BIOATIVIDADE DE QUITOSANA COMO COBERTURA COMESTÍVEL … · Aos professores do programa, pelo...

i

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO ACADÊMICO DE VITÓRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE HUMANA E MEIO AMBIENTE - PPGSHMA

Priscilla Gregorio de Oliveira

BIOATIVIDADE DE QUITOSANA COMO COBERTURA COMESTÍVEL EM QUEIJO DE COALHO NA INIBIÇÃO

DE Listeria monocytogenes

Vitória de Santo Antão

2015

ii

Priscilla Gregorio de Oliveira

BIOATIVIDADE DE QUITOSANA COMO COBERTURA COMESTÍVEL EM QUEIJO DE COALHO NA INIBIÇÃO

DE Listeria monocytogenes

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Erilane de Castro Lima Machado

Co-orientadora: Prof.ª Dr.ª Roberta de Albuquerque Bento

Vitória de Santo Antão

2015

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Saúde Humana e Meio Ambiente

da Universidade Federal de Pernambuco como

requisito para obtenção do título de Mestre em

Saúde Humana e Meio Ambiente.

Área de Concentração: Saúde e Ambiente.

iii

Catalogação na Fonte Sistema de Bibliotecas da UFPE. Biblioteca Setorial do CAV.

Bibliotecária Ana Ligia Feliciano dos Santos, CRB4: 2005

O48b Oliveira, Priscilla Gregorio de.

Bioatividade de quitosana como cobertura comestível em queijo de coalho na inibição de Listeria monocytogenes/ Priscilla Gregorio de Oliveira. – Vitória de Santo Antão: O Autor, 2015.

106 folhas; il., graf., tab. Orientadora: Erilane de Castro Lima Machado. Coorientadora: Roberta de Albuquerque Bento.

Dissertação (Mestrado em Saúde Humana e Meio Ambiente) – Universidade Federal de Pernambuco, CAV, Saúde Humana e Meio Ambiente, 2015.

Inclui bibliografia.

1. Queijo de coalho. 2. Quitosana. 3. Listeria monocytogenes. I. Machado, Erilane de Castro Lima (Orientador). II. Bento, Roberta de Albuquerque. III. Título.

637.3 CDD (23.ed.) BIBCAV/UFPE-043/2015

iv

Dissertação de Mestrado apresentada por Priscilla Gregório de Oliveira ao Programa de Pós-Graduação em

Saúde Humana e Meio Ambiente do Centro Acadêmico de Vitória da Universidade Federal de Pernambuco, sob o título

“BIOATIVIDADE DE QUITOSANA COMO COBERTURA COMESTÍVEL DE QUEIJO DE COALHO NA

INIBIÇÃO DE LISTERIA MONOCYTOGENES”, orientada pela Profa. Dra. Erilane de Castro Lima Machado e

coorientada pela Profa. Dra. Roberta de Albuquerque Bento, aprovada no dia 20 de maio de 2015 pela Banca

Examinadora composta pelos seguintes professores:

___________________________________________________ Dr. Emerson Peter da Silva Falcão

Núcleo de Nutrição – CAV/UFPE

___________________________________________________ Dra. Celiane Gomes Maia da Silva

Departamento de Ciências Domésticas – UFRPE

___________________________________________________ Dra. Tânia Lúcia Montenegro Stamford Departamento de Nutrição – CCS/UFPE

Autora

Priscilla Gregório de Oliveira

v

À Deus, meu refúgio e Fortaleza

À Joel e Lorena, meu esposo e filha, família amada

À Iris e Natanael, meus pais, meu porto seguro

À Erilane e Roberta, minhas queridas mestres

vi

AGRADECIMENTOS

Ao meu grandioso Deus, pela sua fidelidade dia após dia e pelas suas bênçãos

imerecidas.

Ao meu esposo, Joel Sousa, por todo o companheirismo e motivação.

À minha filha, Lorena Gregorio, que foi minha maior motivação para alcançar esse

sonho.

Aos meus queridos pais, Natanael Gregorio e Iris Gregorio, pela tamanha força,

compreensão, amor e dedicação, sem eles certamente eu não teria conseguido essa

conquista, em especial à minha mãe que foi a principal responsável pela realização deste

sonho.

À minha prezada orientadora, Professora Erilane Machado, por todo o carinho,

paciência, compreensão e orientação dada a mim durante este trabalho.

À minha estimada co-orientadora, Professora Roberta Bento, pela orientação e

ensinamentos dados e pela colaboração na construção deste sonho.

À Professora Celiane Gomes, pelo apoio que me deu no decorrer desta caminhada.

À Silvio Assis, pela amizade, apoio e auxílio constante na construção desse sonho.

À Simone Ortiz, pelo apoio carinho e companheirismo nessa dura missão.

Aos técnicos do laboratório, Rafael Albuquerque e Michele Oliveira, pelos

conhecimentos compartilhados, pela paciência e pelo grande apoio que me deram no

desenvolvimento desse trabalho.

Aos professores do programa, pelo conhecimento transmitido, pelo apoio na

caminhada, pelos ensinamentos direto e indiretos, quanto a arte da docência, que contribuiu

de forma ímpar para minha formação acadêmica e profissional.

Aos meus amigos e companheiros de turma, que participaram de toda a minha vida

dentro e fora da academia, aos quais devo meu total afeto e carinho, em especial a minha

querida amiga Renata Meireles, que abraçou a minha causa e me ajudou em todos os

momentos.

À FACEPE, pelo apoio financeiro, através do fornecimento da bolsa de mestrado, que

me capacitou a participar neste projeto.

A todos que contribuíram direta e/ou indiretamente para a realização deste trabalho, o

meu profundo e sincero agradecimento!

vii

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS........................................................................................... ix

LISTA DE TABELAS.......................................................................................... x

LISTA DE SÍMBOLOS........................................................................................ xi

LISTA DE ABREVIATURAS.............................................................................. xii

RESUMO............................................................................................................ xiii

ABSTRACT........................................................................................................ xiv

CAPÍTULO 1....................................................................................................... 1

1.1 Introdução.................................................................................................... 1

1.2 Objetivos...................................................................................................... 3

1.2.1 Objetivo Geral............................................................................................ 3

1.2.2. Objetivos Específicos................................................................................ 3

1.3 Revisão da Literatura.................................................................................. 4

1.3.1 História do Queijo....................................................................................... 4

1.3.2 Queijo de Coalho....................................................................................... 4

1.3.3 Processo tecnológico de fabricação do queijo de coalho.......................... 6

1.3.4 Qualidade e segurança microbiológica do queijo de coalho...................... 10

1.3.5 Contaminação por Listeria monocytogenes............................................... 13

1.3.6 Listeriose.................................................................................................... 19

1.3.7 Quitosana................................................................................................... 23

CAPÍTULO 2.......................................................................................................

Queijo de coalho com cobertura de quitosana: Perfil físico-químico e

aceitação sensorial

28

2.1. Resumo....................................................................................................... 29

2.2 Introdução.................................................................................................... 30

2.3 Material e Métodos...................................................................................... 31

2.4 Resultados e Discussão............................................................................. 33

2.5 Conclusões.................................................................................................. 38

2.6 Abstract........................................................................................................ 38

2.7 Referências.................................................................................................. 39

viii

CAPÍTULO 3.......................................................................................................

Bioatividade de cobertura comestível de quitosana em queijo tipo

coalho na inibição de Listeria monocytogenes

44

3.1. Resumo....................................................................................................... 45

3.2 Abstract........................................................................................................ 46

3.3 Introdução.................................................................................................... 46

3.4 Material e Métodos...................................................................................... 48

3.5 Resultados e Discussão............................................................................. 51

3.6 Conclusões.................................................................................................. 57

3.7 Referências.................................................................................................. 58

DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÕES........................................................... 63

REFERÊNCIAS.................................................................................................. 65

ANEXO I............................................................................................................. 95

ANEXO II............................................................................................................ 96

ANEXO III........................................................................................................... 97

ANEXO IV........................................................................................................... 98

ANEXO V............................................................................................................ 99

ANEXO VI........................................................................................................... 101

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1 Fluxograma geral para a produção de queijo de coalho............................ 07

Figura 1.2 Prensa utilizada na fabricação do queijo de coalho produzido na

comunidade de Tiasol, em Tauá, CE.........................................................

11

Figura 1.3 Produção artesanal de queijo coalho no município de Jucati- PE............. 11

Figura 1.4 Condições de maturação do queijo de coalho produzido por pequenos

produtores no município de Jucati- PE......................................................

12

Figura 1.5 Local de exposição do queijo de coalho.................................................... 12

Figura 1.6 Tipo de caixa utilizada para o transporte do queijo de coalho produzido

na comunidade de Tiasol, em Tauá, CE....................................................

13

Figura 1.7 Exposição das peças de queijo de coalho no local de

comercialização.........................................................................................

13

Figura 1.8 Representação esquemática da estrutura química da quitosana.............. 24

Figura 2.1 Fluxograma do processo de produção do queijo de

coalho.........................................................................................................

31

Figura 2.2 Teste de intenção de compra de queijo de coalho adicionado de

cobertura comestível de quitosana em diferentes concentrações.............

38

Figura 3.1 Curva de sobrevivência de Listeria monocytogenes em queijo de coalho

adicionado de cobertura comestível de quitosana em diferentes

concentrações............................................................................................

53 Figura 3.2 Teste de intenção de compra de queijo de coalho adicionado de

cobertura comestível de quitosana em diferentes concentrações.............

57

x

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.1 Ocorrência de L. monocytogenes em queijos produzidos no Brasil 32

Tabela 1.2 Listeriose associado ao consumo de queijos.................................. 35

Tabela 2.1 Resultados médios das análises físico-químicas do queijo de

coalho adicionado de cobertura comestível de

quitosana.........................................................................................

49

Tabela 2.2 Resultados médios das notas atribuídas no teste de aceitação

para queijos de coalho com e sem adição da cobertura

comestível de quitosana..................................................................

51

Tabela 2.3 Aceitabilidade dos queijos de coalho com e sem adição da

cobertura comestível de quitosana, em diferentes concentrações,

por atributo avaliado........................................................................

51

Tabela 3.1 Contagem (Log UFC.ml-1) de Listeria monocytogenes em queijo

de coalho adicionado de cobertura comestível de quitosana com

diferentes concentrações.................................................................

67

xi

LISTA DE SÍMBOLOS

± Mais ou menos

GBS % Percentual de gordura em base seca

EST Extrato seco total

CD (%) Percentual de capacidade de derretimento

Di2 Diâmetro inicial ao quadrado

Df2 Diâmetro final ao quadrado

UFC/g Unidade formadora de colônia por grama

NMP/ml Número mais provável por mililitro

h Hora

ml/L Mililitro por litro

cm2 Centímetro cúbico

nm Nanômetro

UFC.ml-1 Unidade formadora de colônia por mililitro

ml Mililitro

v/v Volume por volume

µL Microlitro

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

a.C. Antes de Cristo

AM Amazonas

ATCC American TypeCultureCollection

Aa Atividade de água

BA Bahia

BHI Brain Heart Infusion

BPF Boas Práticas de Fabricação

C Amostra controle

CAV Centro Acadêmico de Vitória

CA Amostra controle com ácido acético 1%

Ca+2 Cálcio

CaCl2 Cloreto de cálcio

CDC Centers for Disease Control and Prevention

CE Ceará

DTA Doenças Transmitidas por Alimentos

EUA Estados Unidos da America

GlcN 2-anino-2-desoxi-D-glicopiranose

GlcNAc 2-acetamido-2-desoxi-D-glicopiranose

HCl Ácido clorídrico

IN Instrução normativa

LEAAL Laboratório de Experimentação e Análise de Alimentos

Log Logarítimo

MA Maranhão

MAPA Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento

Met Metionina

mg Miligrama

MG Minas Gerais

NaCl Cloreto de sódio

NaOH Hidróxido de sódio

PAT Pesquisa Agropecuária Tropical

PB Paraíba

PE Pernambuco

xiii

pH Potencial de hidrogênio

Phe Fenilalanina

RDC Resolução da diretoria colegiada

RJ Rio de Janeiro

RS Rio Grande do Sul

SIF Serviço de Inspeção Federal

SP São Paulo

T1 Amostra Queijo de coalho + cobertura de quitosana 5mg/ml



TO Tocantins

UFC Unidade Formadora de Colônia

UFPE Universidade Federal de Pernambuco

xiv

RESUMO

O queijo de coalho é um produto que apresenta insegurança microbiológica, sendo apontado

como um importante veículo de Listeria monocytogenes. O objetivo dessa pesquisa foi

verificar a bioatividade de quitosana como cobertura comestível em queijo de coalho na

inibição de Listeria monocytogenes. Para isso foram elaborados produtos com coberturas de

quitosana em diferentes concentrações: T1 (15mg/mL), T2 (10mg/mL) e T3 (5mg/mL). Como

controle utilizou-se amostras de queijo de coalho sem tratamento (C) e com coberturas de

ácido acético 1% (CA). A cinética de inibição bacteriana da cobertura de quitosana foi avaliada

através da contagem de células viáveis (curva de sobrevivência bacteriana) de Listeria

monocytogenes (ATCC 3533) durante os intervalos 0,1,2,4,8,12 e 16 dias de armazenamento,

após aplicação da cobertura. Os produtos foram avaliados quanto as características físico-

químicas, aos padrões microbiológicos sanitários e sensorialmente. Os resultados observados

no teste de inibição bacteriana contra Listeria monocytogenes apontaram o tratamento T1

como o mais eficiente, por proporcionar menores contagens da carga microbiana, em

comparação aos demais tratamentos, ao longo do período de armazenamento avaliado,

favorecendo reduções logarítmicas de 2,50; 2,46; 2,84; 1,41; 1,09; 1,38 e 0,81,

respectivamente. Quanto às características físico-químicas e aos padrões microbiológicos

sanitários, os produtos avaliados (T1, T2, T3, C e CA) se enquadraram nos requisitos exigidos

pela legislação para queijo de coalho. Verificou-se nos produtos variações de umidade entre

50,07±0,2 e 50,86±0,5 e de gordura entre 46,54±0,1 e 47,77±0,2. Quanto aos coliformes

termotolerantes observou-se que as amostras sob tratamento T1, T2, T3, e controles C e CA

apresentaram valores de: 1,51 x 10¹ NMP/mL, 1,83 x 10¹ NMP/mL, 1,95 x 10¹ NMP/mL, 2,40

10¹ NMP/mL e 1,99 x 10¹ NMP/mL, respectivamente. Na contagem de Staphylococcus

coagulase positivo as amostras apresentaram resultados < 10 UFC/g. Para L. monocytogenes

e Salmonella spp. não foi encontrada a presença destes microrganismos em 25g dos

produtos. Quanto as análises sensoriais, os resultados para a aceitação foram satisfatórios, e

verificou-se que a amostra com maior concentração de quitosana (T1) obteve o maior índice

de aceitabilidade para os atributos sabor (76,66%) e textura (78,33%), assim como melhores

resultados nos testes de preferência e intenção de compra. Concluiu-se que a cobertura

comestível de quitosana pode ser utilizada na conservação de queijo de coalho frente a

contaminação de Listeria monocytogenes, e que o emprego dessa tecnologia não altera os

parâmetros físico-químicos e aceitação sensorial do queijo de coalho.

Palavras-Chave: Antimicrobiano natural, conservação, revestimento, produto lácteo.

xv

ABSTRACT

The coalho-type cheese is a product its food security is not recommended and it has been

pointed out as an important vehicle for Listeria monocytogenes. The objective of this study

was to assess the bioactivity of chitosan as edible coating in coalho-type cheese in inhibiting

Listeria monocytogenes. For this purpose, treatments were realized with coating of chitosan in

different concentrations: T1 (15 mg.mL-1), T2 (10 mg.mL-1) and T3 (5 mg.mL-1). Untreated

samples of cheese were used as a control (C) and coated samples, only, with acetic acid 1%

(CA). Kinetic studies of bacterial inhibition from chitosan coating was assessed by viable cell

counting (microbial survival curves) of Listeria monocytogenes (ATCC 3533) during storages

intervals (0,1,2,4,8,12 e 16 days), after coating application. The products were also assessed

for physical-chemical and sensory characteristics, as well as, sanitary-microbiological criteria.

The results obtained from the test of inhibition against the Listeria monocytogenes showed T1

treatment as the most efficient, by providing a lower growth rate, compared to the other

treatments, during the storage period, representing a log reduction of 2.50; 2.46; 2.84; 1.41;

1.09; 1.38 e 0.81. In relation to the physical-chemical characteristics and sanitary-

microbiological criteria, the evaluated products (T1, T2, T3, C e CA) met the requirements by

the legislation for coalho-type cheese and showed moisture variations between 50.07±0.2 and

50.86±0,5; and fat from 46.54±0.1 to 47.77±0.2.Thermotolerant Coliforms counts were

detected in T1, T2, T3, C e CA samples that proved values: 1,51 x 10¹ MPN.mL-1, 1.83 x 10¹

MPN.mL-1, 1.95 x 10¹ MPN.mL-1, 2.40 10¹ MPN.mL-1 e 1.99 x 10¹ MPN.mL-1, respectively. The

counts of positive-coagulase staphylococci expressed results < 10 CFU.g-1. There was no

evidence of L. monocytogenes e Salmonella spp. in 25 grams of cheese. Application of

sensory test revealed that the addition of coating was well appreciated by a taste panel and

the sample with the highest concentration of chitosan (T1) was better accepted for taste

(76.66%) and texture (78.33%) attributes, in addition to superior performance in preference

test and intention to purchase. In summary that chitosan as edible coating can be used to

preserve coalho-type cheese against Listeria monocytogenes and the appropriate use this

technology cannot affect sensory properties and physical chemistry of the product.

Keywords: Natural Antimicrobial, conservation, coating, dairy product.

1

CAPÍTULO 1

1.1 Introdução

O Queijo de Coalho é um produto típico da Região Nordeste do Brasil e símbolo da

sua cultura. Apresenta-se como um componente alimentar diário e como um produto gerador

da renda familiar, sendo sua receita transmitida por gerações. Apesar de sua notoriedade é

um produto que não apresenta segurança sanitária, sendo apontado como um veículo

frequente de patógenos de procedência alimentar dentre os produtos lácteos.

A maior parte da produção de queijo de coalho é obtida em pequenas e médias

queijarias, em propriedades rurais de pequeno porte ou da agricultura de base familiar, as

quais movimentam, mensalmente, algo na ordem de milhões de reais, o que sinaliza a

importância dessa atividade no âmbito social e econômico local (NASSU; MACEDO; LIMA,

2006; MENEZES; SILVA; SAMUEL, 2012).

A identidade cultural juntamente ao isolamento das propriedades produtoras, fez com

que o queijo de coalho, principalmente o fabricado artesanalmente (segundo métodos

tradicionais, individuais e até mesmo rudimentares), sobrevivesse a modernização dos

processos produtivos e resistisse as exigências especificadas pela legislação quanto a sua

produção e se apresentasse como um produto sem padronização, apesar de ser típico, e

inseguro para o consumo, do ponto de vista higiênico-sanitário (DUARTE et al., 2005;

CAVALCANTE et al., 2007; SEBRAE, 2008a; DANTAS, 2012).

A insegurança microbiológica do queijo de coalho devido à contaminação microbiana

é de grande importância tanto para a indústria, pelas perdas econômicas, bem como para a

saúde pública, pelo risco de causar Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) (FEITOSA et

al., 2003; RUWER; MOURA; GONÇALVES,2011).

Dentre os microrganismos patogênicos causadores de DTA Listeria monocytogenes é

considerada como um patógeno de grande importância para a área de alimentos (SILVA et

al., 2011). Este microrganismo tem sido encontrado em um ampla variedade de produtos

2

alimentícios, seja frescos ou congelados, tais como: produtos vegetais, frutas, frutos do mar,

frango, carnes, leite e em queijos (JAY, 2005).

