BIOMARCADORES DA CARDIOMIOPATIA PARA DISTROFIA …€¦ · Ao Prof. José Meciano Filho e Marco...

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ADRIANA FOGAGNOLO MAURICIO

"BIOMARCADORES DA CARDIOMIOPATIA PARA

DISTROFIA MUSCULAR: ESTUDO

METABOLÔMICO E TERAPIA COM ÔMEGA-3"

Campinas, 2015

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

ADRIANA FOGAGNOLO MAURICIO

"BIOMARCADORES DA CARDIOMIOPATIA PARA

DISTROFIA MUSCULAR: ESTUDO

METABOLÔMICO E TERAPIA COM ÔMEGA-3"

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e

Estrutural do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do

Título de Doutora em Biologia Celular e Estrutural, na área de anatomia.

Orientadora: Dra. Maria Julia Marques.

Este exemplar corresponde à versão final da

tese defendida pela aluna Adriana Fogagnolo Mauricio e orientada pela Dra. Maria Julia

Marques.

Campinas, 2015

vi

Dedico

Aos meus pais, por sempre me proporcionarem o melhor, pelo carinho e

educação que me deram, pelo exemplo de força e dedicação e pelo apoio ao meu

crescimento pessoal e profissional.

Aos meus pais, aos meus queridos irmãos e namorado, que sempre estiveram

ao meu lado me apoiando para que mais esse sonho se tornasse realidade.

vii

Agradecimento especial

À Professora Dra. Maria Julia Marques, pela dedicação de todos esses anos,

pela orientação, acolhimento, paciência, confiança e pelo aprimoramento didático-

científico compartilhado.

viii

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pelas oportunidades que me foram dadas na vida.

Aos meus pais, Mauro e Lucia, pelo dom da vida e seus ensinamentos. Por serem o que

são para mim e para meus irmãos.

Aos meus queridos irmãos Rodrigo, Gabriela e Renata; e ao Rodrigo, meu namorado,

pela paciência, colo, incentivo, apoio, companheirismo, compreensão e amizade.

Ao meu irmão Rodrigo, pela contribuição na correção da escrita.

Aos meus avós Waldomiro in memória e Ilka, Felippe in memória e Olivia in memória,

pelo carinho e base familiar.

Aos meus tios, primos e amigos, pela amizade, compreensão, força e incentivo.

Ao Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural pela contribuição no

desenvolvimento pessoal e profissional.

Ao Prof. Humberto Santo Neto pela colaboração, conhecimento e sugestões dadas

durante a realização deste trabalho.

À Profa. Elaine Minatel por sempre estar à disposição de me ajudar e pela imensa

contribuição durante todo esse tempo.

Ao Prof. José Meciano Filho e Marco Cesar Somazz pelo conhecimento compartilhado,

aprendizado, incentivo e amizade durante o programa de estágio docente.

ix

Aos docentes do Departamento de Anatomia pela contribuição dada para a minha

formação e pelo conhecimento compartilhado nas disciplinas cursadas durante toda essa

jornada.

Aos Professores Doutores Lúcia Elvira Alvares, Andrea Aparecida de Aro e Luiz

Alberto Ferreira Ramos, pelas pertinentes considerações no exame de qualificação.

Ao Laboratório do Estresse - Departamento de Biologia Estrutural e Funcional –

IB/Unicamp e ao Laboratório de RMN do LNBio – Laboratório de Biociências pelo

espaço e equipamentos cedidos para a realização desse trabalho.

À Ana Carolina Zeri e ao Luiz Alberto Ferreira Ramos, pela colaboração durante a

realização desse trabalho.

À Sra. Liliam Alves Senne Panagio pela atenção e auxilio durante todo mestrado e por

sua sensibilidade.

Aos funcionários do Depto. de Anatomia, Sr. Norivaldo Celestino, Sr. Marco Aurélio

Ribeiro de Paula, Sr. Paulo Francisco dos Santos, Sr. Toni Donizeti dos Santos, Sr.

Walter, A Sra. Rosalina de Fátima Telles pela disposição em ajudar durante minha

formação.

Aos amigos do Laboratório de Plasticidade Muscular, Biologia de Reprodução,

Regeneração Nervosa, Plasticidade e Regeneração Óssea, pela amizade e bons

momentos compartilhados durante o doutorado.

Aos amigos do Laboratório de Plasticidade Muscular pelo acolhimento, conversas e

risadas que tornavam os meus dias mais leves.

A Larissa Kido, pela ajuda e paciência ao me ensinar a técnica de gavagem.

x

Aos antigos amigos do laboratório Ana Paula Taniguti, Cíntia Matsumura, Drielen

Moreira, Isabel Chagas, Juliana Maranhão, Juliano Alves Pereira, Letícia

Montanholi, Lauana Marcela Nascimento, Paula Perez, Renato Ferretti, Tereza de

Albuquerque, Samara Carvalho, Viviane Perim, pela importante contribuição no meu

aprendizado no laboratório, pela amizade e convívio.

Aos que estão chegando ao laboratório Camila, Jéssica Silva Ferreira, Marcos Maciel

Junior, Paula Saenz, Renato Rossi, pela amizade e convívio.

Ao Juliano Alves Pereira por sempre estar à disposição de me ajudar e pela imensa

contribuição durante todo esse tempo. Pelas conversas, dicas e discussões de resultados.

A todos os amigos, colegas, docentes e funcionários que contribuíram de alguma forma

para a realização deste trabalho.

Ao CNPq, pela concessão da bolsa de doutorado (processo – 142282/2012-0 – do período

08/12 ao 05/13).

À FAPESP, pela concessão da bolsa de doutorado (Processo 2012/13577-1 – do período

06/13 ao 07/15).

A FAPESP, CNPq, CAPES, CAPES/PROEX e CAPES/DS o apoio financeiro

indispensável.

xi

“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no

mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”

(Madre Teresa de Calcutá)

xii

SUMÁRIO

Abreviaturas........................................................................................................ xv

Resumo........................................................................................................................... xvi

Abstract....................................................................................................................... xvii

1. Introdução.................................................................................................................. 01

1.1. Distrofia Muscular de Duchenne.......................................................................... 01

1.2. Camundongo mdx................................................................................................. 03

1.3. Lesão muscular..................................................................................................... 03

1.4 Cardiomiopatia...................................................................................................... 04

1.5. Biomarcadores...................................................................................................... 05

1.6. Ômega-3............................................................................................................... 06

2. Objetivos..................................................................................................................... 09

3. Materiais e Métodos.................................................................................................. 10

3.1. Animais................................................................................................................. 10

3.2. Protocolo experimental......................................................................................... 10

3.3. Medida de força................................................................................................... 12

3.4. Eletrocardiograma................................................................................................ 12

3.5. Análise da creatina quinase.................................................................................. 14

3.5.1. Análise da CK total........................................................................................... 14

3.5.2. Análise da CK-cardíaca.................................................................................... 14

3.6. Obtenção dos músculos....................................................................................... 14

3.7. Histologia............................................................................................................ 15

xiii

3.7.1. Preparo e análise dos músculos para a técnica de Hematoxilina e Eosina....... 15

3.7.2. Preparo e análise dos músculos para a técnica de Tricrômico de Masson....... 15

3.8. Mensuração do cálcio total................................................................................... 16

3.9. Determinação proteica pela técnica de western blot........................................... 16

3.10. Metabolômica..................................................................................................... 18

3.12. Análise estatística............................................................................................... 19

4. Resultados.................................................................................................................. 20

4.1. Achados clínicos e massa corporal....................................................................... 20

4.2. Medida de força................................................................................................... 21

4.3. Análise bioquímica............................................................................................... 21

4.3.1. Níveis de CK total............................................................................................. 21

4.3.2. Níveis de CK-cardíaca...................................................................................... 22

4.4. Eletrocardiograma................................................................................................ 22

4.5. Análise morfológica: animal de 13 meses....................................................... 26

4.5.1. Músculo diafragma: animal de 13 meses.................................................... 26

4.5.2. Coração: animal de 13 meses.................................................................... 28

4.6. Análise morfológica: animal de 17 meses.......................................................... 30

4.6.1. Músculo diafragma: animal de 17 meses......................................................... 30

4.6.2. Coração: animal de 17 meses.......................................................................... 32

4.7. Quantificação do cálcio total............................................................................. 35

4.8. Western blot........................................................................................................ 36

4.8.1. Músculo diafragma.......................................................................................... 36

4.8.2 Coração............................................................................................................. 38

xiv

4.9. Metabolômica..................................................................................................... 40

4.9.1. Identificação dos metabólitos.......................................................................... 44

4.9.2. Comparação entre os grupos........................................................................... 48

4.9.3. Análise do componente principal (PCA)......................................................... 53

5. Discussão.................................................................................................................... 61

6. Conclusões................................................................................................................. 77

7. Referências Bibliográficas........................................................................................ 78

8. Anexos ........................................................................................................................ 98

xv

ABREVIATURAS

AA – Ácido araquidônico

ALA – Ácido alpha-linolênico

CDG – Complexo distrofina-glicoproteína

CK – Enzima Creatinocinase

COR – Coração

COX - Cicloxigenase

DHA – Ácido Doxosahexaenóico

DIA – Diafragma

DMD – Distrofia Muscular de Duchenne

ECG – Eletrocardiograma

EPA – Ácido Eicosapentanóico

GAPDH – gliceraldeído 3-fosfato dehidrogenase

H&E – Hematoxilina & Eosina

INFL - inflamação

mdx – X chromossome-linked muscular dystrophy

MMPs – Metaloproteinases

NC – Núcleo central

NP – Núcleo periférico

RMN – Ressonância magnética nuclear

TGF1 - Fator de crescimento transformador beta-1

TIMP- Inibidores teciduais endógenos

TNF-Fator de necrose tumoral-alfa

TRPC 1– Canal de cálcio ativado por estiramento

U/L – Unidade Internacional

VD – Ventrículo direito

VE – Ventrículo esquerdo

SEPTO – Septo interventricular

4HNE- 4-hydroxynonenal

xvi

RESUMO

A distrofia muscular de Duchenne (DMD), assim como a distrofinopatia no

camundongo mdx, modelo experimental da DMD, é caracterizada pela falta de distrofina,

fraqueza muscular progressiva e falência cardiorespiratória. Anti-inflamatórios esteroides

são amplamente utilizados na terapia da DMD. Porém, em decorrência dos seus efeitos

colaterais, outras drogas são investigadas. Previamente, demonstramos que o ômega-3

atenua a mionecrose em músculos esqueléticos de animais distróficos jovens (um mês de

idade). No presente estudo, verificamos se o ômega-3 reduziu a distrofinopatia na fase

tardia da doença (13 e 17 meses), em que há aumento de fibrose. Além das técnicas

tradicionais para análise morfológica (morfometria), molecular (Western bloting) e

funcional (eletrocardiografia), analisamos o perfil metabólico dos músculos cardíaco e

diafragma. No coração, o ômega-3 diminuiu a CK cardíaca, os níveis de TNF-, MMP-9,

canal de cálcio TRPC1 e o marcador de stress oxidativo, 4-HNE, bem como reduziu o

cálcio total e melhorou alguns parâmetros do eletrocardiograma; os efeitos na fibrose

cardíaca foram melhores observados na fase mais tardia da doença (17 meses). No

diafragma, o ômega-3 reduziu a distrofinopatia, diminuindo a fibrose e marcadores

moleculares da doença (TNF-, TGF-1, MMP-9 e 4-HNE). A análise do metaboloma

sugeriu que os metabólitos relacionados ao metabolismo energético (valina) e ao estresse

oxidativo (oxipurinol e aspartato) podem ser biomarcadores da fase tardia da doença, uma

vez que estavam alterados no mdx. O ômega-3 teve efeito sobre os metabólitos em ambos

os músculos. Muito embora deva-se ter cuidado ao utilizar dados de animais para pacientes

humanos, concluímos que o ômega-3 pode ser empregado como terapia adicional para as

distrofinopatias, trazendo benefícios tanto para o coração, quanto para o diafragma na fase

tardia da doença.

Palavras-chave: biomarcadores, cadiomiopatia, fibrose, mdx, metaboloma, ômega-3.

xvii

ABSTRACT

In Duchenne muscular dystrophy (DMD) and in the mdx mice model of DMD, the

absence of dystrophin leads to progressive muscular weakness and cardiorespiratory

failure. Corticoids are the choice therapy for DMD. However, due to their side effects other

drugs are investigated. Previously, we demonstrated that omega-3 attenuated myonecrosis

in skeletal muscles of the mdx mice, during an early stage of the disease (one month old). In

the present study, we evaluated whether omega-3 would benefit the dystrophic heart, at

later stages of the disease (13 and 17 months). We used morphological (morphometry),

molecular (Western bloting) and functional (electrocardiogram) analysis and performed the

metabolic profile of mdx heart and diaphragm muscles. In heart, omega-3 decreased cardiac

creatine kinase and the levels of TNF-and MMP-9 (pro-inflammatory markers), TRPC1

(calcium channel) and HNE-4 (marker of oxidative stress); omega-3 reduced heart total

content of calcium, and improved some ECG parameters; the effects on cardiac fibrosis

were best seen at the later stage of the disease (17 months). In diaphragm, omega-3

improved dystrophinopathy by reducing fibrosis and molecular markers of the disease

(TNF-, TGF-1, MMP-9 and 4-HNE). The analysis of metabolome showed that

metabolites related to energy metabolism (valine) and oxidative stress (oxypurinol and

aspartate) were altered in mdx heart and diaphragm, suggesting their use as potential

biomarkers at later stages of the disease. Omega-3 affected the metabolic profile of both

muscles. While care must be taken to translate data from mice to human diseases, the

present results support the use of omega-3 as an additional therapy or nutritional support to

DMD patients, deserving future clinical studies.

Keywords: biomarkers, cardiomyopathy, fibrosis, mdx, metabolomics, omega-3.

1

1.Introdução

1.1 Distrofia Muscular de Duchenne

A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença recessiva ligada ao

cromossomo X que afeta uma em cada 5000 crianças do sexo masculino nascidas vivas.

Descrita pela primeira vez em 1861, destaca-se dentre as distrofias musculares por ser a

mais comum e devastadora miopatia infantil, caracterizada por fraqueza progressiva dos

músculos (ENGEL, YAMAMOTO & FISCHBECK, 1994; MENDELL & LLOYD-

PURYEAR, 2013; McGREEVY et al., 2015).

Ao nascimento, o paciente com DMD não apresenta nenhum sinal clínico da

doença. Esta pode ser diagnosticada pelo mapeamento genético ou através da quantificação

da enzima creatina quinase (CK) no plasma sanguíneo, que se encontra elevada na DMD. A

CK é uma enzima muscular e que pode ser encontrada elevada no plasma quando há lesão

muscular. Assim, o aumento da CK nos pacientes distróficos é consequência da

degeneração muscular. Os sinais clínicos se manifestam entre dois e cinco anos de idade,

quando as crianças demonstram dificuldades motoras. A perda da deambulação ocorre na

adolescência (ENGEL, YAMAMOTO & FISCHBECK, 1994). Embora a utilização de

corticoides e aparelhos ventilatórios melhorem a qualidade de vida do paciente, o óbito

frequentemente ocorre por volta da segunda ou terceira década de vida em decorrência da

insuficiência cardiorrespiratória (BOGDANOVICH et al., 2004; PASSAMANO et al.,

2012).

