Bactérias para controle de insetos

Rose Monnerat

EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia

Goiânia-GO

Agosto 2018

Coleção de Bactérias de Invertebrados

2.700 Bacillus spp.

Primeira coleção de microrganismos brasileira a ser avaliada e reconhecida segundo as normas para funcionamento de um Centro de Recursos Biológicos -CRB

Objetivos

Novas estirpes

Novos biopesticidas

Novos genes

Bacteriocinas (antibioticos, antifungicos)

Promotores de crescimento

Estudos de interações toxina – inseto - planta

Uso sistêmico

Saúde pública

Culex spp. Aedes aegypti Simulium spp.Anopheles spp.

Agrícola

Prospecção

Plutella xylostella Anticarsia gemmatalis Spodoptera frugiperda

Veterinária

Stomoxys calcitrans Haematobia irritansAlphitobius diaperinus

Estirpes Spodopterafrugiperda

LC50 ng/cm2

genes cry Outras características

A 936.1 (460.1-2832.3) cry1Aa, cry1Ab, cry1C, cry1D, cry1I

B 13.3 (10.4-29.4) cry1Aa, cry1Ab, cry1B, cry1D, cry1I

C 6.3 (1.4-9.3) cry1Aa, cry1B, cry1D, cry1I, cry2 Produção de Thuricina17

D 12.9 (1.5-32.2) cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac cry1Ad, cry1B, cry1D, cry1I, cry2cry1D, cry1I, cry2

E 1923.9 (1072.6-6058.4) cry1Aa, cry1Ac, cry1Ad, cry1C, cry1D, cry1I

F 358.2 (233.7-597.6) cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1E, cry1G, cry1I, cry2

G 22.9 (10.5-30.9) cry1Aa, cry1B, cry1C, cry1D

H 349.7 (123.9 – 456.7) Cry1B Produção de melanina

Gene cry1Ia Proteína tóxica a lepidópteros e coleópteros (patente)

Gene cry10 Proteína tóxica a coleópteros (patente)

Novos genes

(patente)

Gene cry1B Proteína tóxica a coleópteros

Bioinseticidas desenvolvidos pela Embrapa Cenargen com instituições privadas à base de Bacillus thuringiensis e Lysinibacillus sphaericus da Coleção.

Ponto Final (Bthek Biotecnologia Ltda.), Inova Bti (Instituto Matogrossense do Algodão-IMAmt), Strike Bio Bti SC (STRIKE Indústria e Comércio), Bt-horus SC (Bthek Biotecnologia Ltda.), Sphaerico (Geratec do Brasil) e Sphaerus-SC (Bthek Biotecnologia Ltda.).

Trabalho social

Educação

Reordenação ambiental

Uso de produtos biológicos

Cidadania

Bactérias esporulantes

aeróbicas como as pertencentes ao gênero Bacilluse correlatos

anaeróbicas que pertencem ao gênero Clostridium

Bactérias não esporulantesBactérias não esporulantes

Serratia, Pseudomonas, Streptococus, Xenorhabdus Chromobacterium.

Pseudomonas entomophila

Patogênica para três ordens de insetos: Diptera (Anopheles gambiae

e D. melanogaster), Lepidoptera (Bombyx mori e Galleria mellonella)

e Coleoptera (Sitophilus oryzae).e Coleoptera (Sitophilus oryzae).

Ação é devido a produção de metabolitos

Chromobacterium subtsugae

Bacteria Gram-negativa apresenta pigmentação violeta e a mobilidade flagelar.

Essa é uma bactéria com atividade tóxica quando ingerida oralmente por larvas de coleópteros Leptinotarsa decemlineata e Aethina tumida e de lepidópteros como Diabrotica spp. e Plutella xylostella

Apresenta crescimento ótimo a 25 C, em pH 6,5-8,0 com 0-1,5% de NaCl adicionado ao meio.

