Avtoreferat proekt Pavlov 2 end - microbio.bas.bg web page/pzrasrb/Doctor...Title: Microsoft Word -...

1

БЪЛГАРСКА АКАДЕМИЯ НА НАУКИТЕ

ИНСТИТУТ ПО МИКРОБИОЛОГИЯ „СТЕФАН АНГЕЛОВ”

Иван Георгиев Иванов

БИОСИНТЕЗ НА ГАЛАНТАМИН ОТ РАСТИТЕЛНИ

IN VITRO СИСТЕМИ НА LEUCOJUM AESTIVUM L.

АВТОРЕФЕРАТ

на дисертационен труд за присъждане на

образователна и научна степен „доктор”

Научна специалност: „Технология на биологично активните

вещества” – 02.11.11.

Научен ръководител: Проф. д.т.н. Атанас Иванов Павлов

София, 2011 г.

2

Дисертационният труд съдържа 256 страници, включително 61 фигури и 48

таблици. Библиографията обхваща 306 заглавия, от които 4 на кирилица и 302 на

латиница.

Дисертационният труд е обсъден и насочен за защита от заседание на Националния семинар по промишлена микробиология и микробни биотехнологии при

Института по микробиология „Стефан Ангелов” – БАН (Протокол от 14.07.2011 г.).

Дисертантът работи в Института по микробиология „Стефан Ангелов”, отдел

„Промишлена микробиология”, Лаборатория по промишлени биотехнологии гр.

Пловдив.

Изследванията по дисертационния труд са проведени в Института по микробиология “Стефан Ангелов”, Лаборатория по промишлени биотехнологии гр.

Пловдив и АгроБио Институт – гр. София

Защитата на дисертационния труд ще се състои на 14.10.2011г. от 11.00 часа в,

на заседание на. Материалите по защитата са на разположение на интересуващите се в

библиотеката на

3

БЪЛГАРСКА АКАДЕМИЯ НА НАУКИТЕ

ИНСТИТУТ ПО МИКРОБИОЛОГИЯ „СТЕФАН АНГЕЛОВ”

Иван Георгиев Иванов

БИОСИНТЕЗ НА ГАЛАНТАМИН ОТ РАСТИТЕЛНИ

IN VITRO СИСТЕМИ НА LEUCOJUM AESTIVUM L.

АВТОРЕФЕРАТ

на дисертационен труд за присъждане на

образователна и научна степен „доктор”

Научна специалност: „Технология на биологично активните

вещества” – 02.11.11.

Научен ръководител:

Проф. д.т.н. Атанас Павлов

Официални рецензенти:

Доц. д-р. Дора Бешкова

Доц. д-р. Виолета Кондакова

София, 2011 г.

4

ИЗПОЛЗВАНИ СЪКРАЩЕНИЯ ±SD стандартно отклонение 2,4-D 2,4-дихлорфеноксиоцетна киселина BAP 6-бензиламинопурин

CV% коефициент на вариабилност EDTA етилендиаминтетраоцетната киселина EtOH етанол

GAE еквиваленти галова киселина GC-MS газхроматограф-масспектроскопия HPLC високо ефективна течна хроматография

IC50 концентрация на алкалоиди, инхибираща 50% от активността на ацетилхолинестеразата

M+ характеристичен масов йон

MeOH метанол

MS Murashige and Skoog хранителна среда NAA α-нафтилоцетна киселина ROS активни кислородни радикали

Rt време на задържане TLC тънкослойна хроматография

АСБ акумулирана суха биомаса БМ биомаса КТ културална течност СБ суха биомаса ТДК тирозин декарбоксилаза ФАЛ фенилаланин амоняк лиаза

УВОД

През последните десетилетия за симптоматично лечение на болестта на Алцхаймер се прилага алкалоидът галантамин, изолиран и пречистван от растения – представители на

семейство Amaryllidaceae (кокичеви). Голяма част от растенията с високо съдържание на

галантамин, от които този алкалоид се добива за целите на фармацевтичната индустрия, са

ендемични и/или с ограничено разпространение. В България основен източник на галантамин е Leucojum aestivum L. (блатно кокиче), като през 1989 г. е обявен за защитен вид и не се

използва за промишлени цели.

Алтернатива на класическия начин за получаване на галантамин са растителните биотехнологии. По същество биосинтезът на биологично активни вторични метаболити в

растителната тъкан е свързан с диференциацията й. От тази гледна точка културите от

прорастъци (shoot) са перспективна технологична матрица. На тази база е възможно да се развие биотехнологичен процес, базиран на shoot органови култури на Leucojum aestivum L.,

култивирани в различни биореакторни системи, които осигуряват пълен контрол и управление на биосинтетичния процес, а това, от своя страна, води до получаване на високи добиви от

целевите метаболити за кратък период, независимо от сезоните и географските ширини.

ЦЕЛ И ЗАДАЧИ НА ДИСЕРТАЦИЯТА Основната цел на настоящата дисертационна работа е анализ на потенциала на shoot тип

in vitro системите на Leucojum aestivum L. като продуценти на галантамин на базата на

задълбочени физиологични, фитохимични и биоинженерни проучвания и въз основа на анализа

на получените резултати да се предложи интегриран подход за получаване на този алкалоид.

Oт поставената цел са дефинирани и основните задачи на разработваната дисертационна

работа, както следва: 1. Разработване на HPLC метод за анализ на галантамин, норгалантамин и ликорин в

алкалоидни екстракти на shoot култури от L. aestivum.

5

2. Анализ на процеса на биосинтез на галантамин от shoot линия L. aestivum G 80 в

култивационна система с временно разбъркване тип RITA®.

3. Анализ на процеса на биосинтез на галантамин от shoot линия L. aestivum G 80 в

модифициран колонен биореактор с вътрешни секции.

4. Изследване на физиологичния отговор на shoot линия L. aestivum G 80 при елиситиране с метил жасмонат и жасмонова киселина.

5. Индуциране и селекция на високопродуктивни shoot линии L. aestivum.

6. Разработване на двуфазен метод за биосинтез на галантамин.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

1. In vitro растителни системи. Shoot тип in vitro култура L. aestivum G 80; калусна

линия L. aestivum LaR 67.

2. Индуциране на shoot тип in vitro системи от L.aestivum. Инициирането се осъществява чрез култивиране на калусна линия LaR 67 на MS хранителна среда, допълнена с 30 g/L захароза, 5.5 g/L агар, 1.15 mg/L NAA и 2.0 mg/L BAP.

3. Условия на култивиране. Дълбочинното култивиране се провежда в Ерленмайерови

колби с обем 500 ml и работен обем от 200 ml, на клатачка (11 rad/s), при 26°С и фотопериод 16

h светло и 8 h тъмно.

Култивиране в култивационна система с временно рабъркване тип RITA®.

Култивирането се извършва в RITA®

апарати с оптимизирана MS хранителна среда (200 ml

работен обем), режим на култивиране с 15 min период на разбъркване и 4, 6, 8, 10 и 12 h период

на покой при различните експерименти и температура на култивиране съответно 18, 22, 26 и

30°С. Дебитът на входящия въздух за всяка RITA е 60 L/(L.h), фотопериод 16 h светло и 8 h

тъмно. Продължителност на култивационния процес – 35 дни.

Култивиране в модифициран колонен биореактор с вътрешни секции. Култивирането се извършва в 1 L оптимизирана MS хранителна среда, при фотопериод 16 h светло и 8 h тъмно, с дебит на входящия въздух 9, 18 и 27 L/(L.h) и 18, 22 и 26°С температура на култивиране при

различните експерименти.Продължителността на култивиране е 35 дни.

Двуфазно култивиране в модифициран колонен биореактор с вътрешни секции. Към

биореактора е свързана колона с 10 g Amberlite XAD-4. Биореакторът е с работен обем 1 L

оптимизирана MS хранителна среда. Култивирането се осъществява при 22°С; фотопериод 16 h

светло и 8 h тъмно; дебитът на входящия въздух е 18 L/(L.h). Продължителността на

култивиране е 35 дни. Втората фаза се включва на 14-ия, 21-ия и 28-ия ден при различните експерименти.

4. Елуиране на алкалоидите от адсорбционната смола. Елуирането се осъщесвява с подкислен метанол (1% 0.5M HCl).

5. Елиситиране. Елеситирането е проведено с използване на жасмонова киселина и

метил жасмонат. 6. Методи за изолиране и анализ Количествено определяне на алкалоиди. Алкалоидите се определят количествено чрез

разработен нов HPLC метод за анализ, описан в „Резултати и дискусия”.

Количествено определяне на фенолни киселини. Фенолните киселини се определят чрез HPLC анализ – колона Discovery HS C18, 5µm (25 cm x 4.6 mm). Елуирането се осъществява

градиентно с разтворител А (2% оцетна киселина) и разтворител В [ацетонитрил/0.5% оцетна

киселина (1:1)] и детекцията при λ=280 и 320 nm.

Анализ на алкалоидните профили. Газхроматограф Agilent Technology Hewlett Packard

7890 A+/MSD 5975 (Hewlett Packard, Palo Alto, CA, USA). Масдетектор Agilent Technology 5975

inert XL EI/CI MSD при 70 eV. Колона HP-5 MS (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm). Температурна

програма: от 100 до 180°С с градиент 15°С/min и от 180 до 300°С с 5°С/мин. и задържане за 10

мин. Температура на инжектора – 250°С. Носещият газ (хелий) е със скорост 1.0 ml/min. Степен

на разреждане – 1:20. Обем на инжектираната проба – 1µl. Компонентите в алкалоидните смеси

се идентифицират чрез сравнение на техните масспектрални фрагменти със стандартни

масспектрални фрагменти в базата данни на NIST 08 (NIST Mass Spectral Database, PC-Version

6

5.0, 2008) – National Institute of Standartization and Technology (Gaithersburg, MD, USA) – и чрез литературни данни (Berkov et al., 2008; Torras-Clivera et al., 2010).

Количествен анализ на хлорофил А и хлорофил Б. Съдържанието на хлорофили в

ацетоновите екстракти се определят спектрофотометрично по метод, описан от Bajracharya

(2003).

Анализ на фенилаланин амоняк лиаза E.C. 4.3.1.5. Анализът е проведен по модифициран

от нас метод на Hino et al., (1982).

Анализ на тирозин декарбоксилаза E.C. 4.1.1.25. Анализът е проведен по модифициран

от нас метод на Ivano and Brodelius (1988).

Определяне на ацетилхолинестераза инхибираща активност. Анализът е проведен по

модифициран от нас метод на Lopez et al., (2002).

Анализ на общи феноли. Анализът е проведен по метода на Folin–Ciocalteu. Анализ на общи протеини. Анализът е проведен с тест кит RANDOX

®.

Количествен анализ на захароза, глюкоза и фруктоза. Анализът е проведен с ензимни

тест-комбинации на Megazyme®.

Количествен анализ на нитратните, амониевите и фосфатните йони. Анализът е проведен с химични тест-комбинации Spectroquant

®.

Определяне на развитието на in vitro културите. Развитието на shoot културите се определя чрез акумулираната суха биомаса и растежния индекс по уравненията.

7. Използван софтуер и статистическа обработка на данните. Всички представени

данни са обобщени стойности от два независими експеримента, извършени в трикратна повторяемост. Статистическият анализ и графичното оформление на получените резултати са

извършени със Scientific Graph System SigmaPlot

v.7.0 (Systat Software, Inc., USA), MINITAB 14

(Minitab Inc.), Microsoft

Excel 2000 (Microsoft, Redmond, USA), Microsoft Word 2000

(Microsoft, Redmond, USA), ACD ChemSketch (Advanced Chemistry Development, Inc., Canada),

NIST 08 (National Institute of Standards and Technology, USA), AMDIS v.2.68 (Automated Mass

Spectral Deconvolution and Identification System, USA) и Brееzе ТМ

3.30 (Waters, Ireland).

РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ 1. HPLC метод за количествено определяне на галантамин, норгалантамин и

ликорин, биосинтезирани от Amaryllidaceae растителни in vitro системи

Описаните HPLC методи в научната литература не разглеждат въпроса за съвместен

анализа на алкалоидни екстракти, съдържащи галантамин, ликорин и норгалантамин –

основните алкалоиди, биосинтезирани от L. aestivum G 80 shoot културата, което е предмет на

изследванията в настоящата дисертация. Към настоящия момент за количествен анализ на

галантамин е използван TLC денситометричен метод, базиран на QuentiScan софтуера. Този

метод не предлага възможност за ефективно разделяне и количествено определяне на

норгалантамина и ликорина. Всички изброени дотук обстоятелства насочиха нашето внимание към разработването на подходящ за нашата биологична матрица HPLC метод.

За целта хроматографската система на Sellés et al. (1999) беше променена чрез моделиране на подвижната фаза (градиент и рН на неорганичния компонент) и скоростта на

потока. За хроматографското разделяне е използвана колона Symmetry® C18 (150 mm x 4.6 mm,

5µm) (Waters Milford, USA). Най-добро разделяне на алкалоидите се постига, когато рН на 1%

амониев ацетат (Разтвор Б) е 6.6. Наред с рН на неорганичния компонент е оптимизирано и

съотношението между неорганичния и органичния компонент на подвижната фаза в началото

на метода, както и градиентът на промените в това съотношение. Частта на органичната фаза

(ацетонитрил) се намалява от 31% (разтвор А) на 10% и по време на разделянето се увеличава

до 90% за 18 минути вместо до 70% за 10 мин. при оригиналния метод (Табл. 1). Друга

съществена промяна е намалената скорост на изтичане в началните етапи на процеса на

разделяне. След оптимизиране на метода се получава перфектно разделяне на стандартите на

целевите алкалоиди (Фиг. 1 Б). Освен за моделни системи методът следва да е подходящ и за

анализа на комплексните растителни екстракти. Получените резултати по анализа на

7

алкалоидните фракции на L. aestivum shoot културата категорично показаха, че методът е приложим за количественото определяне на галантамина, норгалантамина и ликорина (Фиг. 2).

Табл. 1. Градиентни профили на оптимизираната HPLC система и системата на Sellés et al. (1999).

Градиентен профил на системата на Sellés et al. (1999)

Градиентен профил на подобрения метод

Време, min

Скорост на

изтичане, ml/min

%A %Б Време, min

Скорост на

изтичане, ml/min

%A %Б

1. 0.5 31 69 0.4 10 90

2. 6 0.5 31 69 11 0.3 31 69

3. 9 0.5 70 30 15 0.5 70 30

4. 10 0.5 70 30 16 0.5 90 10

5. 12 0.5 31 69 18 0.5 90 10

6. 20 0.5 31 69 20 0.4 31 69

7. - - - - 22 0.4 10 90

8. - - - - 31 0.4 10 90

Фиг. 1. HPLC хроматограма на стандарти. (А) Градиентна систена, описана от Sellés et al. (1999).

(Б) Оптимизирана градиентна система: 1) норгалантамин, 2) ликорин и 3) галантамин.

Фиг. 2. HPLC хроматограма на алкалоидни екстракти на shoot култура на L. aestivum: 1)

норгалантамин, 2) ликорин и 3) галантамин.

За количествено определяне на алкалоидите е използван методът на вътрешния

стандарт. Изготвени са стандартните права за всеки от изследваните алкалоиди. Изведени са

корелационните уравнения, описващи площта на пика и концентрацията на анализирания

8

алкалоид. Стандартните прави са с линейни участъци между 1–150 µg/ml за трите алкалоида с високи коефициенти на корелация r

2 > 0.999.

Резултатите от теста за възпроизводимост на резултатите, показващи надеждността на

използвания HPLC метод за количествено определяне на концентрациите на изследваните компоненти, са представени на Табл. 2.

Табл. 2. Възпроизводимост на HPLC метода за определяне на норгалантамин, ликорин и

галантамин в shoot култура на L. aestivum.

L.aestivum in vitro shoot култура

Норгалантамин, µg/ml Ликорин, µg/ml Галантамин, µg/ml

1 51.78 9.10 48.19

2 54.65 8.32 49.82

3 53.73 9.27 50.94

4 52.52 8.49 52.33

5 58.26 8,99 49.75

Mean ± SD 54.19 ± 2.53 8.83 ± 0.40 50.20 ± 1.53

Относителна грешка, %

3.40 4.20 2.20

CV% 4.67 4.61 3.06

Mean – Средна стойност

Анализът ясно показва надеждността на разработения HPLC метод за количествено

определяне на галантамина, ликорина и норгалантамина. Точността на предлагания метод се характеризира с ниска относителна грешка (между 2% и 4%) и коефициент на вариабилност

(между 3% и 4%).

Създаденият метод за качествен и количествен контрол на алкалоидите галантамин,

ликорин и норгалантамин в алкалоидни екстракти на shoot култури на L. аestivum е добра

методична база за следващите изследвания от настоящата дисертация.

2. Биосинтез на галантамин от L. aestivum L. G 80 shoot тип култура в различни

биореакторни системи

Независимо от непрекъснато нарастващия интерес към растителните in vitro технологии

за получаване на биологично активни вещества (в това число и на галантамин), понастоящем не е реализирана едромащабна технология, основана на растителни органови култури. Една от

основните причини за ограниченото промишлено приложение на растителните shoot култури са трудностите, свързани с култивирането им в големи обеми.

2.1. Биосинтез на галантамин от L. aestivum L. G 80 shoot тип култура в система с временно разбъркване тип RITA

®

Изследван е процесът на биосинтез на галантамин от shoot култура на L. aestivum G 80

при режими на култивиране с период на разбъркване 15 min и 4, 6, 8, 10 и 12 h периоди на

покой. Shoot културата показва балансиран растеж при всички изследвани режими. По време на

култивационния процес отделните прорастъци увеличават значително дължината си. В същото

време голям брой от меристемните тъкани образуват нови прорастъци. Най-голямо количество

суха биомаса (2.40 g/RITA) L. aestivum G 80 акумулира по време на култивирането си в система

тип RITA при режим с 15 min период на разбъркване и 8 h период на покой (Табл. 3). При този

режим се постига и най-високият растежен индекс – 2.98.

Влияние върху развитието на културата оказва и температурата на култивиране, поради

което е анализиран процесът на култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 в система с временно разбъркване, при 18°С, 22°С, 26°С и 30°С и режим на култивиране с 15 min период на

разбъркване и 8 h период на покой, доколкото при този режим на разбъркване се получават

максималните стойности по отношение на акумулираната суха биомаса и растежния индекс. Получените резултати показват, че най-подходящата температура на култивиране е 26°С, при

9

която L. aestivum G 80 натрупва 2.40 g/RITA биомаса (Табл. 3). Растежният индекс (2.98) е по-

висок от този, постигнат при L. aestivum shoot линия G 80, култивирана в колби (2.50).