Em queijos de coalho estudos apontam incidência de L. monocytogenes em

percentuais consideráveis (SOUSA; LIMA; SOUSA, 2000; LEITE et al., 2002; BRANCO et al.,

2003; FEITOSA et al., 2003; SOUSA et al., 2006).

A presença de L. monocytogenes nos queijos, de um modo geral, é preocupante, por

se tratar de um produto que, também, é consumido cru, e pelo fato de que a refrigeração,

condição no qual esse tipo de produto deve ser armazenado, não impede o crescimento e

desenvolvimento desta bactéria (BARANCELLI et al., 2011).

Assim, o emprego das Boas Práticas de Fabricação (BPF) (BEZERRA, 2008; FAEP,

2012) associado a novas tecnologias de conservação microbiológica tornam-se essenciais,

com a finalidade de aprimorar a qualidade e estabilidade microbiológica de produtos

processados como o queijo de coalho.

Dentre vários conservantes alimentares naturais estudados e utilizados com esta

finalidade, a quitosana destaca-se por ser um polímero muito versátil, com ampla

aplicabilidade na indústria alimentícia, sendo empregado, por exemplo: como base na

elaboração de suplementos nutricionais, emulsificantes, fibra em biscoitos dietéticos,

estabilizantes em alimentos em conserva, clarificantes de bebidas (SHAHIDI et al., 1999;

BORDERÍAS et al., 2005; BORGOGNI et al., 2006; LI et al., 2007), como agente conservante

em macarrão, molho de soja, sardinha (RODRÍGUEZ et al., 2002), bacalhau (SHAHIDI et al.,

2002), carne de cordeiro (KANATT et al., 2004), salsicha (DAMIAN, 2005), mortadela (CHI et

al., 2006), patê de carne (BENTO et al., 2011); suco de acerola (ALBUQUERQUE;

STAMFORD, 2011); como filme protetor em caju (OLIVEIRA, 2011), mamões (ALI et al.,

2011), e em maçãs (ASSIS; LEONI, 2003; JORGE et al., 2011), dentre outras aplicabilidades.

As possibilidades de sua aplicação como conservante nos alimentos são ainda mais

enriquecidas pelo fato da quitosana poder ser preparada em diferentes formas (CAMPANA et

al., 2007), por inibir uma ampla faixa de microrganismo (FAI, 2008a), por propiciar uma melhor

qualidade ao produto, pela utilização de uma substância natural e atóxica e por ser

biodegradável, não gerando agressão ao meio ambiente (DIAS et al., 2013).

3

1.2 Objetivos

1.2.1. Objetivo geral

Avaliar a bioatividade de quitosana como cobertura comestível em queijo de coalho na

inibição de L. monocytogenes.

1.2.2. Objetivos específicos

Avaliar as características físico-químicas do queijo de coalho revestidos com cobertura

comestível de quitosana;

Avaliar o queijo de coalho revestidos com cobertura comestível de quitosana quanto

aos padrões microbiológicos sanitários;

Verificar a influência da aplicação da cobertura comestível de quitosana em queijo de

coalho sobre os atributos sensoriais de aceitação e preferência dos produtos;

Avaliar a eficácia da cobertura comestível de quitosana em queijo de coalho, com

diferentes concentrações, na inibição microbiana de cepas de L. monocytogenes.

4

1.3 Revisão da Literatura

1.3.1 História do Queijo

A arte de fabricação dos queijos é muito remota, sendo este alimento um dos mais

antigos de que se tem registro. Embora não se tenha certeza na precisão da data de sua

origem a história do queijo remonta algo em torno de 8.000 a.C. (BERESFORD et al., 2001).

Na literatura são encontradas várias versões que explicam sua origem. Para os antigos

gregos a descoberta do queijo é explicada por uma lenda mitológica que atribui o feito a

Aristeu, filho do deus Apolo, rei da cidade de Arcádia. Outra lenda atribui a um nômade árabe

a descoberta do queijo, ao observar que após armazenar um pouco de leite em um cantil feito

de estômago seco de carneiro havia ocorrido a coagulação do leite. Independente de como

ele foi descoberto, o que se sabe é que o queijo foi utilizado ao longo do tempo como uma

forma de preservação do leite (PERRY, 2004).

Com o passar dos anos o processo tecnológico de produção do queijo foi evoluindo,

afim de atender as demandas sociais e aos paladares mais diversos e exigentes. Variações

na origem do leite, nas técnicas de processamento e no tempo de maturação criaram a imensa

variedade de queijos hoje conhecida, incluindo os de nível nacional, sendo alguns de

expressão regional (BORGES, 2003; DANTAS, 2012).

Dentre muitas variedades encontra-se o queijo de coalho, que devido a seus atributos

apresenta grande aceitação comercial. Seu sabor e consistência peculiar o colocam hoje entre

os principais tipos de queijos nacionais (SEBRAE, 2008a).

1.3.2 Queijo de Coalho

O queijo de Coalho é produzido há mais de 150 anos em vários estados da região

Nordeste do Brasil. O início de sua fabricação ocorreu com a chegada do gado bovino trazido

pelos Portugueses (SEBRAE, 2008a). Atualmente sua produção é tida como uma prática

tradicional entre os produtores de laticínios, devido principalmente à simplicidade da

tecnologia de fabricação, elevado rendimento do processo e grande popularidade do produto

(LIMA, 2010; ARAÚJO et al., 2012; MENEZES; SILVA; SAMUEL, 2012).

5

Nos Estados do Rio Grande do Norte, Ceará, Pernambuco, Paraíba e Alagoas, o queijo

de coalho ganha destaque entre os principais tipos de queijos de fabricação e consumo, pois

está comprovadamente incorporado à cultura regional (MORAIS, 1995; MUNCK, 2004;

ARAÚJO et al., 2012).

O Estado Alagoano dispõe de duas bacias leiteiras significativas, situadas na região

do Agreste e do Sertão Alagoano onde a principal atividade desse arranjo produtivo refere-se

ao seguimento de laticínios e a produção de queijo de coalho (SEBRAE, 2008b).

No Estado de Pernambuco o queijo de coalho é tido como uma representação genuína

da tradição e cultura local, sendo sua produção de importante relevância econômica e social,

especialmente para os pequenos produtores do Agreste e Sertão, onde esta atividade

constitui um dos principais suportes econômicos para as microrregiões do Vale do Ipojuca,

Vale do Ipanema e Garanhuns, além de apresentar uma importância relativa na Zona da Mata,

Sertão do São Francisco, Sertão do Araripe e Sertão do Pajeú, de acordo com Almeida, Júnior

Fernando e Guerra (2010).

A indústria queijeira no Estado do Ceará contribui com forte expressão de comércio,

contando com várias unidades produtoras em diversos municípios do estado. Um diagnóstico

realizado pelo SEBRAE/CE (1998) aponta um consumo diário de 26,4% de queijo de coalho

pela população, consultada em Fortaleza, e 27,7% no interior do Estado do Ceará.

No Rio Grande do Norte, por uma condição histórica, o queijo de coalho possui uma

grande importância, e a atividade de sua produção é uma das mais valorizadas culturalmente,

elevando a região ao reconhecimento em outros estados brasileiros, pelo consumo e

produção desse produto (NASSU, 2005).

De acordo com Soares et al. (2011), no Estado paraibano a produção e

comercialização do queijo de coalho é um importante negócio. A maior parte (73,68%) das

indústrias produtoras de queijos no estado da Paraíba produzem queijo de coalho, e este é o

item mais representativo do mix de produtos destas empresas.

No Nordeste do Brasil, de modo geral, a produção do queijo de coalho é realizada

principalmente por pequenos e médios laticínios, que utilizam essa prática para reforçar a

continuidade e permanência em um território que é lugar de vida e trabalho, do qual representa

uma atividade bastante significativa para a economia regional, visto que em determinadas

localidades é a principal fonte de renda e sobrevivência da população (SEBRAE, 2008a;

ALMEIDA; JÚNIOR FERNANDO; GUERRA, 2010; LIMA, 2010; ARAÚJO et al., 2012;

MENEZES; SILVA; SAMUEL, 2012).

Em 2006 Nogueira Filho et al. classificaram as queijarias do Nordeste como empresas

familiares (95%), societária (3%) e cooperativada (2 %), sendo a principal forma jurídica a

6

informal (71,6%), onde grande parte da produção ainda é feita de forma artesanal (CHALITA

et al., 2010; ARAÚJO et al., 2011). A fabricação de queijos artesanais utiliza tecnologias

próprias e rudimentares pelos produtores de menor renda e pelos grupos influenciados pela

identidade cultural (SOBRAL; PAULA; SILVA, 2007).

1.3.3 Processo tecnológico de fabricação do queijo de coalho

Atualmente no Brasil, a fabricação de queijo de coalho é regulamentada por meio da

instrução normativa (IN) nº 30, do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA),

que aprova o regulamento técnico de identidade e qualidade do Queijo de coalho e estabelece

a identidade e os requisitos mínimos de qualidade que deverá cumprir a fabricação do queijo

de coalho destinado ao consumo humano, bem como pela Portaria nº146 de 7 de março de

1996, do Ministério da Agricultura do Abastecimento, que aprova o regulamento técnico de

identidade e qualidade dos Queijos (BRASIL, 1996; 2001).

Entende-se por queijo o produto fresco ou maturado que se obtém por separação

parcial do soro do leite ou leite reconstituído (integral, parcial ou totalmente desnatado), ou de

soros lácteos coagulados pela ação física do coalho, de enzimas específicas, de bactéria

específica, de ácidos orgânicos, isolados ou combinados, com ou sem agregação de

substâncias alimentícias e, ou especiarias e, ou condimentos, aditivos especificamente

indicados, substâncias aromatizantes e matérias corantes (BRASIL, 1996).

De modo generalista a produção dos queijos constitui basicamente um processo de

concentração do leite no qual envolve etapas básicas, comum a todos os queijos, das quais

são: coagulação, sinérese, corte da coalhada, enformagem/prensagem, salga e maturação

(Figura 1.1) (PERRY, 2004; PAULA; CARVALHO; FURTADO, 2009).

A seleção do leite é uma etapa primordialmente importante que antecede a fabricação

dos queijos. A qualidade microbiológica e química do leite está estritamente ligada ao sucesso

na fabricação do queijo. O leite utilizado deve respeitar os quesitos estipulados pela

legislação. Para a produção do queijo de coalho a IN nº 30 (BRASIL, 2001) orienta que o leite

a ser utilizado deverá ser higienizado por meios mecânicos adequados e submetido à

pasteurização ou tratamento térmico equivalente, de modo que assegure a fosfatase alcalina

residual negativa.

Diante dos diversos problemas ocasionados pelo consumo de leite e derivados

oriundos de leite cru, o processo de pasteurização do leite tornou-se exigência de legislações

específicas, as quais atualmente se encontram estabelecidas na Instrução Normativa 62

7

(BRASIL, 2011) que preconiza que a pasteurização do leite utilizado na fabricação dos queijos

seja realizada à temperatura de 72ºC a 75°C durante 15 a 20 segundos.

Figura 1.1 – Fluxograma geral para a produção de queijo de coalho

Fonte: DANTAS, 2012.

A Coagulação é a primeira etapa básica do processamento de queijos. Compreende a

transformação do leite fluído para um estado em gel, também conhecido como coalhada (FOX

et al., 2000).

Filtração

Pasteurização

Resfriamento Aquecimento

Adição do Coalho

Corte da Coalhada

Aquecimento do Soro

Aquecimento da Massa

Segunda Dessoragem

Salga

Enformagem

Maturação

Embalagem

Recepção do leite

Comercialização

Adição de Fermento/ CaCl2

Coagulação

Repouso

Primeira Dessoragem

8

O mecanismo de formação da coalhada ou coágulo decorre por meio de modificações

físico-químicas provocadas na estrutura das micelas de caseína, principal proteína do leite.

Esta ação pode ser promovida por meio de acidificação ou por ação enzimática (ADAMS,

1997; PERRY, 2004).

A coagulação pelo modo enzimático é o processo mais utilizado e é obtido por atuação

de enzimas específicas conhecidas como coalho ou coagulantes. A designação coalho é

particular às enzimas obtidas de estômago de animais ruminantes já a denominação

coagulante fica direcionada para todas as outras enzimas utilizadas para o processo de

coagulação, como por exemplo, os coagulantes vegetais e microbianos (FOODS

INGREDIENTS BRASIL, 2011).

A IN nº 30 (BRASIL, 2001) define que o queijo de coalho se obtém por coagulação do

leite (por um período de 40 minutos) através da ação do coalho ou outras enzimas coagulantes

apropriadas, complementada ou não pela ação de bactérias lácteas selecionadas.

Tradicionalmente no fabrico de queijos utilizam-se os coalhos de origem animal,

principalmente de ascendência bovina e suína. Porém devido as necessidades especiais do

mercado foram desenvolvidos coalhos de procedência microbiana e vegetal. Os coalhos

vegetais apresentam em geral, bom desempenho, porém um inconveniente à sua aplicação

é o sabor residual amargo que os queijos produzidos com ele costumam apresentar depois

de algum tempo de armazenamento. Os coalhos de origem microbiana possuem atributos

bastante análogos aos de procedência animal (PERRY, 2004).

No processo de coagulação por modo enzimático a enzima irá atuar hidrolisando as

ligações peptídicas da κappa caseína, pela proteólise limitada (quebra da ligação peptídica

Phe105 – Met106), transformando-a em para-caseína, que se agrega em presença de íons Ca+2

formando, assim, o gel de coalhada, onde todos os componentes do leite (principalmente

proteínas e gordura) são aprisionados na estrutura formada (PAULA; CARVALHO;

FURTADO, 2009; FOODS INGREDIENTES BRASIL, 2011).

A adição de cloreto de cálcio (CaCl2) durante a coagulação é comum, permitido por lei

(BRASIL, 2001) e é utilizada com o intuito de aumenta o teor de íons Ca2+ no leite para acelerar

a coagulação da caseína e ajudar a firmar o coágulo. É empregado, especialmente, quando

o teor de proteína no leite não é o ideal (PERRY, 2004).

Após a formação da coalhada é realizado a etapa de corte seguido da mexedura da

massa, para a liberação do lacto soro (processo chamado de sinérese ou dessoragem). O

corte do coágulo deve ser efetivado no momento correspondente (ponto de corte); se

realizado antes, devido à natureza delicada do coágulo, ocorrerá um menor rendimento,

devido às perdas de proteína e gordura e, se realizado depois do ponto, o coágulo estará

9

muito rígido e dessa forma a dessoragem torna-se mais difícil, resultando em queijos com

variações de umidade (BORZANI et al., 2001).

O lactosoro, cujo teor varia com o tipo de queijo, retém cerca de 55% dos nutrientes

do leite (proteínas, sais minerais e vitaminas). Aproximadamente 75% das proteínas do leite

são aproveitadas em queijos obtidos por coagulação enzimática, o restante é retido no soro.

Cerca de 85% a 90% do volume de leite utilizado na fabricação do queijo resulta em soro,

sendo parte desse subproduto aproveitado como matéria-prima na produção de iogurtes,

ricota e outros produtos lácteos (KOSIKOWSKI, 1982; FOX; MCSWEENEY, 1998; WALSTRA

et al., 1999; PERRY, 2004).

Alguns fatores favorecem o processo de dessoragem, tais como: menor espessura do

corte, presença de íons de cálcio, baixo pH, aumento da temperatura de cozimento, mexedura

da coalhada durante o cozimento, maior teor de proteínas e menor teor de gordura (PAULA;

CARVALHO; FURTADO, 2009).

Após este processo a massa pode ser reaquecida com água quente ou vapor indireto

até obtenção de massa semi cozida (até 45ºC) ou cozida a uma temperatura entre 45º e 55ºC.

A legislação, IN nº 30 (MAPA), prediz que esse queijo também poderá ser elaborado a partir

de massa crua (sem aquecimento) (BRASIL, 2001).

Posteriormente a massa, aquecida ou não, é separada do soro e segue para as etapas

de enformagem e salga. A salga (adição de cloreto de sódio) é uma etapa independente e

pode ocorrer em distintos momentos da fase produtiva. Os métodos mais comuns de salga

são: no leite, na massa, em salmoura e a seco. A adição de cloreto de sódio (NaCl) é de

grande importância, uma vez que possui várias funções nos queijos, exercendo ampla

influência na maturação, de modo que se não for bem conduzida, pode ser causa de diversos

defeitos nos queijos (PAULA; CARVALHO; FURTADO, 2009). O teor de sal no queijo de

coalho não é determinado por legislação, porém a IN nº30 (BRASIL, 2001) especifica que a

adição de sal (cloreto de sódio) deve ser feita na massa. Cavalcante et al. (2007) afirmam que

a quantidade de sal usada para o queijo Coalho comum é 0,8-1,0% e para o queijo Coalho no

espeto ou palito é 1,2%, calculada sobre o volume de leite processado.

Na etapa de enformagem/prensagem a massa é depositada em formas, de tamanho

e formatos específicos, para que ocorra a drenagem do soro entre os grãos e se forme uma

massa contínua e homogênea (PAULA; CARVALHO; FURTADO, 2009).

A maturação é a última etapa de processamento do queijo. Nessa fase o produto é

mantido sob determinadas condições de temperatura e (10ºC a 12°C) umidade relativa (75%

a 80%), para desenvolver textura, aroma e sabor, devido as numerosas modificações

microbiológicas, bioquímicas, físicas e químicas que ocorrem neste momento (NASSU;

10

MACEDO; LIMA, 2006; CAVALCANTE et al., 2007; PAULA; CARVALHO; FURTADO, 2009).

A IN n° 30 institui que o queijo de coalho deve ser maturado por um período entre 5 a 10 dias

sob refrigeração (BRASIL, 2001).

Apesar das exigências legais estabelecidas, a fabricação do queijo de coalho, na

grande maioria, não obedece o que é preconizado pela legislação (DANTAS, 2012).

Com isso, este produto apresenta uma grande probabilidade de encontrar-se

contaminado, devido ao uso de matérias-primas de fontes não seguras, falta de higiene

durante o processamento, armazenamento e transporte (OLIVEIRA et al., 2010).

1.3.4 Qualidade e segurança microbiológica do queijo de coalho

A pesar de sua notoriedade, principalmente para a região Nordeste do Brasil, o queijo

de coalho ainda está associado a uma imagem de alimento pouco seguro, do ponto de vista

higiênico-sanitário, para a saúde do consumidor, em função de problemas atrelados a sua

produção, sobretudo no que tange ao modo artesanal de sua fabricação (OLIVEIRA et al.,

2010).

Grande parte da produção tem origem na fabricação artesanal, sendo oriunda de

produção caseira, em propriedades rurais de pequeno porte ou da Agricultura de Base

Familiar (GOMES et al., 2011; ARAÚJO et al., 2012; DANTAS, 2012).

Menezes, Silva e Samuel, (2012), ao conhecerem produtores/comerciantes de queijo

de coalho, constataram que, mesmo diante dos avanços técnico-científicos a produção de

queijos, exibem uma resistência as inovações e estes produtores/comerciantes dão

continuidade em transmitir o saber-fazer.

O saber-fazer engloba os conhecimentos e técnicas utilizadas na elaboração do queijo

de coalho herdado dos antepassados, bem como os instrumentos empregados no seu

beneficiamento, que condizem com a realidade estrutural-financeira de cada produtor (Figura

1.2 e 1.3).

Por não necessitar de equipamentos caros no processo produtivo e pela simplicidade

no processo tecnológico de fabricação o modo de processamento do queijo de coalho é

realizado de maneira rudimentar e formas variáveis (Figura 1.3), resultando em produto com

variações de processamento, sem padronização, apesar de ser tradicional, e com baixa

qualidade (ANDRADE, 2006; GOMES et al., 2011; ARAÚJO et al., 2012; DANTAS, 2012).

11

Figura 1.2 – Prensa utilizada na fabricação do

queijo de coalho produzido na comunidade de

Tiasol, em Tauá, CE

Figura 1.3 - Produção artesanal de queijo

coalho no município de Jucati- PE

Fonte: ARAÚJO, et al., 2012.

