Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos...

Universidade Federal do Rio de Janeiro Hospital Universitário Clementino Fraga Filho – HUCFF Pós Graduação em Clínica Médica – Pneumologia Tese de Doutorado

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Rio de JaneiroMarço de 2009

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Vinicius Ribeiro Cabral

Avaliação da Resposta Imunitária a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de

Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências.

Orientador: Drª Maria Helena Feres Saad

Profª Drª Leila de Souza Fonseca

Rio de JaneiroMarço de 2009

Cabral, Vinicius Ribeiro Avaliação da resposta imunitária celular a antígenos micobacterianos no

sangue periférico de pacientes tuberculosos e contatos saudáveis / Vinicius Ribeiro Cabral. – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2009.

xi, 136 f. : il. ; 31 cm.

Orientador: Maria Helena F. Saad e Leila de Souza Fonseca. Tese (Doutorado) – UFRJ, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-

Graduação em Clínica Médica – Pneumologia, 2009. Referências Bibliográficas: f. 108-124.

1. Tuberculose pulmonar - imunologia. 2. Tuberculose pulmonar -diagnóstico. 3. Mycobacterium tuberculosis - imunologia. 4. Antígenos de bactérias - imunologia. 5. Imunidade celular. 6. Linfócitos T - imunologia. 7. Citocinas - imunologia. 8. Imunofenotipagem. 9. Expressão gênica. 10. Humanos. 11. Feminino. 12. Masculino. 13. Adulto. 14. Meia-idade. 15. Estudos Prospectivos. 16. Pneumologia – Tese. I. Saad, Maria Helena Féres. II. Fonseca, Leila de Souza. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica – Pneumologia. IV. Título.


Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências.

Rio de Janeiro, 11 de Março de 2009.

Aprovada por:

_______________________________________

Presidente: Drª. Maria Helena Féres Saad, Pesquisadora Titular - FIOCRUZ

_______________________________________

Drª. Danuza de Almeida Esquenazi, Profª Adjunta - UERJ

_______________________________________

Drª.Maria Cristina Vidal Pessolani, Pesquisadora Titular - FIOCRUZ

_______________________________________

Drº. Neio Lucio Fernandes Boechat, Profº Adjunto - UFRJ

_______________________________________

Drº. Walter Martin Roland Oelemann, Prof° Adjunto - UFRJ

i

RREESSUUMMOO

CABRAL, Vinicius Ribeiro. Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2009.

A tuberculose é a doença infecciosa que mais mata no mundo, mas ainda permanece um

mistério como ocorre a interação do parasita com o hospedeiro. O objetivo neste trabalho foi

avaliar o perfil de resposta imunitária celular de pacientes com tuberculose pulmonar e seus

contatos recentes e indivíduos sadios de área endêmica, utilizando antígenos brutos ou

recombinantes, tais como 16 kDa, AlaDH, ESAT-6/CFP-10 e 38 kDa/CFP-10. Foi utilizado a

citometria de fluxo para imunofenotipagem e caracterização de células importantes na resposta

imunitária ao M.tuberculosis (MTB). A expressão gênica (por qPCR) e produção in vitro (por

ELISA) de algumas citocinas também foram avaliadas. Nossos resultados com os antígenos

brutos apresentaram-se heterogêneos, tanto para a proliferação celular, como para o perfil de

produção de IFN-γ, onde os voluntarios TCT+ apresentaram menor produção de IFN-γ quando

estimulados com as cepas resistentes e os indivíduos TCT- reconheceram determinadas cepas

cluster, indicando que esta variabilidade parece estar relacionada a capacidade de resposta dos

indivíduos, bem como a característica da cepa infectante. Na caracterização celular frente à

estimulação com antígenos recombinantes de MTB, observamos tendência de queda na

proliferação celular nos pacientes TB, principalmente para linfócitos Tcit, em relação aos

voluntários saudáveis, o que foi refletido na queda da expressão gênica, produção de IFN-γ e

frequência de respondedores. Entre os indivíduos não-TB, os TCT+ mostraram redução

significativa na expansão de linfócitos T CD4+ e CD8+ de memória e efetores, além de NK e

NKT para os antígenos combinados. Nos indivíduos contatos recentes de pacientes com TB com

TCT+ observamos expansão de células NK e NKT que, embora não significativa, pode ter

aumentado a produção média de IFN-γ destas pessoas. Quanto ao tempo de tratamento, os

pacientes TB tratados a <60 dias tiveram os linfócitos Tcit aumentados pelo AlaDH e 16kDa,

sendo que este último também elevou a média dos Tcit de memória, mas apenas nos pacientes

tratados 60 dias. Nestes pacientes, foi evidenciado o aumento de IFN-γ para o ESAT-6/CFP-

10 e para todos os antígenos na IL-10. Nos individuos TCT+ respondedores para IFN-γ, para o

antígeno 16kDa associado as combinacoes, 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10, sugere que estes

podem ser farramenta util para identificar infecção latente. Observou-se, ainda, que o hábito

alcoolista diminuiu a média de linfócitos Taux nos pacientes TB para a combinação 38kDa/CFP-

10, o que indica que um estudo mais aprofundado deva ser realizado. A expressão gênica para

IFN-γ refletiu os resultados obtidos no ELISA, principalmente para 38kDa/CFP-10, ESAT-

6/CFP-10, 16kDa e PPD, porém o mesmo não ocorreu para IL-10. Este estudo mostrou um

achado ainda nao descrito na literatura, concernente ao padrao de resposta de IFN- aos

antígenos 16kDa e a combinaçao 38kDa/CFP-10 simular a descrita para ESAT-6/CFP-10/16

kDa, sugerindo o potencial de ambas como ferramenta para auxiliar em ensaios de liberação de

IFN-γ para detecção de infecção latente. ESAT-6/CFP-10 poderiam ser utilizadas como

ferramenta discriminatória em ensaios de liberação de IFN-γ para detecção de infecção latente,

embora uma população maior deva ser avaliada para confirmar estes dados.

ii

AABBSSTTRRAACCTT

CABRAL, Vinicius Ribeiro. Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2009.

Tuberculosis is the infectious disease that kills more people in the world, but still remains a mystery the interaction of the parasite with the host. The objective of this study was to evaluate the profile of cellular immune response of patients with pulmonary tuberculosis and its recent contacts and healthy individuals from endemic area, using crude or recombinant antigens, such as 16 kDa, AlaDH, ESAT-6/CFP-10 and 38 kDa/CFP-10. Flow cytometry was assayed for immunophenotyping and characterization of cells important in immune response to M.tuberculosis (MTB). The gene expression (by qPCR) and production in vitro (by ELISA) of some cytokines were also evaluated. Our results with crude antigens were heterogeneous for both cell proliferation and to the profile of IFN-γ production, where individuos TCT+ showed lower production of IFN-γ when stimulated with the resistant strains and that TCT-recognized certain cluster strains, indicating that this variability seems to be related to the responsiveness of individuals and the characteristic of the infecting strain. Whencharacterized cell stimulation by recombinant antigens of MTB, was observed a trend of decrease in cell proliferation for TB patients, mainly to T citotoxic lymphocytes in relation to healthy volunteers, which was reflected in the decrease of gene expression, production of IFN-γ and frequency of responders. Among the non-TB, the TCT+individuos elicited significant reduction in the expansion of T CD4+ and CD8+, memory and effector lymphocytes and NK and NKT cells to combinations of antigens. In individuals contact recent of TB patientes with TCT+ was find expansion of NK and NKT cells which, although not significant, may haveled an increase average production of IFN-γ of these contact. According to the tratment, patients TBtreated <60 dayshad the T citotoxic lymphocytes increased by AlaDH and 16kDa, while the latter also increased the average of memory T citotoxic lymphocyte, but only in TB patients 60 days. In these patients, was shown the increase of IFN-γ for ESAT-6/CFP-10 and for all antigens in IL-10. TCT+ individuos was found to increase the response of IFN-γ for the 16kDa and both combination 38kDa/CFP-10 and ESAT-6/CFP-10 antigens; it seems to be useful to identifiy latent infection. Also was observed that the alcoholic habit has decreased the average of T helper lymphocytes in TB patients for the combination 38kDa/CFP-10, indicating that further study should be conducted. The gene expression for IFN-γ reflected the results obtained by ELISA, especially for 38kDa/CFP-10, ESAT-6/CFP-10, 16kDa and PPD, but this has not occurred for IL-10. We conclude that the 16kDa antigen and combinations 38kDa/CFP-10 and ESAT-6/CFP-10 could be used as a discriminatory tool in testing the release of IFN-γ for detection of latent infection.However, futher study must be done to confirm the present data. This study showed a new find concerning the 16kDa antigen and combination 38kDa/CFP-10 eliciting IFN-response pattern similar that described for ESAT-6/CFP-10/16 kDa, suggesting the potential of both combinations as tool in testing the release of IFN-γ for detection of latent infection.

iii

LLIISSTTAA DDEE IILLUUSSTTRRAAÇÇÕÕEESS

Figura 1 Distribuição mundial dos novos casos de Tuberculose no mundo e no Brasil, com taxas de incidência, prevalência e mortalidade. Dados de 2006 adaptados de WHO, 2008.

3

Figura 2 Esquema representativo do envelope celular de M.tuberculosis. Adaptado de Riley, (2006).

6

Figura 3 Gráfico representando a curva de acúmulo de fluorescência (preto) utilizando o modelo logístico de 5 parâmetros e a representação da função da sua primeira (vermelho) e segunda (verde) derivada. O ponto de interseção da linha vertical verde, que parte do ponto de máxima da função da segunda derivada, na curva de acúmulo de fluorescência, corresponde ao Cq (CpD2) e na curva de eficiência (azul) corresponde à eficiência da reação (Eff.). Fonte: Spiess e cols. (2008).

40

Figura 4 Médias e erro-padrão do número de linfócitos T auxiliares (CD3CD4+) e T citotóxicos (CD3CD8+), após estimulação com cepas clínicas com menos de 4 cópias de IS6110 e controles, em cultura de PBMC de indivíduos com teste cutâneo a tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-).

43

Figura 5 Médias e erro-padrão do número de linfócitos T auxiliares e T citotóxicos, após estimulação com cepas clínicas de 10 e 11 cópias de IS6110 e controles, em cultura de PBMC de indivíduos com teste cutâneo a tuberculina positivo e negativo.

44

Figura 6 Citometria de Fluxo representativa do voluntário C com teste cutâneo a tuberculina (TCT) negativo, mostrando a expressão de CD4+ e CD8+ para o controle não-estimulado e estimulado com a cepa 270, a qual induziu diminuição na expressão de Linfócitos T cit (CD8+). Os histogramas foram analisados dentro da população de linfócitos CD3+.

45

Figura 7 Citometria de fluxo representativa no voluntário J com teste cutâneo a tuberculina positivo mostrando diminuição de células T CD4+ após estimulação com as cepas cluster resistentes a tuberculostáticos 081 e 282, mas com manutenção da expressão e número absoluto de células CD8+. Os histogramas foram analisados dentro da população de linfócitos CD3+.

46

Figura 8 Média de produção de IFN- pelas PBMC de voluntários sadios com teste cutâneo a tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-) de acordo com o perfil de susceptibilidade as drogas tuberculostáticas das cepas clínicas de M.tuberculosis usadas como estímulo.

49

Figura 9a Porcentagem média de diferentes populações celulares de pacientes com tuberculose ativa (TBa) e indivíduos não-TB estimulados com o antígeno PPD e os antígenos micobacterianos isolados específicos para MTB.

52

Figura 9b Porcentagem média de diferentes populações celulares de pacientes com tuberculose ativa (TBa) e indivíduos não-TB estimulados com os antígenos micobacterianos combinados, específicos para MTB.

53

iv

Figura 10a Porcentagem média de diferentes populações celulares de indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (TCT-) estimulados com o antígeno PPD e os antígenos micobacterianos isolados, específicos para MTB. * (p<0,05).

54

Figura 10b Porcentagem média de diferentes populações celulares de indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (TCT-) estimulados com o antígeno PPD, os antígenos micobacterianos isolados e combinações, específicos para MTB. * (p<0,05).

56

Figura 11a Porcentagem média de diferentes populações celulares dos indivíduos não-TB categorizados quanto a exposição a tuberculose: CTr = com exposição recente a pacientes com TB ativa e Cae = indivíduos de área endêmica para TB, estimulados com os antígenos PPD e recombinantes simples específicos para MTB.

57

Figura 11b Porcentagem média de diferentes populações celulares de indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (TCT-) estimulados com os antígenos micobacterianos combinados específicos para MTB.

59

Figura 12a Porcentagem de diferentes populações celulares nos pacientes em início do tratamento (TBi<60d) e tratados >60 dias (TBt≥60d), estimulados com os antígenos PPD e recombinantes simples, específicos para MTB. (* p<0,05).

60

Figura 12b Porcentagem de diferentes populações celulares nos pacientes em início do tratamento (TBi<60d) e tratados >60 dias (TBt≥60d), estimulados com os antígenos micobacterianos combinados específicos para MTB.

62

Figura 13 Reatividade média da produção de IFN- e IL-10 testados por em saio imunoenzimático (ELISA) no sobrenadante de cultura de PBMC, de pacientes com tuberculose ativa (TBa), e indivíduos não-TB, categorizados quanto a reação positiva (TCT+) ou negativa (TCT-) para o teste cutâneo à tuberculina estimuladas com diferentes antígenos de MTB.

64

Figura 14 Concentração de IFN- e IL-10 produzido pelos indivíduos não-TB TCT+ e TCT-, categorizados quanto a exposição a tuberculose: CTr = com exposição recente a pacientes com TB ativa e Cae = indivíduos de área endêmica para TB, estimulados com os antígenos PPD, recombinantes simples e combinados, específicos para MTB. (* p<0,05).

66

Figura 15 Resposta média da produção de IFN- e IL-10 por pacientes TBa no início (TBi <60d) e com mais de 60 dias (TBt>60d) de tratamento. Resultados obtidos por teste imunoenzimático (ELISA). (*=p<0,05).

68

Figura 16 Expressão gênica para FoxP3 em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.

76

Figura 17 Expressão gênica para FoxP3 nos indivíduos não-TB em células não estimuladas (N.E.) e estimuladas com antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão já normalizados com a expressão dos genes constitutivos.

77

v

Figura 18 Expressão gênica para IFN- em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.

78

Figura 19 Expressão gênica para IFN- nos indivíduos não-TB em células não estimuladas (N.E.) e estimuladas com antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão já normalizados com a expressão dos genes constitutivos.

78

Figura 20 Expressão gênica para IL-1 em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.

79

Figura 21 Expressão gênica para IL-6 (A) em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos. (B) expressão gênica nos indivíduos não-TB em células não estimuladas (N.E.) e estimuladas com antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão.

80

Figura 22 Expressão gênica para IL-8 em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.

81

Figura 23 Expressão gênica para IL-10 de pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.

82

Figura 24 Expressão gênica para TGF- em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.

83

vi

LLIISSTTAA DDEE TTAABBEELLAASS

Tabela 1 Características, seqüência e condições dos oligonucleotídeos utilizados na reação de qPCR

39

Tabela 2 Características fenotípicas e genotípicas das cepas clínicas de MTB usadas na estimulação in vitro de PBMC de indivíduos com teste cutâneo a tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-)

41

Tabela 3 Heterogeneidade de resposta da produção de IFN- pelas PBMC de voluntários sadios com teste cutâneo a tuberculina positivo e negativo. Os símbolos indicam positivo ou não para a produção de IFN-

48

Tabela 4 Características demográficas, clínicas e laboratoriais dos sujeitos deste estudo: pacientes com tuberculose ativa (TBa), contatos recente de pacientes com tuberculose ativa (CTr) e controles de área endêmica (Cae).

50

Tabela 5 Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares de pacientes com tuberculose ativa (TBa) e indivíduos não-TB, estimulados com o antígeno PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB.

52, 53

Tabela 6 Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares dos indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-), e estímulados com os antígenos PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB.

55, 56

Tabela 7 Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares dos indivíduos não-TB, categorizados quanto a exposição a tuberculose: CTr = com exposição recente a pacientes com TB ativa e Cae = indivíduos de área endêmica para TB, estimulados com os antígenos PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB.

58, 59

Tabela 8 Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares nos pacientes em início do tratamento (TBi<60d) e tratados >60 dias (TBt≥60d), estimulados com os antígenos PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB.

61, 62

Tabela 9 Freqüência e significância estatística da resposta imune por IFN- produzido pelas PBMC de pacientes TBa e indivíduos não-TB com teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (PPD -), estimulados com antígenos micobacterianos.

70

Tabela 10 Freqüência e significância estatística da resposta imune por IL-10 produzida pelas PBMC de pacientes TBa e indivíduos não-TB com teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (TCT-), estimulados com antígenos micobacterianos.

71

vii

LLIISSTTAA DDEE SSIIGGLLAASS EE AABBRREEVVIIAATTUURRAASS

16kDa Proteína de choque térmico de 16kDa

38kDa Lipoproteína ligante de fosfato de 38kDa

a.C. Antes de Cristo

AC Células Apresentadoras de Antígeno

AIC Akaike’s Information Criterion

AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

AlaDH Alanina-L dehidrogenase

APC Flourocromo Aloficocianina

BAAR Bacilo Álcool-ácido Resistente

BCG Mycobacterium bovis – Bacilo Calmette-Guérin

Cae Controle de área endêmica

CD “Clusters of Differentiation” = Grupos de diferenciação

Célula NK / NKT Células Natural Killer / Natural Killer de linhagem T

CFP-10 Proteína do filtrado de cultura de 10 kDa

Cq Ciclo de quantificação

CTLA-4 Antígeno 4 associado ao linfócito T citotóxico

CTr Contato recente de paciente com tuberculose ativa

Cy 5.5 Fluorocromo Cyan 5.5

DC Célula Dendrítica

DEPC Dietilpirocarbonato

DNA Ácido Desoxiribonucléico

DTT 1, 4-Dithiothreitol

Eff Eficiência

ELISA “Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay”

ESAT-6 Alvo antigênico precocemente secretado de 6kDa

ETH Etionamida

FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz

FITC Fluorocromo Isotiocianato de Fluoresceína

GITR Receptro de glicocorticóide associado ao TNF

GPI Glicosilfosfatidilinositol

HIV Vírus da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

HSP Proteínas de choque térmico

viii

HUCFF Hospital Universitário Clementino Fraga Filho

IFN- Interferon-gama

IGRA Interferon Gamma Release Assay

IL Interleucina

IL-1β Interleucina 1 beta

IL-2 Interleucina 2

IL-4 Interleucina 4

IL-6 Interleucina 6

IL-8 Interleucina 8

IL-10 Interleucina 10




INH Isoniazida

IOC Instituto Oswaldo Cruz

IPTG Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo

IS6110 Elemento de Inserção 6110, presente no genoma de MTB

LAM Lipoarabinomanana

LAMICEL Laboratório de Microbiologia Celular

MANr Receptor de manose do macrófago

MDR Multidroga resistência

MDR Multidroga resistência

ML Mycobacterium leprae

MTB Mycobacterium tuberculosis

MTC Complexo M. tuberculosis

não-TB Voluntário ausente de sintomas para tuberculose

nTreg / iTreg Linfócito T regulatório natural / induzido

OMS Organização Mundial de Saúde

ORFs Open reading frame – Janela aberta de leitura

pb Pares de bases (nucleotídeos)

PBMC Células Mononucleares do Sangue Periférico

PBS Tampão Fosfato Salina

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

PE Fluorocromo Ficoeritrina

ix

PHA Phaseosus vulgaris - fitohemaglutinina

PPD Proteína purificada derivada de cultura do MTB

PZA Pirazinamida

qPCR Reação em cadeia da Polimerase em tempo real

R Resistente

RD Região de Diferenciação

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RFP Rifampicina

RI Resposta Imunitária

RNA Ácido Ribonucléico

RNAm Ácido Ribonucléico Mensageiro

RT-PCR Reação em cadeia da Polimerase com Transcriptase Reversa

S Sensível

SM Estreptomicina

SPSS Statistical Package for Social Sciences

Taux / Tcit Linfócitos T auxililar e T citotóxico

TB Tuberculose

TBa Tuberculose ativa

TBi<60d Paciente Tuberculoso com menos de 60 dias de tratamento

TBt≥60d Paciente Tuberculoso com mais de 60 dias de tratamento

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TCR Receptor de Células T

TCT+ / TCT- Teste cutâneo à tuberculina positivo ou negativo

TGF-β Fator de crescimento transformante - beta

Th1 e Th2 Linfócitos T auxiliares de Perfil tipo 1 e 2

TLR Receptores “Toll-Like”

TMB Trimetilbenzidina

TNF Fator de Necrose Tumoral

Treg Linfócito T regulatório

T Células T com receptores TCR tipo Gama-delta

x

SSUUMMÁÁRRIIOO

1) INTRODUÇÃO_________________________________________________ 1

1.1) Bacteriologia da Tuberculose ____________________________________ 41.2) A doença ___________________________________________________ 71.3) O diagnóstico ________________________________________________ 81.4) Os avanços moleculares no diagnóstico da TB _______________________ 91.5) A imunologia _______________________________________________ 12

2) OBJETIVO GERAL____________________________________________ 25

2.1 ) Objetivos Específicos ________________________________________ 25

3) PACIENTES E MÉTODOS ______________________________________ 26

TIPO DE ESTUDO _______________________________________________ 26

POPULAÇÃO AMOSTRAL E SELEÇÃO DOS PACIENTES ____________ 27

PERÍODO E LOCAIS DE ESTUDO _________________________________ 28

CRITÉRIOS DE INCLUSÃO ______________________________________ 28

CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO ______________________________________ 29

ENTREVISTA DOS PACIENTES___________________________________ 30

PROCEDIMENTOS ______________________________________________ 30

Materiais ______________________________________________________ 30Coleta do espécime clínico ________________________________________ 31Teste Cutâneo da Tuberculina ______________________________________ 31Cultura de leucócitos totais do sangue periférico ________________________ 32ELISA para pesquisa de IFN-γ e IL-10 _______________________________ 33Marcação das células do sangue periférico para análise em citômetro de fluxo _ 34

ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA _______________________________ 35

Isolamento de RNA______________________________________________ 35Remoção do DNA contaminante ____________________________________ 36Quantificação dos níveis de expressão________________________________ 37Análise de agrupamento hierárquico dos perfis de expressão gênica _________ 38Testes estatísticos _______________________________________________ 38

4) RESULTADOS ________________________________________________ 41

4.1) Estimulação in vitro de PBMCs de voluntários TCT+ e TCT- com o corpo bacteriano total de diferentes cepas clínicas de MTB. ____________________ 41

4.2) Perfil de linfócitos T auxiliares e T citotóxicos após estimulação com as cepas clínicas de MTB. ___________________________________________ 45

4.3) Resposta de IFN- entre os voluntários sadios TCT+ e TCT- estimulados com diferentes cepas clínicas de MTB________________________________ 47

xi

4.3) Resposta de IFN- entre os voluntários sadios TCT+ e TCT- estimulados com diferentes cepas clínicas de MTB________________________________ 47

4.4) Produção de IFN- em voluntários sadios TCT+ e TCT- após estimulação com cepas de MTB resistentes ou sensíveis às drogas.____________________ 48

4.5) Características clínicas, demográficas e epidemiológicas dos indivíduos arrolados para os testes com antígenos recombinantes. ___________________ 49

4.6) Caracterização celular de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) após estimulação com antígenos micobacterianos recombinantes. ____ 51

4.7) Análise da produção de citocinas Th1 (IFN-) e Th2 (IL-10) _________ 63

4.7) Análise da produção de citocinas Th1 (IFN-) e Th2 (IL-10) _________ 63

4.8) Freqüência de positividade para IFN- e IL-10 no sobrenadante de PBMC dos pacientes TBa e indivíduos não-TB estimulados com diferentes antígenos micobacterianos, determinado pelo método imunoenzimático (ELISA) _______ 69

4.9) Análise dos dados clínicos, epidemiológicos e demográficos relacionados a população com resultado de imunofenotipagem e produção de citocinas ______ 72

4.10) Expressão gênica de diversas citocinas na resposta imunitária ao MTB _ 76

5) DISCUSSÃO __________________________________________________ 84

6) CONCLUSÕES_______________________________________________ 104

7) PERSPECTIVAS _____________________________________________ 107

8) REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS _____________________________ 108

ANEXO A ___________________________________________________ 125ANEXO B____________________________________________________ 128ANEXO C____________________________________________________ 129ANEXO D ___________________________________________________ 130


Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.

1

11)) IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO

A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa que assola a humanidade

desde tempos remotos (ROSEMBERG, 2001). Data de 3.700 a.C. os primeiros relatos

comprovados de infecção micobacteriana, encontrados no Egito Antigo (MORSE e

cols., 1964; MANCHESTER, K., 1984). A moléstia era conhecida entre os gregos, e

Hipócrates a definiu como “doença de tísica” devido ao progressivo definhamento

imposto ao organismo. Galeno, Plínio e Capadócia a descreveram como sendo

relativamente comum entre romanos, mas só tornou-se epidêmica durante a Revolução

Industrial na Europa a partir do século XVIII (AYVAZIAN 1993; LIMA 2001). É uma

doença que possui características de evolução crônica e tem como agente etiológico

Mycobacterium tuberculosis (MTB) que é uma bactéria álcool-ácido resistente, aeróbica

e de crescimento lento (GROSSET, 1993).

Devido à facilidade de propagação e gravidade da doença, a TB foi considerada

por muito tempo um sério problema de saúde pública, sendo uma das causas mais

comuns de morte entre adultos. Entre os anos 1950 e 1980, o número de casos

decresceu em países desenvolvidos, como os Estados Unidos, principalmente pelos

programas de controle da tuberculose humana, com a introdução de um esquema de

tratamento eficiente com múltiplas drogas (HINES II e cols., 1995).

Na década de 70, com a introdução de esquemas terapêuticos de curto período

contendo rifampicina, acreditava-se que a doença seria erradicada, nos países

desenvolvidos, até o final do século passado, deixando assim de receber a merecida

importância de políticos, formadores de políticas públicas e da comunidade científica

dos países desenvolvidos. Porém, com o advento da Síndrome da Imunodeficiência

Adquirida (AIDS), ocorreu um aumento da incidência de TB associada ao quadro de

imunodepressão da doença, principalmente nos países desenvolvidos (RODRIGUES &



2

SMITH, 1990; KOCHI, 1991). Em seguida a situação epidemiológica da TB foi

agravada pela emergência de cepas multidroga-resistentes (MDR) devido

principalmente à elevada taxa de abandono do tratamento, levando a Organização

Mundial de Saúde (OMS), em 1993, a reconsiderar a TB um problema de saúde pública

mundial (RAVIGLIONE e cols., 1995).

A tuberculose é a terceira maior causa mundial de mortalidade, sendo a doença

infecciosa que sozinha mais mata no mundo. Dados atuais da OMS estimam 9,2

milhões de novos casos de TB, incluindo 4,1 milhões de novos casos BAAR+ (44% do

total) e 0,7 milhões de casos HIV-positivos (8% do total). A estimativa de casos

prevalentes é de 14,4 milhões e de 0,5 milhões de casos de TB multirresistente. O

número de notificações aumentou em 2006 para 5,1 milhões de novos casos, sendo 2,5

milhões BAAR+ (50%). Aproximadamente 1,5 milhões de pessoas HIV-negativos e 0,2

milhão HIV-positivo evoluíram a óbito em 2006. A maioria dos casos de TB no mundo

concentra-se em 22 países, com aproximadamente 80% dos casos, que são monitorados

e avaliados anualmente pela OMS. A Índia, China, Indonésia, África do Sul e Nigéria

são os 5 países com o maior número absoluto de casos. O Brasil ocupa o 16º lugar nesta

lista, com incidência de 50/100.000 hab. e taxa de mortalidade de 4/100.000 hab.

(Figura 1 - WHO, 2008). Ainda segundo a OMS, estima-se que nas próximas duas

décadas, 200 milhões de pessoas ficarão doentes e 35 milhões morrerão de tuberculose

no mundo se não forem identificados novos métodos diagnósticos, novas vacinas e

medicamentos, que auxiliem na implementação de estratégias mais apropriadas para a

identificação dos indivíduos doentes, e com infecção latente, levando ao efetivo

tratamento e favorecendo o real controle da TB (WHO, 2004).



3

Figura 1: Distribuição mundial dos novos casos de Tuberculose no mundo e no Brasil, com taxas de incidência, prevalência e mortalidade. Dados de 2006 adaptados de WHO, 2008.



4

1.1) Bacteriologia da Tuberculose

As Micobactérias

Taxonomicamente, as micobactérias são classificadas no gênero

Mycobacterium, o qual é o único representante da família Mycobacteriaceae, na ordem

Actinomycetales. Diversos organismos estão incluídos nesta ordem, porém

micobactérias e outros grupos correlatos são facilmente distinguíveis pela sua

capacidade de síntese do ácido micólico. Espécies micobacterianas são tradicionalmente

diferenciadas com base em características fenotípicas (RASTOGI e cols., 2001).

O gênero Mycobacterium originou-se da observação que bastonetes, mantidos

em cultura líquida, formam películas semelhantes às dos fungos (“mico” = fungo).