A DMD é causada por uma mutação no gene responsável pela expressão da proteína

distrofina no cromossomo X (HOFFMAN, BROWN & KUNKEL, 1987). A distrofina é

uma proteína estrutural encontrada na face citoplasmática do sarcolema ligada aos

miofilamentos de actina e a um complexo de glicoproteínas da membrana (Figura 1).

Juntas, estas proteínas formam o complexo distrofina-glicoproteínas (CDG), que apresenta

importante função na manutenção da estabilidade do sarcolema (DECONINCK & DAN,

2006). Alterações neste complexo comprometem a ligação entre a matriz extracelular e o

citoesqueleto da fibra, conferindo instabilidade ao sarcolema, influxo exacerbado de cálcio

e mionecrose (DECONINCK & DAN, 2006; WHITEHEAD, YEUNG & ALLEN, 2006).

Sabe-se que na ausência da distrofina, outros componentes do CDG estão diminuídos

2

quando comparados a músculos normais (LOHAN, CULLIGAN & OHLENDIECK, 2005;

ERVASTI, 2007).

Vários mecanismos estão envolvidos na patofisiologia desta doença (para revisão

vide MARQUES, 2004; ALLEN, ZHANG & WHITEHEAD, 2010). O aumento do cálcio

intracelular ativa proteases e a produção de espécies reativas de oxigênio, que causam

lesões no sarcolema e mionecrose. Consequentemente, um processo inflamatório intenso

instala-se no local contribuindo para a lesão de outras fibras, sendo este processo

intensificado pelo aumento do estresse oxidativo (WHITEHEAD, YEUNG & ALLEN,

2006).

Ao mesmo tempo em que ocorre a remoção das fibras necróticas pelas células do

processo inflamatório, a regeneração do músculo é estimulada. Porém, prevalece a

Figura1: Esquema do complexo distrofina-glicoproteínas representando a - e -

distroglicanas; -, -, -, - sarcoglicanas; -, 1-sintrofinas; distrobrevina e a

distrofina. A distrofina exerce papel importante na estabilização do sarcolema

conectando actina citoesquelética à cadeia da laminina-2 localizada na lâmina

basal via complexo de glicoproteínas (Laboratório de Junção Neuromuscular –

IB - UNICAMP).

3

formação de tecido fibroadiposo sem características funcionais (ENGEL, YAMAMOTO &

FISCHBECK, 1994).

1.2 Camundongo mdx

Camundongos mdx (X chromossome-linked muscular dystrophy) apresentam

ausência da distrofina (BULFIELD et al., 1984), sendo utilizados como modelo

experimental e também para testes pré-clínicos relacionados à DMD (GROUNDS et al.,

2008). O mdx foi descoberto em 1984 em uma colônia de camundongos C57BL/10 que

apresentava elevados níveis de CK e degeneração muscular (BULFIELD et al., 1984). A

degeneração muscular no mdx se inicia por volta dos 21 dias de vida pós-natal, sendo

observados ciclos de degeneração e regeneração, com picos de inflamação.

Aproximadamente aos 4-6 meses de vida a degeneração declina, voltando a ser mais

exuberante no animal idoso, a partir do primeiro ano de vida (para revisão vide GROUNDS

et al., 2008). Ao contrário da miopatia humana, os camundongos apresentam eficiente

capacidade de regeneração muscular, compensando os ciclos de degeneração (TORRES &

DUCHEN, 1987). Sabe-se que o músculo diafragma é o mais afetado, mimetizando a

patologia observada no humano (STEDMAN et al., 1991). Aos dois anos de idade o mdx

apresenta patologia semelhante aos humanos distróficos, com predominância da

degeneração muscular (LEFAUCHEUR, PASTORET, SEBILLE, 1995).

1.3 Lesão muscular

Sabe-se que a falta da distrofina leva à instabilidade do sarcolema, ao influxo

exacerbado de cálcio e à alteração na homeostase da fibra muscular, gerando inflamação

crônica e mionecrose (ENGEL, YAMAMOTO & FISCHBECK, 1994). Acredita-se que a

intensidade do processo inflamatório esteja diretamente relacionada com a liberação de

diversos mediadores químicos, que atraem um número maior de células inflamatórias para

os sítios mionecróticos, contribuindo para o avanço da doença (GROUNDS & TORRISI,

2004). Juntamente com o processo inflamatório, tem-se a ativação e a proliferação de

células satélite que irão se fundir para formar miotubos. A diferenciação destes em

4

miofibras e a deposição de tecido conjuntivo ocorrem como etapa final da regeneração

(TIDBAL, 2005).

A fibrose muscular é uma característica morfológica evidente encontrada em

indivíduos afetados pela DMD (ENGEL, YAMAMOTO & FISCHBECK, 1994;

BERNASCONI et al., 1995). Estudos demonstram a presença de fibrose a partir do sétimo

mês de vida nos músculos diafragma e cardíaco de camundongos mdx (TANIGUTI et al.,

2011). Acredita-se que a fibrose em músculos distróficos seja decorrente da elevada

expressão do fator de crescimento transformador beta-1 (TGF-1) (BERNASCONI et al.,

1995; TANIGUTI et al., 2011).

As metaloproteinases (MMPs) são moléculas reguladoras da formação,

remodelamento e degradação de componentes de matriz extracelular, tanto em processos

fisiológicos, quanto em processos patológicos. As MMP-2 e 9 são metaloproteinases da

classe gelatinase. Estudos sugerem que as MMPs 2 e 9 participam do processo de

degeneração e regeneração de músculos esqueléticos (FUKUSHIMA et al., 2007).

Acredita-se que a MMP-9 esteja envolvida com o processo inflamatório durante a

degeneração muscular (KIESIER et al., 2001; SCHOSER, BLOTTINER,

STUERENBURG, 2002; FUKUSHIMA et al., 2007). Em contraste, a MMP-2, está

relacionada com o remodelamento da matriz extracelular durante o processo de regeneração

(FUKUSHIMA et al., 2007).

Com o envelhecimento, observa-se aumento das metaloproteinases 2 e 9 (MMP-2 e

MMP-9) e inibidores teciduais endógenos (TIMPS – controlam a atividade enzimática das

MMPs) nos camundongos mdx. Acredita-se que as MMPs estejam associadas à degradação

e remodelamento da matriz extracelular, inflamação e fibrose (DAHIYA et al., 2011).

Tanto as MMPs quanto a TIMP1 são utilizados como biomarcadores para monitorar a

progressão da DMD (NADARAJAH et al., 2011).

1.4 Cardiomiopatia

O músculo cardíaco é comumente afetado em pacientes distróficos (NIGRO et al.,

1990; ENGEL, YAMAMOTO & FISCHBECK, 1994; FINGTERER & CRIPE, 2014). A

cardiomiopatia no DMD se manifesta ao longo do tempo, podendo ocorrer cardiomiopatia

5

dilatada, taquicardia, arritmia, alterações no eletrocardiograma (ECG) e ecocardiograma

(NIGRO et al., 1990; WEHLING-HENRICKS et al., 2005; COLUSSI et al., 2010). Assim

como os pacientes com DMD, os camundongos mdx exibem danos progressivos da

musculatura cardíaca, porém, menos severa do que a observada em humanos (BIA et. al.,

1999). A cardiomiopatia se instala tardiamente, apresentando moderada fibrose ao redor do

sexto e oitavo mês de idade (TANIGUTI et al., 2011). Entre o nono e o décimo mês, o

camundongo mdx começa a apresentar diminuição da função cardíaca (DUAN, 2006;

SPURNEY et al., 2008; BURELLE et al., 2010), em consequência do aumento

significativo de tecido conjuntivo no músculo.

Assim como nos pacientes distróficos, os camundongos mdx apresentam alterações

funcionais observadas tanto no ECG quanto em ecocardiogramas (CHU et al., 2002;

HAINSEY et al., 2003; SPURNEY, 2011; MOREIRA et al., 2013). As alterações mais

comuns no ECG de animais distróficos são: ondas R polifásicas, diminuição da razão R:S,

diminuição do intervalo PR, aprofundamento da onda Q e prolongamento dos intervalos

QRS, QT e QTc, bem como o aumento do índice de cardiomiopatia (BIA et al., 1999;

BOSTICK et al., 2008; BOSTICK et al., 2009; MOREIRA et al., 2013).

1.5 Biomarcadores

Biomarcadores são componentes celulares, representados por organelas ou

moléculas que participam da estrutura (por exemplo, a distrofina) ou de vias bioquímicas

(por exemplo, o aspartato), que podem ser utilizados para avaliar a predisposição, presença,

progressão ou efeito do tratamento de uma doença.

A CK é uma enzima encontrada na fibra muscular e comumente utilizada como

biomarcador sérico para diagnóstico da DMD. Os níveis de CK podem estar elevados no

plasma devido a alterações em caso de lesões musculares (KATIRJI & AL-JABERI, 2001).

Nos pacientes distróficos os níveis de CK encontram-se elevados devido ao processo de

degeneração muscular (ENGEL, YAMAMOTO & FISCHBECK, 1994). Embora a

progressão da doença continue durante toda a vida, em estágios tardios da doença há queda

dos níveis de CK devido a diminuição da degeneração e perda de tecido muscular (EMERY

et al., 2003). Assim, a identificação de novos biomarcadores pode ser útil para o

6

monitoramento da progressão da doença e na identificação de novos alvos terapêuticos

(CARBERRY et al., 2012).

Biomarcadores têm sido descritos com a metabolômica, a qual analisa de maneira

quantitativa os metabólitos produzidos por um organismo. A ressonância magnética nuclear

(RMN) é uma das técnicas utilizadas na identificação de mudanças metabólicas no plasma,

urina e músculo (hmdb.ca), permitindo o entendimento de processos bioquímicos induzidos

por doenças (GRIFFIN & DES ROISIERS, 2009; MARTINS-BACH et al., 2012).

A falta da distrofina e o processo degenerativo no mdx interferem na regulação de

metabólitos (MARTINS-BACH et al., 2012). Em adição, alterações metabólicas podem

preceder as alterações histopatológicas nos camundongos mdx (MARTINS-BACH et al.,

2012). Isto sugere que o estudo do perfil metabólico pode antecipar a análise de alguns

aspectos da progressão da doença, que de outra forma seriam obtidos mais tardiamente, por

outras técnicas.

1.6 Ômega-3

Os corticoides são amplamente utilizados na terapia da DMD. Porém, em

decorrência dos seus efeitos colaterais (ESCOLAR & SCACHERI, 2001; ANGELINI &

PETERLE, 2012), outras drogas têm sido investigadas (FOGAGNOLO MAURICIO et al.,

2013; MOREIRA et al., 2013; PEREIRA et al., 2014). Em estudo anterior realizado pelo

nosso grupo, foi observado que tanto o ácido eicosapentaenoico (EPA) purificado quanto a

cápsula de ômega-3 contendo EPA e o ácido docosahexanóico (DHA) protegeram os

músculos esqueléticos de animais jovens contra a mionecrose (MACHADO et al., 2011;

FOGAGNOLO MAURICIO et al., 2013; CARVALHO et al., 2013).

Sabe-se que o ômega-3, assim como o ômega-6, é um ácido graxo poli-insaturado

essencial, não produzido pelo organismo humano, e que, portanto, deve ser obtido através

da alimentação (para revisão vide CALDER, 2011).

Os ácidos linoleico e linolênico (ambos ômega-6) quando consumidos são

convertidos no organismo em ácido araquidônico (AA – Figura 2). Este, por sua vez,

apresenta capacidade pró-inflamatória uma vez que é convertido pelas enzimas

cicloxigenase (COX) e lipoxigenase (LOX) em prostaglandinas, tromboxanos e

7

leucotrienos de série par, mediadores e reguladores da inflamação (BABCOCK, HELTON

& ESPAT, 2000; CALDER, 2011; FABIAN, KIMLER & HURSTING, 2015).

Por outro lado, o EPA e o DHA, ambos ômega-3, podem interferir na mionecrose. É

sabido que tanto o EPA quanto o DHA possuem características anti-inflamatórias, uma vez

que são convertidos pela COX e LOX em prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos de

série ímpar, bem como em resolvinas (Figura 2 - BABCOCK, HELTON & ESPAT, 2000;

CALDER, 2011; FABIAN et al., 2015). O EPA e o DHA também podem inibir a produção

de eicosanoides e citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-, uma vez que interferem na

síntese do AA através da competição pela COX e LOX (BABCOCK, HELTON & ESPAT,

2000; MARTINEZ-MICAELO et al., 2011).

Adicionalmente, estudos demonstram que a ingestão de ácidos graxos interfere na

composição da membrana fosfolipídica (POUND et al., 2001). Isto, por sua vez, parece

modificar a condução de canais iônicos na membrana e alterar o influxo de cálcio (JUDÈ et

al., 2006; POUND et al., 2001). O consumo de ômega-3 promove ainda a diminuição de

espécies reativas de oxigênio, que de uma maneira geral contribuem para o dano tecidual

(XIE et al., 2011; KAJIKAWA et al., 2010).

O consumo de ômega-3 melhora o prognóstico de doenças inflamatórias como a

psoríase e artrite reumatoide (SIMOPOULOS, 2002; GHEITA et al., 2011). O EPA e o

DHA estão associados também à redução dos riscos de doenças cardiovasculares e à

melhora de parâmetros metabólicos (SIMOPOULOS, 2002; JUDÉ et al., 2006).

No presente estudo, verificamos os efeitos do ômega-3 no músculo esquelético e na

cardiomiopatia em um estágio mais avançado da doença. Adicionalmente, através de um

estudo do metaboloma, pretendemos identificar biomarcadores que possam ser

relacionados à patologia do coração e do diafragma.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kajikawa%20S%22%5BAuthor%5D

8

Figura 2: Conversão dos ácidos graxos em mediadores da inflamação. COX

(cicloxigenase); LOX (lipoxigenase); EPA (ácido eicosapentaenoico); DHA (ácido

docoxaexaenoico); PGs (prostaglandinas), LTs (leucotrienos). Imagem adaptada

de Calder, 2011.

9

2 Objetivos gerais

1) Será avaliado o perfil metabólico dos camundongos mdx a fim de identificar novos

biomarcadores que possam indicar a intensidade da doença nos músculos estriados

esquelético e cardíaco, bem como estudar o efeito do ômega-3 sobre os metabólitos

dos músculos distróficos estudados.

2) Verificaremos se o ômega-3 (EPA + DHA) reduz a cardiomiopatia e a progressão

da doença no músculo diafragma de animais mdx idosos.

2.1 Objetivos específicos

1) Verificar quais metabólitos estão alterados no coração e no diafragma do animal

distrófico e o efeito do tratamento com o ômega-3 nesses metabólitos;

2) Identificar possíveis biomarcadores da cardiomiopatia no animal distrófico, bem

como identificar biomarcadores do músculo diafragma, músculo mais acometido do

animal mdx;

3) Verificar o efeito do ômega-3 nos músculos distróficos (coração e diafragma)

quanto à proteção do sarcolema; acúmulo do cálcio e proteínas envolvidas no seu

tamponamento; formação de fibrose e estresse oxidativo.

10

3 Materiais e Métodos

3.1 Animais

Foram utilizados camundongos de oito meses de idade (idade inicial), de ambos os

sexos, da linhagem mdx e da linhagem controle C57BL/10. Os animais foram adquiridos do

Biotério Central da UNICAMP e mantidos no Biotério do Departamento de Anatomia, IB,

UNICAMP em caixas padrão em condições ambientais controladas (12 horas de ciclo

claro/escuro) com ração e água ad libitum durante 5 meses.

