 0,1

Uréia 0,5

Solução tampão B

Na2CO3 15,0

Na2S•9H2O 1,0

Fonte: ANKOM (2011)

Para coleta do líquido ruminal é preciso: pré-aquecer garrafa térmica

com água a 39 °C (remover a água antes de acondicionar o conteúdo ruminal);

usando o procedimento de coleta apropriado, remover pelo menos 2.000 mL de

conteúdo ruminal e colocar na garrafa térmica; pré-aquecer um liquidificador com

água a 39 ºC; injetar CO2 no liquidificador ao colocar o conteúdo ruminal e

misturar em alta velocidade por 30 segundos (para desalojar microganismos

aderidos á parte sólida, garantindo uma população microbiana representativa);

filtrar a digesta em quatro camadas de gaze em recipiente pré-aquecido a 39 °C

injetando continuamente CO2 (ANKOM, 2011).

Para realizar a incubação deve-se: remover um frasco de digestão por

vez da incubadora DaisyII e adicionar 400 mL de líquido ruminal á solução tampão

e amostras e injetar CO2 durante trinta segundos e fechar a tampa; repetir o

processo para todos os frascos (não permitir que o CO2 forme bolhas no inóculo

tamponado); incubar durante 24 ou 48 horas (a incubadora mantém a temperatura

de 39.5 °C ± 0,5) (ANKOM, 2011).

15

Ao concluir a incubação, remover os frascos e drenar fluido; lavar os

filter bags abundantemente com água fria até que a água esteja limpa, usando o

mínimo de agitação mecânica. Para determinar a digestibilidade verdadeira é

necessário remover resíduos microbianos e as frações solúveis restantes usando

solução de detergente neutro; registrar o peso das amostras após procedimento

de FDN (W3), sendo que as amostras podem ser congeladas para posterior

determinação de FDN (ANKOM, 2011).

As fórmulas para calcular a digestibilidade verdadeira in vitro (DVIV %)

são as seguintes (ANKOM, 2011):

% DVIVMS (base de MS) = 100 – (W3 - (W1 x C1)) / (W2 x DM) x 100

Onde: W1 = tara do bag;

W2 = peso da amostra;

W3 = peso final do bag + resíduo depois da incubação e tratamento com

detergente neutro;

C1 = correção do bag branco (peso final seco em estufa / peso inicial).

2.2.4.1 Comparação dos métodos tradicional e de filter bags

A comparação de métodos é muito importante para a interpretação

adequada dos resultados obtidos, possibilitando a comparação dos trabalhos e

assim possibilitar a identificação de possíveis “falhas” e potencialidades dos

diferentes procedimentos experimentais.

HOLDEN (1999) utilizou a solução tampão do método de filter bags no

método tradicional de TILLEY & TERRY (1963) para compará-los e constatou que

o DAISYII é um sistema eficaz para a medição DIVMS apresentando dados

semelhantes á metodologia tradicional e também não encontrou diferenças

significativas quando grãos e forragens foram incubadas no mesmo frasco de

digestão (Tabela 4).

SANTOS et al. (2000) utilizando a saliva artificial de McDOUGALL

(1948) para o método tradicional e a solução tampão do método de filter bags

observaram diferenças significativas entre as metodologias, para as

16

digestibilidades in vitro da matéria seca e da matéria orgânica de quatro dos cinco

dos cultivares do gênero Cynodon avaliados.

TABELA 4 - Médias de digestibilidade in vitro da MS (%) para dez diferentes

alimentos pelo método tradicional (TM), DAISYII com alimentos iguais no mesmo

frasco (DS), ou DAISYII com alimentos diferentes no mesmo frasco (DD)

Alimento TM DS DD P value

Feno de alfafa 58,84 58,91 59,89 0,87

Capim (pastagem) 61,88 62,89 63,27 0,62

Capim (feno) 49,78 51,73 51,22 0,56

Feno misto 47,40 48,92 47,52 0,90

Silagem de milho 63,92 62,85 63,54 0,96

TMR 69,89 68,53 68,75 0,53

Mistura de grãos 79,53 83,95 81,78 0,31

Milho grão de alta umidade 79,83 85,59 86,02 0,11

Milho floculado 81,58 84,14 85,11 0,17

Milho seco moído 79,93 86,89 88,21 0,14

Fonte: HOLDEN (1999)

Os resultados dos trabalhos sugerem que a solução tampão utilizada

tem efeito sobre as estimativas da digestibilidade. Além disso, o trabalho de

HOLDEN (1999) evidencia uma maior versatilidade do método de filter bags

possibilitando a análise de alimentos de composição bromatológica muito

diferentes.

