UNIJUI UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO RSDBQ DEPARTAMENTO DE BIO LOGIA E QUMICACURSO - QUMICA INDUSTRIAL DE ALIMENTOS INDICEAPRESENTAO.................................................................. ......................................................... 1INTRODUO A TECNOLOGIA D E FERMENTAES........................................................... 2MICROORGA NISMOS DE USO INDUSTRIAL ....................................................... ................ 9ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTO, MEIOS DE CULTURA E AR............... ...................... 18CRESCIMENTO CELULAR ................................... ........................................................................ 27CLASS IFICAO DOS PROCESSOS.............................................................. .............................. 37EMPREGO DE CULTIVOS INICIADORES STARTERS....... .................................................... 40SISTEMAS DE FERMENTAO...... ................................................................................ ............ 48INTRODUO AO ESTUDO DA FERMENTAO ALCOLICA.............................. ............. 54SEPARAO DOS PRODUTOS DE FERMENTAO................................... ........................... 66SEPARAO DOS PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAO COM LEVEDUR AS....... 73PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAO COM BACTRIAS............................ .............. 77DIGESTO ANAERBICA (FERMENTAO METANOGNICA)........................... .............. 79TECNOLOGIA DE PRODUO E UTILIZAO DE ENZIMAS......................... ..................... 89 Prof. Raul Vicenzi 1APRESENTAOA Biotecnologia um ramo muito amplo da Tecnologia q ue se ocupa datransformao ou tratamento de materiais de origem biolgica. Spinks (19 80) defineBiotecnologia comoa utilizao de organismos vivos ou sistemas biolgicos pa ra aproduo industrial e seu uso em servios de saneamento.A tendncia atual de incluir no termo Biotecnologia, em seu aspecto maisessencial, a Microbiologia Industria l, que trata do aproveitamento dos microrganismoscomo agentes de degradao e sntese. Por semelhana dos conceitos fundamentaisque regem o tratamento biolgico de efluen tes, o cultivo de clulas animais e vegetaise a produo de certos medicamentos. Assim , tambm devido ao seu amplosignificado, pode englobar tambm aspecto igualmente imp ortante da Cincia,Tecnologia e Engenharia de Alimentos.De certa forma, os process os de fermentao representa uma elo que liga asantigas artes de elaborao de alimentos (queijo, vinho, ...), mediante o uso de umaflora microbiana natural com a moder na industria de fermentao de alimentos queutilizava cultivos puros e sofisticados equipamentos de controle do processo. Aproduo em larga escala de protenas de organi smos unicelulares, produo deantibiticos, produo de clulas animais e vegetais e a prod compostos qumicosa partir de matrias-primas renovveis em substituio aos combustveis f eis, soexemplos de outras reas onde os processos fermentativos podem ser utilizado s.O componente curricular Biotecnologia de Alimentos pretende tem comoobjetivo p rincipal estudar alguns elementos essenciais e bsicos dos processosfermentativos: introduo a microbiologia industrial, sistemas de fermentaes,desenho de fermentadore s, cintica de crescimento, metabolismo microbiano,esterilizao na indstria fementativ a, produo de enzimas, cultivosstarters.Objetiva, tambm, abordar de forma mais detal hada alguns tipos de fermentao:alcolica, lctica, actica, metanognica. Introduo biotecnologia de alimentosProf. Raul Vicenzi 2INTRODUO A TECNOLOGIA DE FERM ENTAESO termoFermentaoderiva do latimfervere(ferver), devido ao aparecimento das bol hasdevido a produo de dixido de carbono pela ao das leveduras sobre o extrato de frut as ou grosde malte;Significado bioqumico: relata a gerao de energia pelo catabolismo de compostos orgnicos;Produo de vinho: 10.000 a.C. - provavelmente o vinagre foi des coberto na mesma poca e asbebidas alcolicas destiladas surgiram a mais de 10.000 a .C. na China;Cerveja: 5000 - 6000 a.C. - egpcios deixavam a cevada germinar em pot es de barro, apsestrusavam e amassavam os gros lavando-os aps para obter a bebida, ainda, utilizavam asleveduras da cerveja produzir CO2para o crescimento de pes;Lei te e derivados lcteos: dados apontam que em 5000 a.C. se observou que o leite qua ndoretido no estmago de terneiros jovens coagulava-se (ao enzimtica);Produtos crneos: conforme Erichsen (1983), cerca de 1500 a.C. o homem j sabia que a carnefinamente triturada e misturada com sal e especiarias poderia ser preservada, esta carne era secae enrolada (rolos) mantendo suas principais qualidades, como umflavor ag radvelEste produto foi o precursor da lingia fermentada produzida atualmente.O nome salame provm da cidade de Salamis, destruda a mais de 2000anos, situada na costa

oeste da ilha Grega de Cypros.Exame microscpico do sedimento de cerveja escavado de urnas que datam de 3400 a 1440a.C. demonstram claramente que na maioria das v ezes continham leveduras, observando-se umapureza maior nos sedimentos mais rece ntes.A necessidade de preservar a carne da caa e de animais domsticos abatidos dur ante oinverno e consumidos no vero(summer sausage),fizeram com que o homem procur asse soluespara a preservao do produto.Assim, os produtos crneos fermentados tornaram -se de grande importncia no mercadoalimentar permitindo preservar a carne e atrib uir a ela sabor e aroma caractersticos da tecnologiausada.Antonie van Leeuwenhoek, um pioneiro no uso do microscpio, foi o primeiro a examinar em1680 gotas de cerv eja fermentada. Entretanto esta descoberta foi esquecida......1856-1857: Louis Pa steur, aps investigaes detalhadas sobre as leveduras da cerveja e dovinho, concluiu finalmente que leveduras vivas fermentavam o acar em etanol e CO2quando emanaerob iose.Pateur tambm observou muitas outras fermentaes: Ex.: observou provavelmente umP enicilliumque fermentavaD-tartarato de amnio em uma mistura racmica deDeL-tartarat o(tartarato de Na, K);Observou tambm como uns microrganismos cilndricos produziam ci do butrico somente emcondies anaerbias e investigou a produo de cido actico por fer 870 - Pasteur e outros pesquisadores observaram os efeitos antagonistas de um mi crorganismofrente a outros e previram suas aplicaes teraputicas; Introduo biotecnologia de alimentosProf. Raul Vicenzi 31881 - Robert Kock estudou e desenvolveu tcnicas de cultivo puro assim como outros mtodosbacteriolgicos clssicos utilizados at hoje;Dois elementos vitais deram inicio a era moderna da tecnologia de fermentaes industriais:Emprego de fungos e leveduras na modificao de alimentos e bebidas e os estudosmicrobiolgicos pioneiros de Pasteur e Kock.Desenvolvimento de fermentaes em superfcie ou semi-slidas surgiu com o desenvolvimentode alimentos orie ntais e durante as grandes navegaes;Capacidade hidroltica de determinados fungos em hidrolisar o amido e protenas na produode molho de soja, este foi o inicio das ferm entaes industriais.Cultivo de algas e fungos deu inicio ao processo industrial de o bteno de protenas alimentciasmicrobianas (SCP - protenas de organismos unicelulares) e de inculos de microrganismosProduo de vinagre e os estudos de Pasteur sobre a prod uo de cidos prepararam o caminhopara o desenvolvimento de fermentaes que produzissem idos orgnicos;O desenvolvimento da metodologia de cultivos puros por Kock proporci onou o surgimento detcnicas que permitiram estudar as aplicaes industriais de espcie s microbianas individuais,iniciando-se o emprego de cultivos puros, meios esteri lizados e condies asspticas nasfermentaes industriais.FERMENTAO DE ALIMENTOSFermenta po, queijo e cerveja bem como bebidas alcolicas desenvolveram-se parasatisfazer as exigncias comerciais modernas de produo em grande escala, com qualidade elevadae c onstante, custos competitivos e variedade de produtos.Produo de cultivos Starters par a produtos lcteos e o emprego de enzimas industriaismelhoraram a eficincia dos pro cessos, assim como a automao e controle da qualidade naproduo de po e produtos lcteos ermentao de po em temperaturas mais elevadas e com maior quantidade de inoculo;Uso d e amilases microbianas na produo de acares fermentescveis a partir de gros deamido, p oporcionando acares as leveduras para que fermentem liberando CO2(crescer amassa d e po e produzir textura caracterstica).Tcnicas de Pasteurizao: permitiram a produo d erveja em escala industrial fazendo com queindustrias artesanais de cerveja, vin hos, licores passassem rapidamente a grandes complexosproduzindo em grande escal a.Tcnicas de controle de processo como:(Para garantir maior vida-de-prateleira ao s alimentos)Controle da velocidade de inoculao;Viabilidade e condies de armazenamento das leveduras;Controle das condies de oxignio dissolvido;Controle da concentrao de N ognio solvel e de acares fermentescveis no lcool;Controle da temperatura do processo mentao em processos contnuos; Introduo biotecnologia de alimentosProf. Raul Vicenz 4 Introduo de inovaes tecnolgicas como:Obteno de cerveja com elevadas concentrae o;Emprego de cereais no malteados e enzimas microbianasProduo de cervejas com baixos nveis de carboidratosAplicao de tcnicas genticas convencionais para melhorar a qualid de das leveduras eeliminar caractersticas indesejveis.LEVEDURAS DE PANIFICAOSculo XVI os padeiros obtinham suas leveduras nas cervejarias locais;Devido ao seu sabor a margo e atividades de fermentao variveis, foram gradualmente sendosubstitudas por le veduras procedentes de fbricas de bebidas alcolicas.1781 obtm-se as primeiras levedu ras de panificao prensadas, obtidas atravs do processoHolands e posteriormente em 184 mediante o processo denominado VienaAmbos obtinham rendimentos baixos, 5 a 14% res pectivamente referente a matria-prima e30% de lcool.1879-1919 - avanos substanciais