A maior mortalidade de insetos seguiu o tratamento com uma A maior mortalidade de insetos seguiu o tratamento com uma combinação de células vivas com toxinas inseticidas produzidas na fase estacionária de crescimento

Além do pigmento violeta, denominado violaceína, que tem atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, C. subtsugae contém um gene que codifica uma proteína inseticida semelhante ao encontrado em P. luminescense Xenorhabdus nematophilia

Gênero Bacillus e correlatos• Bacillus cereus• Bacillus thuringiensis• Lysinibacillus sphaericus• Paenibacillus popilliae• Paenibacillus lentimorbus• Paenibacillus lentimorbus• Bacillus larvae• Bacillus alvei• Brevibacillus laterosporus

Produzem esporos – Forma de resistência

- Resiste a altas temperaturas

- Vantagem no processo fermentativo

Den

sidad

e óp

tica

t0Célula mãeσE σK

Den

sidad

e óp

tica

t0Célula mãeσE σK

TempoDen

sidad

e óp

tica

t0 t1 t2

t0

Fase vegetativa Esporulação

Esporo

σA

σH σF σG

EI EII EIII EIV EV-VI EVII

TempoDen

sidad

e óp

tica

t0 t1 t2

t0

Fase vegetativa Esporulação

Esporo

σA

σH σF σG

EI EII EIII EIV EV-VI EVII

Paenibacillus popilliae e P. lentimorbus

doença leitosa dos tipos A e B em coleopteros

O primeiro programa bem sucedido de controle de insetos foi o uso de P. popilliae para

controlar larvas do besouro japonês (Popillia japonica).

Programa foi frustrado pois a produção continuada de esporos in vitro não era viável

Lysinibacillus sphaericus

- Tóxica a insetos da Ordem Diptera (larvas de mosqui tos)

- aplicações ambientais e industriais além do controle biológico como, por exemplo,

na biorremediação de metais tóxicos, solubilização de fósforo

Brevibacillus laterosporus

Patogênica a insetos das Ordens Coleoptera, Diptera e Lepidoptera

Utilizado como probiótico humano.

Bacillus thuringiensis

Bactéria que causa doença em alguns organismos

Isolado: 1901

1983: Coleoptera1983: Coleoptera

1960: Lepidoptera1977: Diptera

50.000 estirpes conhecidas

Pode ser encontrada nos solos, ambientes aquáticos, cadáveres de insetos, etc.

Alto nível de especificidade

Microscopia eletrônica de varredura de B.thuringiensis mostrando: (c) cristais; (e)esporos (20.000x).

Microscopia de contraste de fases de B.thuringiensis mostrando: (c) cristais; (e)esporos (2.000x).

Diferentes formas

• Bioinseticidas

• Estirpes nativas

• Estirpes modificadas

• Plantas transgênicas• Plantas transgênicas

Toxinas produzidas pelo B. thuringiensis

α-exotoxinaAtividade citolíticaTermolábilToxicidade a insetos, ratos e outros vertebrados

β-exotoxinas (Thuringiensina)Fase vegetativaEfeito teratogênico e mutagênicoTermoestáveisToxicidade a várias ordens de insetos e vertebrados

VipVipFase vegetativa;Ativa principalmente contra lepdópteros;Não forma cristais.

SipFase vegetativa;Ativa principalmente contra coleopteros;Não forma cristais.

Proteínas Cry

Vip e Sip

Cry1

Cry2

Cry1A

Cry2A

Cry1Aa

Cry2Aa

Cry1Aa1

Cry2Aa1

Cry1B

Cry2B

Cry1Ab

Cry2Ab

Cry1Aa2

Cry2Aa2

As proteínas Cry estão classificadas em 75 grupos e diferentes subgrupos e são codificadas por mais de 840genes cry já sequenciados

95%78%45% 98%

Modo de ação de Bacillus spp.