Outro aspecto importante do trabalho de SANTOS et al. (2000) é que

não houve diferença (p>0,05) entre as cultivares quando avaliadas pelo método

tradicional, enquanto que a metodologia DAISYII apresentou diferença entre as

cultivares (Tabela 5). Esta comparação se torna de maior relevância do que a

anterior, fornecendo mais subsídios para a comparação das metodologias. Estas

informações em um trabalho com o desenho experimental de HOLDEN (1999)

certamente teriam forte impacto sobre a difusão do método de filter bags.

TABELA 5 - Médias da digestibilidade in vitro da matéria seca (DIVMS) e da

matéria orgânica (DIVMO) de cultivares de Cynodon, obtidos pelos métodos

17

TILLEY e TERRY e DAISYII

DIVMS (%) DIVMO (%)

GramíneasTilley &

TerryDaisyII Tilley &

TerryDaisyII

Tifton 44 64,92a 71,27a 66,70a 70,02a

Coast-cross 64,92a 66,74 bc 64,11a 65,49 bc

Estrela Roxa 62,53a 68,23ab 65,34a 66,59ab

Tifton 85 62,88a 66,01 bc 65,28a 64,68 bc

Porto Rico 62,47a 62,27 c 66,18a 61,45 c

Coeficiente de variação (%) 2,62 2,62 2,73 2,73Médias seguidas de uma mesma letra maiúscula na linha e minúscula na coluna não diferemsignificativamente em nível de 5%, pelo teste Tukey.

Fonte: SANTOS et al. (2000)

Pressupõe-se que o método de filter bags seja mais rigoroso,

evidenciando diferenças entre os alimentos, uma vez que foram cultivados e

amostrados nas mesmas condições, bem como todas as cultivares possuíam

composição bromatológica muito semelhante. Os coeficientes de variação

mostram que houve o mesmo controle local para os dois métodos.

2.2.5 Método proposto por HOOVER et al. (1976)

As técnicas de cultura contínua foram desenvolvidas como um meio de

estudar o metabolismo microbiano no rúmen em condições que mais se

aproximam de fermentação in vivo do que as incubações em massa (HOOVER et

al., 1976). Embora em sistemas de cultura contínua, como descrito por SLYTER

et al. (1964), seja mantida uma quantidade de bactérias semelhantes às do

rúmen, SLYTER & PUTNAM (1967) relataram que os números de protozoários

diminuem acentuadamente em comparação com os níveis ruminais.

Nas condições do rúmen in vivo as taxas de renovação de líquidos

(equivalente á taxa de diluição dos fermentadores in vitro) excedem 1,5

volume/dia, sendo que a taxa de passagem dos protozoários do rúmen para o

omaso corresponde a apenas de 6 a 29% da taxa de fluxo de líquidos, sendo

18

assim, para manter o número de protozoários os sistemas de culturas continuas

devem ser desenhados para retardar o fluxo da digesta sólida, enquanto permite

o fluxo líquido a uma taxa similar á rúmen (HOOVER et al., 1976).

O sistema de fluxo simples possui um único orifício para remoção de

material, sendo prejudicial para a manutenção da população de protozoários, uma

vez que, quando operados com taxa de diluição maior que 1,0 (volume do

fermentador/dia), o número de protozoários declina, porque o tempo de geração

de muitas espécies é maior do que o tempo de residência no fermentador,

ocorrendo o carreamento de protozoários, enquanto que a taxa de diluição menor

que 1,0 pode causar uma diminuição no número de protozoários devido ao

aumento das concentrações de produtos finais da fermentação e conseqüente

queda no pH do meio (ABE & KUMENO, 1973).

HOOVER et al. (1976) desenvolveram um equipamento para a cultura

contínua de microorganismos ruminais, que consiste em um sistema duplo de

remoção de efluentes projetado para simular os fluxos diferenciados de líquidos e

sólidos que acontecem no rúmen. Neste aparelho uma parcela do meio de

fermentação é bombeada através de um filtro (principalmente líquidos), enquanto

o meio misto (partículas sólidas, líquidos e microrganismos) é escoado por um

local de transbordamento, possibilitando uma rápida entrada de solução

tamponante para manutenção dos níveis de pH, permitindo um maior tempo de

permanência para a digestão de partículas sólidas.