Fonte: FREITAS FILHO, et al., 2009.

A lacuna de cuidados quanto à qualidade da matéria prima e as condições de

processamento introduzem no mercado produtos de pouca qualidade e insuficiente segurança

higiênico-sanitário, por não atenderem aos requisitos mínimos de qualidade exigidos pela

legislação quanto ao queijo de coalho fabricado para o consumo humano (DUARTE et al.,

2005; ANDRADE, 2006; LIMA, 2010; ALMEIDA; JÚNIOR FERNANDO; GUERRA, 2013).

O principal aspecto pertinente ao empenho da qualidade da matéria-prima relaciona-

se ao uso de leite cru, sem pasteurização, obtido sem os devidos cuidados de higiene e sem

beneficiamento térmico adequado (GOMES et al., 2011; PACHECO, 2011; DANTAS, 2012;

FREITAS; TRAVASSOS; MACIEL, 2013).

Apesar das exigências legais que institui a pasteurização do leite (ou submissão a

tratamento térmico equivalente), como um dos requisitos mínimos a ser cumprido para

destinação desse tipo de queijo ao comércio, e pelo discurso da segurança alimentar, criado

para avigorar a seriedade da pasteurização do leite na fabricação de queijos sobre o

entendimento de que a inocuidade dos produtos lácteos começa pela pasteurização do leite,

uma vez que o leite cru pode aninhar microrganismos patogênicos, representando riscos à

saúde, o uso de leite cru ainda é uma realidade persistente (BRASIL, 2001; DUARTE et al.,

2005; CAVALCANTE et al., 2007; ARAÚJO, et al., 2009; FREITAS; TRAVASSOS; MACIEL,

2013).

Se tratando das condições de processamento (técnicas e estruturas de fabrico), estas

também ficam à margem dos padrões oficiais (Figuras 1.4 e 1.5), e o principal entrave quanto

12

a este quesito se reporta a não adoção ou deficiência nos procedimentos de BPF (SENA et

al., 2000; ESCOBAR et al., 2001; FEITOSA et al. 2003; DUARTE et al., 2005; LUZ, 2008).

Figura 1.4 – Condições de maturação do queijo

de coalho produzido por pequenos produtores no

município de Jucati- PE

Figura 1.5 – Local de exposição do queijo de

coalho



É sabido que as condições de processamento são imprescindíveis para a obtenção de

produtos de qualidade e para a proteção da saúde do consumidor, uma vez que a presença

de certos microrganismo e suas toxinas constituem as causas mais frequentes de problemas

sanitários relacionados aos produtos lácteos (FURTADO, 1990, 1991; FOX, 1993; ARAÚJO

et al., 2009; FREITAS; TRAVASSOS; MACIEL, 2013).

A falta de cuidado higiênico-sanitário no ambiente de produção de queijo de coalho

consiste em uma problemática séria por se tratar de produto altamente manipulado que

viabiliza a presença de microrganismos indicadores e contaminação por bactérias

patogênicas no produto final (RUWER; MOURA; GONÇALVES, 2011).

Esta problemática ainda se agrava devido às condições precárias nas etapas pós-

processamento (transporte, armazenamento e comercialização) do queijo de coalho (Figura

1.6 e 1.7).

As áreas de venda apresentam infraestrutura inadequada, falta de acesso à água

potável e a instalações sanitárias sem contar que, as vendas desses alimentos, na maioria

das vezes, são realizadas por pessoas sem capacitação e conhecimento para a manipulação

correta, sob condições de higiene insatisfatórias e armazenamento inadequado o que faz

aumentar os riscos do produto servir como veículo de doenças (CATANOZI; MORELHÃO;

13

IURCIC, 1999; DALLARI et al., 2000; HANASHIRO et al., 2002; FURLANETO; KATOAKA,

2004).

Figura 1.6 – Tipo de caixa utilizada para o

transporte do queijo de coalho produzido na

comunidade de Tiasol, em Tauá, CE

Figura 1.7 – Exposição das peças de queijo de

coalho no local de comercialização

Fonte: ARAÚJO, et al. 2012. Fonte: ARAÚJO, et al. 2012.

Devido à precariedade com que este alimento é preparado e comercializado, o queijo

de coalho torna-se um produto de vida de prateleira reduzido pela suscetibilidade a

contaminações microbianas, em função das suas características nutritivas e da contaminação

cruzada durante ou após o processamento, e um potente veículo de contaminantes, dentre

os quais se pode citar a L. monocytogenes, que constitui um importante indicador do aspecto

higiênico-sanitário, caracterizando condições higiênicas insatisfatórias além de representar

um risco à saúde do consumidor devido a sua patogenicidade (BALBANI; BUTUGAN, 2001;

NASCIMENTO et al., 2001; PAGANI et al., 2012).

1.3.5 Contaminação por Listeria monocytogenes

L. monocytogenes é uma bactéria Gram-positiva, não produtora de esporos ou

cápsulas, possui motilidade em determinadas condições (entre 20 e 25ºC), e ainda apresenta

natureza microaerófila (ROCOURT; BUCHRIESER, 2007). A temperatura ótima de

crescimento deste microrganismo fica na faixa de 30 a 37ºC (SILVA et al., 2011), porém é

capaz de multiplicar-se sob refrigeração e crescer a baixas temperaturas, inferiores ao ponto

de congelamento, suportando repetidos congelamentos e descongelamentos, o que torna um

14

desafio o seu controle na cadeia de produção de alimentos (FARBER et al., 1991;

SWAMINATHAN; GERNER-SMIDT, 2007).

Podem, ainda, crescer em pH variando entre 5 e 9, atividade de água (Aw) mínima de

0,9 e toleram altas concentrações de cloreto de sódio, superiores a 10% (SILVA et al., 2011).

O habitat natural de L. monocytogenes é o ambiente (FRANCO; LANDGRAF, 2005a),

isso explica o fato dessa bactéria ser facilmente encontrada em alimentos de origem animal e

vegetal, “in natura” ou processados. O leite e seus derivados estão entre os produtos

alimentícios mais frequentes (BARANCELLI et al., 2011).

A natureza ubíqua de L. monocytogenes torna a sua transferência para dentro das

unidades processadoras de alimentos uma ação simples, facilitando, assim, a contaminação

dos alimentos nos ambientes de processamento e a formação dos biofilmes que, por vez,

acaba provocando contaminações recorrentes no produto final devido a sua permanência no

ambiente durante meses ou anos (WAAK et al., 2002; SILVA et al., 2003; KABUKI et al., 2004;

KELLS; GILMOUR, 2004; CAGRI-MEHMETOGLU et al., 2011).

A entrada deste microrganismo nas indústrias lácteas ocorre por distintas vias,

iniciando pela qualidade do leite. Sua presença na matéria prima pode acontecer devido a

eliminação de cepas por animais portadores, assintomáticos ou sintomáticos e/ou pela

contaminação cruzada no momento da ordenha mal executada, quando se utiliza leite cru no

beneficiamento, e pela pasteurização inadequada (SWAMINATHAN, 2001; IVANEK et al.,

2006).

Um levantamento realizado por Silva et al. (2011) sobre a ocorrência de L.

monocytogenes em leite e derivados, entre 2000 e 2009, no Brasil, demonstra uma ocorrência

de até 37,8% deste patógeno em leite cru e em leite pasteurizado este percentual chegou a

ser de até 30%. Os autores afirmam que esses resultados são um indicativo de erros que

ocorrem no processamento térmico de alguns produtos, uma vez que a pasteurização

realizada em temperatura e tempo corretos elimina esse microrganismo.

A literatura também tem descrito intercorrências por contaminação cruzada

subsequente ao processo de pasteurização, por meio de utensílios e equipamentos

contaminados, sistema de ventilação, água, veiculação do agente por operários e/ou

visitantes doentes ou por resíduos, carreando pelo seu fardamento, entre outros pontos

críticos de controle. Este fato aliado, em especial, a não adoção das BPF perpetua o ciclo de

transmissão desta bactéria na cadeia produtiva de laticínios (SWAMINATHAN, 2001;

TOMPKIN, 2002).

Em Fortaleza, Figueiredo (2000) detectou a presença de L. monocytogenes em leite

pasteurizado e em amostras de leite cru, fresco e refrigerado avaliadas em uma indústria

15

beneficiadora de leite. No mesmo estudo foi detectado a presença do patógeno em tanque de

recepção do leite cru, caixas plásticas de transporte de leite, drenos e pisos.

Estudo realizado na Suécia constatou a presença de cepas de L. monocytogenes,

sorotipo 3b, em silos de armazenamento de leite em uma planta de processamento de queijo

blue veined (WAAK et al., 2002).

Kells e Gilmour (2004) verificaram alta ocorrência de L. monocytogenes em amostras

de leite cru, equipamentos e no ambiente de processamento em indústria de processamento

de leite. O percentual de contaminação foi de 22%, 6% e 41%, respectivamente, e as

principais fontes de contaminação apontadas foram os drenos e as escadas de aço inoxidável.

Ho, Lapp e Wiedmann (2007) associaram o ambiente de ordenha como vias de

transmissão de L. monocytogenes na indústria de laticínios de leite de ovelha nos EUA.

Mais recentemente, Alessandria et al. (2010) observaram a presença de L.

monocytogenes em superfícies de equipamentos e ambientes de indústria processadora de

lácteos.

Frece et al. (2010) também constataram positividade para a presença do

microrganismo, ao testarem diferentes métodos de detecção do patógeno em amostras de

leite, queijo fresco e creme de leite.

Munoz et al. (2013) averiguaram que 10,4% dos manipuladores de alimentos de

produtos lácteos e cárneos na Colômbia apresentaram resultado positivo para a presença do

patógeno, sendo 56% destes portadores pertencendo a empresas produtoras de produtos

lácteos.

Parisi et al. (2013) detectaram L. monocytogenes em 20,6% das fábricas de produtos

lácteos avaliadas que apresentaram positividade para Listeria spp., sendo encontradas em

amostras de alimentos (2,4%), superfícies (4,9%) e drenos (18,8%).

Rückerl et al. (2014) observaram um cenário de contaminação substancial ao

encontrarem taxas de ocorrência global de 19,5%, para a presença de L. monocytogenes no

ambiente de processamento de alimentos, matérias-primas e de produtos de uma unidade

produtora de laticínios.

Nas indústrias processadoras de queijo, os mesmos pontos crítico de controle também

têm sido evidenciados como fatores responsáveis pela contaminação cruzada deste produto.

Silva et al. (2003) diagnosticaram a contaminação do queijo Minas frescal ao mesmo tempo

que detectaram a presença deste patógeno no leite cru e no piso da sala de estocagem do

leite.

L. monocytogenes, sorotipo 1/2a de mesmo perfil genético, foram identificados em

queijos, equipamentos e utensílios em uma indústria processadora de queijo Minas em Minas

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160514003924

16

Gerais. O refrigerador do estoque foi apontado como a fonte de contaminação dos queijos por

esta bactéria (BRITO et al., 2008).

Kabuki et al. (2004) ao realizarem um diagnóstico da contaminação por L.

monocytogenes em indústrias norte americana processadoras de queijos frescos averiguaram

a presença em 6,3 % nas amostras de queijos e em 11% das amostras ambientais, que

apontavam: superfícies de mesas, tubos de conexões de plástico, caixas vazadas,

embalagem de leite, drenos e pisos como locais de permanência do microrganismo.

Makinoet al. (2005) verificaram resultados semelhantes em várias amostras do

ambiente de processamento em uma unidade produtora de queijos no Japão. A

contaminação foi constatada pela presença de cepas do sorotipos 1/2a, 1/2b e 4b no tanque

de resfriamento do leite, na sala de produção e cura, dreno e fezes de trabalhadores.

Fox et al. (2011) ao avaliarem a presença de L. monocytogenes em instalações de

fabrico de queijo observaram que grande parte das amostras avaliadas apresentaram

positividade para a presença desta bactéria. Sendo observado um percentual de

contaminação em 6,3% no leite, 13,1% no ambiente de processamento e 12.3% nas amostras

externas ao ambiente de processamento.

Almeida et al. (2013) também encontraram a presença de L. monocytogenes dentro

dos ambientes de fabricação de unidades produtoras de queijos de ovelha artesanal e

industrial.

Barancelli et al. (2014) ao avaliarem a ocorrência de L. monocytogenes em queijo e no

ambiente de três fábricas de lacticínios de pequena escala também encontraram positividade

para a bactéria.

Os queijos são os produtos lácteos mais comumente contaminados por L.

monocytogenes, principalmente os de alta e média umidade (BARANCELLI et al. 2011). Isso

faz com que os queijos sejam apontados como um importante veículo desse patógeno.

Borges et al. (2009), em sua pesquisa sobre a contaminação de leite e produtos lácteos

causada por L. monocytogenes, afirmam que a prevalência desta bactéria tem sido relatada

em diferentes tipos de queijos em diversos países e que a ocorrência chega a ser de até 46

%. No Brasil, Silva et al., (2011) registraram resultados semelhantes, com uma ocorrência de

até 48,3% do patógeno em diversos queijos produzidos entre o período de 2000 à 2009. Na

Tabela 1.1 estão descritos estudos que apontam a ocorrência de L. monocytogenes em

queijos produzidos no Brasil.

17

Tabela 1.1- Ocorrência de L. monocytogenes em queijos produzidos no Brasil

Produtos % de amostras contaminadas

por L. monocytogenes Local Referência

Minas frescal 10% Campinas, SP Destro et al. (1991)

Minas frescal 6,7% São Paulo, SP Furlanettoet al.

(1996)

Minas frescal

artesanal 41,2% R. de Janeiro, RJ Silva et al. (1998)

Minas frescal e

ricota 3% R. de Janeiro, RJ Silva et al. (1998)

Brie, Gorgonzola,

Roquefort 5,7%

Rio de Janeiro -

RJ Silva et al. (1998)

Queijo Minas frescal 25% Campinas - SP Vieira e Massaguer

(2000)

Queijo tipo coalho 20% João Pessoa -

PB Sousa et al. (2000)

Queijo Minas frescal 4,8% Minas Gerais Pereira et al. (2001)

Queijo Minas frescal 15% Jaboticabal - SP Schocken-Iturrinoet

al. (2001)

Queijo Minas frescal 8,0% Araguaína - TO Vieira et al. (2001)

Diversos tipos de

queijo 3,1%

Várias cidades –

MG Ornelas et al. (2002)

Queijo de média

umidade 8,0%

Rio Grande do

Sul

Pompermayeret al.

(2002)

Queijo curado 48,3% Salvador – BA Leite et al. (2002)

Queijo 6,9% Paraná Moscalewskiet al.

(2003)

Queijo tipo coalho

artesanal 1,7% Manaus - AM

Ramos e Costa

(2004)

Queijo Minas frescal 16% Rio de Janeiro Sá et al. (2003)

Queijo coalho 2,3% Ceará Borges et al (2004)

Queijo coalho 16% Fortaleza - CE Castelo Branco et al.

(2004)

Queijo Minas frescal

artesanal 2,5%

Serra da

Canastra – MG Ornelas et al. (2005)

18

Produtos % de amostras contaminadas

por L. monocytogenes Local Referência

Ricota 6,8% Campinas - SP Esper e Kuaye

(2005)

Queijo Minas

artesanal 3,8%

Região litorânea

– RS Zaffari et al. (2005)

Queijos 6,0% Paraná Abrahão et al. (2005)

Diversos tipos de

queijo 0,6% Minas Gerais Ornelas et al. (2007)

Diversos tipos de

queijo 5,0% São Luís - MA

Nascimento et al.

(2007)

Queijo Minas frescal 11% Juiz de Fora –

MG Brito et al. (2008)

Diversos tipos de

queijo 6,7% Paraná Abrahão et al (2008)

Queijo Minas 4,7% Belo Horizonte –

MG Pereira et al. (2009)

Ricotas 6,7% Campinas-SP Esperet al. (2011)

Queijo 21,6% São Paulo Barancelliet al.

(2014)

Queijos frescais e

ricotas 4,7% Paraná Bernardi (2014)

Queijo Minas

Frescal 17% Rio de janeiro

Penteado et al.

(2012)

Fonte: Adaptado de Silva et al. 2011.

Em queijos de coalho a incidência de L. monocytogenes varia entre os queijos de

fabricação artesanal e os industrializados (BORGES et al., 2009).

Na cidade de João Pessoa-PB foram analisadas 30 amostras de queijo de coalho,

provenientes de diversos postos de venda do comércio objetivando-se verificar a ocorrência

de L. monocytogenes. Os resultados demonstraram a presença do patógeno em 50% das

amostras avaliadas (SOUSA; LIMA; SOUSA, 2000).

Leite et al. (2002) ao avaliarem queijo de coalho comercializado na cidade de Salvador

(BA) – Brasil, com e sem o registro do Serviço de Inspeção Federal (SIF), observaram

positividade para a presença de L. monocytogenes nas amostras avaliadas.

19

Borges et al. (2004) observou uma taxas de 19% de ocorrência do patógeno em queijo

industrializado, armazenado sob refrigeração em Fortaleza (CE, Brasil).

Ramos e Costa (2003) encontraram presença de L. monocytogenes em uma amostra

de queijo de coalho coletadas de mercados e feiras livres da cidade de Manaus – AM e a soro

variedade apresentada foi a 1/2b sendo a mesma encontrada entre aquelas mais isoladas de

infecções humanas.

Duarte et al.(2005), pesquisando L. monocytogenes e microrganismos indicadores

higiênico-sanitários em queijo de coalho produzido e comercializado no estado de

Pernambuco observou um percentual de 5,5% de positividade.

Sousa et al. (2006) identificaram a presença de L. monocytogenes em queijo de coalho

artesanal, comercializados em temperatura ambiente na cidade de Fortaleza, demonstrando

que o produto pode ser um substrato para o crescimento dessa bactéria e veículo de listeriose

para os consumidores.

1.3.6 Listeriose

A ingestão de produtos contaminados com organismos viáveis de L. monocytogenes

pode desencadear a listeriose (PEARSON; MARTH, 1980; GANDHI; CHIKINDAS, 2007).

Listeriose é uma doença originada por uma infecção oportunista que acomete homens

e animais (GOLDFINE; SHEN, 2007). Nos seres humanos as formas clínicas podem se

manifestar na forma cutânea, não-invasiva ou invasiva (SWAMINATHAN; GERNER-SMIDT,

2007).

A forma cutânea apresenta-se como uma infecção eczematosa ocasionada pela

exposição direta da pele a células de L. monocytogenes, geralmente ocorre no contato com

animais doentes e com materiais infectados resultantes de aborto (SWAMINATHAN;

GERNER-SMIDT, 2007; GODSHAL et al., 2013).

A listeriose não invasiva é caracterizada por um quadro de gastroenterite febril

acompanhada de vômitos e diarreia (SWAMINATHAN; GERNER-SMIDT, 2007; CRUZ et al.,

2008). A forma invasiva é a mais perigosa, acomete, principalmente, pessoas com sistemas

com déficit no sistema imunológico (GOLDFINE; SHEN, 2007; SWAMINATHAN; GERNER-

SMIDT, 2007).

A ocorrência de listeriose de origem alimentar é relatada principalmente em países

industrializados, ocorrendo isoladamente e/ou em surtos (SCHLECH et al., 1983).

20

Na década de 80, casos de listeriose humana (esporádicos e/ou surtos) começaram a

ser descritos na literatura. Muitos foram confirmados e relacionados ao consumo de alimentos,

dos quais, em alguns casos os queijos encontravam-se envolvidos (BORGES et al., 2009).

A literatura descreve vários casos de listeriose associados ao consumo de diversos

tipos de queijos (Tabela 1.1).

