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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇAO EM DOENÇAS INFECCIOSAS
CAMILA GIUBERTI DE SOUZA
AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DE DIFERENTES TESTES DIAGNÓSTICOS PARA A DENGUE
VITÓRIA
2012
1
CAMILA GIUBERTI DE SOUZA
AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DE DIFERENTES TESTES
DIAGNÓSTICOS PARA A DENGUE
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Doenças Infecciosas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Doenças Infecciosas.
Orientador: Dr. Reynaldo Dietze Co-orientadora: Dra. Elenice Moreira Lemos
VITÓRIA
2012
2
Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP)
(Biblioteca Central da Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)
Souza, Camila Giuberti de, 1984-
S729a Avaliação da sensibilidade de diferentes testes diagnósticos
para a dengue / Camila Giuberti de Souza. – 2012.
70 f. : il.
Orientador: Reynaldo Dietze.
Coorientadora: Elenice Moreira Lemos.
Dissertação (Mestrado em Doenças Infecciosas) –
Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências da
Saúde.
1. Dengue - Diagnóstico. 2. Teste imunoenzimático. I. Dietze,
Reynaldo. II.Lemos, Elenice Moreira. III. Universidade Federal
do Espírito Santo. Centro de Ciências da Saúde. IV. Título.
CDU: 61
3
4
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Reynaldo Dietze pelo incentivo e pela confiança depositada durante a
execução deste projeto. Obrigada por participar da minha formação como
pesquisadora.
À Dra. Elenice Moreira Lemos pelo acompanhamento diário, conhecimento
transmitido e pelas sugestões.
À Dra. Rita Maria Nogueira, do Laboratório de Flavivírus da Fiocruz, por me receber
em seu laboratório, e à Simone Sampaio pela disponibilidade.
Aos amigos, e colegas de mestrado, Lorenzzo Stringari, Ronaldo Bragança e Aline
Lyra pela agradável convivência; pelo apoio e, certamente, pela simples e tão rara
amizade verdadeira.
Aos colegas de laboratório Marco André Tonini, Mariela Piccin e Lygia Herkenhoff,
pela colaboração nas diversas fases de execução deste projeto.
Aos colegas do Laboratório de Leishmaniose e de Dengue, Juliana, Jauber, Renata,
Priscila, Nayana, Laura, Kamila, Giuliana e Aline pela ajuda, troca de idéias e por
cada momento compartilhado.
A todos os colegas da Pós Graduação em Doenças Infecciosas e à toda equipe do
NDI pelas experiências partilhadas, pela ajuda e pela agradável convivência diária.
Aos Professores desta Pós Graduação pela imensa contribuição intelectual.
A todos os funcionários do NDI pela atenção e disponibilidade sempre que
necessário.
Aos laboratórios Bioeasy, Bio-Rad e Inbios pelo fornecimento dos testes.
Ao Laboratório Central da Prefeitura de Vitória pela execução de parte dos testes.
5
Ao LACEN/ES pelo fornecimento dos controles positivos.
À CAPES e ao NDI pelo apoio financeiro.
Aos meus amigos, por participarem de mais esta etapa da minha vida, pelo carinho
e pela sincera torcida para o meu sucesso.
A Rafael, pelo apoio incondicional para meu crescimento profissional.
À minha família, pelo apoio e confiança no meu sucesso.
6
“O começo de todas as ciências é o espanto de as coisas serem o que são.”
Aristóteles
7
RESUMO
Atualmente, a Organização Mundial da Saúde considera a dengue como a mais
importante doença viral transmitida por mosquitos e estima em 50 milhões o número
de novas infecções a cada ano no mundo. A expansão mundial dessa doença e a
demanda por testes diagnósticos rápidos, específicos e de execução simples,
aumentaram o número de novos testes disponíveis no mercado. Sabe-se que, para
uma melhor utilização dessas ferramentas, é fundamental sua avaliação nos
diversos cenários clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. Este trabalho teve por
objetivo avaliar sete testes laboratoriais para o diagnóstico de dengue. As
sensibilidades encontradas para os testes imunocromatográficos baseados na
detecção de NS1 encontradas foram: 24,5% [16,2-34,4] para o Dengue Duo
(Bioeasy) e 29,8% [20,8-40,1] Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad). Para os testes
ELISA NS1 as sensibilidades encontradas foram 43,6% [33,4-54,2] para Dengue
NS1 ELISA Test (Bioeasy), e 54,3% [43,7-64,6] para PlateliaTM Dengue NS1 Ag-
ELISA (BioRad). O teste NS1 que apresentou maior sensibilidade na fase aguda da
doença foi o PlateliaTM (54,3%). Para todos os testes NS1 observou-se maior
sensibilidade para o sorotipo 1 quando comparado com os demais sorotipos e, para
o PlateliaTM, a presença de IgG influenciou negativamente na sensibilidade do teste.
As sensibilidades dos testes para anticorpos IgM, variaram entre 27,1% [15,3-41,9] a
52,1% [37,2-66,7] em amostra de fase aguda, e 72,9% [53,8-81,3] a 97,9% [88,9-
99,9] em fase convalescente. Todos os testes IgM apresentaram sensibilidades
superiores em amostras de fase convalescente. Dentre todos os testes avaliados, o
Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy) em amostra de fase convalescente foi o que
apresentou o melhor desempenho. Em amostra de fase aguda, o melhor
desempenho foi obtido quando combinamos os testes PlateliaTM Dengue NS1 Ag-
ELISA (BioRad) e Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy) (76,6% [66,7-84,7]). Os
resultados sugerem que testes de detecção de NS1 podem exibir sensibilidades
diferentes, de acordo com o sorotipo viral e com a presença de anticorpos IgG.
Além disso, nossos resultados reforçam o fato de que os estudos de avaliação de
testes diagnósticos para a dengue e sua utilização devem levar em consideração o
perfil epidemiológico da população.
Palavras-chave: Dengue. Diagnóstico. Sensibilidade. ELISA. Teste imunocromatográfico.
8
ABSTRACT Currently, the World Health Organization considers dengue the most important viral
disease transmitted by mosquitoes and it is estimated that 50 million new infections
occur each year worldwide. The global spread of dengue and the demand for rapid,
specific and easy to perform diagnostic tests has increased the marketing of new
tests. For a better use of these tools it is essential to evaluate them in different
clinical, epidemiological and laboratory settings. The aim of this study was to
evaluate the sensitivity of seven laboratory tests for dengue diagnosis. The
sensitivities for the NS1 immunochromatographic tests were: 24,5% [16,2 to 34,4] for
Dengue Duo (Bioeasy) and 29,8% [20,8 to 40,1] for Dengue NS1 Ag strip (Bio-Rad).
The sensitivities of the NS1 ELISA tests were: 43,6% for Dengue NS1 ELISA Test
(Bioeasy) [33,4 to 54,2] and 54,3% [43,7 to 64,6] for PlateliaTM Dengue NS1 Ag-
ELISA (BioRad). The NS1 test that demonstrated greatest sensitivity in acute phase
samples was PlateliaTM (54,3%). For all NS1 tests greater sensitivity was observed
for serotype 1, when compared to the others serotypes. The sensitivity of PlateliaTM
(BioRad) was negatively influenced by the presence of IgG. The sensitivity of the
ELISA IgM tests ranged from: 27,1% [15,3 to 41,9] to 52,1% [37,2 to 66,7] in acute
phase samples and from 72,9% [53,8 to 81,3] to 97,9% [88,9 to 99,9] in convalescent
phase samples. Among all the tests evaluated, Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy), in
convalescent phase samples, showed the best performance. The sensitivity in acute
phase samples was 76,6% [66,7 to 84,7] when Dengue NS1 Ag test PlateliaTM ELISA
(BioRad) and Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy) were combined. Our results suggest
that NS1 tests may have different sensitivities, according to the viral serotypes, and
in the presence of IgG antibodies. Furthermore, our results emphasize that the
epidemiological profile of the population must be considered in the use and
evaluation of dengue diagnostic tests.
Key words: Dengue. Diagnosis. Sensitivity. ELISA. Immunochromatographic test.
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação do genoma do vírus Dengue. O genoma viral codifica 3 proteínas estruturais (capsídeo (C), membrana (M) e envelope (E)) e sete não proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) …….……………………………….
20
Figura 2. Teste imunocromatográfico Dengue Duo (Bioeasy) apresentando resultado negativo para detecção de NS1 e de anticorpos IgM e IgG.....................................................................................................
40
Figura 3. Teste imunocromatográfico Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad)........... 41
Figura 4. Gel de agarose dos produtos da etapa semi-nested. Coluna 1 e 2: controle DENV-2. Colunas 3 e 4: controle DENV-3. Coluna 5: branco. Coluna 6: peso molecular (100pb). Coluna 7: controle 1. Colunas 8 a 14: amostras de pacientes...........................................................................................
47
10
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Notificações por dengue de acordo com as semanas epidemiológicas em 2009 nos Municípios de Vitoria, Serra e Vila Velha ..............................................................................................
34
Gráfico 2. Notificações por dengue durante as semanas epidemiológicas do ano de 2010 no Município de Vitória .............................................
35
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Iniciadores utilizados para a tipagem do vírus Dengue..................
38
Tabela 2. Dados demográficos e clínicos dos 158 sujeitos incluídos no estudo.............................................................................................
46
Tabela 3. Sensibilidade dos testes imunocromatográficos Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica) e Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories) em 94 amostras de soro positivas para Dengue......
48
Tabela 4. Sensibilidade dos testes ELISA para detecção de NS1: Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) e Platelia™ Dengue NS1 Ag-ELISA (Biorad Laboratories) em 94 amostras de soro positivas para Dengue....................................................................
49
Tabela 5. Sensibilidade dos testes Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica), Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories), Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) e Platelia™ Dengue NS1 Ag-ELISA (Biorad Laboratories), de acordo com a presença de IgG, em 94 amostras de soro positivas para Dengue..........................
50
Tabela 6. Sensibilidade dos testes Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica), Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories), Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) e Platelia™ Dengue NS1 Ag-ELISA (Biorad Laboratories), de acordo com o sorotipo viral.........
51
Tabela 7. Sensibilidade dos testes ELISA para detecção de anticorpos IgM em 48 amostras pareadas (fase aguda e convalescente)...........
52
Tabela 8.
Sensibilidade do teste Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica) e da combinação dos testes Platelia™ Dengue NS1 Ag ELISA (Biorad Laboratories) e Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) em 94 amostras de fase aguda.................................
52
Tabela 9. Sensibilidade dos testes Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica), DENV Detect IgM (MAC ELISA) (Inbios International) e Dengue IgM Capture ELISA (PanBio) em 48 amostras de fase convalescente de acordo com a presença de IgG em fase aguda.........................................................................