Os animais foram divididos em cinco grupos experimentais: C57BL/10 (n=30),

mdx-nujol (n=30), mdx-ômega-3 (n=30) de treze meses e mdx-nujol (n=4) e mdx-ômega-3

(n=4) de dezessete meses.

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes para

experimentação animal de nossa instituição, sob o protocolo no

2893-1 da Comissão de

Ética na Experimentação Animal (CEUA/UNICAMP).

3.2 Protocolo Experimental

3.2.1 Animal de 13 meses

Grupo mdx-ômega-3

Os camundongos distróficos foram tratados com o óleo obtido das cápsulas de

ômega-3 EPA 1000mg (FDC vitamins, Inc., Miami, Flórida, EUA. Importado e distribuído

exclusivamente por Fedco Ind. Ltda) e receberam 300mg/Kg três vezes na semana, via

gavagem (FOGAGNOLO MAURICIO et al., 2013). O tratamento teve início quando os

animais completaram oito meses de idade e foram tratados durante cinco meses, tendo 13

meses ao término do tratamento.

Grupo mdx controle

Os camundongos distróficos foram tratados com óleo mineral (Nujol; 100% óleo

mineral – Mantecorp Indústria Química e Farmacêutica Ltda.), recebendo a mesma

dosagem que o grupo anterior no mesmo período de tratamento.

11

Grupo Controle

Foram utilizados camundongos C57BL/10. Os camundongos foram tratados com óleo

mineral (Nujol; 100% óleo mineral – Mantecorp Indústria Química e Farmacêutica Ltda.),

recebendo a mesma dosagem que o grupo anterior no mesmo período de tratamento.

3.2.2 Animal de 17 meses

Não foi observada redução significativa da fibrose no coração de animais de 13

meses, tratados com ômega-3, embora tenha sido observada melhora em alguns parâmetros

do eletrocardiograma, bem como efeitos positivos quanto a algumas proteínas, no Western

blot. Assim, resolvemos estudar animais mais velhos para verificar se, em uma idade mais

avançada, em que há aumento de fibrose no músculo cardíaco, poderíamos detectar algum

efeito do ômega-3 na fibrose cardíaca.

Foram utilizados camundongos de doze meses de idade (idade inicial), de ambos os

sexos, da linhagem mdx e da linhagem controle C57BL/10, divididos em três grupos

experimentais: mdx-nujol (n=4), mdx-ômega-3 (n=4) para a realização da técnica

histológica com coloração pelo Tricrômico de Masson.

Grupo mdx-ômega-3

Os camundongos distróficos foram tratados com o óleo obtido das cápsulas de

ômega-3 EPA 1000mg (FDC vitamins, Inc., Miami, Flórida, EUA. Importado e distribuído

exclusivamente por Fedco Ind. Ltda) e receberam 300mg/Kg três vezes na semana, via

gavagem (FOGAGONOLO MAURICIO et al., 2012). O tratamento teve início quando os

animais completaram doze meses de idade e foram tratados durante cinco meses, tendo 17

meses ao término do tratamento.

Grupo mdx controle

Os camundongos distróficos foram tratados com óleo mineral (Nujol; 100% óleo

mineral – Mantecorp Indústria Química e Farmacêutica Ltda.), recebendo a mesma

dosagem que o grupo anterior, pelo mesmo período de tratamento.

12

3.3 Medida da força

Os camundongos de cada grupo tiveram a força dos membros anteriores obtida no

início e ao final do tratamento. A força foi quantificada no aparelho de medida de força

horizontal (Newprimer®). Os animais, estabilizados pela cauda (Figura 3), seguravam com

as patas torácicas uma argola de metal ligada a um transdutor. Ao segurar na cauda do

animal, este puxava a argola e a força realizada neste momento era captada pelo transdutor.

A força de cinco medidas, em quilogramas, foi utilizada para composição da média de cada

animal, sendo o resultado final expresso em Kg/força (TANIGUTI et al., 2011).

3.4 Eletrocardiograma

Para a avaliação funcional do coração foi feito o eletrocardiograma, tal como

descrito anteriormente (MOREIRA et al. 2013). Camundongos C57BL/10 (n=6), mdx-nujol

(n=6) e mdx-ômega-3 (n=6) foram anestesiados com cloridrato de cetamina (50,0 mg/kg) e

cloridrato de xylazina (5,0 mg/kg). A análise foi realizada no término do tratamento. Os

registros foram feitos com eletrodos na forma de agulhas hipodérmicas conectadas a um

eletrocardiógrafo computadorizado de quatro canais (MLS360/7 ECG Analysis Module,

ADInstruments – Austrália). As agulhas foram introduzidas subcutaneamente, duas na

junção ventral entre a caixa torácica e os membros anteriores direito e esquerdo e uma

terceira agulha na junção entre o abdome e o membro posterior esquerdo (Figura 4). Os

traçados foram obtidos com o animal em decúbito dorsal. As amplitudes das ondas foram

Figura 3: Equipamento para medida de força dos membros anteriores. O animal

segura a argola puxando-a para trás, exercendo assim força muscular que é registrada

no visor digital, em quilogramas.

13

mensuradas em microvolts (V) e as durações dos intervalos em milissegundos (ms),

considerando-se a derivação em DI do plano frontal. No registro eletrocardiográfico foi

analisada a média de dez ciclos sucessivos, para determinar os seguintes parâmetros:

intervalo PR, definido como transmissão elétrica do nodo sinoatrial para o nodo

atrioventricular (do início da onda P ao início do complexo QRS); duração do complexo

QRS, definido como o tempo de despolarização ventricular; intervalo QT, definido como a

sístole elétrica ventricular (início do complexo QRS ao final da onda T; alterações no

intervalo QT estão relacionadas à hipertrofia ventricular, indicativo de morte súbita por

fibrilação) intervalo QTc: intervalo QT, corrigido pela frequência cardíaca, segundo a

fórmula de Bazzet e mensuração da amplitude das ondas P, Q, R, S e T. Mensuração da

razão R/S, em que se analisam mudanças na onda S, quantificada pela expressão da

amplitude da onda S como porcentagem da onda R (Bia et al., 1999). O índice de

cardiomiopatia foi determinado pela divisão do intervalo QT pelo segmento PQ (QT / PQ)

(BOSTICK et al., 2008).

Esta análise foi realizada no Laboratório do Estresse - Departamento de Biologia

Estrutural e Funcional – IB/Unicamp, sob a supervisão do pesquisador Luiz Alberto

Ferreira Ramos.

Figura 4: Camundongo mdx sob anestesia com eletrodos subcutâneos para realização

do eletrocardiograma.

14

3.5 Análise de Creatina quinase (CK)

3.5.1 CK Total

A CK no plasma sanguíneo é um indicador do processo de necrose muscular. O

sangue dos animais (13 meses) foi coletado sob anestesia. Após a toracotomia e exposição

do coração, uma seringa heparinizada foi utilizada para retirada do sangue no ventrículo

direito do animal. O sangue foi centrifugado (centrifuga refrigerada Sigma 3-18k) nas

seguintes condições: 3000 RCF (força centrífuga relativa à aceleração da gravidade) 4°C

por 10 minutos, sendo o sobrenadante utilizado para análise. Para quantificação da CK foi

utilizado o kit CK da Bioclin. As absorbâncias das amostras foram lidas a 25°C

utilizando-se espectrofotômetro U.V (Thermo Electron Corporation Spectrophotometer

Genesys 20) com comprimento de onda de 340nm e cubetas de quartzo de 1cm de caminho

óptico. Os valores foram expressos em unidades internacionais (U/L).

3.5.2 CK Cardíaca

A coleta do sangue foi realizada da mesma maneira que a descrita no item anterior.

Para quantificação da CK cardíaca utilizamos o kit CK-MB, Laborclin. A absorbância das

amostras foi lida a 37°C utilizando o espectrofotômetro (Thermo Electron Corporation

Genesys 20) com comprimento de onda de 340 nm e cubetas de quartzo de 1cm de

caminho óptico. Os valores foram expressos U/L.

3.6 Obtenção dos músculos

Os animais foram submetidos à eutanásia com aprofundamento anestésico de

cloridrato de xilazina (6,8 mg/kg, 2% Virbaxyl, Virbac, São Paulo, Brasil) e cloridrato de

cetamina (130 mg/kg, Francotar, Virbac, São Paulo, Brasil), via intraperitoneal. Em

seguida, o músculo diafragma e o coração utilizados para as técnicas histológicas foram

retirados e fixados em suportes de madeira com tragacanth gum, imersos em n-hexano a -

90C por um minuto e imediatamente colocados em nitrogênio líquido. Para as demais

técnicas, os músculos estudados foram congelados em nitrogênio líquido e armazenados em

tubos criogênicos. Após a coleta o material foi retirado do nitrogênio e armazenado a -80C

15

em Biofreezer (Bio-Freezer So Low. Environmental equipment Cincinatti, Ohio EUA.

Modelo: V85-13, distribuido pela Sellex, Departamento de Anatomia, IB).

3.7 Histologia

Para a análise histológica foram utilizados animais C57BL/10 (n=5); mdx-nujol

(n=5); mdx-ômega-3 (n=5). Os músculos foram retirados e armazenados como descrito

previamente. Para o preparo da lâmina, os cortes foram seccionados transversalmente na

espessura de 7μm, utilizando-se criostato (Criostato Leica CM1860, Departamento de

Anatomia, IB).

3.7.1 Preparo e análise dos músculos para a técnica de Hematoxilina e Eosina

(HE)

As lâminas foram lavadas em água corrente por dez minutos e os cortes corados,

primeiro com hematoxilina de Harris e, em seguida, com eosina. Depois, os cortes foram

desidratados em séries de etanol, diafanizados em xilol, e as lâminas foram montadas em

Entelan para posterior observação em microscopia de luz.

Para cada músculo foram utilizados cinco cortes aleatórios. As lâminas coradas com

HE foram observadas com auxílio de objetiva de 40X e ocular de 10X contendo retículo

quadrilátero com 100 pontos, acoplada ao microscópio de luz (Carl Zeiss). Foi quantificado

o (i) número total de fibras musculares, (ii) fibras com núcleo central (indicativo de

regeneração muscular) e (iii) fibras com núcleo periférico (indicativo de fibras que não

sofreram degeneração), utilizando-se contador manual. Para análise da área de

inflamação/regeneração (evidenciada por aumento da celularidade, fibras em diferentes

estágios de regeneração com núcleo central e diâmetros variados), foi utilizado o

fotomicroscópio (Nikon Eclipse E-400) com objetiva de 20X acoplado a um computador

com software para análise de imagens Image Pro-Express (Image Pro-Express Version 4).

3.7.2 Análise da fibrose: coloração com Tricrômico de Masson (TM)

As lâminas foram lavadas em água corrente por dez minutos e corados com

hematoxilina de Harris por oito minutos. Após este período, as lâminas foram lavadas

16

novamente em água corrente e imersas em solução filha de Masson por quinze minutos.

Depois, as lâminas foram banhadas em solução de ácido acético a 0,2% e rapidamente

mergulhadas em solução de azofloxina por cinco minutos e, em seguida, em solução de

verde luz (light green) por 5 minutos. Após esta etapa, os cortes foram banhados em ácido

acético a 0,2% para serem submetidos à desidratação em série de etanol e à diafanização

com xilol. As lâminas foram montadas em Entelan. Os cortes foram observados em

microscópio de luz e submetidos à morfometria.

Foi utilizado o fotomicroscópio (Nikon Eclipse E-400) com objetiva de 10X

acoplado a um computador com software (Image Pro-Express Version 4) para a

quantificação da área total de secção transversal do músculo diafragma e cardíaco e da área

ocupada por tecido conjuntivo, indicativo de fibrose.

3.8 Mensuração do cálcio total

Foi medida a quantidade de cálcio total no músculo diafragma e no coração dos

grupos estudados (13 meses). A dosagem deste íon foi realizada através de espectrometria

de plasma. Os animais C57BL/10 (n=5); mdx-nujol (n=5); mdx-ômega-3 (n=5) foram

sacrificados e congelados como descrito previamente e posteriormente pesados em balança

analítica. Para o preparo das amostras foi utilizado a técnica descrita por Yoshida et al.,

2006. Os músculos foram colocados em balão volumétrico contendo 2% de seu volume de

ácido nítrico p.a. a 100ºC até a digestão total dos músculos. O balão volumétrico foi

completado com água ultrapura e a amostra filtrada com algodão em um funil. A análise da

amostra foi realizada no espectrômetro de emissão ótica em plasma com acoplamento

indutivo (ICP_OES; Optimum 3000 Duo View. Pekin-Elmer, Instituto de Quimica,

Unicamp).

3.9 Western blot

Verificamos se o tratamento com ômega-3 altera a quantidade de proteínas

relacionadas à inflamação (TNF-fibrose (TGF-), remodelação da matriz extracelular

(metaloproteinases: MMP-9, MMP-2) e inibidor de metaloproteinases: (TIMP-1), ao cálcio

17

(calsequestrina e TRPC-1), ao complexo distrofina-glicoproteínas (a proteína da membrana,

-distroglicana), bem como ao estresse oxidativo (4HNE). Os valores foram normalizados

com a proteína gliceraldeído 3-fosfato dehidrogenase (GAPDH). Para isso, foram utilizados

camundongos C57BL/10 (n=9); mdx- nujol (n=9); mdx-ômega-3 (n=9).

3.9.1 Anticorpos

- Anticorpos primários: (i) Rabbit anti-mouse tumor necrosis factor-alfa polyclonal

antibody –TNF- (Millipore); (ii) TGF-1 (mouse monoclonal; Sigma-Aldrich, St Louis,

Missouri, USA), (iii) anti-MMP-2-9 (rabbit polyclonal anti-MMP-2-9; (H-129): sc-10737;

Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA; (iv) anti-TIMP-1 (Santa Cruz

Biotechnology, santa Cruz, California, USA); (v) TRPC1(rabbit polyclonal; Alomone Labs,

Jerusalem, Israel); (vi) calsequestrina esquelética (VIIID 12) e (vii) calsequestrina cardíaca

(PA1-913) - Affinity BioReagents. (viii) beta-distroglicana: NCL-b-DG - Novocastra

Laboratories; (ix) 4-HNE: goat polyclonal (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,

California, USA); (x) GAPDH, (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA).

- Anticorpos secundários: (IgG mouse conjugado à peroxidadse correspondente (H+L)

(KPL, Gaithersburg, Maryland, USA).

3.9.2 Preparação de extrato total

Os músculos foram retirados como descrito supra e homogeneizados em tampão

(Tris-HCl 100 mM, pirofosfato de sódio 100 mM, fluoreto de sódio 100 mM, 10 μg/ml

aprotinin, PMSF 1 mM, e Na3VO 0,25 mM) a 4ºC usando homogeneizador Polytron PTA

20S (Brinkmann Instruments, Westbury, New York, EUA), operado em velocidade

máxima por 30 segundos. Os extratos foram centrifugados a 11000rpm a 4ºC por 20

minutos e o sobrenadante foi utilizado para análise do extrato total. A determinação de

proteína foi realizada pelo método de Bradford et al. (1976).