Micobactérias são bacilos imóveis, gram-positivos, aeróbios obrigatórios, não

formadores de esporos, possuindo alto conteúdo lipídico na parede celular. Esta parede

composta, predominantemente, de ácidos micólicos (mais de 50% do seu peso seco) que

confere aos espécimes deste grupo um caráter álcool-ácido resistente (WHEELER &

RATLEDGE, 1994). Esta característica está relacionada ao fato das micobactérias se

deixarem corar com corantes básicos e não se descorar sob ação de solução álcool-

ácido, característica esta utilizada como ferramenta para auxiliar o diagnóstico das

micobacterioses. Até o momento, são conhecidas 138 espécies de micobactérias

(http://www.bacterio.net) as quais podem ser divididas em três grupos: as que infectam

aves, animais de sangue frio, e as que causam tuberculose em mamíferos (HINES II e

cols., 1995).

Do ponto de vista dos cuidados para cultivo, as espécies do gênero

Mycobacterium formam um espectro natural, que vai desde as micobactérias saprófitas,

que crescem exuberantemente em meios não-enriquecidos, a 45ºC, ao bacilo da



5

tuberculose que cresce discretamente em meios enriquecidos a 37ºC, e ao

Mycobacterium leprae que não foi até agora cultivado em meios artificiais (GROSSET,

1993).

As principais micobacterioses humanas são causadas por M .tuberculosis como

parasita intracelular facultativo e por M.leprae, parasita intracelular obrigatório, agentes

etiológicos da tuberculose e da hanseníase, respectivamente. Estes microrganismos são

ainda causa de morbidade e mortalidade significativas nos países em desenvolvimento

(MURRAY e cols., 1992).

Mycobacterium tuberculosis

O bacilo da tuberculose humana se apresenta sob a forma de bastonetes de 0,2

– 0,6m de largura por 2,4 – 4m de comprimento, disposto isoladamente, aos pares em

forma de V ou em pequenos grumos. Ramificações e espessamento em clava são, por

vezes, observados em esfregaços de culturas antigas. MTB se cora irregularmente pelo

método de coloração de Gram. Para evidenciá-lo, a coloração mais utilizada é a de

Ziehl-Neelsen (GROSSET, 1993).

A parede celular de MTB é extremamente complexa, composta por uma dupla

camada lipídica, interligada por peptidioglicanos. A camada interna é constituída de

ácidos micólicos ligados a peptidioglicanos através de arabinogalactanas (um polímero

de arabinose e galactose). A camada mais externa é constituída de glicolipídios

anfipáticos, com um pólo basal lipídico e um pólo apical polissacarídico (FENTON &

VERMUELEN, 1996). Este envelope celular é composto não só por ácidos micólicos,

mas também por lipídios incomuns como o ácido micocerosídico, fenoltiocerol,

lipoarabinomananas e arabinogalactanas (COLE e cols., 1998). As lipoarabinomananas

são potenciais fatores de virulência e podem se ligar a leucócitos, modulando a resposta



6

imunitária (STRONMEIER & FENTON, 1999). Os ácidos micólicos são ácidos graxos

-hidroxilados com uma cadeia lateral de -alquil (ASSELINEAU, J.; LEDERER, E.,

1950). A parede celular do MTB contém 3 classes de ácidos micólicos: alfa- ceto- e

metoximicolatos. Todos possuem um número variado de anéis de ciclopropano nas

configurações cis e trans e são ligados covalentemente às camadas internas de

peptidioglicanos (figura 2) (GEORGE, e cols., 1995; YUAN, e cols., 1995; BARRY, e

cols., 1998). Os ácidos micólicos estão relacionados com sua característica de álcool-

ácido resistência e, juntamente com outras proteínas secretadas ou exportadas de M.

tuberculosis têm sido descritos como importantes moduladores da resposta imune do

hospedeiro (DAFFÉ & ETIENNE, 1999, DE SOUZA e cols. 2008).

Figura 2: Esquema representativo do envelope celular de M.tuberculosis. Adaptado de Riley, (2006)

Com o avanço científico alcançado nas últimas décadas, os métodos

moleculares tornaram-se ferramentas de extrema utilidade na análise dos mecanismos

genéticos de virulência e patogenicidade da tuberculose. Com o sequenciamento do

genoma de MTB H37Rv, já concluído, observou-se que contém 4,41 milhões de pares

Anel de ciclopropano

Porina

Lipoarabinomanana com capa de manose

Acil-glicolipídeos Lipídios livres Complexos

Ac. Micólicos oxigenados

-Ac. Micólicos

Arabinogalactana

Peptídeoglicano

Proteínas da membrana plasmática Lipoproteínas



7

de bases (pb) no seu ácido desoxiribonucléico (DNA) e em torno de 4.000 genes que

codificam proteínas, sendo conhecida a função de ao menos 52% do total. O genoma é

rico em seqüências de DNA repetitivos, particularmente seqüências de inserção, e

grande quantidade de pares G+C (65,5%). O conteúdo G+C é relativamente constante

ao longo do genoma, indicando que a transferência horizontal de ilhas de

patogenicidade, de composição atípica de bases, é provavelmente ausente (COLE e

cols.,1998). Apenas 376 supostas proteínas não apresentam homologia com proteínas

conhecidas e são presumivelmente únicas de MTB (CAMUS e cols., 2002). Estudos

avaliando antígenos relevantes podem levar a descoberta de alvos antigênicos

específicos para obtenção de diagnósticos mais precisos e de vacinas com maior

eficiência para o tratamento e prevenção da tuberculose.

1.2) A doença

Em 1882, Robert Koch isolou o agente causador da tuberculose humana,

iniciando assim uma nova etapa nas pesquisas sobre a doença que acomete o homem há

mais de 6.000 anos (HINES II e cols., 1995). Desde então, cerca de setenta tipos

diferentes de tratamentos à base de soroterapia foram testados, utilizando bacilos

atenuados experimentalmente mortos pelo calor, além de extratos antigênicos protéicos,

lipídicos, lipoprotéicos e glicídicos. Entre eles, o mais difundido foi à vacina de

Friedman, provinda de micobactéria isolada de tartaruga (ROSEMBERG, 2001).

A infecção tuberculosa humana pode ser causada também por M. bovis,

M.bovis BCG e M. africanum. Estes organismos estão agrupados juntamente com M.

tuberculosis, M. microti, M. canetti, M.pinnipedii e M. caprae no Complexo M.

tuberculosis (MTC), de acordo com suas características sorológicas, bacteriológicas,



8

bioquímicas e por sua estreita relação filogenética e patogênica (ARANAZ e cols.,

1999; GRIFFIN e cols., 1995; VAN SOOLINGEN e cols., 1997).

A transmissão da infecção se dá, predominantemente, por via aérea instalando-se

nos pulmões, podendo atingir outros órgãos e evoluir para uma infecção generalizada.

1.3) O diagnóstico

A etapa mais importante no combate ao controle da tuberculose é a identificação

precoce da infecção e do indivíduo doente e seu imediato e completo tratamento,

quebrando assim a cadeia de transmissão. Mas, uma considerável dificuldade

permanece neste âmbito, devido à morosidade para se confirmar o diagnóstico

laboratorial através da cultura, que apesar de sensível necessita de até 8 semanas para

realização. Assim, na prática clínica, o tratamento do paciente é iniciado sem o

benefício do diagnóstico laboratorial (GUZMÁN e cols., 2003). A bacterioscopia,

método diagnóstico mais empregado por ser de baixo custo, simples, rápido e de fácil

execução, é falha na identificação de casos paucibacilares, incluindo as formas extras

pulmonares. A técnica é sensível em espécimes com concentração de bacilos

>5.000/mL e tem baixa especificidade, não discriminando bactérias mortas das vivas e

espécies saprófitas contaminantes presentes no espécime clínico (GLASSROTH, 1993).

Outro sério problema nas políticas de controle da TB se refere à dificuldade

diagnóstica diferencial da doença. Nos hospitais gerais, são admitidos pacientes com

outras co-morbidades, como a infecção pelo HIV, diabete mellitus, insuficiência renal

crônica, neoplasias malignas e outras situações de imunossupressão que usualmente

estão associadas a apresentações incomuns da TB, como a TB pulmonar paucibacilar e a

pleurisia tuberculosa.



9

Tais situações clínico-radiológicas e laboratoriais dificultam sobremaneira o

diagnóstico da TB ativa pelo médico assistente, bem como retardam o início de uma

investigação apropriada. Neste cenário, aumenta a morbi/mortalidade destes pacientes

com TB ativa e também aumenta o risco de transmissão de M. tuberculosis. Estima-se

que uma pessoa bacilífera possa contaminar de 10 a 15 pessoas por ano na comunidade

com a qual tem contato. O risco de contágio de contatos casuais é de 0,2 a 2% e de

contatos recentes é de 5 a 20% , sendo este número exacerbado em ambiente hospitalar

e carcerário (KRITSKI, 2000).

Testes para auxiliar no diagnóstico da tuberculose ativa e latente são necessários

e os baseados na resposta imune são alternativas atraentes e vários trabalhos têm sido

descritos na última década, porém poucos têm sido submetidos a um cuidadoso sistema

de avaliação quanto o seu potencial em diferentes populações de área endêmica

(PERKINS & KRITSKI, 2002; CHO, 2007). Com a maior disponibilidade de antígenos

purificados específicos de M. tuberculosis, a tarefa principal dos investigadores é

conhecer o potencial dos antígenos na modulação da resposta imune do hospedeiro, o

que favorece a identificação de moléculas que se complementem discriminando a

infecção nos seus vários estágios.

1.4) Os avanços moleculares no diagnóstico da TB

Com o avanço da ciência a procura de novos alvos com potencial diagnósticos

para a tuberculose foi direcionada para o campo molecular. Após a elucidação completa

do genoma de M. tuberculosis, foram identificados uma série de genes ausentes na BCG

e presentes no complexo MTB, bem como diferentes ORFs (seqüência aberta de leitura)

potencialmente codificadores de proteínas (COLE e cols., 1998). Isto trouxe a esperança



10

em encontrar moléculas com potencial vacinal e de imunodiagnóstico diferencial da

tuberculose (PYM e cols., 2003). Variados antígenos protéicos têm sido expressos e

caracterizados por recombinação genética, e alguns deles têm se mostrado promissores

na modulação da resposta celular e na produção específica de anticorpos pelo

hospedeiro.

Os antígenos protéicos codificados pela família de genes ESAT-6, são os mais

estudados até o momento. O antígeno ESAT-6 e a proteína de filtrado de cultura de

10kDa (CFP-10) estão localizados no mesmo óperon na RD1 (região de diferenciação

1), presente somente no genoma de micobactérias patogênicas do complexo MTC –

exceto M. kansassi, M. szulgai e M. marinum – e no M. leprae e ausente em todas as

cepas BCG, são codificados pelos genes esxA ou esat6 e esxB ou lhp, respectivamente, e

se caracterizam por serem secretados e terem baixo peso molecular (PITTIUS e cols,

2001; PYM e cols., 2003).

O ESAT-6 é descrito como um potente indutor da resposta imunitária celular.

Estudo realizado no Brasil mostrou que embora os indivíduos com teste cutâneo à

tuberculina (TCT) positivo sejam frequentemente mais reativos para a produção de

inteferon gama (IFN-) in vitro, quando estimulados com os antígenos ESAT-6

combinado ao CFP-10, não apresentam diferença para os pacientes com TB ativa

(CARDOSO e cols., 2002), o que foi confirmado também por TAVARES e cols.

(2007), que comparam a resposta imune de pacientes TB e indivíduos TCT+ e TCT- a

diferentes combinações de antígenos. Neste trabalho, também foi demonstrado que a

combinação dos antígenos 38kDa/CFP-10 apresentava uma ação sinérgica, em relação

aos antígenos testados individualmente, na indução da produção in vitro de IFN- em

pacientes com TB ativa. A freqüência de pacientes respondedores era similar à obtida

com a combinação internacionalmente utilizada – ESAT-6/CFP-10 (70% x 73%,



11

respectivamente). Mas entre os indivíduos TCT +, a frequência variou

significativamente entre estas duas combinações (88% e 58%, respectivamente).

Por outro lado, 90% dos indivíduos infectados não desenvolvem a doença, o que

leva à pergunta se a resposta induzida pelos antígenos ESAT-6/CFP-10 não estaria, em

parte, relacionada à memória imunológica, após o clearance dos bacilos. Ou se parte da

reatividade observada poderia ser cruzada pela exposição dos indivíduos a outras

micobactérias ambientais, que partilham estes antígenos com MTB (ANDERSEN e

cols., 2000, KUNST, 2006). Poucos estudos envolvendo avaliação de resposta imune

de pacientes e contatos são realizados em área endêmica, existindo um vácuo de

conhecimento sobre a contribuição dos diferentes antígenos micobacterianos, hoje

facilmente clonados e expressos, no diagnóstico da TB ativa e latente em áreas

endêmicas, tal como o 38kDa/CFP-10.

Um dos antígenos mais conhecidos de MTB é o 38kDa, uma lipoproteína ligante

de fosfato. Ela foi o primeiro componente isolado do antígeno 5 e foi descrita como

específica do complexo MTC. Tem sido utilizado em testes sorológicos para

tuberculose, apresentando resultados variados de sensibilidade e especificidade,

principalmente por causa de reações cruzadas com outros antígenos na TB pulmonar

(WILKINSON e cols., 1997; SAMANICHI e cols, 2001).

O antígeno 16kDa (16.3kDa ou Heat Shock Protein - HSP) tem um papel crucial

na habilidade de MTB sobreviver em estado latente, em fase estacionária, persistindo no

hospedeiro mesmo dentro de um ambiente celular hostil (CHANG e cols., 1996). Este

antígeno pode estabilizar a estrutura celular durante longos períodos, permitindo ao

bacilo sobreviver ao ambiente pobre em oxigênio do granuloma. Embora seja

classificado como uma HSP, o 16kDa foi encontrado somente no complexo MTC. Em



12

estudos com indivíduos sadios TCT positivos, observou-se baixa resposta celular por

IFN- e alta produção de anticorpos, sugerindo que este antígeno seria um candidato útil

para teste diagnóstico (WILKINSON e cols., 1998). Recentemente, este antígeno foi

descrito como possível marcador de infecção latente em área endêmica, induzindo

resposta de IFN- mais elevada entre controles sadios de área endêmica (DEMISSIE e

cols, 2006).

1.5) A imunologia

1.5.1) A resposta imune inata e a ativação da resposta imune adaptativa

A resposta imune inata é uma forma evolutivamente conservada de

manutenção da homeostase e defesa do organismo encontrada nos seres vivos. A

evolução do processo imune criou um sistema de regulação extraordinariamente

complexo, onde moléculas e células da resposta imunitária (RI) inata influenciam – de

maneira recíproca – a resposta imunitária adaptativa para manter o equilíbrio

homeostásico, induzir resposta protetora eficaz e ao mesmo tempo evitar dano tecidual e

auto-imunidade (LAMBRECHT e cols., 2001). Características importantes da RI inata

incluem (a) habilidade de reconhecer patógenos e/ou dano tecidual e (b) habilidade de

sinalizar a presença destes eventos para células da resposta imune adaptativa.

A ativação da RI inata é desencadeada através do reconhecimento dos

imunógenos por receptores que reconhecem regiões evolutivamente conservadas

encontradas em diversos patógenos. O reconhecimento destes padrões moleculares

conservados permite ao sistema imune determinar a natureza do agente infeccioso.

Estudos atuais conferem grande importância para os receptores “Toll-Like” (TLR) da



13

resposta inata. Os TLRs são proteínas transmembranares que possuem em sua porção

extracelular domínios repetidos ricos em leucina e na porção citoplasmática homologia

com a família de receptores de IL-1, e se associam a moléculas de sinalização

intracelular como o MyD88 (MEDZHITOV e cols., 1997). Até o momento, foram

descritas ao menos 13 moléculas diferentes para esta família de receptores, os quais são

essenciais para o reconhecimento de imunógenos, tanto por células dendríticas (DC)

como por macrófagos (BANCHEREAU e cols., 2000).

As células apresentadoras de antígenos (ACs), como macrófagos e DC, são

parte importante da RI e ajudam a fazer a ligação entre a resposta inata e a adaptativa.

São também cruciais na diferenciação dos linfócitos T auxiliares para um perfil pró-

inflamatório (Th1) ou antiinflamatório (Th2). Ambos os tipos de células são capazes de

fagocitar MTB, mas enquanto as DCs são fagócitos profissionais e liberam citocinas

que arregimentam células do fenótipo Th1, os macrófagos precisam de ativação para

realizar fagocitose e secretam também interleucina 10 (IL-10) que tem efeito inibitório

na resposta imune protetora (HICKMAN e cols., 2002).

As citocinas presentes no local de infecção, bem como a rota de entrada do

patógeno, o tipo e sua concentração no hospedeiro são fatores determinantes para

diferenciação dos linfócitos. A secreção de IL-4, IL-5 e IL-13, importantes na resposta a

patógenos extracelulares direcionam a RI para um perfil Th2. Por outro lado, o perfil

Th1 parece essencial na defesa contra patógenos intracelulares. Este perfil necessita de

produção de citocinas como o IFN- pelas células Th1, a IL-23 e IL-27, que são

produzidas predominantemente por macrófagos e DCs ativadas, e a IL-12 produzida por

células fagocíticas que também estão envolvidas na resposta a patógenos intracelulares

como MTB (ROBINSON & O’GARRA, 2002).



14

1.5.2) A Imunidade humoral na tuberculose

A importância da imunidade humoral durante a infecção tuberculosa, ainda

está pouco esclarecida, principalmente quanto ao papel dos linfócitos B na produção de

anticorpos específicos, apresentação de antígenos aos linfócitos T e produção de

citocinas que promovem a regulação do perfil de resposta imune.

Embora o papel da imunidade mediada por anticorpos na infecção tuberculosa

permaneça incerta, a exposição ao MTB provoca a produção de anticorpos específicos a

diversos antígenos micobacterianos (ANDERSEN e cols., 2000; BOTHAMLEY, 1995;

DANIEL & DEBANNE, 1987; SAAD e cols., 1996), passíveis de utilização como

marcadores da infecção tuberculosa. Em estudo realizado em voluntários vacinados com

BCG duas vezes em intervalo de tempo de 6 meses, observou-se que os vacinados

apresentavam aumento de anticorpos específicos para o antígeno micobacteriano

lipoarabinomanana (LAM). Estes anticorpos favoreciam a inibição da multiplicação

micobacteriana através do aumento do efeito inibitório de neutrófilos e

macrófagos/monócitos, além de aumentarem significativamente as células envolvidas

na resposta imunitária e a produção de IFN- em células T auxiliares e citotóxicas.

Portanto, estes achados sugerem que os anticorpos específicos para micobactéria

favorecem ambas as respostas inata e mediada por células (DE VALLIERE e cols.,

2005).

Turner e colaboradores (2001) investigaram o papel da IL-4 e linfócitos B,

quanto à hipótese do desenvolvimento da resposta imunopatológica na TB pulmonar e a

manutenção da integridade do granuloma estarem ligados ao aumento da IL-4 e dos

linfócitos B, respectivamente. Utilizando modelo murino experimental de tuberculose

crônica, demonstraram não haver influência das células B e produtos da resposta Th2 na

progressão da infecção tuberculosa crônica em camundongos.



15

Existem alguns trabalhos na literatura que apontam para uma relativa

importância de variados componentes do sistema complemento na infecção tuberculosa.

Experimentos realizados in vitro demonstraram que quando se bloqueia os receptores

para C3, a fagocitose de micobactérias por monócitos e macrófagos humanos é reduzida

entre 70 e 90% (SCHLESINGER, 1993; SCHLESINGER e cols. 1990). Ademais, MTB

não-opsonizado pode ligar-se diretamente aos receptores de C3 (CYWES e cols., 1997)

e de C4 (ZAFFRAN & ELLNER, 1997). Entretanto, o melhor receptor caracterizado

para fagocitose de MTB é o receptor de manose do macrófago (ManR), que reconhece

resíduos terminais de manose na parede celular das micobactérias (SCHLESINGER,

1993; SCHLESINGER e cols., 1996).

1.5.3) A resposta imunitária celular adaptativa

A tuberculose é o exemplo de infecção por bactéria intracelular em que a

imunidade protetora e a hipersensibilidade tardia patológica co-existem. MTB não

produz nenhuma exotoxina ou endotoxina conhecida. Assim, as lesões teciduais são

causadas principalmente pela resposta do hospedeiro. A infecção pulmonar primária

freqüentemente se localiza nos alvéolos próximos à pleura, onde ocorre uma reação

inflamatória aguda inespecífica com presença principalmente de eosinófilos

(APPELBERG, 1992). Nesta reação inicial ocorre, em muitos casos, inibição do

crescimento bacilar através do confinamento dos bacilos e da atividade da imunidade

mediada pelos macrófagos alveolares (MARIANO, 1995). Mais de 90% dos indivíduos

infectados permanecem assintomáticos, mas a bactéria pode sobreviver nos pulmões e,

por algum tipo de falha da homeostase, ter seu processo de multiplicação reativado. O



16

desenvolvimento de doença no indivíduo infectado também pode ocorrer por re-

infecção exógena.

De 6 a 8 semanas após a infecção, os linfonodos regionais são alcançados, e os

linfócitos T CD4+ (Cluster of Differentiation) e T CD8+ são ativados. Estas células T

produzem INF-, que ativa os macrófagos potencializando sua habilidade de eliminar os

bacilos fagocitados. O fator de necrose tumoral (TNF) produzido pelas células T e

macrófagos também possui um papel importante na inflamação local durante a ativação

de macrófagos, formação do granuloma (KINDLER e cols., 1989), e possui

propriedades imunorregulatórias (ORME & COOPER, 1999; TSENOVA e cols., 1999;

EHLERS, 2003). Os camundongos deficientes – tanto para o gene do TNF, quanto para

o receptor p55 de TNF – são altamente susceptíveis às infecções micobacterianas

(KANEKO e cols., 1999; ROACH e cols., 2001). Entretanto, MTB é capaz de

sobreviver no interior dos macrófagos, porque componentes da sua parede celular

inibem a fusão dos lisossomos com os fagossomos. Os fagolisossomos são ricos em

próton-ATPase (próton adenosina-trifosfatase) conferindo um ambiente de pH ácido,

hostil para a micobactéria (SMALL, 1994).

A IL-12, outra importante citocina secretada por macrófagos infectados com

MTB, é um heterodímero formado pelas cadeias p35 e p40. Estudo recente observou

que camundongos não produtores da fração p40 apresentam doença progressiva quando

infectados por MTB por via aérea, não ocorrendo o mesmo, entretanto, em animais

deficientes para p35, porque estes animais são capazes de sintetizar a IL-23 que é

dímero de p40 e p19 (COOPER e cols., 1997, 2002). A IL-12 também ativa os

linfócitos, estimulando-os a produzir IFN- e IL-2, o que leva a um perfil de resposta

celular Th1 e inibição de resposta Th2, e a falta de IL-12 ou IL-27 impede o macrófago



17

de controlar o crescimento micobacteriano (ROBINSON & NAU, 2008).

Aparentemente, IL-12 é uma citocina regulatória que conecta a resposta inata e resposta

adaptativa ao MTB (O’NEILL & GREENE, 1998; SIELING e cols, 1994;

TRINCHIERI, 1995, WU e cols, 2007)

A IL-6 é uma citocina pirogênica e atua sobre os macrófagos que a liberam e

nos da vizinhança, mas também tem efeito sistêmico na produção de proteínas de fase

aguda, como a proteína C reativa e o surfactante pulmonar. Seu efeito na infecção por

MTB é ambíguo, pois tem ação pró e antiinflamatória, inibindo a produção de TNF e

IL-1. É produzida no estágio inicial da infecção micobacteriana e pode aumentar a

susceptibilidade à infecção por MTB, associada a uma produção deficiente de IFN-,

antes do estabelecimento efetivo da resposta celular adaptativa (SAUDERS e cols,

2000; SHINDLER e cols, 1990; LADEL e cols., 1997; LAW e cols., 1996).

A IL-8 (também conhecida por CXCL8) é uma quimiocina produzida por

vários tipos celulares em resposta a IL-1, TNF e lipolissacarídeos, com capacidade

quimiotática de neutrófilos e linfócitos T, para o local de infecção com MTB.

DLUGOVITZKT E COLS (1997) observaram um aumento de IL-8 suficiente para

atrair linfócitos, mas não neutrófilos, no líquido pleural de pacientes com pleurisia

tuberculosa, diferencialmente em relação a pacientes com outras pneumopatias. Em

trabalhos recentes, foi identificada a expressão diferencial de IL-8 aumentada em

monócitos estimulados com MTB (SONG e cols, 2003) e juntamente com a expressão

gênica de FoxP3 e IL-12, a IL-8 foi considerada uma potencial ferramenta na

diferenciação entre infecção latente e tuberculose ativa (WU e cols, 2007).

A IL-1 é outra citocina próinflamatória com importante papel na defesa do

hospedeiro contra a tuberculose. Durante a doença é expressa em excesso,



18

principalmente no sítio de infecção. A deficiência de receptores para IL-1 ou genes

deficientes para IL-1 e IL-1 dificulta a formação do granuloma (JUFFERMANS e

cols, 2000). Trabalho recente de Djoba Siawaya e cols (2009) sugere que a expressão de

IL-1 apresenta-se diferencial entre pacientes com TB ativa e controles TCT positivos.

O Fator de Crescimento transformante (TGF-) é uma citocina antiinflamatória

produzida por monócitos e DC durante a tuberculose, por ação seletiva de LAM

micobacteriano. Assim como a IL-10, é produzida em larga escala durante a infecção e

provoca supressão da resposta imune mediada por células, inibindo a proliferação de

linfócitos T e produção de IFN-, além de induzir células T regulatórias. Em

macrófagos, impede a ativação, liberação de citocinas próinflamatórias e apresentação

de antígenos. O TGF- está envolvido no dano tecidual e fibrose na TB, devido a

produção e deposição de colagenases pelos macrófagos nos tecidos adjacentes (DAHL e

cols, 1996; TOOSSIE e cols, 1998; OTHIENO e cols., 1999)

A IL-4 tem papel importante na tuberculose, principalmente por suprimir a

produção de IFN- e ativação de macrófagos (APPELBERG e cols, 1992, POWRIE &

COFFMAN, 1993). Em camundongos, a progressão da tuberculose e reativação da

infecção latente são associadas a um aumento dos níveis de IL-4, porém sua inibição

não promove a proteção contra tuberculose. Van Crevel e colaboradores (2002)

detectaram aumento da produção de IL-4 em humanos com tuberculose cavitária, porém

outros dados do mesmo grupo mostram que os resultados são inconsistentes, e ainda

permanece a dúvida se a IL-4 é causa ou reflexo da tuberculose ativa em humanos.

A IL-10 é produzida pelos macrófagos após fagocitose de MTB e/ou ligação

com LAM micobacteriano (DAHL e cols, 1996; SHAW e cols., 2000). Linfócitos T

reativos ao MTB também são capazes de produzir a IL-10, inclusive durante a TB ativa,



19

no sangue circulante e no local de infecção (GEROSA e cols, 1999). A IL-10

antagoniza a resposta de citocinas pró-inflamatórias inibindo a produção de IFN-, TNF

e IL-12 e induz a produção de IL-4 pelos linfócitos (FULTON e cols, 1998; HIRSCH e

cols., 1999). Existe alta produção de IL-4 em pacientes com TB ativa anérgicos, seja

antes ou após o tratamento, sugerindo que a IL-10 suprime uma resposta imunitária

efetiva (BOUSSIOTIS e cols.,2000).

O IFN- tem seu papel protetor na TB bem estabelecido, principalmente no

contexto da imunidade de células T antígeno-específica (FLYNN e cols, 1993). A

produção in vitro de IFN- específica para antígenos micobacterianos pode ser usada

como marcador auxiliar de infecção (VAN CREVEL e cols., 1999). O IFN- é

produzido por diversos tipos celulares e como resposta inata ao MTB infectante, as

células NK podem produzir a citocina, por exposição direta a oligodeoxinucleotídeos

micobacterianos ou em resposta a IL-12 e IL-18 (LHO, e cols, 1999). Macrófagos

ativados também produzem IFN- na TB assim como linfócitos T e células CD1-

restritas, quase que exclusivamente no início da infecção.

1.5.4) Tipos celulares importantes na TB

Alguns estudos demonstraram que MTB, tanto in vivo quanto in vitro, estimula

a expressão da forma do receptor de antígenos de células T (TCR), sendo estas

células T capazes de reconhecer antígenos micobacterianos protéicos e antígenos não-

protéicos apresentados em associação às moléculas CD1, assim como as células

CD4CD8-/- TCR CD1-restritas (JANIS e cols., 1989, PORCELLI e cols., 1992;

CONSTANT e cols., 1994; KAUFMANN, 1996; TANAKA e cols., 1995). Este é o



20

único exemplo conhecido de reconhecimento de antígenos não-peptídicos por células T.

Antígenos glicolipídicos bacterianos são tipicamente apresentados a células T por

moléculas CD1, abundantes em DC. Linfócitos T reconhecem estes antígenos não-

protéicos sem necessitar de apresentação (KAUFMANN, 2007). Este tipo celular,

apesar de limitado a uma fração pequena dos linfócitos, pode contribuir na imunidade

antibacteriana, principalmente na fase inicial da infecção (LIN & OTTENHOFF, 2008).