Tabela 1.2 – Listeriose associado ao consumo de queijos

Ano Local Nº de casos

(morte) Tipo de queijo Referências

1983

1987 Suíça 122 (31) Queijo macio Billeet al. (1990)

1985 EUA 142 (48) Queijo fresco estilo

mexicano

Anonymous, (1985)

Linnanet al. (1988)

1989

1990 Dinamarca 26 (6) Queijo de mofo azul Jensenet al. (1994)

1995 França 37 (11) Queijo macio com leite cru

Gouletet al. (1995)

Rocourtet al. (1998)

Lundénet al. (2004)

1997 França 14 Queijo macio Jacquetet al. (1999)

2000

-

2001

EUA 13 Queijo fresco estilo

mexicano

CDC (2001)

MacDonald et al.

(2005)

2001 Suécia >120 Queijo fresco feito

com leite cru

Carrique-Maset al.

(2003)

Danielsson-Thamet al.

(2004)

2001 Japão 38 Queijo Makinoet al. (2005)

2002 Canadá 47 Queijo Pagottoet al.(2006)

2002 Canadá 17 Queijo macio feito com leite

cru

Gaulinet al. (2003)

Pagotto et al. (2006)

2002 Canadá 86 Queijo feito com leite

pasteurizado Pagottoet al. (2006)

21

Ano Local Nº de casos

(morte) Tipo de queijo Referências


mexicano

Carriedo (2003)

Swaminathan e

GernerSmidt (2007)

2005 Suíça 10 (3) Queijo macio Bille et al. (2005)

2008 Canadá 38 (2) Queijo MSSS (2009)

2009

Áustria,

Alemanha e

República

Tcheca

34 (8) Queijo "Quargel" Fretzet al. (2010)


mexicano CDC (2014)

Fonte: DIRECTORATE (2011) e CDC (2014) apud Bernardi (2014)

No Brasil a notificação dos surtos e dos casos de listeriose ainda são escassas, sendo

muitas vezes sub diagnosticadas e subnotificadas. Além disso, nos estudos realizados no

país, não se estabelece nenhum tipo de relação entre a prevalência do microrganismo e a via

de transmissão do mesmo, embora diversos trabalhos mostrem a circulação de L.

monocytogenes na espécie humana e sua ocorrência tenha sido relatada em vários tipos de

alimentos (SILVA et al., 1998; KABUKI et al., 2004; BORGES et al., 2009; BARANCELLI et

al., 2011).

Ainda que exista uma margem de risco para todos os consumidores, este patógeno é

particularmente temido devido a sua forte associação com septicemia, encefalite, meningite e

altos índices de mortalidade entre neonatos, idosos e imunocomprometidos e ainda, abortos

em gestantes, que são considerados como grupos de risco (FERREIRA, 2006).

A gravidade da infecção provocada por L. monocytogenes depende principalmente do

estado imunitário do hospedeiro, da virulência da estirpe, carga microbiana presente no

alimento contaminado, da quantidade de células bacterianas ingeridas, da composição do

alimento, do sistema imune intestinal e integridade do epitélio intestinal (DELGADO, 2008).

A dose infecciosa para o desenvolvimento do quadro de listeriose, irá depender da

vulnerabilidade do consumidor, ou seja, varia em acordo com sua idade e estado de saúde

geral (FORSYTHE, 2010). Estima-se que uma quantidade de 102 UFC (unidades formadoras

de colónias) até 109 UFC, seja suficiente, porém depende do estado imunitário do hospedeiro

e da virulência da cepa.

22

Adaptações às mudanças ambientais induzem alterações fisiológicas nas cepas de L.

monocytogenes, tornando-as mais capazes de expressar sua virulência e causar infecção

(STEPHENS, 1991; JEMMI; STEPHAN, 2006).

L. monocytogenes possui 13 sorotipos (1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab 4b, 4c, 4d,

4e e 7) que se distinguem em três linhagens genéticas: linhagem I composta pelos sorotipos

1/2b, 3b, 4b, 4d e 4e, linhagem II com os sorotipos 1/2a, 1/2c, 3a e 3c e linha III com os

sorotipos 4a e 4c (BROSCH et al., 1994; LUDWIG et al., 2009).

Os estudos de incidência desta bactéria têm apontado para os isolados pertencentes

à linhagem I como sendo os que predominam em infecções humanas, os isolados da linhagem

II provêm essencialmente de alimentos e do meio ambiente enquanto os isolados da linhagem

III ocorrem frequentemente em animais (WESLEY, 2007).

Todas as cepas de L. monocytogenes são consideradas igualmente patogênicas em

países com sistemas de vigilância atuantes (LARSEN et al., 2002).

Este microrganismo tem a capacidade de evitar a resposta do sistema imune humoral

por se multiplicar dentro da célula hospedeira e por disseminar-se através da passagem

célula-célula (VAZQUEZ-BOLAND, 2001).

Seu ciclo celular, nas células eucarióticas, assemelha-se e é iniciado com a adesão

da bactéria à superfície da célula eucariótica e posterior entrada por meio de fagocitose. Em

células não-fagocíticas a invasão ocorre pela interação entre moléculas ligante presentes na

superfície da membrana bacteriana e receptores da superfície da célula eucariótica. L.

monocytogenes possui a capacidade de reconhecer diferentes receptores nas células

eucarióticas, além de componentes da matriz extracelular, que interagem com proteínas

ligantes da superfície da bactéria e atuam no processo de internalização da bactéria

(GAILLARD, 1991; IRETON, 1998; BRAUN, 2000; COSSART 2000; PIZZARRO-CERDA;

2006).

A translocação do patógeno ocorre por um mecanismo conhecido como “zíper”, onde

a bactéria progressivamente vai penetrando na célula até que seja totalmente internalizada.

L. monocytogenes possui mecanismos que impedem a fusão do fagossomo com lisossomo,

no citoplasma, evitando, desta maneira, a ação de enzimas que poderiam levar a sua

destruição. Desta forma o ciclo de infecção é estabelecido e sua disseminação para outros

tecidos mais profundos, pode ocorrer via corrente sanguínea ou linfonodos (FINLAY et al.,

1991; ISBERG; 1994; SWANSON; 1995; SHEEHAN; 1994; GAILLARD, 1991; IRETON, 1998;

VAZQUEZ-BOLAND, 2001; RYSER; 2006).

Sua natureza psicrófila, grande capacidade de resistência as adversidades do meio e

patogenicidade torna L. monocytogenes um dos patógenos de grande importância na

23

contaminação de alimentos. Devido a estes fatos é considerado pela organização mundial de

saúde um dos cinco mais importantes microrganismos causadores de doenças transmitidas

por alimentos. Sua elevada taxa de mortalidade, ≥ 30%, situa a listeriose entre as causas mais

frequentes de morte originadas através de DTA (BRANCO et al., 2003; DENNY;

MCLAUCHLIN, 2008).

A legislação brasileira (BRASIL, 1996) estabelece ausência desse patógeno em 25 g

de amostra, para queijos com média, alta e muito alta umidade, em virtude da sua

patogenicidade para a saúde humana. Ainda assim sua presença tem sido observada

comumente em queijos, dentre eles o tipo “coalho” (SWAMINATHAN, 2001; BRANCO, et al.,

2003; SILVA et al., 2003; KABUKI et al.,2004; SOUSA et al., 2006; JEMMI; STEPHAN, 2006;

DENNY; MCLAUCHLIN, 2008; PENTEADO et al., 2012).

Portanto, diante dos fatos, observa-se a necessidade do emprego de processos de

conservação que primem pela qualidade microbiológica dos queijos, em especial o queijo de

coalho, por ser reconhecido como um importante vetor de transmissão dessa doença.

As novas tecnologias de preservação de alimentos (tecnologias não térmicas,

diferentes sistemas de embalagens, biopreservacão e produtos antimicrobianos naturais

como sistema lactoperoxidase, bacteriocinas, lisozima, quitosana e os derivados vegetais)

vem sendo cada vez mais valorizada pelo mercado por atenderem as crescentes mudanças

no processamento industrial e exigência do consumidor por alimentos mais naturais,

nutritivos, com uma vida útil prolongada, e que ao mesmo tempo mantenha a qualidade

nutricional e sensorial (DEVLIEGHERE et al., 2004; FAI et al., 2008a).

O uso de substâncias antimicrobianas naturais, tem sido difundido desde os anos 80

por apresentarem uma ação sinergista à dos conservantes químicos em produtos alimentícios

e não representarem risco a saúde do consumidor, principalmente, em virtude da

possibilidade de originarem compostos tóxicos de ação carcinogênica (MELO et al., 2004;

MOREIRA et al., 2005).

A quitosana é um dos antimicrobianos naturais que vem sendo estudado em queijo de

alta umidade, uma vez que possuem um amplo espectro bactericida sob microrganismos

patogênicos contaminantes do queijo (CHI et al., 2006; FAI et al., 2008a; BENTO et al., 2011).

1.3.7 Quitosana

A quitosana é um biopolímero do tipo polissacarídeo que possui uma estrutura

molecular semelhante, quimicamente, a celulose e quitina, que se diferenciam somente nos

grupos funcionais (DANCZUK, 2007).

24

A quitina é um polímero natural, precursor direto da quitosana. Constitui o principal

elemento do exoesqueletos de invertebrados marinhos, participando também na estrutura de

celenterados, anelídeos, moluscos, artrópodes, leveduras e da maioria dos fungos

(RINAUDO, 2006; MATSUI, 2007; NITSCHKE, 2011). Alguns fungos apresentam como

componente de suas paredes celulares a quitina e a quitosana simultaneamente, como

aqueles pertencentes ao gênero Zygomicetes, que podem apresentar até 50% deste na sua

estrutura exercendo a função de suporte e proteção para a unidade celular (ASSIS; LEONI,

2003; FRANCO et al., 2005b; ZAMANI et al., 2010).

A forma tradicional de obtenção da quitosana por meio da quitina geralmente se dá a

partir de reações de desacetilação em soluções alcalinas. Neste processo, os grupamentos

acetamido (-NHCOCH3) da quitina são modificados, em graus variados, em grupos amino (-

NH2), dando origem a quitosana (Figura 1.8), que se apresenta como uma mistura de

polímeros de tamanhos variados (OLIVEIRA, 2006; SILVA, 2007).

Os processos de obtenção de quitosana a partir de fungos permitem a extração

simultânea do biopolímero juntamente com a quitina e apresenta-se como uma alternativa de

obtenção do produto (DIAS et al. 2013). A quitosana, quimicamente se apresenta na forma

de um copolímero formado por unidades estruturais de 2-amino-2-desoxi-D-glicopiranose

(GlcN) e 2-acetamido-2-desoxi-D-glicopiranose (GlcNAc) unidas por ligações glicosídicas do

tipo β (1→4) (STREIT, 2004; ALVES, 2008).

Figura 1.8–Representação esquemática da estrutura química da quitosana

Fonte: Antonino, 2007.

As suas cadeias estruturais ligam-se por meio do hidrogênio e podem diferenciar-se

em três diferentes estruturas automórficas (α, β e γ), de acordo com a polaridade adquirida

pelas cadeias (WINTEROWD, 1995; LIMA, 2005).

25

Dentre suas características biológicas e físicas, destaca-se por ser: pouco solúvel em

água, sendo sua diluição em soluções aquosas realizada mediante a presença de ácidos

orgânicos e inorgânicos; por exibir alta bioatividade; permeabilidade seletiva; ação

polieletrolítica; atividade antimicrobiana; habilidade em formar gel e filme; habilidade de

quelação; capacidade adsortiva; por ser biodegradável; biocompatível e apresentar baixa

toxicidade ao ser humano e animais (D’AYALA et al., 2008; SINGH; VESENTINI; SINGH,

2008; DASH et al., 2011).

O uso de quitosana é seguro. Estudos com quitosana a apontam como sendo uma

substância benéfica e segura para o consumo humano por apresentar uma toxicidade menor

do que a glicose ou sacarose (YADAV; BHISE, 2004; KANMANI et al., 2011). A ANVISA

(BRASIL, 1999) a inclui na lista de "Alimentos com alegações de propriedades funcionais e

ou de saúde, novos alimentos/ingredientes, substâncias bioativas e probióticos".

O potencial de aplicação da quitosana é multidimensional, suas propriedades

singulares fazem com que esta seja bastante versátil quanto à sua aplicabilidade, pois oferece

um amplo espectro de aplicações (AZEVEDO et al., 2007; BENTO et al., 2009; MARICATO,

2010).

Na indústria alimentícia sua aplicabilidade tem sido cada vez mais explorada e ampliada,

indo desde o uso na elaboração de suplementos nutricionais, até sua utilização como

emulsificantes, fibras em biscoito dietéticos, estabilizantes para alimentos em conserva,

clarificantes de bebidas (SHAHIDI et al., 1999; BORDERÍAS et al., 2005; BORGOGNI et al.,

2006; LI et al., 2007); e como agente conservante em diversos produtos tais como: macarrão,

molho de soja, sardinha (RODRÍGUEZ et al., 2002), bacalhau (SHAHIDI et al., 2002), carne

de cordeiro (KANATT et al., 2004), salsicha (DAMIAN, 2005), mortadela (CHI et al., 2006),

patê de carne (BENTO et al., 2011); suco de acerola (ALBUQUERQUE; STAMFORD, 2011).

A atividade antimicrobiana é uma das características que distinguem a quitosana dos

demais polissacarídeos. O mecanismo de ação antimicrobiano da quitosana ainda não está

bem definido, de acordo com Azevedo et al. (2007), porém sabe-se que este mecanismo está

intimamente relacionada às propriedades físico-químicas do polímero, que apode atuar

através da ligação à membrana da célula do microrganismo, por meio dos seus grupos

amínicos protonados que se ligam seletivamente à superfície celular por meio dos grupos

aniônicos, resultando em perda de componentes intracelulares e consequente, inibição

microbiana (SILVA et al., 2006; FAI et al., 2008a; KONG et al., 2010).

Outras formas de atuação são atribuídas a ação quelante da quitosana, que se liga

seletivamente a traços de elementos ou nutrientes essenciais e inibe o crescimento bacteriano

26

e por agir sequestrando água e inibindo várias enzimas, ativando diversos mecanismos de

defesa nos hospedeiros (HELANDER et al., 2001; SANTOS et al., 2008).

A eficiência da quitosana como antimicrobiano é comprovada sob diversos

microrganismos como Salmonella typhimurium, Streptococcusfaecalis(CHUNG et al., 2004),

Staphylococcus aureus, Escherichia coli (LI et al., 2007), L. monocytogenes (PORTER et al.,

2000; COMA et al., 2002; CHI et al., 2006), Salmonella entérica, S. paratyphi,

Pseudomonasaeruginosa(YADAV; BHISE, 2004), Bacilluscereus,Shigelladysenteriae,

Aeromonashydrophila, Fusarium, Alternaria, Helminthosporium(COSTA et al., 2006),

Sacharomycescerevisiae, S. ludwigii, Zygosaccharomycesbaillii, Cryptococcusalbidus,

Candidasp., Rhodotorulasp. (RHOADES; ROLLER, 2000; SAGOO et al., 2002).

As possibilidades de aplicações deste polímero como agente antimicrobiano são ainda

mais enriquecidas pelo fato que a quitosana pode ser preparada em diferentes formas, tais

como soluções de viscosidade controlada, géis, filmes e membranas e por apresentar uma

boa capacidade de formação de película. (CAMPANA et al., 2007; MORTAZAVIAN et al.,

2008).

Com isso estudos vêm sendo desenvolvidos com a finalidade no aumento da vida pós-

colheita de frutas e hortaliças utilizando a quitosana para a formação de coberturas e filmes

semipermeáveis com ação antifúngica e bactericida na indústria de alimentos, demonstrando

ser uma técnica eficaz de preservação destes produtos, mantendo a aparência, frescor,

firmeza e o brilho, e aumentando seu valor comercial (NO et al., 2002; VILLADIEGO et al.,

2005; CAMILI, 2007).

Estudos vem demostrando a eficiência da aplicação de quitosana como filme

comestível na preservação de maçãs (ASSIS; LEONI, 2003; JORGE et al., 2011), mamão

(DOTTO et al., 2008; ALI et al., 2011), morango (MAZARO et al., 2008; ASSIS, 2009), alho

(BOTREL et al., 2007), uvas (CAMILI et al., 2007), pêssegos douradão (SANTOS, 2008) e

como filme protetor em caju (OLIVEIRA, 2011).

Em uva “Itália” Camili et al., 2007 avaliaram a ação antifúngica de filmes de quitosana

e demonstraram que as soluções de quitosana suprimiu o crescimento micelial e retardou a

germinação do bolor Botrytis cinérea, considerado o agente de maior incidência na

deterioração desta fruta durante seu transporte e armazenamento.

Botrel et al. (2007) ao utilizarem revestimentos comestíveis antimicrobianos a base de

amido de mandioca, quitosana e glicerol em alho minimamente processado observou que o

tratamento composto pelos constituintes combinados, sendo o único a conte quitosana a

0,5%, foi o que apresentou menores contagens de psicrotróficos e bolores e leveduras durante

20 dias de armazenamento a 10ºC.

27

A utilização da tecnologia de cobertura e filmes com propriedade antimicrobiana para

alimentos vem despertando o interesse de pesquisadores e da indústria por ser uma

tecnologia de conservação rentável e promissora.

Além destas vantagens apresentadas a utilização de quitosana surge como uma forma

de gerenciamento dos problemas decorrentes da poluição ambiental gerada pelos resíduos

da indústria pesqueira promovendo destino adequado para seus resíduos, de modo que as

agressões ao meio ambiente sejam cada vez mais reduzidas.

Nesta expectativa, diante da constatação de que no processo de fabricação de queijo

de coalho a contaminação pode ocorrer em qualquer nível de processamento e que para a

maioria dos alimentos sólidos e semissólido o crescimento microbiano ocorre na superfície o

uso de revestimento comestível de quitosana torna-se uma ótima opção de conservação do

produto e contribui para melhorar a qualidade microbiológica, aumentar o do tempo de vida

de prateleira deste tipo produto e melhorar a sua imagem (BENTO et al., 2009;PAGANI et al.,

2012; NUNES et al., 2013).

Pois, apesar de sua popularidade e importância para o mercado lácteo, principalmente

na Região Nordeste, o queijo coalho ainda recebe uma conotação de alimento inseguro e sem

qualidade (DUARTE et al., 2005, ANDRADE, 2006; LIMA, 2010; ALMEIDA; JUNIOR

FERNANDO; GUERRA, 20013).

28

CAPÍTULO 2

Artigo

Queijo de coalho com cobertura de quitosana: Perfil físico-químico

e aceitação sensorial

Trabalho submetido para publicação ao periódico indexado Boletim do Centro de

Pesquisa e Processamento de Alimentos (Online)

29

QUEIJO DE COALHO COM COBERTURA DE QUITOSANA: PERFIL FÍSICO-QUÍMICO E ACEITAÇÃO SENSORIAL

Priscilla Gregorio de Oliveira*

Erilane de Castro Lima Machado** Roberta Albuquerque Bento***

2.1 RESUMO: O emprego de coberturas comestíveis de ação antimicrobiana é uma tecnologia cada vez mais divulgada por preservar os alimentos. Por fazer parte do produto não deve promover alterações que o descaracterize quanto aos seus parâmetros físico-químicos e sensoriais. O presente estudo objetivou avaliar o perfil físico-químico e aceitação sensorial de queijo de coalho adicionado de cobertura comestível de quitosana. Para isso foram produzidos queijos de coalho com coberturas de quitosana nas concentrações de 15 mg/mL (T1), 10mg/mL (T2) e 5 mg/mL (T3). Como controle foram utilizadas amostras sem tratamento (C) e com cobertura de ácido acético 1% (CA). Os produtos foram avaliados quanto a umidade, atividade de água (Aa), cinzas, pH, acidez, lipídeos em extrato seco e proteínas e quanto aos padrões microbiológicos sanitários. Para as análises sensoriais empregou-se os testes de comparação pareada, aceitação e intenção de compra. Os resultados obtidos nas análises físico-químicas e microbiológicas demonstraram que as amostras atenderam aos requisitos estabelecidos pelas legislações vigentes. No teste de comparação pareada as amostras T1, T2 e T3 apresentaram um percentual de preferência de 51,7%, 45% e 46,7%, respectivamente, em relação a amostra controle C. A amostra com maior concentração de quitosana (T1) obteve o maior índice de aceitabilidade para os atributos sabor (76,66%) e textura (78,33%), e maior frequência de votos para os conceitos de “certamente compraria”. Concluiu-se que a aplicação de cobertura comestível de quitosana em queijo de coalho não influencia nos parâmetros de qualidade do produto.

