Bioinformática: Genômica

e Transcriptômica

mcarazzo@lge.ibi.unicamp.br

Marcelo Falsarella Carazzolle

Laboratório de Genômica e Proteômica

Unicamp

Resumo

- Introdução à genômica

- Estratégias de sequenciamento

- DNA

- mRNA

- Tecnologias de sequenciamento

- Sanger sequencing

- Illumina

- Anotação e bancos de dados biológicos

Genômica

Transcriptômica

Diferenças entre as metodologias

- Sequenciamento de DNA, feito de forma aleatória, fornece :

- Informações sobre regiões codantes (genes) e promotores.

- Mas gera sequências em regiões inter-gênicas (a princípio

sem nenhuma função)

- Sequenciamento de mRNA fornece :

- Informação direta sobre os genes e também sobre a

expressão gênica.

- Mas genes pouco expressos são mais raros de serem

sequenciados por essa técnica

- A situação ideal para um projeto genoma é sequenciar ambos

DNA e mRNA

Estratégias de sequenciamento

- DNA

– Shotgun de genoma inteiro

– Shotgun em pedaços do genoma clonados em BACs

– Primer walking

- mRNA

– mRNA oriundos de diferentes tecidos ou condições

Quebrar em pedaços

aleatórios ~2000pb

(shotgun)

DNA genômico

clonar em vetor

sequenciamento

Shotgun do genoma inteiro

Reconstrução do DNA original a partir do fragmentos

(clusterização)

reads

Sequência consensu

(DNA original)

A reconstrução é feita a partir de sobreposição dos fragmentos

Contigs

Quebrar em pedaços

aleatoriamente desde

50Kpb até 300Kpb

DNA genômico

~800 bp ~800 bp Quebrar em pedaços de

2000pb

Clonar em BAC’s e

sequenciar apenas as

pontas de cada fragmento

clonar em vetor e

sequenciar os fragmentos

Shotgun de pedaços do genoma (BACs)

Primer Walking

Clone to sequence Vector

Primer Sequence

New Primer

Sequence

Repeat

Sempre desenhar o primer de forma que a sequência amplificada tenha

sobreposição com a anterior (tipicamente 100 pb de sobreposição)

Expressed sequence tags (ESTs)

clonar em vetor

sequenciamento

3’ EST 5’ EST

Extrair mRNA de diferentes

tecidos/condições

Síntese de cDNA

Controle Tratado

Extração de mRNA e

síntese de cDNA

sequenciamento sequenciamento

clusterização

Construção da biblioteca

e sequenciamento

Sequência consensu

Expressão gênica : controle

tratado = 2x

Tecnologias de sequenciamento

- Sanger sequencing

- PNAS 74 (1977), n. 12, 5463-5467

- Sequenciador MegaBACE (1Mpb/24 horas)

- Sequências em torno de 800 bp

- Illumina sequencing

- 70 Gbp/24 horas (a corrida dura 8 dias)

- Sequências de 150 bp

Sanger sequencing

denaturação

anelamento dos primers

Exemplo de gel utilizado nos seqüenciadores de gel (ex.: 377). A diferença de tamanho permite a separação dos grupos de fragmentos, e esta

“distribuição normal” da passagem dos fragmentos é representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada seqüência (read).

Filme sequenciamento

- A identificação dos picos é feita através de uma transformada de

fourier do sinal

- A nota está ligada com a resolução entre os picos vizinhos e a

altura do background

background

Região de qualidade alta

• Picos bem definidos e grandes.

• Linha de base boa.

• Distância entre picos anterior e posterior constante.

Analisando o cromatograma

Região de qualidade média – poucas ambigüidades

• Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho médio.

• Linha de base boa a razoável.

• Distância entre picos anterior e posterior razoável.

Região de qualidade baixa – baixa confiabilidade

• Picos mal definidos e de tamanho pequeno.

• Linha de base confusa.

• Distância entre picos anterior e posterior inconstante.

Onde q é a nota phred e P é a probabilidade encontrar uma base

errada :

- Nota phred = 20 => 1 base errada a cada 100 (99%)

- Nota phred = 30 => 1 base errada a cada 1000 (99.9%)

- Sequenciamento produz seqüências da ordem de 500 pb

Fevereiro 2001

Colins et al. Venter et al.