Табл. 3. Максимални стойности на акумулираната биомаса и растежни индекси, получени при култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 в система с временно разбъркване тип RITA.

Условия на култивиране Режим на култивиране, разбъркване/покой min/h

Температура, °C

Акумулирана суха биомаса, g/RITA

Растежен индекс

15 / 8 18 1.17 ±0.38 1.12 ±0.40

15 / 8 22 1.49 ±0.25 1.32 ±0.32

15 / 4 26 2.28 ±0.49 2.06 ±0.15

15 / 6 26 1.55 ±0.43 1.39 ±0.36

15 / 8 26 2.40 ±0.54 2.98 ±0.64

15 / 10 26 2.17 ±0.05 2.10 ±0.18

15 / 12 26 1.46 ±0.37 1.83 ±0.35

15 / 8 30 2.13 ±0.04 1.34 ±0.31

Във връзка с миксотрофния тип на хранене е изследвано влиянието на условията на

култивиране върху фотосинтетичния потенциал на L. aestivum shoot линия G 80 при

култивирането й в система с временно разбъркване чрез количествено определяне на

фотосинтетичните пигменти хлорофил А и хлорофил Б (Табл. 4). Количеството биосинтезиран

хлорофил зависи правопропорционално от продължителността на периодите на покой и не зависи от температурата на култивиране. Максимално количество хлорофил (0.85 mg/RITA – 0.46 mg/RITA хлорофил А и 0.39 mg/RITA хлорофил Б) се биосинтезира при режим с 15 min

период на разбъркване, 8 h период на покой и 26°С – оптималните условия за синтез на

биомаса. Следователно оптималните условия за синтеза на биомаса осигуряват и максимална

експресия на фотосинтетичния потенциал на L. aestivum G 80 – факт с важно значение, защото е известно, че биосинтезът на галантамин зависи от режима на осветеност при култивирането на

shoot култури от L. aestivum (Berkov et al., 2009).

Табл. 4. Максимални количества хлорофил, получени при култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 в система с временно разбъркване тип RITA.

Условия на култивиране Режим на култивиране, разбъркване/покой min/h


Хлорофил A mg/RITA

Хлорофил Б mg/RITA

15 / 8 18 0.41 ±0.02 0.30 ±0.01

15 / 8 22 0.50 ±0.01 0.33 ±0.01

15 / 4 26 0.15 ±0.01 0.15 ±0.02

15 / 6 26 0.28 ±0.02 0.24 ±0.01

15 / 8 26 0.46 ±0.01 0.39 ±0.03

15 / 10 26 0.42 ±0.02 0.36 ±0.02

15 / 12 26 0.26 ±0.04 0.23 ±0.03

15 / 8 30 0.45 ±0.02 0.34 ±0.01

Период на разбъркване, min/ h

Захароза, Глюкоза

, Фруктоза

, g

/L

0

10

20

30

40

50

60Захароза

Глюкоза

Фруктоза

15/4 15/6 15/8 15/10 15/12

1.256.5* ±2.64.45* ±

2.871.8* ±

2.831.9* ±0.37.27* ±

A

Температура, oС

Захароз,

Глюкоза

, Фруктоза

, g

/L

0

10

20

30

40

50

60Захароза

Глюкоза

Фруктоза

18 22 26 30

0.23.39* ±

8.28.48* ±

8.28.71* ±

6.42.49* ±

Б

Фиг. 3 Количества захароза, глюкоза и фруктоза в края на култивационния процес и степен на

усвояване на захарите в % (*) от L. aestivum shoot линия G 80, култивирана в система с временно

разбъркване с различни периоди на разбъркване (А) и при различни температури (Б).

Забележка: Началната концентрация на захарозата е 60 g/L.

10

Най-високата степен на усвояване на захарозата се постига, когато L. aestivum shoot

линия G 80 се развива при 26°С и режим на култивиране с 15 min период на разбъркване и 8 h

период на покой (Фиг. 3).

Периодът на разбъркване и температурата на култивиране не влияят върху усвояването

на нитратните и амониевите йони от L. aestivum shoot линия G 80 (Фиг. 4). Данните, получени

относно усвояването на основните компоненти на хранителната среда, използвана за

култивиране на L. aestivum shoot линия G 80, показват, че култивационната система с временно

разбъркване тип RITA осигурява основните хранителни нужди на изследваната култура.

Период на разбъркване, min/h

Степен на

усвояване, %

0

20

40

60

80

100

PО4

+

NH4

+

NO3

-

15/4 15/6 15/8 15/10 15/12

A

Температура, oC

Степен на усвояване, %

0

20

40

60

80

100

PО4

+

NH4

+

NO3

-

18 22 26 30

Б

Фиг. 4. Степен на усвояване на фосфатни, амониеви и нитратни йони от L. aestivum shoot линия G

80, култивирана в система с временно разбъркване с различни периоди на разбъркване (А) и при

различни температури (Б).

Полученитe резултати относно биосинтеза на галантамин от L. aestivum shoot линия G

80 по време на култивирането й в система с временно разбъркване ясно показват, че режимът

на разбъркване и температурата на култивиране силно влияят на биосинтетичния процес. Те обаче не повлияват съотношението между биосинтезираните вътреклетъчни алкалоиди и

секретираните в културалната течност външноклетъчни алкалоиди (Фиг. 5 и Фиг. 6). Най-

високи количества галантамин (265.0 µg/RITA – 190.7 µg/RITA вътреклетъчен и 74.3 µg/RITA

външноклетъчен) L. aestivum shoot линия G 80 биосинтезира при режим на култивиране с 15

min период на разбъркване и 8 h период на покой (Фиг. 5 А). Следва да се отбележи, че секретираният в културалната течност галантамин е около 1/3 от общото количество

биосинтезиран галантамин при всички режими на култивиране.

Период на разбъркване, min/h

Галантамин

, µ

g/R

ITA

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500Вътреклетъчен

Външноклетъчен

Общо количество

15/4 15/6 15/8 15/10 15/12

A

Ликорин,

µg/R

ITA

0

500

1000

1500

2000




15/4 15/6 15/8 15/10 15/12Период на разбъркване, min/h

Б

Норгалантамин

, µ

g/R

ITA

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450




15/4 15/6 15/8 15/10 15/12Период на разбъркване, min/h

В

Фиг. 5. Влияние на честотата на разбъркване върху биосинтеза на галантамин (А), ликорин (Б) и

норгалантамин (В) от L.aestivum shoot линия G 80 при култивиране в система с временно

разбъркване. Забележка: Температурата на култивиране е 26°С.

Количеството биосинтезиран галантамин от L. aestivum shoot линия G 80 е най-високо

(265.0 µg/RITA – 190.7 µg/RITA вътреклетъчен и 74.3 µg/RITA външноклетъчен) при

температура на култивиране 26°С (Фиг. 30 А). Тази стойност се различава значително от дневните температури по време на цъфтеж (22°С, http://iasas.government.bg), като през този

период се отчита максимален биосинтез на галантамин в интактни растения.

11


Галантамин,

µg

/RIT

A

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450




18 22 26 30

А

Температура,

oC

Ликорин,

µg

/RIT

A

0

500

1000

1500




18 22 26 30

Б


Норгалантамин,

µg

/RIT

A

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450




18 22 26 30

В

Фиг. 6. Влияние на температурата на култивиране върху биосинтеза на галантамин (А), ликорин

(Б) и норгалантамин (В) от L. aestivum shoot линия G 80 при култивирането й в система с временно

разбъркване. Забележка: Режимът на култивиране е с 15 min период на разбъркване и 8 h период на покой.

Освен галантамин L. aestivum shoot линия G 80 биосинтезира значителни количества

ликорин (Фиг. 5 Б и Фиг. 6 Б). Периодът на разбъркване влияе силно върху биосинтеза на

ликорин от L. aestivum shoot линия G 80, като 15 min период на разбъркване и 10 h период на

покой (при 26°С) е най-подходящият режим за биосинтеза му [1699 µg/RITA (992.2 µg/RITA

вътреклетъчен и 706.8 µg/RITA външноклетъчен)] (Фиг. 5 Б). Оптималната температура за

биосинтез и на ликорина, и на галантамина съвпада – 26°С (Фиг. 6). Освен галантамин и

ликорин L. aestivum shoot линия G 80 продуцира и биосинтетичния предшественик на

галантамина – норгалантамина. Очаквано максимално ниво на норгалантамин (225 µg/RITA) се постига при условията за максимален биосинтез на галантамин от L. aestivum shoot линия G 80

(15 min период на разбъркване и 8 h период на покой) (Фиг. 5 В). Оптималната температура за

биосинтез на норгалантамин е 22°С, различна от тази за биосинтез на галантамин – 26°С (Фиг. 6 В). Тази разлика се дължи вероятно на ензима, катализиращ последната стъпка в

биосинтетичния път на галантамина (метилиране на норгалантамина до галантамин),

притежаващ температурен оптимум, различен от 22°С. При 22°С L. aestivum shoot линия G 80

продуцира 388 µg/RITA (293.0 µg/RITA вътреклетъчен и 95.0 µg/RITA външноклетъчен)

норгалантамин.

Резултатите, получени при анализа на влиянието на периода на разбъркване и

температурата на култивиране върху биосинтеза на галантамин и съпътстващите алкалоиди от

L. aestivum shoot линия G 80, показват значимостта на изследваните независими променливи.

На база на резултатите от този анализ (Табл. 5) са изведени регресионните уравнения,

описващи влиянието на периода на покой (Х1) и температурата (Х2) върху добива от биомаса –

Y1, галантамин – Y2, норгалантамин – Y3, и ликорин – Y4:

Y1 = 0.491x1 + 0.688x2 – 0.034x12 – 0.012x2

2 – 9.211 (R1 = 62.12)

Y2 = 41.060x1 + 76.093x2 – 2.651x12 – 1.436x2

2 - 932.400 (R2 = 71.18)

Y3 = 69.179x1 + 12.224x2 – 0.880x12 – 0.042x2

2 - 1979.790 (R3

= 62.91)

Y4 = 440.649x1 + 719.786x2 – 22.582x12 – 14.060x2

2 - 9975.260 (R4 = 69.26)

Получените стойности на коефициентите на корелация (R) са достатъчно високи за

биологични системи с висока степен на диференциация и са маркер за адекватността на

изведените регресионни уравнения.

С използването на Response optimizer функцията на статистическия пакет MINITAB 14

са получени следните стойности на изследваните независими променливи за максимален биосинтез на галантамин, норгалантамин и ликорин (Табл. 6).

Доколкото галантаминът е най-ценният алкалоид измежду изследваните, ние предлагаме следните оптимални условия за култивиране на L. aestivum shoot тип култури в системи с временно разбъркване тип RITA, както следва:

1. Период на ръзбъркване – 15 min;

2. Период на покой – 8 h;

3. Температура на култивиране – 26°С.

12

При тези условия разликата между теоретично изчисленото количество галантамин и

експериментално полученото е само 149.72 µg/L – 11% .

Табл. 5. Експериментален дизайн и числени стойности на функциите на отклик, приложени за

биосинтеза на галантамин и съпътстващи алкалоиди от L. aestivum shoot линия G 80, култивирана

в система с временно разбъркване тип RITA.

Независими променливи Числени стойности на функциите на отклик

X1

Период на разбъркване

15 min/h

X2

Тепмература °C

Y1 АСБ,

g/RITA

Y2 Галантамин, µg/RITA

Y3 Норгалантамин,

µg/RITA

Y4 Ликорин, µg/RITA

1 8 18 1.50 147.9 253.9 602.6

2 8 18 0.75 139.0 169.4 523.1

3 8 18 1.24 147.3 218.4 626.7

4 8 22 1.76 168.2 376.7 763.8

5 8 22 1.38 162.0 361.9 742.4

6 8 22 1.30 208.8 423.8 777.2

7 4 26 1.86 157.2 11.9 479.5

8 4 26 1.95 183.3 12.1 650.4

9 4 26 2.37 200.2 11.8 364.7

10 6 26 1.50 213.0 71.4 1209.1

11 6 26 1.99 234.3 77.7 1035.2

12 6 26 1.15 222.5 167.2 1099.9

13 8 26 2.78 338.0 235.0 1207.8

14 8 26 1.78 217.0 169.0 1144.6

15 8 26 2.64 238.0 270.0 1046.1

16 10 26 2.13 252.4 19.2 1811.3

17 10 26 2.21 259.5 10.4 1603.5

18 10 26 2.19 254.0 17.0 1680.8

19 12 26 1.14 178.9 10.4 1004.3

20 12 26 1.20 182.6 15.3 1500.5

21 12 26 1,53 160.0 10.8 954.4

22 8 30 2.16 270.4 358.5 938.6

23 8 30 2.10 200.0 173.1 768.8

24 8 30 2.18 204.0 145.0 906.0

Табл. 6. Оптимални стойности на изследваните независими променливи за максимален биосинтез

на галантамин, норгалантамин и ликорин от L. aestivum shoot линия G 80, култивирана в система с

временно разбъркване тип RITA.

Алкалоид X1* X2* Ŷ*max

Галантамин 7 h 43 min 26.5°С 1171.95 µg/L

Норгалантамин 7 h 47 min 21.1°С 1321.55 µg/L

Ликорин 9 h 44 min 25.5°С 6929.70 µg/L

X1*, X2* - теоретично получени оптимални нива на независимите променливи; Ŷ*max –

теоретично изчислен максимален добив.

Алкалоидите от семейство Amaryllidaceae притежават висока

антиацетилхолинестеразна активност. Към настоящия момент антиацетилхолинестеразната

активност на повечето Amaryllidaceae алкалоиди, както и на екстракти от интактни растения, е изследвана в детайли, но данни относно активността на комплексни алкалоидни екстракти от

Amaryllidaceae растителни in vitro системи липсват. Това насочи нашето внимание към анализа

на антиацетилхолинестеразната активност на алкалоидните екстракти от L. aestivum shoot

линия G 80, получени при култивирането й в система с временно разбъркване.

13

Табл.7. Ацетилхолинестераза инхибираща активност на алкалоидни екстракти от биомаса и

културална течност на L. aestivum shoot линия G 80, култивирана в система с временно разбъркване.

Условия на култивиране Режим на

култивиране, min / h


Вътреклетъчни алкалоидни фракции

IC50, mg

Външноклетъчни алкалоидни фракции

IC50, ml

15 / 8 18 6.6 ± 0.7 46.8 ± 8.2

15 / 8 22 4.6 ± 0.5 37.8 ± 7.9

15 / 4 26 7.5 ± 0.7 146.3 ± 46.1

15 / 6 26 5.0 ± 0.4 90.5 ± 25.8

15 / 8 26 4.8 ± 0.6 137.1 ± 31.0

15 / 10 26 5.1 ± 0.4 145.0 ± 75.0

15 / 12 26 4.8 ± 0.6 285.6 ± 33.0

15 / 8 30 6.2 ± 0.4 39.9 ± 2.0

Антиaцетилхолинестеразната активност не съвпада с количеството биосинтезиран

галантамин при различните режими на култивиране (Фиг. 5 A. и Фиг. 6 A.). Най-висока

антиацетилхолинестеразна активност притежават алкалоидните екстракти от биомасата (IC50

4.6 mg), получена при режим на култивиране с 15 min период на разбъркване и 8 h период на

покой и 22°С. Активностите, отчетени при in vitro културите на L. aestivum, са близки по стойност на тези, получени при алкалоидните екстракти на интактни растения. За първи път са

изследвани антиацетилхолинестеразните активноси на външноклетъчни алкалоидни смеси.

Най-високата инхибираща активност (IC50 37.8 ml) е отчетена при режим на култивиране с 15

min период на разбъркване и 8 h период на покой при 22°С, т.е при по-ниска от оптималната

температура за биосинтез на галантамин (Табл.7). Този резултат най-вероятно се дължи както

на повишените концентрации на норгалантамин, така и на синергитичен ефект на миноритарните алкалоиди в комплексния екстракт (Orhan and Sener, 2003). За да дадем отговор

на този въпрос, насочихме нашите изследвания към масспектроскопски анализ на алкалоидните фракции, получени при различните условия на култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 в

система с временно разбъркване. В алкалоидните смеси са идентифицирани 18 алкалоида, като три от тях са

мажоритарни (ликорин, галантамин и хамаин), а останалите са в минорни количества (< 1% от

йонния ток) (Табл. 8).

Сигналът за ликорина (16) е най-голям процент от общия йонен ток както при

външноклетъчните, така и при вътреклетъчните алкалоидни екстракти. Относителното му

съдържание е между 60% и 70% от общия йонен ток при различните режими на култивиране. Галантаминът (1) е другият алкалоид с високо относително съдържание: 25%–30% от общия

йонен ток. Следва да се отбележи, че относителното съдържание на галантамин във

външноклетъчните и вътреклетъчните алкалоидни смеси е приблизително еднакво. Периодът

на разбъркване не оказва съществено влияние върху относителното съдържание на галантамин

и ликорин в алкалоидните смеси. За разлика от галантамина и ликорина, относителното

съдържание на хамаина (14), третия главен алкалоид, е между 3%–5% от общия йонен ток във

вътреклетъчните алкалоидни екстракти, докато количествата му във външноклетъчните е 2

пъти по ниско. Максимално количество хамаин в биомасата (5.2% от общия йонен ток) се отчита при режим с 15 min период на разбъркване и 10 h период на покой, а максимално

количество в културалната течност (2.0% от общия йонен ток) се натрупва при режим с 15 min

период на разбъркване и 12 h период на покой. Относителното съдържание на норгалантаминa

(2), прекия предшественик на галантамина, е в по-голяма степен в биомасата, отколкото в

културалната течност, а нарвединът (4) – продукт на галантамина, е в по-голямo относително

количество в алкалоидните смеси, получени от културалната течност. Други идентифицирани

алкалоиди в минорни количества са: 8-О-деметилмаритидин (7), идентифициран само в

алкалоидните смеси, екстрахирани от боимасата, а плувин (10), норплувинацетат (8),

ацетилкаранин (9), хеманатамин (13) и стернбергин (15) се откриват в алкалоидните смеси,

екстрахирани от културалната течност. Алкалоидите витатин (3) и анхидроликорин (5) се откриват както в биомасата, така и в културалната течност. Тези резултати показват, че

14

растителните shoot култури на L. aestivum са добра биологична матрица както за биосинтез на

галантамин, така и за изследване на ценни за медицината и фармацията алкалоиди,

притежаващи разнообразни биологични активности.

