BIO10-329 Biofísica de ProteínasRegente: Célia R. Carlini

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Proteomas e Espectrometria de Massa

Principais componentes moleculares da bactéria Principais componentes moleculares da bactéria E. coliE. coli

Componentes Nº de moléculas diferentes Componentes Nº de moléculas diferentes % peso total% peso total

H2O 1 70Proteínas 3.000 15Ac. Nucléico 1 - DNA e 1000-RNA 7Carbohidratos 50 3Lipídeos 40 2Outros Íons - 12 3 Mol. Monoméricas - 500

A tabela mostra a percentagem em peso dos principais tipos de moléculas presentes em um célula simples, a bactéria Escherichia coli. Observe que as proteínas compõem o grupo mais diverso de moléculas.

Antes das técnicas de proteômica, para se obter informações sobre uma proteína em particular, era necessário separá-la de todas as outras que estão presentes na mesma fonte biológica.

Atualmente, é possível analisar-se um grande conjunto de proteínas ao mesmo tempo, e obter informações de uma proteína em particular sem separá-la das demais, graças às técnicas de espectrometria de massa acoplada com eletroforese 2D e/ou cromatografia líquida.

• METABOLOMA - metabólitos

• GENOMA – DNA – 3,4 bilhões de nt

• SIGNALOSOMA – interações entre proteínas de uma via de sinalização

• TRANSCRIPTOMA – mRNA – 30 mil genes

• INTERACTOMA – interações entre proteínas

• PROTEOMA – Proteínas – 0,3-1,2 milhão proteínas

Homo sapiens

Atualmente, a capacidade de processamento de grandes volumes de informações e técnicas analíticas de alta resolução, entre as quais se destaca a espectometria de massas, permitem o estudo de células e

organismos inteiros – são os “OMAS.

Estratégias experimentais• Do geral para o particular

– Analisar diversos proteomas em condições diferentes e identificar as diferenças

• Do particular para o geral

– Analisar uma única proteína e inferir suas funções no contexto do todo

Separação de proteínas nas amostras

Eletroforese bidimensional Cromatografia líquida (LC)

fragmentação

Determinação de massas para identificação

Peptide mass fingerprint Sequenciamento de novo

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL:• análise simultânea de até 5.000 proteínas

• permite comparação de todas as proteínas expressas por uma célula em dois momentos diferentes:

• análise do efeito de hormônios, • análise do efeito de drogas; • estados fisiológicos (desenvolvimento);• condições patológicas diversas (vírus, bactérias,etc.)

Eletroforese 2D de proteínas totais (proteoma) de células de

Escherichia coli

Proteínas com mesmo pI

Proteínas com a mesma massa

Proteoma Comparativo ou Diferencial

condição condição

Sobreposição permite identificar diferenças nos padrões de bandas

Sobreposição para análise das proteínas diferentemente expressas

Proteínas de cada condição são marcadas com tags fluorescentes diferentes para facilitar a visualização das diferenças

Interatoma de C. elegans - proteínas individuais, representadas por círculos, agrupam-se

(indicado por linhas) conforme suas interações, formando uma rede que permite entender detalhes do controle das funções vitais do organismo.

Identificação de Proteínas por MS: 10 passos

Espectro de massas dos fragmentos

virtuais

Tripsinização virtual

Banco de seqüências

(i.e. SwissProt)

Banda removida do

gel

Fragmentar com tripsina

Obter espectro de massas dos fragmentos

comparação

Ban

co d

e

esp

ect

ros

(1) (2) (3)

(4)

Espectro de massas

(5)(6)(7)

(8)

(9)

Identificação

(10)

Peptide fingerprint ou impressão digital de peptídeos: proteínas são identificadas com base no tamanho dos

peptídeos resultantes da hidrólise com tripsina, comparando-se o espectro de massa real com o teórico,

obtido a partir dos bancos de dados de proteínas.

1529 1 478

1529.7 0.1 164

1529.73 0.01 25

1529.734 0.001 4

1529.7348 0.0001 2

Massa/carga Mass Tolerance (Da) # Hits in Database

Quanto maior a exatidão da medida de massas, maior a segurança na identificação da proteína (hits) que originou os peptídeos trípticos.

Impressão digital de peptídeos: efeito de peptídeos múltiplos

1529.73 0.1 204

1529.73

1252.70

0.1 7

1529.73

1252.70

1833.88

0.1 1

Massa/carga m/z Mass Tolerance # Hits Database

A identificação de mais de um peptídeo triptíco de uma mesma proteína aumenta a confiabilidade da identificação dessa proteína por

espectrometria de massa.