53
12
LISTA DE SIGLAS
ADE: facilitação dependente de anticorpos (antibody dependent enhancement)
cDNA: DNA complementar
CF: Fixação do complemento
Dengue RA: antígeno Dengue recombinante
DENV-1: vírus Dengue sorotipo 1
DENV-2: vírus Dengue sorotipo 2
DENV-3: vírus Dengue sorotipo 3
DENV-4: vírus Dengue sorotipo 4
DENV: vírus Dengue
ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
FD: Febre do Dengue
FHD: Febre Hemorrágica do Dengue
HI: Inibição da hemaglutinação
HRP: Horseradish peroxidase
IgA: Imunoglobulina A
IgG: Imunoglobulina G
IgM: Imunoglobulina M
INF: interferon
IL-8: interleucina 8
LACEN/ES: Laboratório Central de Saúde Pública do Espírito Santo
MAC-ELISA: ELISA de captura de IgM
MTase: metiltransferase
NCA: antígeno celular normal
NS1: proteína não estrutural 1
NS2: proteína não estrutural 2
NS3: proteína não estrutural 3
NS4: proteína não estrutural 4
NS5: proteína não estrutural 5
OMS: Organização Mundial da Saúde
HLA: antígeno leucocitário humano (Human Leukocyte Antigen) PRNT: Teste de Neutralização em Placa (Plaque Reduction Neutralization Test)
RNA: ácido ribonucleico
13
RT-PCR: Reação em Cadeia da Polimerase (Reverse Transcriptase Polimerase
Chain Reaction)
SCD: Síndrome do Choque do Dengue
SESA: Secretaria de Estado da Saúde
TMB: tetrametilbenzidina
14
SUMÁRIO
1 REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................................. 16
1.1 Epidemiologia e Histórico .......................................................................... 16
1.2 O Vírus Dengue ............................................................................................ 20
1.2.1 Proteínas Estruturais ............................................................................... 21
1.2.2 Proteínas não estruturais ......................................................................... 21
1.3 Patogênese da Dengue e Resposta Imune ............................................... 22
1.4 Manifestações Clínicas ............................................................................... 24
1.5 Métodos Diagnósticos ................................................................................ 25
1.5.1 Isolamento Viral ....................................................................................... 26
1.5.2 RT-PCR (convencional e real time) ......................................................... 26
1.5.3 Detecção de antígeno NS1 ...................................................................... 27
1.5.4 Detecção de Anticorpos ........................................................................... 28
2 JUSTIFICATIVA .................................................................................................. 31
3 OBJETIVOS ........................................................................................................ 32
4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 33
4.1 Desenho do Estudo ..................................................................................... 33
4.2 Aspectos Éticos ........................................................................................... 33
4.3 Obtenção de amostras ................................................................................ 33
4.3.1 Pacientes ................................................................................................. 33
4.3.1.1 Critérios de Inclusão ........................................................................... 36
4.4 Caracterização das amostras positivas e do sorotipo infectante .......... 36
4.4.1 RT-PCR ................................................................................................... 37
4.4.1.1 Extração do RNA ................................................................................ 37
4.4.1.2 Síntese do cDNA ................................................................................ 37
4.4.1.3 Amplificação do DNA .......................................................................... 37
4.4.1.4 Tipagem do vírus Dengue (Semi Nested) .......................................... 38
4.5 Testes Diagnósticos .................................................................................... 39
4.5.1 Testes de detecção de NS1 .................................................................... 39
4.5.1.1 Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica) ................................................... 39
4.5.1.2 Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories) .................................... 40
4.5.1.3 Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) ....................................
15
4.5.1.4 PlateliaTM Dengue NS1 Ag-ELISA (Bio-Rad Laboratories) ................ 41
4.5.2 Testes de detecção de anticorpos IgM .................................................... 42
4.5.2.1 Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) ................................. 42
4.5.2.2 DENV Detect TM IgM Antibody Capture ELISA (MAC ELISA) (Inbios
International) ................................................................................................... 43
4.5.2.3 Dengue IgM Capture ELISA (PanBio) ................................................ 43
4.6 Pesquisa de anticorpos IgG ....................................................................... 44
4.6.1 Dengue IgG ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) ...................................... 45
4.7 Análise Estatística ....................................................................................... 45
5 RESULTADOS .................................................................................................... 46
5.1 Obtenção de amostras de soro .................................................................. 46
5.2 Amostras positivas para Dengue ............................................................... 47
5.3 Avaliação da sensibilidade dos testes diagnósticos ............................... 48
5.3.1 Testes para detecção de NS1 ................................................................. 48
5.3.1.1 Presença de anticorpos IgG x sensibilidade dos testes NS1 ............. 49
5.3.1.2 Sorotipo infectante x sensibilidade dos testes NS1 ........................... 50
5.3.2 Testes para detecção de anticorpos IgM ................................................. 51
5.3.2.1 Presença de anticorpos IgG x sensibilidade dos testes IgM .............. 52
5.3.3 Combinação de testes NS1 e IgM ........................................................... 53
6 DISCUSSÃO ....................................................................................................... 54
7 CONCLUSÕES ................................................................................................... 59
8 REFERÊNCIAS ................................................................................................... 60
APÊNDICE ................................................................................................................ 69
APÊNDICE A – Termo de Consentimento ......................................................... 69
APÊNDICE B – Ficha Clínica .............................................................................. 70
16
1 REFERENCIAL TEÓRICO
1.1 Epidemiologia e Histórico
A febre do Dengue/Febre Hemorrágica do Dengue é uma doença febril aguda,
transmitida por mosquitos do gênero Aedes e causada por um dos quatro sorotipos
do vírus Dengue (DENV-1, 2, 3, e 4). O Dengue possui ampla distribuição mundial,
com predominância em regiões tropicais e subtropicais, determinada pela
distribuição do seu principal vetor, o Aedes aegypti. A doença é mais prevalente em
áreas urbanas e suburbanas, e nas últimas décadas, tornou-se um grave problema
de saúde pública mundial. Atualmente, a Organização Mundial da Saúde considera
a dengue como a mais importante doença viral transmitida por mosquitos e estima-
se que 50 milhões de novas infecções ocorram a cada ano no mundo. Nos últimos
50 anos, sua incidência aumentou 30 vezes e hoje aproximadamente dois terços da
população mundial encontram-se sob o risco de adquirir a doença (WHO, 2009).
Nas Américas, o Cone Sul, representado por Argentina, Brasil, Chile, Paraguai e
Uruguai, é responsável por mais da metade das notificações da doença desde a
década de 90, sendo o Brasil responsável por 63% desses casos desde 2000 (San
Martin et al., 2010).
Existem registros, datados do ano 992, de descrições clínicas de uma síndrome
febril similar à febre do dengue, na China (Kyle; Harris, 2008). No final do século
XVIII epidemias de uma doença com manifestações semelhantes também foram
descritas quase simultaneamente em Jakarta (Indonésia), Cairo (Egito) e na
Filadélfia (EUA) (Gubler et al., 2007).
Até próximo da virada do século XX pouco era sabido sobre a etiologia e a
transmissão da doença. Sua etiologia viral foi sugerida experimentalmente no início
do século XX, em estudos conduzidos por militares norte americanos em regiões de
conflito, onde a doença era um grande problema não só de saúde pública mas
também militar. Esses experimentos foram motivados pelo sucesso de estudos
anteriores sobre a etiologia e epidemiologia da febre amarela, realizados por Walter
Reed em Cuba, e foram conduzidos por dois jovens militares do corpo de saúde do
17
exército americano: o capitão P.M. Ashburn e o tenente Charles F. Craig. Enviados
às Filipinas para estudar a doença, os militares iniciaram as investigações através
de uma série de experimentos envolvendo voluntários do exército dos EUA. Durante
os estudos, no verão de 1906, correu uma epidemia de FD no Forte William
McKinley, onde foram registrados 800 casos da doença, dos quais eles conseguiram
estudar 128. Baseados no estudo destes casos, os pesquisadores concluíram que:
a doença era causada por um agente não filtrável, que mais tarde confirmou-se ser
um vírus; que os parâmetros hematológicos dos doentes eram normais à exceção
de leucopenia; que alguns indivíduos não se infectavam, sugerindo a presença de
imunidade; que o período de incubação era de 3,5 dias, em média, e que a doença
não era contagiosa. Ashburn e Craig tentaram também comprovar a hipótese de
transmissão vetorial por mosquitos, cogitada à época por outros pesquisadores,
expondo quatro voluntários a mosquitos alimentados previamente em pacientes com
a doença. Os pesquisadores concluíram que os seus resultados reforçavam a
hipótese de transmissão vetorial, apesar da ausência de evidencia científica do
experimento, uma vez que utilizaram a espécie vetora errada (Culex fatigans
atualmente Culex quinquefasciatus) além de um curto período de incubação
extrínseca – apenas um dia (Ashburn; Craig 2004).
Os avanços tecnológicos ocorridos durante a II Guerra Mundial permitiram que
pesquisadores japoneses, Kimura e Hotta, e americanos, Sabin e Shlesinger,
isolassem pela primeira vez os sorotipos DENV-1 e DENV-2 (Kimura; Hotta, 1944;
Sabin; Schlesinger, 1945). Mais tarde, a existência destes dois sorotipos foi
confirmada através de testes de inibição da hemaglutinação e de estudos sobre
proteção cruzada em voluntários (Sabin, 1952). Os sorotipos 3 e 4 foram isolados
posteriormente, em 1956 nas Filipinas (Hammon et al., 1960). A partir desta época,
surgiram iniciativas para o desenvolvimento não só de uma vacina para a doença
como testes laboratoriais para o seu diagnóstico (Sabin,1952).
Também foi a partir da Segunda Guerra Mundial que a expansão geográfica da
doença tomou impulso, causado principalmente pela modernização dos meios de
transportes e, mais recentemente, pelo crescimento urbano desordenado,
disseminando assim o vírus e o vetor para novas regiões. O resultado foi um
dramático aumento da frequência e da magnitude das epidemias, tornando a doença
18
hiperendêmica na maioria dos centros urbanos do mundo. No sudeste asiático
surgiram as primeiras epidemias de casos graves da doença, febre hemorrágica do
Dengue (FHD), registrados em Manila, em 1956 (Hammon et al., 1960). A
implementação de programas de erradicação do Ae. aegypti a partir da década de
20, permitiu a eliminação do vetor na maioria dos países da América Central e do
Sul. Apesar de ter sido incialmente uma campanha de sucesso, a partir da década
de 50 não foi possível manter a vigilância entomológica e a estrutura de combate ao
vetor em vários países. O resultado foi a reintrodução do vetor em diversos países
do continente e a ocorrência de novas epidemias que evoluíram para epidemias de
FHD nas décadas de 80 e 90 (Pinheiro; Corber,1997; Rigau-Perez et al., 1998).
No Brasil os primeiros relatos de epidemias de dengue datam do século XIX (Rego,
1872; Reis, 1896; Pedro, 1923), porém os primeiros casos confirmados através de
isolamento viral, ocorreram em 1981 em Boa Vista, Roraima, onde foram
identificados os sorotipos 1 e 4 (Osanai et al., 1983). Esta epidemia ficou restrita ao
norte do país e somente após cinco anos, em 1986, o sorotipo 1 disseminou-se pelo
território nacional a partir de sua introdução no Rio de Janeiro (Teixeira et al., 2005).
Registros da doença causados pelo sorotipo 4 só ocorreriam duas décadas após,
em Manaus (Figueiredo et al., 2008).
Provavelmente, a razão para a ausência de surtos de dengue no Brasil entre a
década de 20 e 80 deve-se a campanha de erradicação do Aedes aegipty no país,
que se iniciou a partir de 1902 com Osvaldo Cruz lutando contra a febre amarela. A
partir de 1930, com apoio da Fundação Rockefeller, a campanha de erradição do
vetor foi intensificada. Em 1947, a Organização Pan Americana da Saúde e a
Organização Mundial da Saúde decidiram coordenar a erradicação do Ae. aegypti
no continente. O Brasil participou dessa campanha e teve êxito. Em 1976,
entretanto, o Ae. aegypti retornou ao Brasil em função de falhas na vigilância
epidemiológica e de mudanças sociais e ambientais decorrentes da urbanização
acelerada dessa época. Foram confirmadas reinfestações, e desde então, o
Ministério da Saúde tem implementado programas de controle (Braga e Valle, 2007).
Em 1990 o sorotipo 2 surgiu no Rio de Janeiro, produzindo uma grande epidemia no
estado que se espalhou rapidamente para a região sudeste. No ano de 1998 a
19
epidemia adquiriu grandes proporções com aumento exponencial do número de
casos chegando a 500.000 notificações. Uma grande expansão territorial da
circulação viral foi caracterizada neste período. Em 1999 houve um importante
declínio da incidência, possivelmente devido a redução do número de indivíduos
susceptíveis aos sorotipos circulantes nas áreas afetadas e, de certo modo, também
a medidas de controle vetorial adotadas. Entretanto, a dengue se espalhou para
outras áreas do país, especialmente a região Norte, que nos anos seguintes
demonstrou as mais altas incidências (Teixeira et al., 2005).
No final de 2000 foi confirmado pela primeira vez no Brasil o isolamento do sorotipo
3 na cidade do Rio de Janeiro, que vivenciou uma grande epidemia em janeiro de
2001. Isso se repetiu nos dois anos subsequentes, expandindo-se em seguida para
inúmeras cidades de pequeno porte e estados da região Sul, considerados até então
livres da doença (Teixeira, et al. 2005).
Em 2008 o sorotipo 4 ressurgiu em Manaus, após um hiato de 22 anos (Figueiredo
et al., 2008). Em Julho de 2010, ele reemergiu em Boa Vista, Roraima (Temporão et
al., 2011), tendo sido detectado até o momento em todas a regiões do Brasil à
exceção da região centro oeste (SVS-MSb).