nos processos fermentativos com uso de biomassapermitindo a obteno industrial de l eveduras para panificao de forma independente debebidas alcolicas;1879 - Marquardt i ntroduziu a aerao no processo fermentativo de cereais permitindoaumentar o rendime nto e diminuindo a produo de lcool a 20%.INOVAES TECNOLGICAS:Adio gradual de acar rimeiro processo de retro-alimentaoPermite elevar a eficincia do processo ateprximo do mximo terico sem a formaoconjunta de lcool.Durante a Primeira Guerra Mundial a Ale manha desenvolve a produo de leveduras depanificao usando melao (todo resduo dos proc ssos industriais da poca) como substrato, com afinalidade de produzir protena para o consumo humano - Primeiro processo moderno para produode SCP.Durante a Segunda Guerra Mundial, tambm na Alemanha, inicia-se a produo de SCP paraconsumo humano e a nimal a partir deCandida utilis,utilizando melao procedente da produo depapel e pol pa de celulose, obtendo-se os acares (substrato) a partir da hidrlise cida da madeir a.USA, Sua, Taiwan e Rssia passam tambm a utilizar este processo.CIDOS ORGNICOS1881 cia-se a produo comercial de cidos orgnicos sendo que at hoje50%do cidolctico utiliz a nvel industrial produzido via fermentao usandoLactobacil1us delbrueckii. Introduo biotecnologia de alimentosProf. Raul Vicenzi 5cido Ctrico extrado inicia nte a partir do suco de limo e posteriormente sintetizado apartir do glicerol.1923 - inicia-se a produo de Citrato via fermentao industrial, atualmente estima-se umad emanda aproximada de 450.000 toneladas/ms produzidas exclusivamente por fermentao,i nicialmente:Empregava-se cultivo em superfcie deAspergilius niger como organismo p rodutor (citrato).Aps a 2 Guerra Mundial introduziu-se o processo de cultivo submer so. Entretanto em 1977desenvolve-se o processo que utilizaCandida,muito mais efi ciente.Outros cidos orgnicos so produzidos de forma econmica e rentvel por fermentao .: produo de Acido Glucnico e Acido Actico, este obtido pela oxidao do etanolutilizan oAcetobacter aceti.Entretanto, o cido Actico em escala industrial produzido soment epor via qumica.LCOOL E CETONASDurante Primeira Guerra Mundial a Alemanha impedida de importar azeites vegetais utilizadosna produo de glicerol, componente para prod uo de explosivos, desenvolve a primeiro processofermentativo de produo de glicerol, produzido por leveduras a partir do etanol em presena debissulfito de sdio;Durante a Primeira Guerra na Inglaterra desenvolvido o processo de fermentao acetona-butan ol por via anaerbia, utilizandoClostridium acetobutylicum,este foi o primeiro pro cesso emgrande escala que necessitava mtodos de cultivos puros para prevenir a co ntaminao.Aps a Guerra a demanda deste produto diminuiu, entretanto aumentou a procur a por n-butanol,produzido por fermentao at os anos50,sendo substitudo pelo n-butanol produzido a partir dopetrleo, cujo preo era mais baixo que o preo do amido e dos s ubstratos a base de acar utilizadosno processo fermentativo.1941 - Inicia-se a impl ementao da indstria da fermentao alcolica nos USA, aps revogar-se a proibio da pro ol por bioprocessos, sendo responsvel ento por 77% do lcoolindustrial produzido1973 - A crise do petrleo faz surgir projetos para produo de combustveis alternativos.Surg e o PROLCCOL no Brasil, projeto que em 1987 chegou a produzir 3 bilhes de gales dee tanol/ano, a partir da cana-de-acar.Nos USA inicia-se o Gasohol Program que destinava -se a produzir lcool a partir do milho,adicionando cerca de 10% na gasolina. Este projeto fez surgir um nmero muito grande de plantasindustriais de pequena e gran de escala utilizando processos contnuos e descontnuos.AMINOCIDOSGlutamato Monosdico e a Lisina so os que se produzem em maiores quantidades, cerca de500.000 e 80.000 toneladas/ms, respectivamente.A produo de aminocidos resultado do trabalho de pesqu isa sobre os mecanismosbioqumicos que regulam a biosntese destes compostos por mic rorganismos, obtendo-sesuperprodues a partir de mutaes e do controle do processo de fermentao. Introduo biotecnologia de alimentosProf. Raul Vicenzi 6As novas tcnicas passam a:E stimular as clulas para que usem substratos alternativos;Preveno ou impedimento de r eaes laterais;Induo e ativao de enzimas biosintticas;Reduo ou inibio de ativid que poderiam degradar o produto e, finalmentefacilitar a excreo do aminocido pelo m icrorganismo.As pesquisas que culminaram com o desenvolvimento do processo de fer mentao paraproduo de cido glutmico foram as responsveis pelo grande avano na produ nocidospor fermentao.Hoje a maioria dos aminocidos comerciais so produzidos por ferme tao. Assim como ade monofosfatos de inosina e a guanosina utilizados como potencia lizadores de sabor.BIOPOLIMEROSGoma Xantana- biopolmero mais importante atualmente em funo do volume de produo,utilizada como gelificante ou estabilizante de suspenses . Produzido por fermentao utilizando abactriaXanthomonas campestris.Outras gomas:Alg

inato produzido peloAzetobacter vinelandii;Pululano produzido peloAureobasidium p ullulans;Escleroglucana produzido pelo Sclerotinum;Gelano produzido pelaPseudomona s elodeaGomas em geral possuem elevados pesos moleculares e altas viscosidades c ausandoproblemas nos processos de mistura, transferncia de massa e calor em ferme ntadores. Estesaspectos devem ser levados em conta na hora de escolher ou desenh ar um aparelho de fermentao.POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB): polister termoplstico acumula do intracelularmente emalguns tipos de bactrias (Bacillus subtilis, Pseudomonas o leovorans, Alcaligenes eutrophus, entreoutras)at um nvel de 80% da massa seca celu lar, sua produo permite a fabricao de plsticosbiodegradveis.VITAMINASA maioria das vi aminas produzida por mtodos qumicos. Entretanto algumas vitaminaspodem ser produzi das por fermentao. Ex.: vitaminas do grupo B como a tiamina, biotina, cidoflico, cido pantotnico, piridoxamina, vitamina B12e riboflavina.A sntese qumica da vitamina B12 muito complexa sendo que sua produo comercial s vivel por via fermentativa utilizando Pseudomonas.Riboflavina: sua produo por fermentao compete eficazmente com os mtodos d sntese esemi-sntese, sendo que 30% da demanda mundial produzida por fermentao. Introduo biotecnologia de alimentosProf. Raul Vicenzi 7Recentemente uma cepa reco mbinante deBacillus subtilisfoi patenteada, sendo capaz deproduzir 4,5g de ribof lavina em 24 horas de fermentao, perodo muito inferior aos5diasnecessrios quando se utilizaAscomycetes.ANTIBITICOSPasteur identificou efeitos antagonistas de alguns microrganismos frente a outros e julgouque poderiam ter efeito teraputico.1928 - A lexander Fleming observou quePenicillium notatum,contaminante dos cultivos deSta phylococcus aureos,matava as bactrias, identificando o ingrediente ativo, a Penic ilina, podiainibir outras bactrias.Aps a penicilina ter sido isolada na sua forma a tiva, em 1940 nos USA, Florey e Chaindemonstraram sua destacada atividade antiba cteriana desenvolvendo-se ento um processofermentativo comercial para sua produo. E ste fato marcou o incio da indstria de antibiticos.Seguiu-se ento a descoberta deEstr ptomicina a partir de espcies de StreptomycesCefalosporinas a partir deCephalospor ium acremoniumCom o desenvolvimento a partir de 1940 de tcnicas de gentica microbi ana que implicaramem tcnicas de mutao e seleo de microrganismos, permitiu aumentar mu ito o rendimento daproduo de penicilina de poucas mg/L para at 20g/L de cultivo.Ini ciam-se tambm, nesta poca, os estudos sobre a produo de metablitos secundrios,pequena molculas como os antibiticos que no tm papel importante no crescimento emanuteno das clulas.TRANSFORMAES DE ESTERIDESO uso de microrganismo, o domnio das tcnicas microbio icas e fermentativas permitiufazer transformaes enzimticas altamente seletivas e es pecificas, representando um grande avanona produo de frmacos, como os hormnios esteri es.1940 - descobriu-se que a cortisona, esteride secretado pela glndula adrenal, al iviava a dor depacientes com artrite reumtica, o que fez desenvolver-se um proces so de sntese qumica parasua produo que requeria 37 etapas, a um custo de 200 U$/g;195 2 - cientistas descobrem que uma cepa deRhizopus arrhizushidroxilava a progester ona,produzindo 11-hidroxiprogesterona, permitindo que o custo da sntese de cortiso na casse para11 etapas e o custo reduzisse para U$ 16/g.1980 - Introduziram-se mod ificaes no processo e os custos foram diminuindo gradativamentede forma que hoje e stes custos esto prximos de U$ 0,46/g.Tcnicas semelhantes de biotransformao microbian a permitiram a sntese de outrosesterides como a aldosterona, prednisona e predniso lona, assim como de outros frmacosimportantes na medicina. Introduo biotecnologia de alimentosProf. Raul Vicenzi 8ETAPAS DO PROCESSO FERMEN TATIVO1) Formulao do meio de cultura a ser usado no processo;2) Esterilizao do meio de cultura, fermentadores e equipamentos auxiliares;3) Produo de uma cultura pura e ativa em suficiente quantidade para inocular no fermentador;4) Crescimento dos organismos no fermentador sob condies timas para a formao doproduto5) Extrao do pro o e sua purificao;6) Disposio dos efluentes produzidos no processo.REAS DE APLICAO D ERMENTACO INDUSTRIALA) ALIMENTOSvMassas fermentadas (po, panetone);vCarnes ferment adas (salame, lingia);vBebidas fermentadas (cerveja, vinho ...);vBebidas destilada s (conhaque, aguardente ...);vLeite fermentado (iogurte, queijo ...);vEnzimas (p roteases, amilases, glicose oxidase ...);vCondimentos (vinagre, glutamato...)vAm inocidos (lisina, cido glutmico);vPolissacardeos (dextrano)B) PRODUTOS AGROINDUSTRIA ISvlcool (industrial e carburante);vAntibiticos de uso veterinrio;vBiogs;vHormnios de crescimento vegetal.C) MEDICAMENTOSvAntibiticos;vVacinas;vVitaminas;vHormnios de consumo humano (insulina);vAminocidos.D) CIDOS ORGNICOS E SOLVENTESvcido ctrico;vcido actico;vEtanol;vPropanol;vButanol;vcido lctico.

Microbiologia industrialProf. Raul Vicenzi 9INTER-RELAES ENTRE MICRORGANISMOS E ENZIMASAs relaes existentes entre microrganismos e as enzimas neles contidos so mui toimportantes quando se deseja explorar as enzimas que levam a determinadas reaes qumicasespecificas.As enzimas podem ser isoladas e assim a biotecnologia enzimtica pode convenientementeser manipulada em bio-reatores apropriados.Por outro lado as clulas microbianas quando encontram-se imobilizadas em um suporteslido, atuam c omo catalizadores que levam a reaes qumicas concretas, da mesma maneira que asenzim as isoladas, o que denota menos trabalho preparativo.Desta maneira uma grande pa rte da tecnologia de fermentaes se refere ao cultivo demicrorganismos em grande es cala.A seleo e aplicao dos princpios da engenharia gentica aplicada a microrganismosa ropriados permitem manipular o contedo enzimtico destes em determinadas condies. Tam bmo crescimento de microrganismos em um substrato apropriado provocar a induo da enz imanecessria para a degradao desse substrato de crescimento dentro da clula.Ex.: o c ultivo de levedura sobre maltose induzir a biossntese da enzima maltase, (uma -glu cosidase) que degrada maltose a glicose, que necessria para a produo de energia qumi ca emforma de ATP dentro da levedura.MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIALIntroduo Os p rodutos comercialmente importantes das fermentaes industriais so de 4categorias: clu las microbianas, molculas grandes como enzimas e polissacardeos, produtos bsicose m etablitos secundrios que no so necessrios para o crescimento celular. A produo comer ldos produtos de fermentao tem utilizado principalmente diversas espcies de bactrias , leveduras efungos, ainda que os avanos recentes no desenvolvimento de tcnicas de cultivos tm permitidoutilizar clulas mais complexas nos processos de fermentao.Micr organismos Industriais Na natureza existem duas classes principais de clulas, amba sutilizadas nos processo de fermentao industrial:procariontes- clulas bacterianas;e ucariontes-leveduras, fungos, clulas animais e vegetais.Os microrganismos tambm se diferenciam em funo de suas exigncias de oxignio,podendo dividir-se em estritamente aerbias, como osStreptomycese a maioria dos fungosfilamentosos, que podem desenv olver-se unicamente em presena de O2 e os estritamenteanaerbios, como osClostridio s, que unicamente podem crescer na ausncia de O2 e osmicroorganismos facultativos , entre eles as leveduras industriais, que podem crescer em situao deaerobiose e a naerobiose.As bactrias utilizadas nos processos fermentativos so principalmente qu imiorganotrficos,isto , podem obter sua energia e seu carbono por oxidao dos compost os orgnicos. As bactriaspodem dividir-se em Gram positiva e Gram negativa, em funo d e suas resposta a colorao deGram. A reproduo se d por diviso assexuada. Os esporos s roduzidos usualmente em resposta Microbiologia industrialProf. Raul Vicenzi 10as condies adversas do meio, porque so mais resistentes ao calor e aos compostos txicos que asclulas vegetativas e pos teriormente germinam em condies apropriadas. As bactrias sodesprovidas de clorofila, mas podem possuir outros pigmentos fotossintticosOs fungos (bolores) tambm so quim iorganotrficos e os mais importantes utilizados nasfermentaes se classificam princi palmente em dois grupos: os Zigomycotina, asseptados dosgnerosMucor eRhizophuse o s Deuteromycotina, septados dos gnerosThicotherma, Aspergillus,Penicillium Fusari umeAureobasidium. Os fungos so desprovidos de clorofila ou outros pigmentosfotoss intticos. Sua reproduo pode ser assexuada (esporulao) ou sexuada.As leveduras so fung s geralmente unicelulares e que se reproduzem de forma assexuada(por gemao ou divi so binria) ou sexuada. A levedura mais utilizada nos processos fementativosindustr iais aSaccharomyces cerevisiae, principalmente para produo de lcool e nas panificaes Esta levedura no degrada a lactose, por isso para produzir lcool e biomassa a part ir de soro de leite utilizadaKluyveromyces lactis, que possuem as enzimas necessri as para degradar lactose. Outrasleveduras importantes so:Candida utiliseEndomycop sis fibuliger Os vrus no tm estrutura celular alguma, possui o material gentico (DN A ou RNA) contidopor uma camada de protena. No possuem atividade metablica e, porta nto, no sintetizamprotoplasma nem crescem. Em conseqncia disto sua multiplicao no pod ser feita por umprocesso de diviso, como nos microrganismos celulares. Novos vrus so produzidos pelas clulasnas quais penetram, de acordo com as informaes contidas no seu cido nuclico. So agentessubmicroscpicos que infecta as plantas, animais e bactria s. Os vrus bacterianos (bacterifagos)infectam os processos de fermentao de cepas mic robianas e causa srios problemas,particularmente nos cultivos starter utilizados no processamento de alimentos.Clulas animais e clulas vegetais tambm podem ser utiliz adas nos processos fermentativosindustriais, principalmente para a produo de antib