Алкалоидите, идентифицирани в L. aestivum shoot линия G 80, култивирана в система с временно разбъркване, се групират в четири типа съобразно скелетната си структура и фенол-

окислителното присъединяване на общия им предшественик, 4-О-метилнорбеладина: галантаминов (алкалоиди; 1, 2, 4 и 17), ликоринов (алкалоиди; 5, 8, 9, 10, 12, 15 и 16),

хомоликоринов (6 и 18) и хемантаминов (3, 7, 13 и 14) тип (Фиг. 7). Ликориновият тип

алкалоиди във вътреклетъчните фракции намаляват относителното си съдържание с увеличаване на честотата на разбъркване от 72.6% от общия йонен ток до 57.1% от общия

йонен ток. Честотата на разбъркване практически не оказва влияние на относителното

съдържание на алкалоидите от ликоринов тип във външноклетъчната фракция. Относителното

съдържание във вътреклетъчните фракции на алкалоидите от галантаминовия тип обаче се влияе от периода на разбъркване – повишава се с увеличаване на честотата на разбъркване от

22.1% от общия йонен ток до 35.8% от общия йонен ток. Относителното съдържание на

алкалоидите от хемантаминов тип се увеличава с нарастване на периода на покой от 3.5% от

общия йонен ток (15 min период на разбъркване и 8 h период на покой) до 6.3% от общия йонен

ток (15 min период на разбъркване и 10 h период на покой). По-продължителните периоди на

покой благоприятстват биосинтеза на алкалоиди от галантаминов и хемантаминов тип.

Проучено е и влиянието на температурата на култивиране върху алкалоидния профил

на L. aestivum shoot линия G 80, култивирана в система с временно разбъркване тип RITA, при

режим на култивиране с 15 min период на разбъркване и 8 h период на покой. Идентифицирани

са също 18 алкалоида (Табл. 9). Галантаминът (1) и ликоринът (16) отново са алкалоидите с най-голямо относително съдържание при изследваните температури на култивиране (18, 22, 26

и 30°С). С намаляване на температурата на култивиране от 26°С на 22°С относителното

съдържание на галантамин в алкалоидните екстракти от биомасата и културалната течност се увеличава 2 пъти: вътреклетъчният галантамин от 25.2% от общия йонен ток при 26°С се повишава до 59.8% от общия йонен ток, а външноклетъчният от 27.6% от общия йонен ток се увеличава до 66.3% от общия йонен ток при 22°С При температура на култивиране 22°С

галантаминът е доминиращият алкалоид. Алкалоидите от галантаминов тип – норгалантамин

(2), нарведин (4) и N-формилноргалантамин (17) – също увеличават относителните си

концентрации както в алкалоидните екстракти от биомасата, така и в екстрактите от

културалната течност при температура на култивиране 22°С. Норгалантаминът се увеличава 6.3

пъти (от 0.3% от общия йонен ток до 1.9% от общия йонен ток) при вътреклетъчните алкалоиди

и 2.5 пъти (от 0.2% от общия йонен ток до 0.5% от общия йонен ток) при външноклетъчните алкалоиди. Количеството на нарведина се увеличава 1.6 пъти при вътреклетъчните и

външноклетъчните алкалоиди (от 0.5% до 0.8% от общия йонен ток и от 0.7% до 1.2% от общия

йонен ток), а N-формилноргалантаминът нараства от следи до 0.1% от общия йонен ток. Това

значително увеличение в съдържанието на галантамина и галантаминовия тип алкалоиди

корелира с най-високата отчетена антиацетилхолинестеразна активност на алкалоидните екстракти от биомасата и култyралната течност (Табл. 7). Ликоринът намалява относителното

си съдържание при понижаване на температурата на култивиране от 26°С на 22°С, както

следва: 2.2 пъти при вътреклетъчните (от 69.7% до 31.6% от общия йонен ток) и 2.4 пъти при

външноклетъчните (от 65.5% до 26.7% от общия йонен ток). Този резултат показва, че температура на култивиране 22°С действа инхибиращо на биосинтеза на ликорин и

същевременно активира биосинтеза на галантамин и само чрез промяна в условията на

култивиране можем да манипулираме биосинтетичния път на Amaryllidaceae алкалиодите в

посока биосинтез на галантамин.

15

Табл. 8. Влияние на честотата на разбъркване върху алкалоидния профил на L. aestivum shoot линия G 80, при култивирането й в система с временно

разбъркване тип RITA. Температура на култивиране 26°С. Режим на култивиране, период на разбъркване/ период на покой min/h

15 / 4 15 / 6 15 / 8 15 / 10 15 / 12 Алкалоид Rt M+

БМ КТ БМ КТ БМ КТ БМ КТ БМ ТК

Галантамин (1) а 20.49 287 20.9 ±8.4 32.9 ±3.1 26.2±7.1 24.3±2.2 25.2±3.7 27.6±1.4 34.1±4.6 27.8±1.1 32.8±6.1 28.0±2.5

Норгалантамин (2) а 21.12 273 0.7 ±0.2 сл. 1.1±0.7 0.2±0.1 0.3±0.2 0.2 1.2±1.1 0.4±0.3 1.3 0.2

Витатин (3) б 21.48 271 0.1 ±0.1 0.6 ±0.2 сл. 0.6±0.2 сл. 0.5 0.2±0.1 0.5 0.3±0.1 0.7±0.3

Нарведин (4) а 21.66 285 0.5 ±0.2 0.9 ±0.2 0.4 0.8 0.5±0.2 0.7 0.57 0.7±0.1 0.9±0.2 0.8

Анхидроликорин (5) б 21.91 251 0.5 ±0.3 0.8 0.7±0.2 1.2±0.3 0.3±0.3 0.6 0.8±0.1 0.7±0.1 0.8±0.2 0.8

6-Метоксиликоренин (6) е 21.93 331 0.1 0.2 0.8±0.5 0.4±0.2 0.4±0.3 0.2±0.1 0.4±0.1 0.2 0.4 0.2±0.1

8-O-Деметилмаритидин (7) а 22.06 273 0.3±0.2 - 0.4±0.2 - 0.7±0.7 - 0.9±0.2 - 0.8 -

Норплувинацетат (8) в 22.26 315 - 0.5 ±0.2 сл. 1.2±0.1 сл. 1.1±0.7 сл. 0.5±0.2 сл. 0.6±0.3

Ацетилкаранин (9) а 22.32 313 сл. 0.4 ±0.2 0.1 3.2±1.1 сл. 1.3±0.8 сл. 1.1±0.1 сл. 1.5±0.8

Плувин (10) а 22.98 287 - сл. - сл. - сл. - сл. - -

Панкратинин C (11) г 23.14 287 сл. сл. 0,1 сл. 0.1 сл. 0.1 сл. 0.1 сл.

11,12-Дидехидроанхидроликорин (12)в 23.48 249 0.1 0.1 0,1 0.1 0.1 сл. сл. сл. сл. 0.1

Хемантамин (13) б 23.30 301 - - - сл. - - - сл. - сл.

Хамаин (14) б 24.94 287 4.6 ±2.5 1.5 ±0.1 3.1±1,3 1.1±0.4 2.5±1.5 1.7±0.6 5.2±2.1 1.9±0.3 3.9±1.2 2.0±0.5

Стернбергин (15) д 25.07 331 - 0.4 - 0.2 - 0.5 - 0.2 - 0.2

Ликорин (16) б 25.53 287 72.0±11.8 61.6±2.8 66.8±6.6 66.5±4.6 69.7±6.1 65.5±0.2 56.2±1.0 65.7±2.1 58.6±4.8 64.7±4.8

N-Формилгалантамин (17) а 26.51 301 сл. сл. - сл. сл. сл. сл. сл. сл. -

8-O-Деметилхомоликорин(18) б 26.55 315 сл. сл. 0.1 0.1 сл. сл. 0.1 0.1 сл. сл.

сл. < 0.1% от общия йонен ток; а (Berkov et al., 2005);

б (Berkov et al., 2008);

в (Berkov et al., 2009);

г (Cedrón et al., 2009);

д (Evidente et al., 1984);

е (Kreh et al., 1995).

16

4-О-Метилнорбеладин

NH

OH

OH

MeO

ortho - para' para - para' para - ortho'

N

R2

R1O

R4O

R3O

H

H N

O

R4O

R1

R2

R3

Me

O

R1

N

R4O

R3O

R2

R4O

R3O

R1

N

R2

H

1 R1=OH, R2=H, R3, R4=Me

4 R1+R2=O, R3=Me, R4=Me

2 R1=OH, R2=H, R3=H, R4=Me

17 R1=OH, R2=H, R3=CHO, R4=Me

6 R1=OMe, R2=H, R3, R4=Me

18 R1+R2=O, R3=H, R4=Me

8 R1=Ac, R2=OH, R3=Me, R4=H

9 R1=Ac, R2=H, R3+R4=CH2 10 R1=H, R2=H, R3, R4=Me

15 R1=H, R2=OAc, R3=Me, R4=H

16 R1=H, R2=OH, R3+R4=CH2

3 R1=OH, R2=H, R3+R4=CH2

7 R1=OH, R2, R3=H, R4=Me

13 R1=OMe, R2=OH, R3+R4=CH2

14 R1, R2=OH, R3+R4=CH2

N

O

O

5

Ликоронов тип Хемантаминов тип Галантаминов тип

Хомоликоринов тип

N

O

O

OH

H

H

11

N

O

O

12

Фиг. 7. Биосинтетична връзка на идентифицираните Amaryllidaceae алкалоиди в L. aestivum shoot

линия G 80.

Температурата на култивиране оказва съществено влияние не само върху биосинтеза на

индивидуалните компоненти на алкалоидните смеси, биосинтезирани от L. aestivum shoot линия

G 80, но и като цяло на алкалоидните групи. При температура на култивиране, различна от

благоприятната за синтез на алкалоиди от ликоринов тип (26°С), се наблюдава съществено

повишаване на алкалоиди от галантаминов тип с para-ortho' фенол-окислителна структура

(Фиг. 7), като температурата, при която най-много се увеличават алкалоидите от галантаминов

тип (2.4 пъти), е 22°С. При тази температура галантаминовият тип алкалоиди е доминиращ тип

– от 26.0% от общия йонен ток при 26°С до 62.6% от общия йонен ток за външноклетъчните и

от 28.5% от общия йонен ток на 68.1% от общия йонен ток при вътреклетъчните. От друга

страна, относителната концентрация на алкалоидите от ликоринов тип с ortho-para' фенол-

окислителна структура (Фиг. 7) намалява съответно 2 пъти за екстрахираните от биомасата (от

70.2% от общия йонен ток при 26°С на 34.8% от общия йонен ток при 22°С) и 2.2 пъти (от

69.0% от общия йонен ток при 26°С на 30.6% от общия йонен ток при 22°С) за тези от

външноклетъчните алкалоидни фракции. Хемантаминовият тип алкалоиди с para-para' фенол-

окислителна стуктура (Фиг. 7) при увеличаване на температурата на култивиране от 22°С до

30°С повишават относителното си съдържание във вътреклетъчните фракции 2 пъти на всеки

4°С, като максимум се постига при 30°С–6.1% от общия йонен ток. Тези резултати показват, че температурата на култивиране оказва влияние върху ензимите, катализиращи фенол-

окислителното присъединяване на 4-О-метилнорбеладина и формирането на алкалоиди с различен структурен тип (Фиг. 7).

17

Табл. 9. Влияние на температурата на култивиране върху алкалоидния профил на L. aestivum G 80, при култивирането й в система тип RITA. Режим на

култивиране 15 min период на разбъркване и 8 h период на покой. Температура на култивиране

18 ºC 22 ºC 26 ºC 30 ºC Алкалоид Rt M+

БМ КТ БМ КТ БМ КТ БМ КТ

Галантамин (1) а 20.49 287 44.5 ±7.4 55.6 ±11.0 59.8 ±11.0 66.3 ±11.1 25.2 ±3.7 27.6 ±1.4 51.1 ±2.3 49.7 ±4.6

Норгалантамин (2) а 21.12 273 1.4 ±0.1 0.1 ±0.1 1.9 ±0.5 0.5 ±0.2 0.3 ±0.2 0.2 1.2 ±0.2 0.4 ±0.1

Витатин (3) б 21.48 271 сл сл сл 0.1 сл 0.5 сл 0.2 ±0.1

Нарведин (4) а 21.66 285 0.5 ±0.1 0.6 ±0.1 0.8 ±0.1 1.2 ±0.5 0.5±0.2 0.7 0.4 ±0.1 0.3 ±0.2

Анхидроликорин (5) б 21.91 251 1.3 ±0.4 1.0 ±0.6 1.4 ±1.0 2.1 ±0.5 0.3 ±0.3 0.6 1.0 ±0.7 1.2 ±0.5

6-Метоксиликоренин (6) е 21.93 331 0.9 ±0.1 0.3 ±0.1 0.9 ±0.6 0.4 ±0.1 0.4 ±0.3 0.2 ±0.1 0.3 ±0.1 0.1

8-O-Деметилмаритидин (7) а 22.06 273 0.2 ±0.1 - 0.3 - 0.7 ±0.7 - 0.5 ±0.1 -

Норплувинацетат (8) в 22.26 315 сл 0.2 сл 0.3 сл 1.1 ±0.7 - 0.3

Ацетилкаранин (9) а 22.32 313 сл 0.3 0.7 0.3 ±0.2 сл 1.3 ±0.8 - сл

Плувин (10) а 22.98 287 - сл - сл - сл - сл

Панкратинин C (11) г 23.14 287 0.2 ±0.2 сл 0.1 сл 0.1 сл 0.2 ±0.1 сл

11,12-Дидехидроанхидроликорин (12)в 23.48 249 0.5 0.5 ±0.2 1.0 ±0.3 1.1 ±0.2 0.1 сл 0.6 ±0.1 0.8

Хемантамин (13) б 23.30 301 - сл - 0.3 - - - сл

Хамаин (14) б 24.94 287 2.0 ±1.9 0.6 ±0.1 1.2 ±0.9 0.4 ±0.1 2.5 ±1.5 1.7 ±0.6 5.6 ±0.8 0.5 ±0.2

Стернбергин (15) д 25.07 331 - сл - 0.2 - 0.5 сл 0.7 ±0.4

Ликорин (16) б 25.53 287 48.4 ±6.4 40.6 ±10.2 31.6±12.4 26.7 ±12.4 69.70 ±6.1 65.5 ±0.2 38.9 ±8.7 45.7 ±4.4

N-Формилгалантамин (17) а 26.51 301 сл сл 0.1 0.1 сл сл 0.4 сл

8-O-Деметилхомоликорин(18) б 26.55 315 сл сл сл сл сл сл 0.2 сл







18

Понижаването на температурата на култивиране благоприятства преимуществено

формиране на алкалоиди с para-ortho' фенол-окислително присъединяване (галантаминов тип)

и инхибира формирането на алкалоиди с ortho-para' фенол-окислително присъединяване (ликоринов тип). От друга страна, по-високата температура на култивиране благоприятства

биосинтеза на алкалоиди с para-para' тип на фенолно присъединяване (хемантаминовия тип).

Тези факти ни дават основание да твърдим, че вторичният метаболизъм на L. aestivum G 80,

култивирана в биореакторни системи с временно разбъркване тип RITA, може да бъде насочван

в желана от нас посока чрез промяна в температурата на култивиране.

2.2. Биосинтез на галантамин от L. aestivum L. G 80 shoot тип култура в колонен биореактор с вътрешни секции

В периода на цъфтеж (май–юни) на интактните растения L. aestivum L., когато се отчита

максимално натрупване на галантамин, среднодневните температури са 22°С

(http://iasas.government.bg). На тази база е изследвано влиянието на температурата на

култивиране върху развитието на L. aestivum shoot линия G 80 и върху биосинтеза на

галантамин и съпътстващите го Amaryllidaceae алкалоиди в колонен биореактор с вътрешни

секции. Друг важен фактор при биореакторите с пневматично разбъркване е дебитът на

входящия въздух, осигуряващ както аерацията, така и масообмена на културалната течност.

Растителната shoot култура на L. aestivum G 80 показва балансиран растеж при всички

изследвани температури 18, 22 и 26°С и дебит на входящия въздух 18 L/(L.h). По време на

култивационния процес отделните shoot-ове увеличават значително дължината и обема си.

Първоначално е проведено култивиране на L. aestivum shoot линия G80 в колонен биореактор с вътрешни секции при стандартни условия – температура 26°С, дебит на входящия въздух 18

L/(L.h). При тези условия културата се развива добре, като натрупва 17.8 g/L суха биомаса

(растежен индекс 3.2) (Табл. 10). Не се наблюдават некроза и/или витрификация на тъканта,

дължащи се на хиперхидратация или влошен масообмен. Намаляването на температурата на култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 от 26°С на 22°С води до повишен (14%) добив от

биомаса и достига до 20.8 g/L и по-висок (33%) растежен индекс – 4.8. Следващото намаляване на температурата на култивиране от 22°С на 18°С обаче води до инхибиране на развитието.

Следователно оптималната температура за развитието на L. aestivum G 80, култивирана в

колонен биореактор с вътрешни секции, е 22°С и при тази температура са проведени

следващите експерименти относно анализа на влиянието на дебита на входящия въздух върху

растежните и биосинтетичните характеристики на изследваната култура. Дебитът на входящия въздух оказва съществено влияние върху развитието на

растителните in vitro системи, култивирани в колонен биореактор, защото това е основният

параметър, повлияващ хидродинамичната обстановка в работния обем. Експериментите са

проведени при температура на култивиране 22°С. Анализът на получените резултати показва, че при дебит на входящия въздух 18 L/(L.h) L. aestivum shoot линия G 80 показва най-добри

растежни характеристики (Табл. 10). Намаляването или увеличаването на дебита входящ

въздух води до натрупването на значително по-малки количества биомаса. Растежният индекс, постигнат при тези условия, е около 2 пъти по-висок от този, постигнат при култивиране на L.

aestivum shoot линия G 80 в колби (2.50).

Табл. 10. Максимални стойности на акумулираната суха биомаса и растежните индекси, получени

при култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 в колонен биореактор с вътрешни секции.