Existem poucos estudos envolvendo células T+ durante a infecção tuberculosa, entre

estes um trabalho utilizando Mycobacterium bovis BCG (BCG) demonstrou a produção

de INF- e TNF por estas células, porém não de IL-2, IL-4, IL-5, e IL-10 quando em

contato com antígenos micobacterianos, onde também foi demonstrada sua importância

na diferenciação e liberação de INF- por células CD8+ (DIELI e cols., 2003).

A célula natural killer (NK) é outro tipo celular que parece também contribuir

para a resposta imune protetora contra MTB, mas a supressão destas células in vivo não

modifica o curso da infecção (JUNQUEIRA-KIPNIS e cols., 2003). Estas células estão

associadas a respostas contra patógenos intracelulares e são capazes de produzir IFN-

rapidamente, além de outras citocinas imunoreguladoras, assim como a lise de alvos

celulares específicos, sem necessidade de ativação prévia (BANCROFT, 1993; BRILL e

cols., 2001). Sua importância na TB já foi abordada, inclusive para as células NKT,

outra população celular que tem origem linfóide (APOSTOLOU e cols., 1999; BRILL e

cols., 2001; NIRMALA e cols., 2001; ZAHRAN e cols., 2006; GODFREY e cols.,

2004).

Os linfócitos T auxiliares (CD4+) são os mais importantes agentes na proteção

contra a TB. Eles fazem a ponte entre a ativação de células, seja por liberação de

citocinas ou no contato célula-célula. Outro grupo de igual importância são os linfócitos



21

citotóxicos (CD8+) que, apesar de não atuarem diretamente na apresentação de

antígenos de MTB, são ativados pelas células CD4+ para aniquilar os macrófagos

infectados. A importância destas células na tuberculose já é bem conhecida (BOOM e

cols., 2003; FLYNN & CHAN, 2001), e modelos animais mostraram que a deficiência

de células T CD8+ pode resultar em susceptibilidade a tuberculose (FLYNN e cols.,

1992). Um subgrupo funcional de células T auxiliares é conhecido por linfócitos T

regulatórios (Treg), para os quais já foram descritas duas subpopulações distintas, uma

que pode ser induzida na periferia, chamada de linfócitos T regulatórios induzíveis

(iTregs: CD4+CD25+), e a outra sai do timo já com função regulatória, chamada de

linfócitos T regulatórios naturais (nTregs: CD4+CD25+FoxP3+) (SAKAGUCHI, e cols,

2008).

Um dos marcadores de Treg mais utilizados é o FoxP3 um fator de transcrição

nuclear da família forkhead que ativa a rápida expressão de CD25, o antígeno-4

associado ao linfócito T citotóxico (CTLA-4), o receptor de glicocorticóide relacionado

ao TNF (GITR) e a liberação de IL-10 em células CD4+, reprimindo a transcrição de

genes para a produção de IFN-, IL-4 e IL-2. Este tipo celular é gerado principalmente

no timo (nTreg), mas pode ser ativado nos órgãos linfóides periféricos (iTreg) e sua

sobrevida depende de IL-2 e TGF- (SHEVACH, 2004). Ruprecht e cols. (2005), nos

indica que o receptor de superfície CD27 pode estar relacionado com a atividade

supressora de células Treg FoxP3+ durante o processo inflamatório e também serviria

de marcador de superfície para células CD4+CD25+ com atividade regulatória, o que

torna muito mais fácil a identificação destas células. Outro trabalho interessante foi a

identificação de células com função supressora e fenótipo CD8+CD25+FoxP3+ em

pacientes com câncer coloretal (CHAPUT e cols., 2008). Na tuberculose, a presença de



22

células Treg está associada à doença ativa, principalmente por sua característica

antagônica ao perfil Th1 (HANEKOM, 2005).

1.5.4) caracterização do problema

Existem muitas controvérsias quanto à definição de TB latente. Seja definida

pela reação de hipersensibilidade tardia positiva provocada por antígeno bruto de MTB,

ou por reatividade de anticorpos específicos em testes imunodiagnósticos. A

identificação e tratamento da tuberculose latente permaneceram como um enigma, tão

grande quanto a interação do hospedeiro com MTB durante a doença ativa.

Considerando uma das hipóteses que tentam explicar o estado de TB latente, a

teoria “dinâmica” propõe que o bacilo permaneceria no granuloma, em divisão mínima

e morte celular constantes, até o desaparecimento total dos bacilos. Portanto, nem todos

os indivíduos que tenham se infectado albergariam o bacilo após um tempo, como tem

sido sugerido por mais de 10 anos (CARDONA, 2007). Considerando que o

sequenciamento de MTB disponibilizou uma serie de antígenos cujo potencial

imunodiagnóstico ainda é pouco explorado principalmente em áreas endêmicas, um

estudo avaliando antígenos quanto ao seu potencial para auxiliar na discriminação entre

pacientes com TB ativa e contatos é de grande relevância.

Neste trabalho, além de estimular as células de pacientes e contatos com a

combinação utilizada mundialmente (ESAT-6/CFP-10), em estudo prévio foi também

avaliada a combinação 38kDa/CFP-10, que foi sugerida como estimuladora de

linfócitos T do sangue periférico de pacientes e controles na mesma magnitude do

ESAT-6/CFP10 (TAVARES e cols, 2007), mas com frequencia diferente em indivíduos

sadios TCT+ e respondedores de área endêmica. Outros antígenos como o 16kDa,



23

sugerido ter potencial para identificar infecção latente, juntamente com o ESAT-6/CFP-

10, também foi avaliado comparando os resultados com os obtidos em conjunto com o

38kDa/CFP-10. Outro antígeno pouco estudado, a L-alanina dehidrogenase (AlaDH),

também foi avaliado.

A proteína AlaDH de 40kDa, possui epítopos rconhecidos por células B que

podem ser detectados nas cepas de M. tuberculosis, mas não entre as cepas vacinal BCG

e atípicas. É uma proteína secretada, estando presente em filtrado de cultura de MTB.

Seu potencial imunodiagnóstico tem sido pouco explorado, mas a proteína foi descrita

estar implicada na adaptação de micobactérias em ambiente anaeróbios, que pode estar

relacionado ao estado de infecção latente (HUTTER & SINGH, 1998).

A caracterização das populações celulares e seu papel na modulação da resposta

ao MTB são importantes para a compreensão dos mecanismos de ação do sistema

imunitário. Trabalhos recentes descrevem as subpopulações de linfócitos durante os

eventos da doença – principalmente no sangue periférico – para melhor entender como

as células interagem entre si e com os bacilos. As subpopulações de linfócitos T+

aparentemente necessitam de um contínuo estímulo antígeno-dependente para

manterem-se em quantidades suficientes para auxiliar na regulação dos níveis de

citocinas do tipo Th1 e as células Treg possuem um importante papel no controle da

autoimunidade, suprimindo outros linfócitos T de maneira contato-dependente/citocina-

independente. Neste estudo foi realizada a imunofenotipagem das células do sangue

periférico estimuladas com os antígenos descritos acima.

Estudos, em modelo animal, demonstraram uma associação entre a virulência de

M.tuberculosis e falha no desenvolvimento de resposta Th1. Outros estudos sugerem

que várias cepas podem diferir em seu potencial de transmissão, mostrando interação

complexa e induzindo resposta imune divergente no hospedeiro. A maioria destes



24

estudos é realizada com cepas específicas e geograficamente restritas, como a cepa

Beijing (LOPEZ e cols., 2003; BARCZAK e cols,. 2005). Neste estudo foi avaliada a

diversidade de reposta imunitária, dos indivíduos sadios de área endêmica, à cepas

clínicas de transmissibilidade corrente (cluster) em nosso meio. Portanto, valendo-se de

estudos anteriores de determinação dos perfis genéticos de cepas isoladas de pacientes

internados avaliamos a resposta celular induzida por um painel cepas de padrão clusters

ou único, resistentes ou sensíveis aos tuberculostáticos, investigando o perfil de células

CD4+ e CD8+ e da citocinas Th1(IFN-) utilizando célula micobacteriana intacta.

Portanto neste estudo, sangue periférico obtido de pacientes com TB ativa

(TBa), voluntários com contato recente com pacientes com TB e indivíduos sadios de

área endêmica foi estimulado com antígenos purificados específicos, individualmente

ou combinados, obtidos por recombinação genética, e antígeno bruto (cepas clinicas de

M. tuberculosis), avaliando-se o seu potencial para induzir proliferação de diferentes

populações de células T e produção de citocinas Th1 e Th2 .



25

22)) OOBBJJEETTIIVVOO GGEERRAALL

Avaliar perfil de resposta imunitária celular de pacientes com tuberculose

pulmonar e seus contatos recentes e indivíduos sadios de área endêmica.

2.1 ) Objetivos Específicos

Avaliar a atividade imunológica celular frente a antígenos recombinantes de M.

tuberculosis, de pacientes com TB ativa, caracterizando os grupos de células

envolvidos no processo;

Avaliar a atividade imunológica celular frente a antígenos recombinantes e cepas

clínicas de M. tuberculosis, de voluntários saudáveis TCT+ ou TCT-,

caracterizando os grupos de células envolvidos no processo;

Determinar a capacidade de produção de citocinas de perfil Th1 (IFN-γ) e Th2

(IL-10) no sobrenadante de cultura de PBMC de pacientes TB e contatos,

específicas para antígenos recombinantes de MTB;

Identificar antígeno ou antígenos com possível papel na identificação de TB

latente.

Verificar a modulação da expressão gênica em pacientes TB e voluntários

saudáveis, no sangue periférico estimulado previamente com os antígenos

micobacterianos.



26

33)) PPAACCIIEENNTTEESS EE MMÉÉTTOODDOOSS

TTIIPPOO DDEE EESSTTUUDDOO

Estudo prospectivo transverso-observacional, onde foram utilizados os métodos

clínico-laboratoriais padronizados na rotina, para obtenção de amostras de sangue

periférico de pacientes com tuberculose pulmonar ativa (TBa) e controles. O grupo

controle foi distribuído em contato recente com pacientes tuberculosos, nos últimos 2

anos (CTr), e pessoas sem contato recente, mas de área endêmica para TB (Cae) com

TCT positivo ou negativo.

O sangue periférico obtido foi processado para avaliação do imunofenótipo das

células do sangue periférico após estimulação com: i) antígeno vivo íntegro, utilizando

diferentes cepas clínicas de M. tuberculosis com diferentes genótipos e perfis de

susceptibilidade às drogas e ii) antígenos recombinantes purificados de MTB, isolados

ou combinados, obtidos por recombinação genética. Parte do material foi utilizado para

estimar a produção de citocinas por método imunoenzimático (ELISA) no sobrenadante

das culturas de leucócitos e por real time RT-PCR na detecção de expressão do RNAm

de diferentes citocinas das células estimuladas com os diferentes antígenos

recombinantes. A amostragem foi obtida após análise e consentimento prévio do comitê

de ética em pesquisa da FIOCRUZ, e dos centros colaboradores: Posto de Saúde

Augusto Amaral Peixoto – Guadalupe (Dr. Paulo Albuquerque); Hospital Universitário

Clementino Fraga Filho – HUCFF (Dra. Fernanda C.Q.Mello); Centro de Saúde

Germano Sinval Faria – FIOCRUZ (Dra. Elyne Angstrom e Dra. Else Gribel).



27

PPOOPPUULLAAÇÇÃÃOO AAMMOOSSTTRRAALL EE SSEELLEEÇÇÃÃOO DDOOSS PPAACCIIEENNTTEESS

Pacientes TBa: 21 indivíduos com diagnóstico de tuberculose pulmonar, com

bacteriologia positiva ou não, que se enquadraram nos critérios para definição de casos,

estabelecidos pela Organização Mundial de Saúde (OMS), como descrito a seguir nos

critérios de inclusão.

Controles:

15 Indivíduos sadios, contatos recentes de pacientes com TB pulmonar

ativa confirmada (CTr), com informação do teste de reação à tuberculina

(PPD), clínica e radiologicamente examinados para exclusão de TB,

atendidos nas unidades de saúde que fazem controle de contatos dos

pacientes TB diagnosticados. Estes contatos e seus casos índices fazem

parte de estudo em andamento e já aprovado para tratamento preventivo

de TB no HUCFF/UFRJ.

17 indivíduos sadios sem história passada ou recente de contato de

pacientes TB (Cae) e com informação do resultado do teste cutâneo à

tuberculina, foram arrolados voluntariamente entre os estudantes e

profissionais da FIOCRUZ/RJ para as análises com citometria e real

time RT-PCR. Outros 11 indivíduos foram da mesma maneira

voluntários para os estudos realizados com as cepas clínicas.

Todos os indivíduos que participaram deste estudo foram voluntariamente

incluídos, após assinatura de termo de consentimento livre e esclarecido – TCLE (anexo

1) e após responder ao questionário padronizado de informações clínicas, laboratoriais e

demográficas (anexo 2). As entrevistas foram realizadas somente pelo doutorando



28

Vinicius Ribeiro Cabral, com o consentimento prévio do responsável de cada unidade

de saúde visitada.

PPEERRÍÍOODDOO EE LLOOCCAAIISS DDEE EESSTTUUDDOO

A amostra populacional estudada foi recrutada da demanda espontânea dos

seguintes locais: Posto de Saúde Augusto Amaral Peixoto – Guadalupe, Rio de

Janeiro/RJ; Hospital Universitário Clementino Fraga Filho – HUCFF no serviço de

Pneumologia; Centro de Saúde Germano Sinval Faria – FIOCRUZ, para inclusão no

estudo entre Março de 2007 e Setembro de 2008.

CCRRIITTÉÉRRIIOOSS DDEE IINNCCLLUUSSÃÃOO

- Pacientes com TB ativa confirmada (TBa) segundo critério da OMS 2002.

Confirmado bacteriologicamente (casos definidos de TB), indivíduos com

duas amostras positivas para BAAR em exames direto ou cultura positiva para

M.tuberculosis ou uma amostra positiva para BAAR e presença de alteração

radiológica.

Casos bacteriológicamente negativos: Indivíduos com exame direto e cultura

negativos, mas que apresentavam à radiografia de tórax infiltrado(s) em

lobo(s) superior(s) com ou sem cavitação.

Para aqueles que além das alterações radiológicas, apresentaram sintomas

sistêmicos ou respiratórios, foi também considerada a ausência de melhora

clínica e radiológica após 10 dias de amoxicilina. O diagnóstico de TB foi

baseado na melhora radiológica após quimioterapia para TB.



29

Em indivíduos com história de tratamento anterior para TB que apresentaram

deteriorização das alterações radiológicas quando comparadas com

radiografias anteriores, o diagnóstico de novo episódio de TB foi baseado na

melhora clínica e radiológica após quimioterapia para TB.

Os pacientes foram testados para o vírus da imunodeficiência adquirida (HIV),

pelo menos uma vez nos últimos 3 meses antes da coleta do espécime clínico.

Todos os pacientes arrolados no estudo, possuem ficha clínica preenchida, onde

constam informações pessoais e da doença, todas confidenciais e de uso exclusivo para

a pesquisa, conforme o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

- Controles:

i) Contatos recentes de TB pulmonar ativa (CTr): indivíduos com

bacterioscopia negativa, teste cutâneo a tuberculina positivo (≥10 mm) ou

negativo (<10mm) e imagem radiológica excludente de TB, quando possível.

ii) Controles de Área Endêmica (Cae): indivíduos com bacterioscopia

negativa (quando necessário), teste cutâneo à tuberculina positivo ou negativo

e sem história de tratamento anterior para TB ou contato com paciente TB nos

últimos 2 anos.

CCRRIITTÉÉRRIIOOSS DDEE EEXXCCLLUUSSÃÃOO

Indivíduo com outra doença imunosupressora;

Uso de drogas imunossupressoras do tipo corticoterapia, imunomoduladores e

outros;

Menores de 18 anos e maiores de 65 anos;

Mulheres grávidas;



30

Antecedentes ou suspeita atual de neoplasia;

Pacientes tratados empiricamente para tuberculose, porém, sem melhora clínica

e/ou radiológica após tratamento para TB;

Indivíduo sem ficha individual de identificação e/ou sem assinatura do TCLE;

EENNTTRREEVVIISSTTAA DDOOSS PPAACCIIEENNTTEESS

Após esclarecimento sobre os objetivos do estudo e do consentimento por

escrito, os pacientes responderam a um questionário padronizado contendo questões

referentes aos seus dados clínicos, laboratoriais e demográficos (anexo 1).

PPRROOCCEEDDIIMMEENNTTOOSS

Materiais

Os antígenos micobacterianos recombinantes foram fornecidos pelo Dr.

Mahavir Singh (Helmholtz Center for Infection Research/Lionex, Alemanha), dentro do

acordo de Cooperação Brasil x Alemanha firmado com o Laboratório de Microbiologia

Celular (LAMICEL/IOC/FIOCRUZ). Os antígenos recombinantes ensaiados neste

estudo foram: 16kDa e AlaDH., 38kDa, ESAT-6 e CFP-10. Estes três últimos foram

utilizados nas seguintes combinações: 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10. Os antígenos

foram obtidos por recombinação genética. Resumidamente, os genes codificantes de

cada antígeno foram submetidos à amplificação por PCR, os fragmentos obtidos foram

clonados em vetor plasmidial e as proteínas foram expressas em Escherichia coli (após

indução com IPTG) e purificadas (amylose resin affinity chromatography).

Contaminação das frações antigênicas foram purificadas pelo sistema Mono Q anion

exchange chromatography. Purificação final foi feita por diálise e as proteínas foram

aliquotadas e liofilizadas. A fitohemaglutinina (PHA – Cultilab, PR/Brasil) e o



31

Derivado Protéico Purificado de MTB (PPD RT23 – Statens Serum Institut, Dinamarca)

foram usados como controles da resposta imunitária.

As cepas clínicas de M.tuberculosis utilizadas neste estudo foram isoladas de

pacientes atendidos no Hospital Universitário Pedro Ernesto/UERJ e se encontram

estocadas na biblioteca de cepas mantida no LAMICEL/IOC. As informações de

resistência aos antimicrobianos e perfil genético das cepas foram obtidas de banco de

dados mantidos no LAMICEL onde a tipagem molecular foi realizada em estudos

prévios (Tese de mestrado de Silvia Maria de Almeida Machado intitulada

“Genotipagem por RFLP e spoligotyping no estudo da diversidade genética de cepas de

Mycobacterium tuberculosis isoladas de pacientes atendidos no Hospital Universitário

Pedro Ernesto (HUPE) - Rio de Janeiro”, defendida em outubro de 2007). As cepas

clusters por RFLP foram aquelas que apresentaram o mesmo perfil genético isoladas de

dois ou mais pacientes.

Coleta do espécime clínico

O sangue periférico dos voluntários do estudo foi coletado em seringas estéreis

heparinizadas, nas unidades de saúde colaboradoras, com consentimento prévio do

responsável pelo local e sem prejuízo da rotina de trabalho. Um total de 50mL de

sangue foi coletado, homogeneizado, acondicionado em frasqueira de transporte e

imediatamente levado ao LAMICEL/IOC para realização dos procedimentos.

Teste Cutâneo da Tuberculina

Aplicação, pela técnica de Mantoux, de injeção intradérmica de 0,1 mL de PPD

RT-23 (2UT). O antígeno foi injetado na pele da face anterior do antebraço esquerdo e o

resultado foi lido após 72 horas, pela inspeção e palpação transversal da zona de



32

endurecimento, pelo mesmo profissional que aplicou o antígeno. As provas de Mantoux

com endurecimento de 0 a 4mm foram consideradas negativas, fracamente positivas as

de 5 a 9 mm (pode ocorrer reação cruzada com outras micobactérias e vacinados pela

BCG a menos de dois anos) e fortemente positivas provas com diâmetro de

endurecimento maior ou igual a 10mm (doentes de TB, vacinados recentes pela BCG,

TB latente e contato recente com M.tuberculosis).

Cultura de leucócitos totais do sangue periférico

Ao sangue periférico foi adicionado meio de cultura RPMI 1640 v/v (LGCBio)

e 30mL desta solução foram depositados sobre 20mL de ISOLYMPH (Gallard-

Schlesinger, Noruega) e centrifugadas a 400x g por 30 minutos, à 25°C. A fase superior

contendo plasma e RPMI 1:1 foi guardada e a camada central de leucócitos totais foi

obtida por aspiração. Estas células foram transferidas para novo tubo e adicionadas de

tampão de lise de hemáceas – ACK (0,15M NH4Cl, 1,0M KHCO3, 0,1mM Na2EDTA,

pH 7,4, Sigma, Saint Louis, CA/USA) deixadas em temperatura ambiente (t.a.) por 10

minutos e lavadas com 30mL de RPMI 1640 por centrifugação a 400x g/4°C. O

sobrenadante foi descartado e as células novamente lavadas com 15mL de RPMI 1640

por centrifugação a 400x g/4°C. Após descartar o sobrenadante, as células do sangue

periférico (PBMC) foram ressupensas em 2mL de meio RPMI 1640 completo

(adicionado de L-glutamina [10.000 U.I.] 1:100, estreptomicina-penicilina [10.000 U.I.]

1:100, 25mM HEPES, 10% de soro autólogo) e quantificadas em câmara de Neubauer

com corante de viabilidade celular azul de Trypan (Hyclone, Logan, UT/USA). Foram

utilizadas placas de cultura de 6 poços (NUNC) com um total de 10x106 células em

cada grupo experimental na estimulação com os antígenos recombinantes e placas de

cultura de 24 poços (NUNC) com 1x106 células por grupo experimental na estimulação

com as cepas clínicas de MTB. Os antígenos purificados foram ensaiados na



33

concentração de 5g/mL nos respectivos poços da placa de cultura e os antígenos brutos

foram adicionados na proporção de 1:10 bacilos de cada uma das cepas clínicas

testadas. O material foi identificado e as placas colocadas em incubadora à 37ºC com

atmosfera de 5% CO2 por cinco dias.

ELISA para pesquisa de IFN-γ e IL-10

Citocinas do perfil Th1 (IFN-γ) e Th2 (IL-10) da resposta imunitária, foram

detectadas através do kit comercial de ensaio imunoenzimático (ELISA) da R&D

Systems, utilizando as instruções do fabricante e sendo o limite de detecção mínimo de

8pg/mL para o kit de IL-10 e 6,25pg/mL para IFN-γ. Resumidamente, as placas de

reação de 96 poços (NUNC IMMUNOSORP, CA/USA) foram adsorvidas com os

anticorpos primários por 22-24h em t.a., lavadas com 200µL de tampão de lavagem

[PBS pH 7,2: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.5mM KH2PO4,

adicionado de 0,05% de Tween20 (ICI Américas)] por 4 vezes. Depois foi realizado o

bloqueio da placa com PBS adicionado de 1% de Soro Albumina Bovina (BSA), e

deixado em t.a. por 1 hora. Após nova lavagem, as amostras foram adicionadas (100µL)

em triplicata, e deixadas por 2 horas em t.a.. Mais uma etapa de lavagem para retirar o

material excedente, e o anticorpo secundário foi adicionado aos poços e incubado em

t.a. por 2 horas. Outra etapa de lavagem e então foi adicionada a solução de

estreptavidina (previamente diluída em reagente diluente 1:200 do estoque) e incubado

por 20 minutos em t.a. ao abrigo da luz. Nova lavagem realizada e foi então adicionado

o substrato cromogênico de trimetilbenzidina (TMB – ZYMED, San Francisco –

CA/USA), reagindo por 20 minutos em t.a. ao abrigo da luz e posteriormente foi

adicionada a solução de parada (2N H2SO4 MERCK/ RJ/Brasil) e realizada a leitura

imediata em espectrofotômetro de placas, mensurando o comprimento de onda de

450nm (Bio-Tek® Instruments, LA/EUA). Os dados foram obtidos em densidade óptica



34

(absorbância) e convertidos em concentração através da comparação com valores de

uma curva-padrão de 4 parâmetros logísticos. Os grupos experimentais foram testados

em triplicata.

Marcação das células do sangue periférico para análise em citômetro de fluxo

As células utilizadas foram obtidas da cultura de leucócitos totais após 5 dias de

estimulação com os antígenos micobacterianos recombinantes ou as cepas clínicas. As

células foram centrifugadas a 500x g e ressuspendidas em tampão salina fosfato (PBS)

com azida sódica 0,01% com soro fetal bovino 1% (Gibco, CA/USA), contadas em

câmara de Neubauer com corante de viabilidade celular (azul de Trypan). Foram

utilizados anticorpos monoclonais com os seguintes marcadores: anti-CD3 Fluoresceína

Isotiocianato (FITC) para população de linfócitos, anti-CD8 aloficocianina (APC) para

linfócitos T citotóxicos, anti-CD56/NCAM APC para células NK (R&D Systems,

USA), anti-CD62L ficoeritrina (PE) para selectina-L, anti-CD16 PE para o receptor Fcγ

tipo IIIA, anti-CD4 Cyan 5.5 e anti-CD4 PE para linfócitos T auxiliares (BD

PharMingen, San Diego, CA), anti-CD25 APC para cadeia α do receptor de IL-2, anti-

CD27 FITC para o receptor de TNF (eBioscience), sendo as preparações incubadas em

gelo, ao abrigo da luz por 30 minutos. As células foram centrifugadas a 500x g,

ressuspendidas em PBS/azida 0,01% com paraformaldeído 1% para fixação, e a

aquisição foi feita em citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, CA/USA). As

análises foram feitas utilizando o programa CELLQuest (BD Biosciences, CA/USA).



35

AANNÁÁLLIISSEE DDAA EEXXPPRREESSSSÃÃOO GGÊÊNNIICCAA

Isolamento de RNA

A expressão gênica de citocinas importantes no processo de resposta imunitária

foi verificada através da técnica de real time RT-PCR. Após o tempo de cultivo das

PBMC com os antígenos recombinantes, 3x106 células foram recolhidas e lavadas com

tampão PBS para retirada do meio de cultivo, por centrifugação a 500x g/4°C. A

extração do ácido ribonucléico (RNA) total foi realizada através do protocolo básico

com TRIZOL (Invitrogen, USA), onde 1mL foi adicionado nas células em microtubo

livre de DNAse/RNAse (AXYGEN Scientific Inc, CA/USA) e deixado por 5 minutos

em t.a.. Em seguia 200µL de clorofórmio foram adicionados e homogeneizados para

extração do RNA total. O material então foi centrifugado a 12000x g por 15 minutos à

4°C e a fase aquosa superior foi transferida para novo microtubo. Foram então

adicionados 500µL de Isopropanol (Sigma, USA) e o material foi deixado por 14 horas

a -70°C. Nova centrifugação foi realizada a 12000x g por 30 minutos a 4°C, descartado

o sobrenadante, o precipitado foi lavado (sem homogeneizar) com etanol 70% gelado e

centrifugado com 10000x g por 30 minutos a 4°C. O sobrenadante foi retirado com

cuidado e com o microtubo quase seco, foi adicionada água mili-Q tratada com

dietilpirocarbonato (DEPC, Sigma/USA) para retirada de DNAse/RNAse. O material

foi quantificado por espectofotômetro através da medida de absorbância no

comprimento de onda de 260ηm, em um NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer

(NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE/EUA). A pureza do RNA foi avaliada

através da razão entre dois valores de absorbância: (i) A260ηm / A280ηm para identificar

contaminação protéica e (ii) A260ηm / A230ηm para identificar contaminação por solventes

orgânicos. Ambos os valores devem ser superiores a 1,8 para estimar uma solução com

RNA de boa qualidade (IMBEAUD e cols., 2005).



36

Remoção do DNA contaminante

De modo a remover possível DNA genômico contaminante das preparações de

RNA total realizadas, utilizou-se DNase I recombinante (DNA-free™, Ambion Inc.,

Austin – TX/EUA), seguindo-se o protocolo de tratamento rotineiro fornecido pelo

fabricante. Resumidamente, foi adicionado 1µL de DNAse para cada 5µg de amostra

de RNA total, previamente diluído em água tratada com DEPC, para um volume final

de 15µL. A solução permaneceu por 30 minutos à 42°C e foi adicionado 5µL do

inativador da DNAse, por 2 minutos, seguido de centrifugação à 4°C por 20 minutos em

12000x g. A fase aquosa transparente superior contendo o RNA foi transferida para

microtubo limpo e quantificado novamente por espectrofotômetro.

O RNA total foi então transformado em cDNA para realização do PCR em

tempo real. Inicialmente, foram identificados 2 tubos para cada amostra, sendo um

microtubo para a reação positiva (RT) e outro para o controle negativo (NRT). Foi

adicionado em cada microtubo 500ng de RNA total, e 1µL de primer OLIGOdT 12-18

(Invitrogen/USA), e colocado em banho-seco por 10 minutos a 55°C. Em seguida, foi

adicionado o mix de reação para os tubos RT [Tampão 5x (4µL), DTT (2µL), RiboLock

inibidor de RNAse (1µL), dNTPs 2,5mM de cada (1µL), RevertAid H Minus M-MuLV

transcriptase reversa (1µL)] e para os tubos NRT [(Tampão 5x (4µL), DTT (2µL),

RiboLock inibidor de RNAse (1µL), dNTPs 2,5mM de cada (1µL), água RNAse-free

(1µL)], sendo um total de 20µL de reação. O material foi colocado em banho-seco por

60 minutos a 42°C, seguindo-se inativação da enzima por 10 minutos a 70°C. No final

do processo foi adicionado 80µL de água tratada com DEPC.