iticos e hormnios vegetais. Necessitam de ummeio muito nutritivo e so sensveis a flu tuaes de fatores externos como temperatura, pH, O2e CO2 dissolvidos.FONTES NUTRICI ONAIS PARA OS MICRORGANISMOSBasicamente as necessidades nutricionais dos microor ganismos so as mesmas de todos osseres vivos, que para renovarem seu protoplasma e exercerem suas atividades, exigem fontes deenergia e fonte de material plstico. Nos seres superiores encontra-se apenas dois tipos nutritivos:a) os vegetais so fotossintticos (obtm energia da luz solar) e autotrficos, se nutremexclusivamente d e substncias inorgnicas;b) os animais so quimiotrficos, pois obtm energia as custas d e reaes qumicas e heterotrficos,por exigirem fontes orgnicas de carbono.Entre os micr organismos h uma grande variedade de tipos intermedirios.FONTES DE ENERGIAa) Algum as bactrias realizam fotossntese, porm no produzem oxignio. Podem utilizar fontesinor gnicas (liotrficas) ou compostos orgnicos (organotrficas) como doadores de eltrons.b) Os fungos, leveduras e a grande maioria das bactrias so quimiossintticas, obtendo energia as Microbiologia industrialProf. Raul Vicenzi 11custas de reaes qumicas, nas quais s ubstratos adequados so oxidados com desprendimento deenergia. Estes substratos po dem ser inorgnicos (litotrficos) ou orgnicos (organotrficos). Noprimeiro grupo encon tramos apenas bactrias, como por exemplo,Thiobacillus, capazes deoxidar enxofre, produzindo cido sulfrico, podem ser utilizados na lixiviao de metais, comocobre e urn io. A grande maioria das bactrias e a totalidade de fungos, leveduras e, tambm, os protozorios so quimiorganotrficos.FONTES DE MATERIAL PLSTICOMATRIASPRIMAS COMO FONTE E CARBONOPara os autotrficos a nica fonte de carbono necessria o CO2. Para os heter otrficos, hnecessidade de suprir o meio com outras fontes de carbono, naturais ou sintticas:Celulose, Amido, Sacarose, Lactose, Glicose (alto custo), leos, Metanol, Etanol;Melao de cana-de-acar Composio varivel (rico em aminocidos, vitaminas, min ios acares); corrigir deficincias (N, P, S);Extrato de Malte cevada malteada; 90-95% de CHO; rico em aminocidos.MATRIASPRIMAS COMO FONTE DE NITROGNIOQuanto s necessidades de nitrognio h trs categorias principais de microrganismos:Alguns microrganismos, especialmente bactrias, retiram o nitrognio diretamente da atmosfera e oconverte e m nitrognio orgnico. Muitos fungos e quase totalidade das bactrias utilizam compost osinorgnicos de nitrognio, como amnio e nitratos. Algumas bactrias exigem fontes orgn icas denitrognio. De um modo geral, adicionar aminocidos ou hidrolisados de protena s favorece ocrescimento da maioria dos heterotrficos.oSais de Amnio, Sais (nitrato s); UriaoLquido da macerao do milho ( 4% N);oExtrato de levedura e Peptonas (laboratr o)oAr atmosfricoONS INORGNICOS ESSENCIAISAlm de nitrognio, os microrganismos exigem u ma srie de outros elementos, sob a forma decompostos inorgnicos, alguns em quantid ade bem maiores que outros.oMacronutrientes P, S, K, Mg, Ca, FeoMicronutrientes Cu, Zn, Co, B, ...FATORES DE CRESCIMENTOSo os compostos orgnicos indispensveis a um determinado microorganismo, que ele noconsegue sintetizar. Tais fatores devem es tar presentes no meio para que o microrganismo possacrescer, como por exemplo vi taminas (especialmente do complexo B), aminocidos, nucleotdios,cidos graxos, entre outros.Aspecto importante dessa exigncia resulta do fato que, quando um microrgan ismo exige umdeterminado fator, seu crescimento ser limitado pela quantidade dess e fator presente no meio. Microbiologia industrialProf. Raul Vicenzi 12Dentro de certos limites, o cresc imento ser proporcional ao teor do composto limitante. Issopermite a elaborao de um mtodo de dosagem de certos compostos, baseados na medida docrescimento microbian o. Essa a base da dosagem microbiana de uma srie de substncias,principalmente amin ocidos e vitaminas.AGUAA gua no constitui um nutriente, mas absolutamente indispensv el para o crescimento dosmicrorganismos. Seu papel mltiplo. Os microrganismos se nutrem pela passagem de substnciasem soluo atravs da membrana citoplasmtica. Exerce f uno na regulao da presso osmtica eregulao trmica. A maior parte dos microrganismos rapidamente pela dessecao, a no serquando esta precedida pelo congelamento brusco ( liofilizao)OXIGNIO ATMOSFRICOComo a gua o oxignio no um nutriente e funciona apena o receptor de hidrognionos processos de respirao aerbica. Os microrganismos se compo rtam diferentemente em presenade O2livre:Aerbios exigem oxignio livre; alguns, porm, em pequenas quantidades no tolerando aspresses normais de O2atmosfrico;Anaerbios no t leram a presena de O2livre;Facultativos crescem na presena ou ausncia de O2.Entre as bactrias encontra-se os trs tipos de comportamento. Os fungos (bolores) so estrita menteaerbios, enquanto as leveduras so aerbias ou facultativas.CLASSIFICAO DOS MOSTOS

SINTTICO:composio conhecida quantitativamente e qualitativamente usado em pesquisas quando se quer controlar exatamente o curso de uma fermentao. O objetivo saber a r ota defermentao, saber quanto e quando e quais os substratos que esto sendo utiliza dos pelosMicroorganismos. Tem um alto custo.COMPLEXO:composio no bem definida, esto enquadrados os meios naturais tais como:caldo de cana, melao, suco de uva, extrat o de leveduras, enquadram-se todos os mostos naturais.CARACTERISTICAS DO MOSTORe querimentos bsicos:1) Proporcionar o mximo rendimento de produto ou biomassa por g rama de substrato usado;2) Produzir a mxima concentrao de biomassa ou produto;3) Pe rmitir o mximo rendimento na formao do produto;4) Produzir o mnimo de subprodutos in desejveis;5) Ser de uma qualidade permanente e estar disponvel durante o ano todo6 ) No sofrer degradao durante a esterilizao7) No dever causar problemas em outras eta do processo fermentativo particularmente:aerao, agitao, extrao, purificao e tratam dos efluentes. Microbiologia industrialProf. Raul Vicenzi 13SUBSTRATOS UTILIZADOS NA FERMENTAO ALCOLICAa)Aucaradas:neste grupo temos asdiretamente fermentescveis(contm monossacarde os: Ex.:glicose, frutose, suco de uva, ma, pra, etc.).Principal substrato um monoss acardeo (glicose) e este metabolizado diretamente atpiruvato.As matrias-primasindir etamente fermentescveisso aquelas que contm dissacardeos,predominando a maltose e sa carose. Ex.: caldo de cana-de-acar e melao.A composio do melao de cana-de-acar vari funo de fatores como:qualidade da matria-prima (variedade, idade, sanidade, maturao, ueimada ou no, etc);mtodos de extrao do acar (moagem, clarificao, cozimento, etc); icas das regies aucareiras;condies e tempo de armazenamento.b) Amilceas: contm em su omposio polissacardeos (amido) utilizada para produo devodka, rum, whisky (tem que so frer sacarificao). PREPARO DA MATRIA-PRIMA a) Melao: deve sofrer uma preparao prvia 82 Brix 18 -20 Brix)CRUZ DE COBENGE: regra das misturas, utilizada para calcular os volumes para diluio domelao.B M - b=Quantidade de melao em peso d=volume litros)M b B - M = Quantidade de gua em peso d = volume (litros)B=Brix do melaob = Brix da g ua (zero)M=Brix desejado (18 20 )d = d ensidadeEx.: melao: 80 Brixgua; 0 BrixM = 20 B dmelao= 1,6284dgua =1,000080 20 0 = 20 Kg melao = 12,31 Litros1,6284200 80 20 = 60 kg de gua = 60 litros1,0000 Microbiologia industrialProf. Raul Vicenzi 14No tanque de diluio controla-se:pH: entre 4,5 5,5Nutrientes: Sulfato de amnio (1 g/L); fosfato (1 g/L) sulfato de Mg (0,1 g/L) {ativador enzimtico}b) Caldo de cana-de-acar: no necessita diluio pois a c na sofre adio de gua por asperso namoenda para extrao do acar, neste ponto o brix d icar entre 18-20D = Brix do caldo x Volume do caldo - volume do caldo = Voluma d e H2O a ser adicionadaBrix desejadoEx.: Brix do caldo = 20Volume = 50.000 LBrix desejado = 16 D = 20x50.000 50.000 = 12.500 L de H2O a ser adicionada para ter 16 B rix16Aps fazer a diluio corrige-se o pH para 4,5 - 5,5 usando cido sulfrico, ctrico o ainda suco delimo (caseiro) e colocam-se os nutrientes.DETERMINAO DE SLIDOS SOLVEIS TOTAIS POR REFRATOMETRIA1)Preparo do mosto:a) Determinao de slidos solveis por refra tometria- Para cada grau acima de 20 C subtrai-se 0,06 por grau;-Para cada grau a baixo de 20 C soma-se 0,06 por grau:Ex.: 20 Brix a 25 C 5 x 0,06 = 0,3 20 Brix 0,3 = 19,7 Brix20 Brix a 15 C 5 x 0,06 = 0,3 20 Brix + 0,3 = 20,3 BrixUm mosto inicialmente com 76 Brix preparar 300 ml de mosto com 16% de SST.100 g melao -------- 76 g SSTX g --------------------- 16 g SST X = 21,05 g/100mLPara 300 mL = 63,15 g de most o + 236,85 g de guaRELACO ENTRE DIFERENTES GRAUS DE MEDIDA.1 Brix corresponde a 0,5 4 Baum1 Baum corresponde a 1,8 Brix1 Brix corresponde a 0,85 BaboBRIX=% de slidos s existentes em uma soluo de sacarose quimicamente pura. FermentadoresProf. Raul Vicenzi 16Fermentao por batelada - caractersticas:vDifere ntes fases de crescimento;vDiferentes condies timas;vFermentao parece estar programad a de acordo com a disponibilidade de nutrientes;vpH e temperatura oscilam ao lon go do tempo, para que apaream de acordo com estas trocas assucessivas fases de cr escimentoPRINCIPAIS TIPOS DE FERMENTADORESOs fermentadores classificam-se em doi s grandes grupos:vFermentadores de cultivo disperso: neste sistema os microrgani smos esto imersos no meiode cultivo e seguem os movimentos dos nutrientes lquidos. O fermentador mais simples consiste emum tanque aberto no qual o microrganismo se dispersa no meio lquido.Estes fermentadores forma utilizados de gerao em gerao com muito xito na indstriacervejeira j que ao formar-se na fase anaerbica da fermentao, ma capa de espuma que contmCO2e leveduras, impedindo que o ar penetre no interior do tanque. Para controlar a temperaturadurante a fermentao se pode colocar tubos

