Rev. Inst. Atiolfo Lutz35/36: 91-101, 1975/76.

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA EM ANIMAIS QUANDO

INOCULADOS COM NEJSSERJA MENINGITIDIS DOS GRUPOS "A" E "C" *

José Pascoal SIMONETTI U

Augusta K. T'AKEDA" *Bruno SOERESEN'" *Orivaldo ZIQUINATTI"Nereide B. BOSCARDIN *.

RIAL-AJ423

SIMONETTI, J.P.; TAKEDA, A.K.; SOERESEN, B.; ZIQUINATTI, O.& BOSCARDIN, N. B. - Avaliação da resposta imunológica em ani-mais quando inoculados com Neisseria meningitidis dos grupos "A"e "C". Rev. Inst. Adolfo Lutz, 35/36: 91-101,1975/76.

RESUMO: Para o estudo do comportamento da resposta imune àN. meningitidis dos grupos A e C, foram feitas inoculações em quarentacoelhos e quatro carneiros, com bactérias vivas e mortas, bem comocom polissacarídeos específicos dos grupos A e C com ou sem adjuvante,em diferentes doses e vias de inoculação. Foram feitas várias séries deinoculações para verificar o efeito secundário e terciário da resposta, bemcomo tipo de anticorpos envolvidos.

o nível de antícorpos e a permanência dos mesmos no soro foi me-dido através da reação de hemaglutinação passiva e da imunoeletrofo-rese cruzada; esta última técnica foi utilizada nestes soros para detecçãode antígenos políssacarídícos da N. meningitidis.

A .análise dos resultados obtidos mostra que não existe diferençanas respostas imunes, nas concentrações variando de 5,6 x 107 a 2,4 x 1010

bactérias por coelho. Os anticorpos, tanto hemaglutinantes como preci-pitantes, apareceram 5 dias após a última inoculação, permanecendo porum tempo médio de vinte e cinco dias. Não houve diferença significa-tiva nas respostas primárias, secundária e terciária, sendo que os anti-corpos precipitantes apareciam em maior concentração após inocula-ção de séries sucessivas.

Os polissacarídeos, quando inoculados intravenosamente, não Ilícita-ram resposta imune, porém eles se tornaram imunogênicos, quando admi-nistrados por via intradérrnica, com o adjuvante completo de Freund.

DESCRITORES: Neisseria meningitidis, sorogrupos A e C; Neisseriameningitidis, imunogenicídade em animais.

• Realizado na Seção de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, S. P* * Do Instituto Adolfo Lutz."** Do Instituto Butantan, São Paulo, S. P.

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SIMONETTI, J,P.; TAKEDA, A.K.; SOERESEN, B.; ZIQUINATTI, O. & BOSCARDIN, N.B. - Ava-liação da resposta ímunoíógtca em animais quando inoculados com Neisseria meningitidis dosgrupos "A" e "C". Rev. Inst. Aâolfo Lutz, 35/36: 91-101, 1975/76.

INTRODUÇÃO

Em virtude do surto epidêmico deN. meningitidis na Grande São Paulo, hou-ve necessidade da obtenção, em grande es-cala, de anti-soros específicos e potentescontra a N.meningitidis dos grupos A e C,para serem utilizados no diagnóstico da in-fecção meningocócíca. Com tal objetivo fo-ram preparados diferentes esquemas deimunização, onde se estudou a variação dacose inoculada 2, 3, 4, 0, 7, 10, bem como aconcentração em bactérias por m12, 3, 4, Ü, 6, 8.

Estudou-se ainda, o comportamento de di-ferentes animais em relação a diferentesvias de inoculação com ou sem adjuvan-te 11,13, sendo observada a imunogenicidadedos antígenos e a permanência da respostaimunológica aos mesmos, quando se utiliza-vam doses booster 2,3,4,5,6,7,9,10, .1 ,li) .

Também foram avaliadas as respostasimunes primária, secundária e tercíáría,bem como a existência ou não de fenôme-nos de tolerância imunológica.