3.9.3 Análise das proteínas

As amostras do extrato proteico foram tratadas com tampão Laemmli (azul de

bromofenol 0,04 mg/ml eTris-HCl 0,12 M, glicerol 20%, SDS 2% e ß-mercaptoetanol 0,28

18

M) e aquecidas por 5 minutos. Em seguida, 30 g de proteína foram aplicados em gel SDS-

poliacrilamida 8-15% em aparelho para eletroforese (mini-Protean, Bio-Rad Laboratories,

Richmond, CA, EUA). A eletrotransferência do gel para a membrana de nitrocelulose foi

realizada em 90 minutos a 120 V em aparelho de transferência (mini-Protean, Bio-Rad

Laboratories, Richmond, CA, EUA). As membranas foram incubadas com solução basal

(Trisma base 10 mM, cloreto de sódio 150 mM e Tween-20 0,02%) com os respectivos

anticorpos primários a 4ºC, durante 12 horas. Após 12 horas, as membranas foram lavadas

por 30 minutos com solução basal, para depois serem incubadas com anticorpos

secundários, diluídos em10 ml de solução basal por uma hora e meia, em temperatura

ambiente. Posteriormente, as membranas foram lavadas por 30 minutos com solução basal.

As diluições dos anticorpos primários e secundários foram definidas de acordo com a

marcação obtida.

Para detectar as bandas imunorreativas, as membranas foram expostas a solução de

quimiluminescência (Super Signal West Pico Chemiluminescente, Pierce Biotechnology,

Rockford, Illinois, USA) por 5 minutos, seguida de exposição no G-Box.

A detecção das bandas imunofluorescentes e a quantificação foram feitas no

aparelho G-Box Chemi pelo software de aquisição de imagem GeneSnap (Syngene,

Maryland-EUA). As densidades das bandas foram quantificadas pelo software de análise

GeneTools (Syngene, Maryland-EUA). Após a quantificação no G-Box, os dados foram

transferidos para o Excel.

3.10 Metabolômica: Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)

Foram utilizados 30 camundongos C57BL/10 (n=10); mdx sem tratamento (n=10);

mdx-ômega-3 (n=10).

Os animais de cada grupo foram sacrificados por aprofundamento anestésico e o

músculo diafragma e o coração foram retirados, congelados em nitrogênio líquido e

armazenados a -80ºC.

- Preparação das amostras: para que tivéssemos uma boa leitura das amostras, foi

padronizado o uso de 0,1g de amostra por músculo. Como o músculo diafragma é pequeno,

e com uma amostra esse peso não era atingido, para esse músculo foi necessário fazer pool

19

de dois animais. As amostras foram pesadas homogeneizadas em 250l de

metanol/clorofórmio (2:1) em sonicador. Após quinze minutos foi adicionado ao pellet

250l uma solução de clorofórmio/água milli Q (1:1). Os reagentes foram centrifugados a

4.000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi coletado e liofilizado. O pó obtido foi

resuspendido em 0,7 de óxido de deutério com ácido trimetil-silil tetradeuteropropiônico

(TSP) em 10mM. Posteriormente, as amostras foram transferidas para um tubo padrão de

RMN para análise espectral. Segundo o protocolo de extração celular a partir de LeBelle,

2002.

- Espectroscopia por RMN: foi utilizado o Espectrômetro Varian Inova 600 MHz,

pertencente ao Laboratório Nacional de Biociências (LNBio). Para a espectroscopia

unidimensional (1D), os parâmetros experimentais foram: intervalo de relaxamento: 10s;

largura do pulso de excitação: 12m; aquisição de tempo 14,8s; janela espectral 1,4 kHz,

64k pontos de dados e 256 transientes. Transformação ponderada de Fourier com a linha

de função de apodização e ampliação foi realizada com 0,3 Hz, seguida por correção da

linha de base e ajuste de fase.

- Tratamento dos dados no software Chenomx: o espectro foi normalizado pelo

valor de TSP, um aditivo que é utilizado como referência interna. Os picos observados

foram identificados e o software Chenomx NMR Suite (Versão 7.1; Chenomx Inc.,

Edmonton, Canadá), foi utilizado para o tratamento dos dados obtidos e para análise

qualitativa e quantitativa dos metabólitos presentes na amostra.

Os dados obtidos no Chenomx foram analisados no site do MetaboAnalist através

das análises de variância ANOVA e pelo teste da análise de componentes principais (PCA).

Esta análise foi feita no LNBio – Laboratório de Biociências, sob a supervisão da

pesquisadora Ana Carolina Zeri.

3.11 Análise estatística

Os resultados foram expressos como média±desvio padrão. A comparação direta

entre as médias de dois grupos foi realizada utilizando-se test-t de Student com

significância p≤0,05. A comparação entre três grupos ou mais grupos foi realizada por

análise de variância (ANOVA; p≤0,05), seguida do pós-teste de Bonferroni.

20

4 Resultados

4.1 Achados clínicos e massa corporal:

Para investigar se o tratamento com o ômega-3 afetou o crescimento somático, foi

comparada a massa corporal dos camundongos no início, no meio e no término do

tratamento (Figura 5). Não foi observada diferença na média da massa corporal entre os

grupos C57BL/10, mdx-nujol e mdx-ômega-3 no início e no final do tratamento.

Figura 5: Massa corporal. O tratamento não interferiu no crescimento somático dos

camundongos distróficos. Média±Desvio padrão.

21

4.2 Análise Funcional: Medida de Força

A análise da medida de força foi realizada comparando o início e o término do

tratamento de cada grupo estudado. Foi observado aumento significante da força dos

membros anteriores nos animais C57BL/10 e nos animais tratados com ômega-3 (mdx-Ω3),

ao final do tratamento (13 meses de idade – Tabela 1).

Força/Massa (g/g)

C57BL/10 Mdx-nujol mdx-Ω3

Início 1.51±0.16 1.31±0.29

1.26±0.24

Final 1.67±0.28*

1.39±0.15

1.48±0.12*

4.3 Análise Bioquímica

4.3.1 Níveis de CK total no plasma sanguíneo

Os camundongos mdx apresentaram aumento significante da CK (7,4 vezes maior),

quando comparados aos animais controle. Observou-se diminuição significante de 40% da

CK no grupo tratado com ômega-3, quando comparado ao grupo mdx-nujol (Tabela 2).


137,61±77,22 U/L 1021,05±430,62 U/L* 698,48±372,98 U/L*#

Tabela 1: Medida de força dos camundongos do início (8 meses) e final (13 meses)

do tratamento. (*)p≤0,05 com relação ao início do tratamento.

Tabela 2: CK-total. (*)p≤0,05 com relação ao C57BL/10 e (#)p≤0,05 com relação

com mdx-nujol.

22

4.3.2 Níveis de CK cardíaca no plasma sanguíneo

Assim como o observado na CK total, os camundongos mdx apresentaram aumento

significante (3 vezes maior) da CK cardíaca quando comparados aos animais controle. O

tratamento com ômega-3 reduziu significantemente os níveis da CK cardíaca em

comparação aos animais mdx-nujol (Tabela 3).


41,25±9,85 U/L 119,66±19,79 U/L* 86,24±20,44 U/L*#

4.4 Eletrocardiograma (ECG)

Os ECGs realizados nos animais controles C57BL/10 apresentaram amplitudes

normais das ondas P, Q, R, S e T (BIA et al., 1999 - Figura 6), bem como nos intervalos

PR, QRS, QT e QTc (Figura 7).

Observamos algumas alterações no ECG dos animais distróficoss. Notou-se o

aprofundamento da onda Q, diminuição da amplitude S e aumento da amplitude das ondas

R e T em comparação ao animal controle C57BL/10 (Figura 6). A frequência cardíaca, o

intervalo QRS, QT, QTc e o índice de cardiomiopatia estavam aumentados no camundongo

mdx em comparação ao animal controle C57BL/10. Observou-se também que a razão R/S

estava diminuída (Figura 8).

O tratamento com ômega-3 diminuiu a amplitude da onda R e T, bem como os

intervalos QT e QTc em relação ao animal mdx-nujol (Figuras 6 e 7).

Tabela 3: CK-MB. (*)p≤0,05 com relação ao C57BL/10 e (#)p≤0,05 com relação

com mdx-nujol.

23

Figura 6: Histograma representativo da análise quantitativa do ECG em relação às

amplitudes das ondas P, Q, R, S e T dos animais C57BL/10, mdx-nujol e mdx-Ω3. (*)

diferença significativa quando comparado aos animais C57BL/10 (p≤0,05). (#) diferença

significativa quando comparado aos animais mdx-nujol (p≤0,05).

24

Figura 7: Histograma representativo da análise quantitativa do ECG em relação à

frequência cardíaca (FC), intervalo PR, QRS, QT, QTc e índice de cardiomiopatia

dos animais C57BL/10, mdx-nujol e mdx-Ω3. (*) diferença significativa quando

comparado aos animais C57BL/10 (p≤0,05). (#)

diferença significativa quando

comparado aos animais mdx-nujol (p≤0,05).

25

Figura 8: Registro do ECG, índice de cardiomiopatia e razão R:S expressa como

amplitude da onda S em relação a onda R dos camundongos C57BL/10, mdx-

nujol e mdx-3. (*) diferença significativa quando comparado aos animais

C57BL/10 (p≤0,05).

26

4.5 Analise morfológica de animal de 13 meses

4.5.1 Músculo diafragma

Análise qualitativa

O músculo diafragma de animais C57BL/10 idosos apresentou fibras com núcleo

perifério, indicativo de fibras normais. Nos grupos mdx-nujol e mdx-Ω3, foram observadas

fibras com núcleo periférico e fibras com núcleo central, característica de fibras

regeneradas. Áreas com processo inflamatório foram evidenciadas por aumento aparente

de celularidade. Também pode ser notado aumento de fibrose (Figura 9).

Figura 9: A e B: Corte transversal do músculo diafragma corado com tricrômico

de Masson. Animal C57BL/10 (A); Animal mdx-nujol (B). Área de fibrose

(asterisco). C e D: Corte transversal do músculo diafragma corado com HE.

C57BL/10 (C); Animal mdx-nujol (D). Núcleo periférico (seta); núcleo central

(cabeça de seta); área de inflamação (asterisco). Escala 100m.

27

Análise quantitativa

O ômega-3 protegeu o músculo diafragma da distrofinopatia, no estágio tardio da

doença, promovendo aumento das fibras com núcleo periférico (59.07±1.56 NP, mdx-nujol

vs 77.60±4.57 NP, mdx- Ω3) e diminuição significante das fibras com núcleo central

(40.92±1.56 NC, mdx-nujol vs 24.20 NC, mdx-Ω3) quando comparados ao grupo mdx-

nujol. Foi observada redução significante da área de fibrose nos animais tratados com

ômega-3 comparados ao mdx-nujol (43.62±2.62, mdx-nujol vs. 34.72±1.26, mdx-Ω3 –

Figura 10). Não foi observada diferença da área de inflamação entre os grupos mdx.

Figura 10: Comparação entre a porcentagem de fibras com núcleo periférico

(NP), porcentagem de fibras com núcleo central (NC), porcentagem da área de

inflamação (INFL) e porcentagem da área de fibrose do músculo diafragma em

animais C57BL/10, animais mdx-nujol e animais mdx tratados com ômega-3. (*)

diferença significativa quando comparado aos animais C57BL/10 (p≤0,05). (#)

diferença significativa quando comparado aos animais mdx-nujol (p≤0,05).

28

4.5.2 Coração


Não foram observadas áreas de inflamação e fibrose no músculo cardíaco de

animais controle C57BL/10, no envelhecimento. Nos camundongos mdx observou-se área

de inflamação, pouco evidente e área de fibrose, mais evidente em comparação ao

C57BL/10 (Figura 11). O acúmulo de fibrose era maior no ventrículo direito (VD) do que

no SEPTO e ventrículo esquerdo (VE - Figura 11 – coloração verde).

Figura 11: Cortes transversais do músculo cardíaco corado com tricrômico de

Masson. VD: Ventrículo Direito; Septo: Septo Interventricular; VE: Ventrículo

Esquerdo. Área de fibrose (asterisco). Escala: 100m.

29


Não foi observado aumento significativo da área de inflamação nos grupos

estudados (Figura 12). Os animais mdx apresentaram aumento significante da área de

fibrose no coração com relação ao animal controle C57BL/10. Não foi observada diferença

no acúmulo de fibrose entre os gupos mdx-nujol e mdx-Ω3 (Figura 13).

Figura 12: Porcentagem da área de inflamação em relação à área do ventrículo

direito (VD), do septo interventricular (Septo), do ventrículo esquerdo (VE) e da

área de inflamação em relação à área total do coração.

30

4.6 Análise morfológica de animais de 17 meses

4.6.1. Músculo diafragma


Observamos no músculo diafragma de animais mdx de 17 meses fibras com núcleo

perifério, indicativo de fibras normais, fibras com núcleo central, característica de fibras

regeneradas e acúmulo de fibrose (Figura 14).

Figura 13: Porcentagem da área de fibrose em relação à área do ventrículo direito

(VD), do septo interventricular (Septo), do ventrículo esquerdo (VE) e da área de

fibrose em relação à área total do coração. (*) diferença significativa quando

comparado aos animais C57BL/10 (p≤0,05).

31


Não houve diferença significativa do número de fibras com núcleo central e núcleo

periférico entre os grupos mdx-nujol e mdx-ômega-3 nos animais de 17 meses. Observamos

redução significante da área de fibrose nos animais tratados quando comparados ao grupo

mdx-nujol (49.33±5.13, mdx-nujol vs. 45.17±5.29, mdx-Ω3 – Figura 15).

Figura 14: A e B: Corte transversal do músculo diafragma corado com Tricomico

de Masson. Animal mdx-nujol (A); Animal mdx-Ω3 (B). Área de fibrose (asterisco)

Escala: 100m.

32

4.6.2 Coração


Nos camundongos mdx de 17 meses observou-se área de fibrose no ventrículo

direito (VD), septo interventricular (SEPTO) e ventrículo esquerdo (VE), apresentando

maior área no VD (Figura 16).

Figura 15: Comparação entre a porcentagem de fibras com núcleo periférico

(NP), porcentagem de fibras com núcle central (NC) e porcentagem da área de

fibrose do músculo diafragma em animais mdx-nujol e animais mdx tratados

com ômega-3. (#) diferença significativa quando comparado aos animais mdx-

nujol (p≤0,05).

33

Figura 16: Cortes transversais do músculo cardíaco corado com

tricrômico de Masson. VD: Ventrículo Direito; Septo: Septo

Interventricular; VE: Ventrículo Esquerdo. Área de fibrose (asterisco).

Escala: 100m.

34


Observamos nos animais mdx-nujol de 17 meses aumento na área de fibrose de 25%

no ventrículo direito, 33% no septo interventricular, 40% no ventrículo esquerdo e 33% na

área total quando comparado aos animais do mesmo grupo de 13 meses. O tratamento com

o ômega-3 reduziu a área de fibrose nestes animais, sendo significantemente menor no

ventrículo direito (Figura 17).

Figura 17: Porcentagem da área de fibrose em relação à área do ventrículo direito

(VD), do septo interventricular (Septo), do ventrículo esquerdo (VE) e da área de

fibrose em relação à área total do coração. (#) diferença significativa quando


35

4.7 Quantificação do cálcio total


Os camundongos mdx apresentaram aumento significante de cálcio total no músculo

diafragma (71%) quando comparados aos animais controle. Observou-se uma diminuição

significante de 63% do cálcio total no grupo ômega-3, quando comparado ao grupo mdx-

nujol (Figura 18).