PALAVRAS-CHAVE: Antimicrobiano natural; conservação; características de qualidade; produto lácteo.

*Universidade Federal de Pernambuco –(UFPE-CAV), Vitória do Santo Antão, PE,

Brasil (e-mail: [email protected]). **Professora Adjunta, Departamento de Nutrição, Universidade Federal de

Pernambuco –(UFPE-CAV), Vitória do Santo Antão, PE, Brasil (e-mail: [email protected]).

***Professora Adjunta, Departamento de Nutrição, Universidade Federal de Pernambuco –(UFPE-CAV), Vitória do Santo Antão, PE, Brasil (e-mail:

[email protected]).

mailto:[email protected]



30

2.2 INTRODUÇÃO

Dentre os produtos lácteos produzidos no Nordeste do Brasil o queijo de coalho

é um dos mais tradicionais e de grande valor socioeconômico (LIMA 2010, MENEZES et al., 2012). Sua representação cultural como um artefato simbólico da cultura nordestina somado as suas características sensoriais e nutricionais torna-o um produto de fácil aceitação comercial, e por consequência é amplamente consumido pela população regional, tendo sido observado um crescente consumo, nos últimos anos, nas demais regiões brasileiras (DANTAS 2012).

Apesar de sua notoriedade o queijo de coalho ainda possui uma imagem de alimento pouco seguro para a saúde do consumidor, pela baixa qualidade sanitária (ALMEIDA et al., 2013). Com isso o desenvolvimento de métodos que proporcionem a conservação deste produto tornam-se essenciais com a finalidade de melhorar seu perfil higiênico-sanitário.

O emprego de filmes e coberturas comestíveis, utilizando substâncias antimicrobianas naturais, é uma tecnologia alternativa de conservação, que está sendo cada vez mais avaliada e divulgada como um procedimento viável para elevar o tempo de vida de prateleira dos alimentos, já sendo, inclusive, testada com sucesso em frutas e hortaliças (OLIVEIRA e OLIVEIRA, 2004; ASSIS e BRITO,2014).

O uso de substâncias antimicrobianas naturais tem sido difundido desde os anos 80 por apresentarem uma ação sinergista à dos conservantes químicos em produtos alimentícios e não representarem risco a saúde do consumidor, principalmente, em virtude da possibilidade de originarem compostos tóxicos de ação carcinogênica pelos conservantes químicos (MELO et al., 2004; MOREIRA et al., 2005).

A quitosana é um dos antimicrobianos naturais mais estudados, e vem sendo avaliado em queijos, uma vez que possuem um amplo espectro bactericida sob microrganismos patogênicos contaminantes deste produto (CHI et al., 2006; FAI et al., 2008; BENTO et al., 2011). Seu uso como componente de coberturas e filmes antimicrobianos tem sido avaliados em vários tipos de queijos, demostrando resultados promissores quanto a conservação microbiológica (Di PIERRO et al., 2011; EL-DIASTY et al.,2012; MEI et al.,2013).

Atualmente o grande desafio da indústria alimentícia é atender as exigências do mercado consumidor, que estão cada vez mais rigorosos quanto a qualidade dos produtos alimentares adquiridos. E apresentam preferência de compra por produtos que sejam seguros microbiologicamente, tenha longa vida de prateleira e boas características sensoriais (NIELSEN e RIOS, 2000; MOREIRA et al., 2005; VALERO e GINER, 2006).

Com isso, a avaliação das características de qualidade (físico-químicas e sensoriais) de produtos alimentares que empregam esse tipo de tecnologia de conservação microbiológica, torna-se essencial para que a utilização de revestimentos antimicrobianos naturais torne-se viável em alimentos.

Portanto o objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil físico-químico e os parâmetros sensoriais de queijo de coalho adicionado de cobertura comestível de quitosana.

31

2.3 MATERIAL E MÉTODOS

Elaboração do queijo de coalho com cobertura de quitosana

Os ensaios analíticos foram conduzidos nos laboratórios de Bromatologia e Técnica dietética da UFPE- CAV.

Inicialmente foi realizado o preparo do gel de quitosana a ser utilizado na formação da cobertura comestível aplicada ao queijo de coalho. Para isso o pó de quitosana (Sigma-Aldrich®, extraída da carapaça de crustáceo, de médio peso molecular e desacetilada entre 75 – 85%) foi diluído, totalmente, em ácido acético (1%) sob agitação magnética à temperatura ambiente ±25ºC (±1ºC), sendo posteriormente o pH ajustado para 5,8, usando NaOH ou HCl (Shigemasa e Minami, 1996).

Para o processamento do queijo de coalho foi utilizada a metodologia descrita por Nassu, Macedo e Lima (2006), com algumas modificações, sendo realizado conforme descrito no fluxograma da Figura 2.1. Foram utilizados leite bovino integral pasteurizado, padronizado com 3% de gordura (Betânia®), coagulante líquido HA-LA (Cristian Hansen®) e Cloreto de cálcio e cloreto de sódio (VETEC®) na elaboração dos produtos.

Figura 2.1 - Fluxograma do processo de produção do queijo de coalho. Adaptado de

Nassu, Macedo e Lima, 2006.

Recepção do leite

Higienização da embalagem

Aquecimento do leite (35°C)

Adição de Cloreto (0,5mg/L) de cálcio e coalho (1ml/L)

Homogeneização lenta (1 minutos)

Coagulação (50 minutos)

Cozimento da massa (45°C)

Repouso (5 minutos)

Dessoragem

Salga (1% do peso da massa)

Enformagem

Prensagem (60minutos)

Maturação (3 dias - 4 a 10ºC)

Adição da cobertura de quitosana

Maturação (3 dias - 4 a 10ºC)

Embalagem

Armazenamento (4 a 10ºC)

32

Após a recepção do leite, as embalagens foram higienizadas, utilizando

detergente neutro e álcool 70%, e o leite foi aquecido até atingir uma temperatura de 35ºC, seguindo-se com as etapas posteriores (Figura 2.1).

A etapa de maturação foi adaptada, ocorrendo em dois momentos. A adição da cobertura de quitosana foi realizada, somente, ao terceiro dia de maturação, pois correspondia ao tempo em que a massa encontrava-se firme, sem que houvesse fragmentação ao realizar-se o corte. Para a adição do gel de quitosana na superfície dos produtos e formação da cobertura, os queijos de coalho foram cortados em cubos de aproximadamente 10g, com volume de 2cm³ e imersos individualmente nos géis de quitosana, preparados nas concentrações de 15 mg/ml (T1), 10 mg/ml (T2) e 5mg/ml (T3), por 3 minutos, com auxílio de uma pinça estéril, em seguida foram transferidos, assepticamente, para uma centrífuga de verduras (Plasutil®), onde retirou-se o excesso do gel com rotação manual, durante 30 segundos, seguindo posteriormente para a segunda etapa da maturação, por mais três dias. Após a etapa de maturação os produtos foram embalados em embalagem plástica de polietileno e armazenados sob refrigeração (10ºC) para a realização das análises.

Para realização das análises físico-químicas e sensoriais foram utilizados como controles queijos de coalho sem adição de cobertura (C) e queijo de coalho com cobertura de ácido acético (1%) (CA).

Análises físico-químicas

Os produtos foram avaliados quanto aos parâmetros de: atividade de água (Aa), em temperatura de ± 25ºC (±1ºC) utilizando o equipamento AquaLAb, modelo CX-2 Water Activity System, seguindo as instruções do fabricante; Umidade (Adolfo Lutz 2008 - 012/IV); Resíduo mineral fixo (cinzas) (Adolfo Lutz 2008 - 018/IV); Proteínas (Adolfo Lutz 2008 - 036/IV), considerando o fator 6,38 para a conversão nitrogênio em proteína; Acidez (Adolfo Lutz 2008 - 463/IV); pH (Adolfo Lutz 2008 - 017/IV), utilizando medidor de pH Alpax, modelo PA 200; Determinação de gordura utilizando butirômetro para leite (Adolfo Lutz 2008 - 466/IV) e os resultados expressos como gordura em base seca (GBS %), calculada pela equação:

GBS = % 𝑑𝑒𝑔𝑜𝑟𝑑𝑢𝑟𝑎×100

𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜𝑠𝑒𝑐𝑜𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙

Análises microbiológicas

Em cumprimento a legislação em vigor (Brasil, 2001a), as amostras foram avaliadas quanto a qualidade microbiológica, determinando-se a contagem de coliformes termotolerantes, Staphylococcus coagulase positiva/g, presença de Salmonella ssp./25g e Listeria monocytogenes/25g utilizando a metodologia da Instrução Normativa nº 62 (Brasil, 2003) para análises microbiológicas para controle de alimentos.

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Análise sensorial dos produtos

Foram realizados testes de comparação pareada (diferença e preferência) (Anexo I e Anexo II), teste de aceitação (com escala hedônica estruturada de 9 pontos, onde 9 representa “gostei extremamente” e 1 “desgostei extremamente”) (Anexo III) e teste de intenção de compra (com escala hedônica estruturada de 5 pontos, onde 5 representa “Certamente compraria” e 1 “Certamente não compraria”) (Anexo IV). Também foram avaliados o índice de aceitabilidade das notas atribuídas aos atributos sensoriais avaliados no teste de aceitação. O painel foi composto por 60 provadores, sendo painelistas não treinados, escolhidos conforme disponibilidade e critérios de inclusão (gostar de queijo de coalho). Foram excluídos do painel pessoas que possuíam intolerância a algum componente da fórmula, tivessem idade acima de 60 anos, tabagistas e pessoas com doenças que comprometam a funcionalidade do paladar e olfato. Antes de cada teste, os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo V) conforme o previsto no projeto de pesquisa aprovada pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade Federal de Pernambuco (CAAE 34469914.5.0000.5208), seguindo a Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde.

Análise estatística e reprodutividade

Os dados experimentais obtidos das determinações analíticas, em triplicata, foram avaliados estatisticamente por testes de estatística descritiva (média e desvio padrão) e de estatística inferencial (teste t de Student e teste de Turkey) para determinação de diferenças estatisticamente significantes (p<0.05) entre os diferentes tratamentos aplicados, utilizando o programa STATSOFT (2004). Os índices de aceitabilidade foram calculados de acordo com Stone e Sidel (2004).

2.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO


Os resultados da composição físico-química dos queijos de coalho produzidos encontram-se descritos na Tabela 2.1. Na avaliação da composição centesimal, não se verificou diferença significativa (p>0,05) nos valores de cinzas, proteínas, lipídeos e Aa entre as amostras com cobertura de quitosana e os controles, porém para os parâmetros de umidade, acidez e pH houve diferença (p<0,05) entre as amostras, Os valores de umidade média das amostras T3 e CA inferiores aos demais (p<0,05) podem ser consequência do aumento da concentração de íons de hidrogênio, menor valor de pH entre as amostras (Tabela 2.1), que contribui para uma menor umidade, uma vez que, segundo Souza e Saad (2009), quando esse fenômeno ocorre promove uma diminuição das forças repulsivas e as micelas de caseína começam a agregar-se, acentuando a liberação do soro.

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Apesar das diferenças observadas, os valores de umidade variaram entre 50,07% e 50,86 % (Tabela 2.1), e as amostras apresentaram-se de acordo com o exigido pela legislação (Brasil 1996; Brasil 2001b), que classifica o queijo de coalho como um produto de média a alta umidade, devendo apresentar um conteúdo de umidade entre 46,0 e 54,9%.

Ainda, variações físico-químicas da matéria prima utilizada e resultantes do próprio processamento podem influenciar nos valores da composição físico-química dos produtos obtidos, de acordo Nassu et al., (2001).

O teor médio de umidade encontrado para queijo de coalho na literatura é variável. Silva et al. (2010), observaram teores de umidade variando de 45,5 a 51,5%, podendo ser caracterizado como queijo de média (39% < umidade < 46%) a alta umidade (46% < umidade < 55%). Enquanto Silva et al. (2006) encontraram valores médios de 40,28%. Sousa et al. (2014) obtiveram variações de umidade entre 14,38 e 24,08% para os produtos com inspeção federal, e de 15 e 29,38% para os de fabricação artesanal, caracterizando, assim, queijo de umidade baixa (< 39%). A não conformidade no teor de umidade dessas amostras foi atribuída, pelos autores, possivelmente à falta de padronização na elaboração do queijo.

Tabela 2.1 –Resultados das análises físico-químicas de queijo de coalho adicionado

de cobertura comestível de quitosana

Análises C T1 T2 T3 CA

Umidade 50,75±0,77a 50,86±0,58a 50,86±0,40a 50,16±0,24b 50,07±0,20b Cinzas 3,01±0,17a 3,10±0,13a 3,00±0,10a 2,98±0,10a 3,03±0,13a

Proteínas 18,44±0,24a 18,47±0,17a 18,47±0,22a 18,56±0,18a 18,63±0,16a Lipídeos 47,76±0,36a 46,54±0,17a 46,56±0,24a 47,77±0,20a 46,55±0,13a Acidez 0,031±0,00b 0,031±0,00b 0,030±0,00c 0,030±0,00c 0,035±0,00a

pH 7,03±0,05a 6,98±0,006a 6,70±0,00b 6,76±0,12b 6,50±0,00c Aa 0,98±0,00a 0,98±0,00a 0,98±0,00a 0,98±0,00a 0,98±0,00a

Médias seguidas de letras iguais na horizontal não diferem significativamente (p>0,05) pelo teste de Duncan. C: Controle; T1: cobertura (15 mg/ml Quitosana); T2: cobertura (10 mg/ml Quitosana); T3:

cobertura (5 mg/ml Quitosana) e CA: Controle com ácido acético.

Quanto ao parâmetro de Aa verificou-se valores de 0,98 para todos os produtos

sob os diferentes tratamentos e controles, sem diferenças significativas (p>0,05) entre eles. Dados semelhantes foram observados por Sousa et al. (2014) onde encontraram valores de Aa variando entre 0,911 a 0,963 para queijos de coalho com inspeção federal, e valores entre 0,892 e 0,96 para os queijos de coalho sem inspeção, comercializados em seis estados do nordeste brasileiro.

A legislação brasileira atual que regulamenta a identidade, qualidade e os padrões para queijos de coalho (Brasil 2001b) não institui valores de referência para os parâmetros de potencial hidrogeniônico (pH). Segundo Munk (2004) os queijos têm um pH elevado que varia entre 5,7 a 6,5 quando não se usa fermento. A literatura descreve resultados semelhantes para este parâmetro em queijos de coalho produzidos artesanal e industrialmente, variando entre 5 e 7,5 (MACHADO et al., 2011, SOUSA et al., 2014).

Os valores médios encontrados para pH apresentaram-se entre 6,50 e 7,03, sendo o maior valor atribuído a amostra controle C, sem cobertura, e o menor valor à amostra controle com ácido acético (CA). Entre as demais amostras sob tratamentos, verificou-se que T1, com cobertura de maior concentração de quitosana, foi a única

http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1808-16572014000100030&script=sci_arttext#B26


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amostra que não diferiu significativamente (p>0,05) de C,. Salienta-se que mesmo nas amostras com cobertura em menores concentrações de quitosana (Tabela 2.1), a faixa de pH encontra-se em valores aceitáveis para queijo de coalho verificados na literatura (MACHADO et al., 2011, SOUSA et al., 2014).

A acidez percentual expressa em ácido lático variou de 0,03 a 0,035% de ácido lático, Perez (2005), avaliando queijos de coalho industrializados obteve médias maiores para acidez, variando de 0,18 a 0,50%. Sousa et al. (2014) observaram variações de acidez em queijo de coalho entre 0,12 a 1,01%.

O teor de cinzas não diferiu entre as amostras, corroborando com os achados de Freitas et al. (2013) que constataram teores médios de 2,88% a 3,54% ao avaliarem os queijos de coalho produzidos na Paraíba e Silva et al. (2010) que encontraram valores entre 3,40% e 3,70%.

Quanto ao percentual de proteína, os produtos apresentaram valores médios similares e sem diferença significante (p>0,05), variando entre 18,44% e 18,63%. Freitas et al. (2013) também encontraram valores semelhantes ao deste estudo para proteínas em queijos de coalho, que variaram entre 18,98% e 22,64%. Freitas Filho et al. (2012) ao avaliar os parâmetros físico-químicos do queijo “Coalho” produzido artesanalmente na cidade de Calçado – PE observou valores de proteínas entre 19,35% e 25,88%. Para os níveis de lipídeos, as amostras não diferiram significativamente (p>0,05) entre si e apresentaram-se dentro do estabelecido pela legislação, a qual define como padrão valores de 45% a 60,0% de gordura em base seca.

Análises microbiológicas

As amostras T1, T2, T3, C e CA analisadas quanto aos parâmetros microbiológicos especificados para queijo de coalho apresentaram-se dentro dos limites exigidos pela legislação (Brasil 2001b). As contagens de Staphylococcus coagulase positivo nas amostras foram < 10 UFC/g enquanto para coliformes termotolerantes obteve-se contagens de 1,51x101 NMP/ml, 1,83x 101 NMP/ml, 1,95x 101 NMP/ml, 1,99x 101 NMP/ml e 2,40x 101 NMP/ml, respectivamente. Quanto a determinação de Salmonella ssp. e Listeria monocytogenes não foi detectado a presença destas bactérias em 25g do produto nas amostras avaliadas.

Sousa et al. (2014), quando avaliaram os parâmetros microbiológicos de queijos de coalho comercializados em alguns estados do nordeste do Brasil por estabelecimentos que possuíam e os que não possuíam o selo de inspeção federal (SIF) verificaram que 96,15% das amostras avaliadas estavam fora dos limites aceitos pela legislação para Staphylococcus coagulase positiva e 31% das amostras também não seguiam a padronização exigida para coliformes. Os autores atribuíram o nível de contaminação à qualidade da matéria prima ou às condições de processamento dos queijos.

Análise sensorial

Nos testes de comparação pareada entre os tratamentos T1 e C; T2 e C, e entre T3 e C, para detectar se havia diferença perceptível entre as amostras, foi verificado que dos 60 provadores, 57 sentiram diferença entre as amostras C e T1, 56 perceberam a diferença entre C e T2 e 54 painelistas entre C e T3. Assim, pelo teste monocaudal 60<57, 60<56 e 60<54 foi comprovado que existe diferença sensorial

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entre as duas amostras ao nível de 0,5% de significância, segundo a tabela de número mínimo de resposta corretas (FARIA e YOTSUYANAGI, 2002). No teste de aceitação, verificou-se que as amostras não diferiram significativamente(p>0,05) nos atributos de qualidade (aparência, cor, odor, sabor e textura) avaliados (Tabela 2.2). Tabela 2.2 –Resultados das notas atribuídas no teste de aceitação para queijos de

coalho com e sem adição da cobertura comestível de quitosana

Produtos Aparência Cor Odor Sabor Textura

C 6,51±2,09a 6,63±2,00a 5,63±2,31a 6,86±2,16a 7,00±1,97a T1 6,33±2,40a 6,59±2,12ª 5,86±2,25a 6,88±2,33a 7,06±1,94a T2 6,12±2,07a 6,37±2,06ª 5,86±2,46a 6,51±2,25a 6,86±2,20a T3 6,08±2,07a 6,35±2,06ª 5,82±2,46a 6,53±2,25a 6,89±2,20a

Médias seguidas de letras iguais na vertical não diferem significativamente (p>0,05) pelo teste de Duncan. C: Controle; T1: cobertura (15 mg/ml Quitosana); T2: cobertura (10 mg/ml Quitosana); T3:

cobertura (5 mg/ml Quitosana).