No Espírito Santo, a primeira epidemia de dengue ocorreu em 1995 e foi causada
pelo sorotipo 2. Desde então as epidemias se sucederam, sendo a de maior vulto a
de 1998, causada pelo sorotipo 1, com 39.216 casos notificados. O sorotipo 3 foi
introduzido em 2000 causando importantes epidemias até 2003. A partir 2009 o
sorotipo 1 voltou a recircular, sendo o responsável por grande parte dos casos
notificados nos anos subsequentes (SVS-MSa). Em abril de 2012 os primeiros
casos autóctones do sorotipo 4 foram descritos na região metropolitana de Vitória
(comunicação pessoal LACEN/ES)
20
1.2 O Vírus Dengue
Os vírus Dengue (DENV) compreendem quatro sorotipos distintos: DENV-1, 2, 3 e 4,
e em cada sorotipo são descritos genotipos distintos: cinco no DENV-1, cinco no
DENV-2, quatro no DENV-3 e quatro no DENV-4 (Weaver; Vasilakis, 2009). Esses
vírus pertencem à família Flaviviridae, do latim "flavus” que significa “amarelo”, em
referência ao vírus da Febre Amarela. Nessa família ainda estão incluídos outros
vírus como: o vírus do Oeste do Nilo (WNV) e o vírus da Encefalite Japonesa (JEV).
Os Flavivirus são envelopados com aproximadamente 50nm de diâmetro,
compostos por uma bicamada lipídica com glicoproteínas de envelope (E)
circundando o nucleocapsídeo, que é formado por uma fita simples de RNA de
polaridade positiva, complexada com múltiplas cópias de uma proteína de capsídeo
(C). O genoma viral possui aproximadamente 11.000 pares de base e sua tradução
produz uma única e longa poliproteína de mais de 3.000 aminoácidos. Uma
combinação de proteases celulares e virais cliva essa poliproteína produzindo dez
proteínas: três estruturais e sete não estruturais (Gubler et al., 2007).
Figura 1 – Representação do genoma do vírus Dengue. O genoma viral codifica 3 proteínas
estruturais (capsídeo (C), membrana (M) e envelope (E)) e sete não proteínas não estruturais
(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e N55). UTR = Região não traduzida Fonte:
Fonte: Guzman et al., 2010a
21
1.2.1 Proteínas Estruturais
O genoma dos vírus Dengue codifica três proteínas estruturais: capsídeo (C),
membrana (M) e envelope (E). A glicoproteína de envelope (E) possui
aproximadamente 53kDa e é a principal proteína da superfície do vírion, medeia a
ligação aos receptores, promove a fusão da membrana e é o maior determinante
antigênico nas partículas virais. A proteína C é o primeiro polipeptídeo viral a ser
sintetizado durante a tradução. É uma proteína de aproximadamente 11kDa,
altamente básica, o que lhe permite interagir com o RNA viral (Henchal;
Putnak,1990). A proteína de membrana (M) possui uma proteína precursora (PrM)
que é clivada por proteases do complexo de Golgi. Sua principal função é impedir
que a proteína E sofra rearranjo durante a conversão de partículas virais imaturas
em vírions maduros. A proteína PrM pode também elicitar a resposta de anticorpos
neutralizantes (Kaufman et al., 1989; Falconar,1999; Vazquez et al., 2002)
1.2.2 Proteínas não estruturais
Além das três proteínas estruturais previamente descritas, o genoma do vírus
dengue produz sete proteínas não estruturais: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A,
NS4B e N55. A glicoproteína NS1 possui aproximadamente 50kDa e é expressa
pelas células infectadas de mamíferos sob duas formas: a forma associada à
membrana (mNS1) e a secretada (sNS1) (Flamand et al., 1999). A NS1 secretada
pode ativar diretamente fatores do sistema complemento e parece ter importância na
progressão da doença (Kurosu et al., 2007). Demonstrou-se que a NS1 está
presente em altas concentrações no soro de pacientes infectados pelo vírus Dengue
no início da infecção (Young et al., 2000), o que possibilitou sua utilização em testes
diagnósticos na fase aguda da doença.
A proteína NS2A é hidrofóbica e relativamente pequena (22kDa) atuando
provavelmente na replicação do RNA e montagem viral. A NS2B é uma proteína
pequena, de aproximadamente 14kDa, associada à membrana. NS2B forma um
complexo estável com NS3 e atua como cofator da serino proteinase NS2B-NS3.
22
A NS3 é uma proteína grande (aproximadamente 70kDa) multifuncional contendo
funções helicase e protease, necessárias para o processamento da poliproteína e
replicação do RNA (Harris et al., 2006).
A proteína NS4A tem sido relacionada à alteração das membranas intracelulares do
hospedeiro mas este mecanismo ainda é desconhecido (Miller et al., 2007).
A NS4B tem papel na replicação viral inibindo a sinalização de interferon (INF),
sugerindo importância na patogênese da doença. NS4A e, em menor grau, NS2A
parecem também bloquear a sinalização de INF (Munoz-Jordan et al., 2003).
A NS5 é uma proteína grande (104kDa), altamente conservada entre os sorotipos do
DENV, com atividades metiltransferase (MTase) e RNA polimerase RNA-
dependente. Outros papéis da NS5, além da participação na replicação viral tem
sido levantados como p.ex. a indução da produção de IL-8, que contribui para a
disseminação viral através do recrutamento de células inflamatórias para o local da
infecção (Medin et al., 2005).
1.3 Patogênese da Dengue e Resposta Imune
O vírus Dengue é transmitido pela picada de mosquitos fêmeas do gênero Aedes,
principalmente Aedes aegypti. Após a inoculação, o vírus infecta as células
dendríticas da pele e queratinócitos. As células dendríticas infectadas migram do
sítio de infecção para os linfonodos, onde monócitos e macrófagos são recrutados e
se tornam alvos de infecção. Consequentemente, a infecção é amplificada com a
disseminação do vírus, atingindo diversas células da linhagem mononuclear, que
passam a produzir mediadores envolvidos na resposta inflamatória e hemostática do
hospedeiro (Martina et al., 2009).
Quanto à resposta imune adaptativa do hospedeiro, dois padrões podem ser
observados nas infeções pelo Dengue: a) a de indivíduos primo infectados, e
portanto sem anticorpos prévios – o que denomina-se infecção primária – e b) a de
23
indivíduos que possuem anticorpos prévios, provenientes de uma infecção anterior
por um sorotipo distinto – denominada infecção secundária.
A primeira situação (a) é caracterizada por um aumento gradativo e lento dos níveis
de anticorpos específicos. Os anticorpos IgM são o primeiro isotipo a aparecer e
tornam-se detectáveis, na grande maioria dos pacientes, entre o sétimo e décimo dia
após o início dos sintomas. Os níveis desses anticorpos atingem o pico
aproximadamente duas semanas após do início dos sintomas, permanecendo
detectáveis pelos próximos dois a três meses. Os anticorpos IgG geralmente surgem
no final da primeira semana de doença e permanecem detectáveis por anos e
possivelmente pelo resto da vida (Chanama et al., 2004; Schilling et al., 2004).
Na segunda situação (b), quando o indivíduo já teve infecção prévia por um sorotipo
diferente, os títulos de anticorpos IgG aumentam rapidamente. A resposta de
anticorpos IgM é geralmente mais lenta, menor, podendo até ser não detectável, e
persiste por um período mais curto do que nas infecções primárias. Nas infecções
secundárias os anticorpos IgG predominam, podendo ser detectados já nos
primeiros dias da doença (Schilling et al., 2004; Gubler et al., 2007).
Os anticorpos do tipo IgA também estão presentes na dengue e sua meia vida de
detecção é similar à da IgM (Groen et al., 1999).
A resposta imune adaptativa ao DENV contribui para a resolução da infecção e
desempenha papel de proteção duradoura contra uma nova infecção pelo mesmo
sorotipo, e proteção cruzada temporária, de aproximadamente dois meses, para os
outros sorotipos (Sabin,1952). Por outro lado, estes anticorpos podem contribuir
para o desenvolvimento de formas graves da doença. Halstead et al. mostraram
que uma nova infecção, em indivíduos com anticorpos prévios contra um sorotipo
distinto, aumenta o risco de desenvolvimento de FHD, fenômeno que denominaram
de ADE (antibody dependent enhancement) (Halstead et al., 1970; Halstead et al,.
1973; Halstead; O'Rourke, 1977a; Halstead; O'Rourke,1977b). Estes anticorpos
preexistentes em níveis subneutralizantes, se ligariam ao vírus, formando um
complexo antígeno-anticorpo, que por sua vez se ligaria a membranas dos
leucócitos, especialmente macrófagos, através de receptores Fc, facilitando a
internalização dos vírus na célula com consequente aumento da replicação viral.
24
Esta teoria explicaria também o risco aumentado de FHD em crianças até o primeiro
ano de vida, nascidos de mães com infecções prévias por um sorotipo distinto
(Sangkawibha et al., 1984; Kliks et al., 1988).
A patogênese da infecção pelos vírus do Dengue e principalmente os fatores
determinantes para o desenvolvimento da FHD e Síndrome do Choque do Dengue
(SCD) ainda não estão completamente elucidados. Algumas linhas de pesquisa
incluem, como já mencionado, os estudos relacionados à ADE, à ativação do
complemento (Avirutnan et al., 2011), aos anticorpos anti-plaquetários (Lin et al.,
2001) e à produção de citocinas (Bethell et al., 1998). Também tem sido estudados
os fatores inerentes ao vírus, na tentativa de relacionar determinados sorotipos ou
genotipos à maior gravidade da doença (Leitmeyer et al., 1999). Além dos fatores já
citados, a genética do hospedeiro pode também estar relacionada ao
desenvolvimento de gravidade na doença. Um exemplo é o polimorfismo do gene do
HLA, que parece estar relacionado à susceptibilidade do hospedeiro em desenvolver
as formas mais graves da infecção (Nguyen et al., 2008).
1.4 Manifestações Clínicas
A infecção pelo vírus Dengue apresenta um espectro clínico que pode variar desde
formas assintomáticas, oligossintomáticas, formas clássicas da doença (Febre do
Dengue), até suas formas mais graves: Febre Hemorrágica do Dengue e Síndrome
do Choque do Dengue (WHO, 2009) .
A doença se inicia após um período de incubação de aproximadamente quatro a
sete dias, com febre, mialgia, artralgias, cefaléia e dor retroorbital. Outros sintomas
podem surgir no decorrer da doença como náuseas, vômitos, diarreia e rash cutâneo
(Gubler, 1998). A infecção é autolimitada com duração aproximada de sete dias,
quando ocorre defervescência e regressão dos sintomas. Neste momento, é
importante que haja monitoramento dos sinais de alerta pois, apesar de a maioria
dos pacientes se recuperar, uma pequena porcentagem evolui para formas graves
da doença. Nesta situação, se o paciente não for tratado de forma adequada, pode
25
evoluir para o choque hipovolêmico, com ou sem hemorragia, em consequência da
alteração da permeabilidade vascular que se instala (WHO, 2009).
Distinguir clinicamente a dengue de outras doenças febris durante a fase precoce da
doença não é tarefa simples. Até o momento não há um algoritmo para o seu
diagnóstico diferencial que possa ser aplicado em todas as áreas endêmicas do
mundo. Isto se deve à inespecificidade dos sinais e sintomas, das alterações
laboratoriais e à diversidade de doenças endêmicas presentes, daí a importância de
métodos diagnósticos rápidos, confiáveis e acessíveis para utilização na rotina
diagnóstica do Dengue (Potts; Rothman, 2008).
1.5 Métodos Diagnósticos
Até a década de 70 os testes sorológicos empregados para o diagnóstico da dengue
eram os testes de inibição da hemaglutinação (HI), fixação do complemento (CF) e
teste de neutralização (Halstead, 1965). A partir daí, o desenvolvimento da técnica
de ELISA nos anos 70 (Engvall e Perlmann 1971; Van Weemen e Schuurs, 1971), e
o advento da biologia molecular na década de 80 (Mullis et al., 1986), foram
fundamentais para o avanço não só no diagnóstico laboratorial da dengue, mas para
o diagnóstico laboratorial das doenças infecciosas em geral.
Atualmente, técnicas mais aprimoradas para detecção de anticorpos, detecção de
vírus ou de suas subunidades estão sendo combinados com técnicas ainda mais
modernas e automatizadas a fim de tornar o diagnóstico cada vez mais preciso e
rápido.