Условия на култивиране Температура,

°C

Дебит на входящия въздух, L/(L.h)

Акумулирана суха биомаса, g/L


18 18 14.0 ±1.4 2.4 ±0.1

22 18 20.8 ±4.6 4.8 ±0.3

26 18 17.8 ±2.1 3.2 ±0.4

22 9 15.8 ±0.5 3.4 ±0.1

22 27 9.1 ±2.8 1.4 ±0.4

19

Количеството на биосинтезирани хлорофили е в правопропорционална зависимост от

количеството на натрупаната биомаса (Табл. 11).

Табл. 11. Максимални количества хлорофили, получени при култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 в колонен биореактор с вътрешни секции.

Условия на култивиране Температура,

°C


Хлорофил A, mg/L

Хлорофил Б, mg/L

18 18 2.7 ±0.1 1.4 ±0.1

22 18 4.9 ±0.3 2.6 ±0.3

26 18 3.7 ±0.2 1.9 ±0.2

22 9 3.3 ±0.1 1.9 ±0.1

22 27 1.7 ±0.2 0.9 ±0.1

При намаляване на температурата на култивиране от 26°С до 18°С степента на

усвояване на основния въглероден източник (захарозата) намалява (от 44.9% до 21.9%) (Фиг. 8

А). Подобно намаление в степента на усвояване на захарозата се наблюдава и при намаляване на дебита на входящия въздух от 27 L/(L.h) до 9 L/(L.h) (от 42.4% до 26.5% съответно) (Фиг. 8

Б).

Температура, оС

Захароза, Глюкоза

, Фруктоза

, g/L

0

10

20

30

40

50

60Захароза

Глюкоза

Фруктоза

18 22 26

0.49.21* ±4.05.33* ±

1.29.44* ±

А

Дебит на входящия въздух, L/(L.h)Захароза

, Глюкоза

, Фруктоза

, g/L

0

10

20

30

40

50

60Захароза

Глюкоза

Фруктоза

9 18 27

7.25.26* ±4.05.33* ± 0.64.42* ±

Б

Фиг. 8. Количества на захароза, глюкоза и фруктоза в края на култивационния процес и степен на

усвояване на захарите в % (*) от L. aestivum линия G 80, култивирана при различни температури

(А) и дебити на входящия въздух (Б). Началната концентрация на захарозата е 60 g/L.

Температурата на култивиране не влияе съществено на усвояването на нитратните йони

при култивиране на L. aestivum shoot линия G80 в колонен биореактор (Фиг. 9 А). Степента на

усвояване на фосфатни и амониеви йони обаче зависи от температурата на култивиране (Фиг. 9

А). Максимална степен на усвояване на фосфатните (99%) и амониевите (95%) йони се постига

при оптимален режим на култивиране (22°С и 18 L/(L.h)) на L. aestivum shoot линия G 80 (Фиг. 9 А).

Температура, оС

Степен на усвояване, %

0

20

40

60

80

100NO

3

-

NH4

+

PO4

3+

18 22 26

А


Степен

на

усвояване,

%

0

20

40

60

80

100

NO3-

NH4

+

PO4

3+

9 18 27

Б

Фиг. 9. Степен на усвояване на фосфатни, амониеви и нитратни йони от L. aestivum shoot линия G 80 в края на култивационния процес при различни температури (А) и дебити на входящия въздух

(Б).

Дебитът на входящия въздух оказва значително влияние върху усвояването на

основните хранителни компоненти (нитратни, амониеви и фосфатни йони) (Фиг. 9 Б).

20

Максималната степен на усвояване съвпада с максималното натрупване на биомаса в колонния

биореактор при 18 L/(L.h): съответно 62% – NO3, 95% – NH4, 99% – PO4. Данните, получени

относно усвояването на основните хранителни компоненти от хранителната среда, показват, че колонният биоректор с вътрешни секции покрива напълно хранителните нужди на L. aestivum

shoot линия G 80.

Tемпературата на култивиране и дебитът на входящия въздух силно влияят върху

биосинтеза на галантамин от L. aestivum shoot линия G 80 (Фиг. 10 и Фиг. 11). Максимално

количество галантамин – 1.68 mg/L (1.04 mg/L вътреклетъчен и 0.64 mg/L външноклетъчен), сe

биосинтезира в края на култивирането на L. aestivum shoot линия G 80 при режим на

култивиране с температура 22°С и дебит на входящия въздух 18 L/(L.h) (Фиг. 10 А).

Температура, οC


mg

/L

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0Вътреклетъчен



18 22 26

А


Ликорин, m

g/L

0

2

4

6

8

10

12 Вътреклетъчен



18 22 26

Б


Норгалантамин, m

g/L

0,0

0,5

1,0

1,5




18 22 26

В

Фиг. 10. Влияние на температурата на култивиране върху биосинтеза на галантамин (А), ликорин

(Б) и норгалантамин (В) от L. aestivum shoot линия G 80, култивирана в колонен биореактор с

вътрешни секции. Дебит на входящия въздух – 18 L/(L.h).

При култивирането в колонен биореактор на L. aestivum shoot линия G 80 биосинтезира

и значителни количества ликорин. Температурата на култивиране и дебитът на входящия

въздух оказват силно влияние върху биосинтеза на ликорин. Най-голямо количество 8.32 mg/L

(6.27 mg/L вътреклетъчен и 2.05 mg/L външноклетъчен) се биосинтезира при температура на

култивиране 22°С и дебит на входящия въздух 18 L/(L.h) (Фиг. 10 Б).



, m

g/L

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5




9 18 27

А


Ликорин, m

g/L

0

2

4

6

8

10

12 Вътреклетъчен



9 18 27

Б



, m

g/L

0,0

0,5

1,0

1,5




9 18 27

В

Фиг. 11. Влияние на дебита на входящия въздух върху биосинтеза на галантамин (А), ликорин (Б) и

норгалантамин (В) от L. aestivum shoot линия G 80, култивирана в колонен биореактор с вътрешни

секции. Температура на култивиране – 22°С.

Условията на култивиране оказват съществено влияние и върху биосинтеза на прекия

предшественик на галантамина – норгалантамина. Резултатите, получени в края на

култивационния процес (Фиг. 10 В и Фиг. 11 В), показват, че максимално количество

норгалантамин (1.4 mg/L – 1.05 mg/L вътреклетъчен и 0.35 mg/L външноклетъчен) се синтезира

от L. aestivum shoot линия G 80 при температура 22°С и дебит на входящия въздух 9 L/(L.h).

Получените резултати при анализа на процеса на култивиране на L. aestivum shoot линия

G 80 в колонен биореактор с вътрешни секции показват, че изследваните независими

променливи (температура и дебит на входящия въздух) са значими (Табл. 12). Изведени са

регресионните уравнения, описващи влиянието на температурата (Х1) и дебита на входящия

въздух (Х2) върху акумулираната биомаса (Y1), добива на галантамин (Y2), добива на

норгалантамин (Y3) и добива на ликорин (Y4).

21

Табл. 12. Експериментален дизайн и числени стойности на функциите на отклик, приложени за

биосинтеза на галантамин и съпътстващите го алкалоиди от L. aestivum shoot линия G 80,

култивирана в колонен биореактор с вътрешни секции.

Независими променливи Изходни данни от процеса

X1,

Температура °С

X2

Дебит на входящ

въздух

L/(L.h)

Y1 АСБ,

g/L

Y2 Галантамин,

mg/L

Y3 Норгалантамин,

mg/L

Y4 Ликорин,

mg/L

1 18 18 13.02 0.895 0.383 4.539

2 18 18 15.06 1.487 0.541 7.605

3 22 9 16.18 1.474 1.576 2.715

4 22 9 15.54 0.890 1.222 4.085

5 22 18 24.06 1.486 0.905 7.969

6 22 18 17.58 1.878 1.219 8.666

7 22 27 11.12 0.600 0.297 3.469

8 22 27 7.15 0.664 0.356 1.954

9 26 18 19.37 0.929 0.274 1.547

10 26 18 16.31 1.005 0.254 1.658

След анализа на данните са изведени съответните регресионни уравнения:

Y1 = 13.905x1 + 3.326x2 – 0.305x12 – 0.103x2

2 – 163.935 R1 = 81.02

Y2 = 1.630x1 + 0.314x2 – 0.037x12 – 0.009x2

2 - 18.500 R2 = 73.26

Y3 = 1.897x1 + 0.029x2 – 0.043x12 – 0.002x2

2 - 19.26 R3 = 94.09

Y4 = 11.762x1 + 2.300x2 – 0.280x12 – 0,065x2

2 - 135.27 R4 = 89.45

Получените стойности на коефициентите на корелация (R) са маркер за адекватността

на изведените регресионни уравнения.

Процедурата по оптимизация, проведена с MINITAB 14, дава следните оптимални нива

на независимите променливи Х1 и Х2 за максимално натрупване на биомаса и максимален

биосинтез на галантамин, норгалантамин и ликорин (Y) от L. aestivum shoot линия G 80 (Табл.

13).

Табл. 13. Оптимални стойности на изследваните независими променливи за максимален биосинтез

на галантамин, норгалантамин и ликорин от L. aestivum shoot линия G 80, култивирана в колонен

биореактор с вътрешни секции.

Алкалоид X1* X2* Ŷ*max

Галантамин 21.6°С 16.46 L/(L.h) 1.71 mg/L

Норгалантамин 21.7°С 9.00 L/(L.h) 1.40 mg/L

Ликорин 21.0°С 17.73 L/(L.h) 8.60 mg/L

X1*, X2* - теоретично получени оптимални нива на променливите; Ŷ*max – теоретично изчислен

максимален добив.

Разликата между теоретично изчислен добив галантамин и експериментално получения

при температура на култивиране 22°С е само 0.03 mg/L–1.7%, т.е практически има съвпадение между теоретично изчисления и експериментално получения добив. Въз основа на получените експериментални данни ние предлагаме режим на култивиране на L. aestivum shoot линия G 80

в колонен биореактор с вътрешни секции съответно:

1. Температура на култивиране – 22°С.

2. Дебит на входящия въздух – 18 L/(L.h).

Условията на култивиране влияят и върху антиацетилхолинестеразната активност на

алкалоидните екстракти (Табл. 14). С увеличаване на температурата на култивиране от 18°С до

26°С се повишава 3.7 пъти антиацетилхолинестеразната активност – от IC50 19.5 mg (при 18°С)

до IC50 5.2 mg (при 26°С) – във вътреклетъчните алкалоидни екстракти и 1.7 пъти – от IC50 64.3

ml (при 18°С) до IC50 37.9 ml (при 26°С) – на външноклетъчните алкалоидни екстракти, като

максимална антиацетилхолинестеразна активност се отчита при 26°С и дебит на входящия

22

въздух 18 L/(L.h), съответно IC50 5.20 mg за алкалоидите в биомасата и IC50 37.9 ml за

алкалоидите в културалната течност (Табл. 14). Дебитът на входящия въздух не оказва влияние върху антиацетилхолинестеразната активност на вътреклетъчните алкалоидни екстракти, но

при външноклетъчните се наблюдава повишаване на активността 1.3 пъти, от IC50 58.9 ml (при

9 L/(L.h)) до IC50 45.0 ml (при 27 L/(L.h)).

Табл. 14. Ацетилхолинестераза инхибираща активност на алкалоидни екстракти от биомаса и

културална течност, получени от L.aestivum shoot линия G 80, култивирана в колонен биореактор с вътрешни секции, представени като IC50.

Условия на култивиране



Вътреклетъчни

алкалоидни фракции, IC50, mg

Външноклетъчни алкалоидни

фракции, IC50, ml

18 18 19.5 ±1.8 64.3 ±5.4

22 9 6.5 ±0.1 58.9 ±6.1

22 18 6.4 ±0.9 49.9 ±0.9

22 27 6.0 ±0.2 45.0 ±4.7

26 18 5.2 ±0.7 37.9 ±4.7

За да изясним влиянието на минорните компоненти в комплексните алкалоидни смеси,

насочихме нашите изследвания към идентифициране на тези компоненти чрез масспектроскопски анализ на алкалоидните фракции, получени при различните условия на

култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 в колонен биореактор (Табл. 15).

В алкалоидните смеси се идентифицират 17 алкалоида, три от тях са мажоритарни –

ликорин, галантамин и хамаин, осем алкалоида са в минорни количества и шест са в следи.

Алкалоидите с най-голямо относително съдържание са галантамин (1) и ликорин (16)

при изследваните температури на култивиране (18, 22, и 26°С). С намаляване на температурата

на култивиране от 26°С на 22°С относителното съдържание на галантамин в алкалоидните екстракти от биомасата и културалната течност се увеличава 1.6 пъти: вътреклетъчният

галантамин от 18.2% от общия йонен ток при 26°С до 29.5% от общия йонен ток при 22°С, а

външноклетъчният се увеличава 1.13 пъти, от 39.7% от общия йонен ток до 45.0% от общия

йонен ток. Също така алкалоидите от галантаминов тип – норгалантамин (2) и нарведин (4) –

увеличават своите относителни концентрации както в алкалоидните екстракти от биомасата, така и в екстрактите от културалната течност при температура на култивиране 22°С. Норгалантаминът се увеличава 3.3 пъти (от 0.3% от общия йонен ток до 1.0% от общия йонен

ток) при вътреклетъчните алкалоиди, а при външноклетъчните алкалоиди от следи до 0.1% от

общия йонен ток. Нарвединът повишава своите относителни концентрации 1.5 пъти при

вътреклетъчните и 1.2 пъти при външноклетъчните алкалоиди (от 0.4% до 0.6% от общия йонен

ток; 1.0% до 1.2% от общия йонен ток съответно). Относителните концентрации на ликорина

намаляват при понижаване на температурата на култивиране от 26°С на 22°С, както следва: 1.15 пъти при вътреклетъчните (от 74.4% от общия йонен ток до 64.2% от общия йонен ток) и

1.12 пъти при външноклетъчните (от 56.2% от общия йонен ток до 49.8% от общия йонен ток).

При температура на култивиране 22°С е отчетен и максималният биосинтез на галантамин

(Фиг. 10 А), но при тази температура (22°С) се постига и най-високо количество биосинтезиран

ликорин (Фиг. 10 Б). Понижението на температурата на култивиране от 26°С на 22°С

благоприятства биосинтеза и на двата алкалоида при култивиране на L. aestivum shoot линия G

80 в колонен биореактор с вътрешни секции. Намалението на относителните концентрации на

ликорина в алкалоидните екстракти на биомасата и културалната течност при 22°С се дължи

както на увеличените относителни концентрации на галантамин, така и на повишените относителни концентрации на съпътстващите ги минорни алкалоиди. Температурата на

култивиране оказва съществено влияние и върху относителното съдържание на хамаина (14) в

биомасата и в културалната течност, като по-високата температура (26°С) благоприятства

биосинтеза му. Максимално количество в биомасата (4.3% от общия йонен ток) се натрупва

при 26°С, докато в културалната течност най-висока концентрация (1.8% от общия йонен ток)

се отчита при 22°С.

23

Табл. 15. Влияние на температурата на култивиране и дебита на входящия въздух върху алкалоидния профил на L aestivum линия G 80, култивирана в

колонен биореактор с вътрешни секции.

Условия на култивиране, Температура °С; Дебит на входящия въздух, L/(L.h)

18°C / 18 L/(L.h) 22°C / 18 L/(L.h) 26°C / 18 L/(L.h) 22°C / 9 L/(L.h) 22°C / 27 L/(L.h) Алкалоид Rt M+

БМ КТ БМ КТ БМ КТ БМ КТ БМ КТ

Галантамин (1) а 20.49 287 19.5* 35.8 29.5 45.0 18.2 39.7 34.1 37.0 39.0 60.4

Норгалантамин (2) а 21.12 273 0.3 0.1 1.0 0.1 0.3 сл. 0.8 0.1 1.1 1.6

Витатин (3) б 21.48 271 сл. сл. сл. 0.1 сл. 0.2 сл. 0.1 0.1 0.2

Нарведин (4) а 21.66 285 0.4 0.9 0.6 1.2 0.4 1.0 0.2 1.1 0.5 1.7

Анхидроликорин (5) б 21.91 251 0.9 0.7 0.6 1.3 1.1 1.3 0.8 1.2 2.2 1.7

6-Метоксиликоренин (6) е 21.93 331 0.4 0.1 0.2 0.2 0.1 0.2 0.2 0.1 0.3 0.2

8-O-Деметилмаритидин (7) а 22.06 273 0.5 - 1.0 - 0.8 - 0.8 - 1.1 -

Норплувинацетат (8) в 22.26 315 сл. сл. сл. сл. сл. сл. сл. сл. сл. сл.

Ацетилкаранин (9) а 22.32 313 сл. сл. сл. 0.1 сл. сл. сл. сл. - сл.

Плувин (10) а 22.98 287 - - - - - - - - - -

Панкратинин C (11) г 23.14 287 сл. сл. 0.1 сл. - сл. 0.1 0.1 0.1 сл.

11,12-Дидехидроанхидроликорин (12) в 23.48 249 0.1 0.1 0.1 0.1 0.3 0.2 0.1 0.1 1.0 1.3

Хемантамин (13) б 23.30 301 - сл. - сл. - сл. - 0.1 - сл.

Хамаин (14) б 24.94 287 2.4 1.2 2.6 1.8 4.3 1.0 3.4 1.2 5.0 0.9

Стернбергин (15) д 25.07 331 - 0.1 - 0.1 - 0.1 - 0.1 сл. 0.1

Ликорин (16) б 25.53 287 75.3 60.8 64 49.8 74.4 56.2 59.3 58.6 49.0 31.7

N-Формилгалантамин (17) а 26.51 301 сл. сл. сл. сл. сл. сл. сл. сл. 0.2 сл.

8-O-Деметилхомоликорин(18) б 26.55 315 сл. сл. сл. сл. сл. сл. сл. 0.1 0.2 0.1







* - Представените резултати са средни стойности от два независими експеримента, стандартното отклонение (n=2) e < 5%.

24

Дебитът на входящия въздух също оказва влияние върху алкалоидния профил на L.

aestivum G 80, култивирана в колонен биореактор. Увеличаването на дебита от 18 L/(L.h) до 27

L/(L.h) води до повишаване на относителните концентрации на галантамин 1.32 пъти, от 29.5%

от общия йонен ток до 39.0% от общия йонен ток за вътреклетъчните алкалоидни екстракти, а

при външноклетъчните – 1.34 пъти, от 45.0% от общия йонен ток до 60.4% от общия йонен ток.