O equipamento original proposto pelos autores possui as seguintes

características: três recipientes de vidro com quatro litros de capacidade,

magneticamente agitados e aquecidos por um spray de água quente controlado

termostaticamente; cada recipiente está equipado com entradas para solução

tampão, para alimentação sólida e para o gás nitrogênio, além de um termostato;

cada frasco tem uma porta de transbordamento localizada para fornecer um

volume de líquido de 2.277 mL, permitindo um escape de 1.723 mL; uma saída

filtrada para a remoção principalmente de líquidos, este sistema de dupla saída

permite a remoção de líquidos e sólidos a taxas diferentes (HOOVER et al.,

1976). Um diagrama esquemático do aparelho é mostrado na Figura 1.

19

Figura 1 – Fermentador de cultura contínua de fluxo duplo: “A” reservatório do

tamponante, “B” bureta, “C” bomba peristáltica, “D” frasco fermentador, “E”

agitador magnético, “F” filtro, “G” bomba peristáltica, “H” reservatório de efluentes

filtrados; “I” porta de transbordamento, “J” reservatório do excesso de efluentes,

“K” anel do spray de água aquecida, “L” porta de alimentação mecânica, “M”

sonda termistor, “N” porta de entrada de gás.

Fonte: HOOVER et al. (1976)

A solução tampão contida no reservatório “A” é bombeada

continuamente para o frasco fermentador “D” por uma bomba peristáltica “C”; a

bureta “B” é ligada a um frasco separado de solução tampão, sendo usada para

monitorar as taxas de bombeamento sem interromper o fluxo para o frasco

fermentador; o dispositivo agitador magnético “E” possui aletas de alumínio

posicionadas para agir como um disjuntor de espuma; o filtro “F” é facilmente

inserido e removido através de um orifício na parte de cima do frasco; parte do

meio líquido de fermentação é bombeado para dentro do reservatório de efluentes

“H” por uma bomba peristáltica “G”; o fluxo da mistura de meios sólido e líquido

através de um braço lateral “I” ocorre para o reservatório “J”; a sonda termistor

“M” inserida dentro do fermentador monitora e mantém a temperatura de 39 ºC,

20

controlando o jato de água quente a partir do anel do spray “K” que circunda o

frasco fermentador; o nitrogênio é continuamente borbulhado no conteúdo de

fermentação através de tubo de alimentação “N”; alimentos sólidos do dispositivo

de alimentação mecânica entram no fermentador através do orifício “L”.

Em trabalhos publicados recentemente com os fermentadores

contínuos de fluxo duplo (FUENTES et al., 2009; CERRATO-SANCHEZ et al.,

2007; CASTILLEJOS et al., 2005; CALSAMIGLIA et al., 2002) tem se usado a

solução tampão proposta por WELLER & PILGRIM (1974) (Na2HPO4.2H2O: 2,2

g/L; NaHCO3: 5,0 g/L; KCl: 0,6 g/L; KHCO3: 1,6 g/L; uréia: 0,2 g/L) contendo

0,4 g/L de uréia para simular a reciclagem de nitrogênio, como também a infusão

de saliva e os fluxos de líquido filtrado ajustados para manter uma taxa de diluição

líquidos e sólidos em 0,10 e 0,05/h, respectivamente. O período experimental de

boa parte dos experimentos consiste de cinco dias de adaptação e três dias para

a amostragem, durante os quais os frascos são mantidos a 4 °C para impedir a

atividade microbiana. A temperatura tem sido mantida a 39 ± 5°C, e o pH

estabilizado no nível programado por infusão de 3N HCl ou 5N NaOH, através

do controle de programas computadorizados. As condições anaeróbicas tem sido

mantidas por infusão de N2 a uma taxa de 40 mL/minuto. Fermentadores com

1.300 mL de capacidade tem sido alimentados com 95 a 100 g de MS/dia,

geralmente divididos em três períodos iguais (8, 16 e 24 horas).

Para a manutenção da anaerobiose do meio os pesquisadores têm

usado N2 invés de CO2 para evitar a queda do pH, devido á formação de ácido

carbônico (HOOVER et al., 1976).

21

3 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os métodos de digestibilidade in vitro constituem importantes

ferramentas para o balanceamento adequado de dietas visando atender

exatamente as exigências do animal, contribuindo para o desenvolvimento da

nutrição de precisão para ruminantes.

Os fermentadores contínuos de fluxo duplo são os sistemas que melhor

representam as características do rúmen no animal, enquanto o método de filter

bags comporta-se como alternativa promissora para os estudos da fermentação

ruminal devido ao seu alto rendimento de trabalho.

Para que os sistemas in vitro sejam reprodutíveis, o líquido ruminal

utilizado deve fornecer características específicas, sendo esta parte dos métodos,

a maior fonte de variação entre trabalhos científicos.

22

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