Hoje as técnicas disponíveis para o diagnóstico do dengue incluem: isolamento e
detecção do vírus, detecção do RNA viral, detecção de antígenos ou anticorpos, ou
uma combinação destas. Estes devem ser utilizadas levando-se em consideração a
cronologia da infecção. A seguir faremos um breve resumo das metodologias
utilizadas para o diagnóstico do dengue.
26
1.5.1 Isolamento Viral
A inoculação de espécimes clínicos (soro, plasma ou lisado de células
mononucleares) em linhagens celulares de mosquitos Aedes albopictus (C6/36),
seguido de uma reação de imunofluorescência indireta sorotipo específica, é o
método mais utilizado para o isolamento viral (Gubler et al., 1984). O isolamento
também pode ser realizado através de inoculação direta destes espécimes em
mosquitos ou larvas de Toxorhynchites spp (Tesh, 1979).
A detecção do vírus através do isolamento viral é considerado diagnóstico definitivo,
porém aspectos práticos limitam seu uso: primeiro, o alto custo de manutenção do
laboratório e de pessoal capacitado e segundo, o breve período de viremia no qual o
vírus pode ser recuperado com sucesso e, terceiro a termolabilidade do vírus, que
deve ser levada em consideração nos procedimentos de coleta, transporte e
armazenamento das amostras a serem testadas.
1.5.2 RT-PCR (convencional e real time)
Desde os anos 90, diferentes protocolos de RT-PCR tem sido desenvolvidos e
aplicados pra a pesquisa e diagnóstico de dengue. Os ensaios que envolvem a
amplificação e detecção do RNA viral envolvem três etapas básicas: extração e
purificação do ácido nucleico, conversão do RNA em cDNA e amplificação, e
detecção e caracterização do produto amplificado. Ainda, pode ser realizada uma
segunda etapa de amplificação, utilizando-se simultaneamente os iniciadores
sorotipo-específicos para identificação dos quatro sorotipos virais, chamada Nested
PCR. O produto das reações é separado por eletroforese em um gel de agarose e
visualizado como bandas. Os diferentes sorotipos são identificados pelos pesos
moleculares das bandas características (Lanciotti et al., 1992).
A alta sensibilidade e especificidade fazem dessa metodologia uma ferramenta
importante na confirmação do diagnóstico do dengue. Em comparação ao
isolamento viral, a PCR demonstra sensibilidade variando entre 93% a 100% entre
27
os quatro sorotipos (Lanciotti et al., 1992). Resultados falso positivos podem ocorrer
devido a contaminação secundária à manipulação de produtos de amplificação de
outras reações ou amostras, quando as boas práticas de laboratório não são
respeitadas (WHO, 2009).
Mais recentemente, a metodologia de RT-PCR em tempo real vem gradualmente
substituindo a PCR convencional para o diagnóstico de dengue em amostras de fase
aguda. Essa metodologia possui como vantagens em relação à metodologia
convencional, sua maior rapidez, possibilidade de quantificação do RNA viral, menor
possibilidade de contaminação e maior sensibilidade (Shu; Huang, 2004). A RT-PCR
em tempo real é um ensaio realizado em etapa única utilizando iniciadores e sondas
fluorescentes específicas para cada sorotipo do vírus. A utilização de uma sonda
fluorescente permite a detecção dos produtos de reação em tempo real através de
um equipamento específico, sem a necessidade de utilização de eletroforese em gel
de agarose (WHO, 2009).
1.5.3 Detecção de antígeno NS1
Muitos estudos tem sido direcionados para a utilização do antígeno NS1 do vírus
Dengue no diagnóstico precoce da doença. Em 2000, Young e colaboradores
descreveram o desenvolvimento de um ELISA de captura cujo alvo era a proteína
NS1 do vírus Dengue. A proteína se mostrava presente em altos níveis no soro de
pacientes na fase aguda da doença e sua utilização para diagnóstico precoce da
doença parecia promissora (Young et al., 2000). Atualmente, diversos kits que
utilizam esse princípio estão comercialmente disponíveis e estudos vem
demonstrando que sua sensibilidade e especificidade podem variar entre 52% e
84% e entre 90% e 100%, respectivamente (Dussart et al., 2008; Lapphra et al.,
2008; McBride, 2009; Guzman et al., 2010b; Lima Mda et al., 2010; Osorio et al.,
2010).
Na tentativa de facilitar e agilizar o diagnóstico laboratorial os testes
imunocromatográficos, que também utilizam como alvo a proteína NS1, tem se
tornado uma alternativa rápida, barata e prática.
28
O desenvolvimento de testes rápidos utilizando técnicas de imunocromatografia tem
proporcionado a possibilidade para um diagnóstico a beira do leito. Entretanto, a
acurácia desses testes é questionada, pois geralmente está abaixo do que afirmam
seus fabricantes.
Inúmeros testes rápidos se encontram disponíveis e diversos estudos sido
conduzidos a fim de avaliar seu real desempenho para a adequada aplicação na
prática clinica. Sabe-se que sensibilidade dos testes rápidos para detecção de
antígeno NS1 pode variar bastante, desde 41% a 89%. A especificidade é alta,
ficando geralmente próximo a 100% e não sendo menor que 90% (Dussart et al.,
2008; Hang et al., 2009; Lima Mda et al., 2010; Osorio et al., 2010; Najioullah et al.,
2011). Atualmente o Ministério da Saúde disponibiliza kits de teste NS1 ELISA para
triagem das amostras para isolamento viral em unidades sentinelas. Para a
realização desse teste as amostras devem ser coletadas até o quinto dia do início
dos sintomas, do contrário realiza-se a pesquisa de anticorpos (Brasil, 2010).
A detecção de antígenos virais também pode ser realizada através da técnica de
imunohistoquímica, em material obtido post mortem. Esse método permite a
detecção de antígenos em cortes de tecidos fixados em formalina e processados em
parafina, marcados com anticorpos específicos conjugados com fosfatase alcalina
ou peroxidase. A imunohistoquímica é bastante sensível e específica e deve ser
utilizada após o diagnóstico histopatológico presuntivo (Brasil, 2010).
1.5.4 Detecção de Anticorpos
Os estudos conduzidos durante a Segunda Guerra Mundial demonstraram que a
imunidade ao DENV estava associada a anticorpos neutralizantes e que esses
também poderiam ser utilizados para fins diagnósticos e epidemiológicos
(Sabin,1952). Entre as metodologias utilizando a detecção de anticorpos específicos,
estão: testes de inibição da hemaglutinação (HI), fixação do complemento (CF),
ensaios imunoenzimáticos (ELISA), testes imunocromatográficos, e testes de
29
neutralização.
Por muitos anos HI foi o método padrão para o diagnóstico de dengue. O princípio
do método consiste na capacidade dos anticorpos específicos para dengue,
presentes em amostra de soro, inibirem a aglutinação de eritrócitos. Realiza-se uma
comparação entre os títulos obtidos em amostra de soros coletados na fase aguda e
convalescente da doença. As principais desvantagens do método são a falta de
especificidade, necessidade de amostras pareadas (amostra de fase aguda e de
convalescença) e a incapacidade de distinção do sorotipo viral infectante (De Paula;
Fonseca, 2004).
Durante algum tempo, o teste de fixação do complemento foi considerado um dos
mais importantes no sorodiagnóstico. Atualmente tem pouca aplicação clínica e não
é utilizado na rotina laboratorial para o diagnóstico de dengue. É de difícil execução,
requerendo pessoal treinado para a obtenção de bons resultados. É baseado no
princípio que se houver anticorpos específicos para o DENV, esses irão se
complexar com antígenos, ativando a cascata e consumindo o complemento. Numa
segunda etapa mede-se a atividade hemolítica do complemento remanescente,
permitindo determinar e quantificar a presença de anticorpos na amostra inicial
(Gubler, 1998; Sanchez, 2001).
Ao final da década de 70 a metodologia de ELISA foi aplicada para o diagnóstico do
dengue. Essa metodologia oferecia diversas vantagens sobre as técnicas
sorológicas até então utilizadas: uma maior sensibilidade, a utilização direta do soro,
e a possibilidade de diagnóstico utilizando apenas uma amostra de soro, enquanto
para a HI, por exemplo, havia necessidade de comparação entre amostras pareadas
(Dittmar et al., 1979).
Atualmente, para o diagnóstico de dengue através da detecção de anticorpos, estão
comercialmente disponíveis inúmeros ELISA e testes imunocromatográficos. No
Brasil, o método ELISA de captura de IgM (MAC-ELISA) é o método de escolha para
a confirmação laboratorial na rotina (Brasil, 2010). Nesse ensaio, o IgM total
presente no soro do paciente é capturado por anticorpos específicos imobilizados na
microplaca. É então adicionado uma solução de antígenos específicos proveniente
30
dos quatro sorotipos, ligados a anticorpos marcados com enzima, que forma um
“sanduíche”, caso haja a presença de anticorpos específicos anti-vírus Dengue.
Nesse caso, em presença de substrato, há formação de produto colorido cuja
densidade óptica é medida em espectrofotômetro e posteriormente avaliada em
relação a um valor de cut off determinado. Uma das desvantagens do método é que
um resultado negativo obtido em amostra de soro coletada em fase recente da
doença não exclui o diagnóstico de dengue, uma vez que, em alguns casos, os
níveis de IgM tornam-se detectáveis pelo teste somente após 10 dias. Então para a
confirmação do diagnóstico pode ser necessário uma nova coleta de soro do
paciente (Brasil, 2010).
O ensaio de neutralização em placa (PRNT) é o teste sorológico mais específico
para os flavivirus, e é sorotipo específico para os quatro vírus Dengue. O PRNT foi
primeiramente descrito nos anos 50 e depois adaptado para o DENV (Russell et al.,
1967). O principio básico desse ensaio é permitir que ocorra a interação vírus-
anticorpo em um tubo ou placa de microtitulação, e então avaliar a infecção viral
após o plaqueamento dessa mistura em células susceptíveis. Quanto maior a
presença de anticorpos sorotipo específicos, maior a capacidade neutralizante, e
menor é a infecção do vírus nas células. O PRNT é atualmente o teste laboratorial
padrão para avaliação de anticorpos neutralizantes, sendo utilizado para avaliação
de níveis de proteção (WHO, 2007).
31
2 JUSTIFICATIVA
Como ainda não há vacina nem drogas específicas para prevenção e tratamento da
dengue, a abordagem médica visa basicamente o tratamento dos sintomas e a
prevenção das possíveis complicações (Brasil, 2008). O manejo clínico é
relativamente simples, de baixo custo e efetivo na prevenção das complicações,
incluindo morte, desde que sejam instituídos corretamente e a tempo.
A infecção pelo DENV pode apresentar um amplo espectro de sintomas, muitos
deles inespecíficos, o que dificulta o seu diagnóstico clínico. Assim, a confirmação
laboratorial da doença, através de testes específicos e de rápida execução, pode
auxiliar na rotina da prática clínica e agilizar ações de controle. O diagnóstico
laboratorial pode envolver técnicas baseadas na detecção do vírus, do genoma viral,
de antígenos, anticorpos ou uma combinação destas. A decisão sobre a utilização
das técnicas deve basear-se na cronologia da infecção e nas condições laboratoriais
dos serviços de saúde .
Nós últimos anos, a expansão mundial da doença e a demanda por testes
diagnósticos rápidos, específicos e de execução simples, aumentaram o ritmo de
comercialização de novas plataformas diagnósticas. A validação e comparação do
desempenho destes testes é fundamental para sua implementação nos diversos
cenários clínicos, epidemiológicos e laboratoriais e é uma questão que só poderá ser
respondida através de pesquisas desenhadas para tal (TDR Diagnostics Evaluation
Expert Panel et al., 2010). Atualmente existem muitos testes disponíveis no mercado
e poucos estudos conduzidos no Brasil que avaliem seu desempenho. Além disso, a
maioria dos testes avaliados neste estudo ainda não possuem publicações que
relatem sua sensibilidade e especificidade.
32
3 OBJETIVOS
1. Avaliar a sensibilidade de quatro testes diagnósticos baseados na detecção
de NS1, sendo dois no formato imunocromatográfico e dois no formato
ELISA.
2. Avaliar a interferência da presença de anticorpos IgG na sensibilidade dos
testes para a detecção de NS1.
3. Avaliar a sensibilidade dos testes de detecção de NS1 para os diferentes
sorotipos do Dengue.
4. Avaliar a sensibilidade de três testes diagnósticos ELISA para detecção de
anticorpos IgM, em amostras de fase aguda e convalescente da doença.