При 27 L/(L.h) дебит на входящия въздух галантаминът е доминиращият алкалоид в

извънклетъчните алкалоидни екстракти. Ликоринът при увеличаване на дебита входящ въздух

от 18 L/(L.h) до 27 L/(L.h) понижава своите относителни концентрации спрямо общия йонен

ток – при вътреклетъчните алкалоидни екстракти намалява от 64.2% от общия йонен ток до

49.0% от общия йонен ток (1.3 пъти), а при външноклетъчните алкалоиди – от 49.8% от общия

йонен ток до 31.7% от общия йонен ток (1.57 пъти).

В заключение колонният биореактор с вътрешни секции е подходяща култивационна

система за биосинтез на биологично активни алкалоиди, осигуряваща в максимална степен

основните хранителни нужди на изследваната култура, както и максимална експресия на

фотосинтетичния потенциал на културата. След оптимизация на условията на култивиране е постигнат добив от 1.7 mg/L галантамин – най-високият съобщаван понастоящем в научната

литература. Установено е, че L. aestivum G 80 shoot културата биосинтезира в допълнение и

значителни количества ликорин и норгалантамин – алкалоиди, притежаващи ценни биологични

активности. За пръв път е приложен мултиметаболитният анализ като подход за изясняване на

връзките между условията на култивиране и вторичния метаболизъм на изследваната

растителна in vitro система. Това е принос с фундаментално значение, касаещ изясняването на

метаболитните пътища за биосинтез на изучаваните биологично активни алкалоиди.

Получените резултати показват, че значителна част от изследваните алкалоиди са

външноклетъчни. Този факт, съчетан с конструктивните възможности на модифицирания

колонен биореактор с вътрешни секции, е в основата на разработването на двуфазна

култивационна система за получаване на галантамин.

2.3. Сравнителен анализ на процеса на биосинтез на галантамин и съпътстващи

Amaryllidaceae алкалоиди от L. aestivum shoot линия G 80 в различни култивационни

системи

На база на получените резултати колонният биореактор с вътрешни секции се определя

като по-подходящ за биосинтез на галантамин от L. aestivum shoot линия G 80. В тази

култивационна система при оптимални условия (температура 22°С и дебит на входящия въздух

18 L/(L.h)) се синтезира (1.7 mg/L) галантамин 1.3 пъти повече в сравнение с култивирането в

култивационна система с временно разбъркване тип RITA – 1.3 mg/L галантамин (15 min

период на разбъркване и 8 h период на покой и температура на култивиране 26°С). Максимално

количество норгалантамин (1.9 mg/L) се биосинтезира в култивационна система тип RITA при

оптимални условия за биосинтеза му (15 min период на разбъркване и 8 h период на покой и

температура 22°С), като това количество е 1.3 пъти по-малко при оптималните условия

(температура 22°С и дебит на входящия въздух 9 L/(L.h)) за биосинтеза му в колонен

биореактор – 1.4 mg/L. Видът на култивационната система практически не оказва влияние върху биосинтеза на ликорин. В двете култивационни системи се натрупват приблизително

еднакви количества – 8.5 mg/L за култивационната система с временно разбъркване (при режим

с 15 min период на разбъркване и 10 h период на покой и температура 26°С) и 8.3 mg/L в

колонен биореактор (температура 22°С и дебит на входящия въздух 18 L/(L.h)). При двете култивационни системи оптималните условия за натрупване на биомаса съвпадат с оптималните условия за биосинтез на галантамин, но при колонния биореактор L. aestivum G 80

натрупва 1.7 пъти повече биомаса в сравнение с култивирането в система с временно

разбъркване (20.8 g/L при колонен биореактор и 12.0 g/L при системата с временно

разбъркване). Растежните параметри и продуктивността на култивационните системи са

представени на Табл. 16. Анализът на получените резултати показва, че L. aestivum shoot линия

G 80, култивирана в колонен биореактор с вътрешни секции, показва по-добри растежни

характеристики, като по-висок растежен индекс (4.8), по-кратък период за удвояване на

биомасата (175 h) и 3.7 пъти по-висок добив на биомаса (1.035 g СБ/g захароза), в сравнение с

25

култивационната система с временно разбъркване (0.2783 g СБ/g захароза). Продуктивността на

галантамина е 1.27 пъти по-висока в колонния биореактор (0.048 mg/(L.day)) в сравнение с култивационната система с временно разбъркване (0.037 mg/(L.day)) (Табл. 16). По-добрите растежни и биосинтетични характеристики, постигнати в колонния биореактор, го правят по-

подходящата култивационна система за биосинтез на галантамин от L. aestivum G 80.

Табл. 16. Растежни параметри и продуктивност на алкалоиди от L. aestivum shoot линия G 80,

култивирана в система с временно разбъркване тип RITA и колонен биореактор с вътрешни секции.

Параметри Култивационна система с временно разбъркване тип

RITA

Колонен биореактор с вътрешни секции


2.98 4.80

Време за удвояване на биомасата, h

282 175

Добив на биомаса, g/g захароза

0.2783 1.0357

Добив на галантамин, mg/g

захароза 0.0306 0.0836

Добив на норгаланантамин, mg/g

захароза 0.0450 0.0882

Добив на ликорин, mg/g захароза

0.1969 0.4143

Продуктивност на галантамин,

mg/(L.day)

0.0377 0.0480

Продуктивност на норгалантамин, mg/(L.day)

0.0554 0.0390

Продуктивност на ликорин,

mg/(L.day)

0.2424 0.2377

При култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 в двете култивационни системи са

идентифицирани 18 алкалоида. Сравнителната характеристика в алкалоидния профил на двете култивационни системи при оптималните условия за биосинтез на галантамин показва, че относителното съдържание на галантамин в алкалоидните екстракти от биомасата и

културалната течност в колонния биореактор е по-голямо в сравнение с относителното

съдържание на галантамин в култивационната система с временно разбъркване: при вътреклетъчните относителното съдържание на галантамин е 1.17 пъти повече (25.2%) от

общия йонен ток (култивационна система с временно разбъркване) – 29.5% от общия йонен ток

(колонен биореактор); при външноклетъчните алкалоиди в колонен биореактор относителното

съдържание на галантамин е 1.63 пъти повече (26.6%) от общия йонен ток (култивационна

система с временно разбъркване) – 45.0% от общия йонен ток (колонен биореактор).

В заключение получените резултати категорично показват, че модифицираният колонен

биореактор с вътрешни секции е по-подходяща система за биосинтез на галантамин от L.

aestivum in vitro shoot култури.

3. Елиситиране

Проведени са експерименти по елиситиране на L. aestivum shoot линия G 80 с използване на два елиситора – метил жасмонат и жасмонова киселина.

3.1. Влияние на вида на елиситора върху развитието на L. aestivum shoot линия G

80 и добива на галантамин

Добавянето на метил жасмонатът и жасмоновата киселина в началото на

експоненциалната фаза (28-ия ден) на развитие на културата стимулира синтеза на биомаса

(Фиг. 12 А). 24 h след добавянето на 25µМ метил жасмонат и жасмонова киселина

26

количеството биомаса се увеличава спрямо контролната неелиситирана проба съответно 1.32

пъти (2.47 g/колба) за метил жасмоната и 1.26 пъти (2.36 g/колба) за жасмоновата киселина

(Фиг. 12 А). Независимо от началното увеличение на биомасата на 29-ия ден, до 35-ия ден на

култивиране количеството натрупана биомаса не се променя и е съизмеримо с това при

контролните проби – 2.50 g/колба (Фиг. 12 А).

Ден на култивиранеАкумулирана

суха биомаса, g

/колба

0

1

2

3

4

5Контрола

25µМ МЖ

25µМ ЖК

28 29 32 35 42

А

Ден на култивиране


µg/колба

0

50

100

150

200

250

300

350

400Контрола

25µM МЖ

25µM ЖК

28 29 32 35 42

Б

Ден на култивиранеТирозин декарбоксилаза

, U

/g СВ

0

5

10

15

20

25

30Контрола

25µM МЖ

25µM ЖК

28 29 32 35 42

В

Ден на култивиранеФенилаланин

амоняк лиаза

, U

/g СВ

0

50

100

150

200

250

300Контрола

25µM МЖ

25µM ЖК

28 29 32 35 42

Г

Фиг. 12. Динамика на развитие(А), биосинтез на галантамин (Б) и изменение на ензимните активности на тирозин декарбокслазата (В) и фенилаланин амоняк лиазата (Г) при елиситиране с

25µM метил жасмонат и жасмонова киселина, добавени на 28-ия ден от култивирането на L.

aestivum shoot линия G 80. Представените резултати са средни стойности ± SD.

Забележка: Представените резултати по отношение на алкалоидните добиви представляват

общото количество (вътреклетъчни+външноклетъчни) алкалоиди, биосинтезирани в работния

обем от 200 ml.

Максимални добиви от галантамин се получават при елиситиране с жасмонова

киселина, прибавена на 28-ия ден от началото на култивирането. Максимални количества

галантамин 226.9 µg/колба се отчитат 168 h след прибавяне на елиситора. Това е 1.36 пъти

повече в сравнение с контролата (Фиг. 12 Б).

Добавяне на 25µМ метил жасмонат и жасмонова киселина в началото на стационарната

фаза (35-ия ден) не повлиява биосинтеза на галантамин (Фиг. 13 Б).

В заключение резултатите от проведените експерименти показват, че жасмоновата

киселина е по-подходящият елиситор. Най-висок добив (226 µg/колба) от галантамин се получава 168 h след добавянето, по време на експоненциалната фаза на развитие (28-ия ден от

началото на култивиране) на биологичната система. Фенилаланин амоняк лиазата и тирозин декарбоксилазата са двете ключови ензимни

активности, катализиращи първото стъпало от метаболитния път на Amaryllidaceae

алкалоидите, водещи до двата предшественика – канелената киселина и тирамина. Метил

жасмонатът, добавен в началото на експоненциалната фаза (28-ия ден), индуцира експресията

на двата ензима в първите 24 h след добавянето му – над 2 пъти за тирозин декарбоксилазата и

над 3.2 пъти за фенилаланин амоняк лиазата (Фиг. 12 В и Г). Това е и първопричината за по-

високия добив от изследваните алкалоиди 24 h след прибавянето на елиситора (Фиг. 12 Б). В

процеса на култивиране в следващите 72 h (32-ия ден) активността на тирозин

декарбоксилазата в елиситираните проби силно намалява от 12.5 U/g СБ до 4.9 U/g СБ, което е и 2 пъти по-ниско в сравнение с контролата (32-ия ден) (Фиг. 12 В), а при фенилаланин амоняк

лиазата е налице засилена индукция, като повишена активност се отчита до 168-ия h след

27

добавянето на елиситора (35-ия ден) (Фиг. 12 Г). При елиситиране с жасмонова киселина

тирозин декарбоксилазата се индуцира и увеличава активността си спрямо контролата до 168-

ия h от добавянето на елиситора. Максимална активност 17.7 U/g СБ се отчита на 96-ия h и тя е около 2 пъти по-висока в сравнение с контролата (Фиг. 12 В). Елиситирането с жасмонова

киселина не повлиява активността на фенилаланин амоняк лиазата до 96-ия h след добавянето

на елиситора, но между 96-ия и 168-ия h активността се покачва около 1.9 пъти спрямо

контролата (Фиг. 12 Г). Този факт обяснява повишените добиви от изследваните алкалоиди при

елиситирането с жасмонова киселина 168 h след добавянето й (Фиг. 12 Б).



/колба

0

1

2

3

4

5Контрола

25µМ МЖ

25µМ ЖК

35 36 39 42

А



µg

/колба

0

50

100

150

200

250

300

350

400Контрола

25µM МЖ

25µМ ЖК

35 36 39 42

Б

Ден на култивиранеТирозин декарбоксилсза

, U

/g СБ

0

5

10

15

20

25

30

35Контрола

25µM МЖ

25µM ЖК

35 36 39 42

В



, U

/g СБ

0

50

100

150

200

250

300Контрола

25µM МЖ

25µM ЖК

35 36 39 42

Г

Фиг. 13. Динамика на развитие (А), биосинтез на галантамин (Б) и изменение на ензимните

активности на тирозин декарбоксилазата (В) и фенилаланин амоняк лиазата (В)при елиситиране

с 25µM метил жасмонат и жасмонова киселина, добавени на 35-ия ден от култивирането на L.

aestivum shoot линия G 80. Представените резултати са средни стойности ± SD .




Получените резултати относно изменението на активноста на ключовите ензими от

биосинтетичния път на Amaryllidaceae алкалоидите показват комплексното им влияние върху

изследваните биохимични процеси.

Като част от клетъчния отговор е анализирано влиянието на елиситора върху

биосинтеза на фенолните киселини, които участват в защитните системи на растителната

клетка (Фиг. 14). Използването на метил жасмоната като елиситор, добавен в началото на

експоненциалната фаза (28-ия ден), води до 5-кратно увеличение в концентрациите на

канелената киселина спрямо контролната неелиситирана проба (от 2.6 µg/колба до 13.9

µg/колба) през първите 24 h след елиситирането, дължащо се на трикратното увеличение в

активността на фенилаланин амоняк лиазата (Фиг. 14 А и Фиг. 12 Г) през този период.

Концентрациите на този прекурсор остават по-високи от контролата до 168-ия h след

добавянето на елиситора. Следващата киселина в метаболитния път – р-кумаровата, увеличава

концентрациите си между 24-ия и 96-ия 1.3 пъти (от 39.6 µg/колба до 52.0 µg/колба) (Фиг. 14 Б).

Тези високи концентрации от р-кумарова киселина водят до увеличение на концентрациите на

следващата киселина в метаболитния път – кафеената. Тя увеличава концентрациите си между

96-ия и 168-ия h след добавяне на елиситора 3.7 пъти спрямо контролната проба (от 42.3

µg/колба до 157.9 µg/колба) (Фиг. 14 В). Феруловата киселина, от своя страна, увеличава

концентрацията си до 168-ия h след началото на елиситирането над 9 пъти (от 22.8 µg/колба до

28

205.9 µg/колба) (Фиг. 14 Г). Феруловата киселина е предшественик на ванилиновата,

синаповата и сиринголовата киселина. С този факт може да се обясни увеличението в

концентрациите при синаповата киселина (1.36 пъти) и сиринголовата киселина (2 пъти) (Фиг. 14 Д и З) спрямо контролата на 168-ия h. Увеличение в концентрациите при 168-ия h след

елиситирането се наблюдава и при деривата на кафеената киселина – хлорогеновата киселина

(над 2.3 пъти) (Фиг. 14 Ж), и при деривата на канелената киселина – 2-хидроксибензоената

(салицилова) киселина (1.7 пъти) (Фиг. 14 И). Тези резултати ни показват, че добавянето на

метил жасмонат в експоненциална фаза (28-ия ден от началото на култивиране) води до

координирана индукция на ензимите от фенилпропаноидния метаболитен път, като в най-

голяма степен се индуцират ензимите, участващи в биосинтеза на ферулова киселина: (C4H)

канелена киселина 4-хидроксилаза, (C3H) р-кумарат 3-хидроксилаза и (COMT)-кафеолил О-

метилтрансфераза от фенилпропаноидния път. Метаболитният отговор в биосинтеза на фенолни киселини при добавяне на метил

жасмоната в началото на стационарната фаза (35-ия ден) е много по-слаб. Наблюдава се увеличение в концентрациите само на р-кумаровата киселина (2.8 пъти на 168-ия h) и

салициловата киселина (1.6 пъти на 96-ия h). Добавянето на метил жасмонат на 35-ия ден

индуцира само ензимите в началото на фенилпропаноидния метаболитен път – (C4H) кафеена

киселина 4-хидриксилаза и BA2H бензоена киселина 2-хидроксилаза. Анализът на резултатите при елиситиране с жасмонова киселина показват, че добавянето й в експоненциална фаза (28-ия ден) оказва много слаб ефект върху биосинтеза на

фенолна киселина поради слабата индукция на фенилаланин амоняк лиазата в първите 96 h

след добавянето на елиситора (Фиг. 14). При следващото увеличение на активността на

фенилаланин амоняк лиазата, между 96-ия и 168-ия h, се увеличават и концентрациите на

канелената киселина (2.6 пъти на 168-ия h). Другите изследвани киселини са в по-ниски или

сравними с контролата концентрации. Елиситирането с жасмонова киселина на 35-ия ден от

култивирането води до по-високи концентрации на биосинтезираната канелена киселина в

първите 24 h (2.5 пъти) и тази тенденция се запазва до 168-ия h. През първите 24 h се повишават и концентрациите на биосинтезираната ванилинова киселина – 1.8 пъти, и синапова

киселина – 1.14 пъти. Синаповата киселина увеличава значително (2.8 пъти) концентрациите си

между 24-ия и 96-ия h.

Сравнителният анализ на получените резултати за влиянието на елиситора върху

цялостния вторичен метаболизъм на L. aestivum shoot линия G 80 показва, че при елиситиране с жасмонова киселина както в началото на експоненциалната фаза (28-ия ден), така и в началото

на стационарната фаза (35-ия ден) се индуцира активността преимуществено на тирозин

декарбоксилазата и в по-малка степен на фенилаланин амоняк лиазата. Това води до

увеличение на концентрациите на биосинтезираните алкалоиди, респективно на галантамина

(Фиг. 15 Б). Метил жасмонатът, от своя страна, индуцира преимуществено транскрипцията на

фенилаланин амоняк лиазата в проследения период и в по-малка степен на тирозин

декарбоксилазата. Това води до биосинтез предимно на фенолни киселини, защото канелената

киселина се насочва към фенилпропаноидния метаболитен път (Фиг. 15 А). Механизмите за

генна регулация при двата ензима не са свързани, защото се повлияват по различен начин от

различните елиситори. Необходими са следващи задълбочени изследвания за изясняване на

взаимодействията на жасмоновата киселина и метил жасмоната със сигналната система, включваща се в отговор на стресови състояния в растителната клетка – калций/калмодолин и

протеиновото фосфорилиране/дефосфорилиране, и индуцирането, и експресията на тирозин

декарбоксилазните и фенилаланин амоняк лиазните гени, така също и на другите гени,

участващи в биосинтетичния път на Amaryllidaceae алкалоидите. В заключение жасмоновата киселина е по-подходящият елиситор за индуциране на

биосинтеза на галантамин. Най-подходящото време на добавянето му е в началото на

експоненциалната фаза (28-ия ден) при продължителност на последващия период на

култивиране от 168 h или до началото на стационарната фаза (35-ия ден), защото при този

режим се отчита и максимално увеличение (1.36 пъти) в концентрациите на галантамина

спрямо контролата. Това е вследствие на увеличена експресия предимно на гена на тирозин

декарбоксилазата, водещ до биосинтез на по-високи концентрации тирамин.