refrigerantes. So muito utilizados no tratamentobiolgico de guas residuais em fluxo lento, onde a superfcie do lquido permite que se dissolva oO2do ar e libere o CO2 . Estes efeitos podem ser acelerados com a agitao do lquido que aumenta atransfernci a de gases e mantm a homogeneidade. Nos sistemas anaerbios os prprios gases daferme ntao podem proporcionar a agitao, atravs do desenho do fermentador (cnico/cerveja) ou or meio mecnico (bombas de recirculao).vFermentadores de cultivo imobilizado: nos s istemas imobilizados o microrganismo sedesenvolve sob forma de uma lmina ou capa disposta sobre uma superfcie que est em contato como meio nutritivo. Em laboratrios se utiliza o cultivo em superfcie (placas). Inicialmente aproduo de penicilina era f eira em garrafas que eram introduzidas em uma incubadora. Atualmentese utilizada o cultivo em superfcie na fermentao do cido ctrico (Aspergillus niger ), que seculti va em uma superfcie com um meio adequado contendo melao em bandejas de poucaprofun didade, colocadas em estantes temperatura constante e com circulao de ar freqente.T ambm e pode desenvolver pelculas microbianas sobre uma superfcie de meio slida adequ ada.Este meio pode ser de leito fixo, em pedras, plstico particulado, lminas de pls tico onduladas,atravs dos quais se faz passar o meio lquido sobre a capa de microb iana da superfcie.vNa prtica, porm, ocorre que nos sistemas de cultivo disperso tam bm aparece uma capa sobrea superfcie do recipiente, e no cultivo imobilizado exist e um certo numero de microrganismosdispersos no meio de cultivo. FermentadoresProf. Raul Vicenzi 17Qualquer processo fermentativo divide-se em uma etapa puramente fermentativa e outra derecuperao do(s) produto(s), conforme o esquema abaixo:EsterilizadorRefrigeraoCom ou sem ruptura celularFormulaoArmazena,men to deMatrias-primas InculoVolume: 1 a 2 litros Preparao deMeios Fermentadorde produoT nque deSemeadura(p-de-cuba)Separao declulas Etapas deRecuperao doProdutoEnvasamento e rmazenamento PRODUTOTratamento deEfluentes Utilizao deSubprodutos- gua- ar- vaporgu a doProcessoAr EstrilVapor EnergiaInculoPreparado1:10 Esterilizao na indstria fermentativaProf. Raul Vicenzi 18ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTO , MEIOS DE CULTURA E ARIntroduoA esterilizao implica a destruio, inativao ou remo forma de vidamicrobiana. Isso quer dizer que a esterilizao provoca nos microrgani smos uma perda irreversivelda capacidade de reproduo no ambiente considerado. No im plica, entretanto, a inativao totaldas enzimas celulares, toxinas, etc.Antes de en trarmos na discusso dos mtodos, conveniente fazermos algumasconsideraes em torno dos mecanismos de esterilizao e das caractersticas das populaesmicrobianas.O mecanismo l etal varia conforme o processo de esterilizao empregado. O efeito final,entretanto , o mesmo. Deve ocorrer a destruio e/ou inativao da(s) enzimaas) envolvida(s) emproc essos vitais para o microrganismo. Teoricamente, basta que o agente esterilizant e bloqueie umareao enzimtica essencial ou destrua uma molcula vital. Na prtica, entre tanto, agentes com aoto especifica no encontram aplicao como esterilizantes, por vri motivos: A heterogeneidadeda populao microbiana; a possibilidade da existncia de mi crorganismos com capacidade deutilizar outras rotas metablicas para vencer o bloque io estabelecido; a dificuldade do agente ematingir um alvo muito especfico; etc., podem ser mencionados como fatores que justificam autilizao de agentes capazes de atingir o microrganismo de um modo mais grosseiro e inespecfico.Principalmente n o caso da esterilizao de equipamentos industriais, procura-se utilizar processosca pazes de danificar generalizadamente a clula, em vez de se procurar um ponto espe cfico de suaestrutura metablica.Outra considerao importante, no caso da esterilizao d equipamentos, a cessao doefeito esterilizante no final do processo de esterilizao. Em outras palavras, o agente ou condioesterilizante deve atuar eficientemente dura nte o processo de esterilizao. Terminada aesterilizao, no deve haver ao residual. No so de fermentao industrial, por exemplo, umapossvel ao residual pode ser to ou mais p ejudicial que a presena de certos contaminantes.Essas consideraes ajudam a apontar os processos fsicos como os mtodos de escolha naesterilizao de equipamentos.MTODOS DE ESTERILIZAOFsicos QumicosCalor:- Seco: Flambagem ; ar quente- mido: vapor fluente, v apor sob presso;tindalizao.Radiao:- Ultravioleta- Ionizantes (RX e )Filtrao : Membr uidos, Gases e vaporesEsterilizantes gasosos:xido de etileno(maiseficiente que os demais; utilizado em cmarasde esterilizao)Formaldedo mais comum-propiolactona-carcin gncia cido peractico Esterilizao na indstria fermentativaProf. Raul Vicenzi 19A escolha do mtodo depend e das caractersticas dos produtos a serem esterilizado e do custodo processo.Quan do se usa agentes qumicos: tempo de contatoQuando se usa calor: tempo e a tempera

tura de contatoOBS.: O vapor direto acarreta um aumento no volume do mostoMECANI SMOS DE ESTERILIZACOSe bem que os mtodos usuais de esterilizao tenham uma ao generali ada sobre a clula,o mecanismo pelo qual isso conseguido varia conforme o agente e mpregado. No caso do calor,sabe-se, desde os tempos de Koch, que o mecanismo de destruio dos microrganismos pelo calorseco no o mesmo que ocorre quando se utiliza vapor.Exceto em casos em que haja uma destruio fsica do microrganismo, como o caso daflambagem do equipamento a ser esterilizado, o mecanismo de esterilizao no est bem elucidado.Em alguns casos, a ruptura da parede celular e a vacuolizao da clula so a parentes e poderiam serinterpretadas como oriundas da atuao de foras osmticas.A adso ro de corantes pelas clulas, a incapacidade de reproduo e, no caso demicrorganismos m eis e a perda da motilidade, so caractersticas que auxiliam na constatao daperda de viabilidade de clulas individuais.Enquanto que a inativao pelo calor seco , essencia lmente, um processo oxidativo, o uso devapor causa uma coagulao das protenas celula res com prejuzo para a organizao estrutural domicrorganismo, afetando a sua competnc ia fisiolgica.TABELA1 - Efeito da temperatura sobre o tempo necessrio para destrui r esporos bacterianos defermentao simples em meio com concentrao inicial de 1,6 x 10 5esporos/mLTEMPERATURA ( C) TEMPO (minutos)100 1200105 600110 190115 7120 19125 71 30 3135 1Tempo de esterilizao corresponde ao tempo em que o material foi submetido aquelatemperatura especfica e no ao tempo total do processo, que deve incluir o t empo de aquecimento eresfriamento.DESNATURAO DE PROTENASAlm das estruturas primria, s ecundria e terciria, as molculas de protena podem serconstitudas por mais de uma cade ia de polipeptdios. A conformao estrutural da molcula protica Esterilizao na indstria fermentativaProf. Raul Vicenzi 20 estabilizada por ligaes c valentes e no-covalentes. Essas ligaes reduzem a flexibilidade dascadeias polipeptdi cas, garantindo sua disposio de uma forma ordenada, compacta e,conseqentemente, de baixa entropia, em vez de uma associao ao acaso. Entre as ligaescovalentes, o tipo d e ocorrncia mais geral a ligao dissulfeto As ligaes no-covalentes podemser pontes d idrognio, ligaes hidrofbicas e inicas. As ligaes hidrofbicas so as que maiscontrib a a estabilizao da estrutura protica, pois de um modo geral, 40% dos resduos deaminoc idos de uma protena possuem ramificaes no-polares.Uma alterao estrutural da molcula protena , normalmente, acompanhada de umaperda de atividade biolgica, pois a ao de en zimas pode ser explicada por uma perturbaoconformacional especifica induzida pelo substrato no centro ativo da enzima.Considerando-se que as clulas de microrganism os podem conter, normalmente, de 40 a 60%de seu peso seco em protenas, e consider ando-se, ainda, as funes metablicas e/ou estruturaisdesempenhadas por essas protenas na clula microbiana, pode-se perceber, com facilidade, o efeitoque agentes ou co ndies capazes de desorganizar estruturalmente as protenas podero exercersobre a clula .ALTERAO DNASe, de um lado, agentes que atuam sobre as protenas so capazes de compro meterdiretamente a competncia fisiolgica, agentes capazes de causar alteraes no mate rial gentico domicrorganismo podem provocar o aparecimento de mutaes letais. Donde a possibilidade de seutilizarem, na esterilizao, substncias ou condies que apresentem maior afinidade pelo cidodesoxirribonuclico (DNA).- Agentes qumicos como propionol actona, cido nitroso, etc., agem sobre o material gentico dasclulas, causando alter aes que tero conseqncias sobre as caractersticas fisiolgicas domicrorganismo.- Radia zendo-se incidir uma radiao sobre microrganismos, os componentes celularespodero ab sorver energia radiante. O efeito letal das radiaes uma demonstrao da presena, nacl viva, de molculas capazes de absorvera energia radiante. Protenas e cidos nuclicos, constituintes essenciais da matria viva possuem estruturas que absorvem principal mente luzultravioleta. As alteraes fotoqumicas que ocorrem, em virtude da absoro de l uz ultravioleta, somuito prejudiciais s clulas.POPULAO MICROBIANAAo tratar de esteril izao, temos de levar em conta, tambm, as caractersticas dosmicrorganismos contaminan tes do equipamento a esterilizar. No caso de existirem no equipamentoapenas form as vegetativas de microrganismos, e se o meio em que se encontram for um meio qu eno as abrigue e proteja da ao do agente esterilizante, e mais ainda, se pudermos e star certos deque o agente esterilizante ser capaz de atuar sobre as clulas microb ianas em condies favorveis epor tempo suficiente, ento o problema de esterilizao ser lativamente simples. Esterilizao na indstria fermentativaProf. Raul Vicenzi 21FIGURA 1- Esterilizao de u m meio de cultura em autoclave a 121 C por 20 minutos. O tempototal de esterilizao 100 minutos.ESTERILIZAO POR AGENTES FSICOSCALOR SECOcalor seco mata os microrganismo