33
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Desenho do Estudo
Do ponto de vista didático este estudo foi divido em duas etapas. Em um primeiro
momento foi realizada a obtenção de amostras de soro de pacientes com dengue.
Nessa etapa foram selecionados 158 pacientes com suspeita clínica de dengue dos
quais foram obtidas amostras de soro na fase aguda e 83 obtidas convalescente da
doença. Em um segundo momento, utilizando as amostras positivas para infecção,
avaliou-se a sensibilidade de sete testes diagnósticos.
4.2 Aspectos Éticos
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Ciências da
Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo, sob o número de registro: 100/09.
Todos os indivíduos incluídos no estudo foram previamente esclarecidos sobre o
mesmo e concordaram em participar, assinando o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (Apêndice A).
4.3 Obtenção de amostras
4.3.1 Pacientes
Foram incluídos na primeira etapa desse estudo 158 indivíduos com sinais e
sintomas de dengue, com até sete dias do início dos sintomas, que procuravam
atendimento em unidades de Pronto Atendimento do Sistema Único de Saúde dos
municípios de Vitória (São Pedro III), Serra (Serra Sede) e Vila Velha (Cobilândia). A
escolha de diferentes municípios teve por objetivo aumentar a chance de obtenção
dos diferentes sorotipos virais. A inclusão dos pacientes foi realizada em dois
34
momentos: entre os meses de maio e julho de 2009 (Vitória, Serra e Vila Velha) e
entre maio a agosto de 2010 (somente Vitória). Esses períodos corresponderam às
semanas epidemiológicas de 21 a 27 de 2009, e às semanas epidemiológicas 18 e
32 de 2010. A inclusão dos pacientes nesses dois períodos teve por objetivo otimizar
a captação dos pacientes em momentos de maior notificação da doença. Os
números de notificações por dengue nos dois períodos de inclusão pode ser
visualizado nos Gráficos 1 e 2.
Gráfico 1. Notificações por dengue de acordo com as semanas epidemiológicas em 2009 nos
Municípios de Vitoria, Serra e Vila Velha (Dados SESA).
35
Os pacientes com suspeita de dengue, atendidos nos Pronto Atendimentos dos
bairros acima mencionados, foram encaminhados para atendimento por um médico
infectologista, ou membro treinado, da equipe do estudo. Após assinatura do termo
de consentimento, um formulário foi preenchido com dados demográficos e clínicos
(Apêndice B), e se o paciente preenchesse os critérios de inclusão do estudo, uma
amostra de sangue periférico era coletada (amostra de fase aguda). O paciente era
então orientado a retornar após duas semanas para coleta de uma segunda amostra
(amostra fase convalescente). Todas as coletas de sangue foram realizadas em
tubos secos para soro de 10mL (Vacutainer™, BD). Após a coleta, as amostras
foram mantidas em caixas térmicas até o processamento. As amostras foram
centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos, sob refrigeração, em até 4 horas após a
coleta. O soro foi aliquotado em microtubos de polipropileno de 1,5 mL, livre de
RNAse, DNAse e pirógenos (Axygen, Inc.). As alíquotas foram armazenadas em
freezers -70°C e -20°C, para a posterior utilização nos testes.
Gráfico 2. Notificações por dengue durante as semanas epidemiológicas do ano de 2010 no
Município de Vitoria (Dados SESA).
36
4.3.1.1 Critérios de Inclusão
Para a inclusão dos pacientes foi utilizado o seguinte critério, baseado no critério de
“provável dengue” da OMS (WHO, 2009): presença de febre há até sete dias,
acompanhada de dois ou mais dos seguintes sintomas:
- dor de cabeça,
- mialgia e artralgias
- náusea, vômito ou diarreia
- rash cutâneo
- prova do laço positiva
Foram excluídos do estudo todos os sujeitos que, no momento da avaliação clínica,
apresentavam tosse, coriza ou outra infecção de etiologia claramente identificável
(otite, faringite, pneumonia, infecção urinária, etc.).
4.4 Caracterização das amostras positivas e do sorotipo infectante
Foram definidas como positivas as amostras de soro de fase aguda que
apresentaram resultado positivo para a detecção do genoma de qualquer um dos
sorotipos do vírus dengue através da metodologia de RT-PCR baseada no protocolo
descrito por Lanciotti et al. (Lanciotti et al., 1992).
O RT-PCR é uma metodologia bastante sensível quando aplicado na fase virêmica
da doença. Tal teste foi escolhido para utilização como teste de referência neste
trabalho devido às vantagens em relação ao isolamento viral, método considerado
“padrão ouro”. O isolamento viral quando comparado com métodos de biologia
molecular, na prática, possui desvantagens que influenciam diretamente em sua
sensibilidade. Como já mencionado, é breve o período no qual o vírus pode ser
recuperado com sucesso. Mais ainda, as condições de coleta, transporte e
armazenamento das amostras poderiam interferir diretamente na sensibilidade de
detecção do vírus através desse método. Tal fato foi também observado por nós
quando amostras de soro negativas no isolamento viral, provenientes do LACEN/ES,
37
foram positivas em nosso laboratório através da metodologia de RT-PCR (dados não
mostrados).
4.4.1 RT-PCR
4.4.1.1 Extração do RNA
O RNA viral foi extraído a partir de 140µL de soro utilizando o kit QIAamp® Viral
RNA Mini Kit (Qiagen, Germany) segundo as instruções do fabricante. O RNA
extraído foi imediatamente utilizado para a produção do DNA complementar (cDNA).
4.4.1.2 Síntese do cDNA
O cDNA foi sintetizado a partir de 5µL do RNA extraído e 15µL de um mix contendo
20mM de nucleotídeos (Promega), 20 picomol de primer D2 (Promega), 0,1M DTT
(Invitrogen), 40U de inibidor de RNAses RNAseout ™ (Invitrogen), 1,5U da enzima
RT-AMV (Invitrogen), 4 µL de tampão de hibridização (Invitrogen) e 4,9 µL de água
ultrapura (Gibco). A reaçao foi realizada em termociclador (Maxygene, Axygen)
programado para um ciclo de 42°C por 60 minutos.
4.4.1.3 Amplificação do DNA
Para amplificação do fragmento específico do genoma viral foi utilizado 1 µL do
cDNA obtido na reação anterior e 19 µL de um mix contendo: 2 µL de tampão
(Invitrogen), 3,0mM de MgCl2 (Invitrogen), 4mM de nucleotídeos (Promega), 10
picomol de iniciador D1 e D2, 1 U da enzima Taq Polimerase (Invitrogen). A etapa
de amplificação foi realizada no mesmo termociclador, programado para 30 ciclos de
desnaturação (94°C, 35s), anelamento (56°C, 1min) e extensão (72°C, 2 min).
38
4.4.1.4 Tipagem do vírus Dengue (Semi Nested)
Uma segunda etapa de amplificação foi realizada a partir de 5µL do produto da
reação anterior, diluídos na proporção de 1:100, em água ultrapura. A 10µL do
produto dessa diluição foi adicionado 10µL de um mix contendo 2 µL de tampão
(Invitrogen), 3,0mM de MgCl2 (Invitrogen), 4mM de nucleotídeos (Promega), 10
picomol de iniciador D1, 10 picomol de cada iniciador sorotipo específico TS1, TS2,
TS3 e TS4, e 1U da enzima Taq Polimerase (Invitrogen). Para essa etapa foram
programados 18 ciclos de desnaturação (94°C, 30 s), anelamento (55°C, 1 min) e
extensão (72°C, 2 min).
10 µL do produto da reação final foi submetido à eletroforese em gel de agarose 2%
(BioAmerica). Após o final da eletroforese, o gel foi corado com solução de brometo
de etídeo e visualizado em transiluminador (BioAmerica). As amostras foram
classificadas como positivas para algum dos sorotipos virais caso fosse visualizada
a banda de tamanho característico de cada sorotipo viral (Tabela 1).
Iniciador Sequência Tamanho do segmento
amplificado (pb)
D1 5'-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3' 511
D2 5'-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3'
TS1 5'-CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3' 482
TS2 5'-CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3' 119
TS3 5'-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3' 290
TS4 5'-CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA-3' 392
Tabela 1. Iniciadores utilizados para a tipagem do vírus Dengue.
39
4.5 Testes Diagnósticos
Foram avaliados os seguintes testes para o diagnóstico de dengue: Dengue NS1 Ag
Strip™ (Bio-Rad Laboratories), Dengue Duo™ (Bioeasy Diagnóstica), Platelia™
Dengue NS1 Ag-ELISA (Bio-Rad Laboratories), Dengue NS1 ELISA Test™ (Bioeasy
Diagnóstica), DENV Detect™ IgM Antibody Capture ELISA (MAC ELISA) (Inbios
International), Dengue IgM ELISA Test™ (Bioeasy Diagnóstica), Dengue IgM Capture
ELISA™ (PanBio). Dos sete testes avaliados, quatro baseavam-se na detecção do
antígeno viral NS1, e três baseavam-se na detecção de anticorpos IgM.
O teste Dengue IgM Capture ELISA (PanBio), foi executado pelo Laboratório Central
da Prefeitura Municipal de Vitória conforme as instruções do fabricante. Todos os
demais testes avaliados foram executados no laboratório do Núcleo de Doenças
Infecciosas, conforme as instruções fornecidas pelo fabricante e segundo as normas
de biossegurança. Todos esses testes foram gentilmente doados pelos fabricantes,
à exceção do teste Dengue NS1 Ag Strip™ (Bio-Rad Laboratories), adquirido do
distribuidor. Os testes baseados na detecção da NS1 foram realizados somente nas
amostras de soro de fase aguda. Os testes para pesquisa de anticorpos IgM foram
realizados nas amostras de soro pareadas, ou seja, nas amostra de fase aguda e
em suas respectivas amostras de convalescência.
4.5.1 Testes de detecção de NS1
4.5.1.1 Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica)
É um teste imunocromatográfico qualitativo para detecção simultânea de antígeno
viral NS1 e anticorpos IgM e IgG para o DENV em amostra de soro, plasma ou
sangue total. Ao lado esquerdo do dispositivo encontra-se o teste para detecção de
antígeno NS1 e ao lado direto se encontra o teste para IgM e IgG para DENV. No
teste para detecção de NS1, foram adicionadas três gotas de soro e, no teste para
detecção de anticorpos, foram adicionados 10µL de soro e quatro gotas de tampão.
A interpretação dos resultados foi realizada entre 15 a 20 minutos após a aplicação
40
da amostra. A formação de uma linha visível na região C (controle) e T (teste)
indicou teste positivo para NS1. A visualização da linha na região C (controle) e das
linhas M e/ou G indicaram a presença de anticorpos IgM e/ou IgG para DENV.
4.5.1.2 Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories)
É um teste imunocromatográfico qualitativo, para detecção do antígeno viral NS1 em
plasma ou soro humano. É composto de um tampão de migração e uma tira de
nitrocelulose constituída de três zonas: uma zona de contato com a amostra; uma
zona de conjugado contendo partículas de ouro coloidal ligadas a anticorpos
monoclonais anti-NS1 e partículas de ouro coloidal ligadas a estreptavidina; e uma
zona da membrana, onde ocorre a reação. Essa última com duas linhas,
correspondentes à linha Teste, contendo anticorpos monoclonais anti-NS1, e a linha
Controle contendo biotina. Em um tubo de ensaio plástico adicionava-se 50µL de
soro e uma gota do tampão de migração. A tira Dengue NS1 Ag Strip com a
extremidade indicada, era colocada na posição vertical dentro do Tubo. A leitura da
reação era feita após 15 minutos. A presença de uma banda rosa na Linha Teste e
na Linha Controle indicou resultado positivo. O aparecimento somente da banda
Controle indicou resultado negativo.
Figura 2. Teste imunocromatográfico Dengue Duo (Bioeasy) apresentando resultado negativo para detecção de NS1 e de anticorpos IgM e IgG.