• Composto de várias etapas:

• Ingestão

• Solubilização

• Ativação e ligação aos receptores

• Inserção na membrana, agregação e formação do poro

• Alteração da permeabilidade e morte celular

• Bomba de Na+/K+;

• H2O.

• Morte do inseto

Epitélio intestinal de Aedes aegypti

Receptores Moleculares da proteína Cry1A. CADR, receptor caderina; APN, receptoraminopeptidase-N; ALP, receptor fosfatase alcalina; GCR, receptor glicoconjugado de270 kDa (Bravo et al., 2007).

S. cosmioides S. eridania S. frugiperda

Proteínas Cry CL50 (µg/mL) Intervalo de confiança (95%)

Cry1Aa 0,58 (0,14 – 1,52) ab 74,74 (42,83 – 121,4) c 0,32 (0,14 – 0,72 ) a

Susceptibilidade entre espécies

Cry1Ab 0,37 (0,12 – 0,82) a 62,33 (37,34 – 188,22) c 0,88 (0,40 – 1,74) a

Cry1Ac 2,77 (1,20 – 6,26) b 21,34 (14,29 – 33,97) b 10,90 (4,78 – 30,65) b

Cry2A 23,98 (8,91– 171,1) c 1,00 (0,42 – 2,36) a 1,87 (0,70 – 5,30) ab

(Santos et al., 2009)

1. Brasil

2. MéxicoCry1Ba

Cry1Ca

- + - + -+

Mexico Colombia Brasil

Variabilidade Genética x susceptibilidade x receptoresem S.frugiperda

3. Colombia

Toxina México Colombia Brasil

LC50 ng/cm2

Cry1B > 2000 74 (31-148) 403 (198 - 690)

Cry1C 42 (27 - 55) 21 (6-48) 84 (61 - 129)

Cry1D 80 (66 - 128) 7 (2 - 22) >2000

Cry1Ca

Cry1Da

Monnerat et al., 2006

Modos de ação diferentes para a protoxina e toxina

Bioinseticida – ação da protoxina e da toxina

Planta Bt – ação da toxina

Toxicidade das diferentes produtos biológicos para larvas de S. frugiperdadas populações susceptível e resistente a plantas Bt (Cry1F, Cry1Aa,Cry1Ab, Cry1Ac)

Produto

LC50 ng/cm2

Susceptivel Resistente

Formulado 1 31,74 (26,26 - 62,29) 15,97 (9,4 – 53,88)

Formulado 2 395,16 (206,57 - 632) 335,42 (145,97 – 889,48)

Formulado 3 2175,21 (1518,01-2923,03) 2283,02 (1172,84 - 3486,7)

Produtos à base de B. thuringiensis podem ser utilizados em insetos resistentes a toxinas de plantas Bt

Produção de microrganismos

Fermentação

Inóculo

Meio de Cultura

Controle de

qualidade

Envase

Concentração

Formulação

qualidade

Fatores limitantes ao processo de produção

1- Meio de Cultura

É uma das chaves do sucesso da produção.

Na composição básica deve conter carbono,

nitrogênio e minerais

Composição variável conforme a espécie e a cepaComposição variável conforme a espécie e a cepa

Deve ser sempre esterilizado

2- Inóculo – puro – só a bactéria

Fatores limitantes ao processo de produção

3- Condições fermentativaspH - neutroOxigenação - altaAgitaçãotemperatura – aproximadamente 30º C

4- Controle de qualidade4- Controle de qualidadeNormalmente as bactérias usadas em controle biológi co não são boas competidoras Precisa ser realizado em todas as fases do processo

---- Nunca produzir dois microrganismos juntos....