MATERIAL E MÉTODOS1. Bactérias íntegras

Foram usadas cepas dos grupos A e C deN. meningitidis isoladas do líquido cefalor-raquidiano. As culturas foram obtidas emcaldo de M. Hinton, submetidas a agitaçãoconstante, a 37°C, durante 16 a 18 horas e,a seguir, foram tratadas com formaldeídona concentração final de 2% e lavadas trêsvezes por centrifugação em solução fisio-lógica estéril. O sedimento obtido foi res-suspenso em solução fisiológica nas concen-trações de 8,0 x 106 a 3,0 x 109 bactériaspor ml, de acordo com a percentagem detransmítâncía, mostrada na tabela 1:

Foi incluída ainda uma preparação deN. meningitidis viva, também submetida alavagem por centrifugação e, logo a seguir,ressuspensa.

2. Polissacarideos

Foram utilizados polissacarídeos de va-cina antimeningocócica *, grupos A e C, epolissacarídeos extraídos de N. meningitidis,

TABELAConcentrações dos antígenos, inoculados por via intravenosa, nos diferentes

esquemas

Esquemas Antígeno N.de meningitidis

imunização Grupos

A" C

Aa

C

Aa

C

Ab

CA

cC

Ab

C

Número de Icoelh~_

Concen trações

ITransmitãncia"Bact./ coelho Bact./ml

(TI/0

5,6 X 107 8,0 X 106 98

2,5 X 108 3,6 X 107 96

6,3 x 109 9,0 X 108 60

7,9 .. 1O!l 9,0 x lOS 60

8,3 X 109 9,0 X 108 60

2,4 X lU" 352,4 x 1010 e

30 x 109 30

33

32

8

8

3"*3

1

* As percentagens de transmitância (a 650 um) são aproximadas." * Um animal de cada grupo foi inoculado com suspensão de bactérias vivas.• Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories, E.U.A.

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SIMONETTI, J.P.; TAKEDA, A.K.; SOERESEN, B.; ZIQUINATTI, O. & bOSCARDIN, N.B. - Ava-liação da resposta imunológica em animais quando inoculados com Neisseria meningitidis dosgrupos "A" e "C". Rev. Inst. Adoljo Lu.te, 35/36; 91-101, 1975/76.

TABELA 2Esquemas de imunização de coelhos inoculados com N. meningitidis

dos grupos A e C

Esquemas I n o culaçõ e s em m

de l.a Semana I 2.a Semana 3.a Semanaimunização ~-i

l.0 dia 2.° dia 3.0 dia l.0 dia 2.0 dia 3.0 dia I 1.0 dia 2.° dia 3.0 dia----~

Ia 0,25 0,25 0,50 0,50 0,50 1,00 1,00 1,00 2,00b 0,25 0,50 0,50 0,50 1,00 1,00 1,00 2,00 2,00c 0,25 0.50 0.50 1.00 100 1.00 1.00 2.00 2,00

grupos A e C, segundo a técnica de CAR-BONARE et alii 1.

3. Adjuvante

O adjuvante completo de Freund foi pre-parado com 85% de óleo mineral inerte -Nujol; 15% de substância tensioativa - Ar-lacel - e 1 mg/rnl de bacilos da tuberculose(obtidos de B.C.G.).

4. Animais

Quarenta coelhos, pesando 2.500 a3.500 g, foram inoculados com N. meningi-tidis dos grupos A e C, segundo os esque-mas apresentados na tabela 2. Na tabela 1é apresentada a concentração do antígenoutilizado.

Quatro carneiros adultos foram inocu-lados com N. meningitidis dos grupos A eC, segundo o esquema para a l.a série apre-sentada na tabela 3.

o esquema utilizado para a 2.a sériefoi semelhante ao dos coelhos inoculados

com concentração de 9,0 x 108 bactérias porml, havendo alteração na dose de 7,25 ve-zes maior para o antígeno do grupo A e 2,5vezes maior para o do grupo C (tabelas1 e 2).

o esquema utilizado para a 3.a e 4.aséries, tanto para o antígeno do grupo Acomo para o do grupo C, foi 1,8 vezesmaior.