41
4.5.1.3 Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica)
É um ensaio imunoenzimático para detecção qualitativa de antígeno NS1 em soro
humano. Em cada poço, foi adicionado 50µL de diluente de amostra. Foram
adicionados 50µL dos controles (três negativos e dois positivos) e 50µL de soro nos
respectivos poços. A microplaca placa foi incubada a 37°C por 60 minutos. Após a
incubação foi realizada as lavagens e adicionados 100µL de solução do conjugado,
incubando a 37°C por 60 minutos. Após as lavagens, foram adicionados 100µL de
substrato tetrametilbenzidina a cada poço, incubando a temperatura ambiente por 10
minutos. Foram adicionados 100µL de solução ácida de interrupção e a densidade
óptica foi obtida imediatamente em espectrofotômetro no comprimento de onda de
450nm com filtro de referência de 620nm. O ponto de corte foi calculado adicionando
o valor de 0,3 à média dos controles negativos. Se a amostra apresentasse o valor
de absorbância maior ou igual ao ponto de corte estabelecido, então foi considerada
positiva para presença de antígeno NS1.
4.5.1.4 PlateliaTM Dengue NS1 Ag-ELISA (Bio-Rad Laboratories)
O teste PlateliaTM Dengue NS1 Ag é um método imunoenzimático, do tipo
“sanduiche,” em formato de microplaca, para detecção qualitativa ou semi
quantitativa do antígeno viral NS1 em soro ou plasma. Foi adicionado aos poços da
Figura 3. Teste imunocromatográfico Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad).
42
microplaca 50µL de solução diluente, e nos respectivos poços, 50µL de soro, 50µL
de cada controle e 50µL do calibrador. A cada poço foi adicionado 100µL de
conjugado diluído e incubado por 90 minutos a 37°C. Após a incubação foram
realizadas as lavagens e adicionado 160µL de uma solução cromógena, incubando
a temperatura ambiente por 30 minutos. A reação enzimática foi parada com a
adição de 100µL da solução ácida e em seguida procedida a leitura da densidade
óptica em espectrofotômetro (Molecular Devices) em comprimento de onda de
450nm com filtro de referência de 650nm. O resultado de cada amostra foi avaliado
através da comparação entre a densidade óptica obtida para a amostra e a
densidade óptica obtida para o calibrador. A razão das absorbâncias dos controles
foi utilizada para a validação dos testes. Para avaliar as amostras, se obtivessem
razão menor que 0.5 foram consideradas negativas. Amostras que obtiveram
resultado da razão entre 0.5 e 1 foram consideradas duvidosas. Amostras que
obtiveram razão maior que 1 foram consideradas positivas.
4.5.2 Testes de detecção de anticorpos IgM
4.5.2.1 Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica)
Ensaio imunoenzimático para detecção qualitativa de anticorpos IgM para DENV em
soro humano. As amostras de soro dos pacientes e os controles fornecidos pelo
fabricante foram inicialmente diluídos em solução diluente fornecida no kit, na
proporção 1:100. Em seguida adicionou-se 100µL destas soluções nos respectivos
poços da microplaca, que era incubada a 37°C por 60 minutos. Após a incubação
procedeu-se a lavagem manual dos poços, aos quais adicionava-se 100µL de
solução conjugada (anti Dengue HRP + antígeno diluído). A placa era novamente
incubada a 37°C por 60 minutos. Após uma última lavagem, adicionou-se 100µL do
substrato TMB em cada poço. A placa foi então incubada a temperatura ambiente
por 10 minutos e em seguida adicionava-se 100µL de solução de ácido sulfúrico
1,6N para encerrar a reação enzimática. Procedeu-se então a leitura em
espectrofotômetro (Molecular Devices) a 450nm com filtro de referencia de 620nm.
O ponto de corte, sugerido pelo fabricante, foi calculado adicionando-se o valor de
43
0,3 à média do valor da leitura dos controles negativos. Valores maiores ou iguais ao
ponto de corte estabelecido, foram considerados positivos para a presença de IgM.
4.5.2.2 DENV Detect TM IgM Antibody Capture ELISA (MAC ELISA)
(Inbios International)
DENV Detect MAC ELISA consiste num ensaio imunoenzimático do tipo sanduiche.
As amostras de soro e os controles, negativo e positivo, foram diluídos na proporção
1:100 em solução diluente. Posteriormente, 50µL dos soros e controles diluídos
foram adicionados na placa, em duplicata, e incubados a 37°C por 60 minutos. Após
a incubação, procedeu-se a lavagem e foram adicionados 50µL antígeno dengue
recombinante (Dengue RA) e Antígeno Normal Celular (NCA) separadamente, para
cada duplicada da amostra. A placa foi incubada a 37°C por 60 minutos, lavada, e
adicionado 50µL de anticorpo específico anti-Dengue RA marcado com peroxidase.
A placa foi novamente incubada a 37°C por 60 minutos e lavada. Após essa etapa,
foram adicionados 150µL de solução EnWash a cada poço e a placa foi incubada a
temperatura ambiente por 5 minutos. A placa foi novamente lavada, adicionado TMB
(tetrametilbenzidina) e incubada por 10 minutos em local escuro. Uma solução ácida
foi adicionada para parar a reação enzimática e a leitura da densidade óptica foi
realizada em espectofotômetro (Molecular Devices) a 450nm. O resultado para cada
amostra foi determinado através do cálculo da razão da absorbância entre o poço
que continha o Dengue RA e o poço NCA correspondente.
4.5.2.3 Dengue IgM Capture ELISA (PanBio)
É um ensaio imunoenzimático para detecção qualitativa de anticorpos IgM para o
DENV em soro humano. Para realização desse teste, as amostras de soro do estudo
foram enviadas, congeladas, para o Laboratório Central da Prefeitura Municipal de
Vitória, onde o teste foi executado conforme as instruções do fabricante. Foram
diluídos, na proporção 1:100, em solução diluente, os controles positivo e negativo, o
calibrador e as amostras de soro. Paralelamente foi preparada a solução conjugada
antígeno-anticorpo marcado com enzima, adicionando 30µL do antígeno a 7,5mL do
diluente do antígeno e posteriormente foi adicionado igual volume do anticorpo
44
monoclonal marcado com peroxidase. A solução foi incubada por 60 minutos a
temperatura ambiente e reservada. À placa do teste foi adicionado 100µL das
amostras, controles e calibrador diluídos. A placa foi coberta e incubada a 37°C por
60 minutos. Procedeu-se a lavagem da placa e foram adicionados 100µL da solução
antígeno-anticorpo previamente preparada por poço. A placa foi coberta e incubada
a 37°C por 60 minutos. Após a incubação a placa foi lavada e a cada poço foi
adicionado 100µL de substrato TMB. A placa foi incubada por a temperatura
ambiente por 10 minutos. A reação enzimática foi interrompida adicionando-se
100µL da solução ácida de interrupção. A leitura foi efetuada em espectrofotômetro
em comprimento de onda de 450nm com filtro de referência de 650nm. O valor de
corte foi calculado utilizando a média das triplicatas do calibrador multiplicada pelo
fator de calibração (específico de cada lote e detalhado na folha de especificações
do teste). O valor indexador foi calculado dividindo a absorbância da amostra pelo
valor de corte calculado anteriormente. Se o valor do indexador obtido foi menor que
0,9, então o resultado da amostra foi considerado negativo. Se o valor do indexador
obtido foi entre 0,9 e 1,1, o resultado da amostra foi considerado duvidoso. Se o
valor do indexador obtido foi maior que 1,1 então o resultado foi considerado
positivo.
Nesse estudo a especificidade dos testes não foi avaliada. Não foi possível a
obtenção de um painel de soros de fase aguda de doenças caudadas por outros
flavivírus que poderiam apresentar reações cruzadas como: febre amarela,
chikungunya, vírus da febre do oeste do Nilo, Ilhéus, Rocio, vírus da encefalite de
Saint Louis, entre outros.
4.6 Pesquisa de anticorpos IgG
Com o objetivo de avaliar a interferência da presença de anticorpos IgG na
sensibilidade dos testes para detecção do antígeno NS1, e nos testes de IgM em
fase convalescente, foi realizado o teste Dengue IgG ELISA Test (Bioeasy
Diagnóstica) nas amostras de fase aguda.
45
4.6.1 Dengue IgG ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica)
Ensaio imunoenzimático para detecção qualitativa de anticorpos IgG para o DENV
em soro humano. As amostras de soro dos pacientes e os controles fornecidos pelo
fabricante foram inicialmente diluídos em solução diluente fornecida no kit, na
proporção 1:100. Em seguida adicionava-se 100µL destas soluções nos respectivos
poços da microplaca, que era incubada a 37°C por 60 minutos. Após este período
de incubação procedeu-se a lavagem manual dos poços, aos quais adicionava-se
100µL de solução de conjugado. A placa foi novamente incubada a 37°C por 60
minutos. Após uma última lavagem, adicionou-se 100µL do substrato
tetrametilbenzidina (TMB) em cada poço. A placa foi então incubada a temperatura
ambiente por 10 minutos e em seguida adicionou-se 100µL de solução de
interrupção para encerrar a reação enzimática. Procedeu-se então a leitura em
espectrofotômetro (Molecular Devices) a 450nm com filtro de referencia de 620nm.
O ponto de corte, sugerido pelo fabricante, foi calculado adicionando-se o valor de
0,3 à média do valor da leitura dos controles negativos. Valores maiores ou iguais
ao ponto de corte estabelecido, foram considerados positivos para a presença de
IgG.
4.7 Análise Estatística
Os dados clínicos e resultados os testes diagnósticos foram incluídos em tabelas
utilizando o programa Microsoft Excel. Os cálculos estatísticos foram realizados
através do Teste Qui-quadrado e exato de Fisher utilizando o programa GraphPad
Prism, versão 5.0, assumindo significância estatística α<0,05. A sensibilidade foi
definida como: número de testes positivos/número de amostras positivas.
46
5 RESULTADOS
5.1 Obtenção de amostras de soro
De um total de 225 pacientes triados, 158 indivíduos preencheram os critérios de
inclusão e foram incluídos no estudo. A média da idade dos indivíduos foi de 34
anos, sendo 39,2% (62/158) do sexo masculino e 60,8% (96/158) do sexo feminino.
Em relação à procedência, 39 (24,7%) eram provenientes do município de Vitória, 62
(39,2%) do município de Vila Velha, 57 (36,1%) do município da Serra. Os dados
demográficos e clínicos da população incluída podem ser vistos na Tabela 2. De
todos os pacientes obteve-se amostra no momento da entrada no estudo (amostra
de fase aguda). Entretanto, só foi possível obter a amostra de fase convalescente
em 83 (52,5%) dos indivíduos. As amostras de fase aguda foram coletadas em
média 3,6 dias após o início dos sintomas e na fase convalescente 13,3 dias após o
início dos sintomas.
Tabela 2. Dados demográficos e clínicos dos 158 sujeitos incluídos no estudo. Características Demográficas Feminino (%) 60,8%
Masculino (%) 39,2%
Idade em anos (media, mediana e [intervalo]) 34,32 [18-79]
Sinais e Sintomas Clínicos no Momento da Inclusão Início dos sintomas em dias (média, mediana e [intervalo]) 4,3 [1-7]
N e (%)
Febre 158 (100,0%)
Dor de cabeça 151 (95,6%)
Mialgia 149 (94,3%)
Dor retroorbital 130 (82,3%)
Artralgia 124 (78,5%)
Náusea 107 (67,7%)
Rash 56 (35,4%)
Diarréia 46 (29,1%)
Vômito 40 (25,3%)
Sangramento anormal 14 (8,9%)
47
5.2 Amostras positivas para Dengue Das 158 amostras de fase aguda, 94 (59,5%) foram positivas para dengue pela
metodologia de RT-PCR, utilizada neste estudo como teste de referência para
confirmação da infecção. Os sorotipos identificados nessas amostras foram: DENV-1
em 16 (17%), DENV-2 em 67 (71,3%), DENV-3 em 10 (10,6%) e nenhum DENV-4.
Em uma única amostra (0,1%) constatou-se infecção simultânea por dois sorotipos:
DENV-1 e 2. A Figura 2 mostra a imagem do gel de agarose que inclui o resultado
da amostra do indivíduo com a dupla infecção (coluna 14). Este resultado foi
reconfirmado utilizando-se uma segunda alíquota de soro do mesmo paciente,
armazenada em freezer -70°C.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Figura 4. Gel de agarose dos produtos da etapa semi-nested. Coluna 1 e 2: controle DENV-2. Colunas 3 e 4: controle DENV-3. Coluna 5: branco. Coluna 6: peso molecular (100pb). Coluna 7: controle 1. Colunas 8 a 14: amostras de pacientes.