4.7.2 Coração

Assim como foi observado no músculo diafragma, o coração dos camundongos mdx

apresentou aumento significante de cálcio total (173%) quando comparado ao coração

controle. Observou-se diminuição significante de 42% do cálcio total no grupo ômega-3,

quando comparado ao grupo mdx-nujol (Figura 19).

Figura 18: Concentração de cálcio total no músculo diafragma (DIA) de animais

controle C57BL/10, animais mdx-nujol e animais mdx tratados com ômega-3. (*)

diferença significativa quando comparado aos animais C57BL/10 (p≤0,05). (#)

diferença significativa quando comparado aos animais mdx-nujol (p≤0,05).

36

4.8 Western blot


No estágio tardio da doença, observou-se aumento nos níveis de TNF-, TGF-1,

MMP-9, MMP-2, TIMP-1, TRPC-1 e 4HNE e diminuição dos níveis de -distroglicana e

calsequestrina no diafragma de animais mdx, em comparação aos músculos de animais

controle C57BL/10. O tratamento com ômega-3 reduziu significantemente o TGF-1,

MMP-9, TIMP-1, TRPC-1 e 4HNE e aumentou significantemente os níveis de

calsequestrina. O tratamento não alterou os níveis de TNF-, MMP-2 e -distroglicana

(Figura 20 e 21).

Figura 19: Concentração de cálcio total no coração (COR) de animais controle

C57BL/10, animais mdx-nujol e animais mdx tratados com ômega-3. (*) diferença

significativa quando comparado aos animais C57BL/10 (p≤0,05). (#)

diferença

significativa quando comparado aos animais mdx-nujol (p≤0,05).

37

Figura 20: western blot do músculo diafragma de animais C57BL/10, mdx-nujol e

mdx-Ω3. Gráfico representando os níveis de TNF-, TGF-1, MMP-9, MMP-2

TIMP-1 e -distroglicana, normalizados pelo GAPDH.. (*) diferença significativa

quando comparado aos animais C57BL/10 (p≤0,05). (#) diferença significativa

quando comparado aos animais mdx-nujol (p≤0,05).

38

4.8.2 Coração

No coração, notamos aumento nos níveis de TNF-, TGF-1, MMP-9, TIMP-1,

TRPC-1 e 4HNE e redução nos níveis de -distroglicana e calsequestrina nos animais mdx

quando comparados aos animais controle C57BL/10. O tratamento com ômega-3 reduziu

significantemente os níveis de TNF- MMP-9, TIMP-1, TRPC-1 e 4HNE e aumentou

Figura 21: western blot do músculo diafragma de animais C57BL/10, mdx-nujol e

mdx-Ω3. Gráfico representando os níveis de Calsequestrina (CSQ), TRPC-1 e 4-

HNE, normalizados pelo GAPDH. (*) diferença significativa quando comparado

aos animais C57BL/10 (p≤0,05). (#) diferença significativa quando comparado aos

animais mdx-nujol (p≤0,05).

39

significantemente os níveis de -distroglicana e calsequestrina. O tratamento com ômega3

não alterou os níveis de TGF-1 e MMP-2 (Figura 22 e 23).

Figura 22: western blot do coração de animais C57BL/10, mdx-nujol e mdx-Ω3. Gráfico

representando os níveis de TNF-, TGF-1, MMP-9, MMP-2, TIMP-1 e -

distroglicana, normalizados pelo GAPDH. (*) diferença significativa quando

comparado aos animais C57BL/10 (p≤0,05). (#)

diferença significativa quando


40

4.9 Metabolômica

Para a implantação da técnica do metaboloma foram realizados alguns testes para

estabelecer qual seria a melhor metodologia para a extração dos músculos. Utilizamos o

músculo quadríceps femoral de animais controle (C57BL/10), uma vez que a extração

desse músculo proporciona grande quantidade de amostra.

Para a obtenção de um bom espectro de RMN em volume total de 600ul (tampão +

amostra), é necessário cerca de 0,1g do tecido. O músculo foi pesado e inserido na solução

Figura 23: western blot do coração de animais C57BL/10, mdx-nujol e mdx-

Ω3. Gráfico representando os níveis de Calsequestrina (CSQ), TRPC-1 e 4-

HNE, normalizados pelo GAPDH. (*) diferença significativa quando

comparado aos animais C57BL/10 (p≤0,05). (#) diferença significativa quando


41

clorofórmio/metanol e feita a extração. Para o primeiro teste, verificamos qual tipo de

extração seria mais eficiente na leitura. Separamos três amostras contendo o mesmo

material e utilizamos as seguintes metodologias de extração: 1) extração da amostra

utilizando o polytron; 2) extração da amostra utilizando o sonicador e; 3) extração da

amostra utilizando tanto o polytron quanto o sonicador. Obtivemos o seguinte espectro

(Figura 24).

Observa-se que a linha verde, espectro da amostra extraída com o sonicador,

apresentou picos mais intensos do que nos demais tipos de extração, indicativo de maiores

concentrações metabólicas. Assim, concluímos que a extração com o sonicador foi mais

eficiente na obtenção e preservação dos metabólitos.

Figura 24: região do espectro de RMN de amostras extraídas por diferentes

maneiras. Em que temos: a) Linha verde: representa o espectro da amostra

controle extraída com o sonicador; b) Linha roxa: representa o espectro da amostra

controle extraída com o polytron e; c) Linha preta: representa o espectro da

amostra controle extraída com o sonicador e o polytron. O espectro representado

na linha vermelha é correspondente a amostra de animais distróficos, utilizado

para verificar as variações metabólicas entre os dois grupos.

42

Após o estabelecimento da metodologia, a extração dos músculos de todos os

grupos foi realizada, bem como a leitura das amostras no aparelho de RMN. Os espectros

foram salvos e analisados com o programa Chenomx. Quando o espectro é lido, tem-se um

intervalo em que é feita a leitura da água, o que interfere na leitura de alguns metabólitos.

Deste modo, retiramos o intervalo em que aparece o pico da água. Em seguida, iniciamos a

correção das linhas de base de todos os espectros.

Os espectros obtidos no aparelho de RMN nem sempre estão alinhados com a linha

de base, apresentando o traçado acima da linha ou abaixo. Portanto, é necessário que se

faça a correção da linha de base de cada espectro (Figura 25). As linhas de base foram

corrigidas com o mesmo padrão em todas as amostras para que não houvesse problema na

quantificação, principalmente quanto a interferência na concentração dos metabólitos.

Após a correção da linha de base iniciamos a análise dos espectros quanto a

quantificação dos metabólitos. Inicialmente, realizamos a quantificação dos metabólitos já

citados em artigos científicos, como por exemplo, a taurina, a creatina, o lactato e a

glutamina, dentre outros. Os intervalos em que os sinais correspondentes a cada metabólito

Figura 25: Exemplo de espectro em que os metabólitos estão alinhados a linha de

base. Áreas contendo mais de um metabólito, denominadas “clusters”, não atingem

a linha base.

43

apareciam foram anotados para que seguíssemos o mesmo padrão de análise em todas as

amostras (Figura 26). Verificamos que os dados por nós obtidos em relação aos animais

controle e mdx estavam de acordo com a literatura (GRIFFIN et al., 2001; GRIFFIN &

DES ROISIERS, 2009; MARTINS-BACH et al., 2012).

Observamos diferenças qualitativas aparentes em alguns metabólitos (por exemplo,

taurina, glicina, lactato, glicerol, creatina), ao compararmos o animal distrófico com o

animal controle. Também verificamos que a droga diminuiu a concentração de alguns

metabólitos (por exemplo, taurina, lactato, glutamina, glicina) comparando-se os mdx com

os mdx-ômega-3, (Figura 27).

Figura 26. Exemplo de espectro já analisado. A linha preta representa o espectro, a

linha vermelha representa os metabólitos analisados. Na tabela, podem-se observar

os espectros analisados e as respectivas concentrações dos metabólitos.

44

Outra análise feita foi a comparação conjunta de três espectros, sendo cada espectro

de um grupo experimental. Através desta análise detectamos novos metabólitos que

aparentemente estavam alterados nos animais do grupo controle vs. animais do grupo mdx

vs. animais do grupo mdx tratado.

Os valores das concentrações obtidos no Chenomx foram analisados no site do

MetaboAnalyst em que se encontra uma ampla variedade de análises. Optamos por realisar

a análise pelo teste ANOVA, teste normalmente utilizado por nós no laboratório e fizemos

também a análise de componentes principais (PCA), análise mais utilizada em artigos

científicos com estudo da metabolômica (GRIFFIN & DES ROISIERS, 2009; MARTINS-

BACH et al., 2012).

4.9.1 Identificação dos metabólitos

Foram identificados 42 metabólitos no músculo diafragma e coração tanto nos

animais controles quanto nos animais distróficos (Tabela 4). O diafragma apresentou maior

número de metabólitos com concentrações diferentes comparado ao coração. Na

Figura 27: Exemplo de região do espectro com três traçados. Linha preta: animal

C57BL/10. Linha verde: animal mdx-nujol. Linha azul: animal mdx-ômega-3.

45

comparação diafragma controle e diafragma mdx, foram observados de 13 a 17 metabólitos

com concentrações diferentes. Já na comparação coração controle e coração mdx, foram

observados de 4 a 8 metabólitos com concentrações diferentes (Tabela 5).

METABÓLITOS COR CT COR MDX COR Ω3 DIA CT DIA MDX DIA Ω3

Taurina 251±103.5 300±79.2 325.4±122.6 248.3±29.31 186±8.4*b 148.6±26.8*#

Lactato 82.4±41 97.5±38.9 80.8±27.1 91.2±20.8 44±1.4*b 31.2±6.8*#

Creatina 73.6±30.2 71.5±21 80.8±31 104.6±23.4 66.5±5.6* 53.5±10.3*#

Oxipurinol 37±14.3 25.4±17.3 15.5±5.6* 167±68.9a 48.8±11.4*

b 35.1±4.4*#

Glutamina 37.7±17.3 45.7±13.9 48.5±19.1 24±5.8 21.5±3.1b 17.8±2.5

Glutamato 31±12 38.7±13.1 38.2±13.1 18.9±3 23.2±3.3b 17.5±3.7#

Alanina 16.9±6.8 21.9±7.9 16.9±6.4 14.3±3.6 15±0.6 8.9±1.8*#

AMP 12.1±4.7 13.1±5.9 15±8.5 4±0.7a 4.9±0.6

b 4.3±0.7

Glicerol 6±2.6 3.3±1.9* 8.7±17.5 7.8±1.3 3.5±0.7* 3.7±0.7*

Aspartato 7±2.5 12.2±5.2* 7.8±3.4# 6.9±2.2 9±2.7 5±1.3#

Malonato 6.6±3.9 5.8±3.1 7.7±4 8.5±3.4 4.4±2.1* 4.5±1.4*

Sucinato 4.9±2.1 6.4±3.3 4.2±1.5 2.6±1.5 2.4±0.9b 1.4±0.5

Acetato 4.4±1.7 4.7±1.4 4.5±1.7 5.5±0.4 5.5±0.6 3.8±0.8*#

Formato 9.2±16.7 2.3±0.9* 1.5±0.5* 1.6±0.08a 1.8±0.2 1.4±0.2

Malato 4.6±2.1 5.7±1.7 5.2±2.4 10.4±1.2a 3.9±1.4* 3.5±0.5*

Glicina 3.2±1.3 4.8±1.4* 5.8±3.4* 8.4±1.5a 9.8±1

b 7.7±1.4#

Lisina 2.9±1.3 2.6±0.9 2.7±0.7 4.6±1.1a 2.6±0.7* 3.1±2.1*

Niacinamida 1.8±0.8 1.2±0.5 1±0.3* 2.1±0.6 1.1±0.1* 0.6±0.2*#

Tabela 4: Concentração dos metabólitos estudados para o músculo diafragma (DIA) e

coração (COR). (a

- azul) diferença significativa quando comparado o COR ct com o

DIA ct (p≤0,05). (b

- verde) diferença significativa quando comparado o COR mdx-

nujol com o DIA mdx-nujol (p≤0,05). (* - vermelho) diferença significativa quando

comparado aos animais C57BL/10 do mesmo músculo (p≤0,05). (#

- laranja) diferença

significativa quando comparado aos animais mdx-nujol do mesmo músculo (p≤0,05).

46

METABÓLITOS COR CT COR MDX COR Ω3 DIA CT DIA MDX DIA Ω3

Glutationa 2.4±1.2 3.3±0.9 4.2±1.8* 1.8±0.8 2.3±0.5 2.5±0.4

Biotina 2.3±1.4 1.5±0.7 2.3±0.8 2.6±0.6 1.5±0.7* 1.7±0.1*

NAD 2.8±2 3.5±1.4 4.2±1.6 1.5±0.8 1.1±0.2b 1±0.1

Carnosina 1.3±0.5 1.2±0.3 1.1±0.3 0.9±0.2 1.1±0.1 0.9±0.2

Leucina 1.2±0.5 1.5±0.5 1±0.2# 1.5±0.1 1.7±0.5 1.2±0.2

Piruvate 0.9±4.8 1±0.2 1±0.4 1.2±0.2 0.9±0.1* 0.6±0.1*#

Valina 1.1±0.4 1.6±0.5* 1±2.1# 1.8±0.1a 1.3±0.6* 1±0.2*#

Adenosina 1.4±0.9 1.1±0.5 1±0.3 0.6±0.5 0.3±0.3b 0.3±0.08

Colina 1.2±0.4 1±0.5 0.9±0.3 2.8±1.5a 1.8±0.8 1±0.3

Creatina fosfato 1.3±0.4 2±0.6* 2±0.7* 3.4±1.2a 3.8±1.9

b 3.5±0.8

Creatinina 0.9±0.4 1±0.3 0.8±0.4 1.4±0.6 0.9±0.3 0.4±0.2#

Fumarato 0.6±0.2 0.6±0.2 0.6±0.3 0.8±0.1 0.4±0.005* 0.3±0.008*

Isoleucina 0.5±0.2 0.7±0.2 0.5±0.1 0.8±0.1 0.7±0.008 0.5±0.1#

N-

acetylglutamina 0.7±0.3 0.9±0.4 0.6±0.4 0.9±1 0.4±0.1

b 0.3±0.1

Piridoxina 1.3±0.6 1.6±0.8 1.6±0.7 0.9±0.2 1±0.2 0.7±0.1

Pirimidina 0.9±0.7 1.1±0.4 1.5±0.8 0.4±0.3 0.4±0.1b 0.3±0.005

Citrato 0.8±0.4 1.7±0.6* 1.5±0.4* 1.4±0.2a 1.8±0.5 1.2±0.2

Metionina 1±0.4 1.2±0.3 1.4±0.4 1.2±0.5 0.8±0.2b 1±0.3

Imidazole 0.4±0.2 0.6±0.2 0.5±0.1 0.7±0.1a 0.6±0 0.4±0.008#

Cholato 0.4±0.2 0.4±0.1 0.4±0.1 0.2±0 0.4±0.2 1.5±2.4

Guanidoacetato 0.7±0.3 0.9±0.2 0.8±0.1 1±0.2 0.7±0.008* 0.5±0.1*

Glicolato 0.6±0.2 1±0.3* 0.9±0.2* 1±0.2a 0.9±0.1 0.8±0.2

Acetamida 0.2±0.1 0.3±0.1 0.5±0.1*# 1.5±2.6 0.2±0.004 0.3±0.004

Carnitina 0.2±0.1 0.4±0.7 0.5±0.9 0.3±0.008 0.4±0.1 0.2±0.008

Dimetilamina 0.008±0.007 0.08±0.006 0.07±0.004 0.1±0 0.1±0 0.06±0.005

47

Grupos comparados Número de metabólitos com concentrações diferentes

Cor ct x Dia ct 12

Cor mdx X Dia mdx 14

Cor ct X Cor mdx 6

Cor ct X Cor mdx-Ω3 8

Cor mdx X Cor mdx-Ω3 4

Dia ct X Dia mdx 13

Dia ct X Dia mdx-Ω3 17

Dia mdx X Dia mdx-Ω3 15

Os metabólitos que apresentaram diferença significativa entre os grupos estudados

estão relacionados ao metabolismo energético (formato, creatina-fosfato, citrato, valina,

leucina, fumarato, malato, piruvato, alanina, glicerol, lactato, creatina e malonato), a vias

do estresse oxidativo (oxipurinol, citrato, valina, leucina, glutationa e lactato) e da

inflamação (acetamida e niacenamida), a formação de colágeno (glicolato e lisina) e a

síntese de outros metabólitos (aspartato e guanidoacetato – tabela 6).