29


Канелена

киселина,

µg

/колба

0

5

10

15

20Контрола

25µM МЖ

25µM ЖК

28 29 32 35 42

A


р-Кумарова киселина,

µg/колба

0

20

40

60

80

100Контрола

25µM МЖ

25µM ЖК

28 29 32 35 42

Б


Кафеена киселина,

µg

/колба

0

50

100

150

200

250Контрола

25µM МЖ

25µM ЖК

28 29 32 35 42

В


Ферулова

киселина,

µg/колба

0

50

100

150

200

250

300Контрола

25µM МЖ

25µM ЖК

28 29 32 35 42

Г


Синапова киселина,

µg

/колба

0

50

100

150

200

250

300

350

400Контрола

25µM МЖ

25µM ЖК

28 29 32 35 42

Д


Ванилинова

киселина,

µg/колба

0

50

100

150

200Контрола

25µM МЖ

25µM ЖК

28 29 32 35 42

Е

Ден на култивиранеХлорогенова

киселина,

µg/колба

0

50

100

150

200

250

300Контрола

25µM МЖ

25µM ЖК

28 29 32 35 42

Ж

Ден на култивиранеСиринголова

киселина,

µg/колба

0

20

40

60

80

100Контрола

25µМ МЖ

25µМ ЖК

28 29 32 35 42

З

Ден на култивиране2-ОН

Бензоена

киселина,

µg/колба

0

100

200

300

400

500

600Контрола

25µМ МЖ

25µМ ЖК

28 29 32 35 42

И

Фиг. 14. Динамика на биосинтез на фенолни киселини при елиситиране с 25µM метил жасмонат и

жасмонова киселина, добавени на 28-ия ден от култивирането на L. aestivum shoot линия G 80.

Представените резултати са средни стойности ± SD.

Фиг. 15. Влияние на вида елиситор върху вторичния метаболизъм на L. aestivum shoot линия G 80.

Метил жасмонат (А), жасмонова киселина (Б).

3.2. Влияние на концентрацията на жасмоновата киселина върху развитието на L.

aestivum shoot линия G 80 и добива на галантамин

Повишените концентрации на жасмоновата киселина (от 25 µМ до 70 µМ) не оказват

влияние върху биосинтеза на биомаса при прибавяне на елиситора в началото на

експоненциалната фаза (28-ия ден) (Фиг. 16 А). Обаче при добавяне на елиситора в началото на

стационарната фаза на развитие културата се потиска (Фиг. 17 А).

NH2

COOH

COOH

COOH

OH

NH2

COOH

OH

NH2

OH

ФенилаланинТирозин

Канелена киселина Тирамин

р- Кумарова киселина

Фенолни киселина Amaryllidaceae алкалоиди

Норбеладин

NH

OH

OH

MeO

NH2

COOH

COOH

COOH

OH

NH2

COOH

OH

NH2

OH

ФенилаланинТирозин

Канелена киселина Тирамин

р- Кумарова киселина

Фенолни киселина Amaryllidaceae алкалоиди

Норбеладин

NH

OH

OH

MeO

ФАЛ ФАЛ ТДК ТДК

А Б

30

Максимален добив от галантамин (287.9 µg/колба) се постига 168 h след елиситиране на

L. aestivum shoot линия G 80 с 40µМ жасмонова киселина, добавена в началото на

експоненциалната фаза (28-ия ден) (Фиг. 16 Б). Това е 1.72 пъти по-висок добив от този при

контролния вариант. Този положителен резултат се дължи на повишената активност (2 пъти) на

тирозин декарбоксилазата 96 h след добавянето на елиситора (Фиг. 16 В). Високата експресия

на тирозин декарбоксилазата позволява биосинтеза на достатъчни количества тирамин, което,

от своя страна, води до увеличен биосинтез на алкалоидите. Повишаването на ензимната

активност (2 пъти) спрямо контролата е в синхрон със степента на повишаване на добива от

галантамин – 1.72. Активността на фенилаланин амоняк лиазата при елиситиране с 40 µМ

жасмонова киселина се покачва 2.2 пъти през първите 24 h спрямо контролата, но в

продължение на култивационния процес до 168-ия h активността спада до нива, сравними с контролната неелиситирана проба (около 65-75 U/g СБ) (Фиг.16 Г).

Добавянето на 40µМ жасмонова киселина в началото на стационарната фаза (35-ия ден)

индуцира синтеза на галантамин и неговите концентрации се увеличават 1.6 пъти (257.7

µg/колба) след 24 h култивиране спрямо контролата (160.8 µg/колба) (Фиг. 17 Б). Този добив

обаче е 11% по-нисък от добива, получен при прибавянето на 40 µМ жасмонова киселина на 28-

ия ден от началото на култивиране – 287.9 µg/колба. При всички други изследвани

концентрации на жасмонова киселина и периоди на култивиране количеството на

биосинтезирания галантамин е сравнимо или по-ниско от това на контролните неелиситирани

проби.

В заключение 40 µМ жасмонова киселина, индуцираща в максимална степен биосинтеза

на галантамин – 287.9 µg/колба (1.72 пъти повече спрямо контролата), когато е добавена в

началото на експоненциалната фаза на развитие (28-ия ден), периодът на култивиране е 168 h.

При тази концентрация и време на добавяне на елиситора тирозин декарбоксилазата се експресира в максимална степен и нейната активност е най-висока (19.0 U/g СБ), което, от своя

страна, обезпечава и насочването на вторичния метаболизъм към биосинтез на алкалоиди.



/колба

0

1

2

3

4

5Контрола

25µМ МЖ

40µМ ЖК

70µМ ЖК

28 29 32 35 42

А



µg

/колба

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500Контрола

25µM ЖК

40µM ЖК

70µM ЖК

28 29 32 35 42

Б

Ден на култивиранеТирозин

декарбоксилаза

, U

/g СБ

0

5

10

15

20

25

30Контрола

25µM ЖК

40µМ ЖК

70µМ ЖК

28 29 32 35 42

В



, U

/g СБ

0

50

100

150

200

250

300Контрола

25µM ЖК

40µM ЖК

70µM ЖК

28 29 32 35 42

Г


активности на тирозин декарбоксилазата (В) и фенилаланин амоняк лиазата (Г) при елиситиране

с 25µМ, 40µМ и 70µМ жасмонова киселина, добавена на 28-ия ден от култивирането на L. aestivum

shoot линия G 80. Представените резултати са средни стойности ± SD.




31



/колба

0

1

2

3

4

5Контрола

25µМ ЖК

40µМ ЖК

70µМ ЖК

35 36 39 42

А



µg

/колба

0

50

100

150

200

250

300

350

400Контрола

25µM ЖК

40µМ ЖК

70µМ ЖК

35 36 39 42

Б

Ден на култивиранеТирозин

декарбоксилаза

, U

/g СБ

0

5

10

15

20

25

30

35

40Контрола

25µM ЖК

40µM ЖК

70µM ЖК

35 36 39 42

В



, U

/g СБ

0

50

100

150

200

250

300Контрола

25µM ЖК

40µM ЖК

70µM ЖК

35 36 39 42

Г


активности на тирозин декарбоксилазата (В) и фенилаланин амоняк лиазата (Г) при елиситиране

с 25µМ, 40µМ и 70µМ жасмонова киселина, добавена на 35-ия ден от култивирането на L. aestivum

shoot линия G 80. Представените резултати са средни стойности ± SD.




3.3. Алкалоиден профил на L. aestivum shoot линия G 80, елиситирана с 40µМ жасмонова киселина, добавена в началото на експоненциалната фаза на развитие

Чрез газхроматографски–масспектрален анализ са идентифицирани 15 Amaryllidaceae

алкалоида, 6 от които са в измерими количества (над 1% от общия йонен ток): хорденин (1),

галантамин (3), нарведин (6), 11,12 -дидехидроанхидроликорин (11), хамаин (12) и ликорин (14)

(Табл. 17). Сигналът на галантамина (3) е в най-голям процент (между 50%т–70% от общия

йонен ток). Относителното количество галантамин при елиситираната с 40µМ жасмонова

киселина намалява във вътреклетъчните и външноклетъчните алкалоидни смеси. При

вътреклетъчните количеството намалява с 23%, а при външноклетъчните – с 13% (Табл. 17).

Ликоринът (14) е вторият алкалоид с високи относителни концентрации. За разлика от

галантамина, неговите относителни концентрации при елиситираната проба се повишават с над

25% както във вътреклетъчните, така и във външноклетъчните алкалоидни екстракти (Табл.

17). Хамаинът (12) – третият алкалоид, увеличава в значителна степен своите относителни

концентрации при елиситираната проба. При алкалоидните екстракти от биомасата

относителните му концентрации се увеличават 3.5 пъти спрямо контролата, а при алкалоидите, екстрахирани от културалната течност, се повишава с 50% (Табл. 36). Протоалкалоидът

хорденин (1) намалява относителните си концентрации при елиситираните проби във

вътреклетъчните алкалоидни екстракти от 3.0% от общия йонен ток до 1.5% от общия йонен

ток, но остава практически непроменен в концентрациите си в алкалоидните екстракти от

културалната течност. Друг алкалоид, увеличаващ концентрациите си в елиситираните проби, е нарвединът (6). Във вътреклетъчните алкалоиди концентрациите му се увеличават с 60%, а при

външноклетъчните алкалоиди съдържанието не се променя. Следва да се отбележи, че при

миноритарните алкалоиди настъпват съществени промени. Алкалоидите N-деметилгалантамин

(4), витатин (5), 8-О-деметилмаритидин (9) и панкратинин С (10) не са идентифицирани във

вътреклетъчните алкалоидни екстракти на контролата, но се идентифицират в алкалоидните

32

екстракти от биомасата на елиситираните проби. Алкалоидите 1-ацетил-9-деметилплувин (8) и

стернбергин (15) се идентифицират във външноклетъчните алкалоидни екстракти на

елиситираните проби, но не се откриват в екстрактите, получени от контролата. Тези резултати

показват, че добавянето на 40µМ жасмонова киселина като елиситор не само индуцира и

пренасочва цялостния вторичен метаболизъм на клетката към биосинтеза на алкалоиди, но и

променя съотношението на отделните алкалоиди във вътреклетъчните и външноклетъчните алкалоидни екстракти.

Табл. 36. Алкалоиден профил на L. aestivum shoot линия G 80 168 h след елиситиране с 40µМ

жасмонова киселина, добавена в началото на експоненциалната фаза на развитие.

Контрола Елиситирана проба Алкалоид Rt M+

БМ КТ БМ КТ

Хорденин (1) 7.55 165 3.0 ±0.6 0.2 1.5 ±0.1 0.3 ±0.1

Трисферидин (2) 18.51 223 0.2 - 0.3 ±0.1 -

Галантамин (3) 20.49 287 67.3 ±3.8 73.3 ±2.6 51.6 ±4.5 63.3 ±2.2

N-Деметилгалантамин (4) 21.12 273 - 0.4 ±0.2 0.1 0.2 ±0.1

Виратин (5) 21.48 271 - 0.2 ±0.1 0.3 ±0.1 0.5

Нарведин (6) 21.66 285 2.6 ±0.4 2.7 ±0.1 4.2 ±0.4 2.6

Анхидроликорин (7) 21.91 251 0.4 0.7 ±0.3 0.7 ±0.4 1.2 ±0.3

1-Ацетил-9-деметилплувин (8) 21.93 331 - - - 0.5 ±0.4

8-O-Деметилмаритидин (9) 22.06 273 - - 0.6 ±0.1 -

Панкратинин C (10) 23.14 287 - 0.1 0.3 ±0.2 0.2

11,12-Дидехидроанхидроликорин (11) 23.48 249 1.4 ±0.2 0.7 ±0.2 1.6 ±0.1 0.7 ±0.1

Хамаин (12) 24.94 287 2.4 ±1.0 0.6 ±0.1 8.4 ±2.5 0.9 ±0.7

Стернбергин (13) 25.07 331 - - - 0.9 ±0.8

Ликорин (14) 25.53 287 22.6 ±1.7 21.0 ±2.2 30.3 ±5.2 28.5 ±2.0

N-Формилгалантамин (15) 26.51 301 0.1 0.1 0.1 0.2 ±0.1

В заключение при изследване на влиянието на два абиотични елиситора – метил

жасмонат и жасмонова киселина – върху вторичния метаболизъм на L. aestivum shoot линия G

80 е установено, че метил жасмонатът индуцира преимуществено ензима фенилаланин амоняк

лиаза и насочва метаболизма към бииосинтез на фенолни киселини, а жасмоновата киселина

индуцира преимуществено тирозин декарбоксилаза и пренасочва вторичния метаболизъм на

растителните клетки към биосинтез на Amaryllidaceae алкалоиди. Максимално индуциране на

галантаминов биосинтез е постигнато 168 h след добавяне на 40µМ жасмонова киселина в

експоненциалната фаза на растеж на културата (28-ия ден) – 1.72 пъти по-висок добив в

сравнение с контролата. Анализът на алкалоидния профил на елиситираните проби показа

индукция в биосинтеза на миноритарните алкалоиди както в биомасата, така и в културалната

течност. При елиситирането с жасмонова киселина се увеличават в голяма степен алкалоидите с para-para' фенол-окислителна структура – хемантаминовият тип. Тези резултати показват, че елиситирането, като част от цялостен технологичен процес, е преспективна стратегия за

увеличаване на добивите на галантамин от shoot култури на L. aestivum.

4. Селекция на високопродуктивни линии

Селекцията на високопродуктивни линии е важен етап от разработването на

технологичен процес за биосинтез на биологично активни вещества от растителни in vitro

системи. Паралелно с това от съществено значение е разработването на ефективни (евтини)

процеси за изолиране и пречистване на целевите метаболити. L. aestivum shoot линия G 80,

култивирана в различните култивационни системи (колонен биореактор и култивационна

система с временно разбъркване), показа добри растежни и биосинтетични характеристики, но

освен галантамин, културата биосинтезира и големи количества съпътстващи алкалоиди.

Количеството биосинтезиран галантамин във вътреклетъчните алкалоидни екстракти е 29.5%

от общия йонен ток и 45.0 % от общия йонен ток при външноклетъчните алкалоидни екстракти.

Тези ниски относителни количества от целевия продукт биха оскъпили значително процеса на

изолиране и пречистване на галантамина. На тази база насочихме вниманието си към селекция

33

на нови shoot тип линии от L. aestivum, които, от една страна, да биосинтезират

преимуществено галантамин, а, от друга, целевият метаболит да е в стопанско значими

количества. За получаването на новите линии е използвана пасивна селекция чрез трансфер на

недиференцирана калусна култура в среда за редиференциация на тъкани и следващ анализ на

получените линии.

Shoot културите са получени чрез прехвърляне на калусна линия LaR 67 в среда за

диференциация. Културите се субкултивират през 28-дневен период. От формирания

ембриогенен калус се отделят прорастъци и се прехвърлят в нова хранителна среда. По този

начин са получени 160 нови линии. В процеса на култивиране от новополучените 160 линии

108 се заразиха, 40 некротизираха и 12 линии се развиват добре – LaR 19, LaR 26, LaR 28, LaR

29, LaR 35, LaR 36, LaR 38, LaR 40, LaR, 86, LaR 92, LaR 99 и LaR 128.

Новополучените 12 линии бяха подложени на първоначален скрининг за определяне на

растежните и биосинтетичните им характеристики. Растежният индекс на всички новополучени

линии, освен LaR 28, е по-нисък от контролната линия G 80. Растежният индекс на линия LaR

28 (2.0) е и най-високият в сравнение с другите новоселекционирани линии и същевременно

съвпада с този на контролната линия G 80.

Новоселекционираните линии биосинтезират преимуществено галантамин.

Количествата акумулиран галантамин при всички новополучени линии са значително по-

високи в сравнение с контролната L. aestivum G 80 (76 µg/g СБ). Най-общо новополучените линии могат да се разделят на четири групи според количеството синтезиран галантамин в

биомасата: 1. Над 400 µg/g СБ – LaR 28 (449 µg/g СБ) и LaR 86 (420 µg/g СБ).

2. 300 ÷ 400 µg/g СБ – LaR 19 (328 µg/g СБ), LaR 29 (381 µg/g СБ), LaR 35 (358 µg/g СБ)

и LaR 36 (350 µg/g СБ).

3. 200 ÷ 300 µg/g СБ – LaR 38 (288 µg/g СБ), LaR 92 (282 µg/g СБ), LaR 99 (230 µg/g СБ)

и LaR 128 (259 µg/g СБ).

4. 100 ÷ 200 µg/g СБ – LaR 26 (135 µg/g СБ) и LaR 40 (186 µg/g СБ). Линиите LaR 28 и LaR 86 биосинтезират между 5.5–6.0 пъти повече галантамин от

линия L. aestivum G 80.

Първичният скрининг на новите линии LaR показва, че те преимуществено

биосинтезират галантамин и норгалантамин (галантаминов тип алкалоиди). Като най-

високопродуктивна линия се определя LaR 28, защото освен високия си биосинтетичен

потенциал тя има и добри растежни характеристики, сравними с контролната линия G 80,

култивирана твърдофазно.

Стабилността на биосинтетичните характеристики на продуцентите на биологично

активни вещества е от особено значение за разработването на ефективни процеси за

получаването им. В тази връзка проследихме растежните и биосинтетичните характеристики на

новоселекционираните линии в рамките на дванадесетмесечен период. За целта бяха подбрани

за изследване линии, показали най-висок растежен индекс (над 1) и висок биосинтетичен

потенциал (LaR 26, LaR 28, LaR 38, LaR 86 и LaR 99) (Фиг. 18). Периодите на анализ съвпадат и

с годишните сезони – пролет (3), лято (6), есен (9) и зима (12). Резултатите показват стабилност

в растежния индекс на културите в проследения 12-месечен период (Фиг. 18 А). Линия LaR 28

има най-висок растежен индекс (1.42 ±0.4), следвана от LaR 26 (1.35 ±0.1), LaR 86 (1.30 ±0.1) и

LaR 99 (1.30 ±0.1). LaR 38 има най-нисък растежен индекс (1.05 ±0.1) от изследваните линии.