48
5.3 Avaliação da sensibilidade dos testes diagnósticos
5.3.1 Testes para detecção de NS1
Para avaliação da sensibilidade dos testes de detecção de NS1 foram utilizadas as
94 amostras de soro de fase aguda, positivas para dengue por RT-PCR. A
sensibilidade dos testes diagnósticos para detecção de NS1, nos formatos
imunocromatográfico e ELISA, variaram de 24,5% a 54,3%. Não houve diferença
estatística entre a sensibilidade dos testes imunocromatográficos (Tabela 3) nem
entre os de formato ELISA (Tabela 4). O Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad
Laboratories) foi estatisticamente superior quando comparado com os testes
imunocromatográficos (p < 0,05).
Tabela 3. Sensibilidade dos testes imunocromatográficos Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica) e Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories) em 94 amostras de soro positivas para Dengue.
Testes N0 Positivos/Total Sensibilidade % [95% IC]
Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica)* 23/94 24,5% [16,2-34,4]
Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories)
28/94 29,8% [20,8-40,1]
*somente considerada a leitura de NS1
49
Tabela 4. Sensibilidade dos testes ELISA para detecção de NS1: Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) e Platelia™ Dengue NS1 Ag-ELISA (Biorad Laboratories) em 94 amostras de soro positivas para Dengue.
Testes N0 Positivos/Total Sensibilidade % [95% IC]
Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) 41/94 43,6% [33,4-54,2]
Platelia™ Dengue NS1 Ag ELISA (Bio-Rad Laboratories)
51/94 54,3% [43,7-64,6]
Para a análise da sensibilidade dos testes de detecção do antígeno NS1, como
mencionado na seção Materiais e Métodos, foi avaliada também a interferência da
presença de anticorpos IgG, e do sorotipo infectante no desempenho dos testes
NS1.
5.3.1.1 Presença de anticorpos IgG x sensibilidade dos testes NS1
A sensibilidade dos testes de acordo com a presença ou não de IgG pode ser
observada na Tabela 5. A sensibilidade de todos NS1 os testes foi menor para o
grupo em que foi detectado anticorpos IgG, entretanto somente foi estatisticamente
significante apenas para o teste Platelia.
50
Tabela 5. Sensibilidade dos testes Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica), Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories), Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) e Platelia™ Dengue NS1 Ag-ELISA (Biorad Laboratories), de acordo com a presença de IgG, em 94 amostras de soro positivas para Dengue.
Detecção de IgG
N° de amostras
Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica)
somente NS1 Dengue NS1 Ag Strip
(Bio-Rad Laboratories) Dengue NS1 ELISA
Test (Bioeasy Diagnóstica)
Platelia™ Dengue NS1 Ag ELISA
(Bio-Rad Laboratories)
N° de positivos
sens. (%) [95% IC]
N° de positivos
sens. (%) [95% IC]
N° de positivos
sens. (%) [95% IC]
N° de positivos
sens. (%) [95% IC]
negativo 49 14 28,6% [16,6-43,3] 16 32,7 %
[20,0-47,5] 24 49% [34,4-63,7] 33 67,4%
[52,5-80,0]
positivo 45 9 20% [10,0-34,6] 12 26,7%
[14,6-41,9] 17 37,8% [23,8-53,5] 18 40% a
[25,7-55,7]
a = diferença estatística em relação ao grupo negativo para IgG (p<0,05)
5.3.1.2 Sorotipo infectante x sensibilidade dos testes NS1
A sensibilidade dos testes também foi avaliada de acordo com o sorotipo infectante.
Todos os testes para detecção de NS1 apresentaram a maior sensibilidade para do
DENV-1 em relação ao sorotipos 2 e 3 (p<0,05), exceto o Platelia que apresentou
diferença estatística somente entre os sorotipos 1 e 3 (Tabela 6).
51
5.3.2 Testes para detecção de anticorpos IgM
Para avaliação da sensibilidade dos testes para detecção de IgM, foram utilizadas
48 amostras pareadas, coletadas na fase aguda e na convalescente. As
sensibilidades dos testes variaram de 27,1% a 52,1% em fase aguda, e entre 72,9%
a 97,9% em fase convalescente. Para todos os testes houve diferença estatística
entre as sensibilidades obtidas nas amostras coletadas em fase aguda e
convalescente, da doença como pode ser visualizado na Tabela 7.
Tabela 6. Sensibilidade dos testes Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica), Dengue NS1 Ag Strip (Bio-Rad Laboratories), Dengue NS1 ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) e Platelia™ Dengue NS1 Ag-ELISA (Biorad Laboratories), de acordo com o sorotipo viral.
Sorotipo viral
n° de
amostras
Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica)
** Dengue NS1 Ag Strip
(Bio-Rad Laboratories) Dengue NS1 ELISA
Test (Bioeasy Diagnóstica)
Platelia™ Dengue NS1 Ag ELISA
(Bio-Rad Laboratories)
N° de positivos
sens. (%) [95% IC]
N° de positivos
sens. (%) [95% IC]
N° de positivos
sens. (%) [95% IC]
N° de positivos
sens. (%) [95% IC]
DENV-1 16 12
a, c,
75,0% 12
a, c
75,0% 12
a, c
75,0% 12
75,0% c
[47,6-92,7] [47,6-92,7] [47,6-92,7] [47,6-92,7]
DENV-2 67 10 14,9% d
15 22,4% d
27 40,3%
35 52,2%
[7,4-25,7] [13,1-34,2] [28,5-53,0] [39,7-64,6]
DENV-3 10 0
0
[0,0-30,9]
0
0
[0,0-30,9]
1 10,0%
3 30,0%
[0,25-44,5] [6,7-65,3]
1não DENV-2 26 12
46,2%
12
46,2%
13
50,0%
15
57,7%
[26,6-66,6] [26,6-66,6] [30,0-70,1] [36,9-76,7]
1 Neste grupo estão incluídos as 16 amostras DENV-1 e as 10 amostras DENV-3. * A amostra com infecção dupla não foi considerada para essa análise. ** apenas NS1 positivos As letras a , b e c e d representam diferenças estatisticamente significantes (p< 0,05) em relação aos grupos DENV-2, DENV-1, DENV-3 e não DENV-2 respectivamente.
52
Tabela 7. Sensibilidade dos testes ELISA para detecção de anticorpos IgM em 48 amostras pareadas (fase aguda e convalescente).
Teste
Fase Aguda Fase Convalescente
N0 Positivos/Total Sensibilidade %
[95% IC] N0 Positivos/Total
Sensibilidade %
[95% IC]
Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica)
25/48 52,1%
[37,2-66,7] 47/48
97,9% a
[88,9-99,9]
DENV Detect TM IgM (MAC ELISA) (Inbios International)
13/48 27,1%
[15,3-41,9] 41/48
85,4% a
[72,2-93,9]
Dengue IgM Capture ELISA
(PanBio) 20/48
41,7%
[27,6-56,8] 33/48
72,9% a
[53,8-81,3]
a = diferença estatística em relação a fase aguda (p<0,05)
5.3.2.1 Presença de anticorpos IgG x sensibilidade dos testes IgM
Para os testes de detecção de IgM, também foi avaliada a relação da presença de
anticorpos IgG em fase aguda, que sugere infecção secundária, com a sensibilidade
observada em fase convalescente. Não houve diferença estatística entre as
sensibilidades nas amostras positivas e negativas para anticorpos IgG (Tabela 8).
Tabela 8. Sensibilidade dos testes Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica), DENV Detect IgM (MAC ELISA) (Inbios International) e Dengue IgM Capture ELISA (PanBio) em 48 amostras de fase convalescente de acordo com a presença de IgG em fase aguda.
Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica)
DENV Detect TM IgM (MAC ELISA)
(Inbios International) Dengue IgM Capture
ELISA (PanBio)
Detecção de IgG *
n° de amostras
fase convalescente
n° de posi.
sens. (%) [95% IC]
n° de posi.
sens. (%) [95% IC]
n° de posi.
sens. (%) [95% IC]
negativo 18 18 100% [81,5-100,0] 16 88,9%
[65,3-98,3] 12 66,7% [41-86,7]
positivo 30 29 96,7% [82,8-100,0] 25 83,3%
[65,3-94,4] 21 70,0% [50,6-85,3]
* em amostra de fase aguda
53
5.3.3 Combinação de testes NS1 e IgM
Para o Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica), que possui detecção de NS1 e
anticorpos IgM no mesmo teste, quando considerou-se a leitura de NS1 e/ou IgM, a
sensibilidade do teste foi 48,6%, superior estatisticamente ao seu desempenho
quando considerada somente a leitura para NS1 (24,5%). Nesse mesmo raciocínio,
quando combinou-se o ELISA NS1 Platelia e o ELISA IgM do fabricante Bioeasy,
testes que apresentaram os melhores resultados, a sensibilidade para o diagnóstico
em fase aguda da doença foi de 76,6%. A sensibilidade observada com a
combinação desses dois testes foi estatisticamente superior à utilização do teste
imunocromatográfico Duo que possui detecção simultânea de NS1 e IgM (Tabela 9).
Tabela 9. Sensibilidade do teste Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica) e da combinação dos testes Platelia™ Dengue NS1 Ag ELISA (Biorad Laboratories) e Dengue IgM ELISA Test (Bioeasy Diagnóstica) em 94 amostras de fase aguda.
Teste N° de Positivos/Total Sensibilidade (%) [95% IC]
Dengue Duo (Bioeasy Diagnóstica) 44*/94 46,8% [36,4-57,4]
Platelia™ Dengue NS1 Ag ELISA (Biorad Laboratories) + Dengue IgM ELISA
Test (Bioeasy Diagnóstica) 72/94 76,6% [66,7-84,7] a
*Considerou-se os positivos para NS1 e/ou IgM a (p<0,05)
54
6 DISCUSSÃO
Nas últimas duas décadas, os avanços tecnológicos ocorridos na área diagnóstica
das doenças infecciosas e o aumento global das epidemias de dengue aumentaram
o número de testes diagnósticos disponíveis comercialmente no mercado. O
aumento de oferta tornou crucial a avaliação do desempenho destes testes em
diferentes cenários epidemiológicos de forma a possibilitar uma utilização adequada
e racional dos mesmos. Este aspecto foi reforçado pela OMS em 2006 através de
uma reunião do Scientific Working Group on Dengue, que incluía entre as
prioridades o desenvolvimento e a avaliação de testes diagnósticos para a melhora
do manejo clínico da doença (Kroeger; Nathan, 2006). A importância para avaliação
de testes diagnósticos motivou a realização deste estudo, que avaliou a
sensibilidade de sete testes laboratoriais, disponíveis comercialmente para o
diagnóstico da dengue.
Na primeira etapa deste trabalho foram incluídos 158 pacientes que preencheram os
critérios clínicos baseados na classificação de “provável dengue” segundo a OMS.
Apesar da utilização destes critérios, só foi possível confirmar a infecção por dengue
em pouco mais da metade (59,5%) dos indivíduos, o que reforça a inespecificidade
dos sintomas dessa doença e a necessidade da utilização de testes laboratoriais
complementares específicos para finalização do diagnóstico.
Nas amostras deste estudo, o DENV-2 prevaleceu sobre os demais: 71,3% seguido
do DENV-1 (17%) e DENV-3 (10,6%). Os sorotipos identificados coincidem com os
sorotipos que circulavam na região metropolitana de Vitória na ocasião (LACEN/ES
comunicação pessoal). Um indivíduo apresentou dupla infecção (DENV-1 e 2) e este
paciente teve evolução clínica de dengue sem complicações. Relatos de infecções
simultâneas por mais de um sorotipo tem se tornado relativamente frequentes no
mundo. O primeiro caso foi publicado em 1985 (Gubler et al., 1985) e de lá para cá
diversos casos de infecções simultâneas em diferentes países já foram publicados
(Gubler et al., 1985; Laille et al., 1991; Lorono-Pino et al., 1999; Wang et al., 2003;
Bharaj et al., 2008; Chinnawirotpisan et al., 2008; Gupta et al., 2008; Mamani et al.,
2010), sendo seis casos no Brasil (dos Santos et al., 2003; Araujo et al., 2006;
55
Figueiredo et al., 2011). Nenhum estudo até o momento conseguiu associar a
infecção simultânea por dois ou mais sorotipos com gravidade da doença.