Tabela 5: Número de metabólitos encontrados em maior ou menor

quantidade quando comparado o músculo diafragma (DIA) e coração

(COR), nos diferentes grupos controle, mdx e mdx-Ω3.

48

4.9.2 Comparação entre os grupos

- Diafragma controle e Diafragma mdx-nujol

Quatorze metabólitos estavam mais concentrados no grupo controle quando

comparado ao grupo mdx (taurina, lactato, creatina, oxipurinol, glicerol, malonato, malato,

lisina, niacinamida, biotina, piruvato, valina, fumarato e guanidoacetato – Figura 28;

Tabela 4 e Tabela 7).

Grupo Funcional Metabólitos

Metabolismo energético

Formato, creatina-fosfato, citrato, valina,

leucina, acetato, biotina, guanidoacetato,

fumarato, malato, piruvato, alanina, glicerol,

lactato, creatina e malonato.

Estresse oxidativo Oxipurinol, citrato, valina, leucina,

glutationa, aspartato e lactato.

Inflamação Niacinamida, acetamida e aspartato

Formação de colágeno Glicolato e lisina.

Regeneração Taurina

Tabela 6: Divisão dos metabólitos nos seus respectivos grupos funcionais.

49

- Coração controle e Coração mdx-nujol

Na comparação entre controle e mdx-nujol observamos que dois metabólitos

estavam mais concentrados no grupo controle (glicerol e formato) e cinco metabólitos

estavam mais concentrados no grupo mdx-nujol (aspartato, glicina, valina, creatina-fosfato,

citrato e glicolato – Figura 29; Tabela 4 e Tabela 7).

Figura 28: Concentrações em M dos metabólitos no músculo diafragma que foram

significantemente diferentes entre os grupos C57BL/10 (vermelho) e mdx-nujol

(verde) (p≤0,05).

50

Diafragma Coração

Maior no mdx Menor no mdx Maior no mdx Menor no mdx

Controle vs. mdx -

Taurina, lactato,

creatina,

oxipurinol,

glicerol, valina,

malonato,

malato, lisina,

niacinamida,

biotina, piruvato,

fumarato,

guanidoacetato

Aspartato,

glicina, valina,

creatina-fosfato,

citrato e glicolato

Glicerol e

formato

Tabela 7: Sumário das alterações metabólicas entre os grupos controle C57BL/10 e

mdx-nujol no músculo diafragma e no coração.

Figura 29: Concentrações em M dos metabólitos no coração que foram

significantemente diferentes entre os grupos C57BL/10 (vermelho) e mdx-nujol

(verde) (p≤0,05).

51

- Diafragma mdx-nujol e Diafragma mdx-Ω3

Na comparação entre os grupos mdx e mdx-Ω3 foi observado que oito metabólitos

estavam mais concentrados no grupos mdx sem tratamento quando comparado ao mdx

tratado com ômega-3 (taurina, lactato, alanina, aspartato, acetato, piruvato, creatinina,

creatina, niacinamida, glicina, glutamato, oxipurinol, valina, isoleucina, imidazole – Figura

30; Tabela 4 e Tabela 8).

- Coração mdx-nujol e Coração mdx-Ω3

Entre os grupos mdx e mdx tradado, observamos diferença na concentração de cinco

metabólitos, em que três estavam mais concentrados no grupo mdx-nujol (leucina, valina e

Figura 30: Concentrações em M dos metabólitos no músculo diafragma que foram

significantemente diferentes entre os grupos mdx-nujol (verde) e mdx-3 (vermelho)

(p≤0,05).

52

isoleucina) e dois metabólitos estavam mais concentrado no grupo mdx-Ω3 (aspartato e

acetamida – Figura 31; Tabela 4 e Tabela 8).

Diafragma Coração

Maior no mdx Ω-3 Menor no mdx Ω-3 Maior no mdx Ω-3 Menor no mdx Ω-3

mdx vs. mdx-3 -

Taurina,

alanina,

aspartato,

acetato,

formato,

piruvato e

valina.

Acetamida. Valina, leucina,

aspartato.

Tabela 8: Sumário das alterações metabólicas entre os grupos mdx-nujol e mdx-Ω3 no

músculo diafragma e no coração.

Figura 31: Concentrações em M dos metabólitos no Coração que foram

significantemente diferentes entre os grupos mdx-nujol (verde) e mdx-3 (vermelho)

(p≤0,05).

53

4.9.3 Análise de componentes principais (PCA)

A análise de PCA é uma das análises mais utilizadas na RMN. Através dessa análise

é possível identificar os metabólitos que caracterizam cada grupo estudado, conforme

mostrado a seguir:

- Diafragma controle e Diafragma mdx-nujol

Na análise do músculo diafragma entre os grupos controle e mdx-nujol observamos

que os dois grupos estavam separados um do outro (Figura 32). Observamos que os

metabólitos creatina, malonato, lisina, taurina, lactato, oxipurinol, glicerol, piruvato,

fumarato, acetamida, imidazole, guanidoacetato, valina, biotina e malato se destacaram

mais no grupo controle, enquanto os metabólitos citrato, piridoxina e colato se destacaram

no animal mdx-nujol (Figura 33).

Figura 32: Gráfico de escores PC1 (31,9%) x PC2 (20,5%) das amostras do

músculo diafragma dos grupos controle (vermelho) e mdx-nujol (verde).

54

- Diafragma mdx-nujol e Diafragma mdx-Ω3

A distinção entre os grupos mdx-nujol e mdx-Ω3 no músculo diafragma só não foi

completa pelo pool de animais do número 174, que se assemelhou muito ao grupo mdx-

nujol (Figuras 34 e 35).

Figura 33: Gráfico biplot dos metabólitos do músculo diafragma dos grupos

controle e mdx-nujol.

55


músculo diagragma dos grupos mdx-nujol (verde) e mdx-Ω3 (vermelho).

56

- Coração controle e Coração mdx-nujol

Na análise do coração entre os grupos mdx-nujol e controle, não foi observada

distinção total entre os grupos (Figura 36). Observamos que os metabólitos formato,

glicerol, niacinamida e oxipurinol se destacaram mais no grupo controle, enquanto o

metabólito carnitina se destacou mais no coração mdx-nujol (Figura 37).

Figura 35: Gráfico biplot dos metabólitos do músculo diafragma dos grupos

mdx-nujol e mdx-Ω3.

57


coração dos grupos controle (vermelho) e mdx-nujol (verde).

58

- Coração mdx-nujol e Coração mdx-Ω3

Assim como observado na comparação do coração entre os grupos mdx-nujol e

controle, observamos que muitos metabólitos eram comuns aos grupos mdx-nujol e mdx-Ω3

(Figura 38). Metabólitos como a pirimidina, acetamida, glutationa, biotina, glicerol

caracterizaram mais o grupo mdx-Ω3, enquanto os metabólitos como oxipurinol, aspartato,

sucinato, leucina e valina caracterizaram mais o grupo mdx-nujol (Figura 39).

Figura 37: Gráfico biplot dos metabólitos do coração dos grupos controle e

mdx-nujol.

59


coração dos grupos mdx-nujol (verde) e mdx-Ω3 (vermelho).

60

Figura 39: Gráfico biplot dos metabólitos do coração dos grupos mdx-nujol e

mdx-Ω3.

61

5. Discussão

5.1 Quanto ao efeito do ômega-3 na massa corporal e medida de força

Sabe-se que danos na musculatura cardíaca se manifestam tardiamente no

camundongo mdx, com expressivo acúmulo de fibrose (LOHAN et al., 2005; SPURNEY,

2011). Atualmente, anti-inflamatórios esteroides são amplamente utilizados para a terapia

da DMD. Entretanto, em decorrência dos seus efeitos colaterais, outras drogas são

investigadas (MOXLEY et al., 2005). Sabe-se que o ômega-3 apresenta atividade anti-

inflamatória e antioxidante. Acredita-se também que ele possa estar envolvido na

modulação de canais iônicos. Em estudo prévio, demonstramos que o ácido

eicosapentaenoico (EPA) purificado (MACHADO et al., 2011) ou cápsulas de ômega-3

contendo EPA + ácido docosahexaenóico (DHA – FOGAGNOLO MAURICIO et al.,

2013), atenuaram a mionecrose em músculos esqueléticos de camundongos mdx durante os

estágios iniciais da doença. No presente trabalho verificamos o efeito do ômega-3 no

estágio tardio da doença.

A dosagem de ômega-3 utilizada neste trabalho foi de 300mg/kg, o que está de

acordo com a dosagem recomendada para humanos que é de 3 a 5g/dia, segundo a

normalização utilizada para converter a dose utilizada em animais para os humanos

(REAGN-SHAW, NIHAL & AHMAD, 2008). Em adição, sabe-se que o ômega-3 começa

a apresentar toxicidade a partir da dosagem de 5g/kg (TISDALE & DHESI et al., 1990). No

decorrer do tratamento não houve diferença entre os grupos C57BL/10, mdx-nujol e mdx-

Ω3 quanto a mortalidade e massa corporal. Não ocorreram óbitos e a massa corporal não se

modificou durante o período do tratamento, em todos os grupos. Isto sugere que, na dose

utilizada, o ômega-3 não provocou nenhum efeito colateral no camundongo mdx no estágio

mais tardio da doença. O nujol, óleo mineral utilizado para o tratamento dos animais

controles C57BL/10 e mdx, também não apresentou nenhum efeito colateral nos

camundongos.

Observamos ganho da força ao longo do tempo em todos os grupos estudados.

Porém, o ganho da força foi significante somente nos grupos C57BL/10 e mdx-ômega3

(18%, C57BL/10 vs. 5%, mdx-nujol vs. 17%, mdx-ômega-3). Concomitantemente à

melhora das características histopatológicas do diafragma, a análise funcional indicou que o

62

ômega-3 permitiu maior ganho de força muscular, provavelmente pela redução da

mionecrose (redução da CK), com consequentemente redução da fibrose. Sabe-se que com

a preservação das fibras musculares tem-se a diminuição da fibrose (TANIGUITI et al.,

2011).

5.2 Quanto ao efeito do ômega-3 nos níveis plasmáticos da creatina quinase

(CK) total e creatina quinase cardíaca (CK-cardíaca)

Sabe-se que pacientes com DMD e camundongos mdx, apresentam aumento nos

níveis séricos da CK (BULFIELD et al., 1984; ENGEL, YAMAMOTO & FISCHBECK,

1994). A CK é o biomarcador mais usado para diagnosticar a DMD, sendo utilizado como

primeiro sinal de diagnóstico da doença. A CK-cardíaca tem sido usada como biomarcador

específico para alterações no miocárdio (LOTT & STANG, 1980; KEMP et al., 2004).

No presente trabalho observamos que os níveis séricos da CK-total (indicativo de

degeneração muscular) e da CK-cardíaca (indicativo de danos no miocárdio), estavam

aumentados no grupo mdx-nujol quando comparado ao grupo controle C57BL/10. O

tratamento com ômega-3 reduziu significantemente em 40% a CK total e em 25% a CK

cardíaca.

Acredita-se que a diminuição da CK-total esteja relacionada à proteção contra a

mionecrose, observada com a redução de fibras com núcleo central no músculo diafragma,

indicativo de fibras que sofreram degeneração e regeneração. Quanto a diminuição da CK-

cardíaca, embora não tenha sido notado efeitos protetores quanto a morfologia no músculo

cardíaco, notou-se redução dos níveis do TNF- e MMP-9, mediadores da inflamação

(ABDEL-SALAM, ABDEL-MEGUID & KORRAA, 2009; FUKUSHIMA et al., 2007) no

músculo cardíaco dos camundongos mdx tradados com ômega-3. Sabe-se que intensa

infiltração de células imunes no local da injúria, gera inflamação crônica e mionecrose

(EMERY, 2002). Em adição, sabe-se que a CK-cardíaca é expressa no músculo esquelético.

Assim, pacientes com lesão na musculatura esquelética podem apresentar alterações na CK-

cardíaca (KEMP et al., 2004). Portanto, a redução nos níveis da CK total pode também ter

influenciado a redução da CK cardíaca.

63

5.3 Quanto ao efeito do ômega-3 no eletrocardiograma

Camundongos mdx apresentam danos progressivos na musculatura cardíaca (BIA,

RADDA & CLARKE, 1999). Por volta do sexto e oitavo mês de vida, já é possível

observar deposição de fibrose no coração destes animais (TANIGUTI et al., 2011). A

cardiomiopatia se instala tardiamente e ao redor do décimo mês já é observada diminuição

da função cardíaca (SPURNEY et al., 2008; BURELLE et al., 2010).

Assim como em estudos anteriores (BIA, RADDA & CLARKE, 1999; MOREIRA

et al., 2013), os ECGs dos camundongos mdx estavam alterados, demonstrando disfunção

cardíaca. Os animais controle C57BL/10 não apresentaram alterações na idade estudada (13

meses).

Nos animais mdx-nujol, os achados eletrocardiográficos revelaram aprofundamento

da onda Q, aumento da amplitude T e diminuição da amplitude S e na razão R/S, bem

como prolongamento dos intervalos QRS, QT e QTc. Observamos ainda que a FC e o

índice de cardiomiopatia estavam aumentados no camungongo mdx em comparação ao

animal C57BL/10. Esses achado estão de acordo com estudos anteriores (BIA, RADDA &

CLARKE, 1999; MOREIRA et al., 2013). Sugere-se que estas alterações

eletrocardiográficas sejam decorrentes da presença de tecido fibroso na musculatura

cardíaca destes animais (WEHLING-HENRICKS et al., 2005; CHU et al., 2002;

HAINSEY et al., 2003).

O tratamento com o ômega-3 melhorou alguns parâmetros eletrocardiográficos

quando comparado aos animais mdx-nujol. Observamos diminuição da amplitude das ondas

R (corresponde a despolarização ventricular) e T (corresponde a repolarização ventricular),

bem como os intervalos QT (corresponde a atividade elétrica, despolarização e

repolarização ventricular e indicativo de morte súbita) e QTc (corresponde ao intervalo QT

corrigido pela frequencia cardíaca, segundo a fórmula de Bazett – BOSTICK et al., 2008).