O cDNA foi então utilizado para a realização da PCR em tempo real, com

iniciadores para 2 genes constitutivos (18s, RLP13a) e 13 genes alvo (FoxP3, IFN-γ, IL-



37

1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-17, IL- 24, TGF-β, TNF – veja tabela 1).

Foram realizadas duplicatas experimentais e controles de placa e de reação. Após

padronização o cDNA foi utilizado diluído a 1:10 e 5µL desta solução foi adicionado a

reação da PCR. A PCR foi realizada no aparelho ABIPRISM 7000 Sequence Detector

System em placas ópticas de 96 poços no volume final de 15µL, sendo adicionados,

além do cDNA, 10µL do mix de reação (SYBR GREEN 2x – Applied Biosystems e

0,5µL dos primers a 12,5mM) em cada poço.

Quantificação dos níveis de expressão

A partir dos dados de acúmulo de fluorescência das triplicatas da reação da PCR

em tempo real de cada amostra, utilizou-se um modelo logístico ou sigmóide de 3, 4 ou

5 parâmetros para desenhar a curva de amplificação a partir do pacote qPCR (SPIEES e

cols., 2008). A escolha do melhor modelo, ajustado pela minimização do erro médio

quadrático dos valores de fluorescência das triplicatas nos 40 ciclos, baseou-se no

Akaike’s Information Criterion (AIC). O ciclo de quantificação (Cq) foi determinado

pelo ponto de interseção de uma linha perpendicular, oriunda do ponto de máxima da

função de segunda derivada do modelo logístico utilizado, na curva de amplificação

(figura 3). O uso deste ponto de máxima característico é conveniente uma vez que ele se

encontra numa região de eficiência constante na fase exponencial da curva de

amplificação, além de ser invariante do poço e placa aonde ocorre à reação de PCR

(REBRIKOV & TROFIMOV, 2006). A eficiência (Eff) foi calculada para cada amostra

utilizando a razão do dado de fluorescência do ciclo de quantificação sobre o do ciclo

anterior.

Posteriormente, os dados de EffCq de cada amostra, foram processados em conjunto

de acordo com VANDESOMPELE e cols. (2002) para servir de entrada para o pacote



38

geNorm, o qual determina os genes mais estáveis ou normalizadores dentro do seu

grupo de estudo. Os níveis de expressão normalizados são obtidos pela divisão dos

dados brutos de expressão de cada amostra pelo seu respectivo fator de normalização,

que é representado pela média geométrica dos níveis de expressão dos genes

normalizadores.

Análise de agrupamento hierárquico dos perfis de expressão gênica

Os dados dos níveis de expressão normalizados em função logarítmica de base 2

foram utilizados para a análise de agrupamentos. Foram avaliadas as distâncias

Manhattan, Euclidiana e Minkowski e os métodos de ligação single linkage, complete

linkage e ward. Os grupos formados foram validados pela medida de silhouettes e a

melhor distância e algoritmo de agrupamento foram determinados pelo coeficiente de

correlação co-fenético. Todas as análises acima descritas foram realizadas com o auxílio

de pacotes do programa R, versão 2.8.1 (www.r-project.org).

As analises acima descritas foram realizadas em colaboração com o Dr. Marcelo

Ribeiro Alves do Laboratório de Hanseníase/IOC/FIOCRUZ.

Testes estatísticos

A análise estatística foi realizada no software Statistical Package for Social

Sciences (SPSS versão 15). As médias aritméticas, desvios-padrão, e erros-padrão

foram calculados e realizados os testes estatísticos Mann-Whitney (para 2 grupos não

pareados - não paramétrico), teste T-Student-Neuman-Keuls e Kruskal-Wallis (para

mais de 3 comparações). Os dados foram considerados significativos quando p< 0.05.

As análises foram feitas em colaboração com a MsC. Isabela Gama Sardella, do

Laboratório de Microbiologia Celular/IOC/FIOCRUZ.



39

Tabela 1: Características, seqüência e condições dos oligonucleotídeos utilizados na reação de qPCR.

Nota: em negrito são mostrados os genes constitutivos utilizados (housekeeping-genes).

Gene Proteína Seqüência do oligonucleotídeoConcentraçã

o finalTamanho do

produtoTM do produto

18s Subunidade 18s ribossomal5´ AGGATGAGGTGGAACGTGTG 3´5´ CTTCACGGAGCTTGTTGTCC 3´

400 nM 125pb 79°C

RLP13aProteína de Ligação Ribossomal 13a

5´ GACAAGAAAAAGCGGATGGT 3´5´ GTACTTCCAGCCAACCTCGT 3´

400 nM 142pb 84°C

FoxP3 Fator de Transcrição forkhead P35´ TCCCAGAGTTCCTCCACAAC 3´5´ GATGGCGTTCTTCCAGGTG 3´

500 nM 194pb 81°C

IFN-γ Interferon-gama 5´ TGACCAGAGCATCCAAAAGA 3´5´ GGACATTCAAGTCAGTTACCG 3´

500 nM 130pb 76°C

IL-1β Interleucina 1-beta5´ CAAAATACCTGTGGCCTTGG 3´5´ TTTTTGGGATCTACACTCTCCAG 3´

500 nM 105pb 79°C

IL-2 Interleucina 25´ CAAACCTCTGGAGGAAGTGC 3´5´ TTCAGATCCCTTTAGTTCCAG 3´

500 nM 112pb 78°C

IL-4 Interleucina 45´ ACGCACCATGAGAAGGACAC 3´5´ ACAGGACAGGAATTCAAGCC 3´

500 nM 134pb 86°C

IL-6 Interleucina 65´ GAAAATCATCACTGGTCTTTTGG 3´5´ GCATCTAGATTCTTTGCCTTTTT 3´

500 nM 150pb 79°C

IL-8 Interleucina 85´ CTGCGCCAACACAGAAATTA 3´5´ TGAATTCTCAGCCCTCTTCAA 3´

500 nM 118pb 79°C

IL-10 Interleucina 105´ GATGCCCCAAGCTGAGAAC 3´5´ ATCGATGACAGCGCCGTAG 3´

300 nM 104pb 83°C

IL-12 Interleucina 125´ GTGGAGGTCAGCTGGGAGTA 3´5´ TTTCTTTTCTCTCTTGCTCTTGC 3´

500 nM 105pb 79°C

IL-17 Interleucina 175´ GCCCAAATTCTGAGGACAAG 3´5´ TCATTGCGGTGGAGATTCCA 3´

500 nM 142pb 82°C

IL-24 Interleucina 245´ CAAACAGTTGGACGTAGAAG 3´ 5´ TGACACAGGGAACAAACCAG 3´

500 nM 143pb 83°C

TGF-βFator de Crescimento Transformante-beta

5´ CAGCAACAATTCCTGGCGATA 3´5´ AAGGCGAAAGCCCTCAATTT 3´

500 nM 136pb 84°C

TNF Fator de Necrose Tumoral5´ CCCCAGGGACCTCTCTCTA 3´5´ GAGGGTTTGCTACAACATGG 3´

400 nM 101pb 84°C

_ _ Vinicius Ribeiro Cabral


40

Figura 3: Gráfico representando a curva de acúmulo de fluorescência (preto) utilizando o modelo logístico de 5 parâmetros e a representação da função da sua primeira (vermelho) e segunda (verde) derivada. O ponto de interseção da linha vertical verde, que parte do ponto de máxima da função dasegunda derivada, na curva de acúmulo de fluorescência, corresponde ao Cq (CpD2) e na curva de eficiência (azul) corresponde à eficiência da reação (Eff.). Fonte: Spiees e cols. (2008).



41

44)) RREESSUULLTTAADDOOSS

4.1) Estimulação in vitro de PBMCs de voluntários TCT+ e TCT- com o corpo

bacteriano total de diferentes cepas clínicas de MTB.

Este estudo foi realizado para avaliar a habilidade de diferentes cepas clínicas

de M.tuberculosis, com diferentes características genotípicas (determinada pela posição

e número de cópias de IS6110) e de resistência à tuberculoestáticos, na indução de

resposta imunitária em voluntários sadios (tabela 2). Foram utilizadas PBMC de 11

voluntários saudáveis, sendo 6 pessoas com reação positiva para o teste cutâneo à

tuberculina (TCT+) e 5 pessoas com reação negativa (TCT-).

Tabela 2: Características fenotípicas e genotípicas das cepas clínicas de MTB usadas na estimulação in vitro de PBMC de indivíduos com teste cutâneo a tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-).

Cepa ClínicaN° cópias

IS6110Cluster MDR

Resistência aos antimicrobianos

046 10 Sim Sim INH/RFP/PZA

065 10 Sim Não S

081 10 Sim Não INH/ETH/PZA

213 11 Sim Não PZA

215 4 Sim Não S

238 2 Sim Não INH

270 a 9 Não Não S

274 a 9 Não Não S

282 8 Sim Sim INH/RFP/SMa: Infecção policlonal; IS6110: seqüência de inserção 6110, elemento repetido presente nas cepas do Complexo M. tuberculsosis; MDR: Multi Droga Resistência; INH- isoniazida, RFP- rifampicina, PZA- pirazinamida; SM- estreptomicina, ETH - etionamida,; S: sensível à todas as drogas.



42

A estimulação foi realizada utilizando o bacilo vivo, recém retirado de meio de

cultivo sólido rico (Löwenstein-Jensen), e quantificado na proporção de 1:10

(PBMC:bacilos), para os ensaios de estimulação in vitro. Após o quinto dia de

estimulação o sobrenadante de cultura foi recolhido, livre de células, para quantificação

de Interferon gama (IFN-), as PBMC foram tipadas para avaliação de linfócitos Taux e

Tcit. Foram utilizadas a cepa de M. tuberculosis H37Rv e o antígeno PPD como

controles experimentais. Duas das cepas clínicas utilizadas foram obtidas do mesmo

paciente e, embora tenham apresentado o mesmo número de cópias de IS6110, na

tipagem genotípica, estas diferiam quanto ao tamanho, caracterizando em uma infecção

policlonal.

A estimulação com as cepas clínicas, mostrou-se diferencial em relação ao

perfil genético do bacilo. A estimulação de PBMC de voluntários TCT+ com as cepas

clínicas portando baixo número de cópias da IS6110 (até 4 cópias) levou a redução

significativa da média de números absolutos de linfócitos Taux e Tcit quando

comparados com os controles não-estimulados (p= 0,013 e p= 0,005) e com os que

receberam estímulo com o antígeno PPD (p=0,044 e p=0,021). Nos indivíduos não

reatores ao teste tuberculínico, a diferença foi encontrada apenas em relação ao controle

não estimulado, para ambos os tipos de linfócitos (p=0,028 e 0,004 respectivamente;

Figura 4).



43

Figura 4: Médias e erro-padrão do número de linfócitos T auxiliares (CD3CD4+) e T citotóxicos (CD3CD8+), após estimulação com cepas clínicas com menos de 4 cópias de IS6110e controles, em cultura de PBMC de indivíduos com teste cutâneo a tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-).

No estímulo realizado com cepas clínicas de 8 e 9 cópias de IS6110, foi

observada uma tendência de queda na média absoluta de células T aux e Tcit, embora

sem diferença significativa. Entretanto, nos indivíduos com reação tuberculínica

positiva (TCT+) foi observado um maior decréscimo de ambos os tipos celulares, em

relação aos outros voluntários, mas sem diferença significativa.

Linfócitos CD3CD8+ Indivíduos TCT+

Controle PPD H37Rv <4 Cópias IS61100

5

10

15

20

25*

*

p=0,005

p=0,021

Nú

mer

o d

e C

élu

las

x 10

5

Linfócitos CD3CD4+ Indivíduos TCT-


0

5

10

15

20

25

* p=0,028

Nú

mer

o d

e C

élu

las

x 10

5



5

10

15

20

25* p=0,004

Nú

mer

o d

e C

élu

las

x 10

5


Controle PPD H37Rv < 4 cópias IS61100

5

10

15

20

25*

*

p=0,013

p=0,044

Nú

mer

o d

e C

élu

las

x 10

5



44

Similarmente, a utilização de cepas clínicas com 10 e 11 cópias de IS6110

provocou uma redução generalizada na média de células em ambos os voluntários

TCT+ e TCT-, porém diferença significativa foi evidenciada apenas em relação ao

controle não estimulado (p<0,04; figura 5).

Figura 5: Médias e erro-padrão do número de linfócitos T auxiliares e T citotóxicos, após estimulação com cepas clínicas de 10 e 11 cópias de IS6110 e controles, em cultura de PBMC de indivíduos com teste cutâneo a tuberculina positivo e negativo.


Controle PPD H37Rv 10 a 11cópias IS61100

5

10

15

20

25 * p=0,013

Nú

mer

o d

e C

élu

las

x 10

5



5

10

15

20

25* p=0,04

Nú

mer

o d

e C

élu

las

x 10

5



5

10

15

20

25

p=0,022*

Nú

mer

o d

e C

élu

las

x 10

5



5

10

15

20

25

* p=0,027

Nú

mer

o d

e C

élu

las

x 10

5



45

4.2) Perfil de linfócitos T auxiliares e T citotóxicos após estimulação com as

cepas clínicas de MTB.

As subpopulações celulares de linfócitos T auxiliares e T citotóxicos foram

analisadas após 5 dias de estimulação com as cepas clínicas, na cultura de PBMC dos

voluntários TCT+ e TCT-. No voluntário C TCT- foi observada diminuição do número

de células CD8+ apenas quando estimuladas com a cepa 270, sensível aos

quimioterápicos, em relação ao controle não-estimulado. Entretanto, a expressão de

CD4+ manteve-se semelhante ao controle não estimulado. Esta cepa foi obtida junto

com a cepa 274, do mesmo paciente, sendo geneticamente distintas, mas apresentaram

resultados diferentes de estimulação para linfócitos CD8+ (figura 6).

Figura 6: Citometria de Fluxo representativa no voluntário C com teste cutâneo a tuberculina(TCT) negativo, mostrando a expressão de CD4+ e CD8+ para o controle não-estimulado e estimulado com a cepa 270, a qual induziu diminuição na expressão de Linfócitos T cit (CD8+). Os histogramas foram analisados dentro da população de linfócitos CD3+.

N° Células x 105/mLImunofenótipo

Controle Cepa 270

CD3+ 15,3 7,4

CD3CD4+ 4,4 2,3

CD3CD8+ 2,1 0,7

Cepa 270

Controle



46

Por outro lado, o voluntário J/TCT+ mostrou queda no número de células CD4+

e manutenção da expressão e número de células de CD8+, quando estimuladas com as

cepas cluster 081 e 282. Estas cepas são resistentes aos antibióticos utilizados no

tratamento da TB (figura 7).

Figura 7: Citometria de fluxo representativa no voluntário J com teste cutâneo a tuberculina positivo mostrando diminuição de células T CD4+ após estimulação com as cepas cluster resistentes a tuberculostáticos 081 e 282, mas com manutenção da expressão e número absoluto de células CD8+. Os histogramas foram analisados dentro da população de linfócitos CD3+.

Nde células x 105/mLImunofenótipo

Controle Cepa 081 Cepa 282

CD3+ 21,3 14,9 10,7

CD4+ 9,8 3,3 2,1

CD8+ 4,9 3,3 2,4

Sem estímulo

Cepa 081

Cepa 282



47

4.3) Resposta de IFN- entre os voluntários sadios TCT+ e TCT- estimulados

com diferentes cepas clínicas de MTB

A resposta de produção de IFN- frente à estimulação com o painel de cepas

clínicas de MTB dos voluntários TCT+ e TCT- foi heterogênea conforme mostrado na

tabela 3. O antígeno PPD foi utilizado com controle e apenas os indivíduos TCT+

foram responsivos. A cepa clínica multidroga resistente 046 foi reconhecida

positivamente pela maioria dos indivíduos testados (8/10), dos quais 62,5% eram TCT+

e 37,5% eram TCT-, enquanto que para a cepa 238, apenas um dos indivíduos TCT+

(>20mm) foi capaz de produzir IFN- (1/10). A cepa 270 foi a única reconhecida apenas

pelos voluntários TCT+, mas a cepa 274 (infecção policlonal) não foi capaz de

estimular a produção de IFN- em um destes voluntários (H). Em geral, a produção

desta citocina foi positivamente associada com o tamanho da resposta ao teste cutâneo à

tuberculina. Os voluntários TCT+ mostraram maior produção de IFN- que os TCT-

(Tabela 3).



48

Tabela 3. Heterogeneidade de resposta da produção de IFN- pelas PBMC de voluntários sadios com teste cutâneo a tuberculina positivo e negativo. Os símbolos indicam positivo ou não para a produção de IFN-.

4.4) Produção de IFN- em voluntários sadios TCT+ e TCT- após estimulação

com cepas de MTB resistentes ou sensíveis às drogas.

Ao avaliar a resposta imune por IFN- dos voluntários considerando o teste de

susceptibilidade às drogas das cepas testadas, foi observado que entre os voluntários

sadios TCT- havia uma produção média significativamente menor de IFN- (p<0,05),

quando estimulados com cepas de ambos os perfis de susceptibilidade, comparados aos

voluntários TCT+. Mas houve tendência de queda da produção de IFN- quando os

indivíduos TCT+ foram estimulados com as cepas resistentes às drogas

tuberculostáticas, porém sem diferença significativa (Figura 8).

065(S)5

+++++++-++-K) >20

+++-++++++-J) 15

+++-+---++-I) 13

--+-+--+++-H) 13

+++-+++-+--G) 10

--------++-F) 5

---------+-E) 0

+---+++-+--D) 0

-------+++-C) 0

-----------A e B) 04

282(R)1,5

274(S)

270(S)

238(R)2,5

215(S)5

213(R)2,5

081(R)3,5

046(R)1,5

ControleID/PPD(mm)

ID – Identificação dos voluntários; 1 MDR: multi droga resistência; 2 monoresistente; 3Resistência múltipla; 4 resposta de dois indivíduos; 5- Cepas Cluster; S - Sensível às drogas; R - Resistente às drogas.

Cepas clínicas de MTB

H37Rv



49

Figura 8: Média de produção de IFN- pelas PBMC de voluntários sadios com teste cutâneo a tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-) de acordo com o perfil de susceptibilidade as drogas tuberculostáticas das cepas clínicas de M.tuberculosis usadas como estímulo.

4.5) Características clínicas, demográficas e epidemiológicas dos indivíduos

arrolados para os testes com antígenos recombinantes.

No período de Julho de 2007 à Setembro de 2008, foI coletado sangue de 21

pacientes TBa e 32 indivíduos não-TB, dos quais 15 foram classificados como contatos

recentes de pacientes com TB ativa (CTr) e 17 controles de área endêmica (Cae). As

suas características clínicas, demográficas e laboratoriais, estão descritas na tabela 4.

Não foi encontrada diferença significativa na média de idade, de gênero e quanto ao

hábito tabagista e de consumo de álcool nos diferentes grupos, embora a maioria dos

indivíduos sejam não-tabagista e não-alcoolista.

p<0,05

ResistentesSensíveis

TCT negativo

TCT positivo

0

100

200

300

400

500

600

IFN

-ga

ma

(pg

/mL

)



50

Tabela 4 – Características demográficas, clínicas e laboratoriais dos sujeitos deste estudo: pacientes com tuberculose ativa (TBa), contatos recente de pacientes com tuberculose ativa (CTr) e controles de área endêmica (Cae). N.A.: não aplicável.

Número Absoluto (%)Características

Total TBa CTr Cae

Total 53 (100) 21 (100) 15 (100) 17 (100)

Idade (x ± DP) 37,5±13,0 37,2±15,5 47,6±12,8 34,1±8,6

Gênero

Feminino 27 (51) 12 (57) 8 (53) 7 (41)

Masculino 26 (49) 9 (43) 7 (47) 10 (59)

Bacterioscopia:

Positiva 12 (24) 12 (62) NA

Negativa 9 (18) 7 (33) 2 (13) NA

NR 30 (59) 1 (5) 13 (87) 17 (100)

Cultura:

Positiva 3 (6) 3 (14) NA

Negativa 11 (21) 9 (43) 2 (13) NA

NR 39 (73) 9 (43) 13 (87) 17 (100)

Marca BCG

Sim 47 (89) 17 (81) 14 (93) 16 (94)

Não 6 (11) 4 (19) 1 (7) 1 (6)

TCT (mm)

TCT+ (≥ 10) 10 (32) NA 8 (53) 3 (18)

TCT - 21 (68) NA 7 (47) 14 (82)

TB anterior

Positiva 8 (15) 8 (38)

Negativa 45 (85) 13 (62) 15 (100) 17 (100)

Tratamento TB

TB trat. (≥60 dias) 10 (48) 10 (48) NA NA

TB inic. (<60 dias) 11 (52) 11 (52) NA NA

Alcoolista

Sim 24 (45) 8 (38) 6 (40) 10 (59)

Não 29 (55) 13 (62) 9 (60) 7 (41)

Tabagismo

Sim 12 (23) 6 (29) 4 (27) 2 (12)

Não 36 (68) 11 (52) 11 (73) 14 (82)

Ex-tabagista 5 (9) 4 (19) 1 (6)



51

4.6) Caracterização celular de células mononucleares do sangue periférico

(PBMC) após estimulação com antígenos micobacterianos recombinantes.

A imunofenotipagem das células do sangue periférico foi realizada para verificar

o perfil celular frente à estimulação com os antígenos micobacterianos recombinantes

isolados 16kDa e AlaDH, ou combinados 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10; o antígeno

PPD foi utilizado como controle experimental e a fitohemaglutinina (PHA) foi usada

como controle mitogênico. As populações celulares verificadas foram: CD3CD4+ para

linfócitos T auxiliares e CD3CD8+ para linfócitos T citotóxicos, além da marcação com

CD62L para as os linfócitos de memória (Taux e Tcit); células NK CD16CD56+ e NKT

CD3CD16CD56+; e células Treg induzidas CD4CD25+ ou Treg naturais

CD4CD25CD27+.

Foram tipados um total de 14 pacientes TB e 21 indivíduos não-TB e observou-

se que o número absoluto bem como o percentual dos diferentes fenótipos celulares

estão mais baixos entre os pacientes com TBa, embora sem diferença significativa. Isto

foi observado principalmente nas células controle (não estimuladas e estimuladas com

PHA). Apenas os linfócitos Tcit apresentaram-se, em média absoluta,

significativamente diminuídos nos pacientes TBa, tanto para estímulo não específico

PHA (p=0,022), como para os antígenos micobacterianos (p<0,028), exceto para o

AlaDH (p=0,058) e 38kDa/CFP-10 (p=0,077). Os linfócitos T citotóxicos de memória

apresentaram-se com média absoluta reduzida apenas para o estímulo do antígeno PPD

(p=0,023; Tabela 4). Entretanto, significância no número absoluto de células e no

percentual de expressão dos receptores só foi observada nos indivíduos estimulados

com o antígeno ESAT-6/CFP-10 para os linfócitos T citotóxicos (p=0,025) (Tabela 5 e

Figura 9a e 9b).



52

Tabela 5: Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares de pacientes com tuberculose ativa (TBa) e indivíduos não-TB, estimulados com o antígeno PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB. S.E.M. = erro-padrão da média.

TBa Não-TB

Estímulos Células (x 104) Média±S.E.M. % Média±S.E.M. % p-valor

PPD CD3CD4 178,2 ± 23,8 47,5 209,2 ± 19,2 45,6 > 0,05

CD3CD8 82,4 ± 9,4 * 21,7 115,2 ± 9,0 26,1 0,0275

Razão CD4/CD8 2,4 ± 0,3 1,9 ± 0,2 > 0,05

CD4CD62L 89,5 ± 1,3 24 113,7 ± 14,6 25,5 > 0,05

CD8CD62L 42,6 ± 5,3 * 11,7 66,2 ± 6,2 15 0,0231

CD16CD56 6,3 ± 2,4 1,8 15,6 ± 7,5 4,6 > 0,05

CD3CD16CD56 1,0 ± 0,3 0,3 10,7 ± 7,1 3,5 > 0,05

CD4CD25 3,0 ± 1,0 0,9 5,9 ± 1,4 1,5 > 0,05

CD4CD25CD27 18,6 ± 4,4 5,5 31,9 ± 5,8 7,6 > 0,05

16 kDa CD3CD4 148,0 ± 11,7 43,9 206,2 ± 22,4 46,5 0,0772

CD3CD8 74,1 ± 7,1 22,1 109,3 ± 11,7 26,0 0,0275

Razão CD4/CD8 2,3 ±0,3 1,9 ± 0,2 > 0,05

CD4CD62L 74,8 ± 9,5 21,4 111,3 ± 19,2 25,4 > 0,05

CD8CD62L 37,8 ± 5,2 11,0 53,6 ± 5,1 13,4 0,0617

CD16CD56 5,5 ± 1,9 1,7 14,7 ± 8,2 4,0 > 0,05

CD3CD16CD56 0,7 ± 0,3 0,2 11,1 ± 7,8 3,2 > 0,05

CD4CD25 2,7 ± 0,9 0,8 5,8 ± 2,0 1,4 > 0,05

CD4CD25CD27 15,8 ± 3,8 5,0 29,5 ± 5,8 7,3 > 0,05

AlaDH CD3CD4 165,7 ± 14,5 45,1 198,6 ± 20,6 46,2 > 0,05

CD3CD8 80,0 ± 7,3 21,9 103,1 ± 8,4 25,5 > 0,05

Razão CD4/CD8 2,3 ±0,3 1,9 ± 0,2 > 0,05

CD4CD62L 90,1 ± 12,6 23,7 105,1 ± 16,0 25,5 > 0,05

CD8CD62L 41,6 ± 5,5 11,4 55,3 ± 6,6 13,5 > 0,05

CD16CD56 4,9 ± 1,5 1,6 12,5 ± 5,9 4,3 > 0,05

CD3CD16CD56 0,8 ± 0,2 0,2 8,5 ± 5,6 3,5 > 0,05

CD4CD25 1,5 ± 0,5 0,5 3,2 ± 0,7 0,8 > 0,05

CD4CD25CD27 10,9 ± 2,6 3,6 26,5 ± 6,3 6,5 0,0665

Figura 9a: Porcentagem média de diferentes populações celulares de pacientes com tuberculose ativa (TBa) e indivíduos não-TB estimulados com o antígeno PPD e os antígenos micobacterianos isolados específicos para MTB.

0

10

20

30

40

50

TBa N-TB TBa N-TB TBa N-TB

PPD 16 kDa AlaDH

% d

e cé

lulas

T

CD3CD4 CD3CD8 CD4CD62L CD8CD62LCD16CD56 CD3CD16CD56 CD4CD25 CD4CD25CD27

% d

e cé

lula

s



53

Tabela 5 (continuação): Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares de pacientes com tuberculose ativa (TBa) e indivíduos não-TB, estimulados com o antígeno PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB. S.E.M. = erro-padrão da média.

TBa Não-TB


38kDa CD3CD4 151,9 ± 14,8 44,5 177,4 ± 18,3 45,0 > 0,05

+ CD3CD8 72,3 ± 8,1 21,1 96,1 ±9,3 25,2 0,0772

CFP10 Razão CD4/CD8 2,3 ±0,3 1,9 ± 0,2 > 0,05

CD4CD62L 76,1 ± 11,3 21,8 90,6 ± 13,6 23,4 > 0,05

CD8CD62L 36,2 ± 7,0 9,9 46,0 ± 5,6 11,6 > 0,05

CD16CD56 5,2 ± 1,8 1,6 12,5 ± 6,9 4,0 > 0,05

CD3CD16CD56 0,8 ± 0,3 0,2 8,8 ± 0,3 3,1 > 0,05

CD4CD25 2,0 ± 0,6 0,6 4,8 ± 1,4 1,3 > 0,05

CD4CD25CD27 15,1 ± 2,9 4,9 25,7 ±4,7 7,4 > 0,05

ESAT-6 CD3CD4 149,0 ± 16,2 43,9 195,9 ± 20,2 46,0 > 0,05

+ CD3CD8 66,7 ± 8,3 * 19,6 * 104,8 ± 12,0 25,1 0,0252

CFP10 Razão CD4/CD8 2,3 ±0,3 1,9 ± 0,2 > 0,05

CD4CD62L 71,4 ± 1,3 22,4 96,4 ± 15,4 22,9 > 0,05

CD8CD62L 34,1 ± 7,0 9,7 46,1 ± 5,3 10,8 > 0,05

CD16CD56 4,8 ± 1,6 1,4 16,0 ± 9,1 4,3 > 0,05

CD3CD16CD56 0,8 ± 0,3 0,2 12,5 ± 8,9 3,5 > 0,05

CD4CD25 2,6 ± 0,7 0,9 5,5 ± 1,8 1,4 > 0,05

CD4CD25CD27 15,8 ± 3,5 5,1 27,9 ± 4,9 7,3 > 0,05CD3CD4/CD8+: células T aux/cit, CD4/CD8CD62L+: células T aux/cit de memória; CD16CD56+: Células NK; CD3CD16CD56+: Células NKT; CD4CD25+: linfócitos Treg induzidos; CD4CD25CD27+: linfócitos Treg naturais.

Figura 9b: Porcentagem média de diferentes populações celulares de pacientes com tuberculose ativa (TBa) e indivíduos não-TB estimulados com os antígenos micobacterianos combinados,específicos para MTB.