No quesito aparência, as médias obtidas para este atributo compreenderam a nota 6 ± 2, que reflete nos termos hedônicos entre “desgostei ligeiramente” e “gostei moderadamente”, onde a amostra C obteve a maior média sobre as demais, assim como o índice de aceitabilidade (Tabela 2.3) neste parâmetro, no entanto sem diferença significativa (p>0,05) em relação aos produtos sob tratamento. Segundo Dutcosky (1996), índices acima de 70% de aceitação indicam que o produto possui potencial mercadológico.

Tabela 2.3 - Aceitabilidade dos queijos de coalho com e sem adição da cobertura comestível de quitosana, em diferentes concentrações, por atributo avaliado

Produtos Aparência Cor Odor Sabor Textura

C 73,33% 73,66% 62,44% 76,22% 77,77%

T1 70,33% 73,22% 65,11% 76,66% 78,33%

T2 68,00% 70,77% 65,11% 72,22% 76,66%

T3 67,55% 71,66% 64,66% 72,55% 76,55% C: Controle; T1: cobertura (15 mg/ml Quitosana); T2: cobertura (10 mg/ml Quitosana); T3:

cobertura (5 mg/ml Quitosana).

Pereira (2013) comenta que a aparência é um atributo que reflete diretamente nas características globais, sendo muitas vezes responsável pela aceitação, rejeição, ou preferência de um produto. Em seu estudo, ao avaliar sensorialmente o emprego do gel de quitosana sob a superfície de queijo minas frescal, observou resultados semelhantes, onde a amostra C apresentou maior nota para aparência sobre os tratamentos que empregava quitosana com 5mg/ml e 20mg/ml. A cor, também, é um atributo muito importante na aceitabilidade do produto bem como para a sua caracterização. Assim como no atributo aparência, no quesito coloração, a amostra C obteve maior nota (Tabela 2.2), bem como maior índice de aceitabilidade, seguido da amostra T1, T3 e T2 (Tabela 2.3). Foi observado que a adição das coberturas de quitosana promoveram uma coloração levemente amarelada as amostras, porém salienta-se que, embora em termos absolutos, a amostra C tenha apresentado maiores médias, os resultados não variaram

37

estatisticamente. Yu Zhong et al. (2014) e Mei et al. (2013) também observaram que a dição da quitosana em revestimentos aplicados à queijos proporcionaram uma coloração amarelada aos produtos. El-Diasty et al. (2012) em seu estudo utilizando quitosana nas concentrações de 5mg/ml e 10mg/ml no controle fúngico de queijo Kariesh, relataram que os membros do painel sensorial não detectaram diferença entre os queijos tratados e não tratados com respeito a cor. Em frutas, por retardar o escurecimento enzimático, a aplicação da cobertura de quitosana apresenta resultados desejáveis à melhoria da coloração, conforme observado em mangas ‘Tommy Atkins’ (Souza et al. 2011) e goiabas ‘Kumagai’ (Cerqueira, 2007). Quanto a textura e sabor o T1 obteve maiores notas (Tabela 2.2) dentre as amostras avaliadas. Em queijo mussarela, Altieri et al. (2005) observaram que a quitosana não comprometeu a funcionalidade tecnológica nem promoveu modificações na textura do produto. Pereira (2013) verificou que a textura não sofreu influência do antimicrobiano pois as amostras não apresentaram diferença significativa. Porém em relação ao sabor, este mesmo autor relata que a amostra com cobertura de maior concentração (20mg/ml) obteve menor desempenho sobre as demais, e atribui esse fato à hipótese de que a adição de quitosana mais concentrada promove um sabor residual mais perceptível. Neste estudo o odor foi a característica que obteve as menores notas dadas pelos painelistas (Tabela 2.2), sem diferença significativa entre as amostras (p>0,05). As amostras obtiveram média entre 5,63 e 5,86 para este atributo, o que corresponde aos termos hedônicos entre “Não gostei/nem desgostei” e “Gostei ligeiramente”, e um índice de aceitabilidade entre 62,44% e 64,11%.

Acredita-se que a proximidade entre as amostras no momento da avaliação sensorial pode ter influenciado neste parâmetro, de forma que o odor dos produtos com a cobertura de quitosana, que segundo Brangel (2011) é uma substância que apresenta odor bem característico, tenham influenciado no odor das amostras controle. Em contrapartida El-Diasty et al. (2012) não observaram diferença significativas entre as amostras de queijos com e sem tratamento com relação aos atributos de consistência, sabor e odor. Di Pierro et al. (2011) quando avaliaram a extensão da vida útil de queijo Ricotta utilizando filme contendo quitosana, observaram que o revestimento, melhorou manutenção da textura e não interferiram nas características sensoriais.

Nos testes de comparação pareada para preferência a amostra T1 obteve melhor resultado dentre os tratamentos por ser preferida por pouco mais da metade do painel provador (51,7%), enquanto que T2 foi preferida por 45% e T3 por 46,7%. Estes resultados podem ter sido influenciados pelos atributos de qualidade (Tabela 2.2) que também refletiu no índice de aceitabilidade (Tabela 2.3), principalmente na aparência, em que as amostras T2 e T3 apresentaram valores inferiores ao limite mínimo de aceitabilidade. A preferência pela amostra T1 pôde ser confirmada no teste de intenção de compra, onde se destacou apresentando maiores frequências de notas em relação ao conceito “Certamente compraria”, conforme ilustrado na Figura 2.2. Vale salientar que os conceitos “Certamente compraria, Provavelmente compraria e Tenho dúvida se compraria”, foram mais repetidos pelos painelistas para as amostras avaliadas.

38

Figura 2.2 - Teste de intenção de compra de queijo de coalho adicionado de cobertura comestível de quitosana em diferentes concentrações

T1: queijo de coalho + cobertura (15mg/ml); T2: queijo de coalho + cobertura (10mg/ml); T3:

cobertura (5 mg/ml Quitosana) e C: controle T3: cobertura (5 mg/ml Quitosana).

2.5 CONCLUSÕES

A adição da cobertura de quitosana, independente da concentração utilizada, não alterou os requisitos físico-químicos estabelecidos pela legislação para queijo de coalho. Quanto as características sensoriais do produto a utilização do antimicrobiano, mesmo na concentração mais elevada, demostrou não ser um fator contraproducente, uma vez que os produtos, com e sem quitosana, obtiveram resultados semelhantes. A adição da cobertura comestível de quitosana, ainda proporcionou contagens microbianas inferiores ao padrão sem cobertura, demostrando ser uma método de conservação microbiológica viável para este produto. Portanto a aplicação de cobertura comestível de quitosana em queijo de coalho, possui um potencial promissor, por não proporcionar alterações nos aspectos de qualidade e agregar valor ao produto pela utilização de um composto antimicrobiano natural, atóxico e biodegradável.

COALHO-TYPE CHEESE WITH CHITOSAN EDIBLE COATING: PHYSICAL-

CHEMICAL AND SENSORY PROFILES

2.6 ABSTRACT: Antimicrobial edible coatings have been used increasingly widespread for food preservation and as part of the product their physical-chemical and sensory parameters can not changed. The aim of this study was to evaluate the physical-chemical and sensory profiles in coalho-type cheese added to the chitosan edible coating. For this purpose were produced coalho-type cheese coated with chitosan at concentrations of 15 mg.mL-1 (T1), 10 mg.mL-1 (T2) e 5 mg.mL-1 (T3). Untreated samples of cheese were used as a control (C) and coated samples, only, with acetic acid 1% (CA). Products were assessed for moisture, water activity (Aw), ashes, pH, acidity, proteins and fat in drymatter. Sensory analysis was performed by

21

1613

5 5

22

17

11

5 4

1916 15

46

18 18

13

5 6

0

10

20

30

40

50

60

Certamentecompraria

Provavelmentecompraria

Tenho dúvida secompraria

Provavelmentenão compraria

Certamente nãocompraria

Núm

ero

de P

rovadore

s

C T1 T2 T3

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paired comparison test, acceptance and intention to purchase, as well as, sanitary-microbiological criteria. The results obtained from physical-chemical and microbiological analysis showed that all samples met the requirements established by the Brazilian legislation. Samples T1, T2 e T3 proved a acceptance rates, 51.7%, 45% e 46.7%, respectively for paired comparison test. The sample with the highest concentration of chitosan (T1) was better accepted for taste (76.66%) and texture (78.33%) atributes and superior score to a “I would certainly buy” on purchase intention scale. In summary that chitosan as edible coating on coalho-type cheese cannot affect quality parameters of the product. KEYWORDS: Natural Antimicrobial, conservation, quality parameters, dairy product.

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40

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41

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44

CAPÍTULO 3

Artigo

Bioatividade de quitosana como cobertura comestível em queijo de

coalho na inibição de Listeria monocytogenes

Trabalho submetido para publicação ao periódico indexado Pesquisa Agropecuária Tropical

(PAT)

45

BIOATIVIDADE DE QUITOSANA COMO COBERTURA COMESTÍVEL EM QUEIJO

DE COALHO NA INIBIÇÃO DE Listeria monocytogenes

Priscilla Gregorio de Oliveira1, Erilane de Castro Lima Machado2, Roberta Albuquerque

Bento3

3.1 RESUMO: A falta de cuidados quanto à qualidade da matéria prima utilizada e as condições

de processamento tornam o queijo de coalho um alimento pouco seguro do ponto de vista

sanitário. Objetivou-se com este trabalho estudar a bioatividade da cobertura comestível de

quitosana em queijo de coalho na inibição de Listeria monocytogenes. Para isso, a partir de três

tratamentos (T1, T2, T3), correspondendo ao queijo de coalho adicionado de cobertura de

quitosana com diferentes concentrações (15 mg/mL, 10 mg/mL e 5 mg/mL, respectivamente),

avaliou-se a cinética de inibição bacteriana através da contagem de células viáveis de L.

monocytogenes, nos tempos de 0, 1, 2, 4, 8, 12 e 16 dias de armazenamentos. Onde o intervalo

0 dia corresponde ao momento de aplicação da cobertura e inoculação do microrganismo, na

superfície dos produtos com a cobertura. O queijo de coalho sob o tratamento que apresentou

melhor resposta antimicrobiana foi avaliado quanto as suas características físico-químicas e

intenção de compra. Observou-se que o tratamento T1 proporcionou uma menor contagem de

células viáveis, durante todos os intervalos avaliados, em comparação aos demais tratamentos

e controles, sendo portanto, considerado o tratamento mais eficaz. Os parâmetros físico-

químicos avaliados apresentaram-se dentro do recomendado pela legislação em vigência. A

amostra T1 obteve resultados satisfatórios por obter maior média para o termo hedônico de

“certamente compraria” e “provavelmente compraria”. Conclui-se que o emprego de cobertura

comestível de quitosana apresenta eficiência quanto à conservação microbiológica, não interferi

nas características físico-químicas e sensorial, por gerar satisfação quanto a intenção de compra.

PALAVRAS CHAVES: Produto lácteo; contaminação bacteriana; antimicrobiano natural.

46

BIOACTIVITY OF CHITOSAN AS EDIBLE COATING IN COALHO-TYPE CHEESE IN

INHIBITION OF Listeria monocytogenes

3.2 ABSTRACT: The absence of care on quality of raw materials used and processing

conditions have made coalho-type cheese an unsafe food to the consumption. This study aimed

to assess the bioactivity of chitosan as edible coating in coalho-type cheese in inhibition

ofListeria monocytogenes. For this purpose were performed three treatments (T1, T2, T3)

corresponding to the different chitosan concentrations of 15 mg/mL, 10 mg/mL e 5 mg/mL,

respectively, and kinetics of inhibition by viable cell counts of L. monocytogenes was evaluated

at 0, 1, 2, 4, 8, 12 and 16 days of storage. Time zero when applying bioactive coatings and

microorganism inoculated on surface of the product coated. The cheese showed the best

antimicrobial response was evaluated in relation to the physical-chemical characteristics and

intention to purchase. Treatment T1, considered the most effective treatment, produced

lower viable cell counts, during all intervals assessed, when compared to the control samples

and other treatments. The results obtained from physical-chemical analysis showed that all

samples met the requirements established by the Brazilian legislation. Sample T1 showed

superior scores to the “I would certainly buy” and “I would probably buy”. In summary the use

of chitosan edible coating for food preservation is efficient, can increase the purchase intent

and does not interfere on the physical-chemical and sensory characteristics.

KEYWORDS: Dairy product, bacterial contamination, natural Antimicrobial.

3.3 INTRODUÇÃO

A insegurança sanitária pela contaminação microbianos nos alimentos é uma grande

preocupação para a indústria alimentícia devido as perdas econômicas e pelo risco de causar

Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) à população (Ruwer et al. 2011). Nas últimas

décadas, dentre os microrganismo patogênicos veiculados através dos alimentos, que têm

47

ocasionado ampla preocupação, pode-se destacar a Listeria monocytogenes (Silva et al. 2011),

devido, principalmente, às graves consequências à saúde humana que a presença deste

microrganismo acarreta (Guahyba Bisneto, 2012).

Segundo Hofer et al. (2006) é provável que a maior parte dos casos de listeriose humana,

doença causada por Listeria monocytogenes, tenha o alimento como veículo de transmissão, e

vários tipos de produtos alimentícios, tanto de origem vegetal como animal, têm sido associados

como vetor de transmissão desta bactéria.

Dentre os produtos lácteos os queijos são os mais comumente contaminados (Borges et

al. 2009). A facilidade de contaminação dos produtos lácteos, se dá pela baixa qualidade da

matéria-prima, falta de Boas práticas de fabricação nas etapas anterior e posterior ao

processamento e pela natureza ubíqua do patógeno, que torna a transferência e permanência de

cepas desta bactéria dentro das unidades processadoras de alimentos uma ação simples,

facilitando assim, contaminações recorrentes no produto final (Kabuki 2004, Pacheco 2011).

Outra preocupação associada a contaminação dos alimentos por L. monocytogenes é

pela sua condição Psicrotrófica, sendo capaz de multiplicar-se sob refrigeração. O uso da cadeia

de frio na estocagem de alimentos, representam nichos que favorece o seu crescimento e torna

um desafio o seu controle na cadeia de produção de alimentos (Kozak et al. 1996).

Assim, o desenvolvimento de métodos de controle microbiano para queijos torna-se

essenciais, afim de promover a qualidade sanitária destes produtos.

A quitosana é um dos antimicrobianos naturais que vêm sendo estudados em queijo de

alta umidade, uma vez que possuem um amplo espectro bactericida frente a microrganismos

patogênicos contaminantes do queijo (Fai et al. 2008, Bento et al. 2011).

Nesta perspectiva, o uso de cobertura comestível de quitosana torna-se uma alternativa

promissora de conservação para o produto final e contribui para melhorar a qualidade

microbiológica e aumentar o tempo de vida de prateleira, agregando, desta forma, mais valor

http://www.lume.ufrgs.br/browse?type=author&value=Guahyba%20Bisneto,%20Jo%C3%A3o%20Pereira

48

ao produto por deixá-lo mais natural e seguro, melhorando sua imagem (Pagani et al. 2012,

Nunes et al. 2013). Portanto o objetivo deste trabalho foi avaliar a bioatividade da cobertura

comestível de quitosana aplicada ao queijo de coalho na inibição de L. monocytogenes.

3.4 MATERIAL E MÉTODOS

Os ensaios foram conduzidos nos laboratórios de Bromatologia, Técnica dietética e

Microbiologia dos Alimentos da UFPE- CAV.

Preparo da quitosana

A quitosana empregada nesse estudo foi obtida da empresa Sigma-Aldrich (Alto de

Pinheiros, São Paulo, SP, Brasil), sendo, descrita como, de médio peso molecular, desacetilada

entre 75 – 85%, procedente da purificação de quitina extraída da carapaça de crustáceo. O

preparo do gel de quitosana foi realizado por dissolução em ácido acético a 1%, mantido sob

agitação moderada em agitador magnético, durante 24h, em temperatura ambiente ± 25ºC

(±1ºC), até a total dissolução do pó e obtenção do gel homogêneo, sendo posteriormente

realizada a calibração do pH para 5,8, utilizando NaOH e HCl, conforme descrito por

Shigemasa e Minami (1996). Foram preparadas coberturas com diferentes concentrações de

quitosana,, de 15mg/ml, 10mg/ml e 5mg/ml, denominadas de T1, T2 e T3 respectivamente.

Preparo do queijo de coalho com cobertura de quitosana

Para a produção de queijo de coalho foram utilizados leite bovino integral pasteurizado

(Betânia®), padronizado com 3% de gordura, adquiridos de representantes comerciais locais,

Cloreto de cálcio (VETEC®), coagulante líquido HA-LA (Christian hansen®) e cloreto de sódio

(VETEC®).

A metodologia de elaboração do queijo de coalho foi adaptada de Nassu, Macedo e

Lima (2006). Após a higienização (com solução clorada a 200ppm) dos utensílios de apoio,

bancadas e embalagem do leite, o leite foi aquecido até atingir uma temperatura de 32ºC.

49

Posteriormente foram adicionados lentamente, cloreto de cálcio (0,5ml/L) e o coagulante

líquido (1ml/L) previamente diluído em água esterilizada, sendo homogeneizados durante um

minuto e permanecendo em repouso por mais 50 minutos. Após o repouso, foi realizado o corte

da coalhada (cubos com1cm2 de aresta), seguido de agitação lenta, durante cinco minutos, e

aquecimento da massa (45ºC). Em seguida a este procedimento foi realizado o segundo

descanso (5 minutos) seguido da dessoragem, salga da massa (1% em relação ao peso da

massa), enformagem e prensagem durante 60 minutos, sendo realizada uma viragem do queijo

ao completar-se 30 minutos de prensagem.

Para desenvolver aroma e sabor, o queijo de coalho foi maturado em câmara refrigerada,

à temperatura de 10°C, durante três dias, correspondendo ao tempo em que a massa não

apresentava fragmentação ao realizar-se o corte. Após este período, foi realizado a etapa de

adição da cobertura, através da imersão do queijo de coalho em gel de quitosana. O queijo foi

cortado em cubos de aproximadamente 10g, com volume de 2cm³ e imersos individualmente

nos géis de quitosana, por 3 minutos.Com auxílio de uma pinça estéril foram transferidos,

assepticamente para uma centrifuga de verduras (Plasutil®), onde retirou-se o excesso do gel

com rotação manual, durante 30 segundos. As amostras retornaram para a câmera refrigerada

(8°C), onde permaneceram por mais três dias para que se completasse o tempo de maturação.

Ação antimicrobiana da quitosana sob a viabilidade de L. monocytogenes em queijo de coalho

O inóculo de L. monocytogenes ATCC 3533 utilizado nos ensaios de atividade

antimicrobiana foi obtido de culturas semeadas em caldo BHI e incubadas a 37ºC por 18-24

horas, suspendendo as células bacterianas, com o auxílio de uma alça de platina estéril, em

solução salina estéril para a padronização da densidade em espectrofotômetro sob um

comprimento de onda de 625nm, obtendo-se um inóculo bacteriano de aproximadamente de 1

x 108 UFC.ml-1 (CLSI, 2003).