5 . Métodos soro lógicos

Os antígenos polissacarídicos foramdetectados pela reação de imunoeletroforesecruzada (r. C.) em acetato de celulose, efe-tuada segundo a técnica pesquisada porPALHARES et alii 10.

Anticorpos específicos foram determi-nados pela reação de hemaglutinação pas-siva (H. P. ), de acordo com a técnica des-crita por TAKEDA et alii 12, como tambémpela imunoeletroforese cruzada.

TABI;:;LA 3Esquemas de imunização, durante a l.a série de inoculações em carneiros,utilizando como antígeno Neisseria meningitidis, grupos A e C, mortas

Concentração de Bactérias----

Transmi- Itãncia 55 76 80 0* 25 0"*

. % II, ----v;;J~me -

2,0 1,0 2,0 1,0 1,0 i,oi ml !'I'ra.nsmí-

tância 35 75 80 0* 25 0"*%

vorume0,5 1,0 2,0 1,0 1,0 1,0ml

Antígenos N.meningitidis

GRUPO A

Vias

Intravenosae

intradérmicaalternadas

GRUPO C Intravenosa

* 5 ínoculações de papa de bactéria** 2 inoculações de papa de bactéria

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SIMONETTI, J.P.; TAKEDA, A.K.; SOERESEN, B.; ZIQUINATTI, O. & BOSOARDIN, N.B. - Ava-liação da resposta imunológica em animais quando inoculados com Neisseria meningitidis dosgrupos "A" e "O". Rev. Inst. Atlolfo Lute, 35/36; 91-101, 1975/76.

RESULTADOS

1. Avaliação da resposta imunológica doscoelhos

Através da análise das tabelas 4 e 5, po-de-se verificar que:

a) Existe especificidade nas respostasdos coelhos imunizados com N. meningitidisdos grupos A e C.

b) Não há diferenças significativasdos níveis de anticorpos em relação à dose.

c) O políssacarídeo do grupo C nãofoi imunogênico, quando administrado in-travenosamente.

d) Os polissacarídeos dos grupos A eC, quando inoculados com o adjuvantecompleto de Freund, via intradérmíca, pas-sam a ser imunogênicos.

e) A resposta imune a polissacarídeosé mais tardia e os títulos de anticorpos,mais baixos, em relação àquela obtida quan-do se utiliza bactéria íntegra.

f) Os anti-soros obtidos com a bacté-ria íntegra apresentam anticorpos precipi-tantes capazes de detectar até 0,03 ",g/mlde polissacarídeos específicos na reação de

I. C., podendo ser utizados no diagnósticode doença meningocócica no líquido cefa-Iorraquídiano .

TABELA 4

Demonstração da resposta imune dos coelhos inoculados, por via inirauenosa,com diferentes concentrações de Neisseria meningitidis dos grupos A e C

H.P. I.C. PeriodoDose N.o de Antigeno N. Títulos Títulos para

Bactérias/ meningitidisobtenção

coelho coelhos GrupoAc A Ac C Ac A Ac C dos titulos

5,6 X 107 33

AC

2.048 +1.024

----- ----- ---------- ----3 A 2.048

2,5 x 108 2 C-I 024 +. 1 ._-- _

~~09-1 ~ i

11 4.096

7,9 X 10911

----- ----------- -

4.096

-- ---- ------

7,9 X 10911

__________ ------ ----------1------ ----

+8,3 X 10931

_____ ------1--- ---- ----------- ----------

+2,4 X 1010

AC

2.048

4.096

AC

4.096

A (viva)C (viva)

2.048

AC

4.096

AC

H. P. = Hemaglutinação passiva

1. C. = Imunoeletroforese cruzadaAc = Anticorpos antípolíssacarídeos

94

+

+1.024---1----

4.096

+

+

+

+4.096

+ positivonegativo

+

+

+

+

SIMONETTI, J.P.; TAKEDA, A.K.; SOERESEN, B.; ZIQUINATTI, O. & BOSCARDIN, N.B. - Ava-liação da resposta imunológica em animais quando inoculados com Neisseria meningitidis dosgrupos "A" e "C". Rev. Inst. Adolfo Lutz, 35/36: 91-101, 1975/76.