Produção em reator

Controle de:- pH - temperatura- oxigenação- agitação

Meio de cultura - autoclavado

Ar estéril

Peso Seso S1450

3

4

5

6

7

8

9

Pes

o S

eco

g/L

NYSM S1450

Bt I S1450

Bt II S1450

0

1

2

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 72

Tempo (horas)

Pes

o S

eco

g/L

Formulação

Objetivos

1) Estabilizar o agente microbiano durante a distri buição e estocagem;

2) Melhorar o manuseio e a aplicação do produto;

3) Proteger o agente de fatores ambientais adversos ;

4) Melhorar a eficiência do agente microbiano no ca mpo

Processo fermentação e recuperação do complexo espo ro-cristal

Tipos de Formulações

Suspensão Concentrada;

Concentrado Emulsionável;

Pó Molhável;

Granulado;

Grânulos Dispersíveis em Grânulos Dispersíveis em

água;

Pastilhas ou Tabletes;

“Gelo”.

Produção “on farm”

•Decreto 4074, alterado pelo Decreto 6.913 em 2009:

•“Art. 10-D.

•§ 8º Ficam isentos de registro os produtos fitossanitários com

uso aprovado para a agricultura orgânica produzidos

exclusivamente para uso próprio.

Produção de microrganismos

Concentração

Fermentação

Inóculo

Meio de Cultura

comercial

On farm

Envase

Concentração

Formulação

•Produção caseira de Bt

- Qualidade do produto (instalações inadequadas, inoculo de má

qualidade, falta de controle de qualidade)

≠≠

Ações da Embrapa

- Manual para controle de qualidade

- Prestação de serviços em controle de qualidade

- Treinamentos em produção e controle de qualidade- Treinamentos em produção e controle de qualidade

Produção de bioinseticidas à base de Bacillus thuringiensis: da bactéria ao produto

Outubro-2017

Produção em baldes x fermentador

x

Controle de qualidade de produtos à base de Bacillus thuringiensis

Manual em redação

1- Introdução

2. Objetivo2. Objetivo

3. A Bactéria Bacillus thuringiensis

4- Produção e formulação de produtos à base de Bacillus thuringiensis

5- Controle de qualidade dos produtos

6- Estrutura mínima para produção

1- Procedimento para determinação de pH de produtosbiológicos a base de Bacillus thuringiensis

2- Procedimento para determinação do teor de ingrediente ativo de produtos

biológicos a base de Bacillus thuringiensis

Determinação de UFC- unidades formadoras de colônias

Células- direto Esporos- choque térmico (80ºC-12 min, gelo- 5 min.)% esporulação- numero de células : número de esporos

3- Procedimento para avaliação da eficácia de produtosbiológicos a base de Bacillus thuringiensis para o controle delarvas de lepidopteros

- Aplicar 100 µL de cada suspensão sobre a dieta

- Deixar secar

- Colocar a lagarta de segundo instar

- Incubar o bioensaio em sala com condições

controladas

- Efetuar leitura após 48 horas

4- Procedimento para determinação de contaminantes em produtos biológicosa base de Bacillus thuringiensis

- Semear em cada placa de Petri, 0,1mL de cada uma das amostras- Espalhar com alça de Drigalsky a suspensão sobre toda a superfície do meio de cultura;- Colocar as placas em estufa incubadora;- Após 24 horas de incubação, contar o número de colônias - Utilizar a média de colônias obtidas nas duas placas

Microrganismo Especificação Meio de cultura

B. thuringiensis Controle Ágar nutritivo

Coliformes termotolerantes

≤500 UFC Ágar Bile Cristal-Violeta Vermelho Neutrotermotolerantes

Escherichia coli ≤400 UFC Ágar Macconkey

Enterecocos ≤ 50 UFC Ágar Confirmatório para Enterococos

Estreptococos 0 Agar Seletivo para Estreptococos

Salmonella 0 Ágar Verde-Brilhante

Fungos 0 Ágar Sabouraud 4%

Meios

Ágar Macconkey

Agar Bile verde-

brilhante

Ágar Confirmatório

para Enterococos

Agar Seletivo para

Estreptococos

Ágar Verde-Brilhante

Ágar Sabouraud

4%celulas esporos

Escherichia coli Coliformes termotolerantes

Enterecocos Estreptococos Salmonella Fungos

≤400 UFC ≤500 UFC ≤ 50 UFC 0 0 0

A-Fermentador

0 0 0 0 0 0 8 x 1010 8 x 1010

A- balde >400 >500 >50 >500 >500 >500 24 x 108 0,5 x 105A- balde >400 >500 >50 >500 >500 >500 24 x 10 0,5 x 10