s por oxidao dos componentes celulares. O ar seco no umbom condutor de calor e sua ao no to enrgica quanto a do vapor. Por esse motivo necessrioumatemperatura e tem iores de esterilizao.o emprego do calor seco ou ar quente, recomendado quando o con tato direto ou completo dovapor sobre presso com o material indesejvel ou improvvel , que o caso de vidraria, leos, pse substncias similares.A esterilizao pelo calor se o consiste em submeter o equipamento a ser esterilizado a umatemperatura tal que , durante o perodo de aquecimento, haja inativao dos microrganismospresentes.A maio r resistncia demonstrada por microrganismos ao calor seco parece depender de umen durecimento da camada mais externa da clula por meio de coagulao das protemas, difi cultandoa penetrao do calor no interior da clula propriamente dita e ulterior coagu lao das protenasplasmticas. Devido muito menor capacidade de penetrao do calor seco ecessrio aquecer oequipamento a ser esterilizado a temperaturas mais altas por te mpo mais prolongado, o que tornaesse mtodo inadequado quando materiais como papel , algodo, plsticos, etc., esto presentes.Populaes homogneas de esporos apresentam uma relao linear de inativao com relaoao tempo de exposio a 125 C. A no-linearidade q com populaes naturais, pode seratribuda a uma heterogeneidade da populao. As relaes lineares obtidas com populaesnaturais podem ser reproduzidas por misturas adequada s de esporos com resistncias trmicasdiferentes, isolados daquelas mesmas populaes. A lis, essa heterogeneidade das populaes Esterilizao na indstria fermentativaProf. Raul Vicenzi 23A morte das clulas expost as ao calor exponencial. A base bioqumica desse fenmeno difcil de ser explicada em t ermos de acontecimentos especficos na clula. O calor mido age sobrevrios componentes celulares e, na clula, pode-se observar uma srie de efeitos.Inativao trmica dos espo rosOs esporos so dotados de uma camada interna de mucopeptdeo recoberta por uma ca paprotica rica em cistena. As seguintes teorias tentam explicar a termorresistncia dos esporos:impermeabilidade do esporo; enzimas em formas inativas estabilizadas ; desidratao do materialprotico, com estabilizao conseqente da maior interaproximao radicais hidrofbicos eimobilizao inica.A inativao dos esporos em presena de vapor de deve-se atividade da gua e nopropriamente ao calor latente do vapor. Esse fato mo stra que os altos coeficientes de temperatura,caractersticos da inativao trmica de e sporos. s podem ser devidos a processos de coagulao deprotenasESTERILIZAO DE EQUIPAME TOS POR RADIAES UV E IONIZANTES Os princpios bsicos da utilizao da radiao UV so a microrganismospresentes no ar e a destruio de clulas depositadas na superfcie do equ ipamento e expostas radiao. A radiao UV tem sido empregada como agente auxiliar para diminuir os nveis decontaminao.A ao de radiaes ionizantes (raios gama) sobre os micr anismos se manifesta como umuma inibio do poder de multiplicao dos mesmos.ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS POR AGENTES QUMICOSApresenta a vantagem de ser feita a temperatur a inferior a 50 C. Os fatores que influenciamna eficincia da esterilizao so: tempo de contato, temperatura, pH, matria orgnica, estabilidadeao oxignio umidade, etc. dete rgentes, lquidos (cidos e lcalis, glutaraldedo, formaldedo, iodfors,cido peractico) s e vapores (oznio, brometo de metila, formaldedo, -propionolactona, xidode etileno, cido peractico)ESTERILIZAO DO MEIO DE CULTURADe acordo com um conceito bem amplo, a esterilizao de um meio a operao que tem porfinalidade remover ou destruir todas as formas de vida, animal ou vegetal, macro ou microscpicas,saprfita ou no, existentes no meio considerado.O grau de esterilizao dos meios de fermentao varia conforme o p rocesso a que se destina.Algumas vezes totalmente dispensvel (fermentao lctica de ho rtalias e polvilho; tratamentobiolgicos de resduos); realizada de forma incipiente (fermentao alcolica; produo de leveduraspara panificao; fermentao actica do vinag izada com alto grau de exigncia (produo deantibiticos, enzimas, vitaminas, acetona, butanol). Em ensaios laboratoriais sempre necessrio(devido ao uso de culturas pur as)Em plantas industriais o calor mido a principal forma de se efetuar a esteriliz ao. Pode Esterilizao na indstria fermentativaProf. Raul Vicenzi 24ser feita nos prprios rec ipientes destinados a fermentao (processo descontnuo) ou em separado(processo contnu o)ESTERILIZAO EM BATELADA:Vrios meios de cultura so esterilizados no fermentador a 12 C (para destruir esporos), otempo calculado em funo dos constituintes do mosto(pH, material em suspenso, etc) e dotamanho do fermentador.Esterilizar s vlvulas e eletr odos e outros equipamentos que entram em contato direto com ofermentadorMtodo indi reto - injetar vapor no fermentador atravs de camisa ou da serpentina;Mtodo direto - injetar vapor direto na soluo nutriente, assim o vapor deve estar livre de aditi

vosqumicosOBS.:O vapor gerado pela indstria normalmente contm substncias potencialme nte txicas aosmicrorganismos, derivadas de anticorrosivos utilizados no processo de gerao de vapor. Cominjeo direta de vapor no meio de cultura o volume deste aument ar, pois uma parte do vapor secondensa aumentando o volume do lquido dentro do fer mentados.Vantagema) tem a vantagem de esterilizar o fermentador e o meio simulta neamente, evitando perigos decontaminaes;Desvantagema) Manuteno de temperaturas alta s por perodos longos, favorecendo possveis alteraes no meio;b) Consumo elevado de va por e gua de resfriamento;c) Problemas de corroso pelo contato do equipamento com o meio aquecido.d) Elevado tempo ocioso do equipamento;e) interaes qumicas com nutr ientesESTERILIZAO CONTINUAAs principais desvantagens apresentas podem ser evitadas p ela esterilizao contnua; melhorcontrole de temperatura; temperaturas mais elevadas diminui o tempo da operao; Fornece meioesterilizados para fermentadores de vrios ta manhosEtapa preliminar obrigatria nos processos fermentativos contnuos, tambm tem va lor nosprocessos em batelada, pois diminui o tempo de esterilizao e a rea fsica nece ssria para oprocesso, devido a relao exponencial entre taxa de morte e temperatura tomando bem menor otempo necessrio para a destruio de todos os microrganismos quand o temperaturas maiores soutilizadas;Na esterilizao em batelada so necessrios 30 a 60 inutos a 121 C, a esterilizao contnuanormalmente realizada em 30 a 120 segundos a 14 0 C;Meio de cultura torna-se diludo pois a condensao do vapor aumenta o volume do lqu do,para resolver este problema o meio aquecido bombeado atravs de uma vlvula de ex panso e ocondensado removido por uma bomba de vcuo at que o meio de cultura fique c om a mesmaconcentrao de antes da esterilizao. Esterilizao na indstria fermentativaProf. Raul Vicenzi 25Pode se feita pela injeo d reta de vapor ou por meio de trocadores de calor.Em certos casos a pasteurizao j p su ficiente para eliminar grande parte do flora microbiana. uma operao rpida utilizando temperaturas prximas de 100 C seguida de resfriamento. Emmeio cidos equivale a uma esterilizaoPara pequenas quantidade de meio pode-se lanar mo da tindalizao.FIGURA 2 squema de esterilizao contnua do meio de cultura em trocadores de calorDESTRUIO DE NU TRIENTESA esterilizao do meio pelo calor acarreta alteraes na sua composio qumica. A erincia mostra que, quanto mais elevada for a temperatura de esterilizao de um dado meio,menor ser a destruio de nutrientes e, conseqentemente, melhores sero os resulta dos dafermentao posterior. Esta menor destruio de nutrientes uma conseqncia de fato servadaexperimentalmente de ser a energia de ativao de destruio trmica dos microrgan smos maiordo que a de destruio trmica dos nutrientes. Essa afirmativa de importncia prtica, tanto naesterilizao de meios de fermentao como na esterilizao de alimentos.E RILIZAO DO ARAs fermentaes aerbias, com o microrganismo em suspenso, constituem os pr cessosfermentativos de maior importncia industrial atualmente. Em tais fermentaes a quantidade de arintroduzida no sistema grande e perfeitamente aceitvel, que haja grande preocupao quanto aesterilizao do ar a ser admitido nos fermentadores. Tais c uidados devem ser tomadosprincipalmente nas horas iniciais da fermentao.- A maior parte dos processos fermentativos conduzido com agitao vigorosa, e o ar fornecidoa o fermentador deve ser estril.- O nmero de partculas e microrganismos depende da lo calizao da indstria, do movimento doar e do tratamento prvio que o ar foi submetido.

Esterilizao na indstria fermentativaProf. Raul Vicenzi 26MTODOS PARA ESTERILIZAO DO ARCalor seco- normalmente antieconmica ou de difcil realizao;Radiaes Apenas as radia poderiam ter aplicao prtica, porm pouco usada devido aogrande tempo de exposio. Pode ser usada em pequenas instalaes (laboratrios, pesquisa). Atuamais como desinfetante .Filtrao sem dvida o processo mais importante por ser o de maior aplicao na industri iltros feitos de l de vidro, acetato de celulose, etcOs filtros pode ser de dois tipos principais:Filtros que apresentam poros - reteno mecnica dos microrganismos ( cartuchos de membranas desteres de celulose, nylon);Filtros de camadas de materia l fibroso (l-de-vidro, ) - Atua na combinao de vrios efeitosfsicos: inrcia, bloqueio, difuso, separao por gravidade e atrao eletrosttica. Metabolismo e cintica de crescimento microbianoProf. Raul Vicenzi 27CRESCIMENTO CELULARO crescimento dos microrganismos uma parte integral de quase todos os pr ocessos defermentao. Sabe-se que as bactrias se reproduzem por diviso binria, produzi ndo duas clulas demesmo tamanho, entretanto a reproduo de muitas leveduras se d por gemao;os mofos crescempor extenso das hifas e a morfologia de seu miclio pode variar em funo do meio ambiente.quando um fungo cresce na superfcie de um meio slido produ