50

A cinética de inibição bacteriana da cobertura de quitosana em amostras de queijo de

coalho sob a viabilidade celular de L. monocytogenes foi acompanhada através da contagem

de células viáveis (curva de sobrevivência bacteriana) frente às diferentes coberturas de

quitosana produzidas (T1, T2 e T3). Amostras com cobertura de ácido acético 1% (CA) e

amostras sem adição de cobertura (C) foram utilizadas como controles. No tempo 0, momento

de incorporação das coberturas ao produto, foi adicionado 1ml do inóculo bacteriano na

superfície das amostras, com o auxílio de um pipetador automático. Após este procedimento,

as amostras foram mantidas sob refrigeração (10ºC) e a contagem de L. monocytogenes foi

realizada nos intervalos de 0, 1, 2, 4, 8, 12 e 16 dias de armazenamento. Para isso, 10g das

amostras (CA, C, T1, T2 e T3) foram assepticamente transferidas, com o auxílio de uma pinça

estéril, para sacos estéreis de stomacher, adicionados de 90ml de solução salina, e macerados,

com o auxílio de um pistilo, e em seguida, foram homogeneizados em stomacher durante 5

minutos em velocidade de 3.5 rpm. O produto foi diluído seriadamente (1:9 v/v) em água

peptonada 0,1% (10-1 – 10-6) estérile alíquotas de 100µL das diluições foram semeadas em

placa de Petri contendo Listeria Selective Agar base + Listeria SelectiveSupplement II

(Acriflavinhydrochloride (Trypaflavin) 15mg, Nalidixicacid 40mg, Cycloheximide 50mg),

uniformemente distribuída com alças Drigalski e incubadas a 35ºC por 48h. Após a contagem

do número de células viáveis, os resultados foram expressos em Log de UFC/ml (SAGDIÇ,

2003). O percentual de redução de UFC/ml ao longo dos tempos analisados foi determinado

com base no inóculo microbiano inicial e comparado ao grupo controle.

Analises físico-químicas e Sensorial

O produto com tratamento mais eficiente frente a inibição de L. monocytogenes,

juntamente com a amostra C, foi avaliado quanto aos parâmetros físico-químicos para queijo

de coalho exigido pela legislação em vigor, determinando-se o teor de Umidade (012/IV) e

Lipídeos (466/IV) nas amostras, além do pH (017/IV) e atividade de água. As análises foram

51

executadas conforme descrito por Adolf Lutz (2008) e os resultados de lipídeos foram expresso

como gordura em base seca (GBS %), através da equação:

GBS = % 𝑑𝑒 𝑔𝑜𝑟𝑑𝑢𝑟𝑎 ×100

𝐸𝑆𝑇

Na análise sensorial foi aplicado teste de intenção de compra (Anexo IV). Os painelistas

foram escolhidos conforme disponibilidade e critérios de inclusão (gostar de queijo de coalho)

e de exclusão (Pessoas que apresentassem intolerância a algum componente da fórmula, idade

superior a 60 anos, tabagistas, pessoas com doenças que comprometessem a funcionalidade do

paladar e olfato), sendo formado um painel de 60 provadores. Os testes sensoriais foram

realizados após a aprovação pelo comitê de ética em pesquisa da Universidade Federal de

Pernambuco (CAAE 34469914.5.0000.5208), seguindo a Resolução 196/96 do Conselho

Nacional de Saúde, e após ciência e assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido

(Anexo V). As análises físico-químicas foram realizadas no dia 0, referente ao momento de

incorporação das coberturas, enquanto a análise sensorial foi realizada após completar-se os 6

dias de maturação.

Análise estatística e reprodutividade

Os dados das análises executadas em triplicata foram submetidas a análise estatística

descritiva (média e desvio padrão) e inferencial (teste t de Student e teste de Turkey) para

determinação de diferenças estatisticamente significantes (p<0.05) entre os diferentes

tratamentos aplicados através do programa STATSOFT (2004).

3.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Viabilidade de Listeria monocytogenes frente a cobertura comestível de quitosana aplicada

ao queijo de coalho

52

Os resultados observados através da análise da curva de sobrevivência de L.

monocytogenes, ao longo de 16 dias de armazenamento (Tabela 3.1), demonstraram efeito

significativo e inversamente proporcional dos diferentes tratamentos (T1, T2 e T3) utilizados,

ou seja, havendo aumento da concentração de quitosana verificou-se maior diminuição do

crescimento microbiano, nos períodos avaliados.

Tabela 3.1 – Contagem (Log UFC.ml-1) de Listeria monocytogenes em queijo de coalho

adicionado de cobertura comestível de quitosana em diferentes concentrações

DIAS C T1 T2 T3 CA

0 6,06±0,01Ac 3,56±0,07Dd 3,54±0,04Dg 5,23±0,03Ce 5,91±0,02Bc

1 6,21±0,01Ab 3,75±0,08Dc 4,45±0,04Ce 5,61±0,03Bd 6,24±0,04Aa

2 6,26±0,05Aa 3,42±0,04De 4,63±0,03Cd 5,90±0,01Ba 6,26±0,01Aa

4 5,20±0,03Bf 3,79±0,02Ec 4,29±0,01Df 5,01±0,02Cf 5,35±0,02Af

8 5,46±0,02Be 4,37±0,04Da 4,74±0,02Cc 5,81±0,03Ab 5,44±0,03Be

12 5,76±0,01Ad 4,38±0,04Da 4,88±0,02Cb 5,70±0,01Bc 5,72±0,02Bd

16 5,05±0,03Dg 4,24±0,04Eb 5,14±0,03Ca 5,25±0,01Be 6,05±0,03Ab abcMédias seguidas de letras iguais na vertical não diferem significativamente (p>0,05) pelo teste de Duncan. ABC Médias

seguidas de letras iguais na horizontal não diferem significativamente (p>0,05) pelo teste de Duncan. C: Controle; T1:

cobertura (15 mg/ml Quitosana); T2: cobertura (10 mg/ml Quitosana); T3: cobertura (5 mg/ml Quitosana) e AA: Controle

com ácido acético.

A curva de sobrevivência de Listeria monocytogenes está melhor ilustrada na Figura

3.1, onde se observa que os tratamentos T1 (15 mg/ml Quitosana) e T2 (10 mg/ml Quitosana)

proporcionaram os melhores resultados e que estes foram bastante próximos, exibindo reduções

logarítmicas da carga microbiana variando de 2,84 a 0,81 e 2,52 a 0,88, respectivamente, em

relação ao grupo controle C. Atribuiu-se o efeito antimicrobiano à quitosana uma vez que não

se verificou efeito relacionado ao ácido acético, o qual proporcionou um curva de crescimento

bacteriano semelhante ao grupo controle C, sem adição de cobertura.

O período de maior redução da carga microbiana apresentada pelos tratamentos T2 e T1

corresponderam aos intervalos de 0 e 2 dias de armazenamento. A amostra T2 só apresentou

eficiência na inibição do crescimento microbiano até o 12º dia de armazenamento, onde após

53

esse período já é possível observar (Tabela 3.1 e Figura 3.1) que esta amostra apresenta carga

microbiana superior a amostra C.

O tratamento T3, não apresentou resultados satisfatório, pois a partir do 8º dia já foi

possível observar que o tratamento não apresenta nenhum efeito inibitório sobre o crescimento

de L. monocytogenes, resultando em um produto com carga microbiana mais elevada que a

amostra CA e C, neste intervalo, e contagens mais elevadas que as amostras T1 e T2 nos

intervalos subsequentes.

Figura 3.1 - Curva de sobrevivência de Listeria monocytogenesem queijo de coalho

adicionado quitosana em diferentes concentrações.

C: Controle; T1: cobertura (15 mg/ml Quitosana); T2: cobertura (10 mg/ml Quitosana); T3: cobertura (5 mg/ml Quitosana) e

AA: Controle com ácido acético.

Botrel et al. (2007) constataram resultados semelhantes a estes, quando averiguaram que

para o controle de bactérias psicotrópicas, bolores e leveduras em alho minimamente

processado, é necessário o uso de revestimentos com concentrações de quitosana acima de

5mg/ml, pois revestimentos com essa concentração apresentaram resultados semelhantes aos

revestimentos utilizando somente o ácido acético.

Pereira (2013), quando avaliou o comportamento de Staphylococcus aureus em queijo

Minas Frescal com cobertura de quitosana, extraída da carapaça de crustáceo, obteve melhor

0

1

2

3

4

5

6

7

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

LO

G U

FC

.ml-1

TEMPO (DIAS)

C

T1

T2

T3

CA

54

resposta para o revestimento com concentração de 20mg/ml frente ao de 5mg/ml, constatando

que, embora houvesse um crescimento contínuo da quantidade do microrganismos em todas as

amostras, a amostra tratada com a cobertura de 20mg/ml de quitosana conseguiu manter

menores contagens (p<0.05) até o 10º dia de armazenamento, chegando a exibir reduções de

3,05 ciclos logarítmicos enquanto que o tratamento com 5mg/ml diminuiu em 1,79 ciclos

logarítmicos, em comparação a amostra controle.

Di Pierro et al. (2011) quando aplicaram um filme de quitosana (8mg/ml) em ricota, sob

atmosfera modificada, à 4ºC, observaram-se que os números viáveis de microrganismos

mesofilos e psicrotróficos ultrapassou o limite de aceitabilidade para carga microbiana em

alimentos, 7 log UFC/g (ICMSF, 1986), no 7 º dia e 14º dia para os respectivos microrganismos.

Altieri et al. (2005) estudando a eficiência antibacteriana da quitosana em queijo

mussarela mantido sob temperatura de refrigeração (4ºC), concluíram que a quitosana utilizada

na massa do queijo (0,75mg/ml, baixo peso molecular e 85% desacetilada) inibiu o crescimento

de microrganismos do grupo coliforme e de Pseudomonas spp., porém menores contagens,

apresentadas pelo antimicrobiano, só foram observado ao 3º e 5º dia de armazenamento, para

os respectivos microrganismos.

Bento et al. (2009) ao avaliar o efeito antilisterial de quitosana, in vitro, com grau de

desacetilação (85%), produzida por Mucorrouxxi UCP 064, observaram que as reduções da

carga microbiana (em 2 Log UFC/ml) obtidas para a concentração bactericida mínima (5,0

mg/ml) e para a concentração inibitória mínima (2,5 mg/ml) ocorreram em um período inicial,

compreendido em 2 e 4 horas respectivamente e se mantiveram constante até 96h (4 dias).

Shekarforoush et al. (2015) ao avaliarem o efeito inibitório do uso de quitosana e óleo

essencial de orégano em carne de frango curada frente a Listeria monocytogenes e Escherichia

coli, observaram que a amostra com quitosana (10mg/ml) apresentou um redução significativa

55

(0,49, 0,42 e 0,45 Log) (p<0,05) em relação a amostra controle, sem antimicrobiano, em um

intervalo de 24, 48 e 72 horas respectivamente, quando armazenadas a temperatura de 8ºC.

Mei et al. (2013) quando avaliaram um filme protetor, composto por quitosana, no

armazenamento de queijo da Mongólia, utilizando uma concentração de 13mg/ml, obtiveram

reduções da carga microbiana autóctone, mesofilos e fungos, nos tratamentos, em todos os

intervalos de armazenamento (ºC) avaliados (15 e 30 dias), quando compararam a amostra

controle.

El-Diasty et al. (2012) utilizando quitosana nas concentrações de 5mg/ml e 10mg/ml no

controle fúngico de queijo Kariesh, obteve reduções nas contagens de bolores e leveduras

durante os 21 dias de armazenamento, variando em aproximadamente em 1 Log UFC/g.

O mecanismo de ação da quitosana está intimamente relacionado à diversas variáveis e

que estes fatores atuam de forma ordenada e independente para cada tipo de microrganismo

(Kong 2010, Badawy 2011, Nascimento 2013). No que se refere ao modo de ação, Garcia

(2011) comenta que o efeito bactericida da quitosana sob bactérias do grupo Gram-positiva, se

dá pela formação de uma película ao redor da célula bacteriana, inibindo a absorção de

nutrientes e consequentemente levando à sua morte. Outro fator à ressaltar, é que ao entrar em

contato com o alimento, os materiais utilizados nas coberturas formam interações complexas,

que ocorrem simultaneamente e em intensidades variadas (Paria & Khilar 2004, Assis & Brito

2014).


Os resultados obtidos nos ensaios físico-químico da amostra com melhor desempenho

na atividade antimicrobiana, T1 e da amostra C encontraram-se em acordo como exigido pela

Portaria 146/ 96 (Brasil 1996) e IN 30 (Brasil 2001) para umidade e gordura, apresentando,

respectivamente, um teor médio de 51,45% ± 0,54 e 51,02% ± 0,77, para umidade e 43,22% ±

0,15 e 43,54 ± 0,33 de gordura nos sólidos totais (GST), sem diferença estatística (p>0,05).

56

A legislação brasileira estabelece que o queijo de coalho deve conter entre 36% a 54,9%

de umidade, sendo classificado como queijo de alta umidade. Esses resultados corroboram com

os observado por Silva et al. (2010) que relatam valores de umidade entre 45,5 a 51,5% em

queijo de coalho.

Segundo Freitas Filho et al. (2009), a umidade interfere na atividade de água (Aa) e nas

ações metabólicas de microrganismos ao longo da maturação, por favorecer o seu

desenvolvimento pela elevada quantidade de água não ligada disponível para a suas reações

metabólicas. Segundo Franco & Landgraf (2008) a atividade de água ótima para o crescimento

de Listeria é próxima a 0,97, contudo, esta bactéria tem a capacidade de se multiplicar em

atividade de água considerada baixa para a multiplicação de patógenos – 0,92. O valor de

atividade de água obtido pelas amostras foi de0,97, sem diferença. Apesar deste resultado

apresentar-se no valor de a atividade de água ótima para o crescimento do patógeno, essa

variável não deve ter influenciado no desenvolvimento microbiano, já que não houve diferença

significativa (p>0,05) entre as amostras.

A amostra T1 apresentou pH mais ácido que a amostra C: 6,6 e 7,0 respectivamente,

existindo diferença (p<0.05) entre as amostras. Pereira (2013) e Hernandez-Muñoz et al (2008)

também descreveram valores mais ácidos para as amostras adicionadas de cobertura de

quitosana. Isso se deve a presença do ácido acético bem como o ajuste do pH da quitosana, para

obtenção de um maior grau de protonação dos agrupamentos amina.

Análise Sensorial

No teste da intenção de compra verificou-se que a amostra T1 obteve resultados

satisfatórios por apresentar maior média para o termo hedônico de “certamente compraria” e

“provavelmente compraria” Respostas no nível 3 “tenho dúvida se compraria” apresentaram

frequência bastante próximas entre as amostras T1 e C. Os conceitos “provavelmente não


57

compraria” e certamente não compraria” foram os menos votados pelos julgadores. Nascimento

(2013) e Jorge (2010) também obtiveram resultados satisfatórios quando avaliaram a atitude de

compra para goiabas minimamente processadas e maçãs revestidas de quitosana.

Figura 3.2–Teste de intenção de compra de queijo de coalho adicionado de cobertura

comestível de quitosana em diferentes concentrações.

T1: queijo de coalho + cobertura (15mg/ml) e C: controle T3: cobertura (5 mg/ml Quitosana).

3.6 CONCLUSÕES

O tratamento T1 foi o mais eficiente na inibição do crescimento de Listeria

monocytogenes ATCC 3533 durante o período de 16 dias de armazenamento do queijo de

coalho, por manter as menores contagens ao longo do tempo. No teste de intenção de compra,

esta amostra foi bem votada, demostrando possuir um potencial mercadológico. Portanto, tendo

em vista a grande importância econômica e nutricional do queijo de coalho os resultados obtidos

demostram ser promissores no que se refere à conservação do queijo de coalho pelo emprego

de coberturas naturais e comestíveis como a quitosana, por proporcionar qualidade

microbiológica e a manutenção das características físico-químicas e sensoriais.

2118

14

4 3

2319

11

3 4

0

10

20

30

40

50

60

Certamente

compraria

Provavelmente

compraria

Tenho dúvida se

compraria

Provavelmente

não compraria

Certamente não

compraria

Núm

ero

de

Pro

vad

ore

s

C T1

58

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63

DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste trabalho evidenciam que a utilização da cobertura

comestível de quitosana, extraída da carapaça de crustáceos, de médio peso molecular,

aplicada em queijo de coalho mostrou-se eficaz na inibição de cepa de L. monocytogenes

ATCC 3533, uma vez que se verificou que a adição do antimicrobiano proporcionou menores

contagens microbiana, com melhor desempenho para a amostra com cobertura de maior

concentração (15 mg/ml) que, diante das demais, proporcionou menores cargas microbianas

no período de 16 dias de armazenamento.

Também foi observado que a adição da cobertura comestível de quitosana, nas

diferentes concentrações, proporcionaram melhores resultados quanto aos requisitos

microbiológicos exigidos pela legislação, por possibilitar menores contagens para os

microrganismos avaliados em relação a amostra controle.

Quanto aos parâmetros físico-químicos pôde-se observar que a adição da cobertura

de quitosana, nas diferentes concentrações, não descaracterizou o produto quanto aos

requisitos da composição de qualidade estabelecidos pela legislação para queijo de coalho,

ao qual determina os parâmetros de umidade e gordura. Aos demais atributos físico-químicos

avaliados, discretas alterações foram encontradas, porém não afetaram a qualidade do

produto final, podendo ter influenciado, apenas, na seleção sensorial do melhor produto.

Sensorialmente, as amostras de queijo de coalho com cobertura de quitosana, nas

diferentes concentrações, foram bem avaliadas quanto a aceitação, por apresentarem

resultados nos mesmos termos hedônicos, para os atributos avaliados, das amostras sem

cobertura. Em relação a preferência e intenção de compra dos produtos as amostras com

cobertura comestível de quitosana de maior concentração (15mg/ml) se destacaram dentre

os demais tratamentos.

Estes resultados são bastante promissores do ponto de vista da segurança alimentar,

pois a adição de cobertura comestível de quitosana ao queijo de coalho apresenta-se como

uma alternativa viável para sua conservação, uma vez que este produto, em sua maioria,

apresenta deficiência quanto à padronização da qualidade, sendo apontado frequentemente

como um importante canal de patógenos de procedência alimentar dentre os produtos lácteos,

além de agregar valor ao produto.

64

Ressalta-se que a qualidade do produto é uma vantagem competitiva para as

empresas e as impedem de ficarem às margens do mercado consumidor, uma vez que a

segurança dos produtos alimentícios é a primeira e principal responsabilidade da indústria de

alimentos.

Além disso, o uso de substâncias naturais para a preservação dos alimentos ganha

força no sentido de que o mercado consumidor está cada vez mais exigente quanto a

qualidade dos produtos agroalimentares, uma vez que estão cada vez mais a procura por

produtos mais saudáveis, inócuos, nutritivos e que adotem métodos de produção de baixo

impacto ambiental.

Entretanto, estudos adicionais são necessários para que se avalie a interferência da

aplicação da cobertura comestível de quitosana sob a vida de prateleira do queijo de coalho,

no intuito de garantir ao consumidor um alimento saudável e seguro.

65

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STREIT, F. Estudo do aproveitamento do bagaço de maçã para produção de quitosana

fúngica. 2004. 101 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Alimentos). Universidade

Federal de Santa Catarina. Florianópolis, 2004.

SWAMINATHAN, B. Listeria monocytogenes. In: DOYLE, M.P.; BEUCHAT, L.R.;

MONTVILLE, T.J. (Eds). Food microbiology: fundamentals and frontiers. Washington:

ASM, p.383-409, 2001.

SWAMINATHAN, B.; GERNER-SMIDT, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes

and Infection, v. 9, n. 10, p. 1236-1243, 2007.

SWANSON, Joel A.; BAER, Stephen C. Phagocytosis by zippers and triggers. Trends in

cell biology, v. 5, n. 3, p. 89-93, 1995.

TOMPKIN, R. B. Control of Listeria monocytogenes in the food-processing

environment. Journal of Food Protection, Des Moines, v. 65, n. 4, p. 709-725,Nov., 2002.

VAZQUEZ-BOLAND, J. A.; KUHN, M.; BERCHE, P.; CHAKRABORTY, T.;

DOMINGUES-BERNAL, G.; GOEBEL, W.; GONZALEZ-ZORN, B.; WEHLAND, J.;

KREFT, J. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical

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VIEIRA, S. D.; POIATTI, M. L.; SCHOCKEN-ITURRINO, R. P.; VIEIRA, H.; ANDRADE, T. M.

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Araguaíana-TO. In: Anais do 21º Congresso Brasileiro de Microbiologia. Foz do Iguaçu,

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VIEIRA, M.A.S.; MASSAGUER, P.R. Incidência de Listeria ssp. em queijos minas frescal

comercializados em Campinas/SP. Revista Indústria de Laticínios, v.23, n.4, p.62-65,

2000.