Comumente a melhora funcional da cardiomiopatia é atribuída a redução da fibrose,

fator que interfere na condução elétrica dos impulsos cardíacos (WHELING-HENRICKS et

al., 2005; MOREIRA et. al, 2013). No presente trabalho, embora não tenha sido observada

diferença significante quanto ao acúmulo de fibrose no músculo cardíaco entre os grupos de

camundongos mdx, observamos uma tendencia a diminuição da fibrose tanto no ventrículo

64

direito quanto no ventrículo esquerdo dos animais mdx tratados com ômega-3. Em adição,

observou-se que o ômega-3 reduziu a concentração de cálcio total bem como os níveis de

TRPC1 (ambos discutidos a seguir).

Sabe-se que parametros do ECG apresentam melhoras quando há redução de cálcio

intracelular nos camundongos mdx (SHIN et al., 2011). Assim, sugerimos que a melhora

nos parâmetros ECG possa estar relacionada a capacidade do ômega-3 em afetar canais de

cálcio, ou canais de sódio e potássio dependentes, mas estudos futuros são necessários para

melhor compreensão deste resultado.

5.4 Quanto ao efeito do ômega-3 no músculo diafragma nos estágios tardios da

doença

Sabe-se que a falta da distrofina acarreta diversos danos à fibra muscular gerando

inflamação crônica e mionecrose (ENGEL, YAMAMOTO & FISCHBECK, 1994). Após o

processo inflamatório, tem-se a ativação e proliferação de células satélites as quais irão se

fundir para formarem miotubos. A diferenciação de miotubos em miofibras e a deposição

de tecido conjuntivo ocorrem como etapa final da regeneração (TIDBALL, 2005). Sabe-se

que simultaneamente à reação inflamatória ocorre deposição de fibrose (BERNASCONI et

al., 1995). A fibrose muscular é uma característica morfológica evidente encontrada em

indivíduos afetados pela DMD e em de camundongos mdx idosos (ENGEL, YAMAMOTO

& FISCHBECK, 1994).

Verificamos o efeito do ômega-3 em animais mdx com 13 meses de idade, uma vez

que a fibrose é significantemente maior com o avançar da idade. Tratamos os animais

durante cinco meses (8-13 meses de idade ao sacrifício) via gavagem três vezes por

semana. Sabe-se que o ômega-3 apresenta atividades que podem interferir na mionecrose e

inflamação, bem como interferir na composição da membrana fosfolipídica (POUND et al.,

2001; FOGAGNOLO MAURICIO et al., 2013). O consumo de ômega-3 promove ainda a

diminuição de espécies reativas de oxigênio, que de uma maneira geral contribuem para o

dano tecidual (KAJIKAWA et al., 2010; XIE et al., 2011)

No diafragma, o ômega-3 protegeu contra a degeneração, levando a um aumento na

quantidade de fibras com núcleo periférico e diminuição na quantidade de fibras com

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kajikawa%20S%22%5BAuthor%5D

65

núcleo central, indicando preservação de fibras íntegras, que não sofreram processo de

degeneração (fibras com núcleo periférico) e diminuição da mionecrose (fibras com núcleo

central). Concomitante a proteção contra a mionecrose, observou-se no grupo tratado com

ômega-3 uma redução significante na área de fibrose quando comparado ao grupo mdx-

nujol. Sabe-se que com a preservação das fibras musculares tem-se a diminuição da fibrose

(TANIGUITI et al., 2011). Isto sugere que o ômega-3 diminuiu a distrofinopatia no estágio

tardio da doença. Tanto no grupo mdx-nujol quanto no grupo mdx-ômega3, foi observada

pouca área de inflamação, que pode ser explicada pela idade avançada dos animais.

O TGF-1 está diretamente envolvido na deposição de fibrose nos músculos

distróficos (YAMAZAKI et al., 1994; BERNASCONI et al., 1995; TANIGUTI et al.,

2011). Terapias com drogas antifibróticas e com anti-inflamatórios diminuem a expressão

de TGF-1 e consequentemente a deposição de fibrose no músculo (HARTEL et al., 2001;

TANIGUTI et al., 2011; MOREIRA et al., 2013). No presente trabalho, observamos

diminuição significante da fibrose no diafragma de animais mdx tratados com ômega-3,

provavelmente devido à diminuição dos níveis de TGF-1 observados neste músculo. Este

resultado está de acordo com a observação de que o EPA diminui a expressão do mRNA do

TGF-1 em músculo liso vascular de ratos hipertensos (NAKAYAMA et al., 1999).

Sabe-se que os níveis do TNF- estão elevados nos estágios iniciais da doença, em

que se encontram picos de inflamação e um amplo processo de degeneração/regeneração

(SPENCER & TIDBALL, 2001; GROUNDS, 2004; TIDBALL, 2005). Não observamos

diferença significativa quanto aos níveis de TNF- entre os grupos mdx-nujol e mdx-

ômega-3. Acreditamos que, devido ao estágio tardio da doença, o TNF-, proteína

relacionada ao processo de inflamação, não estava em níveis muito elevados para que o

tratamento pudesse ter efeito, o contrario do observado nos estágios iniciais da doença

(FOGAGNOLO MAURICIO et al., 2013).

Concluímos que o tratamento de longa duração com ômega-3 melhora a

distrofinopatia e protege o músculo diafragma de animais idosos.

66

5.5 Quanto ao efeito do tratamento com ômega-3 na histopatologia cardíaca

Um dos objetivos deste trabalho foi verificar os efeitos do ômega-3 no coração do

camundongo mdx idoso. A cardiomiopatia é responsável pela morte de 30 a 40% dos

pacientes DMD que ultrapassam os 20 anos de idade. O entendimento dos mecanismos da

cardiomiopatia é de grande relevância para o desenvolvimento de novas terapias para a

DMD (SPURNEY, 2011).

No mdx, a cardiomiopatia se instala tardiamente, ao redor do 8-9 meses de idade.

Intensa deposição de fibrose e processo inflamatório progressivo levam a alterações

funcionais, observadas tanto em eletrocardiogramas quanto em ecocardiogramas do

camundongo mdx (BOSTICK et al., 2008; SPURNEY et al., 2008). Interessante ressaltar

que os músculos cardíaco e estriado esquelético, não obstante a falta de distrofina, ambos

apresentam mecanismos distintos da distrofinopatia (DUAN 2006; BOSTICK et al., 2009).

Evidências disto se originam da observação de que drogas que melhoram a distrofinopatia

em músculos estriados esqueléticos podem agravar a cardiomiopatia. A estreptomicina, por

exemplo, melhora a patologia do músculo tibial anterior do mdx, mas não afeta o músculo

diafragma e, no músculo cardíaco, agrava a distrofinopatia (JORGENSEN et al., 2011). O

contrário também é observado, em que o losartan previne a cardiomiopatia e não melhora a

patologia de músculos esqueléticos estriados (BISH et al., 2011). Desta forma, torna-se

fundamental a análise dos efeitos do ômega-3 no coração dos mdx.

Estudos demonstraram que entre o sétimo e o décimo segundo mês de vida,

camundongos mdx apresentam considerável aumento de fibrose nos músculos diafragma e

coração (HAINSEY et al., 2003; QUINLAN et al., 2004; TANIGUTI et al., 2011). Com

base nesses dados, utilizamos animais mdx com oito meses de idade para verificar os

efeitos dos ácidos graxos na cardiomiopatia. Uma vez que a fibrose cardíaca é

significantemente maior com o avançar da idade e que a terapia farmacológica na DMD se

estende por longo período, tratamos os animais durante cinco meses (13 meses de idade a

eutanásia).

No músculo cardíaco do camundongo mdx, há controvérsias quanto a

predominância de fibrose em relação aos ventrículos. Alguns autores relatam que a fibrose

parece ser maior no ventrículo esquerdo do que no direito (SPURNEY et al., 2008; AU et

67

al., 2011), enquanto outros, relatam que os dois ventrículos são igualmente acometidos

(QUINLAN et al., 2004). No presente trabalho, observamos acúmulo significantemente

maior de fibrose no ventrículo direito. Provavelmente, o ventrículo direito encontra-se mais

acometido pela fibrose devido ao maior comprometimento do músculo diafragma, que pode

trazer complicações respiratórias nos estágios mais avançados da doença. Coerente com

esta hipótese é o fato de que a hipertensão pulmonar e a insuficiência respiratória podem

levar ao aumento da pressão pulmonar e danos no ventrículo direito (MELACINI et al.,

1996).

No presente trabalho, não observamos efeito do ômega-3 na fibrose do músculo

cardíaco nos animais de 13 meses. Uma das possibilidades para explicar esse resultado

seria a de que o diafragma, por apresentar mais fibrose que o coração (44% de fibrose no

diafragma e 9 % de fibrose no coração do mdx não tratado), possibilitou que os efeitos

protetores do ômega-3 sobre a fibrose fossem mais facilmente observados neste músculo,

do que no cardíaco.

Com base nesses resultados, estudamos um grupo de animais com idade mais

avançada (17 meses a eutanásia). O tratamento com ômega-3 reduziu significantemente a

fibrose no ventrículo direito dos animais de 17 meses (30%) quando comparado aos

animais mdx-nujol da mesma idade. Em adição, o aumento de fibrose no ventrículo direito,

septo interventricular e ventrículo esquerdo no grupo mdx-nujol de 17 meses foi

respectivamente de 23%, 45% e 42% quando comparado ao mesmo grupo de 13 meses. Já

no grupo mdx-Ω3 de 17 meses, observamos redução na fibrose de 8% no ventrículo direito

e 17% no ventrículo esquerdo quando comparado ao grupo mdx-nujol 13 meses. Assim, o

ômega-3 se mostrou eficiente na prevenção quanto a deposição de fibrose no coração em

animais mais velhos, em que há um aumento da fibrose.

Os camundongos mdx de 13 meses apresentaram níveis elevados de TNF-e TGF-

no coração quando comparados aos animais controle C57BL/10. O TNF- está

relacionado diretamente à inflamação (ABDEL-SALAM, ABDEL-MEGUID & KORRAA,

2009; FUKUSHIMA et al., 2007). A pouca área de inflamação encontrada na análise

morfológica, contradizendo os níveis elevados de TNF- pode ser justificada pelo fato do

aumento dessa proteína anteceder o processo inflamatório (FUKUSHIMA et al., 2007;

68

MAGEE, PEARSON & ALLEN, 2008; ABDEL-SALAM, ABDEL-MEGUID &

KORRAA, 2009).

O tratamento com ômega-3 reduziu significantemente os níveis de TNF-, que está

de acordo com estudos anteriores (SUZUKI et al., 1997; MACHADO et al., 2011;

FOGAGNOLO MAURICIO et al., 2013). Acredita-se que os efeitos anti-inflamatórios do

ômega-3 estejam relacionados ao fato de que estes ácidos graxos interferem no

metabolismo do ácido araquidônico. Assim, o ômega-3, ao competir com a ciclooxigenase

e lipooxigenase, enzimas que metabolizam o ácido araquidônico em prostaglandinas e

leucotrienos, inibe a produção destes eicosanoides, bem como a de citocinas pró-

inflamatórias, tal como o TNF- (BABCOCK, HELTON & ESPAT, 2000; JAMES,

GIBSON & CLELAND, 2000; JOUSSEN et al., 2002; WELDON et al., 2007; RIEDGER

et al., 2009; ANDER et al., 2010). Quanto ao TGF- importante mediador da fibrose

(ROBERTS et al., 1986; YAMAZAKI et al., 1994), verificamos que o ômega-3 não

interferiu nos níveis desta citocina, o que está de acordo com os resultados obtidos na

análise morfológica da fibrose.

5.6 Quanto ao efeito do ômega-3 no cálcio

Vários mecanismos estão envolvidos na patofisiologia do animal distrófico

(MARQUES, 2004). O aumento intracelular do cálcio é um dos fatores importantes para a

patogênese do animal distrófico, o qual está relacionado à ativação de proteases e produção

de espécies reativas de oxigênio, que causam lesões no sarcolema e consequente

mionecrose e processo inflamatório (para revisão vide WHITEHEAD, YEUNG & ALLEN,

2006).

Observamos nos animais distróficos, tanto no músculo cardíaco, quanto no músculo

esquelético, aumento da concentração de cálcio total quando comparados aos animais

controle C57BL/10.

O cálcio total encontra-se elevado em músculos distróficos, tanto em modelos

experimentais (DUNN & RADDA, 1991; YOSHIDA et al.; 1997; PEREIRA et al., 2014),

bem como em pacientes com DMD (MAUNDER-SEWRY et al.,1980). A possibilidade de

realizar esta medida em biópsias humanas torna-a de grande valor sob o ponto de vista

69

clínico, o que nos motiva a sempre avaliar este parâmetro em nossos estudos no mdx, que

por sua vez oferece uma avaliação pré-clínica.

Em nosso laboratório, demonstramos que drogas que inibem a entrada de cálcio na

fibra, tais como o verapamil, diltiazem (inibidores de canais de cálcio voltagem-

dependentes; MATSUMURA et al., 2009) e a estreptomicina (inibidor de canal de cálcio

ativado por estiramento, TRPC1; MATSUMURA et al., 2011), diminuem o cálcio total em

diferentes músculos do mdx, concomitante a diminuição da mionecrose. Assim, podemos

assumir que o cálcio total é um bom indicativo dos fenômenos intracelulares relacionados

ao cálcio, uma vez que o aumento do influxo de cálcio devido a instabilidade do sarcolema

e alterações em canais de cálcio pela falta da distrofina, leva a mionecrose, e também a

diminuição do cálcio total ocorre concomitante com a diminuição da mionecrose

(WHITEHEAD, YEUNG & ALLEN, 2006).

O ômega-3 reduziu os níveis de cálcio total no coração em 42% e no diafragma em

63%. Concomitante a isto, observamos aumento da -distroglicana (discutido a seguir) e

diminuição do TRPC-1 (discutido a seguir). Estes dois efeitos do ômega-3 podem ter

contribuído indiretamente para a diminuição do cálcio total: o primeiro, por auxiliar na

estabilidade da membrana (aumento da -distroglicana) e o segundo, por possivelmente

diminuir a entrada de cálcio (níveis menores de TRPC1).

Uma segunda explicação para a diminuição do cálcio total pelo ômega-3 poderia

estar relacionada ao fato deste se incorporar na membrana (STULNIG et al., 2001; YE et

al., 2010). Previamente, demonstramos que o ômega-3 diminui o numero de fibras positivas

ao Azul de Evans, marcador que indica alteração na permeabilidade da fibra muscular

(FOGAGNOLO MAURICIO et al., 2013), sugerindo melhora da estabilidade da fibra.

Assim, através de uma ação direta, o ômega-3 poderia promover a estabilidade da

membrana e, em consequência, haver possível redução da entrada de cálcio.

O TRPC-1 é um mediador da entrada de cálcio intracelular, que está aumentado nos

camundongos mdx (VANDERBROUCK et al., 2002; ZANOU et al., 2010). Concomitante

ao aumento da concentração de cálcio, observamos aumento na expressão do TRPC-1 nos

animais distróficos quando comparados aos animais controle. O tratamento com ômega-3

também reduziu significantemente a expressão do TRPC-1 no coração e no diafragma.

70

Acredita-se o ômega-3 possa estar envolvido na modulação de canais iônicos (YE et al.