2 peptídeos

3 peptídeos

Thomson, 1897 – fez descoberta do elétron e inventou a espectrometria de massa, com a primeira medida da razão massa/carga de uma partícula.

Prêmio Nobel de Química, 2002 – foi para os inventores de métodos de ionização branda em espectrometria de massa, que permitiu análise de macromoléculas como proteínas

John B. Fenn (E.U.A.) - Electrospray (ESI) Koichi Tanaka (Japão) - Soft Laser Desorption (SLD).

Espectrometria de Massas

Espectrômetros de massas usam diferenças na razão massa-carga (m/z) de átomos ou moléculas ionizadas para separá-los, e/ou para determinar a composição e a estrutura química. Moléculas fragmentam-se de maneiras diferentes, sendo que a análise MS dos fragmentos permite sua caracterização estrutural.

O poder de separação de íons de um MS é descrito por sua resolução, que é definida como:

R = m / m sendo m, a massa do íon m, a diferença de massa entre dois picos no

espectro de massa

Ex: um MS com resolução de 1000 consegue separar íons com m/z de 100.0 e 100.1

O espectro de massas de uma molécula consiste de uma família de picos, correspondendo a espécies carregadas que diferem de 1 unidade de massa e carga. A “deconvolução” desses picos, gerando o gráfico acima, dá a massa de uma molécula com precisão de 0,01%

A massa de uma molécula pode ser determinada a partir dos m/z de quaisquer dois picos vizinhos, que diferem por 1 carga (+) ou 1 próton:

(m/z)1 = M + n2x n2

M é a massa da moléculan2 é o número de cargasX é a diferença entre dois picos

(m/z)2 = M + (n2x +1)X n2 + 1

Temos duas equações e dois desconhecidos, M e n2, que podem ser calculados resolvendo-se esse sistema de equação:

n2 = (m/z)2 – X (m/z)2 – (m/z)1

M = n2 [(m/z)2 – X]

MS de setor magnético:

Ionização: um feixe de elétrons de alta energia é utilizado para ejetar um elétron de uma molécula, formando um radical catiônico designado como íon molecular. Se o íon molecular for muito instável ele poderá se fragmentar em íons menores.

Analisador de massa: os íons moleculares são focalizados, formando um feixe, são acelerados através de um campo magnético, sendo defletidos (desviados) de acordo com as massas dos íons.

Analisadores de massa

Analisadores de massa

Quadrupolo - consiste de quatro eletrodos (tubos metálicos), dois positivos e dois negtivos. A voltagem aplicada afeta a trajetória de íons passando através aos eletrodos. Para uma dada condição de corrente e voltagem, somente íons com uma dada razão massa/carga seguem o trajeto entre os tubos, e todos os outros são desviados para fora do quadrupolo. Obtem-se um espectro de massas variando-se gradualmente a corrente e voltagem para detectar-se todos os íons presentes.

MS quadrupolo de transmissão: consiste de um ionizador, lentes para acelerar e focalizar os íons para a entrada no quadrupolo, o quadrupolo com controles de V e A, um detector de íons. Todo o sistema necesssita de alto vácuo. Resolução: separa íons com diferenças de 0.3 m/z

A equação que governa a separação de íons por TOF é:

m/z razão massa/carga do íonE potencial do pulso de extraçãos comprimento do setor em que E é aplicadod comprimento do tubo de vôot tempo de vôo do íon

                                                                            

A energia cinética de um íon é 0.5mv2, assim ions mais leves têm velocidade maior que os pesados e atingem o detector em menos tempo.

MS tempo de vôo: íons são acelerados a partir do ionizador até um tubo de vôo, sem campo elétrico ou magnético, onde se movem na direção do detector com uma velocidade proporcional a m/z. Ao contrário de outros MS, não há limite superior de detecção de m/z. O TOF-MS é afetado pela energia inicial dos íons antes de serem acelerados. Para corrigir, utiliza-se um conjunto de campos elétricos, o reflectron, que refocalizam os íons de mesma m/z com velocidades diferentes. É o mais preciso de todos os MS, permitindo análise elementar. Podem fazer até 100 espectros por segundo. Originalmente desenvolvido na década 1950, foi obscurecido pelos MS quadrupolos até o desenvolvimento do MALDI nos anos 1980.