B- balde >400 >500 0 >500 >500 >500 27,5 x 106 0,5 x 105

C- balde >400 >500 0 >500 >500 >500 89 x 108 1,1 x 107

T- balde >400 >500 >50 >500 >500 >500 300 x 108 0

1- Área de utilidades: A área de utilidades pode-se restringir a uma cobertura sob aqual se disponham um gerador de vapor, compressor de ar e sistema deresfriamento (torre de resfriamento e/ou água gelada).

2- Laboratório de controle de qualidade e processo: Este espaço deve contercapela de fluxo laminar, sistema de inoculação, microscópio de contraste de fases,placa aquecedora ou banho-maria, autoclave pequena, estufa de secagem, estufade crescimento, pipetas de precisão.

3- Salão de fermentação: neste ambiente serão colocados reatores esterilizáveis insito.

4- Sala de estoque de insumos: nesta sala deverão ser colocados todos os

Estrutura mínima

4- Sala de estoque de insumos: nesta sala deverão ser colocados todos osmateriais que serão empregados no processo de fermentação.

5- Sala de armazenamento de produto acabado: nesta sala será estocado oproduto acabado e de preferencia deverá estar refrigerada.

• Todas as áreas deverão ser passíveis de limpeza e de sinfecção, com acabamento impermeável.

Sugestões para produção “on farm”

• Uso próprio

• Cooperativas, associações

• Cepas limitadas (especificação de referência do MAPA, ou material próprio)

• Obrigatoriedade de estrutura mínima• Obrigatoriedade de estrutura mínima

• Responsável Técnico

• Controle de qualidade (Manual)

• Cadastramento no MAPA

01 – Cotesia flavipes

02 – Trichogramma galloi

03 – Neoseiulus californicus

04 – Isca vegetal à base de Tephrosia cândida

05 – Baculovírus Anticarsia gemmatalis

06 – Baculovírus Condylorrhiza vestigialis

07 – Metarhizium anisopliae , isolado IBCB 425

08 – Trichoderma stromaticum , isolado CEPLAC 3550

09 – Azadirachta indica

16– Stratiolaelaps scimitus

17 – Deladenus (=Beddingia) siricidicola

18 – Cryptolaemus montrouzieri

19– Trichoderma asperellum , isolado URM-5911

20– Baculovírus Spodoptera frugiperda

21 – Chrysoperla externa

22 – Trissolcus basalis

23 – Orius insidiosus

24 – Trichoderma asperellum , isolado CBMAI 840 (T -211)

30 especificações de referência

09 – Azadirachta indica

10 - Beauveria bassiana , IBCB 66

11 – Phytoseiulus macropilis

12– Trichogramma pretiosum

13 – Regulador de crescimento à base de Ecklonia maxima

14 – Terra de Diatomácea (Dióxido de Silício)

15 – Paecilomyces lilacinus , isolado UEL Pae 10

24 – Trichoderma asperellum , isolado CBMAI 840 (T -211)

25 – Bacillus subtilis , isolado UFPEDA 764

26 – Trichoderma harzianum , isolado IBLF006

27 – Bacillus methylotrophicus , isolado UFPEDA 20

28 – Bacillus thuringiensis var. Kurstaki, isolado HD-1 (S1450) (CCT1306)

29 – Beauveria bassiana , isolado CBMAI 1306

30 - Beauveria bassiana , isolado IBCB 66 + Metarhizium anisopliae , isolado

IBCB 425

Obrigada !

Rose.monnerat@embrapa.br