Новоселекционираните линии показват и стабилни биосинтетични характеристики по

отношение на галантамина. Стандартните отклонения при отделните линии са между 20 и 70

µg/g СБ, a коефициентът на вариабилност варира от 10 до 30% (Фиг. 19). Следва да се отбележи, че през пролетния (3) и зимния (12) сезон културите биосинтезират повече галантамин в сравнение с летния (6) сезон. Това е свързано с годишния цикъл, през който

преминават интактните растения в естествените си местообитания.

34

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5


Линия

ПериодLaR 26

LaR 28LaR 38

LaR 86LaR 99

36

912

A

0

100

200

300

400

500

600


, µ

g/g

CБ

Линия

ПериодLaR 26

LaR 28LaR 38

LaR 86LaR 99

36

912

Б

Фиг. 18. Растежни индекси (А) и количества акумулиран галантамин (Б) от новополучените линии

L. aestivum за период от 12 месеца.

Линия LaR

Алкалоид

, µ

g/g

CБ

0

100

200

300

400

500

600

700Галантамин


Ликорин

26 28 38 86 99

*10.4

*38.9

*26.8

*18.6*34.8

Фиг. 19. Средни стойности на биосинтезираните алкалоиди през проследения дванадесетмесечен

период. *Коефициент на вариабилност (CV%).

Анализът на получените резултати показва, че линиите LaR 28, LaR 86 и LaR 99

биосинтезират в приблизително равни количества галантамин (между 310 и 380 µg/g СБ). От тях LaR 86 биосинтезира най-големи количества галантамин (379.5 µg/g СБ), следвана от LaR

28 (332.3 µg/g СБ) и LaR 99 (310.2 µg/g СБ). Линиите LaR 26 и LaR 38 биосинтезират

значително по-малко галантамин – 273.0 µg/g СБ за LaR 38 и 126.2 µg/g СБ за LaR 26 (Фиг. 19).

Новоселекционираните линии биосинтезират норгалантамин в значителни количества. Между

отделните линии се наблюдава много малка разлика в биосинтеза на норгалантамин.

Натрупаните количества са между 140 и 180 µg/g СБ. Най-голямо количество е отчетено при

LaR 99 – 183.8 µg/g СБ.

В заключение новоселекционираните линии показват стабилен растежен и

биосинтетичен потенциал във времето при твърдофазно култивиране. Най-високопродуктивни

линии по отношение на биосинтеза на галантамин са линиите LaR 86 (379.5 µg/g СБ) и LaR 28

(332.3 µg/g СБ). Всички линии биосинтезират ликорин в незначителни количества. На база на

получените резултати линии LaR 26, LaR 28, LaR 38, LaR 86, LaR и LaR 99 са определени за

следващата стъпка на селекция – култивиране в модифициран колонен биореактор с вътрешни

секции.

4.1. Култивиране на новоселекционираните линии в колонен биореактор с вътрешни

секции

Биосинтетичният капацитет на новоселекционираните линии е оценен и при култивиране в колонен биореактор в оптимални условия за биосинтез на галантамин –

температура на култивиране 22°С и дебит на входящия въздух 18 L/(L.h). Постигнатите резултати по отношение на биосинтеза на биомаса и растежните характеристики на

35

новоселекционираните линии са представени на Табл. 18. От новоселекционираните линии

най-добър растежен индекс (2.7) и най-много биомаса (13.9 g/L) натрупва линия LaR 38. Това

количество биосинтезирана биомаса е около 1.5 пъти по-малко от количеството,

биосинтезирано в контролната линия

Табл. 38. Акумулирана суха биомаса и растежни индекси, получени след 35-дневно култивиране на

новоселекционираните shoot тип линии на L. aestivum в колонен биореактор с вътрешни секции.

Линия Акумулирана суха биомаса,

g/L


LaR 26 10.2 1.6

LaR 28 9.8 1.5

LaR 38 13.9 2.7

LaR 99 10.5 1.7

G 80 20.8 4.8

Количествата биосинтезиран галантамин от новоселекционираните линии са значително

по-големи спрямо контролната линия. Максимално количество галантамин биосинтезира линия

LaR 28 – 3.3 mg/L (1.8 mg/L вътреклетъчен и 1.5 mg/L външноклетъчен). Това количество

биосинтезиран галантамин е 1.94 пъти повече в сравнение с контролната линия G 80 – 1.7 mg/L (1.0 mg/L вътреклетъчен и 0.7 mg/L външноклетъчен) (Фиг 20 А).

Линия LaR

Галантамин, m

g/L

0

1

2

3


ВъншноклетъченОбщо количество

28 38 99 G 8026

A

Линия LaR

Норгалантамин,

mg/L

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9




28 38 99 G 8026

Б

Линия LaR

Ликорин, m

g/L

0123456789

101112

Вътреклетъчен



28 38 99 G 8026

В

Фиг. 20. Биосинтезирани количества галантамин (А), норгалантамин (Б) и ликорин (В) от новоселекционираните линии на L. aestivum, култивирани в колонен биореактор с вътрешни секции.

Чрез газхроматографските масспектрални анализи на вътреклетъчните и

външноклетъчните алкалоидни екстракти на новоселектираните линии, култивирани в колонен

биореактор, са идентифицирани 13 алкалоида (Табл. 19). Сигналът на галантамина (3) е в най-

голям процент от общия йонен ток както в алкалоидите, екстрахирани от биомасата, така и при

алкалоидите, екстрахирани от културалната течност. Относителното съдържание на галантамин

(3) в новоселекционираните линии е между 2.6 и 2.9 пъти (между 70%–80% от общия йонен

ток) по-високо във вътреклетъчните и около 2 пъти по-високо (между 87%–93% от общия

йонен ток) при външноклетъчните алкалоидни екстракти в сравнение с контролната линия G

80. Максимално относително съдържание на галантатамин във вътреклетъчните алкалоидни

смеси 87.2% от общия йонен ток се отчита при LaR 38, следвана от LaR 26 (81.2% от общия

йонен ток) и LaR 28 (78.8% от общия йонен ток), а най-ниско съдържание се отчита при LaR 99

(70.8% от общия йонен ток). Максимално относително съдържание на галантамин във

външноклетъчните алкалоидни смеси биосинтезира LaR 38 (92.7% от общия йонен ток),

следвана от LaR 28 (92.0% от общия йонен ток) и LaR 26 (91.7% от общия йонен ток), а най-

ниско относително количество галантамин във външноклетъчните екстракти синтезира LaR 99

(87.3% от общия йонен ток). Прекият предшественик на галантамина – норгалантаминът (4), в новоселекционираните линии е в пъти по-високи относителни концентрации при

вътреклетъчните и външноклетъчните алкалоиди. Максимално количество норгалантамин в

алкалоидите от биомасата има LaR 99 (6.0% от общия йонен ток), следван от LaR 28 (3.2% от

общия йонен ток). Големи относителни концентрации от норгалантамин при

външноклетъчните алкалоиди се отчитат също при линии LaR 99 (4.6% от общия йонен ток) и

LaR 38 (2.7% от общия йонен ток) (Табл. 19).

36

Табл. 19. Алкалоиден профил на новоселекционираните shoot тип линии на L. aestivum, култивирани в колонен биореактор с вътрешни секции.

Контрола Новоселекционирани линии

G 80 LaR 26 LaR 28 LaR 38 LaR 99

Алкалоид Rt M+

БМ КТ БМ КТ БМ КТ БМ КТ БМ КТ

Апогалантамин (1) - - 1.0 0.7 сл 0.1 сл 0.1 сл сл

Трисферидин (2) 18.51 223 - - 0.2 0.1 0.1 сл 0.1 - 0.2 -

Галантамин (3) 20.49 287 29.5 ±6.5 45.0 ±6.1 81.2 91.9 78.8 92.0 87.2 92.7 70.8 87.3

N- деметилгалантамин (4) 21.12 273 1.0 ±0.3 0.1 2.3 0.1 3.2 сл 2.6 2.7 6.0 4.6

Витатин (5) 21.48 271 сл 0.1 0.5 2.2 0.2 1.5 0.2 0.3 1.4 1.1

Нарведин (6) 21.66 285 0.6 1.2 ±0.2 0.1 2.5 0.4 4.7 0.2 1.7 0.8 2.7

Анхидроликорин (7) 21.91 251 0.6 ±0.3 1.3 ±0.1 - - - - - - - -

6-метоксиликоренин (8) 21.93 331 0.2 ±0.1 0.2 - - - - - - - -

8-O-деметилмаритидин (9) 22.06 273 1.0 ±0.2 - 10.4 0.6 12.9 - 3.1 - 6.8 0.1

Норплувинацетат (10) 22.26 315 сл сл - - 0.1 - - - - -

Ацетилкаранин (11) 22.32 313 сл 0.1 - - - - - - - -

Плувин (12) 22.98 287 - - - - - - - - - -

Панкратинин C (13) 23.14 287 0.1 сл 0.2 0.2 0.1 0.1 - - 0.2 0.1

11, 12-дидехидроанхидроликорин (14) 23.48 249 0.1 0.1 0.2 0.1 - 0.1 сл 0.1 0.2 сл

Хемантамин (15) 23.30 301 - сл - - - - - - - -

Хамаин (16) 24.94 287 2.6 ±0.1 1.8 ±0.4 3.2 1.3 3.2 1.0 5.8 2.1 12.0 3.0

Стернбергин (17) 25.07 331 - 0.1 - - - - - - - -

Ликорин (18) 25.53 287 64.2 ±7.1 49.8 ±7.0 0.5 0.3 0.6 0.1 0.3 - - -

N-формилноргалантамин (19) 26.51 301 сл сл 0.1 - 0.4 0.3 0.4 0.2 1.5 1.0

8-O-деметилхомоликорин (20) 26.55 315 сл сл - - - - - - - -

сл. <0.1% от общия йонен ток

37

Нарвединът (6), продуктът на галантамина, се идентифицира в по-големи относителни

концентрации в алкалоидните екстракти на културалната течност, докато в екстрактите от

биомасата той е в минорни количества – под 1% от общия йонен ток. Най-високо относително

съдържание на нарведин в алкалоидите, екстрахирани от културалната течност, се отчита при

линия LaR 28 (4.7% от общия йонен ток). N-формилноргалантаминът (19) се идентифицира във

високи относителни концентрации в алкалоидните екстракти на линия LaR 26 – 1.5% от общия

йонен ток за вътреклетъчните и 1.0% от общия йонен ток за външноклетъчните. Хемантаминовият тип алкалоид 8-О- деметилмаритидин (9) е на второ място по количество

след галантамина в алкалоидните смеси от биомасата, при линии LaR 26 и LaR 28 съответно

10.4% от общия йонен ток и 12.9% от общия йонен ток. В алкалоидните екстракти от биомасата

на второ място при линии LaR 28 и LaR 99 е друг хемантаминов тип алкалоид – хамаинът (16).

Относителните му концентрации в алкалоидите, екстрахирани от биомасата, при линия LaR 38

са 5.8% от общия йонен ток, а при LaR 99 са 12.0% от общия йонен ток. Ликорин (18) в

новоселекционираните линии се идентифицира в минорни количества, под 1% от общия йонен

ток (Табл. 19) Ликорин не се идентифицира в алкалоидните екстракти на линия LaR 99 и във

външноклетъчните екстракти на LaR 38. При култивиране на линия LaR 26 в колонен

биореактор се идентифицира в относително големи концентрации апогалантамин (1), във

вътреклетъчните алкалоидни екстракти относителното му съдържание е 1% от общия йонен

ток, а във външноклетъчните алкалоидни смеси е 0.7% от общия йонен ток, като този алкалоид

е с неизвестна биологична активност. В заключение новоселекционираните линии биосинтезират значително по-големи

количества галантамин в сравнение с контролната линия G 80. Най-голямо количество

галантамин се биосинтезира от линия LaR 28 (3.3 mg/L) при култивирането й в колонен

биореактор с вътрешни секции. Галантаминът в тази линия е 92% от общия йонен ток при

външноклетъчните алкалоидни екстракти и 79% от общия йонен ток при вътреклетъчните. Тази

висока чистота на биосинтезирания галантамин позволява по-евтин и бърз процес на

пречистване от съпътстващите го алкалоиди. Тези резултати показват, че линия LaR 28 е подходяща биологична матрица за разработване на технологична схема за продукция на

галантамин. Високите относителни концентрации на външноклетъчен галантамин определят

линия LaR 28 като подходяща за разработване на двуфазен метод за биосинтеза му.

5.Двуфазни системи за биосинтез на галантамин

В предварителни експерименти адсорбционната смола Amberlite XAD-4 е определена

като най-подходяща за втора фаза при разработването на двуфазна система за биосинтез на

галантамин от растителни in vitro системи на L. aestivum L. Най-подходящ елуент за

десорбиране на галантамин е подкислен с 1% (0.5М HCl) метанол.

Изследвано е влиянието на смолата Amberlite XAD-4 върху растежните и

биосинтетичните характеристики на линия LaR 28 (показала най-добри биосинтетични

характеристики по отношение на биосинтеза на галантамин), култивирана в колонен

биореактор при включване на втората фаза на 14-ия, 21-ия и 28-ия ден от началото на

култивационния процес. Табл. 20. Акумулирана суха биомаса и растежни индекси, получени при двуфазно култивиране на

shoot тип линия L. aestivum LaR 28 в колонен биореактор с вътрешни секции.

Ден на добавяне на втората фаза

Акумулирана суха биомаса, g/L


Контрола 9.8 1.5

14-ия ден 6.8 1.5

21-ия ден 12.3 2.2

28-ия ден 8.3 1.4

Анализът на растежните характеристики на културата при включване на втората фаза в

култивационния процес на 21-ия ден от началото на култивиране показва, че акумулираната

биомаса се увеличава 1.25 пъти спрямо контролната проба (9.8 g/L) и достига до 12.3 g/L.

38

Растежният индекс също се покачва с 1.46 пъти от 1.5 при контролната проба до 2.2 при

пробата с включена втора фаза (Табл. 20). Другите два режима на добавяне на втора фаза не влияят на синтеза на биомаса. Анализът на фотосинтетичните пигменти показва, че добавянето на втора фаза (на 14-ия

ден и 21-ия ден) повишава и фотосинтетичния потенциал на културата при култивирането й в

колонен биореактор. Общото количество на хлорофилите се повишава с 1.48 пъти – от 3.3 mg/L

(2.0 mg/L хлорофил А и 1.3 хлорофил Б) при контролната проба до 4.9 mg/L (3.0 mg/L

хлорофил А и 1.9 хлорофил Б) при пробата, към която е добавена втора фаза на 21-ия ден от

началото на култивиране (Табл. 21). При включване на втората фаза в 14-ия ден от началото на

култивиране биосинтезът на фотосинтетичните пигменти се покачва 1.39 пъти спрямо

контролата. Табл. 21. Количества фотосинтетични пигменти, биосинтезирани при двуфазно култивиране на

shoot тип линия L. aestivum LaR 28, култивирана в колонен биореактор с вътрешни секции.


Хлорофил А, mg/L

Хлорофил Б, mg/L

Контрола 2.0 1.3

14-ия ден 3.0 1.6

21-ия ден 3.0 1.9

28-ия ден 1.9 0.9

Максимално количество галантамин се биосинтезира при култивиране на линия LaR 28

в колонен биореактор с включена втора фаза на 21-ия ден от началото на култивационния

процес – 5.9 mg/L (3.2 mg/L вътреклетъчен и 2.7 външноклетъчен). Това количество

биосинтезиран галантамин е 1.78 пъти повече в сравнение с контролата (3.3 mg/L – 1.8 mg/L

вътреклетъчен и 1.5 mg/L външноклетъчен) (Фиг. 21). Добавянето на втора фаза, от една

страна, индуцира биосинтеза на галантамин в растителната клетка, а, от друга, увеличава

секрецията му в културалната течност. Вътреклетъчният галантамин при пробата с добавена

втора фаза се увеличава с 1.77 пъти (3.2 mg/L) в сравнение с контролата – 1.8 mg/L.

Външноклетъчният галантамин се повишава съответно с 1.8 пъти (2.7 mg/L) в сравнение с контролата – 1.5 mg/L. 96.3% от външноклетъчния галантамин (2.6 mg/L) е адсорбиран върху втората фаза Amberlite XAD-4 и само 0.1 mg/L се отчита в културалната течност. Тези

резултати показват, че при добавянето на втора фаза на 21-ия ден от началото на

култивационния процес се нарушава концентрационното равновесие (клетка–среда) и клетката, от една страна, биосинтезира de novo галантамин в биомасата, а, от друга, се увеличава

секрецията му в културалната течност.


Галантамин, m

g/L

0

1

2

3

4

5

6

7

8



Адсорбиран от Amberlite XAD-4


Контрола 21-ия14-ия 28-ия

Фиг. 21. Биосинтезирани количества галантамин при двуфазно култивиране на линия L. aestivum

LaR 28 в колонен биореактор с вътрешни секции.

При включване на втора фаза на 21-ия ден от началото на култивиране в колонен

биореактор новоселекционираната линия LaR 28 биосинтезира 3.5 пъти повече галантамин (5.9

mg/L) в сравнение с контролната линия G 80 – 1.68 mg/L. Отчетената продуктивност на

системата при двуфазно култивиране по отношение на галантамина е 168.6 µg/(L.day); тази

39

продуктивност е 1.78 (94.3 µg/(L.day)) пъти по-висока спрямо еднофазното култивиране и 3.5

пъти по-висока (48.0 µg/(L.day)) спрямо контролната линия G 80. Това е положителен резултат, определящ добавянето на втора фаза в процеса на култивиране (Amberlite XAD-4) като важен

етап в разработването на технологичен процес за производство на галантамин, защото, от една

страна, се увеличава добивът от галантамин, а, от друга, концентрациите на съпътстващите алкалоиди намаляват в значителна степен (норгалантамин) и/или не се синтезират. За първи път е анализиран алкалоидният профил на различните части на двуфазна

система за биосинтез на биологично активни вещества от растителни in vitro системи (Табл.

22). Идентифицирани са 8 алкалоида при културите с добавена втора фаза. Тези

идентифицирани алкалоиди са с пет по-малко в сравнение с контролата без добавена втора

фаза. Идентифициран е един нов за вида L. aestivum L. алкалоид, адсорбиран върху втората

фаза – 3-О-метилноргалантамин (4). Този алкалоид е с неизвестна биологична активност.