TABELA 5Demonstração da resposta imune dos coelhos inoculados, por via intravenosa ou

via intradérmica, com polissacarídeos dos grupos A e C

Dose em N.O de !AntígenoPo-1 H.P.lissacarídico I Títulosde N.Menin-Iml Coelhos I gitidis AcA AcC

1 Grupo A 32

8,75 Grupo C 256 I

Grupo C i -

H.P.I.C.

Hemaglutinação passivaImunoeletroforese cruzada

Ac Anticorpos antipolissacarídeosA.C.F. = Adjuvante completo de Freund

2. Variação da resposta imunológica dosanimais

A figura 1 mostra a permanência daresposta em coelhos inoculados com N. me-ningitidis dos grupos A e C, via íntraveno-sa, durante duas séries de ínoculações. Po-de-se verificar que:

a) Os anticorpos precipitantes perma-neceram durante um período médio devinte dias, tanto na l.a como na 2.a séries;

b) os anticorpos hemaglutinantes atin-giram um título máximo de 4096,permane-cendo por dez dias; em seguida, verificou-se uma queda a partir do trigésimo diaapós a última inoculação;

c) não houve variação significativa naresposta imune entre as duas séries de ino-culações, como também não houve variaçãoda resposta em relação à concentração debactérias inoculadas por coelho, quandoesta concentração variou de 6,0 x 106 a9,0 x 1()8 bactérias por mI.

A variação da resposta imune à N. me-ningitidis, grupos A e C, durante um perío-do médio de 17 dias, é demonstrada na fi-gura 2:

a) A variação da resposta imunogêni-ca dos coelhos que receberam 3 séries deinoculações foi significativa em relação àprodução de anticorpos hemaglutínantes,sendo que um maior número de coelhosrespondeu na faixa de títulos de anticorposde 512 a 4096;

b) não se conseguiu uma elevação detítulos, tanto na 2.a como na 3.a séries deinoculações;

I.C.Títulos VIA

Período paraobtenção dos

títulos-----!AcC IAcA

I Intradérmica !i com A.C.F. \

-------' I

Intravenosa i60 dias

negativo+ positivo

c) OS antícorpos precipitantes se tor-r.aram mais potentes e específicos, à me-dida que aumentava o número de sériesde inoculações.

A variação da resposta imunológica doscarneiros inoculados com N. meningitidisdos grupos A e C, durante quatro séries, émostrada na figura 3:

a) A dose de antígenos utilizada du-rante a l.a série foi excessiva, uma vez quefoi detectada a presença de antígeno nosoro desses animais e, conseqüentemente,queda brusca no nível de anticorpos;

b) com a redução das doses do antí-geno inoculado, obteve-se uma melhor res-posta, não se detectando antigeno no san-gue circulante desses animais;

c) o título obtido na segunda sériepermaneceu constante por um tempo maior(45 dias);

d) observa-se que as concentraçõesmais baixas utilizadas durante a 3.a e 4.aséries foram responsáveis pela menor flu-tuação dos títulos, com um período maiorde permanência;

e) não houve grande variação nos tí-tulos máximos obtidos nas quatro séries;

f) a permanência dos níveis de anti-corpos hemaglutinantes foi maior para astrês últimas séries, em uma faixa de va-riação no título de 2.048a 16.384;

g) em relação a anticorpos precipitan-tes, conseguiu-se uma resposta melhor nastrês séries subseqüentes, detectando-se até0,03 ",g/ml de polissacarfdeos espeoífícos-

h) Existe uma correlação indireta en-tre o nível de anticorpos hemaglutinantese precipitantes.