z uma rede miceliana , cuja naturezareflete a natureza do meio. Nos cultivos sub mersos, as clulas fngicas podem crescer unidas apartculas de nutrientes suspensas n a forma de miclio filamentoso difuso ou como massa densa. Amorfologia e crescimen to influem na velocidade de crescimento e na formao de produtosQuando um microrgan ismo inoculado em um meio de volume e composio conhecidos, ocultivo passa por uma srie de fases, como se pode observar na figura 1. Depois da inoculao,existe uma fas e de latncia, em que o microrganismo se adapta as condies do meio. Aps um certoperodo de tempo em que a velocidade de crescimento das clulas aumenta gradualmente, as clulascrescem a uma velocidade constante mxima ; esta fase se denomina exponencial ou logartmica. medida que o crescimento continua, os nutrientes se vo esgotando e os produtos vo sendoexcretados pelo organismo, a velocidade de crescimento diminu i e finalmente o crescimento cessa,devido freqentemente ao esgotamento de um nutr iente ou pelo acumulo de algum produto txico;esta fase se denomina estacionria.FIG URA 3 Crescimento de um microorganismo em um cultivo desontnuo FATORES QUE INFLUEM NA VELOCIDADE DE CRESCIMENTOA velocidade de crescimento varia com o tipo de clul a microbiana e tambm em funo dascondies fsico-qumicas do meio ambiente. Em geral, o po para que se duplique a biomassaaumenta com a complexidade do microrganismo, d e forma que os tempos de duplicao mdio paraas clulas animais e vegetal so substancial mente maiores que os de mofos e leveduras, que por suavez so maiores que das bactr ias. Metabolismo e cintica de crescimento microbianoProf. Raul Vicenzi 28O crescimen to celular varia com a temperatura. A maioria dos microrganismos cresce entre25 e 35 C. Dentro deste espao o crescimento aumenta com o aumento da temperatura at um valormximo, acima do qual a velocidade cai rapidamente devido ao incremento da t axa de mortemicrobiana.O pH influi no crescimento da mesma forma que na atividad e enzimtica. A maioria dosmicrorganismos cresce em uma escala de pH variando de 3 a 4.A velocidade de crescimento da clula microbiana depende da atividade de gua ( Aw) e daumidade relativa. As bactrias necessitam uma Aw 0,95 enquanto os mofos pode m crescer emvalores de atividade de gua menores, de at 0,7 como mnimas.Como em qual quer reao qumica, a velocidade de crescimento depende da concentrao denutrientes qumi os, e pode ser descrita pela equao de Monod. Os valores tpicos de Ks para asdiversa s fontes de carbono esto compreendidos entre 1 e 10 mg/dm3. As clulas podem cresce r avelocidades prxima as maxquando a fonte de carbono limitante maior que 10 Ks ou 10 a 100mg/dm3. As concentraes de carboidratos elevadas podem inibir o cresciment o devido ao efeitoosmtico que tem uma influencia maior sobre as bactrias do que so bre os mofosFoi comprovado que a quantidade de massa celular total, formada dura nte o crescimentocelular, freqentemente proporcional a quantidade de substrato ut ilizado.Biomassa produzida (g)x/s = ------------------------------x/s=coeficiente de rendimento de biomassaSubstrato consumido (g)METABOLISMO MICROBIANO O crescim ento microbiano depende da capacidade da clula para utilizar os nutrientes demeio ambiente e sintetizar os compostos macromoleculares das estruturas celulares e tambm osprincipais compostos de baixo peso molecular, necessrio para a atividade c elular. O metabolismointermedirio inclui as reaes que transformam os compostos de c arbono e nitrognio que entramna clula em novo material celular ou em produtos que so excretados. A sntese desses compostosnecessita energia e a maioria das clulas ut ilizada nas fermentaes, so heterotrficas e obtm suaenergia a partir da quebra de comp ostos orgnicos. Nos processos respiratrios ou aerbios, osmicrorganismos so capazes d e oxidar completamente alguns dos substratos a CO2e H2O, obtendo omximo de energi a para a converso dos substratos remanescentes em nova massa celular. Nometabolis mo fermentativo ou anaerbio, as clulas so menos eficazes para converter os substrat osorgnicos em material celular e usualmente excretam intermedirios degradados parc ialmente.O crescimento de urna cultura microbiana pode ser dividido em fases ou estgios. Aps ainoculao de uma cultura em um meio nutriente existe um perodo durante o qual o crescimentoparece no ocorrer; este perodo refere-se fase lage pode ser cons iderado como uma fase deadaptao. Seguindo um perodo durante o qual a taxa de cresci mento das clulas aumentagradualmente, as clulas crescem a uma taxa constante, este perodo conhecido comofaseexponencial. Quando o crescimento diminui ou cessa e as clulas entramfase estacionria. Aps um Metabolismo e cintica de crescimento microbianoProf. Raul Vicenzi 29longo perodo de tempo o nmero de clulas viveis decresce e a cultura entra nafase de morteoudecln

io. Tanto quanto esta cintica de crescimento, o comportamento de uma cultura pode serdescrito de acordo com os produtos, os quais so gerados durante os estgios da curva decrescimento.Quando um microrganismo inoculado em um meio rico em nutrien tes, a velocidade dadiviso celular, e portanto a produo de biomassa, varia de acord o com uma seqnciacaracterstica. A fase lag pode virtualmente ser eliminada aumentan do o tamanho do inculo eotimizando as condies fsicas dentro do fermentador. Em um pr ocesso industrial a durao dafermentao contribui pra o custo do produto, logo uma fas e lag mnima aconselhvel.FIGURA 4.Curva de crescimento de biomassa e consumo de gli cose em um cultivo em batelada.Quando um microrganismo cresce em um ambiente no qual todos os seus nutrientesessenciais esto em excesso, esses nutrientes se tran sformam em produtos finais do metabolismoenergtico, em calor, ou em compostos req ueridos para a reproduo de novas clulas. Durante afase exponencial de crescimento a diviso celular ou velocidade de aumento da biomassa chega a sermxima e os produto s gerados so essencialmente para o crescimento das clulas e incluem:aminocidos, nuc leotdeos, protenas, cidos nuclicos, lipdios, carboidratos, etc. Estes produtos soconh cidos como os primeiros produtos do metabolismo ouMETABOLITOS PRIMRIOSe afase a q ual eles so produzidos (fase log ou exponencial) comotrofofase.Tambm se inclui nes tacategoria a biomassa celular que pode ser considerada como o metablito mais pri mrio.Muitos produtos do metabolismo primrio so considerados economicamente importan tes eso produzidos por fermentao.Durante a desacelerao e na fase estacionria, algumas culturas microbianas sintetizamcompostos os quais no so produzidos durante atrofof asee os quais parecem no ter nenhumafuno bvia no metabolismo celular. A estes compos tos nos referimos comoMETABLITOSSECUNDRIOSe a fase na qual eles so produzidos (equi valente fase estacionria) comoidiofase. importante salientar que os metablitos secu ndrios ocorrem em cultivos contnuos a Metabolismo e cintica de crescimento microbianoProf. Raul Vicenzi 30baixas taxa s de crescimento sendo uma propriedade destas, baixas taxas de crescimento, e ta mbm,da fase onde no tem crescimento celular.TABELA 3. Produtos do metabolismo primr io microbiano e sua significncia comercial.Metabolismo Primrio Significncia Comerci alEtanol Ingrediente ativo em bebidas alcolicas, usado como combustvel emmotores q uando misturado ao petrleocido Ctrico Vrios usos na indstria alimentarcido glutmico ensificador de FlavorLisina Suplemento alimentarNucleotdeos Intensificador de Fla vorFenilalanina Precursor do Aspartame - AdoantePolissacardeos Aplicao na indstria al imentarVitaminas Suplementa AlimentarFonte: Stanbury, Whitaker & HallinPrinciple s of Fermentation Technology. 1995.Os metablitos secundrios so compostos que no so ne cessrios para a biossntese celular,no tendo um papel direto no metabolismo energtico . A biossntese destes compostos estintimamente ligada com o metabolismo primrio das clulas que os produzem, j que normalmenteseus precursores so metablitos primrios ou modificados, como cidos orgnicos, aminocidos,derivados de acares e bases nitrogenadas . Um conceito apropriado para os metablitos secundriosso os compostos no essenciais p ra o crescimento exponencial(Wiseman, A.)Os metablitos secundrios mais importantes do ponto de vista comercial so os antibiticos,entre eles a Penicilina, cuja produo a nual chega a 10.000 ton/ano. As toxinas e os alcalidesrepresentam o resto dos met ablitos secundrios de importncia industrial.Quando se observa que microrganismos cr escem a taxas relativamente baixas de crescimentono seu meio ambiente natural, i sto sugere indicio de que aidiofaseque prevalece sobre atrofofase,aqual pode ser mais uma das propriedades da cultura de microrganismos.METABOLISMO ENERGTICOA en ergia necessria aos microrganismos pode ser fornecida pela luz (organismosfototrfi cos), ou pela oxidao de substncias qumicas (organismos quimiorganotrficos). Nos doisc asos a energia vai ser estocada pela forma de energia de ligao qumica, biologicamen te utilizvel.Trata-se essencialmente da ligao anidridofosfrica do trifosfato de aden osina (ATP), formada pelafosforilao do difosfato de adenosina (ADP).ORGANISMOS QUI MIORGANOTRFICOSA maioria das bactrias, leveduras e mofos so incapazes de efetuar a fotossntese, utilizam aenergia liberada no decorrer das reaes qumicas de oxidao. So madas quimiorganotrficas.As reaes de oxidao podem ser efetuadas de vrios modos: Metabolismo e cintica de crescimento microbianoProf. Raul Vicenzi 31- Perda de eltron:Fe++Fe++++ e-+ energia- Desidrogenao:R-CH2OH R-CHO + 2H++ 2e-+ energia- Hidr atao-desidrogenao:R-CHO + H2O R-COOH + 2H+2e-+ Energia- Descarboxilao-desidrogenao: COOH + H20 R-COOH + CO2+ 2H++ 2e-+ EnergiaEm todos os casos h perda de eltrons fre qentemente acoplada a uma perda de prtons.Estes eltrons e prtons, aps transferncia ma

s ou menos longa, feita por intermdio de uma cadeiade oxireduo, vo reduzir um acepto r final. Os microrganismos quimiorganotrficos tiram suaenergia da oxidao de substnci as orgnicas elaboradas, as quais devem obrigatoriamenteencontrar-se no meio, logo , trata-se de microrganismos heterotrficos. A grande maioria dosmicrorganismos qu e intervm na biotecnologia faz parte deste grupo.ACEPTOR FINAL DE ELTRONSO sistema de transporte de eltrons mais ou menos complexo e recorre as enzimas(desidrogena ses, citocromos redutases, etc.) e co-enzimas (FAD, NAD, NADP, citocromos, etc.) queso intermedirios aceptores de eltrons (e de prtons); trata-se de um seguimento d e reaesacopladas com oxireduo. No final desta cadeia, eltrons (e prtons) servem para eduzir umaceptor final que pode ser de diversas naturezas: Oxignio molecular, com posto mineral oxidado oucomposto intermedirio do metabolismo. Existe, tambm, um me canismo de eliminao de eltronse prtons prprio de numerosas bactrias anaerbias, sob a rma de hidrognio, devido ahidrogenase.Se o substrato for completamente oxidado, d iz-se que h respirao (fala-se s vezes, de viaoxidativa). Se o substrato for parcialm ente oxidado e, por isso, incompletamente degradado, o queacarreta a formao de met ablitos, diz-se que h fermentao. A fermentao traz geralmente onome da(s) substncia(s roduzida(s) ou da mais abundante se a produo for complexa.RESPIRAO AERBIAExistem vrio mecanismos de respirao aerbia. O fato comum entre eles que o aceptorfinal de prtons o oxignio do ar e no podem intervir seno quando os microrganismos socultivados em c ondies de aerobiose. Para cada par de prtons transformados em gua, h formaode 3 mol de ATP, podendo s vezes haver uma oxidao direta. Esta via leva a formao deperxido de hidrognio (H202) que txico para clula; exceto se esta possuir catalase, enzima capa zde decompor o H2O2. Quando um microrganismo possui esta via, e no tem catalase, morto pelooxignio do ar, sendo portanto, um anaerbio estrito. Metabolismo e cintica de crescimento microbianoProf. Raul Vicenzi 32FERMENTAO / RESPIRAONa fermentao propriamente dita, uma substncia orgnica originria da degrada strato serve como aceptor de eltrons (e de prtons). De fato, pode-se considerar qu e a mesmasubstncia que serve, ao mesmo tempo, de doador e aceptor. Numerosas ferm entaes podem serefetuadas em anaerobiose, pois todos os prtons liberados servem par a reduzir um substratoorgnico; outras devem ser efetuadas em aerobiose, pois pelo menos uma parte dos prtons liberadosservem para reduzir o oxignio. CINTICA DO CRES CIMENTO MICROBIANONa fase logartmica podemos dizer que dobram por intervalo de te mpo:O nmero de clulas (bactrias e leveduras):A biomassa (actomicetos e fungos).A velo idade de crescimento se mantm constante durante a fase logartmica, ainda que o mei ose altere pelo consumo de substrato e excreo de metablitos.A velocidade de crescime nto independe da concentrao do substrato, pois um excesso desubstrato est presente.O substrato limitante a substncia que pela mudana de sua concentraao promove: mudanas na velocidade de crescimento do microrganismomudanas na velocidade de consumo do s ubstratomudana na velocidade de formao do produto.Na pratica podemos dizer que todo o substrato limitante.O processo industrial interrompido ao final da fase logartm ica ou antes da fase dedeclnio, depende se o processo associado ou no associado.A taxa de aumento da biomassa est relacionada com a velocidade especfica de crescime nto() e a concentrao da biomassa (X) expressa em g/L.dx------- = X , ondedt = velocid ade mxima da biomassaX = concentrao de biomassaA taxa do aumento do nmero de clulas e t relacionada com a velocidade especfica decrescimento e com a densidade celuIar ( N) expressa em clulas/L.dN------- = N , onde N = densidade celulardtO tempo de gerao (G) uma constante da cepa da clula e depende das condies de cultivo. o espao de temp necessrio para que uma clula se duplique. Quando o microrganismo est na faseexpone ncial o tempo de gerao constante e dado por: Metabolismo e cintica de crescimento microbianoProf. Raul Vicenzi 33t tG = --= --------------------z 3,322 log Nf/NiMETABOLISMO MICROBIANOA sntese do produto se d no interior da clula, para que o substrato seja convertido emproduto, ele dev e entrar na clula e ser biotransformado por uma seqncia especfica de enzimas.Quanto mais complexo o produto, maior ser o nmero de enzimas envolvidas no metabolismo.Es quema simplificado do metabolismo celular.S[ X P ]P ENTRADA DO PROCESSO: transport e do substrato para dentro da clulaMETABOLISMO-TRANSFORMACO: o que diferencia o pr ocesso qumico do fermentativo.s vezes X =P.SAIDA DO PROCESSO: liberao do produto da enzima, podendo ficar intra ou extracelular.S = concentrao do substrato em g/LX =c oncentrao de clulas em g/LP =concentrao do produto em g/L ou mg/LVELOCIDADE DE FORMA E CLULASA velocidade de formao de clulas e dada pela variao da concentrao de clula