94

VILLADIEGO, A. M. D.; SOARES, N. F. F; ANDRADE, N. J.; PUSCHMANN, R.; MINIM, V.

P. R.; CRUZ, R. Filmes e revestimentos comestíveis na conservação de produtos

alimentícios. Revista Ceres, v. 52, n. 300, p. 221-244, 2005.

WAAK, E.; THAM, W.; DANIELSSON-THAM, M. Prevalence and fingerprinting

ofListeria monocytogenes strains isolated from raw whole milk in farm bulk tanks and in dairy

plant receiving tanks. Applied and Environmental Microbiology, v. 68, n. 7, p. 3366-3370,

July, 2002.

WALSTRA, P.; GEURTS, T. J.; NOOMEN, A.; JELEMA, A. VAN BOEKEL, M. A. J. S.; Dairy

technology: principles of milk properties and processes. Food science and technology,

New York, p. 727, 1999.

WESLEY, I. V. Listeriosis in animals. In E. T. Ryser& E. H. Marth, Listeria, Listeriosis and

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WINTEROWD, J. G.; SANDFORD, P. A. “Chitin and Chitosan”. Food Polysaccharides and

Their Applications, Stephen, A M, Ed. Marcel Dekker. Nueva York, 1995.

YADAV, A. V.; BHISE, S. B. Chitosan: a potential biomaterial effective against

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ZAFFARI, C. B.; MELLO, J. F.; DA COSTA, M. Quantificação de coliformes fecais e

isolamento de E. coli e Listeria sp. Em queijos produzidos artesanalmente e comercializados

na região litorânea no Rio Grande do Sul. In: Anais do 23º Congresso Brasileiro de

Microbiologia, Santos: SBM; 2005.

ZAMANI, A.; EDEBO, L.; NIKLASSON, C.; TAHERZADEH, M. J. Temperature shifts for

extraction and purification of zygomycetes chitosan with dilute sulfuric

acid. Internationaljournalof molecular sciences, v. 11, n. 8, p. 2976-2987, 2010.

95

ANEXO I

Universidade Federal de Pernambuco

Centro Acadêmico de Vitória Programa de Pós-Graduação em Saúde Humana

e Meio Ambiente

Nome Data

E-mail Celular/ Whatsap

FICHA DE AVALIAÇÃO SENSORIAL I

1. TESTE DE COMPARAÇÃO PAREADA (DIFERENÇA)

INSTRUÇÕES: Você está recebendo 2 amostras, para serem avaliadas. Deguste

cuidadosamente cada uma das amostras e responda se existe diferença entre elas.

SENTIU DIFERENÇA

Sim ( )

Não ( )

Comentários:_______________________________________________________________

__________________________________________________________________________

96

ANEXO II



e Meio Ambiente

Nome Data


FICHA DE AVALIAÇÃO SENSORIAL I

1. TESTE DE COMPARAÇÃO PAREADA (PREFERÊNCIA)

INSTRUÇÕES: Você está recebendo 2 amostras, para serem avaliadas. Deguste

cuidadosamente cada uma das amostras e escreva o código da amostra preferida.

CÓDIGO DA AMOSTRA PREFERIDA

Comentários:_______________________________________________________________

__________________________________________________________________________

97

ANEXO III


Centro Acadêmico de Vitória Programa de Pós-Graduação em Saúde Humana e

Meio Ambiente

Nome Data


FICHA DE AVALIAÇÃO SENSORIAL III

TESTE DE ACEITAÇÃO

INSTRUÇÕES: Você está recebendo um par de amostra.Avalie cada um dos atributos sensoriais (aparência, cor, odor, sabor e textura), e atribua uma nota (de acordo com

as descrições da primeira coluna)

1- Desgostei extremamente 2- Desgostei moderadamente 3- Desgostei regularmente 4- Desgostei ligeiramente 5- Não gostei/nem desgostei 6- Gostei ligeiramente 7- Gostei regularmente 8- Gostei moderadamente 9- Gostei extremamente

ATRIBUTO

CÓDIGO DA AMOSTRA

CÓDIGO DA AMOSTRA

Aparência

Cor

Odor

Sabor

Textura

Comentários:_______________________________________________________________

__________________________________________________________________________

98

ANEXO IV



e Meio Ambiente

Nome Data


FICHA DE AVALIAÇÃO SENSORIAL IV

TESTE DE INTENÇÃO DE COMPRA

INSTRUÇÕES: Após a avaliação das amostras atribua uma nota (de acordo com as descrições da primeira coluna) quanto a intenção de compra de cada produto.

5- Certamente compraria 4- Provavelmente compraria 3- Tenho dúvida se compraria 2- Provavelmente não compraria 1- Certamente não compraria

CÓDIGO CÓDIGO CÓDIGO

NOTA NOTA NOTA

Comentários:_______________________________________________________________

________________________________________________________________

99

ANEXO V

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Você está sendo convidado(a) a participar, como voluntário(a), da pesquisa “Bioatividade de quitosana como cobertura comestível em queijo de coalho na inibição de cepas de Listeria monocytogenes”, no caso de você concordar em participar, favor assinar ao final do documento. Sua participação não é obrigatória, e, a qualquer momento, você poderá desistir de participar e retirar seu consentimento. Sua recusa não trará nenhum prejuízo em sua relação com o pesquisador(a) ou com a instituição.

Você receberá uma cópia deste termo onde consta o telefone e endereço do pesquisador(a) principal, podendo tirar dúvidas do projeto e de sua participação. NOME DA PESQUISA: “Bioatividade de quitosana como cobertura comestível em queijo de coalho na inibição de cepas de Listeria monocytogenes” PESQUISADOR(A) RESPONSÁVEL: Erilane de Castro Lima da ENDEREÇO: R. da Chesf, nº 113, Timbi, Camaragibe/PE. CEP: 54765-270. TELEFONE: (81) 8834 4067 CONTATO COM O COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA: Av. da Engenharia s/n, Cidade Universitária, Recife-PE, CEP: 50740-600, Tel.: 2126 8568/21268500. Email: [email protected] PESQUISADORES PARTICIPANTES: Roberta Bento de Albuquerque (Profª) e Priscilla Gregorio de Oliveira (Aluna). OBJETIVOS: Verificar a bioatividade antimicrobiana da quitosana como cobertura comestível em queijo de coalho frente a Listeria monocytogenes objetivando fornecerão mercado novas tecnologias de conservação do produto. Afim de aumentar sua vida de prateleira e oferecer ao consumidor um produto seguro e saudável. Uma vez que a quitosana é um antimicrobiano natural que não gera risco à saúde. PROCEDIMENTOS DO ESTUDO: Os participantes não treinados receberão as amostras, e deverão avaliar o produto quanto aos atributos sensoriais cor, aroma, sabor, sabor residual, textura e qualidade global, através de fichas sensoriais. Amostras dos produtos elaborados serão servidas, aos provadores, em cabines individuais iluminadas com luz branca, à temperatura de 8 ºC, em copos descartáveis, aleatoriamente codificados. RISCOS: Pequeno risco, quanto ao desconforto sensorial. Após a análise, o participante receberá água mineral para aliviar o desconforto, caso haja. Pessoas que apresentam alergia a produtos lácteos não serão selecionados, sendo portanto a apresentação de alergia aos produtos lácteos um critério de exclusão. A quitosana é um produto natural que possui propriedades medicinais para a saúde humana, trazendo assim benefícios para os componentes do painel sensorial. A ANVISA considera a quitosana como um alimento funcional, Isto é, alimento que produz efeitos metabólicos e/ou fisiológicos e/ou efeitos benéficos à saúde. CUSTO/REEMBOLSO PARA O PARTICIPANTE: Os participantes de pesquisa não arcarão com nenhum gasto decorrente da sua participação. Além disso, os participantes da pesquisa não receberão qualquer espécie de gratificação devido à participação na pesquisa.

100

CONFIDENCIALIDADE DA PESQUISA: Garantimos que somente serão divulgados dados diretamente relacionados aos objetivos da pesquisa; e a privacidade dos sujeitos, quanto aos dados pessoais, serão confidenciais.

Assinatura do Pesquisador Responsável: ___________________________________________________

TERMO DE CONSENTIMENTO DO VOLUNTÁRIO

Eu, _______________________________________ - NOME DO

ENTREVISTADO(A), ___________________ - RG/CPF, declaro que li as informações contidas nesse documento, fui devidamente informado(a) pelo pesquisador(a) Erilane de Castro Lima Machado dos procedimentos que serão utilizados, riscos e desconfortos, benefícios, custo/reembolso dos participantes, confidencialidade da pesquisa, concordando ainda em participar da pesquisa. Foi-me garantido que posso retirar o consentimento a qualquer momento, sem que isso leve a qualquer penalidade. Declaro ainda que recebi uma cópia desse Termo de Consentimento.

Vitória de Santo Antão, ________de ___________________ de 2014.

NOME E ASSINATURA DO SUJEITO

(Nome por extenso) (Assinatura)

TESTEMUNHAS

(Nome por extenso) (RG ou CPF)

(Nome por extenso) (RG ou CPF)

101

ANEXO VI

DIRETRIZES PARA AUTORES

Periódico: Centro de Pesquisa e Processamento de Alimentos

As colaborações devem ser enviadas pelo Sistema Eletrônico de Revistas da UFPR, digitadas em Word for windows, usando fonte Arial, tamanho 12, espaçamento simples e organizadas da seguinte forma:

• título breve e descritivo do conteúdo do artigo;

• nome do autor (titulação, instituição a que pertence e endereço eletrônico em nota de rodapé);

• resumo em português (250 palavras ou 5% do texto - NBR-6028/03);

• palavras-chave (de 3 a 6 – recomenda-se consulta aos tesauros da área);

• introdução;

• material e métodos;

• resultados e discussão;

• conclusão;

• título em inglês, abstract (resumo em inglês) e palavras-chave em inglês;

• referências (em sua maioria publicada após 2000).

Tabelas e ilustrações

As tabelas e ilustrações devem ser numeradas distinta e consecutivamente, inseridas o mais próximo possível do local em que são mencionadas no texto e apresentar títulos explicativos. Enviar figuras e gráficos em aquivos separados com extensão *.jpeg.

Para assegurar nitidez, os desenhos, mapas e fotografias devem ser apresentados no original em preto-e-branco.

102

Conjugação verbal

Recomenda-se a expressão impessoal evitando o uso da primeira pessoa do singular ou plural. Os dados referentes aos resultados de experiências e observações devem ser expressos no passado. Generalidades, verdades imutáveis, fatos e situações estáveis exigem formas verbais indicativas de seu valor constante (presente).

Referências

As referências efetivamente citadas no artigo pelo sistema autor/data devem constituir lista única (em ordem alfabética) no final do trabalho e serem apresentadas de acordo com a NBR - 6023/02 (reeditada em agosto de 2002) da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT).

Modelos

Livros

Ex.: WHITE, C.; ZAINASHEFF, J. Yeast: the practical guide to beer fermentation. Boulder, Colorado: Brewers Publications, 2010. 304 p.

Capítulos de livro

Ex.: WHITE, C.; ZAINASHEFF, J. Biology, enzymes and esters. In: WHITE, C.; ZAINASHEFF, J. Yeast: the practical guide to beer fermentation. Boulder, Colorado: Brewers Publications, 2010. p.17-40

Publicações periódicas

Ex.: MARTINS, M.; PACHECO, A.M.; LUCAS, A.C.; ANDRELLO, A.C.; APPOLONI, C.R.; XAVIER, J.J.M. Brazil nuts: determination of natural elements and aflatoxin. Acta Amazonica, v.42, n.1, p. 157-164, mar. 2003.

Dissertações e teses

Ex.: SANTANA, A.A. Influência de características físicas de plastificantes na confecção e no comportamento estrutural e higroscópico de filmes de alginato de cálcio. 2010. 155 f. Dissertação

(Mestrado em Engenharia Química) – Faculdade de Engenharia Química, Universidade Estadual de

Campinas, Campinas, 2010.

Legislação

Ex.: BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa n. 12 de 4 de setembro de 2003. Regulamento técnico para fixação dos padrões de identidade e qualidade gerais para suco tropical. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, 9 de setembro de 2003. Seção 1, p. 2.

Anais de Congressos, Simpósios, Seminários e Conferências

Ex: PIMENTEL, T.C.; GARCIA, S.; GARCIA, S.; PRUDÊNCIO, S.H. Efeito do grau de polimerização de frutanos tipo inulina sobre os atributos de qualidade de iogurtes probióticos. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS, 10., 2010, Curitiba. Anais... Curitiba: SBCTA, 2010. p. 1-10.

103

Documentos eletrônicos

Ex.: TUNGLAND, C. Inulin: a comprehensivescientificreview. 2000. Disponível em: <http://members.shaw.ca./ duncancrow/inulin_review.html>. Acesso em: 07/02/2011.

Periódico: Pesquisa Agropecuária Tropical

Pesquisa Agropecuária Tropical (PAT) é o periódico científico trimestral editado pela

Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos da Universidade Federal de Goiás, em

versão eletrônica (e-ISSN 1983-4063). Destina-se à publicação de Artigos Científicos cuja

temática tenha aplicação direta na agricultura tropical. Logo, a vinculação indireta do objeto

de estudo com essa temática não é razão suficiente para que uma submissão seja aprovada

para seguir no processo editorial deste periódico. Notas Técnicas, Comunicações Científicas

e Artigos de Revisão somente são publicados a convite do Conselho Editorial.

A submissão de trabalhos é gratuita e deve ser feita exclusivamente via sistema eletrônico,

acessível por meio do endereço www.agro.ufg.br/pat ou www.revistas.ufg.br/index.php/pat.

Os autores devem cadastrar-se no sistema e manifestar, por meio de documento (ver

sugestão de modelo) assinado por todos, escaneado e inserido no sistema como documento

suplementar, anuência acerca da submissão e do conhecimento da política editorial e

diretrizes para publicação na revista PAT (caso os autores morem em cidades diferentes, mais

de um documento suplementar pode ser inserido no sistema, pelo autor correspondente).

A revista PAT recomenda a submissão de artigos com, no máximo, 5 (cinco) autores. A partir

deste número, uma descrição detalhada da contribuição de cada autor deve ser encaminhada

ao Conselho Editorial (lembre-se de que, às vezes, a seção “Agradecimentos” é mais

apropriada que a autoria).

Durante a submissão on-line, o autor correspondente deve atestar, ainda, em nome de todos

os autores, a originalidade e ineditismo do trabalho (trabalhos já disponibilizados em anais de

congresso ou repositórios institucionais não são considerados inéditos, por tratarem-se de

uma forma de publicação e ampla divulgação dos resultados), a sua não submissão a outro

periódico, a conformidade com as características de formatação requeridas para os arquivos

de dados, bem como a concordância com os termos da Declaração de Direito Autoral, que se

http://www.agro.ufg.br/uploads/68/original_Modelo_Declara%C3%A7%C3%A3o_Autores.doc?1361367131

http://www.agro.ufg.br/uploads/68/original_Modelo_Declara%C3%A7%C3%A3o_Autores.doc?1361367131

104

aplicará em caso de publicação do trabalho. Por fim, deve-se incluir os chamados metadados

(informações sobre os autores e sobre o trabalho, tais como título, resumo, palavras-chave –

em Português e Inglês) e transferir os arquivos com o manuscrito e documento suplementar

(anuência dos autores).

Se o trabalho envolveu diretamente animais ou seres humanos como sujeitos da pesquisa,

deve-se comprovar a sua aprovação prévia por um comitê de ética em

pesquisa. Experimentos conduzidos em condições de campo devem apresentar dados

oriundos de, pelo menos, dois ciclos de produção, ou dois anos de avaliação.

Os trabalhos devem ser escritos em Português ou Inglês. A possibilidade de submissão e

publicação de trabalhos em outros idiomas deve ser submetida à análise do Conselho

Editorial.

Os manuscritos devem ser apresentados em até 18 páginas, com linhas numeradas. O texto

deve ser editado em Word for Windows (tamanho máximo de 2MB, versão .doc) e digitado

em página tamanho A-4 (210 mm x 297 mm), com margens de 2,5 cm, em coluna única e

espaçamento duplo entre as linhas. A fonte tipográfica deve ser Times New Roman, corpo 12.

O uso de destaques como negrito e sublinhado deve ser evitado. Todas as páginas devem

ser numeradas. Os manuscritos submetidos à revista PAT devem, ainda, obedecer às

seguintes especificações:

1. Os Artigos Científicos devem ser estruturados na ordem: título (máximo de 20

palavras); resumo (máximo de 250 palavras); palavras-chave (no mínimo, três palavras, e, no

máximo, cinco, separadas por ponto-e-vírgula); título em Inglês; abstract; key-

words; Introdução; Material e Métodos; Resultados e

Discussão; Conclusões;Agradecimentos (se necessário, em parágrafo único)

e Referências. Chamadas relativas ao título do trabalho e os nomes dos autores, com suas

afiliações e endereços (incluindoe-mail) em notas de rodapé, bem como agradecimentos,

somente devem ser inseridos na versão final corrigida do manuscrito, após sua aceitação

definitiva para publicação.

2. As citações devem ser feitas no sistema “autor-data”. Apenas a inicial do sobrenome do

autor deve ser maiúscula e a separação entre autor e ano é feita somente com um espaço em

branco. Ex.: (Gravena 1984, Zucchi 1985). O símbolo “&” deve ser usado no caso de dois

autores e, em casos de três ou mais, “et al.”. Ex.: (Gravena&Zucchi 1987, Zucchi et al. 1988).

Caso o(s) autor(es) seja(m) mencionado(s) diretamente na frase do texto, utiliza-se somente

105

o ano entre parênteses. Citações de citação (citações secundárias) devem ser evitadas, assim

como as seguintes fontes de informação: artigo em versão preliminar (no prelo ou preprint) ou

de publicação seriada sem sistema de arbitragem; resumo de trabalho ou painel apresentado

em evento científico; comunicação oral; informações pessoais; comunicação particular de

documentos não publicados, de correios eletrônicos, ou de sites particulares na Internet.

3. As referências devem ser organizadas em ordem alfabética, pelos sobrenomes dos autores,

de acordo com a norma NBR 6023:2002, da Associação Brasileira de Normas Técnicas

(ABNT). Os destaques para títulos devem ser apresentados em itálico e os títulos de

periódicos não devem ser abreviados.

4. As tabelas e figuras (dispostas no decorrer do texto) devem ser identificadas

numericamente, com algarismos arábicos, e receber chamadas no texto. As tabelas devem

ser editadas em preto e branco, com traços simples e de espessura 0,5 ponto (padrão Word

for Windows). Quando aplicável, os títulos de tabelas e figuras devem conter local e data. As

figuras devem ser apresentadas com resolução mínima de 300 dpi.

5. A consulta a trabalhos recentemente publicados na revista PAT (www.agro.ufg.br/pat ou

www.revistas.ufg.br/index.php/pat) é uma recomendação do corpo de editores, para dirimir

dúvidas sobre estas instruções e, consequentemente, agilizar a publicação.

6. Os autores não serão remunerados pela publicação de trabalhos na revista PAT, pois

devem abrir mão de seus direitos autorais em favor deste periódico. Os conteúdos publicados,

contudo, são de inteira e exclusiva responsabilidade de seus autores, ainda que reservado

aos editores o direito de proceder a ajustes textuais e de adequação às normas da publicação.

Por outro lado, os autores ficam autorizados a publicar seus artigos, simultaneamente, em

repositórios da instituição de sua origem, desde que citada a fonte da publicação original na

revista PAT.

7. Endereço e contatos:

Pesquisa Agropecuária Tropical (PAT)

Escola de Agronomia

Universidade Federal de Goiás

Caixa Postal 131 - Campus II (Samambaia)

CEP 74.001-970 - Goiânia, GO - Brasil

E-mail: [email protected]

106

Telefone: (62) 3521-1552

Homepage: http://www.agro.ufg.br/pat ou www.revistas.ufg.br/index.php/pat

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