MS-TOF

Analisadores de massa

Espectrômetro de massa por tempo de vôo

MS Íon-trap: formado por um quadrupolo tridimensional

Consiste de eletrodos cilíndricos simétricos, que formam dois “end caps” e um anel. Pode ser bastante pequeno, com somente 1-2 cm separando os eletrodos. A face interna de cada eletrodo tem uma superfície hiperbólica. Uma corrente e voltagem são aplicadas ao eletrodo em forma de anel, enquanto os “end caps” ficam aterrados.  De maneira análogo ao MS quadrupolo linear, variando-se a voltagem ocorrem rápidas inversões na direção do campo, com os íons sendo alternadamente acelerados e desacelerados na direção axial e vice versa na direção radial, aprisionando-os. Aumentando-se a voltage, os íons assumem trajetórias instáveis e saem do trap, numa ordem de m/z crescente. Ainda que a resolução do MS ion trap seja mais baixa, apresenta como vantagem a pré-concentração do íon de interesse antes da análise.

Analisadores de massa

Ionização por impacto de eléctrons (EI) As moléculas são vaporizadas e bombardeadas com elétrons de alta energia (70 eV), formando de íons moleculares (+) quando esses elétrons colidem com a molecula e deslocam eléctrons mais externas. Alguns desses íons são instáveis e de fragmentam em íons menores. Adequada para compostos não termolábeis.

Dessorpção por Laser assistida por matriz (Matrix Assisted Laser Desorption) (MALDI):

      Técnica desenvolvida por Karas e Hillkamp em 1988, para ionização de peptídeos e proteínas, oligossacarídeos, glicolipídeos, nucleotídeos, etc. As amostras são co-cristalizadas com uma matriz (substância que absorve luz ultravioleta). Para proteínas, utiliza-se o ácido sinapínico, que absorve a radiação de 337 nm do laser de nitrogênio. A energia absorvida pela matriz é transferida para as moléculas, evitando sua decomposição por calor. Após a incidência do pulso de laser, uma grande quantidade de energia é absorvida pela matriz e há uma "explosão" com emissão de um gás com íons moleculares com uma carga.

Técnicas de Ionização

Mass SpectrometryMatrix-assisted laser desorption ionizaton – time of flight

Maldi-Tof

Técnicas de Ionização

Ionização por electronspray (ESI)

Método adequado para análise de moléculas termolábeis, como proteínas. O processo de ionização das moléculas ocorre pela nebulização de gotículas (nanolitros) de uma solução em um campo elétrico intenso, formando gotículas altamente carregadas. Quando o solvente evapora, formam-se íons moleculares de simples ou múltiplas cargas. Podem ser formados íons (-) ou (+), de acordo com o campo eléctrico aplicado. No modo positivo, observam-se adutos alcalinos (protonados) dos analitos e no modo negativo, os íons são desprotonados.

Técnicas de Ionização

Sequenciamento de novo de proteínas por espectrometria de massas

Para sequenciar proteínas é preciso obter o espectro MS/MS de seus peptídeos.

Isso significa 2 etapas de MS acopladas. Depois de fazer o MS da molécula inteira, esta é fragmentada dentro do aparelho por colisão com gases.Os fragmentos são então separados e analisados por MS.

hélio ou argônio

A ligação peptídica se quebra formando fragmentos típicos, como os íons b e y mostrados na figura acima, que terão massas diferentes de acordo com o radical R de cada aminoácido.

Quando um peptídeo é analisado por MS/MS, a fragmentação gera uma família de fragmentos peptídicos com massas que vão diferir uma da outra em valores que correspondem a um íon b, permitindo a identificação de cada aminoácido.

Sequenciamento de novo de proteínas

A sequência obtida pela análise dos íons de uma série pode ser confirmada pela determinação da sequência feita a partir da série complementar de íons, no caso do exemplo, os íons y.

Sequenciamento de novo de proteínas

Espectro MS/MS do peptídeo tríptico

GLSDGEWQQVLNVWGK.

AA Codes Mono. AA Codes  Mono.

Gly G 57.021464 Asp D 115.02694

Ala A 71.037114 Gln Q 128.05858

Ser S 87.032029 Lys K 128.09496

Pro P 97.052764 Glu E 129.04259

Val V 99.068414 Met M 131.04048

Thr T 101.04768 His H 137.05891

Cys C 103.00919 Phe F 147.06841

Leu L 113.08406 Arg R 156.10111

Ile I 113.08406 CMC 161.01467

Asn N 114.04293 Tyr Y 163.06333

- - - Trp W 186.07931

Analiza-se o espectro buscando diferenças de m/z equivalentes a um resíduo de aminoácido, que permitem conhecer

a seqüência do peptídeos

perda de amônia = 17 u.m.

perda de H2O = 18 u.m.perda de CO2= 28 u.m.

Sequenciamento de novo

Espectro MS/MS do peptídeo

GLSDGEWQQVLNVWGK.

Íons b e a

Íons y

http://prospector.ucsf.edu/

http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/index.html 

http://www.ionsource.com/