0

10

20

30

40

50

TBa N-TB TBa N-TB

38 kDa/CFP-10 ESAT-6/CFP-10

% d

e ce

lulas

T


% d

e cé

lula

s



54

Considerando a tendência de aumento no número absoluto dos diferentes

fenótipos celulares nos indivíduos não-TB, estes foram analisados quanto à reatividade

ao teste cutâneo à tuberculina. Foi observando que o aumento no número absoluto de

células está associado aos indivíduos TCT- (n=21), principalmente para aqueles cujas

células foram estimuladas com os antígenos combinados 38kDa/CFP-10 e ESAT-

6/CFP-10. Diferença significativa foi observada para os valores absolutos de linfócitos

Taux e Tcit, efetores e de memória, além das células NK e NKT (p<0,045), embora sem

diferença significativa para o percentual de expressão dos receptores de superfície

celular, exceto nas células NK estimuladas com o antígeno 38kDa/CFP-10 e 16kDa

(p<0,045; tabela 6 e figuras 10a & 10b). Diferentemente, nos indivíduos TCT+ (n=10),

apenas o estímulo com o antígeno PPD e com o inespecífico (PHA), provocaram

aumento médio do percentual e/ou número absoluto na população de células nTreg

(p=0,037).

Figura 10a: Porcentagem média de diferentes populações celulares de indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (TCT-) estimulados com o antígeno PPD e os antígenos micobacterianos isolados, específicos para MTB. * (p<0,05).

0

10

20

30

40

50

PPD+ PPD- PPD+ PPD- PPD+ PPD-

PPD 16 kDa AlaDH

% de

celul

as T


*

*

% d

e cé

lula

s

* *

TCT+ TCT+ TCT+TCT- TCT- TCT-



55

Tabela 6: Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares dos indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-), e estímulados com os antígenos PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB. S.E.M. = erro-padrão da média.

TCT + TCT - -


PPD CD3CD4 222,9 ± 40,6 45,0 199,5 ± 21,2 44,7 > 0,05

CD3CD8 128,8 ± 20,9 27,4 106,0 ± 8,5 24,7 > 0,05

Razão CD4/CD8 1,7 ± 0,1 2,1 ± 0,3 > 0,05

CD4CD62L 55,3 ± 27,6 13,6 109,1 ±22,8 23,5 > 0,05

CD8CD62L 74,0 ± 11,4 16,4 58,9 ± 7,5 13,4 > 0,05

CD16CD56 7,1 ± 2,0 1,4 24,6 ± 17,5 7,7 > 0,05

CD3CD16CD56 1,0 ± 0,3 0,3 20,3 ± 1,9 6,7 > 0,05

CD4CD25 10,6 ± 4,2 2,5 4,5 ± 1,9 1,3 > 0,05

CD4CD25CD27 54,3 ± 11,8 * 12 * 21,5 ± 5,9 5,5 0,016

16 kDa CD3CD4 185,0 ± 33,1 47,4 227,3 ± 31,6 45,2 > 0,05

CD3CD8 95,2 ± 13,7 25,8 122,0 ± 18,5 25,4 > 0,05

Razão CD4/CD8 1,9 ± 0,1 2,0 ± 0,3 > 0,05

CD4CD62L 31,2 ± 15,4 13,3 128,1 ± 30,2 24,3 > 0,05

CD8CD62L 43,0 ± 7,2 13,0 58,6 ± 6,6 12,7 > 0,05

CD16CD56 4,5 ± 1,0 1,2 24,7 ± 19,4 6,7 * 0,045

CD3CD16CD56 0,8 ±0,2 0,3 21,3 ± 4,4 6,0 > 0,05

CD4CD25 3,7 ± 1,4 0,9 8,2 ± 4,4 2,0 > 0,05

CD4CD25CD27 32,3 ± 9,0 8,1 29,7 ± 8,9 7,0 > 0,05

AlaDH CD3CD4 201,9 ± 38,2 46,4 201,2 ± 24,9 45 > 0,05

CD3CD8 107,1 ± 18,6 25,7 102,6 ± 8,0 24,7 > 0,05

Razão CD4/CD8 1,8 ± 0,1 2,1 ± 0,3 > 0,05

CD4CD62L 38,9 ± 19,8 13,7 109,8 ± 23,5 23,8 > 0,05

CD8CD62L 53,4 ± 16,3 13,3 54,4 ± 6,7 12,4 > 0,05

CD16CD56 5,4 ± 1,5 1,1 19,8 ± 13,8 7,5 > 0,05

CD3CD16CD56 0,6 ± 0,3 0,2 16,2 ± 1,1 6,7 > 0,05

CD4CD25 4,1 ± 1,6 0,8 3,1 ± 1,1 1,0 > 0,05

CD4CD25CD27 31,7 ± 8,5 7,1 23,1 ± 8,2 5,9 > 0,05



56

Tabela 6 (continuação): Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares dos indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) e negativo (TCT-), e estimulados com os antígenos PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB.S.E.M. = erro-padrão da média.

TCT + TCT - -


38kDa CD3CD4 114,6 ± 19,5 42,8 209,7 ± 21,6 45,1 0,006

+ CD3CD8 61,8 ± 7,2 23,8 112,2 ± 11,7 24,8 0,005

CFP10 Razão CD4/CD8 1,8 ±0,2 2,1 ± 0,3 > 0,05

CD4CD62L 20,9 ± 12,5 11,4 108,0 ± 19,9 23,1 0,020

CD8CD62L 18,5 ± 7,1 7,9 55,1 ± 8,2 11,8 0,010

CD16CD56 1,7 ± 0,5 0,5 22,2 ± 16,2 * 7,2 * 0,030

CD3CD16CD56 0,2 ± 0,1 0,1 17,3 ± 2,6 6,2 0,045

CD4CD25 2,5 ± 0,8 0,9 6,9 ± 2,6 1,8 > 0,05

CD4CD25CD27 21,0 ± 5,9 7,5 28,6 ± 6,7 7,2 > 0,05

ESAT-6 CD3CD4 127,1 ± 12,8 46,4 233,0 ± 27,3 44,7 0,010

+ CD3CD8 65,3 ± 5,9 24,3 125,2 ± 17,7 24,6 0,003

CFP10 Razão CD4/CD8 2,0 ± 0,1 2,1 ±0,4 > 0,05

CD4CD62L 25,9 ± 15,8 10,7 109,3 ± 23,9 22,5 0,037

CD8CD62L 18,3 ± 7,1 6,9 55,0 ± 8,2 11,1 0,006

CD16CD56 2,8 ± 1,3 1,0 27,9 ± 21,3 7,4 0,050

CD3CD16CD56 1,9 ± 1,6 0,7 23,0 ± 3,7 6,4 > 0,05

CD4CD25 2,5 ± 0,8 0,8 8,1 ± 3,7 1,9 > 0,05

CD4CD25CD27 22,8 ± 5,8 7,4 30,9 ± 7,4 7,2 > 0,05CD3CD4/CD8+: células T aux/cit, CD4/CD8CD62L+: células T aux/cit de memória; CD16CD56+: Células NK; CD3CD16CD56+: Células NKT; CD4CD25+: linfócitos Treg induzidos; CD4CD25CD27+: linfócitos Treg naturais.

Figura 10b: Porcentagem média de diferentes populações celulares de indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (TCT-) estimulados com o antígeno PPD, os antígenos micobacterianos isolados e combinações, específicos para MTB. * (p<0,05)

05

101520253035404550

PPD+ PPD- PPD+ PPD-


% d

e ce

lulas

T


*

% d

e cé

lula

s

*

TCT+ TCT- TCT+ TCT-



57

Os indivíduos não-TB também foram categorizados quanto à exposição recente

a pacientes com TBa (CTr; n=15) ou exposição ambiental (Cae; n=17). Em geral, a

média absoluta e percentual de expressão de células iTreg, NK, NKT e nTreg, estão

aumentados nos indivíduos classificados como CTr, não havendo diferença entre os

reatores (8/15) e os não reatores (7/15) ao teste cutâneo à tuberculina. Por outro lado,

em geral, o número absoluto e percentual de células Taux e Tcit de memória, mostrou-

se mais elevado entre os indivíduos Cae estimulados com todos os antígenos, embora

sem diferença significativa, sendo esta evidenciada apenas na população de linfócitos

Taux de memória para os antígenos PPD e 38kDa/CFP-10 (p<0,05; tabela 7 e figura 11a

e 11b).

0

10

20

30

40

50

60

CTr Cae CTr Cae CTr Cae

PPD 16 kDa AlaDH

% c

elul

as T


Figura 11a: Porcentagem média de diferentes populações celulares dos indivíduos não-TB categorizados quanto a exposição a tuberculose: CTr = com exposição recente a pacientes com TB ativa e Cae = indivíduos de área endêmica para TB, estimulados com os antígenos PPD erecombinantes simples específicos para MTB.

% d

e cé

lula

s



58

Tabela 7: Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares dos indivíduos não-TB, categorizados quanto a exposição a tuberculose: CTr = com exposição recente a pacientes com TB ativa e Cae = indivíduos de área endêmica para TB, estimulados com os antígenos PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB. S.E.M. = erro-padrão da média.

CTr Cae


PPD CD3CD4 205,9 ± 28,7 42,5 212,4 ± 25,7 48,6 > 0,05

CD3CD8 113,1 ± 14,1 24,4 117,3 ± 11,3 27,9 > 0,05

Razão CD4/CD8 1,8 ± 0,2 2,0 ± 0,4 > 0,05

CD4CD62L 89,3 ± 15,8 20,3 138,2 ± 27,3 30,7 0,05

CD8CD62L 59,6 ± 8,8 13,1 72,9 ± 9,0 16,9 > 0,05

CD16CD56 25,5 ± 17,5 7,8 5,7 ± 2,0 1,3 > 0,05

CD3CD16CD56 20,1 ± 17,5 6,6 1,3 ± 0,6 0,3 > 0,05

CD4CD25 9,7 ± 3,0 2,5 2,2 ± 0,8 0,6 > 0,05

CD4CD25CD27 40,6 ± 9,7 9,3 23,2 ± 6,5 5,8 > 0,05

16 kDa CD3CD4 227,0 ± 32,2 44,6 185,5 ± 31,5 48,4 > 0,05

CD3CD8 119,8 ± 18,6 24,2 98,8 ± 14,0 27,8 > 0,05

Razão CD4/CD8 1,8 ± 0,2 2,0 ± 0,4 > 0,05

CD4CD62L 106,2 ± 26,9 20,6 116,5 ± 28,1 30,2 0,062

CD8CD62L 49,8 ± 6,7 10,8 57,3 ± 8,1 16,1 > 0,05

CD16CD56 24,6 ± 19,4 6,8 4,7 ± 1,7 1,1 > 0,05

CD3CD16CD56 21,2 ± 19,4 6,0 1,0 ± 0,5 0,3 > 0,05

CD4CD25 8,5 ± 4,4 2,0 3,2 ± 0,9 0,9 > 0,05

CD4CD25CD27 34,7 ± 9,4 7,9 24,3 ± 6,8 6,6 > 0,05

AlaDH CD3CD4 210,7 ± 28,0 43,5 186,5 ± 31,0 48,9 > 0,05

CD3CD8 108,3 ± 11,3 23,6 97,9 ± 12,7 27,5 > 0,05

Razão CD4/CD8 1,8 ± 0,2 2,0 ± 0,4 > 0,05

CD4CD62L 93,3 ± 19,4 20,1 116,9 ± 27,0 30,8 > 0,05

CD8CD62L 50,0 ± 10,7 10,5 60,7 ± 7,8 16,5 > 0,05

CD16CD56 20,1 ± 13,8 7,5 4,8 ± 1,7 1,2 > 0,05

CD3CD16CD56 15,9 ± 13,8 6,7 1,0 ± 0,7 0,3 > 0,05

CD4CD25 4,7 ± 1,4 1,1 1,7 ± 0,5 0,6 > 0,05

CD4CD25CD27 25,8 ± 6,7 5,7 27,2 ± 11,9 7,4 > 0,05



59

Tabela 7 (continuação): Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares dos indivíduos não-TB, categorizados quanto a exposição a tuberculose: CTr = com exposição recente a pacientes com TB ativa e Cae = indivíduos de área endêmica para TB, estimulados com os antígenos PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB. S.E.M. = erro-padrão da média.

CTr Cae


38kDa CD3CD4 161,0 ±23,1 41,8 193,7 ± 30,0 48,1 > 0,05

+ CD3CD8 83,1 ± 10,8 22,2 109,1 ± 16,5 28,1 > 0,05

CFP10 Razão CD4/CD8 1,8 ± 0,3 2,0 ± 0,4 > 0,05

CD4CD62L 71,6 ± 19,1 17,2 109,7 ± 19,8 29,6 0,020

CD8CD62L 25,9 ± 6,4 6,3 66,0 ± 10,0 16,8 > 0,05

CD16CD56 20,3 ± 16,3 6,9 4,7 ± 1,7 1,1 > 0,05

CD3CD16CD56 17,1 ± 16,3 6,1 0,6 ± 0,1 0,2 > 0,05

CD4CD25 6,3 ± 2,6 1,8 3,3 ± 1,1 0,9 > 0,05

CD4CD25CD27 25,6 ± 6,4 7,1 25,8 ± 7,0 7,7 > 0,05

ESAT-6 CD3CD4 182,2 ± 29,2 43,3 209,7 ± 28,1 48,7 > 0,05

+ CD3CD8 94,7 ± 18,6 22,5 114,9 ± 15,1 27,8 > 0,05

CFP10 Razão CD4/CD8 1,8 ± 0,3 2,0 ± 0,4 > 0,05

CD4CD62L 66,2 ± 20,1 15,7 126,6 ± 24,4 30,1 > 0,05

CD8CD62L 24,9 ± 6,5 5,3 67,3 ± 8,8 16,2 > 0,05

CD16CD56 25,7 ± 21,4 7,0 6,3 ± 2,2 1,5 > 0,05

CD3CD16CD56 22,9 ± 21,4 6,4 2,0 ± 1,6 0,7 > 0,05

CD4CD25 7,6 ± 3,8 1,9 3,4 ± 1,0 0,9 > 0,05

CD4CD25CD27 27,6 ± 7,3 7,2 28,1 ± 6,6 7,3 > 0,05CD3CD4/CD8+: Células T aux/cit, CD4/CD8CD62L+: Células T aux/cit de memória; CD16CD56+: Células NK; CD3CD16CD56+: Células NKT; CD4CD25+: Linfócitos Treg induzidos; CD4CD25CD27+: Linfócitos Treg naturais.

Figura 11b: Porcentagem média de diferentes populações celulares de indivíduos não-TB, categorizados quanto ao teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (TCT-) estimulados com os antígenos micobacterianos combinados específicos para MTB.

0

10

20

30

40

50

60

CTr Cae CTr Cae


% c

elul

as T

CD3CD4 CD3CD8 CD4CD62L CD8CD62L

CD16CD56 CD3CD16CD56 CD4CD25 CD4CD25CD27

% d

e cé

lula

s



60

Embora os pacientes com TBa tenham apresentado menor estimulação pelos

antígenos testado e controles, avaliamos se o tratamento com tuberculostáticos interfere

na expressão das populações celulares. Em geral, não houve diferença nas populações

celulares entre os pacientes tratados >60 dias (TBt≥60d.; n=10) e pacientes ainda não

tratados ou tratados a menos de 60 dias (TBi<60d; n=11). Entretanto, o percentual de

linfócitos Tcit aumentou significativamente com o estímulo dos antígenos 16kDa e

AlaDH nos TBi<60d (p=0,043), enquanto que os linfócitos Taux de memória estão em

média mais elevados entre os TBt≥60d na estimulação com 16kDa (p=0,008). Embora

sem diferença significativa, os antígenos 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10 levaram a

um aumento de expressão destas células nos pacientes TBt≥60d (tabela 8, figuras 12a e

12b).

Figura 12a: Porcentagem de diferentes populações celulares nos pacientes em início do tratamento (TBi<60d) e tratados >60 dias (TBt≥60d), estimulados com os antígenos PPD e recombinantes simples, específicos para MTB. (* p<0,05)

0

10

20

30

40

50

TBi<60d TBt≥60d TBi<60d TBt≥60d TBi<60d TBt≥60d

PPD 16 kDa AlaDH

% c

elul

as T


**

* *

% d

e cé

lula

s

* *



61

Tabela 8: Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares nos pacientes em início do tratamento (TBi<60d) e tratados >60 dias (TBt≥60d), estimulados com os antígenos PPD, os antígenos micobacterianos recombinantes isolados e combinações, específicos para MTB. S.E.M. = erro-padrão da média.

TBi<60d TBt≥60d


PPD CD3CD4 170,8 ± 20,8 46,3 183,7 ± 62,2 48,4 > 0,05

CD3CD8 93,3 ± 19,7 24,8 74,2 ± 9,2 19,4 > 0,05

Razão CD4/CD8 2,7 ± 0,2 2,1 ± 0,6 > 0,05

CD4CD62L 82,6 ± 15,4 20,6 98,5 ± 14,2 28,6 > 0,05

CD8CD62L 37,6 ± 5,7 10,3 49,2 ± 12,3 13,7 > 0,05

CD16CD56 7,2 ± 4,0 1,9 5,1 ± 3,0 1,6 > 0,05

CD3CD16CD56 0,9 ± 0,5 0,2 1,1 ± 0,6 0,3 > 0,05

CD4CD25 4,2 ± 1,5 1,5 1,4 ± 0,5 0,5 > 0,05

CD4CD25CD27 22,3 ± 7,8 6,2 13,6 ± 3,4 4,5 > 0,05

16 kDa CD3CD4 131,2 ± 18,4 39,4 160,7 ± 16,4 47,3 > 0,05

CD3CD8 85,7 ± 15,7 25,6 * 65,3 ± 6,8 19,5 0,043

Razão CD4/CD8 2,6 ± 0,2 1,8 ± 0,6 0,059

CD4CD62L 61,3 ± 12,1 16,9 93,0 ± 13,1 27,3 * 0,008

CD8CD62L 33,7 ± 6,7 9,6 43,2 ± 9,8 12,8 > 0,05

CD16CD56 6,0 ± 3,1 1,8 4,9 ± 2,5 1,6 > 0,05

CD3CD16CD56 0,4 ± 0,2 0,1 1,1 ± 0,6 0,3 > 0,05

CD4CD25 3,4 ± 1,4 1,0 1,6 ±0,6 0,5 > 0,05

CD4CD25CD27 17,0 ± 6,3 5,2 14,2 ± 4,0 4,7 > 0,05

AlaDH CD3CD4 141,5 ± 24,4 40,2 183,9 ± 12,9 48,8 > 0,05

CD3CD8 93,0 ± 10,6 25,2 * 70,2 ± 6,2 19,3 0,043

Razão CD4/CD8 2,7 ± 0,2 1,8 ± 0,5 0,059

CD4CD62L 81,2 ± 20,3 19,7 101,9 ± 10,0 29,1 > 0,05

CD8CD62L 36,7 ± 6,6 10,2 48,2 ± 10,3 13,1 > 0,05

CD16CD56 5,1 ± 2,2 1,6 4,7 ± 2,6 1,5 > 0,05

CD3CD16CD56 0,7 ± 0,2 0,2 0,9 ± 0,5 0,3 > 0,05

CD4CD25 2,2 ± 0,8 0,7 0,6 ± 0,2 0,2 > 0,05

CD4CD25CD27 11,7 ± 4,2 3,9 9,9 ± 3,3 3,3 > 0,05



62

Tabela 8 (continuação): Médias e erro-padrão do número de células e porcentagem de diferentes populações celulares nos pacientes em início do tratamento (TBi<60d) etratados >60 dias (TBt≥60d), estimulados com os antígenos PPD, recombinantes simples e combinados específicos para MTB. S.E.M. = erro-padrão da média.

TBi<60d TBt≥60d


38kDa CD3CD4 123,7 ± 21,8 40,3 173,1 ± 9,6 47,7 > 0,05

+ CD3CD8 71,9 ± 15,7 22,5 72,6 ± 9,1 20,0 > 0,05

CFP10 Razão CD4/CD8 2,6 ± 0,2 2,0 ± 0,5 > 0,05

CD4CD62L 69,9 ± 15,3 18,1 84,3 ± 5,8 26,8 0,059

CD8CD62L 36,2 ± 8,8 9,4 36,2 ± 11,6 10,7 > 0,05

CD16CD56 5,3 ± 2,6 1,7 5,2 ± 3,0 1,4 > 0,05

CD3CD16CD56 0,6 ± 0,3 0,2 1,0 ± 0,7 0,3 > 0,05

CD4CD25 1,7 ± 0,9 0,8 2,4 ± 0,8 0,2 > 0,05

CD4CD25CD27 14,6 ± 4,2 4,7 15,6 ± 4,3 5,2 > 0,05

ESAT-6 CD3CD4 123,7 ± 24,5 39,1 167,9 ± 3,6 47,6 > 0,05

+ CD3CD8 67,5 ± 14,9 20,6 66,2 ± 9,7 18,9 > 0,05

CFP10 Razão CD4/CD8 2,7 ± 0,2 2,0 ± 0,5 0,059

CD4CD62L 64,5 ± 13,8 19,3 80,6 ± 9,2 26,5 > 0,05

CD8CD62L 32,7 ± 8,4 9,3 36,0 ± 11,8 10,1 > 0,05

CD16CD56 5,2 ± 2,5 1,6 4,3 ± 2,6 1,2 > 0,05

CD3CD16CD56 0,7 ± 0,2 0,2 0,9 ± 0,6 0,3 > 0,05

CD4CD25 2,6 ±1,1 0,9 2,6 ± 0,8 0,8 > 0,05

CD4CD25CD27 15,8 ± 5,2 5,1 15,8 ± 4,6 5,0 > 0,05CD3CD4/CD8: células T aux/cit, CD4/CD8CD62L: células T aux/cit de memória; CD16CD56: Células NK; CD3CD16CD56: Células NKT; CD4CD25: linfócitos Treg induzidos; CD4CD25CD27: linfócitos Treg naturais.

Figura 12b: Porcentagem de diferentes populações celulares nos pacientes em início de tratamento (TBi<60d) e tratados >60 dias (TBt≥60d), estimulados com os antígenos micobacterianos combinados específicos para MTB.

0

10

20

30

40

50

60

TBi<60d TBt≥60d TBi<60d TBt≥60d


% c

elul

as T


% d

e cé

lula

s



63

4.7) Análise da produção de citocinas Th1 (IFN-) e Th2 (IL-10)

A produção de citocinas do perfil Th1 (IFN-) e Th2 (IL-10) no sobrenadante da

cultura de PBMC estimuladas com antígenos recombinantes micobacterianos foi

avaliada em 18 pacientes TBa e 32 indivíduos não-TBa, dos quais 11 TCT+ e 21 TCT-.

Houve produção espontânea de ambas as citocinas nos controles não estimulados: TBa:

25,1 ± 6,3; indivíduos TCT+: 132,2 ± 40,3; indivíduos TCT-: 29,6 ± 7,8 para IFN- e

TBa: 566,4 ± 203,9; indivíduos TCT+: 64,0 ± 36,1; indivíduos TCT-: 404,0 ± 136,4

para IL-10.

A média de produção de IFN- foi mais elevada entre os indivíduos TCT+ em

relação aos pacientes TBa e indivíduos TCT- (p≤0,015); com os antígenos 16kDa

(131,5 ± 49,7) e ESAT-6/CFP-10 (130,3 ± 28,2) mostrando as maiores reatividades

médias, seguido do AlaDH (119,2 ± 51,3), PPD (117,3± 44,0), e da combinação

38kDa/CFP-10 (105,7 ± 34,5), porém sem diferença significativa (figura 13).

Nos pacientes TBa, a maior reatividade média foi obtida para a combinação

ESAT-6kDa/CFP-10 (68,0 ± 22,4), seguida do 38kDa/CFP-10 (59,7 ± 18,4), AlaDH e

PPD (43,1±18,8 e 37,7±7,4 respectivamente); já entre os indivíduos TCT-, os antígenos

ESAT-6kDa/CFP-10 (44,8 ±14,2) e 38kDa/CFP-10 (37,9 ±16,1) contribuíram com a

maior reatividade média de IFN-,bem como o antígeno PPD (44,4 ±9,3) Para ambos

os grupos de indivíduos o antígeno 16kDa foi o menos reconhecido (16,2 ± 4,0; 19,0 ±

5,5 respectivamente – figura 13).

A análise da produção de IL-10 mostrou resultado inverso ao IFN-, pois a

produção média de IL-10 foi menor nos indivíduos TCT+ que nos indivíduos com TBa

e indivíduos TCT- (p<0,03), com o antígeno 16kDa responsável pela maior reatividade



64

média (139,6 ± 50,8). Os antígenos que melhor induziram a produção de IL-10 nos TBa

e sadios não reatores ao teste tuberculínico, foram o 38kDa/CFP-10 (741,2 ±256,3) e

ESAT-6kDa/CFP-10 (841,8 ±360,7) e o 16kDa, além do antígeno PPD (756,6 ±279,2;

688,6 ± 210,3 respectivamente – figura 13).

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

160,0

180,0

200,0

TBa PPD+ PPD-

IFN

-gam

a (p

ico

gra

mas

/mL

)

PPD

16K

ALADh

38CFP

ESAT CFP

* p≤0,015

Figura 13 – Reatividade média da produção de IFN- e IL-10 testados por ensaio imunoenzimático (ELISA) no sobrenadante de cultura de PBMC, de pacientes com tuberculose ativa (TBa), e indivíduos não-TB, categorizados quanto a reação positiva (TCT+) ou negativa (TCT-) para o teste cutâneo à tuberculina estimuladas com diferentes antígenos de MTB.

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

TBa PPD+ PPD-

IL-1

0 (

pic

og

ram

as/

mL

)

PPD

16K

AlaDh

38kDa/CFP-10

ESAT6/CFP-10

* p<0,03

TCT+ TCT-

TCT+ TCT-



65

Ao avaliar a reatividade por IFN- e IL-10 nos indivíduos não-TB/TCT positivos

e negativos, dicotomizados quanto a exposição à tuberculose (CTr e Cae), observou-se

que a maior produção média de IFN- está associada aos CTr/TCT+ e, embora a média

de IFN- para o ESAT-6/CFP-10 esteja mais elevada esta não difere estatisticamente

das médias induzidas pelos outros antígenos. Embora TCT+, o grupo Cae apresentou

intensidade média de IFN- similar ao grupo Cae não reator ao PPD, para os antígenos

AlaDH, e as combinações 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10, exceto o 16kDa cuja

média de IFN- foi mais elevada para Cae/PPD+, embora sem diferença significativa. O

grupo de voluntários Cae contém apenas três indivíduos, onde um deles mostrou-se alto

produtor de IFN- (>362,8pg/mL) para todos os antígenos testados, o segundo indivíduo

foi médio produtor para o antígeno 16kDa (90,6pg/mL) e foi baixo produtor de IFN-

para todos os outros antígenos, exceto 38kDa/CFP-10 (52,14pg/mL), o terceiro

indivíduo foi baixo produtor para todos os antígenos exceto para o ESAT-6/CFP-10

(76,8pg/mL , figura 14).

A produção média de IL-10 nestes mesmos indivíduos mostrou-se invertida com

média mais elevada associada ao grupo Cae/TCT- para o antígeno 16kDa (p=0,048). A

combinação de ESAT-6/CFP-10 nos PPD não reatores foi também forte indutora de IL-

10, diferencialmente em relação ao grupo CTr/TCT+ (p<0,05; figura 14).



66

0

20

40

60

80

100

120

140

160

CTr Cae CTr Cae

TCT+ TCT-

IFN

-ga

ma

(p

ico

gra

ma

s/m

L)

PPD

16kDa

ALADh

38CFP

ESAT CFP

617,2

•90,6

•

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

CTr Cae CTr Cae

TCT+ TCT-

IL-1

0 (

pic

og

ram

as

/mL

)

PPD

16K

AlaDh

38kDa/CFP-10

ESAT6/CFP-10

*

Figura 14: Concentração de IFN- e IL-10 produzido pelos indivíduos não-TB TCT+ e TCT-, categorizados quanto à exposição para tuberculose: CTr = com exposição recente a pacientes com TB ativa e Cae = indivíduos de área endêmica para TB, estimulados com os antígenos PPD, recombinantes simples e combinados, específicos para MTB. (* p<0,05).

617,2

•



67

Analisando a resposta imune celular por IFN- e IL-10 nos pacientes TBa quanto

ao tempo de tratamento observou-se maior produção média de IFN- nos pacientes

TBt>60d apenas quando estimulados com a combinação ESAT-6/CFP-10 (92,8 23,9),

porém sem diferença significativa quando comparado com as médias dos outros

antígenos testados. Embora a média de resposta por IFN- para ESAT-6/CFP-10 (63,8

21,9) e 38kDa/CFP-10 (63 26,6) entre os TBi<60d tenham sido similares, estas se

comportam diferentemente dos TBt>60d, pois para o 38kDa/CFP-10, bem como para os

outros antígenos, houve um decréscimo na média de produção de INF- (38,8 10,6),

embora sem diferença significante. O antígeno 16kDa não se mostrou um bom indutor

de IFN- nos pacientes TBa tratados ou não tratados (figura 15).

Na avaliação da resposta para IL-10, produção significativa foi observado para o

grupo TBt>60d vs. TBi<60d para todos os antígenos micobacterianos (p<0,028), exceto

para o antígeno PPD (p=0,318; figura 15).