do tempo, na fase exponencial de crescimento (fase log), a velocidade constante e pode sercalculada pelo numero de clulas (N) por contagem direta dos microrganis mos ou por contagem emplacas e ainda pela massa seca de clulas (X). Ela chamada v elocidade especifica de crescimento,calculada por:ln Nf ln Ni ln Xf ln Xi ln DOf ln DOi = ------------------- ou -------------------- ou ---------------------tf ti tf - ti tf - tipara [ ] de clulas para Biomassa para densidade ticaFIGURA 5-Var iao da Concentrao Celular em Funo do TempoOBS.: Para microrganismos no filamentosos fervel utilizar nmero de clulas e paramicrorganismos filamentosos, a massa seca de clulas. Metabolismo e cintica de crescimento microbianoProf. Raul Vicenzi 34VELOCIDADE DE CONSUMO DE SUBSTRATOA medida que a clula est se reproduzindo os substratos esto sendo consumidos, avelocidade de consumo do substrato ser teoricamente constante, enquanto for constante ocrescimento celular, isto quase nunca acontece, uma vez que o substrato no s utilizado para ocrescimento celular, mas tambm para formao de etablitos, em alguns processos o substratopode ter uma velocidade de consumo quas e linear por um perodo de tempo, e a velocidade chamada de velocidade especfica de consumo do substrato e calculada por:ln Sf ln Si = ------------------- Sf = conce ntrao de substratotf tiFIGURA 6- Variao da Concentrao de Substrato em Funo do Tem IDADE DE FORMAO DO PRODUTOA velocidade de formao do produto tende a ser constante du rante um perodo de tempo. chamada de velocidade especifica de formao do produto e ca lculada por:ln Pf ln Pi = ------------------- Pf = Produto finaltf ti Metabolismo e cintica de crescimento microbianoProf. Raul Vicenzi 35FIGURA 7- V ariao da Concentrao de Produto em Funo do TempoVELOCIDADE ESPECFICA DE CRESCIMENTO trs parmetros:-Concentrao de substrato limitante (S)- Velocidade mxima de cresciment o (max)-Constante especifica do substrato (ks), equivale a concentrao em= 0,5max a c ncentrao de substrato que d a metade da velocidade mxima de crescimento. E dadapela equao de MONOD, que equivale a equao de Henri-Michaelis-Menten para cinticaenzimtica. =max--------------- Ks = corresponde a metade domaxKs + SFIGURA 8- Relao entre a Vel ocidade de crescimento e Concentrao de Substrato Metabolismo e cintica de crescimento microbianoProf. Raul Vicenzi 36Existindo vr ios substratos limitantes, podemos estender a equao de Monod para:K 1.S1K 2.S2K n. Sn =max.--------- + --------- + + .......+ -----------K 1+ S1K 2+ S2K n+ Sn -Se e xistir um excesso de todos os substrato, ento = maxe a cultura est na fase log, na suavelocidade mxima de crescimento.Se o primeiro substrato for exaurido e outro s ubstrato estiver presente, teremos uma segundafase lag e log com outro tempo de gerao que caracteriza a metabolizao deste segundo substrato,este fenmeno chamado de IAUXIA. Isto ocorre porque um dos substratos, geralmente aglicose, catabolizada p referencialmente e inibe a quebra de outros substratos. As enzimas que cataboliz amos outros substratos so induzidas (durante a segunda fase lag) aps a metabolizao c ompleta doprimeiro substrato.TABELA 4- Efeito do comprimento da cadeia de glicos e na velocidade mxima de crescimento deFusarium graminearuma 30 CACAR N de UNIDADE deG LICOSEmax(h-1) G (h)Glicose 1 0,28 2,48Maltose 2 0,22 3,15Maltotriose 3 0,18 3,85 FIGURA 9 Crescimento triuxico deFusarium graminearum Com isto chegamos a concluso q ue o mximo depende do:microrganismo;condies de cultivo;composio do meio de cultur atura de incubao;outros fatores (pH, oxignio, etc.) Metabolismo e cintica de crescimento microbianoProf. Raul Vicenzi 37CLASSIFICAO D OS PROCESSOSTIPO 1 - ASSOCIADONo processo associado o produto derivado diretamen te do metabolismo primrio, usadopara a produo de energia. O crescimento, o cataboli smo de carboidratos e a formao do produtoocorrem ao mesmo tempo. A TROFOFASE (fase de crescimento) e a IDIOFASE (fase de formaodo produto) no so separadas.Ex. produo d biomassa, etanol e cido glucnico. Sendo A, B, e C, produtosintermedirios do metabo lismo primrio, a formao do produto pode ser considerada:AB CPRODUTO FIGURA 10- Rela re Crescimento Celular e Formao de Produto em um ProcessoAssociadoTIPO 2- SEMI-ASS OCIADOO Produto derivado de um substrato usado no metabolismo primrio, mas segue uma rotacolateral. A tropofase e a idiofase so separadas. Em fermentao em batelada este tipo de cinticapossui dois pontos importantes:1) crescimento celular acompan hado de alto consumo de substrato e pouca ou nenhuma formaode produto;2) O crescim ento diminui e a formao do produto comea acompanhada de um alto consumo desubstrato .Ex.: produo de cido ctrico e de alguns aminocidos. A reao de formao do produto po xemplificada como:AB CMetabolismo Primrio DEProduto

Metabolismo e cintica de crescimento microbianoProf. Raul Vicenzi 39-Produo de cid o lctico: tipo 1 e 2-Produo de antibiticos aminonoglicosdicos: tipo 2 e 3Um processo pode se comportar de duas formas distintas, conforme os parmetros defermentao. Por exemplo, a produo de etanol um processo associado, mas pela modificao dascondies de rmentao, pode ser forado a se comportar como no-associado. Cultivos starters na industria de alimentosProf. Raul Vicenzi 40EMPREGO DE CUL TIVOS INICIADORES - STARTERSOs cultivosstartersso utilizados atualmente no proces samento de alimentos para induzirdiversas mudanas em suas propriedades, tais como a modificao da textura, a conservao, odesenvolvimento de aromas ou melhora nutricio nal, e na produo de enzimas.As principais aplicaes de cultivosstartersse encontram n as indstrias de panificao,crnea e leiteira, ainda que existam levedurasstartersdesti nadas a fermentao de bebidas alcolicase a produo de lcool industrial.Atualmente est impondo o emprego destarterspreparados com cepas de microrganismosmais adequados para elaborao de cada produto.As culturasstartersusadas nos produtos crneos curado s consistem, normalmente de umorganismo tipicamente acidificante comoLactobacill usouPediococcuspara estabilizar o produtobiologicamente e um organismo com carac tersticas nitrato redutoras que, por uma srie de reaesproduzir uma atrativa cor averm elhada associada com o tipo de produto, sendo que o organismonitrato redutor nor malmente MicrococcusouStaphylococcuscoagulase negativa.1.DEFINIAO:Startersso grupos de microrganismos selecionados com caractersticas bioqumicasdesejadas e definidas produzidos sob rigorosas e controladas condies (pH, temperatura, acidez,substrato , etc.) e so usados na elaborao de produtos fermentados.2. OBJETIVOS DO USO DE STAR TERS.Incorporar um nmero desejado de microrganismos no meio de modo que estes poss amcrescer, multiplicar-se e produzir as alteraes desejveis no meio e no produto fin al;Superar o desenvolvimento de qualquer agente contaminante, competindo com este s pelossubstratos e pela produo de substncias que inibam os contaminantes;Ajustar um a escala de produo, permitindo uma produo programada de produtos (seinocular, pode-s e ter certeza do que ser o produto final e o tempo que leva a produo);Obter uma maio r uniformidade em diferentes lotes de produo;PARA UMA CULTURA MICROBIANA SER UTILI ZADA COMOSTARTERDEVEPOSSUIR ALGUNS REQUISITOS FUNDAMENTAIS COMO:ser tolerante ao sal (salmoura de 6 a 10%);ser tolerante a presena de nitritos (50 a 100 ppm)ter cre scimento na faixa de 26 a 43 C e temperatura tima de crescimento entre 32 a 35 C;ser homofermentativo (produzir somente cido lctico);no ser proteoltico;no ser lipoltic oduzir sabores e aromas atpicos ao produto final; Cultivos starters na industria de alimentosProf. Raul Vicenzi 41no ser patognico;a presentar destruio trmica a 57-60 C. Os cultivosstartersno devem ser patognicos, toxi icos nem formar antibiticos, almdisso no devem degradar os aminocidos a aminas farma cologicamente ativas (ex. histamina)ou a cido sulfidrico. As bactrias lcticas devem formar muito pouco ou nenhum perxido dehidrognio, no formar gs e pouco ou nenhum cid o actico.3. PRODUO DE CULTURAS PARA FERMENTAAO EM ALIMENTOSSeleco:Selecionar cepas ou microorganismos que vo produzir a caracterstica ideal.O microorganismo deve ser ge neticamente estvel.Manuteno:Uma vez obtido o cultivo satisfatrio devemos mant-lo puro e ativo.Mantm-se a cultura ativa por transferncia ou repicagem em meio de cultura apropriado. O meio decultura de repicagem deve ser o mesmo da atuao, de preferncia ;No ponto mdio da fase exponencial de crescimento, guardar sob refrigerao para para lisaro crescimento. Neste ponto temos o maior nmero de clulas viveis e mais saudveis de umacultura, se a usarmos como inoculante de um processo.O nvel de sobrevivncia depende do ambiente: cuidar a temperatura, culturas mantidas aaltas temperatura s (ou mesmo ambiente) continuaro metabolizando e suas enzimas podem serdescaracte rizadas.Usar sempre a mesma porcentagem de inculo.Usar culturas que esto com o seu crescimento no ponto mdio da fase exponencial. Se oinculo for uma cultura mais re sistente, podemos usar a cultura at o final da fase estacionria.4.PUREZA DA CULTUR AEvitar a presena de contaminantes. Os mtodos de controle usados para checar a pur eza doinculo vo depender do tipo de microrganismo em questo:Exame microscpico um mto o utilizado para identificao de contaminantes desde que seconhea a morfologia do mi crorganismo que estamos trabalhando e que o contaminante tenha umamorfologia dif erenteA deteco de substncias produzidas pelos contaminantes e que no so produzidas pe losstarters. Ex.: culturas lcticas so todas catalase negativa, enquanto que a gran de maioria dos contaminantesso catalase positiva.Repicar uma amostra para o meio onde o contaminante cresce bem e de preferncia tenhacolnias caractersticas.Em caso