Quanto aos testes diagnósticos avaliados, não existem dados publicados na
literatura sobre o desempenho dos testes da Bioeasy Diagnóstica, o que
impossibilita a comparação dos nossos resultados com os de outros estudos. Os
testes da Bio-Rad já foram descritos em várias publicações, que relataram
sensibilidades que variam de 57,7% a 98,7% para o teste de formato
imunocromatográfico Dengue NS1 Ag Strip™ (Dussart et al., 2008; Ramirez et al.,
2009; Lima Mda et al., 2010; Osorio et al., 2010; Tricou et al., 2010; Bisordi et al.,
2011; Blacksell et al., 2011) e de 56,5% a 99,3% para o formato ELISA, Platelia™
Dengue NS1 Ag-ELISA (Dussart et al., 2008; Lapphra et al., 2008; Castro-Jorge et
al., 2010; Lima Mda et al. 2010; Osorio et al. 2010; Bisordi et al., 2011; Blacksell et
al., 2012).
No Brasil apenas três estudos, todos publicados em 2010, avaliaram o desempenho
dos testes BioRad. O primeiro deles, publicado por Castro-Jorge e Colaboradores
(2010), avaliou a sensibilidade do teste Platelia™ (Bio-Rad) em 105 indivíduos com a
infecção confirmada através da combinação de cultura e/ou RT-PCR e/ou presença
de anticorpos IgM. Neste estudo todas as amostras eram de um único sorotipo, o
DENV-3. A sensibilidade do teste Platelia™ foi cerca de 20% maior na dengue
primária (89,6%) do que na dengue secundária (70,3%), que correspondiam a 33%
das amostras do estudo.
O segundo estudo, realizado por Bisordi et al. (2010), mostrou uma sensibilidade
muito elevada para ambos os testes NS1 da BioRad: 99,3% para o formato ELISA
(Platelia™) e 99,5% para o imunocromatográfico (Dengue NS1 Ag Strip™). Chama a
atenção nesse estudo a baixa frequência do DENV-2 (3,8%) entre os sorotipos
identificados na amostra: 72,8% DENV-1 e 23,4% DENV-3. Diferente do nosso
estudo, esse utilizou somente isolamento viral como teste de referência e os autores
não fazem distinção entre amostras de infeções secundárias e primárias.
O terceiro estudo, realizado por Lima et al. (2010), relatou sensibilidade de 83,6%
para o Platelia™ e 89,5% para o Dengue NS1 Ag Strip™. Nesse estudo os autores
56
dispunham de uma distribuição semelhante dos três sorotipos, mas só fizeram
distinção entre infecção primária e secundária em um pequeno percentual de soros
da amostra, 24,5% (54/220), cuja sensibilidade foi aproximadamente 20% inferior
nas infecções secundária (71,4%) em relação às infecções primárias (95%).
No nosso estudo encontramos sensibilidades de 54,3% para o Platelia™ e 29,8%
para o teste Dengue NS1 Ag Strip™, inferiores às descritas nos três estudos
brasileiros. Estas baixas sensibilidades podem ser parcialmente explicadas pelo fato
que a maioria das amostras do nosso estudo eram DENV-2 (71,3%). Estudos
recentes tem chamado atenção para a variação sorotipo dependente, da
sensibilidade dos testes de detecção de NS1. Esse fato foi também detectado em
nosso estudo, no qual observamos maior sensibilidade para o sorotipo 1 sobre os
demais, em quase todos os testes.
No estudo de Castro-Jorge et al. (2010) todas as amostras eram de um único
sorotipo (DENV-3) e no estudo de Bisordi et al. (2010) o DENV-2 compreendia
menos de 4% das amostras, o que limita sua comparação com os nossos
resultados. Guzman et al. (2010), em estudo multicêntrico no qual avaliou o teste
Platelia™, encontraram 34% de sensibilidade em amostras de pacientes da
Nicarágua, as quais eram em 94% do sorotipo DENV-2 (Guzman et al., 2010b).
Blacksell et al. (2012) encontraram 38% de sensibilidade no mesmo teste para o
DENV-2, 70% para o DENV-1 e 73% para o DENV-3 (Blacksell et al., 2012). Duong
et al. (2011) também relataram sensibilidade variável entre os sorotipos. Nesse
estudo foi observado sensibilidades de 40% para o DENV-2, 80% para o DENV-1 e
63,6% para o DENV-3 (Duong et al., 2011).
Outra variável que poderia ter interferido na sensibilidade dos testes de detecção da
proteína NS1 é a presença de IgG, encontrada precocemente nas infeções
secundárias, e que atuaria sequestrando a proteína NS1 através da formação de
imunocomplexos (Koraka et al. 2003; Bessoff et al. 2008; Hang et al. 2009). Bessoff
e colaboradores (2008) observaram que, para o kit Platelia™ Bio-Rad havia uma
relação inversa entre os títulos de IgG e a frequência de um resultado positivo
(Bessoff et al. 2008). Hang e colaboradores (2009) mostraram também relação
inversa entre a presença de IgG e a positividade dos testes da BioRad. Os autores
57
relataram uma diferença de aproximadamente 33% (93,1% para 60,5%) na
sensibilidade do teste Platelia™ e de 36% (de 83,9% para 47,4%) no teste
imunocromatográfico quando o soro testado era positivo para anticorpos IgG (Hang
et al. 2009).
Essa diferença entre a sensibilidade dos testes NS1 na presença de IgG também foi
observada no nosso estudo. Na presença de IgG, a sensibilidade de todos os testes
foi menor em relação às sensibilidades observadas nos soros negativos para este
anticorpo. Entretanto, esta diferença só foi estatisticamente significativa para o teste
Platelia™. Dentre os estudos brasileiros citados, o de Bisordi et al. (2010) não avaliou
este aspecto. O estudo de Castro-Jorge et al. (2010) possuía 33% de casos
secundários e o estudo de Lima et al. (2010) só investigou a existência de infecção
secundária (presença de IgG) em 54 dos 220 (24,5%) soros da amostra.
Não existem estudos publicados sobre dois (Dengue IgM ELISA Test da Bioeasy
Diagnóstica e DENV Detect TM IgM (MAC ELISA) da InBios International) dos três
testes ELISA IgM avaliados neste estudo. Nossos resultados mostraram que a
sensibilidade média dos testes para detecção de IgM foram aproximadamente
40,3% em amostras de fase aguda e 84% em amostras de fase convalescente. O
teste que apresentou a maior sensibilidade foi o teste Dengue IgM ELISA Test
(Bioeasy Diagnóstica) com 52,1% de sensibilidade para amostras de fase aguda e
97,9% para amostras de fase convalescente.
Sensibilidades próximas às mostradas no nosso estudo nos testes da Panbio foram
descritas por Blacksell et al (2012) que encontraram 83,2% de positividade nas
amostras de fase aguda e 93,7% nas amostras convalescentes. É importante
destacar que no estudo de Blacksell não há informação sobre o tempo de início dos
sintomas em relação à coleta das amostras, o que pode influenciar na sensibilidade
dos testes para detecção de anticorpo IgM, como demostra nosso estudo. Branch e
Levett (1999) encontraram 85% de sensibilidade em amostra de soro obtidas na fase
convalescente (Branch; Levett 1999). Hu e colaboradores (2011), estudando
somente casos de infecção primária encontraram 42,9% de sensibilidade em
amostras coletadas até o terceiro dia de doença e 100% em amostras obtidas após
o oitavo dia (Hu et al. 2011).
58
A sorologia para IgM é um ensaio simples e confiável, porém com sensibilidade
reduzida na fase aguda da doença, já que depende da produção e ascensão dos
níveis de anticorpos. Como previsto, a sensibilidade para todos os testes IgM foi
maior para amostras coletadas na fase convalescente em comparação com
amostras de fase aguda. Nesse estudo, as mais altas sensibilidades foram obtidas
com testes para detecção de IgM em amostras de fase convalescente, entretanto,
do ponto de vista clínico, a conclusão de um diagnóstico de dengue nessa fase tem
pouca importância clínica.
Na fase aguda da doença, a combinação de testes que detectam simultaneamente
ou separadamente NS1 e IgM, aumentam a sensibilidade do diagnóstico da doença
como já foi demonstrado por outros pesquisadores (Guzman et al., 2010b; Duong et
al., 2011; Blacksell et al., 2012). O nosso estudo mostrou que o teste
imunocromatográfico que possuía essas duas plataformas de detecção apresentou
maior sensibilidade para o diagnóstico quando comparado com a leitura isolada do
teste NS1. Da mesma forma, a combinação de resultados de testes ELISA para
detecção de NS1 e anticorpos IgM, permitiu um aumento na sensibilidade do
diagnóstico em relação à utilização de seus resultados isoladamente.
À luz dos recentes resultados sobre o desempenho dos testes para o diagnóstico do
dengue, devemos destacar que, em estudos futuros, é fundamental a análise dos
resultados estratificados conforme o sorotipo infectante e quanto ao status
sorológico do indivíduo, e tempo de doença.
59
7 CONCLUSÕES
1. Todos os testes NS1 apresentaram maior sensibilidade para o DENV-1 em
relação ao DENV-2 e 3.
2. O teste Platelia™ (Bio-Rad) apresentou sensibilidade mais baixa na presença
de anticorpos IgG.
3. Para o diagnóstico de dengue utilizando amostras de fase aguda, a
combinação de um teste para detecção da proteína NS1 com um teste de
detecção de anticorpos IgM aumentou a sensibilidade dos testes para
diagnóstico.
4. A maior sensibilidade para os testes de detecção de IgM foi observada para
amostras coletadas em fase convalescente da doença.
60
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APÊNDICE
APÊNDICE A – Termo de Consentimento
TERMO DE CONSENTIMENTO ESCLARECIDO
TÍTULO DO PROJETO: Avaliação do desempenho de diferentes metodologias no diagnóstico da Dengue. Eu,___________________________________________________________ fui convidado (a) para participar como voluntário de um estudo para avaliar o desempenho de diferentes metodologias para o diagnóstico da Dengue. Para isso, serão realizadas duas coletas de sangue, sendo que a primeira será feita no momento em que você comparecer no posto de saúde para a coleta de sangue para os exames solicitados pelo médico da unidade. A segunda será realizada quando você retornar para confirmar o diagnóstico da Dengue. Todos os procedimentos éticos em pesquisa serão rigorosamente cumpridos. Se você aceitar participar deste estudo, suas informações serão mantidas confidenciais. CONSENTIMENTO Eu recebi uma cópia desse termo de consentimento e sei que uma cópia ficará guardada no arquivo do estudo. Entendo que posso deixar o estudo a qualquer momento que quiser ou que o médico do estudo pode me pedir para deixar o estudo se ele entender que esta decisão é melhor para mim. Eu entendo que se eu assinar, ou colocar minha impressão digital no espaço abaixo, estou concordando em participar do estudo e realizar todos os procedimentos do mesmo estabelecidos neste documento. ________________ __________________________ ______________ Assinatura do voluntário Nome do voluntário Data/Hora Eu expliquei os objetivos deste estudo para o voluntário. Tenho plena convicção que ele (a) entendeu os objetivos, riscos e benefícios da sua participação no estudo. ________________ __________________________ ______________ Assinatura do investigador Nome do investigador Data/Hora
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APÊNDICE B – Ficha Clínica
PROJETO DENGUE – FICHA CLÍNICA Dados pessoais Nome:______________________________________________________________ Sexo: M ( ) F ( ) Data de nascimento: ___/___/______ Idade:_________ Endereço: ___________________________________________________________ Bairro:___________________________ Cidade: _________________________ Ponto de referência: ___________________________________________________ Telefone: (res) _______________ (cel) ________________ (outro) ____________ Ocupação (profissão):_______________________________ Dados Clínicos Data da primeira coleta: ___/___/___ _____ dias de sintoma Local da coleta: _______________ Data da segunda coleta: ___/___/___ _____ dias de sintoma
Sinais e Sintomas Primeira Coleta Segunda Coleta Febre ( ) ( ) Cefaléia ( ) ( ) Mialgia ( ) ( ) Artralgia ( ) ( ) Dor retro-orbital ( ) ( ) Náusea ( ) ( ) Vômito ( ) ( ) Diarréia ( ) ( ) Rash ( ) ( ) Sangramento anormal ( ) ( ) Outras Informações Dengue anterior: ( )Não Quantas vezes: _________________________ ( ) Sim Prova do laço: ( ) Negativa ( ) Positiva Hemograma (se houver) Hematócrito: Leucócitos: Plaquetas: