BIOLOGIA MOLECULAR

Enzimas de restriccin

Para algunos de los estudios en biologa molecular se utilizan enzimas de restriccin. Las enzimas de restriccin son endonucleasas de ADN doble hlice que se obtienen de organismos procariontes. Su funcin normal en estos organismos es eliminar ADN forneo. Estas enzimas cortan de distintas formas segn el tipo de enzimas que sean. Algunas al cortar dejan extremos de adhesin y otras dejan extremos romos. Extremos romos: dejan la doble hlice armada.Extremos de adhesin: dejan un segmento pequeo de cadena simple.

ELECTROFORESIS

Consiste en un proceso basado en un campo elctrico que separa molculas en base a tamao y/o carga. Segn las cargas algunas sustancias migrarn para un NODO o un CTODO (Ej: cidos nucleicos, cuyos grupos fosfato tienen carga negativa, migran haca un nodo).Los geles utilizados para la transferencia son comnmente de poliacrilamida y agarosa. La tincin posterior se hace con bromuro de etidio, el cual va a ser fluorescente frente a cierto tipo de iluminacin.La identificacin se hace por medio de SONDAS: ADN o ARN que se une hibrida- por complementariedad. Las sondas estn marcadas generalmente con nucletidos radiactivos.

BLOTTING

TipoSouthernNorthernWestern

AnalizaADNARNProtenas

Preparacin muestraFragmentacin--

ElectroforesisTamaoTamaoTamao/carga

TratamientoDesnaturalizacinalcalina--

TransferenciaCapilaridadCapilaridadCampo elctrico

IdentificacinSondaSondaAnticuerpos

SECUENCIACIN DE ADN

Mtodo de terminacin de cadenaEn este mtodo de secuenciacin se utilizan didesoxirribonucletidos que no pueden unirse a otras bases por no poseer el OH en el extremo 3. Se usa una cantidad de hebra molde de ADN simple cadena, un primer, una polimerasa, gran cantidad de desoxirribonucleotidos y poca cantidad de didesoxirribonucletidos distribuidos en 4 tubos de ensayo, uno para el didesoxirribonucletido de ADENINA, otro para GUANINA, otro para CITOSINA y otro para TIMINA. Al hacer esto, se comienza a polimerizar en cada tubo de ensayo las hebras faltantes de cada muestra de ADN y se va deteniendo dependiendo de cundo se aade a la misma un didesoxirribonucletido. Esto quiere decir que en cada tubo voy a obtener distintos fragmentos de ADN polimerizados hasta un cierto punto, donde hay un stop dado por un didesoxirribonucletido de Adenina, Guanina, Citosina o Timina, dependiendo el tubo. Al hacerlos correr por electroforesis y separarse por tamao, quedan ordenados por tamao y por nucletidos, por lo que se puede determinar la secuencia de bases.

PCR (Polymerase chain reaction)

Este proceso hace una duplicacin y amplificacin de un segmento especfico de ADN. Se necesitan para el proceso: el ADN a amplificar, oligonucletidos (primers), NTPs, un buffer neutro y una ADN polimerasa estable a cambios de temperatura.El mtodo se inicia con una separacin de las hebras de ADN por desnaturalizacin a 95 durante 15 minutos. Luego se hace una hibridacin de la cadena con los primers al disminur la temperatura, y al aumentar la temperatura a unos 72, comienza el trabajo de la polimerasa. Este ciclo se repite y se crean copias del ADN haciendo una amplificacin. Estos ciclos se pueden hacer repetitivamente utilizando un fluocromo, que se une a la doble cadena y avisa por medio de fotones cundo se debe elevar la temperatura a un termociclador.

CLONADO DE ADN

Para esta tcnica, parte de un ADN forneo se intrudoce en un vector y este es llevado a una clula hospedadora. La introduccin de ADN en un plsmido para llevar a este a una bacteria sera un ejemplo.Para introducir el ADN forneo se deben utilizar enzimas de restriccin. Las ms usadas son las que producen extremos adhesivos.

MARCACIN DE LOCI EN CROMOSOMAS

Este proceso se hace con hibridacin in situ de cromosomas parcialmente desnaturalizados con genes marcados.

Algunos conceptos sobre gentica:

Polimorfismo: Variaciones en el ADN, ya sea por cambio de base, deleccin o insercin. Los polimorfismos son la base de la variabilidad gentica, pero pueden ser base tambin para la etiopatogenia de enfermedades hereditarias.

Regiones hipervariables del ADN: Son repeticiones de secuencias en tndem. Los fragmentos repetidos son distintos en todos los individuos. Se usan para determinar ADN en medicina forense (por ejemplo, en la incriminacin de un sospechoso) y son conocidos como la huella digital del ADN.

PRODUCCIN DE PROTENAS TERAPUTICAS

Si se asla una colonia de bacterias y a sus protenas se las somete a un Western Blot, se puede saber si las mismas producen protenas que pueden ser de utilidad para distintas situaciones en medicina. Va insertar un ADN forneo en un plsmido, puedo obtener protenas por ADN recombinante (la mezcla de dos ADNs).Por ejemplo, la bacteria E.coli se utiliza para la produccin de GH. En el caso de que las protenas requieran modificaciones postraduccionales, se pueden utilizar sistemas eucariontes.Entonces, si yo quiero expresar algn gen en comn en una colonia para que ellas me produzcan una cierta protena, se puede hacer por medio del mtodo de ADN recombinante con insercin de un plsmido con ADN forneo.

VACUNAS

En las vacunas, actualmente se utiliza crear la protena de membrana (antgeno) del virus, y poner esta misma protena en sangre (sola, sin el virus) para que la protena sea reconocida por los anticuerpos y se pueda desencadenar la respuesta sin tener riesgos de que el virus pueda infectar. La creacin de esta protena de membrana se logra por ADN recombinante con posterior glicosilacin (modificacin postraduccional) de la misma en sistemas eucariontes.

TERAPIA GNICA

La terapia gnica se basa en la introduccin de genes de retrovirus (virus con ARN) o adenovirus (virus con ADN lineal doble cadena), o con receptores destinados a un especfico tipo celular; para modificar la actividad de la clula, reemplazando, por ejemplo, material gentico defectuoso.Cito textual:La terapia gnica slo funcionar si se logra entregar un gen normal a un gran nmero de clulas -por ejemplo, varios millones- en un tejido. Y tienen que ser las clulas correctas, en el tejido correcto. Una vez que el gen llegue a su destino, debe ser activado, y producir la protena codificada por el gen. La entrega y activacin del gen son los mayores obstculos que enfrentan los investigadores de terapia gnica. La orientacin de un gen a las clulas correctas es crucial para el xito de cualquier tratamiento de terapia gnica. Igualmente importante, sin embargo, es asegurarse de que el gen no se incorpore a las clulas equivocadas. La entrega de un gen en otro tejido sera ineficaz y podra causar otros problemas de salud al paciente.