68

0

20

40

60

80

100

120

140

TBi <60d TBt ≥60d

IFN

-ga

ma

(pic

og

ram

as/

mL

)

PPD

16K

AlaDh

38kDa/CFP-10

ESAT6/CFP-10

0

500

1000

1500

2000

2500

TBi <60d TBt ≥60d

IL-1

0 (

pic

og

ram

as/

mL

)

PPD

16K

AlaDh

38kDa/CFP-10

ESAT6/CFP-10

*

Figura 15: Resposta média da produção de IFN- e IL-10 por pacientes TBa no início (TBi <60d) e com mais de 60 dias (TBt>60d) de tratamento. Resultados obtidos por teste imunoenzimático (ELISA). (*=p<0,05).



69

4.8) Freqüência de positividade para IFN- e IL-10 no sobrenadante de PBMC

dos pacientes TBa e indivíduos não-TB estimulados com diferentes antígenos

micobacterianos, determinado pelo método imunoenzimático (ELISA)

A análise da freqüência de positividade para o IFN- (≥50pg/mL) no teste de

ELISA mostra que os indivíduos TCT+ foram significativamente mais respondedores

(p<0,005) que os indivíduos TCT- e TBa, para todos os antígenos testados. Maior

freqüência de positividade foi obtida com o antígeno combinado 38kDa/CFP-10 (90%),

seguido dos antígenos ESAT-6/CFP-10, 16kDa, PPD (81% respectivamente) e AlaDH

(73 %) para os indivíduos TCT+. No grupo TCT-, a frequência de produtores de IFN-,

é menor que entre os pacientes TB ativa, porém sem diferença significativa.

Analisando o grupo não-TB quanto a exposição a TB observou-se que o maior

número de respondedores se encontra entre os CTr, principalmente para a combinação

38kDa/CFP-10 e antígeno PPD (100%; tabela 9). É interessante notar que entre os

CTr/TCT+ 7 de 8 que foram positivos para a produção de IFN- quando estimulados

com o antígeno 16kDa, e também o foram para o AlaDH e ESAT-6/CFP-10; mas o

38kDa/CFP-10 induziu IFN- em todos os CTr, apresentando melhor reatividade.

Resultado similar foi obtido com os indivíduos Cae/TCT+ onde 2 de 3 que foram

positivos para IFN- quando induzidos com o 16kDa o foram também para o

38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10.

Considerando os CTr/TCT- apenas 2 de 7, que foram positivos para IFN-

quando induzidos com o 16kDa, também o foram para ambas as combinações. Já no

grupo Cae/TCT- a freqüência de respondedores foi baixa e não obedeceram ao padrão

observado acima para os antígenos 16kda, e as combinações, onde o único indivíduo

positivo para 16kDa, foi negativo para as combinações (tabela 9).



70

Tabela 9: Freqüência e significância estatística da resposta imunitária por IFN- produzido pelas PBMC de pacientes TBa e indivíduos não-TB com teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (PPD -), estimulados com antígenos micobacterianos.

Número de positivos/total (%)TB TCT+ TCT-

PPD 7/18 (39) 9/11 (81) * 8/21 (38)16kDa 1/18 (6) 9/11 (81) * 4/21 (19)AlaDH 5/18 (28) 8/11 (73) * 3/21 (14)38kDa/CFP-10 7/18 (39) 10/11 (90) * 6/21 (29)ESAT-6/CFP-10 7/18 (39) 9/11 (81) * 7/21 (33)

* = p<0,05

Número de positivos/total (%)TCT + TCT -

CTr Cae CTr Cae

PPD 8/8 (100) 1/3 (33) 3/7 (43) 5/14 (36)16kDa 7/8 (87,5) 2/3 (67) 2/7 (29) 1/14 (7)AlaDH 7/8 (87,5) 1/3 (33) 1/7 (14) 2/14 (14)38kDa/CFP-10 8/8 (100) 2/3 (67) 4/7 (57) 2/14 (14)ESAT-6/CFP-10 7/8 (87,5) 2/3 (67) 4/7 (57) 3/14 (21)

A frequência de positividade para IL-10 (≥200pg/mL) para os grupos testados

apresenta resultados contrários aos obtidos para IFN- onde os grupos TB e TCT-

respondem com uma maior freqüência de positividade, em relação ao grupo TCT+. A

queda de produção de IL-10 no grupo TCT+ foi significante para todos os antígenos

micobacterianos (p<0,05). Quando os indivíduos não-TB foram dicotomizados em CTr

e Cae, observou-se que os respondedores distribuem-se em maior frequência entre o

grupo Cae, seja para os indivíduos TCT+ ou TCT-. Não observamos resposta entre os

TCT+/CTr, mas contrariamente, o grupo TCT-/CTr foi forte respondedor, para todos os

estímulos antigênicos (tabela 10).



71

Tabela 10: Freqüência e significância estatística da resposta imunitária por IL-10 produzida pelas PBMC de pacientes TBa e indivíduos não-TB com teste cutâneo à tuberculina positivo (TCT+) ou negativo (TCT-), estimulados com antígenos micobacterianos.

Número de positivos/total (%)TB TCT+ TCT-

PPD 11/18 (61) 2/11 (18) * 12/21 (57)16kDa 12/18 (67) 1/11 (9) * 14/21 (67)AlaDH 8/18 (44) 2/11 (18) * 14/21 (67)38kDa/CFP-10 9/18 (50) 2/11 (18) * 15/21 (71)ESAT-6/CFP-10 9/18 (50) 2/11 (18) * 12/21 (57)

* = p<0,05

Número de positivos/total (%)TCT + TCT -

CTr Cae CTr CaePPD 0/8 (0) 2/3 (67) 6/7 (86) 6/14 (43)16kDa 0/8 (0) 1/3 (33) 6/7 (86) 8/14 (57)AlaDH 0/8 (0) 2/3 (67) 6/7 (86) 8/14 (57)38kDa/CFP-10 0/8 (0) 2/3 (67) 6/7 (86) 9/14 (64)ESAT-6/CFP-10 0/8 (0) 2/3 (67) 4/7 (57) 8/14 (57)

Entre os pacientes TBa com BAAR positivo, dois eram mais bacilíferos

(BAAR++) e não responderam para nenhum dos antígenos testados; já os menos

bacilíferos [BAAR+ 36%(4/11)] responderam por IFN- ao antígeno PPD e ESAT-

6/CFP-10 em 27%, ao AlaDH e 38 kDa/CFP-10, e o antígeno 16kDa foi reconhecido

por apenas um paciente recém diagnosticado e ainda sem início de tratamento. Os

pacientes TBa paucibacilares (BAAR-) foram em sua maioria respondedores para o

ESAT-6/CFP-10, 38 kDa/CFP-10 e PPD (3/4, respectivamente) seguido do AlaDH

(1/4) e o 16kDa não foi reconhecido por nenhum deles. Para IL-10 todos os bacilíferos

(BAAR++ e BAAR+) responderam aos antígenos 16kDa (64 %) e PPD (54 %) e para os

paucibacilares 2/4 responderam para todos os antígenos, respectivamente.



72

4.9) Análise dos dados clínicos, epidemiológicos e demográficos relacionados a

população com resultado de imunofenotipagem e produção de citocinas

Através do banco de dados montado com as informações dos sujeitos do estudo

por questionário padronizado, foram avaliadas a relação entre a estimulação das PBMC

com os antígenos micobacterianos recombinantes e as características clínicas,

epidemiológicas e demográficas.

4.9.1) Análise quanto aos diversos grupos celulares:

Pacientes TBa: os pacientes TBa apresentaram diferenças significativas em

algumas subpopulações de linfócitos. No grupo de alcoolistas, houve decréscimo da

média celular para linfócitos Taux estimulados com 38kDa/CFP-10 (p=0,043) e na

razão Taux/Tcit, quando da estimulação com ESAT-6/CFP-10 (p=0,043), em relação

aos indivíduos não-TB; Entre os pacientes tabagistas a estimulação com a combinação

de antígenos 38kDa/CFP-10 provocou queda significativa da média de linfócitos Taux

de memória (p=0,020).

Pacientes no inicio (TBi<60d) ou em tratamento para TB (TBt>60d) : avaliamos

se o tratamento possuía alguma influência na modulação da resposta imunitária em

pacientes antes e durante o tratamento para TB. A estimulação com os antígenos

micobacterianos provocou um discreto aumento na razão CD4/CD8, sendo que o

antígeno 16kDa elevou a porcentagem de linfócitos Taux de memória (p=0,008) e os

antígenos PPD, 16kDa e AlaDH aumentaram a porcentagem de linfócitos Tcit de

memória nos pacientes durante o tratamento com tuberculoestáticos (p=0,04).

A estimulação com os antígenos micobacterianos também foi importante na

modulação da porcentagem de linfócitos Taux de memória nos pacientes com



73

bacterioscopia positiva para BAAR. Os antígenos 16kDa e os combinados provocaram

queda significativa no percentual celular (p<0,05).

Contatos Recentes de pacientes com TBa e Controles de Área Endêmica: no

grupo de indivíduos com exposição recente a pacientes com TB, o fato de ser alcoolista,

foi associada a redução no número absoluto de linfócitos NKT (p =0,045). Entretanto a

redução desta população celular foi exacerbada sob estimulação com os antígenos

16kDa (p=0,019), AlaDH (p=0,004) e a combinação ESAT-6/CFP-10 (p=0,002). As

células NK também tiveram sua média absoluta reduzida significativamente pela

estimulação do antígeno AlaDH (p=0,045) e percentualmente pelo 16kDa (p=0,04).

Outro grupo de células que sofreu decréscimo percentual nos alcoolistas, foram as

iTregs estimuladas com o antígeno 16kDa (p=0,03).

A utilização de tabaco regularmente também modulou negativamente a razão

entre os linfócitos Taux eTcit (razão CD4/CD8) nos indivíduos CTr (p =0,006). Sob

estimulação dos antígenos 16kDa, AlaDH, e as combinações de 38kDa e ESAT-6 com o

CFP-10, esta redução numérica e percentual tornou-se mais acentuada (p =0,003). Esta

modulação foi reflexo da redução nas populações de linfócitos Taux sob estímulo de

38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10 (p=0,05) e de linfócitos Tcit para os estímulos 16kDa

(p=0,05) e AlaDH (p=0,01).

Como esperado, indivíduos com reação positiva ao teste cutâneo à tuberculina

apresentaram redução no número absoluto de células estimuladas com o antígeno PPD,

sendo significativo para as os linfócitos nTreg (p =0,022) e linfócitos Tcit de memória

(p =0,05). O estímulo com os antígenos combinados, provocou queda na contagem de

linfócitos Tcit efetores e de memória, além dos linfócitos Taux de memória (p =0,05).



74

Para os indivíduos controle de área endêmica, nenhuma das características

clínicas foi significante, na modulação da média celular. Entretanto o percentual de

linfócitos nTreg foi reduzido pela estimulação com 16kDa, nas PBMC de indivíduos

alcoolistas (p=0,03).

4.9.2) Análise quanto à produção de citocinas Th1 e Th2:

Quando os indivíduos foram analisados quanto ao hábito tabagista, nenhuma

diferença significativa foi encontrada. Entretanto o mesmo não acontece nos indivíduos

alcoolistas, já que os antígenos 38kDa e ESAT-6 em combinação com o CFP-10,

induziram maior reatividade média ao IFN- nas pessoas que mantinham este hábito

(p<0,048). Outros dados como vacinação por BCG e idade não apresentaram relação

com o perfil de produção de citocinas.

Pacientes TB ativa: o único grupo que apresentou significativa diferença na

estimulação de IFN- foi de pacientes com TCT+, o que é esperado, pois todos os

doentes deste estudo são TCT+ (p=0,017). O fato do indivíduo já ter tido tuberculose

anteriormente, é significativo na reatividade do antígeno 16kDa (p=0,05) e do AlaDH

(p=0,018). Nenhum outro fator como tabagismo ou alcoolismo influenciou

diferencialmente a resposta das citocinas.

Pacientes no inicio (TBi<60d) ou em tratamento para TB (TBt>60d) : o tempo

de tratamento influenciou na capacidade de resposta específica da citocinas frente a

estimulação de antígenos micobacterianos. Para o IFN-, apenas o antígeno PPD

induziu resposta positiva significativa nos pacientes tratados por ≥60 dias (p=0,016); já

para a IL-10, o tratamento foi associado a capacidade de responder a todos os antígenos

recombinantes (p<0,028).



75

Contatos Recentes de pacientes com TBa e Controle de Área Endêmica: No

grupo CTr reatividade média de IFN-foi positivamente associada ao estímulo com

16kDa (p=0,047). A produção média de IL-10 foi significativa para a estimulação com

os antígenos AlaDH, 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10 (p<0,

Quando estes indivíduos foram agrupados pela reatividade ao teste cutâneo à

tuberculina, os indivíduos TCT+ positivamente associados para a produção média de

IFN-, para todos os antígenos testados, incluindo o antígeno PPD (p<0,035). Já na

produção de IL-10, o estímulo com os antígenos AlaDH e PPD foram os únicos que

mostraram associação positiva (p=0,037; p=0,030 respectivamente).



76

4.10) Expressão gênica de diversas citocinas na resposta imunitária ao MTB

A formação da resposta imunitária contra a tuberculose é complexa e envolve

muitas citocinas diferentes. Nesta parte dos resultados, procuramos visualizar a

expressão de diferentes genes para citocinas (FoxP3, IFN-, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 e

TGF-) na TB ativa e em indivíduos controles não-TB. A expressão gênica para FoxP3

foi maior entre os não-TB para todos os antígenos testados, inclusive os controles PHA

e PPD. É interessante notar que o estímulo com o antígeno 16kDa foi o único com

diferença significativa na baixa expressão de FoxP3 na comparação TBa vs. não-TB

(p=0,012; figura 16).

Figura 16: Expressão gênica para FoxP3 em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.

Analisando a expressão média de FoxP3 pelos linfócitos T de indivíduos não-

TB, estimulados ou não com os antígenos micobacterianos, observa-se que o antígeno

Expressão de FoxP3 mRNA

PHAPPD

16kD

a

Ala-D

h

38kD

a/CFP-1

0

ESAT-6/

CFP-10

PHAPPD

16kD

a

Ala-D

h

38kD

a/CFP

-10

ESAT-6/C

FP-1

0-20

-10

0

10

20

p=0,012

Não-TB TBa

Nív

el d

e E

xpre

ssão

No

rmal

izad

o



77

PPD e o 38kDa/CFP-10 foram significativamente indutores da expressão média de

FoxP3 (P<0,05; figura 17). Nos pacientes TBa, não houve diferença entre os valores

não estímulados e estimulados como os antígenos.

Figura 17: Expressão gênica para FoxP3 nos indivíduos não-TB em células não estimuladas (N.E.) e estimuladas com antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão já normalizados com a expressão dos genes constitutivos.

O IFN- é um grande ativador inflamatório, pois induz ao perfil Th1 e aumenta a

expressão de MHC tipo 2 nos macrófagos. Foi evidenciado que a expressão média de

mRNA para IFN- nos pacientes TBa foi aumentada apenas para os antígenos

combinados, mas em nível menos elevado que para os indivíduos não-TB. Diferença

significativa da expressão média de INF- nestes dois grupos só foi observada para o

antígeno PPD (figura 18). A expressão gênica para IFN- em células T não estimuladas

vs. estimuladas, com os diferentes antígenos, analisada no grupo de indivíduos não-TB,

mostrou que apenas os antígenos PPD, 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10 induzem

expressão significativa do gene para INF- (p<-0,05; figura 19).

Expressão de FoxP3 mRNA em não-TB

N.E.

PHAPPD

16kD

a

Ala-D

h

38kD

a/CFP-1

0

ESAT-6/C

FP-10

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

@ @

@ = p<0,05 em relação ao não estimulado (N.E.)

Nív

el d

e E

xpre

ssão

No

rmal

izad

o



78

Figura 18: Expressão gênica para IFN- em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.

Figura 19: Expressão gênica para IFN- nos indivíduos não-TB em células não estimuladas (N.E.) e estimuladas com antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão já normalizados com a expressão dos genes constitutivos.

Expressão de IFN mRNA

PHAPPD

16kD

a

Ala-D

h

38kD

a/CFP-1

0

ESAT-6/

CFP-1

0PHA

PPD

16kD

a

Ala-D

h

38kD

a/CFP

-10

ESAT-6/C

FP-10

-20

-10

0

10

20

30

p=0,048

Não-TB TBa

Nív

el d

e E

xpre

ssão

No

rmal

izad

o

Expressão de IFN- mRNA em não-TB

N.E.

PHAPPD

16kD

a

Ala-D

h

38kD

a/CFP-1

0

ESAT-6/C

FP-10

-40

-30

-20

-10

0

10

@

@ = p<0,05 em relação ao não estimulado (N.E.)

@ @

Nív

el d

e E

xpre

ssão

No

rmal

izad

o



79

Analisando a produção de RNA mensageiro (RNAm) para IL-1, uma citocina

com papel semelhante ao TNF na mediação da inflamação local, observamos que houve

uma tendência de aumento na expressão da citocina no grupo TBa, porém sem diferença

significativa (figura 20), o mesmo ocorrendo quando comparadas a expressão nas

células não estimuladas vs. estimuladas com os antígenos micobacterianos.

Expressão de IL-1 mRNA

PHAPPD

16kD

a

Ala-D

h

38kD

a/CFP-1

0

ESAT-6/C

FP-10

PHAPPD

16kD

a

Ala-D

h

38kD

a/CFP

-10

ESAT-6/C

FP-10

-30

-20

-10

0

10

20

30

Não-TB TBa

Nív

el d

e E

xpre

ssão

Nor

mal

izad

o

Figura 20: Expressão gênica para IL-1 em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.

A expressão gênica para IL-6, uma citocina pirogênica que age em resposta a IL-

1, atuando no fígado para produção de proteínas de fase aguda, mostrou níveis mais

baixos nos pacientes com TBa vs. indivíduos não-TB para todos os estímulos

antigênicos, mas diferença significativa só foi observada para a estimulação com

combinação 38kDa/CFP-10 (p=0,048; figura 21A). A expressão média de RNAm para



80

IL-6 nas células T não estimuladas vs. estimuladas, com os diferentes antígenos,

mostrou que apenas o estímulo inespecífico PHA e o antígeno PPD foram

significativamente diferentes (p=0,05) (figura 21B).

Figura 21: Expressão gênica para IL-6 (A) em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos. (B) expressão gênica nos indivíduos não-TB em células não estimuladas (N.E.) e estimuladas com antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão.

Expressão de IL -6 m RNA em não-T B

N.E.

PHAPPD

16kD

a

Ala-D

h

38kDa/C

FP-10

ESAT-6/C

FP-10

-30

-20

-10

0

10

@

@ = p<0,05 em re lação ao não estimulado (N.E.)

@

Nív

el d

e E

xpre

ssão

No

rmal

izad

o

E xpres são de IL6 m RNA

PHAPPD

16kD

a

Ala-D

h

38kD

a/CFP-1

0

ESAT-6/C

FP-10

PHAPPD

16kD

a

Ala-D

h

38kD

a/CFP-1

0

ESAT-6/

CFP-10

-30

-20

-10

0

10

20

30

p =0 ,0 4 8

Não-TB TB a

Nív

el d

e E

xpre

ssão

No

rmal

izad

o

A

B



81

A IL-8 tem atividade quimiotática, também muito importante na modulação da

resposta inflamatória, e por isso foi analisada. Os níveis médios de expressão de IL-8

estão mais elevados para os indivíduos não-TB, porém com nível de expressão

significativamente aumentado apenas para a combinação de antígenos 38kDa/CFP-10

(p=0,048; figura 22).

Figura 22: Expressão gênica para IL-8 em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.


PHAPPD

16kD

a

Ala-D

h

38kD

a/CFP-1

0

ESAT-6/C

FP-1

0PHA

PPD

16kD

a

Ala-D

h

38kD

a/CFP-1

0

ESAT-6/

CFP-1

0-30

-20

-10

0

10

20

p=0,048

Não-TB TBa

Nív

el d

e E

xpre

ssão

No

rmal

izad

o



82

A IL-10 é uma citocina importante na regulação da resposta imunitária, pois tem

papel antagônico ao IFN-. Embora os valores médios de expressão da IL-10 tenham

sido menores nos pacientes tuberculosos, a diferença não foi significativa entre os

antígenos, comparando com os indivíduos não-TB, bem como entre as células não

estimuladas vs. estimuladas (figura 23).


PHAPPD

16kD

a

Ala-D

h

38kD

a/CFP

-10

ESAT-

6/CFP

-10

PHAPPD

16kD

a

Ala-D

h

38kD

a/CFP

-10

ESAT-

6/CFP

-10

-30

-20

-10

0

10

20

Não-TB TBa

Nív

el d

e E

xpre

ssão

Nor

mal

izad

o

Figura 23: Expressão gênica para IL-10 de pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.



83

Assim com o a IL-10, o TGF- possui atividade anti-inflamatória, pois inibe a

proliferação de macrófagos e células T efetoras. A expressão de TGF- entre os

pacientes TBa foi menor que nos indivíduos não-TB, principalmente para os antígenos

recombinantes micobacterianos, apesar de não haver diferença significativa (Figura 24).

Expressão de TGF- mRNA

PHAPPD

16kD

a

Ala-D

h

38kD

a/CFP-1

0

ESAT-6/C

FP-10

PHAPPD

16kD

a

Ala-D

h

38kD

a/CFP-1

0

ESAT-6/C

FP-10

-20

-10

0

10

20

Não-TB TBa

Nív

el d

e E

xpre

ssão

No

rmal

izad

o

Figura 24: Expressão gênica para TGF- em pacientes com TBa (n=3) e indivíduos não-TB (n=8), após estimulação com diferentes antígenos micobacterianos. Valores de média ± erro padrão da razão do material estimulado/material não estimulado, já normalizado com a expressão dos genes constitutivos.



84

55)) DDIISSCCUUSSSSÃÃOO

Talvez o mais antigo microorganismo patogênico conhecido, co-evolui com a

humanidade desde tempos imemoriáveis. Mycobacterium tuberculosis parece estar tão

bem adaptado ao ambiente de seu hospedeiro que, mesmo com os recentes avanços das

ciências e a completa elucidação do seu genoma, permanece como um dos grandes

males da humanidade e, aumentou em número de casos associado à infecção por HIV,

principalmente nos países desenvolvidos, e ganhou status de “reemergente” (WHO,

2008). Há apenas 127 anos, o bacilo foi descrito e até hoje não foi descoberta uma

vacina e o tratamento, além de demorado e tóxico, é feito com medicamentos que já não

contemplam as recentes micobactérias multidroga resistentes.

O diagnóstico precoce diferencial, principalmente em populações de áreas

endêmicas é uma necessidade premente, assim como o entendimento sobre a relação

parasita-hospedeiro. O presente trabalho foi realizado para verificar determinados

aspectos da resposta imunitária ao MTB, no perfil celular, frente à estimulação com

cepas clínicas de MTB e antígenos recombinantes.

Através do banco de cepas do laboratório, foi selecionado um painel de cepas

clínicas de MTB com diferentes padrões de cópias do elemento de inserção IS6110,

pertencendo ou não a cluster, e de susceptibilidade às drogas tuberculostáticas. Os

resultados obtidos com a estimulação destas cepas mostraram heterogeneidade na

proliferação de células e na expressão de moléculas de superfície nas PBMC dos

voluntários TCT+ e TCT-. A estimulação com as cepas com menos de 4 cópias de

IS6110 provocou queda na média absoluta de linfócitos Taux e Tcit, tanto em relação às

PBMC não-estimuladas como em relação ao estímulo com o antígeno PPD, sendo

significativa apenas nos indivíduos TCT+. Cepas com 10 ou 11 cópias de IS6110



85

também modularam negativamente a proliferação celular, porém em menor escala.

Segundo alguns autores, determinadas cepas endêmicas prevalentes e com poucas

cópias de IS6110 possuem uma alta taxa de virulência e transmissão e estão associadas

com o tipo de resposta imunitária não-protetora, com supressão da produção de IL-1,

IFN-γ e TNF (VALWAY e cols. 1998; MANCA e cols. 1999; SHARMA e cols. 2003).

Em nosso estudo, foi também observado que cepas cluster foram menos reconhecidas

pelos voluntários TCT+, que as cepas não cluster.

É sabido que nos indivíduos primariamente infectados, a defesa imunitária bem

sucedida é caracterizada por forte resposta de hipersensibilidade tardia cutânea, mediada

por população de células T CD4+. Estes indivíduos sensibilizados produzem resposta

proliferativa de CD4+ e IFN- quando estimulados com antígenos tais como o PPD.

Estas células de memória não só controlam o foco de infecção inicial como também

seriam capazes de proteger o organismo contra reinfecção exógena. O

comprometimento desta população celular, como ocorre nos indivíduos infectados por

HIV, leva à infecção progressiva, reativação endógena ou aumenta a susceptibilidade a

reinfecção. (BOOM, 1996). Por outro lado, as células T CD8+, embora não seja clara

sua função na TB, têm sido descritas importantes na infecção por MTB, pois elas

participariam diretamente da lise de células infectadas, poderiam induzir apoptose e

secretar citocinas como IFN-γ e IL-4 (SCHLUGER & ROM, 1998). Em nosso estudo, o

voluntário J é sensibilizado (TCT+) e, embora tenha mostrado decréscimo na

quantidade de linfócitos Taux 52% maior em relação ao controle para a cepa 081 e 29%

maior para a cepa 282, foi respondedor para a produção de IFN- para todas as cepas,

exceto a cepa 238. Já o voluntário C, não reator (TCT-) apresentou redução 14% maior

que o controle nas células Tcit para a cepa 270, sem alteração das células Taux, não



86

sendo capaz de produzir IFN-, embora tenha se mostrado reativo para outras duas

cepas cluster (tabela 3).

Estes resultados mostram que existe variabilidade entre os voluntários na

quantidade de células ativadas e na produção de IFN- e esta variabilidade parece estar

relacionada à capacidade de resposta dos indivíduos, bem como a característica da cepa

infectante (tabela 3). A hipótese de estes resultados serem decorrentes de problemas

operacionais foi descartada, já que cada voluntário foi testado para todo o painel de

cepas na mesma série de experimentos. É interessante notar que indivíduos de área

endêmica TCT-, reconhecem determinadas cepas micobacterianas, principalmente cepas

prevalentes (cluster). Estes achados podem ser relevantes na busca de alvos para vacina,

pois considerando que os indivíduos apresentam resposta imunitária variada a diferentes

cepas, uma vacina eficaz deve conter moléculas indutoras de resposta imunitária

abrangente, isto é, que não estimule apenas as células CD4+, pois possivelmente outras

populações de células T devem contribuir para a proteção (KAUFMANN, 2006). De

acordo com Zhang e colaboradores (1998), a limitada quantidade de informações

disponíveis sobre as características de crescimento de MTB em células humanas, reflete

a dificuldade na análise e eliminação de fatores controversos na resposta imune ao

MTB.

Recentemente, em estudo realizado na Rússia, foi descrito que a supressão da

resposta imunitária humoral e celular está associada a maior resistência às drogas da

cepa de MTB infectante (PROBL TUBERK BOLEZN LEGK, 2008). Outro estudo

verificou redução de IFN-, para o antígeno PPD, produzido pelas PBMC de pacientes

infectados com cepas MDR-TB, em relação aos indivíduos TCT+ saudáveis, estando

associado à proliferação e contagem de linfócitos TCD4+ (LEE e cols. 2002). Em nosso

estudo, com PBMC de indivíduos saudáveis TCT+, observou-se que as cepas



87

infectantes resistentes às drogas levaram a menor produção média de IFN- quando

comparadas com as cepas sensíveis, embora sem diferença estatística. Estes resultados

sugerem que mesmo havendo resposta proliferativa às cepas estudadas, as cepas droga-

resistentes podem também estar suprimindo a resposta Th1 como observado, em maior

em estudos realizados em pacientes MDR-TB.

Para determinar possíveis modificações na média e percentual de linfócitos

periféricos em pacientes e contatos, a imunofenotipagem de diferentes populações

celulares foi realizada após estímulo com diferentes antígenos recombinantes

purificados. Estudos anteriores demonstraram variação na porcentagem e número

absoluto de linfócitos, relacionados à raça, sexo e idade (TOLLERUD e cols. 1989;

SHAHABUDDIN, 1995). No nosso estudo, estas diferenças não foram verificadas.

Corroborando resultados anteriores, foi observado tendência de queda no

número absoluto e percentagem de todos os grupos celulares nos pacientes TBa (AL-

MAJID & ABBA 2008, RODRIGUES e cols. 2002, JONES e cols. 1997). Um aspecto

interessante na tipagem celular foi a diminuição significativa no número absoluto e/ou

porcentagem dos linfócitos T citotóxicos nos TBa, quando estimulados com antígenos

brutos (PPD) e os recombinantes 16kDa e ESAT-6/CFP-10 (tabela 5). Resultado, este

similar ao obtido por Rodrigues e colaboradores (2002) em pacientes TB recém

diagnosticados e em controles operacionais de São Paulo, porém diferente dos obtidos

por Al-Majid & Abba (2008) em pacientes da Arábia Saudita, que nenhuma diferença

encontraram. Outros autores, entretanto, observaram contagens altas de CD8+ em TBa,

no Iran e Minas Gerais, que revertaram após tratamento (PESSARAN e cols 2005,

BARCELOS e cols 2006).