O genoma humano é praticamente o mesmo (99.9%) em todas as pessoas.

Apenas 2% do genoma contém genes

Humanos tem cerca de 25 mil genes; a função de muitos deles é desconhecida

Maioria das proteínas humanas tem similaridade com outros organismos

Pequenas diferenças genéticas entre indivíduos podem causar grandes diferenças nos efeitos de fármacos

Solexa sequencing

Filme sequenciamento

http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=1000-genomes-project

Projetos de ressequenciamento

3ª geração de sequenciadores

Sequenciador pessoal

Nanopore technology

$1000 mil dólares o aparelho + $900 do chip

1 chip = 25Gb

Medicina personalizada

Processamento de sequências brutas

A identificação da região de vetor é feita através da comparação, via

BLAST (bl2seq), da sequência fasta com a sequência do vetor. A sequência

do vetor utilizado na clonagem pode ser obtida no site do

fabricante/distribuidor :

http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=94

Outra possibilidade é utilizando o banco de sequências de vetores do NCBI

(BLASTn): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html

Para análises em larga escala o programa cross_match (linux) faz a

identificação da região do vetor através da comparação entre as

sequências fasta e o banco de vetores mascarando a região do vetor

na sequência fasta. Isto é, substitui os nucleotídeos identificados com

vetor pela letra X :

>Unknown sequence

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXAAATGGCATGTACCCCATCCGGGGAAGTACC

NNNATCGTTTTGGGCCAAAAATGGCATGTACCCCATCCGGGGAAGTACC

NNNATCGTTTTGGGCCAXXXXXXXXXXXXXXXXXX

X => Sequência do vetor de clonagem

Identificar regiões de

baixa qualidade

Identificar regiões de

vetores

Cortar regiões de baixa

qualidade e vetor

- Como as regiões de vetor e qualidade ruim estão

sobrepostas o problema pode ser complicado

Bioinformatics 17 (2001), n. 122001, 1093-1104

Bioinformatics 17 (2001), n. 122001, 1093-1104

- Possíveis combinações de regiões com qualidade ruim

e vetores

Processamento de sequências de ESTs

LNBI 4643 (2007), 57-68

ESTs

Montagem de sequências de DNA ou ESTs

- Utilizado para :

- montagem de genomas completos

- melhoria da qualidade de uma sequência de

interesse

- agrupar ESTs para análises de padrões de

expressões gênicas

reads

Sequência consensu

(DNA original)

A reconstrução é feita a partir de sobreposição dos fragmentos

Processo de montagem

Montagem de genomas

Controle Tratado

Extração de RNA

e síntese de cDNA

sequenciamento sequenciamento

montagem

Construção da biblioteca

e sequenciamento

Sequência consensu

Expressão gênica : controle

tratado = 2x

Montagem de ESTs

- Uma forma rápida de agregar alguma informação sobre uma

sequência desconhecida é compará-la com um banco de dados de

sequências com funções conhecidas

- Esta comparação é feita através de alinhamentos par a par entre

as sequências. Isto é, se o banco de dados possuir 1000 sequências

conhecidas serão realizados 1000 alinhamentos

?

Alinhamento de sequências

- Tipicamente são usados os bancos de dados mundiais (NCBI,

EMBL)

Fonte: http://www3.ebi.ac.uk/Services/DBStats/

- Atualmente uma busca nesses bancos faz 100,000,000 de

alinhamentos

- Existem vários programas de alinhamentos com diferentes metodologias,

sendo que o mais utilizado é o BLAST

Outras aplicações de alinhamento de sequências

- Montagem de genomas e transcriptomas

- Comparação entre genomas

- ...

Alinhamentos de DNA

- A comparação entre sequências de DNA de organismos

diferentes é baseada no conceito de que estes organismos

originaram-se de um ancestral comum.