de a contaminao retornar para a cultura estoque, ou se houver a suspeita de queest a est contaminada, fazer a repurificao estriando a cultura em meio seletivo para a culturadesejada e proceder a purificao. Cultivos starters na industria de alimentosProf. Raul Vicenzi 425.CARACTERSTICA S DAS BACTRIAS CIDO LCTICASSo anaerbias facultativas: crescem melhor com baixa tenso e oxignio;So basicamente sacarolticas: outros componentes so pouco alteradosProduzem grande quantidade de cido lctico: so ineficientes quanto a produo de energiaDiviso q anto a fermentao da lactose: homo e heterofermentativas;Mecanismos biossintticos po bres: necessrio o suprimento de carboidratos, aminocidos,lipdios, minerais, etc, pa ra que se desenvolvam:No usam O2no seu metabolismo, por isto no decompem completame nte o alimento e seusmetablitos bsicos acumulam no meio.A nica forma de metabolismo energtico a fermentao:So gram-positivas.6. FERMENTAO PORSTARTERS alterao da mat formando alimentos com caractersticas sensoriais agradveis eproporcionando uma ma ior vida-de-prateleira.Os primeiros produtos fermentados foram descobertos empir icamente e serviam apenas paraconservar. Aps desenvolveu-se um certo gosto por pr odutos fermentados, hoje fabricados para obterpropriedades de conservao e atender a demanda do mercado.E considerada como um mtodo de preservao provocando modificaes d as caractersticasqumicas da matria-prima e pelo fato de que os agentes conservadore s se formam como produto damesma, por ao dos microrganismos so, no entanto alteraes d irigidas.As transformaes mais importantes de produtos alimentcios tem como principa l substratoos carboidratos.Quase todos os conservantes produzidos por ao microbian a so cidos (cido lctico) elcool.O efeito conservante dessas substncias geralmente c lementado pela aplicao deoutros mtodos: baixas temperaturas, calor, anaerobiose, sa l, acar, adio de um cido (vinagre).As bactrias lcticas so utilizadas em uma srie d tos como: queijos, leitesfermentados, vegetais e produtos crneos produzem substnci as inibidoras (cidos, lcool, H2O2eantibiticos (bacteriocinas)).7.TIPOS DE FERMENTAOOs microrganismos lcticos utilizados na indstria de alimentos uns so homo e outroshet erofermentativos, ou seja, alguns produzem apenas cido lctico (homofermentativos) comoproduto da transformao do substrato em questo e, outros produzem cido lctico e um a gama deoutros cidos que ficam incorporados ao produto.Lctica:picles, chucrute, a zeitonas verdes, queijo, leites fermentados, produtos crneos, etc..Alcolica:vinho, cerveja, sucos de frutas fermentadas, licores, destilados. etc...Actica: maiones e, vinagre, etc.Propinica:cido propinico. Cultivos starters na industria de alimentosProf. Raul Vicenzi 438. IMPORTNCIA D O DESENVOLVIMENTO DA ACIDEZa) Controle de contaminaes indesejveis, antagonismo (pat ognicos);b) Ajuda na eliminao de umidade. Ex. queijos.c) Formao do sabor;d) Formao d orpo e textura;e) Facilita a ao de outros aditivos. Ex. a renina atua melhor em pH cido;f) Ajuste do pH adequado para os diversos processos fermentativos;g) Conser vao dos produtos(aumenta a vida til ou vida-de-prateleira dos produtos.);h) Produo de bacteriocinas (protenas que so produzidas a partir de seu metabolismo)9. IMPORTAN CIA DO CIDO LACTICO NOS PRODUTOS FERMENTADOSa) Preservao do produto;b) Seleo da flora microbiana, evitando contaminaes;c) Contribui para o sabor, aroma eflavor dos pro dutos fermentados;d) Melhora a digestibilidade de alguns produtos: Ex.: a precip itao de protenas em partculasfinas facilita a digesto enzimtica;e) Melhora a utiliza Clcio, Fsforo e Ferro no organismo (so melhores absorvidos empH cido);f) Estimula a secreo do suco gstrico.10 FATORES IMPORTANTES NO DESENVOLVIMENTO DA FERMENTAOA prese na de antibiticos constitui um srio problema para obteno destarterslcticos. Apenicili a, muito utilizada para combater mamites, e a aureomicina em concentrados da die ta. Osresduos desses antibiticos no leite produzem inibio dos microrganismos lcticos ate 96 horasaps a aplicao ter sido feita no animal.Nveis de 0,05 a 0,10 U.I. de peni cilina/mL inibem o desenvolvimento da maioria dosStreptococcuse 0,5 U.I./mL inib e por completo a fermentao.OsLactobacillusso mais resistentes, embora algumas espcie s so inibidas por completocom 5U.I./mLde penicilina no leite.Presena de resduos de sanitizantes (iodforos e amonioquaternrios), os iodforos embaixas concentraes estimul a a presena de cidos enquanto que em nveis maiores (50 a 100 ppm)a reduzem. Geralme nte o cloro ativo em concentraes entre25e 200 ppm impedem a fermentaolctica. Amonioqu aternrios, nveis entre 25 e 75 ppm causam diminuio da velocidade ou detenoda fermenta 1. IMPORTNCIA DAS CULTURAS STARTERS PARA INDSTRIAAs formas de obteno e estocagem de culturasstarterstem proporcionado o aparecimentode culturas em melhores condies de uso do que as tradicionalmente usadas. O estoque das culturas mantido em plantas

de processamento via sub culturas em laboratrio Cultivos starters na industria de alimentosProf. Raul Vicenzi 44O uso de cultu ras congeladas ou liofilizadas tem tomado possvel inocular o volume decultura dir etamente no produto ou na preparao deste em uma cuba.Existem diversas vantagens pa ra o uso de culturasstartersconcentradas:A atividade da cultura pode ser cuidados amente controlada para monitorar a planta deprocessamento;A manuteno do estoque de cultura da planta de processamento pode ser eliminado;Menos trabalho requerido;O s istema de rotao de culturastarter fcil de estabelecer ajudando a manter o controles obre a bacteriofase;Os recentes desenvolvimentos da cincia e tecnologia destarter sesto gradualmenteencontrando novas aplicaes.As seguintes tendncias certamente figur aro nos futuros negcios da indstria de alimentos:Uso de bactrias cido lcticas especi zadas em trocar ou promover certos tipos defuncionalidade protica;Controlar a matu rao de produtos fermentados; Produo de novos produtos (diferentes composies, textura lavor); Novos produtos lcteos (produtos lcteos puros ou misturada com cereais);Uma n ova gerao de bebidas fermentadas (teraputicas e bebidas profilticas; novosflavors);Pr odutos com baixo teor de gordura;Suplementos dietticos para atletas, crianas e idos os; Produtos lcteos no alergnicos;.Destoxificao de certos produtos fermentados; Pro enriquecidos com antimicrobianos; Disponibilidade de um largo espectro de bactria sready-set starter.Existem inmeros fatores que ajudam a proteger os produtos crneo s fermentados darancificao pelo oxignio do ar e dentre eles destaca-se a catalase d os micrococcaceaea qualquebra os perxidos, incluindo o perxido de hidrognio produzi do porLactobacillus,alm disso, osmicrococcaceaetambm ajudam a aromatizar os produt os curados e o presunto cru, conformemostra a figura 13.Figura 13- Efeito da cat alase positiva (micrococcaceae)em produtos curados e produtos crus.Fonte: Lcke, 1 986.Reduo do NitratoDegradao dos PerxidosHidrlise das gordurasDesenvolvimento e estab lizaoda cor e do produto curado einibio da rancidezIntensificao do odor e flavor Cultivos starters na industria de alimentosProf. Raul Vicenzi 45A figura 14 mo stram de forma simplificada como os grupos de bactrias so importantes nacarne e no s produtos crneos e como elas podem ser distinguidas entre si.Os microrganismos m ais importantes na fabricao de linguia seca e presunto crupertencem aos gnerosLactob acillus. Staphyllococcus e MicrococcusA funo mais importante das bactrias catalase positivas (particularmenteMicrococcaceae)em produtos crneos curados manter a cor do produto e proteger as gorduras contra o ataque dooxignio do ar, pois a rancide z um problema maior nos produtos crneos crus do que nos cozidos.Isto e devido ao fato de que muitosLactobacillusproduzem perxidos durante a cura do produto enos p rodutos cozidos no existem enzimas lipolticas.No forma esporos FIGURA 14- Bactrias g ram-negativas importantes para a carne e produtos crneos. Fonte:Lcke,1986.Atividad e Lipolitica dosMicrococcusMicrococcaceaeso tambm usados comostartersdevido a sua atividade lipoltica que daruma contribuio essencial aoflavor do produto. Os micrococ custm uma grande atividadelipolitica sendo capazes de atacar cidos graxos de cadei a longa ou curta, triglicrides de 16 a 18tomos de carbono. Observou-se que o mximo de atividade lipoltica do micrococcus ocorreu a pH7,0 e a 32 C e esta atividade de cresce com o decrscimo do pH e temperatura. Por exemplo a pH 5,5e 11 C nenhuma ati vidade lipoltica extracelular foi observada sobre diversos triglicrides e gordurad e suno.Talon(1993),testouStaphylococcus warnieri854, 863 e 864,Sraphylococcus sap rophyticusM252e 852 eMicrococcus variansM204 com relao a sua atividade lipolitica e percebeu queamostra inoculada comMicrococcus variansteve uma atividade menor q ue as outras bactriastestadas, no entanto, segundo o mesmo autor, a diferena entre estas cepas no pode ser explicada CoccusBastonetesCatalasenegativaCatalaseposit ivaNo formaesporos Formaesporos ObrigatoriamenteanaerbiaAerotoleranteanaerobiaMicr ococcusStaphylococcus Catalasenegativa CatalasepositivaObrigatoriamente anaerbiaA erotoleranteanaerobia AerbioobrigatrioAerbio ouanerbiofacultativoBacillus Clostridiu mLactobacillusAnaerbiofacultativoAerbioBrochothrix Cultivos starters na industria de alimentosProf. Raul Vicenzi 46pelo seu cresc imento, emboramicroccocus varianstenha mostrado o maior crescimento, suaatividad e lipoltica foi inferior as demais bacterias, sendoStaphylococcus saprophyticcus8 52 a capaque apresentou a maior atividade lipoltica.Conforme relata Talon (1993), a produo de lipases por Micrococcus variansdepende doO2, pois nenhuma atividade l ipolitica pode ser detectada quando esta cepa foi cultivada sem agitaoe aerao.Debeve re (1976), j relatava que Micrococcus variansnecessita crescer sob agitao eaerao para

hidrolisar gordura de suno. Esta atividade pode ser evidenciada pelo decrscimo do scidos graxos insaturados ao final da incubao e pode ser devido ao metabolismo bact eriano ou aoxidao, pois as bactrias forem obtidas sob condies de agitao e aerao ap as.Outros autores tambm mostraram queMicrococcus varians foicapaz de produzir em adioa oxidao outros compostos carbonlicos a partir de cidos graxos saturados (Talon, 993).Oflavor tpico dos salames devido a produo de cidos durante a fermentao, ao sal adiferentes compostos derivados ao catabolismo dos aucares ou ainda a compostos p roduzidosdurante a maturao da carne estes compostos podem ser de origem no enzimtica , como durante aoxidao dos lipdios ou pode ser resultado de umaEsta catlise e devida a enzimas endgenas no caso dos produtos onde so usadosstarterscomo opresunto cura do mas depende tambm de enzimas exgenas no caso dos produtos.Efeito dos CultivosSt artersem Embutidos SecosAs bactrias lcticas inibem, pela formao de cido lctico, o des nvolvimento demicrorganismos indesejveis e melhoram a textura dos embutidos secos . Em troca. a microbiotacatalase positiva, melhora a cor, aroma e proteo do produt o frente ao efeito prejudicial dooxignio. Para tanto, depende do tipo de produto desejado a convenincia do emprego de cultivosstarterse quais deles devem ser empr egados.Formao de Cor e FlavorA formao de cor no produto curado resultado de uma srie de reaes desencadeadaspelas bactrias nitrato