95

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4096

2.048

1.024a:'"~ 512~~ 256Q...~ 128

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8 coelhos inoCul"deIo com conc,li/Álrllllilo cio 9,0 • 10""",'Ófi •••'",1 } •...,-:"~.•..:- .. 8 coelhos inoCuladelo c. ,QMc~'raç~o do 9,0 • Ia- baClÓf'as/ml }0-0--0 3 coelhos inoCul_ com concll/lll,.,ç&; di 3,6 • 10' bat'.'i"" ,,,,, Grupo D-<O-i-G 3 coelhos _ul_ com CGIIC~I,açilo .cIo3,6 • 'O' 1>00,1""" Iml G<voo. A

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so•....,•....O:-'•....eo...;j

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Fig.1- Permanência de títulos após a 1.a e 2,a séries de inoculações com suspensão de Neisseria meninçituiis dos grupos A e C,mortas, em diferentes concentrações.

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5 12 19 34 49 6~ ,2"sé,io, 5--';-t Pv.senço de Ac pr!Çpranfes r

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SIMONETTI, J.P.; TAKEDA, A.K.; SOERESEN, B.; ZIQUINATTI, O. & BOSOARDIN, N.B. - Ava-liação da resposta imunológica em animais quando inoculados com Neisseria meningitidis dOEgrupos "A" e "O". Rev. Inst. Adoljo Lutz, 35/36: 91-101, 1975/76.

I~ SERIE 2~ SERIE 3~ SÉRIE

•

• •• o_ ..-000000 _ ..... 0000 .._ ..000'0

•• 00000000000 ••••••••••••••••• 0000000 .18.0 0000

••••••••••• 0000000000 .111 •••••• 00000 •• 000

-OOOOOOOQOO .._- 0000000000000000000000 000

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•• o

• Resposto dos coelhos inoculodos com grupo "o Respoe" _ coelhos inoculados com IIfUl)O C

I~ ,,2':' séries - varioçllo de títulos de IS coelholporo cada grupo de N.mening!tidiI3· série - variação de títuloS de 5 COIJlhotl paro

cada IIfUPO de N. meningllldlf

interveio de tempo entre 011 •• rle •• 30 dlaa

Fig. 2 - Variação de resposta à Neisseria Meningitidis dos grupos A e C durant;um período médio de 17 dias após a última inoculação com diferentesconcentrações.

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SIMONETTI, J.P.; TAKEDA, A.K.; SOERESEN, B.; ZIQUINATTI, O. & BOSCARDIN, N.B. - Ava-liação da resposta imunológica em animais quando inoculados com Neisseria meningitidiS dosgrupos "A" e "C". Rev. Inst. Aâolfo Lu.te, 35/36: 91-101, 1975/76.

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Fig. 3 - Avaliação da resposta imunológica dos dois carneiros inoculados comNeisseria meningitidis dos grupos A e C, durante 4 séries de inocula-ções com diferentes concentrações.

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SIMONETTI, J.P.; TAKEDA, A.K.; SOERESEN, B.; ZIQUINATTI, O. & BOSCARDIN, N.B. - Ava-liação da resposta imunológica em animais quando inoculados com Neisseria meningitidis dosgrupos "A" e "C". Rev. Inst. Aâolfo Lutz, 35/36: 91-101, 1975/76.

DISCUSSÃO E CONCLUSõES

A necessidade da obtenção de grandeQuantidade de anti-soros potentes e especí-ficos, para ser utilizada no diagnóstico deinfecção meningocócica, levou-nos ao estu-do do melhor esquema de imunização, on-de fosse possível determinar o tempo deaparecimento de títulos máximos, comotambém o período de permanência dessestítulos e, ainda, a concentração ideal de an-tígeno inoculado, o qual poderia, em doseelevada, levar a uma toxicidade ou a umaparálise imunológica.

A ausência de produção de anticorposespecíficos a antígenos polissacarídicos pu-rificados quando inoculados por via intra-venosa, mostra a importância da utilizaçãodo adjuvante completo de Freund, utilizan-do a via intradérmica.

A resposta ao antígeno polissacarídiconão purificado, ou seja, associado à bacté-ria na sua forma de origem de acordo comdados apresentados, leva-nos à hipótese daexistência de componentes da constituiçãobacteriana, que viriam a atuar como adju-vantes. Com base nisso, podemos afirmarque antígeno, adjuvante e via de inoculaçãosão interdependentes, dentro de um esque-ma de imunização.