Por outro lado, diferentemente desses autores, para os linfócitos Tcit de

memória, verificamos redução na estimulação com o antígeno PPD (p=0,0231). Não se



88

conhece bem a função destas células na TB, porém é sabido que antígenos

micobacterianos podem ser processados através do MHC-classe 1, por uma via

alternativa que não requer penetração do antígeno no citosol, o que pode promover um

mecanismo adicional de ativação de células T CD8+ (CANADAY e cols. 1999;

ACKERMAN & CRESSWELL, 2004). Em modelo murino, é sugerido que os

linfócitos Tcit sejam necessários no controle do estágio tardio da infecção por MTB

(Van PINXTEREN e cols. 2000). Baseado nestes dados é possível que a presença destas

células na TB esteja associada com a regulação do balanço Th1/Th2, porém,

considerando que os linfócitos CD8+ são mais freqüentes no local da infecção, isto

explicaria sua reduzida expressão no sangue periférico (ROSSI e cols. 1967). O fato de

Rodrigues e colaboradores (2002) terem obtido aumento na população de células

TCD8+ de memória, pode estar relacionada ao marcador por eles utilizado (CD38). Este

marcador de superfície foi observado, até o momento, apenas em pacientes HIV+ e no

diabetes mellitus tipo 1 (EVANS e cols. 1998; PEAKMAN e cols. 1994).

Ao analisarmos o perfil de células dos indivíduos não-TB divididos pela reação

ao teste tuberculínico, os indivíduos TCT+ apresentaram declínio da média absoluta de

diversos tipos celulares com estimulação dos antígenos micobacterianos,

significantemente para as combinações 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10 (tabela 6),

exceto para as células Treg. Rodrigues e colaboradores (2002) obtiveram resultado

similar na estimulação com o antígeno PPD para as células TCD4+ e TCD8+, embora

nossos resultados não tenham sido significativos para este antígeno, sugerindo que em

nossa população, os antígenos combinados estimulam melhor as células TCD4+ e

TCD8+, ambas importantes na imunidade contra a tuberculose. Em modelos animais, é

mostrado que a deficiência de células T CD8+ pode resultar em susceptibilidade à

tuberculose (FLYNN e cols. 1992; BOOM e cols. 2003; FLYNN & CHAN, 2001). Nos



89

indivíduos TCT+ da Arábia Saudita, foram descritos valores mais elevados de linfócitos

Taux e Tcit, que em nossa população, porém as células foram analisadas ex-vivo e é

sabido que os antígenos purificados induzem proliferação mais modesta (AL-MAJID &

ABBA, 2008; BOOM, 1996).

Para as células NK, tem sido descrito que os indivíduos TCT- possuem maior

número médio celular que os TCT+ quando testados ex-vivo (BARCELOS e cols.

2008). Em nosso estudo, apenas os indivíduos TCT- estimulados com as combinações

38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10 e o antígeno 16kDa apresentaram números de células

e/ou percentual elevados significativamente. Já para as NKT, encontramos diferença

significativa apenas na estimulação com o 38kDa/CFP-10, mas Barcelos e

colaboradores (2008) mostraram-nas reduzidas em relação ao TCT+. Essa diferença

pode estar relacionada ao tamanho da amostragem, pois estes autores utilizaram 5 TCT-,

enquanto em nosso estudo foram avaliados 21 indivíduos TCT-. Por outro lado, quando

analisamos os não-TB dicotomizados quanto à exposição a tuberculose, os indivíduos

contato recente de pacientes TBa (CTr) apresentam números de NK e NKT em média

mais elevados que os controles de área endêmica (Cae), sugerindo que estas células

estivessem envolvidas no reconhecimento inicial e controle de possível infecção destes

indivíduos expostos.

As células NK são capazes de reconhecer o bacilo BCG (ESIN e cols. 2004), e

reconhecem diretamente moléculas micobacterianas solúveis, sem necessidade de

ativação prévia por linfócitos Taux (BANCROFT, 1993; BRILL e cols., 2001). As

células CD56+ podem facilitar o controle da infecção por MTB em TCT+, através da

produção precoce de IFN- que provavelmente mantém a freqüência de células

respondedoras para MTB e expande a atividade citotóxica das células NK

(APOSTOLOU e cols., 1999; ZAHRAN e cols., 2006; GODFREY e cols., 2004). As



90

células NKT são importantes contra infecções por parasitas intracelulares,

principalmente por ter ação rápida, antes da ativação da resposta imunitária adquirida,

sendo capazes de reconhecer antígenos independentemente de apresentação via MHC II

(DIELI e cols. 2003) e possuir atividade antimicobacteriana direta, através de liberação

de granulisina (GANSERT e cols. 2003). Possuem também atividade regulatória,

secretando citocinas pró ou antiinflamatórias que levam à limitação da infecção, mas

ainda não está claro como contribuem para este balanço (TANIGUSHI e cols. 2003; van

KAER, 2004).

Os linfócitos T CD4+ regulatórios já foram descritos como duas subpopulações

distintas, onde uma destas pode ser induzida na periferia, chamada de linfócitos T

regulatórios induzíveis (iTregs: CD4+CD25+), e a outra sai do timo já com a função

regulatória, chamada de linfócitos T regulatórios naturais (nTregs:

CD4+CD25+FoxP3+) (SAKAGUCHI, e cols. 2008). Entretanto, Ruprecht e cols.

(2005), descreveram que o receptor de superfície CD27 pode ser relacionado com a

atividade supressora de células Treg FoxP3+ durante o processo inflamatório, local e

sistemicamente, e também serviria de marcador para células CD4+CD25+ com

atividade regulatória. Portanto, neste estudo, CD4+CD25+CD27+ e as CD4+CD25+

foram utilizados para estudar as células nTreg e iTregs.

Ambos os linfócitos T regulatórios foram modulados nos indivíduos TCT+. Nos

diversos estímulos antigênicos, percebemos um quadro heterogêneo de resposta: os

antígenos 16kDa e AlaDH promoveram um aumento discreto na média de linfócitos

Treg para os TCT+, enquanto os antígenos 38kDa e ESAT-6 combinados com o CFP-

10, promoveram pequeno decréscimo em relação ao grupo TCT- (figura 6), embora

apenas para o antígeno PPD aumento significativo no percentual das nTreg tenha sido

observado. Estes achados podem ser indicativos de infecção recente, já que no trabalho



91

de Chen e cols. (2007) foi observada maior quantidade de linfócitos Treg nos pacientes

com TBa, estimulados com BCG e ESAT-6, em relação aos voluntários saudáveis Em

nosso estudo, entretanto, os TBa tiveram discreta diminuição das Treg, apenas para os

antígenos PPD, 16kDa e AlaDH; já as combinações apresentaram média do número

absoluto de células similar entre TBa e TCT+, sugerindo que estes antígenos modulam

diferentemente estas populações celulares.

Os achados acima podem ser explicados pelo fato da tuberculose ser uma doença

transmitida pessoa a pessoa e, portanto, a exposição dos indivíduos saudáveis, pode

acontecer por meio de um doente tuberculoso bacilífero ou por contato ambiental

esporádico. O estado do Rio de Janeiro é área endêmica de TB com incidência

aproximada de 92/100.000 pessoas (RELATÓRIO DE SÉRIES HISTÓRICAS DA

SAÚDE, 2007), o que significa que mesmo os indivíduos sem contato recente com

pacientes TBa, possuem risco de contrair a infecção. Segundo alguns autores,

freqüência de 0,2 a 2% foi estimada para o risco de infecção em área endêmica e de até

20% no contato freqüente com pacientes TBa (KRITSKI, CONDE & de SOUZA,

2000). Portanto, a observação de que os CTr apresentam tendência de aumento na

média de células iTreg, NK e NKT para todos os estímulos, sem diferença entre os

TCT+ e TCT-, e nos indivíduos Cae, aumento significativo dos linfócitos Taux e Tcit

de memória os antígeno PPD e 38kDa/CFP-10, pode estar relacionada a epidemiologia

da TB em nosso meio (tabela 7 e figura 11a e 11b).

Analisamos a influência do tratamento com tuberculostáticos em pacientes

tratados a ≥60 dias (TBt≥60d.) e pacientes não tratados ou tratados a menos de 60 dias

(TBi<60d). Os estímulos de 16kDa e AlaDH provocaram significativo aumento de

linfócitos Tcit, chegando a diminuir a razão de células CD4+/CD8+, nos pacientes

TBi<60d . Estes dados estão de acordo com os achados de Rodrigues e colaboradores



92

(2002), que observaram uma recuperação dos níveis de células CD8+ após o tratamento

para TB. Nosso estudo também encontrou números aumentados de linfócitos Taux de

memória no estímulo com 16kDa para os TBt≥60d, o que corrobora os achados de

Caccamo e colaboradores (2002)(tabela 8). Este aumento do número de linfócitos para

os pacientes TBt≥60d, pode ser atribuído à liberação das células reativas ao MTB – que

estavam seqüestradas no local de infecção, para o sangue periférico, após o tratamento

para TB (WILKINSON e cols. 1998; DIELI e cols. 1999).

Grande expectativa vem sendo gerada na comunidade científica com a

possibilidade de introdução de novas ferramentas de diagnóstico para auxiliar no

controle da TB. Testes alternativos são necessários principalmente para os casos

paucibacilares, onde a microscopia falha na identificação dos bacilos, e a cultura,

embora seja mais sensível, é morosa e laboriosa e, portanto, usualmente o paciente

inicia tratamento sem o benefício do diagnóstico. O diagnóstico da TB latente é outra

preocupação para a saúde pública, pois o teste mais utilizado é ainda o TCT. Assim,

novas estratégias são desejadas para se detectar o doente bem como prevenir a infecção

e/ou doença.

A elucidação do genoma de M. tuberculosis, M. bovis BCG e M. avium abre um

leque de possibilidades de conhecimentos e obtenção de antígenos relevantes para

avaliações de seus potenciais diagnóstico e vacinal (COLE e cols. 1998). A

identificação de antígenos micobacterianos que ativem a proliferação de células T e a

secreção de IFN-γ é critico no desenvolvimento de vacinas para TB. Vários antígenos,

principalmente os secretados, têm sido objeto de estudos mostrando serem capazes de

induzir resposta imune celular. Entre estes se destacam o ESAT-6 e CFP-10, cujo

potencial vem sendo exaustivamente descrito na literatura internacional para

diagnóstico da TB latente, na forma de ensaios para detecção de IFN- liberado pelas



93

células do sangue periférico estimuladas com estes antígenos ou suas combinações,

conhecidos com IGRA (Interferon gamma Release Assay). Porém estudos de meta

análise não corroboram a utilidade para o teste (SRENSEN e cols. 1995; AREND e

cols. 2000; MENZIES e cols. 2007, PAI e cols. 2008, 2009).

Assim, novas estratégias são desejadas para se detectar o doente precocemente,

bem como prevenir a infecção e/ou doença. No presente estudo foram testadas as

combinações ESAT-6/CFP-10; e 38kDa/CFP-10, esta última ensaiada, anteriormente,

em nosso meio mostrando resultados similares ao ESAT-6/CFP-10; e os antígenos

16kDa e AlaDH quanto a capacidade de induzir a produção de INF- e IL-10 nas PBMC

utilizadas no estudo de imunofenotipagem.

Alguns autores descrevem a produção espontânea de citocinas e esta é

considerada normal nos países em desenvolvimento, sendo observada tanto em pessoas

saudáveis, como em pacientes com TB (BHATTACHARYYA e cols. 1999; AL-

ATTIYAH e cols. 2006). Por outro lado, sabe-se que a produção espontânea de

citocinas, não está associada com qualquer diferença significativa em comparação a

produção induzida. O IFN- tem sido descrito como a segunda citocina com maior

produção espontânea, principalmente por células T e NKT (JASON e cols. 2000;

WALKER e cols. 2002). Em nosso estudo, produção espontânea de citocinas foi

observada, sendo que para o IFN- o perfil quantitativo foi decrescente, isto é, TCT+

>TCT- >TBa e para a IL-10 perfil inverso foi encontrado.

Acompanhando os resultados de quantificação das populações celulares, a

produção de IFN- após estímulos específicos mostrou-se, em geral, diminuída nos

pacientes em relação ao controle TCT+. Os antígenos 16kDa e ESAT-6/CFP-10 foram

os que induziram maior reatividade média, seguido do AlaDH, PPD e 38kDa/CFP-10;

entretanto considerando o ponto de corte do teste, a positividade para os TCT+ não



94

refletiu exatamente esta ordem pois maior positividade foi evidenciada para a

combinação 38kDa/CFP-10 (90%) seguidos do ESAT-6/CFP-10, 16kDa e PPD (81%,

respectivamente). Esta alta positividade para o 38kDa/CFP-10 não foi compartilhada

por estudo anterior em nosso meio (TAVARES e cols. 2007). Mas esta diferença pode

estar relacionada à população selecionada para o estudo, pois este autor utilizou apenas

indivíduos sem história conhecida de TB e, portanto, população menos exposta ao

bacilo, enquanto que no presente estudo foram utilizados também contatos recentes de

pacientes com TB (Ctr), sendo estes os mais respondedores entre os TCT+. A produção

elevada de IFN- nos TST+ não foi acompanhada por uma quantificação média maior

das populações celulares, tais como CD4+ e CD8+. A resposta proliferativa, em geral, é

resultado da capacidade de expansão de células T CD4+, com secreção ativa e autóctone

de IL-2, que também é secretado em menor quantidade pelas CD8+ não ativadas. Hoje

sabemos que a produção de IFN- na TB é associada a ambos os tipos de células

(LALVANI e cols. 1998, SHAMS e cols 2001, MASUNGI, 2002). Por outro lado,

outras células linfocitárias tais como NK e NKT são descritas como altas produtoras de

IFN- (BARCELOS e cols 2008, BATONI e cols 2005, GODFREY e cols 2000). E

assim, como outros autores, nosso estudo mostrou expansão para estas células

estimuladas com todos os antígenos no grupo Ctr/TCT+, sugerindo participação destas

populações na alta produção de IFN- nestes indivíduos. Entretanto, outros estudos

devem ser realizados para confirmar estes dados, quantificando o IFN- produzido

especificamente para as células CD4+/CD8+, pelas NK e suas subpopulações, ja que

alguns autores sugerem que as células NK CD56High seriam as mais produtoras de IFN-

(SCHIERLOH e cols, 2005, BARCELOS e cols. 2008).

Adicionalmente, mostramos que o antígeno 16kDa foi capaz de diferenciar os

indivíduos TCT+, dos TCT- e pacientes TBa, corroborando os dados de Demissie e



95

colaboradores (1999). Nos indivíduos TCT+ o antígeno 16kDa induziu a produção

média de IFN- em magnitude similar ao ESAT-6/CFP-10. Contrariamente, o 16kDa se

mostrou em média o menos reativo para os TCT- e TBa (Tabela 9, figura 13). Ao

analisarmos estes TCT+ quanto a exposição à TB, verificou-se um padrão de resposta

peculiar onde todos os indivíduos CTr/PPD+ respondedores para o 16kDa o foram

também para o 38kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10, exceto um indivíduo que não

respondeu a este último antígeno. Os indivíduos CTr/TCT- (2/7) e Cae/TCT+ (2/3)

apresentaram este mesmo padrão de resposta (tabela 9).

O antígeno ESAT-6 é secretado em maior quantidade após 4 a 6 meses de

tratamento, pode ocorrer em níveis aumentados no início da infecção e em níveis

reduzidos na infecção tardia por MTB (DEMISSIE e cols. 2006). Os genes que

codificam o ESAT-6 e o CFP-10 se encontram no mesmo óperon, inseridos na região de

diferença 1 (RD1) e ambas as proteínas são secretadas (PITTIUS e cols. 2001; PYM e

cols. 2003). Em testes sorológicos mostram-se pouco sensíveis, mas com alta

especificidade (BRUSASCA e cols. 2001). Estes antígenos têm sido exaustivamente

investigados para o imunodiagnóstico baseado na resposta de células T. O CFP-10,

embora menos sensível, se mostra mais especifico que o ESAT-6 (AREND e cols. 2000,

TAVARES e cols. 2007). Atualmente, ESAT-6, combinado com CFP-10 e antígeno

TB9.7, vêm sendo preconizado como marcadores de infecção latente em ensaio

comercial de liberação de IFN-γ (IGRA), mas não existe evidência de habilidade

preditiva na identificação de TB latente em áreas endêmicas com estes antígenos (PAI,

RAMSAY & O´BRIEN 2008). Nestas áreas a exposição dos indivíduos sadios da

comunidade é maior; sabe-se que dos indivíduos infectados 5% a 10% provavelmente

vão adoecer durante a sua vida, portanto a maioria não adoecerá.



96

Segundo alguns autores, há evidências que sugerem que células T de memória

podem permanecer no sistema imunitário na ausência do antígeno (KAUFFMAN,

2006). Pela teoria dinâmica, proposta por Cardona (2007), os bacilos latentes teriam

uma meia vida durante o seu ciclo de replicação limitada e morte, até a sua eliminação

do organismo humano. Assim os testes baseados no ESAT-6 poderiam estar indicando,

principalmente em áreas endêmicas, presença de memória celular e não exatamente

infecção latente.

O antígeno 38kDa, um dos mais estudados antígenos de M. tuberculosis devido

a sua alta especificidade, tem sido usado como reagente imunodiagnóstico com

potencial para distinguir entre infectados e doentes. A resposta imune celular in vitro

obtida anteriormente em trabalho do nosso grupo, confirma que em populações de área

endêmica para TB, este antígeno induz resposta nos indivíduos expostos, mas não nos

TST- (TAVARES e cols. 2007a). Wilkinson e colaboradores (1998b) demonstraram que

o antígeno 38kDa induz produção de IFN-γ por células CD8+ restritas ao MHC de

classe I e que esta produção era mais elevada nos indivíduos sadios TST+ que nos

pacientes, sugerindo que as células T induzidas por este antígeno conferem proteção em

humanos.

Já o antígeno 16kDa (originalmente descrito como proteína de 14kDa e

conhecido por HspX ou Rv2031c) (CHANG e cols. 1996) tem mostrado significante

imunogenicidade em estudos sorológicos apresentando elevada sensibilidade na

meningite tuberculose e na TB infantil, indicando ser um antígeno imunogenicamente

seletivo nos estágios iniciais da infecção tuberculosa e na tuberculose primária (UMA

DEVIA, RAMALINGAM & RAJA 2002; 2003). Wilkinson e cols. (1998a)

investigando a resposta mediada por linfócitos T e B em humanos estimulados com o

antígeno 16kDa, observaram maior taxa de respondedores para linfoproliferação e IFN-



97

em indivíduos sadios TST+. Em nosso meio, estudos anteriores mostraram resultados

similares com resposta por IFN- no grupo saudável TST+ (TAVARES e cols 2007a).

Os nossos achados, aliados as características dos antígenos descritos acima,

podem estar evidenciando que a utilização concomitante do 16kDa, 38kDa/CFP-10 ou

ESAT-6/CFP-10 pode se constituir em um indicador para a TB latente em áreas

endêmicas. Demissie e cols (2006) em estudo realizado na Etiópia sugeriram que forte

resposta ao 16kDa em indivíduos respondedores para o ESAT-6 estaria associada com

infecção latente. Nossos resultados corroboram estes achados, pois foram observados

CTr/TCT+/- respondedores para o 16kDa e ESAT-6/CFP-10, bem como 38kDa/CFP-

10, mas também evidenciamos indivíduo CTr/TCT+ respondedor ao 16kDa e 38

kDa/CFp-10, porem não respondedor ao ESAT-6/CFP-10. Outro fato evidenciado em

nosso estudo é que para estes indivíduos o antígeno AlaDH acompanhou os resultados

do 16kDa.

Nos indivíduos Cae/TCT- não deveria ser evidenciada resposta para estes

antígenos, mas considerando a endemicidade do estado do Rio de Janeiro para TB,

compreende-se que estes indivíduos possam ter maior freqüência de contatos com TB e

a resposta imunitária ser estimulada, embora não obedecendo o padrão acima. . Entre os

Cae/TCT+, 2/3 responderam para os antígenos 16 kDa, ESAT-6/CFP1- e 38 kDa/CFP-

10, porém enquanto um respondeu fortemente para estes antígenos, o outro respondeu

apenas para o 38kda/CFP-10 e o 16kDa. O terceiro indivíduo Cae/TCT-, embora

respondedor para ESAT-6/CFP-10, não reconheceu os outros dois antígenos ou o

AlaDH. Os dois indivíduos respondedores são funcionários do laboratório, porém não

exercem nenhuma atividade de contato com micobactérias ou pacientes a mais de 5

anos, mas parecem estar latentemente infectados. Porém o terceiro embora seja

funcionário do mesmo laboratório e trabalhar com cepas de micobactérias há pelo



98

menos 10 anos, foi respondedor apenas para o ESAT-6/CFP-10 o que pode representar

resposta de memória.

Assim como citocinas Th1, principalmente IFN-, estão implicadas na resposta

imunitária protetora, as citocinas Th2, como por ex. a IL-10, estão relacionadas à

reativação de TB crônica. A IL-10 é produzida por macrófagos bem como células Treg

e elas antagonizam a resposta por citocinas próinflamatórias regulando negativamente a

produção de IFN- e TNF (REDPATH e cols. 2001). A frequência de positividade para

IFN- nos pacientes TBa foi menor que a obtida anteriormente em nosso meio para

todos os antígenos testados (CARDOSO e cols 2002, TAVARES e cols 2007a, 2007b).

Entretanto, em estudo realizado no Gâmbia, resultados similares em TBa foram obtidos

para ESAT-6 (43% x 39%) (VEKEMANS e cols. 2001). Esta diferença pode estar

relacionada ao estágio da doença, pois o envolvimento avançado do parênquima

pulmonar leva a diminuição da produção de IFN-, embora a gravidade da doença esteja

mais relacionada com a citocinas Th2, como por exemplo IL-4 e IL-10. Nossos

pacientes em sua maioria estão no inicio do tratamento (<60 dias) e, portanto, na fase

ativa da doença e a alta produção média de IL-10 relacionada ao TCT+ pode indicar que

a presença desta citocina encontra-se associada com a imunopatogenia da doença

pulmonar e que forte resposta por IL-10 foi produzida, enquanto observada fraca

resposta de IFN- (VERBON e cols 1999, SEAH e cols 2000, 2001).

A combinação ESAT-6/CFP-10 estimulou produção média de IFN- mais

elevada em pacientes tratados há mais de 60 dias (92,8± 23,9) que os não tratados ou em

início de tratamento (63,8 21,9), porém sem diferença significativa, o que está de

acordo com a pequena expansão de células CD4+ e CD4CD62L+ aqui obtidas (Tabela

8). Esta diferença na reatividade média entre os pacientes, de acordo com o tempo de

tratamento,foi similar a de outros autores (ULRICHS e cols. 1998; AL-ATTIYAH e



99

cols. 2003) e a resultados obtidos anteriormente em pacientes brasileiros (TAVARES e

cols 2007a), porém estes autores encontraram diferença significativa. Isto pode ser

explicado pelo fato de apenas três pacientes tratados há mais de 6 meses terem sido

incluídos no presente estudo, tempo este a partir do qual há restauração de resposta

celular a estes antígenos (AL-ATTIYAH e cols. 2003). Portanto, estes resultados

sugerem que a resposta proliferativa é restaurada precocemente, enquanto produção de

IFN- é restaurada mais tarde ao longo da quimioterapia. Outros fatores que podem

explicar o aumento da resposta celular durante o tratamento, tais como: o seqüestro das

células T para o local da infecção e a conseqüente diminuição de seu número no sangue

periférico; a produção de citocinas antiinflamatórias como IL-10 e TGF-β e a inibição

da capacidade de ativação das células T na fase ativa da doença seriam facetas

importantes na modulação da resposta imune (WILKINSON e cols. 1998b). Isto pode

ser corroborado pelo fato de nos pacientes TBt>60d a média de reatividade de IL-10 estar

significativamente aumentada em relação aos TBi <60d, exceto para o PPD.

Para os outros antígenos, 38 kDa/CFP-10, AlaDH e PPD, ocorreu o inverso, isto

é, maior média de IFN- foi observada nos TBi <60d, resultados este similares aos obtidos

previamente no Brasil (TAVARES e cols. 2007a), e consequentemente IL-10

apresentou-se menos elevada (Figura 15). Recentemente, em trabalho realizado na Índia

avaliando a produção de IL-10 e IL-12 em pacientes tratados, estimulados com antígeno

85A recombinante do BCG, observou-se diminuição de IL-10 e aumento de IL-12,

sugerindo que o tratamento aumenta a resposta protetora (SAI PRIYE e cols. 2009).

Portanto, estas citocinas poderiam ser úteis na monitoração do tratamento, porém em

nosso estudo parece ocorrer um aumento da IL-10 em relação aos TBi <60d, mas este

diferença pode está relacionada ao pequeno número de pacientes TBt≥60d (n=3).



100

Os indivíduos TCT+ responderam para IL-10, em sua maioria, com níveis

médios abaixo do ponto de corte de 200pg/mL. Estes dados são corroborados por outros

autores que apresentam uma maior tendência de produção de IL-10 em pacientes TBa,

comparados com indivíduos TCT+ (HIRSCH e cols. 1999; AL-ATTIYAH e cols.

2006). No grupo de indivíduos não-TB/TCT-, os Cae apresentaram tendência de

aumento da liberação de IL-10 em relação aos outros indivíduos saudáveis, mas apenas

o estímulo com 16kDa aumentou significativamente esta produção, mas se contrapondo

a diminuída produção de IFN- (figura 14). A presença de IL-10 em TCT- não estaria,

em principio, refletindo regulação negativa da resposta imunitária destes indivíduos,

pois as quantidades médias e o número de respondedores estão menores que os

pacientes TBa. Estes resultados são consistentes com outros estudos em que células

estimuladas com antígenos micobacterianos são menos proliferativas nos indivíduos

sadios que nos pacientes (SALINA & MOROZOVA, 2004, DEMISSIE e cols 2004,

AL-ATTIYAH e cols. 2006).

A análise dos dados clínicos, epidemiológicos e demográficos dos sujeitos

arrolados no estudo, têm sido descrita relevante para identificar possíveis fatores de

risco de infecção por MTB ou reinfecção após tratamento (BUSKIN e cols. 1994;

SEVERO e cols. 2007; PICON e cols. 2007).

No presente estudo, os pacientes com TBa que utilizavam álcool regularmente,

apresentaram decréscimo na quantidade média de linfócitos Taux e na razão CD4/CD8

para as combinações de antígenos, além de maior reatividade média para o IFN- Já

entre os TBa/tabagistas, houve um declínio de linfócitos Taux de memória no estímulo

do 38kDa/CFP-10. Quando observamos a influência do tempo de tratamento, o grupo

TBt≥60d apresentou melhora significativa na média de linfócitos Taux e Tcit de memória,

principalmente para a estimulação com o antígeno 16kDa. Os pacientes deste grupo



101

responderam positivamente para a produção de IL-10 com todos os antígenos

micobacterianos e apenas para o antígeno PPD na produção de IFN-.

Os voluntários CTr/alcoolistas apresentaram redução significativa na média de

células NKT, mesmo nas PBMC não estimuladas, mostrando a influência negativa do

álcool na modulação do estado de saúde do indivíduo (FLEMING e cols. 2006; FISKE,

HAMILTON & STOUT, 2008). Esta redução foi mais acentuada na estimulação das

PBMC com os antígenos AlaDH, ESAT-6/CFP-10 e 16kDa para as células NKT;

AlaDH e 16kDa para células NK e células iTreg, sugerindo a capacidade do antígeno

16kDa em modificar o perfil celular, mesmo em pessoas apenas infectadas, que ainda

não apresentam quadro clínico para TB. O hábito tabagista no grupo CTr parece

interferir na redução de linfócitos Taux, que foi significativa na estimulação com os

antígenos combinados, enquanto os linfócitos Tcit foram diminuídos somente com os

antígenos AlaDH e 16Kda, refletindo também na menor razão CD4/CD8, resultados

estes similares a de outros autores (ALTET-GOMEZ, e cols. 2005).

Infelizmente, por problemas técnicos e metodológicos, a análise da expressão

dos genes para diversas citocinas importantes na infecção tuberculosa, não pode ser

realizada satisfatoriamente, sendo assim apenas 7 dos 14 genes previstos para serem

estudados puderam ser acessados e com um número amostral reduzido em cada grupo

de indivíduos.

A expressão de FoxP3 mostrou tendência de queda nos pacientes com TBa em

relação aos voluntários saudáveis, sendo significativa apenas para o antígeno 16kDa.