Галантаминът (3) при вътреклетъчните алкалоидни екстракти увеличава концентрациите си при

пробите с добавена втора фаза при всички изследвани режими. При режим на добавяне на 14-ия

и 21-ия ден от началото на култивационния процес галантаминът е единственият алкалоид,

идентифициран във вътреклетъчните алкалоидни екстракти, а при 28-ия ден е 98.8% от общия

йонен ток. Галантаминът е единственият алкалоид, наличен в алкалоидните екстракти на

културалната течност при трите режима на култивиране. Тези резултати показват, че добавянето на втора фаза в процеса на култивиране насочва вторичния метаболизъм на

културата към биосинтез на галантамин. Наличието само на галантамин в културалната течност

показва, че той изпълнява защитни функции за клетката. 3-О-метилгалантаминът (4) се идентифицира в алкалоидната фракция, адсорбирана върху втората фаза (5.2% от общия йонен

ток), само при режим на добаянето й на 14-ия ден. Прекият предшественик на галантамина –

норгалантаминът (6), се идентифицира само адсорбиран върху втрората фаза при добавянето й

на 21-ия ден от началото на култивационния процес. 8-О-деметилмаритидин (9) – вторият по

концентрация алкалоид във вътреклетъчните алкалоидни екстракти, идентифициран в

контролната проба, не се открива в алкалоидните екстракти при добавяне на втората фаза на 14-ия и 21-ия ден. Този алкалоид се отчита само във вътреклетъчните алкалоидни екстракти

при добавяне на втората фаза на 28-ия ден от началото на култивационния процес (1% от

общия йонен ток) и адсорбиран върху втората фаза при добавянето й на 21-ия ден (2.5% от

общия йонен ток). Витатин (7) се идентифицира само адсорбиран върху втората фаза при

добавянето й на 14-ия (4.1% от общия йонен ток) и 21-ия ден (2.9% от общия йонен ток) и не се открива във вътреклетъчните алкалоидни екстракти (Табл. 22).

Табл. 22. Алкалоиден профил при двуфазно култивиране на shoot тип линия L. aestivum LaR 28 в

колонен биореактор с вътрешни секции.

Ден на включване на втората фаза Amberlite XAD-4 Контрола

14-ия ден 21-ия ден 28-ия ден Алкалоид

БМ КТ БМ КТ Втора

фаза

БМ КТ Втора

фаза

БМ КТ Втора

фаза

Апогалантамин(1) сл. 0.1 - - - - - - - - -

Трисферидин (2) 0.1 сл. - - - - - - - - -

Галантамин (3) 78.8 92.0 100 100 87.7 100 100 90.7 98.8 100 100

3-O-Метилгалантамин (4) - - - - 5.2 - - - - - -

N-Деметилгалантамин (6) 3.2 сл. - - - - - 0.4 - - -

Витатин (7) 0.2 1.5 - - 4.1 - - 2.9 - - -

Нарведин (8) 0.4 4.7 - - 2.6 - - 2.4 0.2 - -

8-O-Деметилмаритидин (9) 12.9 - - - - - - 2.5 1.0 - -

Панкрацин C (10) 0.1 - - - - - - 0.1 - - -

Дедихидроанхидроликорин (11) - 0.1 - - 0.1 - - 0.1 - - -

Хамаин (12) 3.2 1.0 - - 0.3 - - 0.9 - - -

Ликорин (13) 0.6 0.1 - - - - - - - - -

N –Формилноргалантамин (14) 0.3 0.4 - - - - - - - - -

сл. <0.1% от общия йонен ток

40

Алкалоидите, идентифицирани в различните режими на добавяне на втората фаза, се групират според структурния си тип в три групи – галантаминов, хемантаминов и ликоринов.

Галантаминовият тип алкалоиди с para-ortho' фенол-окислителна структура са единственият

тип алкалоиди, открити в биомасата и културалната течност при добавяне на втората фаза на

14-ия и 21-ия ден. При добавяне на втората фаза на 28-ия ден от началото на култивациония

процес галантаминовият тип алкалоиди при вътреклетъчните екстракти е 99% от общия йонен

ток, а при външноклетъчните екстракти е 100%. В алкалоидните екстракти от втората фаза

галантаминовият тип алкалоиди са между 93% и 100% от общия йонен ток.

В заключение добавянето на втора фаза в процеса на култивиране на линия LaR 28 в

колонен биореактор с вътрешни секции насочва алкалоидния метаболизъм към синтез на

галантамин и инхибира синтеза на алкалоиди от хемантаминов и ликоринов тип. Това е добра

база за използването на двуфазния метод на култивиране на shoot култури от L. aestivum като

промишлена продукционна система.

6. Заключение

Създаването на биотехнологии за получаване на биологично активни вещества, в

основата на които е растителната клетка, култивирана при in vitro условия, е сложен и

многоетапен процес. Алгоритмите за оптимизация и контрол на биосинтетичния процес на

целевия метаболит в изследваната in vitro система трябва да са изградени на базата на

задълбочено изучаване на физиологичните, фитохимичните и биоинженерните особености,

както и на следващ анализ на връзките в биологичната система „растителна in vitro система –

продукт”. Необходимо условие за постигане на индустриално значими добиви от биологично

активни вещества от растителни in vitro системи е и разработването на ефективни

култивационни системи на база на развитието на подходящ дизайн на използваните биореактори, както и на неконвеционални стратегии за оптимизация на биологичните системи.

На база на резултатите от дългогодишните изследвания в Лабораторията по Промишлени биотехнологии–Пловдив към Института по микробиология–БАН и изследванията

в настоящата дисертация предлагаме следния интегриран подход за получаване на галантамин

от растителни in vitro системи на Leucojum aestivum L. (Фиг. 22)

Ключов етап от представената технологична схема са перманентната селекция на

високопродуктивни линии, адаптирането на дизайна на култивационните системи и in situ

екстракцията на целевия метаболит. Селекция на високопродуктивни линии. В резултат от проведените експерименти по

получаване и селекция на in vitro системи са получени shoot органови култури, различаващи се в значителна степен както по растежните си характеристики, така и по биосинтетичния си

потенциал по отношение на продукцията на галантамин. Селекционирана е shoot култура

Leucojum aestivum L. LaR 28 и е определена като най-перспективна in vitro система – продуцент

на галантамин (332.3 µg/g СБ).

Базирайки се на изменчивостта на вторичния метаболизъм на културите от калусните системи, ние твърдим, че перспективното прилагане на разработения селекционен алгоритъм

би довело до значителни ползи за технологичните процеси.

Култивационна система. Получените резултати категорично показват, че разработеният в нашата лаборатория модифициран колонен биореактор с вътрешни секции е подходящ за култивиране на shoot култури от L. aestivum L., с цел биосинтез на галантамин.

Хидродинамичната обстановка в култивационната система осигурява ниво на масообмен,

подходящ за изследваната технологична матрица. Елиситиране. Най-високо повишение в добива на галантамин (1.73 пъти) в изследваната

shoot култура L. aestivum G 80 се достига след прибавяне на 40 µМ жасмонова киселина в

началото на експоненциалната фаза на растеж на културата (28-ия ден).

Резултатите от проведения експеримент по елиситиране показват, че елиситирането е ефективен подход за оптимизиране на биосинтез на галантамин и е задължителен етап от една

бъдеща технология за получаването му. Важни етапи за осъществяване на ефективно

елиситиране са експерименталното установяване на вида елиситор, неговата концентрация и

времето му на добавяне към култивационната система.

41

Фиг. 22. Технологична схема за получаване на галантамин от растителни in vitro системи

на Leucojum aestivum L. 1* Качествен и количествен анализ – HPLC, GC-MS; антиацетилхолинестеразна активност. 2* 10 сек. 70% етанол, 15 мин. 7% р-р CaCl(ClO), промиване с дестилирана вода. 3* MS хранителна среда с добавени 2.0 mg/L 2,4-D и 0.1 mg/L Кинетин; температура 26°С на

тъмно.

4* MS хранителна среда с добавени 1.15 mg/L NAA 2.0 mg/L BAP температура 26°С;

фотопериод 16 h на светло/ 8 h на тъмно.

5* Качествен и количествен анализ – HPLC, GC-MS; антиацетилхолинестеразна активност. 6* MS хранителна среда с добавени 1.15 mg/L NAA 2.0 mg/L BAP; температура 26°С;

фотопериод 16 h на светло/ 8 h на тъмно

7* Инокулум - 60 g/L свежа биомаса; температура 22°С, дебит на входящия въздух 18 L/(L.h),

фотопериод 16 h на светло/ 8 h на тъмно; 35 дни.

7а* 40µМ жасмонова киселина, добавена на 28-ия ден

7б* 10 g/L Amberlite XAD-4 включена на 21-ия ден 8а* Концентриране на вакуумизпарител при 70°С.

8б* Лиофилизиране. 8в* Елуиране с 1% (0.5М HCl) метанол.

9* Следва да се разработи.

In situ екстракция на галантамин. Разработена е двуфазна система за култивиране на L.

aestivum L. shoot култура в модифициран колонен биореактор с вътрешни секции. В качеството

си на втора фаза се използва йоннообменната адсорбционна смола Amberlite XAD-4. Най-

високо повишение в добива на галантамин (1.78 пъти) от изследваната shoot култура L. aestivum

LaR 28 се постига след добавяне на втората фаза на 21-ия ден от началото на култивационния

процес. Получените резултати при двуфазното култивиране показват, че този метод е един от

най-ефективните подходи за повишаване на биосинтеза на галантамин и е задължителен етап от

една бъдеща технология за получаването му. Важни етапи за осъществяване на ефективен

процес по двуфазно култивиране са експерименталното установяване на вида на втора фаза и

времето на добавянето й към култивационната система. Наред с повишаването на добивите на

42

галантамин, двуфазното култивиране предоставя възможност за биосинтез de novo на (3-О-

метилгалантамин) алкалоиди с неизвестна биологична активност. В заключение предложеният интегриран подход за получаване на галантамин от

растителни in vitro системи на Leucojum aestivum L. включва използването на различни

стратегии, целящи постигането на значително повишение в добива на галантамин от

селекционираната in vitro система. Всяка от предложените стратегии може да доведе до

значително повишение в добива на галантамин, но за разгръщане на пълния биосинтетичен

потенциал на in vitro системите е необходимо тяхното комплексно прилагане. По този начин се достига максимална продуктивност на култивационната система, което е предпоставка за по-

добра икономическа ефективност на процесите на биотехнологичното получаване на

галантамин. Вследствие на прилагането на интегриран подход е постигнат добив от 5.6 mg/L

галантамин и продуктивност на системата 168.6 µg/(L.day). Това са най-високите добиви,

съобщавани понастоящем в научната литература.

ИЗВОДИ

1. Установено е, че оптималните условия за култивиране на L. aestivum shoot линия G 80 в

система с временно разбъркване тип RITA за максимален добив на галантамин са 15 min

период на разбъркване, 8 h период на покой и температура 26°С. При този режим на

култивиране L. aestivum shoot линия G 80 биосинтезира 1.3 mg/L галантамин.

2. Доказано е, че модифицираният колонен биореактор с вътрешни секции е най-

подходящата култивационна система за биосинтез на галантамин от shoot култури на L.

aestivum. Максималната продуктивност [48 µg/(L.day)] и максималният добив на

галантамин (1.68 mg/L) се постигат чрез култивирането на L. aestivum shoot линия G 80

при температура 22°С и дебит на входящия въздух – 18 L/(L.h).

3. За пръв път са изследвани антиацетилхолинестеразните активности на комплексни алкалоидни смеси, получени от растителни in vitro системи на L. aestivum.

Антиацетилхолинестеразните активности на алкалоидните, екстрахирани от биомасата

(IC50 4.6 mg), са съпоставими с тези, екстрахирани от интактни растения.

4. Вследствие на мултиметаболитни анализи е доказано, че алкалоидните смеси, получени

от L. aestivum shoot линия G 80, съдържат 18 Amaryllidaceae алкалоида, като три от тях са

доминиращи – ликорин, галантамин и хамаин.

5. Доказано е, че температурата на култивиране на L. aestivum shoot линия G80 влияе на

фенол-окислителното свързване на 4-О-метилнорбеладина и на формирането на

алкалоиди с различен структурен тип.

6. Доказано е, че жасмоновата киселина (40 µМ), прибавена на 28-ия ден от началото на

култивационния процес, е подходящ елиситор за индукция на биосинтеза на галантамин

от L. aestivum shoot линия G 80. При този режим добивът на галантамин се увеличава 1.73

пъти.

7. Установено е, че жасмоновата киселина насочва вторичния метаболизъм на клетката

преимуществено към биосинтез на алкалоиди чрез индуциране на тирозин

декарбоксилазата 8. Селекционирана е линия L. aestivum LaR 28, акумулираща 332.3 µg/g СБ галантамин –

биосинтетичен капацитет, сравним с най-добрите, съобщавани понастоящем за in vitro

култури от този вид.

9. Постигнатият добив от галантамин (3.3 mg/L) при култивиране в колонен биореактор с вътрешни секции на линия L. aestivum LaR 28 е 1.96 пъти повече спрямо базисната линия

G 80.

10. Чрез GC-MS анализи е доказано, че новоселекционираните линии, култивирани в

колонен биореактор с вътрешни секции, биосинтезират предимно галантамин.

11. Установено е, че смолата Amberlite XAD-4 показва най-голям адсорбционен капацитет –

11.5 mg галантамин/1g смола. Най-подходящата елуентна система за максимална

десорбция на галантамин (93.6%) е подкисленият с 1% (0.5М HCl) метанол.

43

12. Установено е, че при включване на втора фаза в 21-ия ден от началото на

култивационния процес на линия L. aestivum LaR 28 в колонен биореактор с вътрешни

секции се постига максимален добив от галантамин – 5.9 mg/L, като 96,3% от

външноклетъчния галантамин се адсорбират върху втората фаза. Това е най-високият

добив на галантамин от растителна in vitro система, съобщаван понастоящем.

13. Доказано е, че при двуфазно култивиране върху смолата Amberlite XAD-4 се адсорбира 3-

О-метилгалантамин – нов за вида L. aestivum L. алкалоид.

ПРИНОСИ

1. Разработен е нов метод за разделяне и количествено определяне на галантамин, ликорин

и норгалантамин в алкалоидни екстракти на shoot култури на L. aestivum, базиран на

високоефективна течна хроматография. 2. За първи път е използвана „технологията” с временно разбъркване за биосинтез на

Amaryllidaceae алкалоиди от диференцирани растителни in vitro системи.

3. За първи път е приложен мултиметаболитен анализ на алкалоидните смеси от shoot

култури на L. aestivum като елемент от интегриран подход за оптимизиране на

биосинтетичния процес. 4. Разработен е алгоритъм за селекция на shoot тип линии L. aestivum, базиран на

вътреклетъчната изменчивост на вторичния метаболизъм на растителните клетки в

калусните култури.

5. Разработен е нов двуфазен метод за култивиране на растителни in-vitro системи,

биосинтезиращи галантамин.

6. Идентифициран е нов за вида Lеucojum aestivum L. алкалоид – 3-О-метилгалантамин.

44

ПУБЛИКУВАНИ МАТЕРИАЛИ

Статии, публикувани в международни списания:

Ivanov I., Georgiev V., Georgiev M., Ilieva M., Pavlov A. (2011) – Galanthamine and related

alkaloids production by Leucojum aestivum L. shoot culture using a temporary immersion

technology. Appl Biochem Biotechnol, 163: 268-277 (IF 2010 – 1.879)

Ivanov I., Berkov S., Pavlov A. (2009) – Improved HPLC method for the determination of

Amaryllidaceae alkaloids. Biotechnol. & Biotechnol. Eq, 23 SE: 809-813 (IF 2009 – 0.291)

Статии, публикувани в български списания и сборници: Иванов И., Георгиев M., Георгиев В., Илиева M., Павлов A. (2008) – Двуфазни системи за

биосинтез на галантамин: Адсорбционен капацитет на смолите Amberlite XAD. Научни

трудове УХТ, LV: 319-324,

Материали, докладвани на конференции в чужбина: Georgiev V., Ivanov I., Georgiev M., Ilieva M., Berkov S., Pavlov A., Alkaloids biosynthesis in

Amaryllidaceae plant in vitro systems. European BioPerspectives –2008, 7 – 9 October,

Hanover, Germany

Georgiev V., Ivanov I., Pavlov A., Georgiev M., Ilieva M., Galanthamine production by Leucojum

aestivum in vitro shoot cultures. 7th Joint Meeting of AFERP, ASP, GA, PSE & SIF – 2008, 3–

8 August, Athens, Greece

Материали, докладвани на конференции и конгреси в България: Ivanov I., Georgiev V., Berkov S., Pavlov A. – Biotechlological production of galanthamine by

Leucojum aestivum L. shoot culture in modified bubble column bioreactor. Fifth National

Pharmaceutical Congress with international participation. – 2011, 1-3 April, Hysarya,

Bulgaria Ivanov I., Georgiev V., Ilieva M., Berkov S., Pavlov A. – Biotechnological production of

galanthamine. Twelfth Congress of the Bulgarian Microbiologists – 2010, 11-14 October,

Yundola, Bulgaria

Ivanov I., Georgiev V., Georgiev M., Ilieva M., Berkov S., Pavlov A. – Bioreactor production of

galanthamine by Leucojum aestivum L. shoot culture. A comparative study. Twelfth Congress

of the Bulgarian Microbiologists – 2010, 11-14 October, Yundola, Bulgaria

Ivanov I., Berkov S., Pavlov A. – Improved HPLC method for determination of Amaryllidaceae

alkaloids. XI Anniversary Scientific Conference with International Attendance “Biology –

Traditions and Challenges” – 2009, 27-29 May, Sofia, Bulgaria

Иванов И., Георгиев M., Георгиев В., Илиева M., Павлов A. – Двуфазни системи за биосинтез на галантамин: Адсорбционен капацитет на смолите Amberlite XAD. Хранителна

Наука, Техника и Технологии – 2008, 24 – 25 Октомври, Пловдив, България

Благодарности: Изследванията в настиящият дисертационен труд са

осъществени благодарение на финансовата подкрепа на фонд Научни

изследвания към МОМН (проект ДО 02/105 – 2009).

Avtoreferat proekt Pavlov 2 end - microbio.bas.bg web page/pzrasrb/Doctor...Title: Microsoft Word -...

Documents

Transcript of Avtoreferat proekt Pavlov 2 end - microbio.bas.bg web page/pzrasrb/Doctor...Title: Microsoft Word -...