Em várias séries de inoculações emcoelhos e carneiros, observou-se que os tí-tulos máximos obtidos eram sugestivos deuma ausência de resposta secundária, ouque as inoculações subseqüentes utilizadascom o intuito de booster tinham comoefeito a elevação da produção de anticorposaté um determinado título máximo que foiigual para todas as séries de inoculação.

O comportamento dos carneiros (fig. 3)destaca em primeiro plano a discrepanteresposta obtida após a 1.a série de inocula-ções em relação às subseqüentes séries,

uma vez que os títulos de anticorpos íní-cialmente obtidos tiveram variações acen-tuadas, alcançando um título máximo compequeno período de permanência e uma rá-pida queda subseqüente. Tendo-se detecta-do antígeno no soro desses animais, pro-vavelmente inoculado em dose elevada, osanticorpos produzidos teriam sido neutrali-zados por esses antígenos, impedindo a de-tecção in vitro, dada a formação e metabo-lízação deste complexo antígeno.antícorpo,Também não foi verificada resposta secun-dária, uma vez que as doses de booster fun-cionaram apenas para a elevação de títulosaté um máximo constante para todas asséries de inoculações.

Com a observação da permanência detítulos de anticorpos após a 2.a, 3.a e 4.aséries de inoculações, onde foram utiliza-das concentrações menores de antígenos,podem-se estabelecer esquemas quase queideais para uma boa imunização, se bemque não definitivos, uma vez que o animalfoi pré-imunizado (1.a série).

Os anticorpos do tipo precipitante tam-bém apareceram em concentrações maio-res, de acordo com a progressão das séries,levando-nos a concluir que o aparecimentodos mesmos depende de um número maiorde estímulos ou de selecionamente de célu-las ímunocompetentes, com maior especifi-cidade.

Os anti-soros obtidos para a N. menin-gitidis do grupo A eram todos específicos,enquanto que o mesmo não ocorreu coma N. meningitidis do grupo C. Este fatopoderia ser explicado se levarmos em contaserem as N. meningitidis dos grupos A e Cportadoras de um determinante antigênicocomum o qual, no grupo A, não seria imu-nodominante, ou estaria antigenicamentemascarado. Esta reação cruzada pôde serfacilmente contornada absorvendo-se os so-ros com políssacarídeos ou bactérias degrupos específicos.

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SlMONETTl, J.P.; TAKEDA, A.K.; SOERESEN, B.; ZlQUINATTl, O.& BOSCARDIN, N. B. - Evaluation of the immune response of aní-mals inoculated with serogroups A and C Neisseria meningitidis.Rev. Inst. Aâotto Lutz, 35/36: 91-101,1975/76.

SUMMARY: In order to study the immune response to serogroupsA and C N. meningitidis the author inoculated 40 rabbits and 4 sheepswith live and dead bacteria as well as with specific A and C polysaccha-rides, with and without adjuvants in different doses and by differentinoculation vias. SeveraI series of inoculation were carried out in orderto verify the booster response. The leveI of the antibodies and theirpermanence in the serum was measured through passive haemaggluti-nation and counter-immunoelectrophoresis. The same techinic was usedto detect the polysaccharide antigens of N. meningitidis in these sera.

The analysis of the results obtained indicated that there is no díffe-rence in the immune responses at concentrations varying from 5,6 x 107to 2,4 X 1010 bacteria per rabbit. Both haemagglutínatíng and precipitat-ing antíbodíes appeared five days after the last inoculation and remam-ed for an average period of twenty five days. There was no significantdifferences between primary, secondary and tertiary responses yet theprecipitating antibodies appeared in heavier concentrations after íno-culation of the sucessives series. When inoculated intravenously thepo-lisaccharides did not induoe immune response but they became ímmuno-genic when injected intradermically whith complete Freund adjuvant.

DESCRlPTORS: Neisseria meningitidis, serogroups A and C; Neis-seria meningitidis, immunogenicity in animals.

REFERÊ:NCIASBIBLIOGRÁFICAS

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Recebido para publicação em 2 de outubro de 1975

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