Quando comparamos os resultados dos indivíduos não-TB, houve aumento da expressão

de FoxP3 para os estímulos de PPD e 38kDa/CFP-10 em relação ao controle não

estimulado, sugerindo que esta resposta é específica para antígenos de MTB. Entretanto,

este dado contraria outros estudos onde foi observada maior produção de FoxP3 nos



102

pacientes TBa, porém estes trabalhos utilizaram outros tipos de antígenos, tal como o

BCG (ROBERTS e cols. 2007) ou ainda consideraram que a eficiência da metodologia

não altera os resultados obtidos, pois em nosso estudo a eficiência de amplificação dos

genes não foi assumida para o valor máximo (Eff=2,0), como no estudo WU e cols

(2007), mas ajustada para o mínimo erro médio entre as amostras e replicatas que variou

entre 1,55 e 1.95. Os dados de expressão de IFN- foram similares aos obtidos com o

teste de ELISA, pois nos pacientes TBa, principalmente para os antígenos 38/CFP-10,

ESAT-6/CFP-10 houve expressão de RNAm para IFN-. Wu e cols (2007) descreve

resultado similar, embora o autor tenha estimulado as células apenas com o ESAT-6. O

mesmo ocorreu para os indivíduos não-TB onde expressão de RNAm foi evidenciada

em diferentes magnitudes para os antígenos combinados, 16kDa e PPD, embora apenas

neste último com diferença significativa. Para esta citocina a expressão foi obtida nos

três indivíduos do grupo Cae/TCT+, o que permite uma análise mais fina. Os resultados

mostram que todos os três respondem ao 38kDa/CFP-10, ESAT-6/CFP-10 e PPD, mas

não responderam para 16kDa, portanto não corroboram os resultados obtidos com o

teste de ELISA para esta citocina. Este resultado pode conter um viés operacional ou

então os resultados de expressão gênica não refletem exatamente os obtidos com

ELISA. Como o número amostral é pequeno, outros estudos deverão ser realizados para

dirimir esta dúvida.

A expressão gênica verificada para TGF-, IL-6 e IL-8 mostrou tendência de

queda no grupo de pacientes, este resultado foi contrário ao obtido por Roberts e cols

(2007) que estimulou as células com BCG, mas isto pode ser explicado pelo pequeno

número de indivíduos testados em nosso estudo. A IL-6 e IL-8, entretanto, mostraram

expressão significativa para 38kDa/CFP-10 e apenas IL-6 para o PPD no grupo não-TB,

o que também foi observado por Wu e cols (2007) com o ESAT-6. Estes resultados



103

sugerem que diferentes antígenos podem estimular igualmente a expressão de citocinas,

porém como um número amostral pequeno, é necessário confirmar estes dados. Por

outro lado, a expressão de IL-10 em TBa, ao contrário do IFN-, não acompanhou os

resultados obtidos no teste de ELISA, mostrando maior expressão entre os não-TB,

porém sem diferença significativa. Estes resultados podem conter um viés pelo pequeno

número amostral testado. Por outro lado, esta citocina e a TGF-β, são citocinas

antiinflamatórias e a queda de sua expressão pode ter implicações na evolução da

doença. Higgins e cols (2009) mostraram ,em modelo murino, que a ausência de IL-10

não altera a capacidade de crescimento micobacteriano, apesar da forte resposta Th1

verificada nos 4 primeiros meses após a infecção. Entretanto, sem a regulação desta

resposta, o processo inflamatório é exacerbado, principalmente pela elevada produção

de TNF no local da infecção, levando à necrose pulmonar. Outra explicação é que a IL-

10 seria parte de um processo de regulação negativa (feedback), isto é, uma vez que a

célula produz a IL-10 esta exerce efeito regulador sobre a célula que a produziu levando

a diminuição da expressão gênica de diversas citocinas, inclusive a própria.



104

66)) CCOONNCCLLUUSSÕÕEESS

Antígenos brutos, caracterizados por cepas clínicas de diferentes padrões genotípicos

e fenotípicos de resistência às drogas, usadas para avaliar a resposta imune de

voluntários TCT+ e TCT- mostraram que existe variabilidade entre os indivíduos na

quantidade de células ativadas e na produção de IFN-γ, e esta variabilidade parece

estar relacionada a capacidade de resposta dos indivíduos, bem como a característica

da cepa infectante.

Indivíduos saudáveis TCT+, estimulados com cepas com perfil de resistentes às

drogas tuberculostáticas, apresentaram decréscimo na produção de IFN- quando

comparadas com as cepas sensíveis, porém sem diferença estatística. Estes resultados

sugerem que embora haja resposta proliferativa às cepas estudadas, as droga-

resistentes podem também estar suprimindo ligeiramente a resposta Th1, como

observado, em maior escala em pacientes MDR-TB.

Indivíduos TCT- de área endêmica reconhecem determinadas cepas micobacterianas,

principalmente cepas prevalentes (cluster). Estes achados podem ter relevância na

busca de alvos vacinais.

Verificou-se um decréscimo na expansão de células CD4+ e CD8+ nos pacientes

TBa para todos os antígenos em relação aos não-TB, porém com diferença

significativa para CD8+ estimuladas com o PPD, 16kDa e as combinações ESAT-

6/CFP-10, refletindo no decréscimo da média de INF- produzido e expresso, bem

como na freqüência de respondedores.

Entre os não-TB, os TCT+ mostraram redução significativa na expansão de células T

CD4+, CD8+ (efetores e de memória) e células NK e NKT para os antígenos



105

combinados 38 kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10. Isto não se refletiu no decréscimo de

IFN- secretado.

Os indivíduos não-TB contato recente com pacientes TBa (Ctr/TCT+) apresentaram

expansão de células NK e NKT, embora não significativa, para todos os antígenos

testados, quando comparados com o grupo Cae, o que possivelmente foi refletido no

aumento da produção de IFN- neste grupo.

Os estímulos de 16kDa e AlaDH provocaram significativo aumento de linfócitos

Tcit, chegando a diminuir a razão de células CD4+/CD8+, nos pacientes TBi<60d .

Níveis aumentados de linfócitos Taux de memória foram evidenciados apenas no

antígeno 16kDa para os TBt≥60d. Este aumento do número de linfócitos durante o

tratamento, pode ser atribuído á liberação das células reativas ao MTB, que estavam

seqüestradas no local de infecção, para o sangue periférico após o tratamento para

TB.

Nos pacientes TBt≥60d foi evidenciado aumento de IFN- para ESAT-6/CFP-10, mas

não para o 38kda/CFP-10, mostrando que a restauração da resposta imune está

associada ao sucesso do tratamento para aquele antígeno. Já a IL-10 foi

significativamente aumentada para todos os antígenos, exceto o PPD. Isto pode ser

reflexo da restauração do balanço Th1/Th2, que regula a resposta inflamatória e

antiinflamatória minimizando o dano tecidual.

Foi evidenciado em indivíduos Ctr ou Cae/TCT+ que a resposta de IFN- aos

antígenos 16kDa, 38 kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10 pode estar associada a infecção

latente.



106

O hábito alcoolista diminuiu significativamente a média de linfócitos Taux e a razão

CD4/CD8 nos TBa para os antígenos 38 kDa/CFP-10 e ESAT-6/CFP-10,

respectivamene, refletindo no decréscimo significativo da produção de IFN-.

A expressão gênica de IFN- refletiu os resultados obtidos no teste de ELISA para

TBa e não-TB, principalmente para 38kDa/CFP-10, ESAT-6/CFP-10, 16kDa e PPD,

porém o mesmo não ocorreu para IL-10. Entre outras, a explicação pode estar

relacionada à regulação (tipo feedback) exercida pelo IL-10 sobre a célula produtora.



107

77)) PPEERRSSPPEECCTTIIVVAASS

Os resultados deste trabalho abrem perspectivas quanto ao potencial dos

antígenos estudados como ferramentas para auxiliar no diagnóstico da TB latente.

Ajudaram a compreender que as diferenças de resposta imune a um mesmo antígeno

podem estar relacionadas às características da população testada ou às cepas infectantes.

Daí a importância da avaliar os antígenos, que se mostraram relevantes na estimulação

da resposta imunitária, em áreas endêmicas. Embora alguns dos antígenos avaliados não

tenham mostrado a mesma acurácia descrita na literatura internacional os

conhecimentos aqui adquiridos abrem novas perspectivas para formulação e concepção

para testes dignósticos futuros. Para tal, de imediato seria altamente importante realizar

um estudo comparativo dos antígenos 16kDa e ESAT-6/CFP-10 vs. 16kDa e 38

kDa/CFP-10 em indivíduos não-TB CTr e Cae para obter melhor conhecimento sobre a

potencialidades destes antígenos em proporcionar imunidade consitente com TB latente

ou infecção. Este trabalho deve ser prospetivo longitudinal, acompanhando os

indivíduos por um período entre 2 a 5 anos, pois a maioria dos trabalhos, inclusive o

nosso, estabeleceu estes parâmetros em estudo transversal e, portanto, tem o olhar do

momento temporal único. Outro aspecto decorrente deste estudo e que deve ser

abordado com metodologia específica é a relação do hábito alcoolista e tabagista como

fatores de risco ou não para o desenvolvimento da resposta imunitária na TB.

Recentemente, foi descrito associação de positividade de ELISA-IgG e IgA a antígenos

micobacterianos entre pacientes alcoolistas, por outro lado associação negativa foi

detectada entre aqueles com hábito do tabagismo. O presente estudo não foi desenhado

para investigar estes fatores, simplesmente foram analisados dados constante

oportunamente do questionário, já que estudos anteriores dão conta que o álcool pode

afetar a produção e citocinas e outros aspectos da resposta imune.



108

88)) RREEFFEERREENNCCIIAASS BBIIBBLLIIOOGGRRÁÁFFIICCAASS

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ANEXO A

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Avaliação da Resposta Imunitária Celular a Antígenos Micobacterianos Recombinantes no Sangue Periférico de Pacientes Tuberculosos e Contatos Saudáveis.

Investigador principal: Maria Helena Féres Saad, Lab. Microbiologia Celular, IOC/FIOCRUZ

Objetivos:

O objetivo deste documento é fornecer informações sobre esta pesquisa. Nele estão os objetivos,

procedimentos, benefícios e riscos que podem ocorrer durante o estudo. Você pode não compreender

determinadas palavras. Se isto ocorrer, por favor, peça esclarecimentos ao médico responsável pelo

estudo. Sua participação neste trabalho é voluntária. Isto significa que você pode se recusar a participar

dele, ou deixar de fazer parte dele a qualquer momento, sem que isto modifique o atendimento médico

que você tem nesta unidade de saúde.

Introdução/Objetivos:

Você foi chamado para participar deste estudo porque seu médico diagnosticou que você com

suspeita de ter tuberculose. (ou porque você é contato de paciente com TB). Por isso, seu médico propôs

que você fizesse exame de sangue e no escarro para exames de rotina. Estes exames têm o objetivo de

fazer alguns testes diagnósticos (exames) que permitirão descobrir qual é o seu problema e tratá-lo. (Ou

sendo você um contactante de paciente com TB você pode estar infectado mas não doente com a bactéria

que causa a tuberculose) Mas nós ainda não compreendemos totalmente esta doença. Assim nós

pretendemos fazer alguns testes adicionais no material retirado, e para isto retiraremos sangue. Estes

testes ainda são experimentais. Partes do sangue serão congeladas para futuros testes, caso você permita.

Nós também pretendemos congelar uma parte do sangue que foi retirado para exames de rotina, para

futuros testes. Nenhum procedimento será feito apenas para a pesquisa. Nós apenas vamos utilizar uma

parte do material coletado (sangue) para testes adicionais, e congelar uma parte para futuros testes que

possam surgir.

Métodos:

Se você concordar em participar do estudo, você será submetido a retirada de sangue feitos de

rotina. Nós vamos submeter este material a exames experimentais e vamos congelar uma parte do

material. Alguns exames de sangue também serão feitos, em particular, o exame do HIV, caso você

autorize. Nós também pediremos que você responda a algumas perguntas e que nos autorize a olhar

alguns dados médicos no seu prontuário. Você também será submetido a uma prova tuberculínica, que é

um teste feito com uma injeção na pele que provoca uma pequena reação local. O tamanho desta reação

será medido e pode ter implicações no seu diagnóstico. Este também é um procedimento rotineiro e não

da pesquisa.

Riscos e desconfortos:

Os exames de sangue que você vai fazer podem causar algum incômodo como dor leve pela

introdução da agulha para a coleta ou infecção no local onde a agulha entra na veia, mas isto é raro. Estas

possíveis complicações e desconfortos não decorrem da pesquisa, e sim dos procedimentos aos quais você

precisa se submeter para saber mias sobre a sua doença.

Benefícios potenciais:

Sua participação nesta pesquisa pode nos ajudar a saber mais sobre mais sobre esta doença e

como a diagnosticar melhor. Se com este estudo obtivermos informações importantes sobre a sua saúde,

notificaremos você e seu médico. De qualquer forma, participar do estudo não traz benefícios diretos para

você no momento, apenas permite saber um pouco mais sobre esta doença.

Custos e /ou pagamento por participar do estudo:

Não há custos para você participar do estudo. Você não terá que pagar pelo tratamento ou por

qualquer consulta ou exame que façam parte do estudo. Você também não receberá qualquer quantia por

participar.

Confidencialidade (privacidade dos dados):

Seus dados poderão ser revistos por mais de 15 anos pela equipe envolvida no estudo, apenas

com o objetivo de recuperar informações relativas à pesquisa. O material congelado ficará armazenado

por mais de 5 anos. Os resultados do estudo serão publicados, mas seu nome não será revelado em

nenhuma publicação. Todas as informações são confidenciais.

As informações obtidas com os testes serão direcionadas à equipe envolvida na pesquisa, que vai

mantê-las trancadas em um armário com cadeado. No Brasil, as autoridades sanitárias devem ser

informadas (notificação compulsória) de todo o caso de tuberculose. Se o seu diagnóstico for tuberculose,

seu médico deverá informar isso às autoridades de saúde (mesmo que você não participe do estudo). O

comitê de ética em pesquisa também deverá ser informado caso você tenha algum problema com o

procedimento.

Participação voluntária:

Sua participação neste estudo é voluntária. Isto significa que é escolha sua participar ou não. Se

você optar por não participar, isto não vai influenciar em nada no seu tratamento ou no seu

acompanhamento médico. Seu médico vai tratar você com o tratamento padrão e acompanhar você no

futuro. Se você optar por participar, você poderá mudar de idéia a qualquer momento e sair do estudo sem

nenhum prejuízo para seu tratamento. Nesta situação, você também será tratado da forma usual. Seu

médico também pode tirar você do estudo caso considere que isto será melhor para você. Seu médico ou

eu discutiremos isso com você.

Direitos legais:

Se ocorrer qualquer problema você terá atendimento médico de emergência – você continua

tendo todos os seus direitos como qualquer outro paciente da unidade. Você não está abrindo mão de

nenhum dos seus direitos participando da pesquisa ou assinando este documento.

Pessoas que podem ser contatadas: Se você tiver qualquer dúvida a respeito desta pesquisa

pode contatar o seu médico que lhe atendeu. Os telefones (abaixo) estarão à sua disposição para casos de

emergência. Uma cópia deste termo de consentimento ficará anexada aos seus dados e você receberá uma

cópia para guardar.

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

1. Eu compreendi que este é um trabalho de pesquisa.

2. Eu li todas as páginas deste termo de consentimento. A equipe envolvida na pesquisa me deu todas as

informações a respeito dos procedimentos do trabalho. Tive a oportunidade de fazer perguntas, e minhas

perguntas foram respondidas de forma satisfatória. Foi-me dado tempo suficiente para considerar com

atenção as informações recebidas e decidir participar ou não do estudo.

3. Fui devidamente informado que minha participação neste estudo é inteiramente voluntária e que eu

posso me recusar a participar ou decidir deixar o estudo a qualquer momento, sem qualquer tipo de

prejuízo ao meu acompanhamento médico.

4. Eu autorizo que meus dados sejam revelados à equipe envolvida na pesquisa, bem como às autoridades

sanitárias e ao comitê de ética responsável pela aprovação deste projeto, apenas para finalidades relativas

ao estudo. Esta autorização é válida por um período de 15 anos.

5. Eu autorizo que o material coletado seja armazenado por um período de mais de 5 anos para fins de

pesquisa.

7. Eu compreendi que vou receber um a cópia deste termo para guardar comigo depois de assinada.

8. Eu compreendi que não estou abrindo mão de meus direitos legais ao assinar este termo.

Minha assinatura abaixo indica que, de forma voluntária, concordo em participar deste estudo.

Participante:

____________________________ __________________________________ _____________

(Assinatura) (Nome)Médico:

____________________________ __________________________________ _____________

(Assinatura) (Nome) Tel.

Data: ____________________

ANEXO B

ANEXO C

European Respiratory SocietyAnnual Congress 2009

Abstract Number: 255541

Abstract Categories: 10.2. Tuberculosis

ERS Young Scientist Sponsorship: No, do not consider me for sponsorship.

François Brenot Award: No, do not consider me for this award.

ERS Annual Inflammatory Airway Disease Award: No, do not consider me for this award.

ERS COPD Travel Grant: No, do not consider me for this grant.

Cell & Molecular Biology Young Scientist Travel Award: No, do not consider me for this award.

Travel Grant for Sleep Medicine: No, do not consider me for this grant.

ERS Paediatric Respiratory Epidemiology Abstract Award: No, do not consider me for this award.

Lung Transplantation Best Abstract Award: No, do not consider me for this award.

Keyword 1: tuberculosis Keyword 2: diagnosis Keyword 3: antigen Keyword 4: immune response Keyword 5: interferons

Target Audience: Scientists

General Conflicts of Interests: Authors have no, real or perceived conflicts of interest that relate to this abstract.

Tobacco-Industry related conflict of interests: No

Title: 38kDa/CFP-10 associated to 16 kDa recognized by asymptomatic contacts of endemic area for tuberculosisMr. Vinicius R. Cabral, [email protected];1, Ms. Fernanda Luiza P. Guimarães, [email protected], Ms. Isabela G. Sardella, [email protected], Dr. Fernanda C. Q. Mello, [email protected], MD2, Dr. Paulo Albuquerque, [email protected], MD3, Dr. Elyne M. Engstron, [email protected], Prof. Mahavir Singh, [email protected] and Dr. Maria Helena F. Saad, [email protected]. 1Microbiology Cellular Lab/IOC, Oswaldo Cruz Foundation, Rio de |Janeiro, RJ, Brazil, 2045-360; 2Univ. Hospital, UFRJ, Rio de Janeiro, RJ, Brazil, 21941-913; 3Guadalupe Health Care, SES, Rio de Janeiro, RJ, Brazil, 20080-900; 44Germano Silval Farias School Health Care/ENSP, Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, RJ, Brazil, 20045-360 and 5Lionex Diagnostic and Therapeutic, Lionex, Braunchweig, Germany, 38124. Body: For diagnosis of latent tuberculosis (TB) it has been used tuberculin skin test (TST) for decades. It is also well known that the majority of healthy individuals exposed to M. tuberculosis do not develop active TB. Recently, IFN-g based on ESAT-6/CFP-10 and 16 kDa antigens have been reported as good marker for latent TB. Inspired by recent finds that combination of 38kDa/CFP-10 offer similar IFN-g reactivity to ESAT-6/CFP-10 for Brazilians TB patients, we then compared the production of IFN-g to 38kDa/CFP-10 and 16 kDa, among contacts recent with TB patients (Ctr/TST+, n=8; Ctr/TST-, n= 7) and healthy individuals from endemic area (Cae/TST+, n= 3; Cae/TST-, n= 14 ). Positive IFN-g production induced by 38/CFP-10 and ESAT-6/CFP-10 associated to 16 kDa were found in 6/8 Ctr/TST+, 1/8 react only with 38/CFP-10 and 16 kDa and 1/8 did not recognized 16 kDa. For Cae/TST+, 2/3 reacted with 16 kDa, but one gave strong response for both combination and the other for 38/CFP-10. Although TST-, 2/7 CTr showed the same positive IFN-g pattern for both combined antigens and 16 kDa, but for Cae this pattern of antigens recognition was not observed. These preliminary results suggest that 38 kDa/CFP-10 and 16 kDa is also a good marker for latent TB. Financial support: FAPERJ, CNPq, Brazil/Germany Cooperation Program

ANEXO D

Lymphoproliferative and Interferon-gamma response to different Mycobacterium

tuberculosis Clinical Strains (Pilot study)

Vinicius R. Cabral1; Claudia F. de Souza1; Fernanda L.P. Guimarães1, Silvia

Maria Almeida Machado 1, Maria Helena F. Saad1

1Laboratório de Microbiologia Celular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de

janeiro, Brasil

Running title: Immune response to M.tuberculosis clinical strains

Corresponding author: Maria Helena Féres Saad, Laboratório de Microbiologia Celular,

Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Av. Brasil 4365, 21045-900, Rio de Janeiro, RJ,

Brasil. Phone: +55-21-25-98-43-46. Fax: +55-21-22-70-99-97. E-mail:

[email protected]

Sending:

Accepted:

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is among the most successful human pathogens.

According to WHO (2006), based on positive hypersensitivity response to purified

protein derivative (PPD), about 2 million people are infected with Mtb worldwide.

Paradoxically, the human immune response is quite efficient in defeat the pathogen

growth but lack efficacy to eradicate it. The natural history of TB signed that only 10%

of infected individuals is at a lifetime risk to developed the disease, by the other side the

majority of infected individuals may be at a risk to reactivated the disease once the

immune system fail or to be reinfected with new strain. Some studies have been

demonstrated the correlation between Mtb virulence and lack of Th1 response in murine

models. Other studies suggest that several strains can show distinct interactions with the

host, according to potential transmission, inducing divergent immune responses. In this

pilot study, we propose the “in vitro” analysis of the cellular expansion and cytokine

production by healthy volunteers with positive or negative tuberculin skin test (TST) in

response to a panel of clinical isolates of Mtb with different genotypic and phenotypic

patterns. The clinical strains were isolated from immunocompetent patients with

pulmonary tuberculosis at the Pedro Ernesto University Hospital, Rio de Janeiro. M.

tuberculosis H37Rv, was obtained from American Type Culture Collection (Manassas,

VA) and purified protein derivative (PPD RT-23) was purchase from the Statens Serum

Institute (Copenhagen, Denmark) been used as positive controls. Strains characteristics

are described in Table 1. Susceptibility test was performed by Löwenstein-Jensen

Proportion Method (Caneti et al, 1963) and IS6110 pattern was obtained by restriction

fragment length polymorphism (RFPL) according to Van Embden et al, (1993) with

minor modification (Saad et al, 1999).

A total of 11 healthy volunteers were included, 6 individuals who tested positive for

TST (≥5mm) and 5 individuals TST negative. Peripheral blood mononuclear cells

(PBMC) were prepared layering the heparinised blood on Ficoll-Hypaque according to

Tavares et al (2007). In vitro stimulation of 106 cells/well was done incubating, with a

suspension containing 105 bacilli/well, quantified by McFarland scale, for 48 hours.

Supernatants of cell culture free of bacteria were collected to quantify IFN- by ELISA

(R&D Systems). Leucocytes were harvested and stained with the specific antibodies α-

CD3_FITC; α-CD4_PE; α-CD8_APC (BD PharMingen, San Diego, CA) for evaluation

of expression of surface receptors by flow cytometry.

The mean of CD4+ and CD8+ cell number significantly decreased in TST+ stimulated

with strains of low IS6110 copies number (<4 bands) related to H37v, PPD (p=0,044

and p=0,021) and no stimulated cell (p=0,013 and p=0,005). None TST-negative

volunteer showed cell expansion. Higher IS6110 copy number strains (10-11bands), did

induce decrease of mean CD4+ and CD8+ cell number in TST+ and negative, although

without statistic significance. Of note, PBMC of the volunteer J/TST+ had a significant

decrease of T CD4+ expression after stimulation with two resistant strains (81, 282), but

IFN- production was detected. In contrast, the volunteer C/TST-negative displayed

lower expression of CD8+ only for a susceptible strain 270. This strain was isolated

from the same patient together with strain 274 (polyclonal infection because the strains

have different genotypic patterns), which showed cells expansion similar to H37Rv, but

both strains did not elicit IFN- production (Figure 1). Both strain were recognized by

all TST+, excepted volunteer H that did not produced IFN- upon stimulation with

strain 274 (Table 1). As expected the mean level of IFN- secretion by PBMC of TST+

donors was higher (448,9±209,0 vs. 569,7±194,5) although not significant, and

correlated positively with TST reaction size. Among TST-negative volunteers, three (A,

B and C) did not respond for none of the clinical strains. The MDR strain 046 with 10

IS6110 copies and belonged to a cluster was the most recognized by the volunteers,

including by 50 % (2/4) of the TST-negative. This may suggest that some healthy

subjects, although TST-negative, were not naive to M. tuberculosis strains. TST+

volunteers’ responder was lower than TST- for clustered strains. By the other side, the

resistant strain 238 harboring only two copies of IS6110, drug-resistant and belonged to

a cluster did not elicited IFN- secretion in none of the volunteers, except one with the

highest TST reaction (20mm, Table 1). It was observed, for TST+, that resistant strains

elicited lower mean level of IFN- production (448,9±209,0) compared with drug-

susceptible (569,7±194,5) strains, although difference was not significant.

The described results and those presented in table 1 show that there is variability in

activated cell count and IFN- production that seems to be related to the host immune

response capability associated with infected strains characteristic. Operation problem

for this variability is rulled out since each volunteers was tested for all strains in a same

series of experiments. The fact that some TST- individuals from endemic area recognize

mycobacterial strains, mainly those prevalent (cluster), may have relevance in vaccine

target search. BCG is a potent inducer of CD4+ T cells, which is important for

granuloma formation and bacterial containment, but is an insufficient stimulator of

CD8+ T cells that are additionally required for long term control of the microorganism.

Considering the variability of host immune response to different strains, a more

efficacious vaccine may contain molecules that induce CD4 T cells but also other T

cells population to improve the protection (Kaufmann, 2006). Zhang et al (1998),

reported that the limited information about Mtb interaction with human cell result in

difficult to analyze and eliminate contradictory factors in Tb immune response.

According to previous reports some prevalent endemic strains and those with low copies

of IS6110 may have higher virulence index and transmission and are associated with no

protective immune response suppressing IL-1β, IFN- and TNF production (VALWAY

et al, 1998; MANCA et al, 1999; SHARMA et al, 2003). In this study was observed that

cluster strains were less recognized by TCT+ volunteers.

Supression of the humoral and cells response has been reported to be associated to high

resistance of Mtb infecting strain of Tb patients in Russia (Probl Tuberk Bolezn Legk.

2008). In other study reduction of IFN- production was described in patients infected

with MDR strains, which PBMC were stimulated with PPD, ant it was associated to

CD4+ T cell count (LEE et al, 2002). Our study showed similar result for TST+

volunteers and thus corroborates that drug-resistant strains indeed contributed to down

regulate Th1 response.

In this pilot study, we observe heterogeneity of cellular and cytokine immune response

for a panel of clinical Mtb strains. In general effective immune response is more likely

dependent on the host than infected strains, however some particular response related to

strain feature was observed. Our results suggested that, in our set some TST- individuals

is not naïve to some strains tested By the other side TST+ do not recognized all strains

tested, suggesting that immune response is more likely dependent on the host as well as

characteristics of infected strains.

Table 1. Genotypic and phenotypic characteristics of clinical strains used to stimulate peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 11 volunteers and the positivity for interferon-gamma production.

Strains H37Rv 046 081 213 238 282 065 215 270 274

RFLP-IS6110 copy number

10 10 11 2 8 10 4 9 9

Cluster/Clone Name N Y Y Y Y Y N N N N

Drug Susceptibility S R (MDR)

R (INH/ETH

/PZA)

R (PZA)

R (INH)

R (MDR)

S S S S

Volunteers/TST(mm)1 ELISA Interferon-gamma results

A & B 0 - - - - - - - - - -

C 0 + + - - - - + - - -

D 0 - + + + - - - + - -

E 0 + - - - - - - - - -

F 5 + + - - - - - - - -

G 10 - + + + - + - + + +

H 13 + + - - - - + + + -

I 13 + + - - - + - + + +

J 15 + + + + - + + + + +

K 20 + + + + + + - + + +

Tuberculin Skin Test negative (TST-) or positive (TST+). IS6110: repetitive element insertion sequence 6110, which patterns were obtained by restriction fragment length polymorphism, N= no, Y= yes, S= sensitive, R= resistant, MDR= multidrug resistance (isoniazide - INH/rifampicin - RFM), ETH=ethionamide, PZA= pirazinamide. mm: milimeter

Figure 1: Representative histogram of CD4 and CD8 expression in PBMC from two volunteers obtained by double stain with a pair of monoclonal antibodies specific for T helper cells (CD3CD4+) and T citotoxic cells (CD3CD8+) A) volunteer C with Tuberculin Skin Test (TST) negative, showing that clinical strain 270 decreased expression of CD8+ cells, B) volunteer Jwith TST+, showing that the clinical strain 81 and 282 decreased expression of CD4+ cells. The number of cells is showed above.

A)

B)

Number of cells x 105/mLImmunophenotypeControl 270 strain

CD3+ 15,3 7,4

CD3CD4+ 4,4 2,3

CD3CD8+ 2,1 0,7

Number of Cells x 105/mLImmunophenotype

Control 81 Strain 282 Strain

CD3+ 21,3 14,9 10,7

CD3CD4+ 9,8 3,3 2,1

CD3CD8+ 4,9 3,3 2,4

R2

100 101 102 103 104

FL 2 Log

0

73

147

221

295

Cou

nts

Control: 43,35%

81 strain: 20,13%

CD4 PE Log Comp

R3

100 101 102 103 104

FL 4 Log

0

72

145

218

291

Cou

nts

Control: 22,56%

81 strain: 22,13%

CD8 APC Log Comp

R2

100 101 102 103 104

FL 2 Log

0

73

147

221

295

Cou

nts

Control: 43,35%

282 strain: 16,31%

CD4 PE Log Comp

R3

100 101 102 103 104

FL 4 Log

0

72

145

218

291

Cou

nts

CD8 APC Log Comp

Control: 22,56%

282 strain: 21,89%

REFERENCES

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