- No contexto de evolução as sequências de DNA sofrem

mutações. Estas modificações locais entre os nucleotídeos podem

ser :

- Inserções : inserção de uma base ou várias bases na

sequência

- Deleções : deleção de uma base ou mais bases na sequência

- Substituições : substituição de uma base por outra

- Portanto um programa de alinhamento de sequências biológicas

tem que considerar essas mutações

Exemplo :

Match = 1 Mismatch = -1

Gap = -2

- Gaps representam as inserções e deleções entre as sequências

- O melhor alinhamento entre duas sequências é aquele que

maximiza o score :

- Score = #Matchs * (1) + #Mismatch * (-1) + #Gaps * (-2)

= 24 – 4 – 10 = 10

Alinhando proteínas

- Alinhamento proteína-proteína

- Alinhamento nucleotídeo-proteína

- Alinhamento proteína-nucleotídeo

- Alinhamento nucleotídeo-nucleotídeo (feito em proteínas)

Matrizes de substituição

- BLOSUM (BLOcks of amino acid SUbstitution Matrix )

- I e V => Hidrofóbicos

- D e W => D (carga negativa) e W (aromático)

- C => pontes de sulfeto (estrutural)

- A matriz foi construída a partir de alinhamentos múltiplos globais

de 504 grupos de proteínas

- BLOSUM 62 : grupos com similaridade >62%

- BLOSUM 80 : grupos com similaridade >80%

- BLOSUM 45 : grupos com similaridade >45%

Query Length Substitution Matrix

<35 PAM-30

35-50 PAM-70

50-85 BLOSUM-80

>85 BLOSUM-62 PNAS 89 (1992), 10915-19919

BLAST

• Basic Local Alignment Search Tool

• Algoritmo BLAST (Alstchul et al.; 1990 – J. Biol., 215, 403-410)

• Implementações: NCBI BLAST e WU-BLAST

• Acesso via web / local (linux)

• Consulta de seqüências em BDs biológicos (nt ou proteínas)

• Alinhamento – sobreposição de trechos semelhante de duas seqüências (seqs). BLAST traz pontuação e mostra alinhamentos.

• Similaridade – grau de semelhança de seqs num alinhamento.

• Homologia – genes com ancestral comum

• BDs – nucleotídeos, proteínas, domínios,

genomas específicos, dados particulares

• Blastp – prot / prot (distantes)

• Blastn – nt / nt (próximos)

• Blastx – nt trad / prot (novas seqs)

• Tblastn – prot / nt trad (regiões não anotadas)

• Tblastx – nt trad / nt trad

Query BD Compara Programa

nt nt nt blastn

nt (trad) aa aa blastx

aa aa aa blastp

aa nt (trad) aa tblastn

nt (trad) nt (trad) aa tblastx

Query = formato da seq de entrada.

BD = formato das seqs do BD.

nt (trad) = seq em nt traduzida pelo programa.

Compara = o que é comparado, nucleotídeos (nt) ou aminoácidos (aa).

Programa = um dos cinco principais tipos de blast.

BLAST interface

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/

BLASTp

Limita a região da sequência

que será usada na consulta

Pode ser usado um arquivo com várias

sequências gravadas no formato fasta

Pode ser colocado várias sequências ao mesmo tempo ou

vários GI’s (genbank identifier)

Banco de dados de proteínas do NCBI

Filtro por organismo, use o banco de

taxonomia do NCBI para ver a forma

correta de escrever o organismo

Filtros mais elaborados usando as opções

avançadas de busca do NCBI :

protease NOT hiv1[organism] => retornará

apenas resultados com proteases que não sejam

do organismo HIV 1

Banco de dados de proteínas curadas

pelo EBI

Banco de dados de proteínas com a

estrutura tridimensional conhecida

Número máximo de sequências alinhadas

E-value de corte

Número de bases que serão

utilizados para formar as k-tuplas

Altera as penalidades de criação e

extensão de gaps no alinhamento

Mascara regiões de repetição

Link

Corte 1e-5

1

subject

query

71

1 64

134

BL2SEQS

- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi

- Faz um alinhamento de uma sequência contra a outra (blastn/blastx/blastp/tblastx/tblastn)

Repositório de banco de dados NCBI

Artigos

científicos

Banco de

sequências

de AA e NT

Buscas por palavra chave

Buscas por similaridade de sequências

FIM