2010). Uma vez incorporado na membrana fosfolipídica, o ômega-3 pode alterar a

corformação do TRPC-1 e consequentemente o influxo de cálcio intracelular (STULNIG et

al., 2001; YE et al., 2010).

Acredita-se que um dos principais fatores que levam a degeneração seja o aumento

do cálcio intracelular. A calsequestrina participa da homeostase do cálcio intracelular.

Localizada no retículo sarcoplasmático, a calsequestrina se liga ao cálcio durante o

relaxamento muscular, tamponando o cálcio liberado durante a contração (YANO &

ZARAIN-HERZBERG, 1994; BEARD, LAVER & DULHUNTY, 2004). Os níveis de

calsequestrina estão diminuídos no camundongo mdx (FERRETTI et al., 2009; PERTILLE

et al., 2010). O ômega-3 aumentou os níveis da calsequestrina nos dois grupos musculares

estudados.

Acredita-se que o aumento de cálcio intracelular possa reduzir a capacidade do

retículo sarcoplasmático em armazenar o cálcio, sugerindo que isso seja uma das causas da

redução dos níveis de calsequestrina no animal distrófico (DOWLING, LOHAN &

OHLENDIECK, 2003; DORAN et al., 2004). Isto sugere que o ômega-3 também possa

participar de mecanismos de regulação do cálcio, tendo em vista que ele reduziu os níveis

de TRPC-1 e aumentou os níveis de calsequestrina.

5.7 Quanto ao efeito do ômega-3 no 4HNE

Sabe-se que a falta da distrofina no camundongo distrófico está envolvida com o

aumento do estresse oxidativo nestes animais (RANDO et al., 1998; NAKAE et al., 2004).

Acredita-se que isso esteja relacionado ao fato dos camundongos mdx apresentarem

aumento de cálcio intracelular com consequente ativação de proteases e espécies reativas de

oxigênio (WHITEHEAD, YEUNG & ALLEN, 2006; KIM et al., 2013). No presente

trabalho, estudamos os níveis de 4-hydroxynonenal (4HNE) como marcador da

peroxidação lipídica (ZARKOVIC et al., 2003). Observamos que os níveis de 4HNE

estavam elevados tanto no músculo diafragma, quanto no coração dos camundongos mdx

em comparação aos animais controle.

71

Há contradições na literatura quanto ao efeito antioxidante do ômega-3. Alguns

trabalhos descrevem que a ingestão de ômega-3 pode elevar o número de espécies reativas

de oxigênio (MELO et al., 2010; AL-GUBORY, 2012). Entretanto, há estudos que

demonstram a capacidade antioxidante do ômega-3 (TAKAHASHI et al., 2002;

KANJIKAWA et al., 2010; FRAN, ZIRPOLI & QI, 2013). Neste trabalho observamos que

o tratamento com ômega-3 reduziu os níveis de 4HNE nos dois músculos estudados.

Acredita-se o ômega-3 possa atuar contra espécies reativas de oxigênio aumentando a

atividade de moléculas que diminuam a produção das espécies reativas de oxigênio

(RICHARD et al., 2009).

5.8 Quanto ao efeito do ômega-3 nas MMPs e TIMP-1

Em processos patológicos, as MMPs estão em níveis elevados, uma vez que

participam da formação, remodelamento e degradação de componentes da matriz

extracelular (FUKUSHIMA et al., 2007; PEREIRA et al., 2014). Os camundongos mdx

apresentaram níveis elevados da MMP-9 e MMP-2 no músculo diafragma e da MMP-9 no

coração e níveis quando comparados aos animais controle. Observamos que o tratamento

com ômega-3 reduziu significantemente os níveis da MMP-9 tanto no coração, quanto no

diafragma.

Sabe-se que as TIMPS, inibidores teciduais endógenos, controlam a atividade

enzimática das MMPs nos camundongos mdx (DAHIYA et al., 2011). Assim como as

MMPs a TIMP-1 estava aumentada nos animais mdx quando comparados ao controle. O

ômega-3 reduziu os níveis da TIMP-1 nos dois músculos estudados. Sabe-se que o balanço

entre MMPs e TIMPs é importante para o remodelamento da matriz extracelular (MOORE

et al., 2012). Assim, acreditamos que devido a ação inibitória do ômega-3 na MMP-9,

houve consequente redução nos níveis da TIMP-1, uma vez que a sua produção está

diretamente relacionada a das MMPs (MORRE et al., 2012). Embora seja sugerido que as

TIMPs não possuem especificidade para uma determinada MMP, a TIMP-1 parece atuar

preferêncialmente na MMP-9 (GOMES et al., 2012).

72

5.9 Quanto ao efeito do ômega-3 na -distroglicana

Sabe-se que, em ausência da distrofina, outras proteínas do CDG também estão

diminuídas (ERVASTI, 2007; LOHAN, CULLIGAN & OHLENDIECK, 2005). Assim

como descrito anteriormente (DOWLING, LOHAN J & OHLENDIECK, 2003;

MATSUMURA et al., 2009), observamos que a -distroglicana está reduzida no mdx em

comparação ao controle, nos músculos cardíaco e diafragma. O ômega-3 elevou os níveis

da -distroglicana no músculo cardíaco, atingindo valor próximo ao encontrado nos

animais controle. A -distroglicana é uma proteína que conecta a distrofina com a laminina,

na matriz extracelular, tendo portanto papel fundamental na manutenção da estabilidade do

sarcolema e na manutenção do CDG (BARRESI & CAMPBEL et al, 2006). Uma vez que a

-distroglicana é degradada pela MMP-9 (MICHALUK et al., 2007; LI et al., 2009),

acreditamos que o efeito do ômega-3 na MMP-9 possa ter contribuído para o aumento da

expressão da -distroglicana, fato já observado com outras drogas que inibiram a MMP-9,

tais como a suramina (TANIGUTI et al., 2012).

O mesmo não foi observado no músculo diafragma. Acreditamos que o efeito do

ômega-3 na -distroglicana não tenha sido eficaz no diafragma devido as condições

patológicas desse músculo. Pode-se relacionar expressão dos níveis da -distroglicana aos

danos da fibra muscular (DOWLING, LOHAN J & OHLENDIECK, 2003). Sabe-se que o

diafragma é o músculo mais afetado no camundongo mdx (STEDMAN et al., 1991;

ISHIZAKI et al., 2008).

5.10 Quanto ao metaboloma

Quanto a implantação da técnica metabolômica, observamos que o uso do sonicador

para a extração proporcionou uma leitura melhor do perfil metabólico quando comparado

ao uso do polytron e do polytron+sonicador. Assim, o uso do sonicador para a extração das

amostras foi mais eficiente quanto a quantidade de metabólitos expressos no espectômetro

do que nas demais técnicas testadas ( Figura 24).

Baseado em dados já descritos (GRIFFIN & DES ROISIERS, 2009; MARTINS-

BACH et al., 2012), separamos primeiramente uma lista de 25 metabólitos para dar início a

73

análise dos espectros do coração e do músculo diafragma, dos três grupos estudados.

Observamos diferença qualitativa na concentração de alguns destes metabólitos, como a

taurina, creatina, glutamato, glutamina e lactato entre os grupos estudados. Em adição,

analisamos o espectro dos três grupos juntos e separamos mais uma lista de 20 metabólitos

que, aparentemente, apresentavam alterações entre os grupos. Tendo em mãos os dados dos

metabólitos analisados, foi necessário estudar as vias metabólicas que cada um estava

relacionado.

Assim como descrito anteriormente (GRIFFIN & DES ROISIERS, 2009;

GULSTON et al., 2008; MARTINS-BACH et al., 2012; XU et al., 2012), observamos que

os metabólitos lactato, creatina, creatina-fosfato, glicerol, valina, aspartato e taurina

estavam alterados nos camundongos mdx quando comparados aos animais controle. No

presente estudo, observamos ainda alterações nos metabólitos formato, piruvato, citrato,

fumarato, malato, malonato, guanidoacetato, biotina, lisina, niacinamida, glicolato e

oxipurinol. Sabe-se que camundongos mdx apresentam alterações metabólicas quando

comparados a animais controle (GRIFFIN & DES ROISIERS, 2009; GULSTON et al.,

2008; MARTINS-BACH et al., 2012; XU et al., 2012). Em adição, as alterações

metabólicas podem apresentar variações decorrentes da idade e/ou da evolução da

distrofinopatia (GULSTON et al., 2008; MARTINS-BACH et al., 2012).

Sabe-se que o metabolismo energético do camundongo mdx está alterado (DUNN,

TRACEY & RADDA, 1993; EVEN, DECROUY & CHINET, 1994). Observamos que

metabólitos relacionados com a produção de energia celular estavam alterados no grupo

mdx, quando comparado ao grupo controle (lactato [d-], creatina[d-], creatina-fosfato [c+],

glicerol [c-,d-], glicina [c+] valina [c+;d-], formato [c-], piruvato [d-], citrato [c+], fumarato

[d-], malato [d-], malonato [d-], guanidoacetato [d-] e biotina [d-] – em que [d] se refere ao

diafragma, [c] ao coração, [-] está relacionado a diminuição da concentração e [+] ao

aumento da concentração desses metabólitos no mdx em relação ao controle). Há uma

maior alteração desses metabólitos no músculo diafragma.

Concomitante aos nossos resultados, outros estudos demonstram que o animal

distrófico apresenta redução no metabolismo energético (DUNN, TRACEY & RADDA,

1993; EVEN, DECROUY & CHINET, 1994; HEIRE et al., 2014). Acredita-se que estes

74

metabólitos estejam diminuídos no músculo diafragma distrófico de 13 meses uma vez que

nessa idade há intensa substituição de fibra muscular por tecido conjuntivo (44% de

fibrose) e pouca regeneração. O mesmo não foi observado no coração, em que alguns

metabólitos estavam aumentados. Sugerimos que isso possa estar relacionado à diferença

do acometimento nos dois músculos, em que se observa um avanço maior da doença e uma

perda muscular maior no músculo diafragma do que no coração.

Sabe-se que a valina está envolvida no metabolismo energético e juntamente com os

outros aminoácidos que formam o BCAA (Branch Chain Amino Acids). Os BCAA são

essenciais para a síntese de proteínas (LU et al., 2014), bem como estimulam o crescimento

e o reparo muscular (hmdb.ca – Human Metabolome Database). Assim, sugerimos que

aumento da concentração de valina no coração distrófico possa ser um mecanismo

compensatório para a degradação proteica decorrente do aumento dos níveis de radicais

livres observado nesses animais (LAFOUX et al., 2006; LU et al., 2014). Assim como no

músculo esquelético, estudos demonstram que o metabolismo energético do coração de

camundongos mdx também se encontra alterado, apresentando níveis reduzidos de

metabólitos como a creatina-fosfato, citrato e creatina (ZHANG et al., 2008; GRACIOTTI

et al., 2011). No presente estudo observamos aumento da creatina-fosfato e citrato no

coração. Acreditamos que isso possa estar relacionado ao aumento da valina e

consequentemente aumento na atividade energética do músculo para a síntese de novas

fibras musculares.

Observamos ainda redução do oxipurinol no músculo diafragma distrófico. Assim

como o metabolismo energético, o metabolismo do estresse oxidativo também está

diminuído nos animais mdx (KIM & LAWLER, 2012; KIM et al., 2013). Sabe-se que o

oxipurinol atua como antioxidante, inibindo a xantina oxidase, enzima que gera espécies

reativas de oxigênio (hmdb.ca – Human Metabolome Database). Sugere-se que o aumento

das espécies reativas de oxigênio no camundongo mdx seja decorrente desta alteração no

metabolismo do estresse oxidativo desses animais. No coração observou-se ainda aumento

do glicolato no grupo mdx, metabólito que está relacionado a radicais livre e deposição de

colágeno bem como o aumento do aspartato, metabólito que participa na construção de

75

outras proteínas, confere resistência a fadiga e é imuno estimulante (hmdb.com – Human

Metabolome Database).

A taurina é um dos metabólitos mais citados na literatura (GRIFFIN & DES

ROISIERS, 2009; GULSTON et al., 2008; MARTINS-BACH et al., 2012; XU et al., 2012)

e assim como a maioria dos metabólitos, ela encontra-se elevada em algumas idades e

reduzida em outras quando comparados os animais mdx com os animais controle (GRIFFIN

et al., 2001; GRIFFIN & DES ROISIERS, 2009; GULSTON et al., 2008; MARTINS-

BACH et al., 2012; XU et al., 2012). Acredita-se que a taurina possa estar relacionada

diretamente com a estabilização da membrana e homeostase da fibra muscular, podendo

participar da modulação de canais iônicos (MARTINS-BACH et al., 2012). Sugere-se que

o aumento da taurina nos camundongos mdx esteja diretamente relacionado ao aumento de

células proliferativas e consequentemente com a capacidade de regeneração muscular

(GRIFFIN & DES ROISIERS, 2009). Em contradição, sugere-se que a taurina esteja

reduzida nos animais distróficos em decorrência ao rompimento e instabilidade da

membrana (MARTINS-BACH et al., 2012). No presente estudo, observamos redução da

taurina no músculo diafragma de animais mdx idosos quando comparado ao animal

controle. Acredita-se que a redução nos níveis de taurina no diafragma distrófico de 13

meses possa estar relacionada à perda de tecido muscular que esses animais apresentam,

bem como a fase em que se encontra a progressão da doença, em que não se observa picos

de degeneração/regeneração.

No músculo diafragma, o tratamento com ômega-3 diminuiu significantemente as

concentrações dos metabólitos energéticos como o formato, piruvato, valina e alanina

quando comparado ao grupo mdx-nujol. Previamente observamos que o diafragma do

grupo mdx-nujol apresentou 40% de fibras com núcleo central, indicativo de fibras

regeneradas, enquanto o grupo tratado com ômega-3 apresentou 24% de fibras com núcleo

central. Sabe-se que durante o processo de necrose, degeneração e regeneração tem-se um

gasto maior de energia (HEIRE et al., 2014). Assim, acreditamos que o tratamento com

ômega-3 reduziu esses metabólitos uma vez que ele protegeu o músculo contra a

degeneração. Concomitante a esses resultados, observamos redução da taurina nos animais

tratados quando comparados ao grupo mdx-nujol.

76

O ômega-3 reduziu ainda as concentrações da valina e leucina, bem como do

aspartato no coração dos camundongos mdx, aproximando esses valores aos dos animais

controle. Observou-se também aumento na concentração de acetamida nos animais

tratados. No presente estudo, mesmo não sendo observada intensa área de inflamação,

observou-se que os níveis de TNF- e MMP-9 estavam elevados no coração do grupo mdx

e que o tratamento com ômega-3 reduziu significantemente esses valores. Concomitante a

esses resultados, a redução das concentrações de valina, leucina e aspartato, indicam

proteção contra a mionecrose do ômega-3 no coração. Em adição, o aumento na

concentração de acetamida confirma o efeito anti-inflamatório do ômega-3, uma vez que

este é um amino ácido com função biológica anti-inflamatória (hmdb.ca – Human

Metabolome Database).

Observamos ainda que os metabólitos obtidos no teste estatístico foram os mesmos

observados na análise de PCA, exceto a carnitina, que não deu diferença significativa no

teste estatístico e foi observada como um fator de diferenciação na comparação do coração

controle com o coração mdx-nujol, estando em maior concentração no segundo grupo.

Sabe-se que a carnitina é um amino ácido relacionado ao metabolismo energético e à

construção de novas proteínas. Conforme descrito anteriormente, este dado está de acordo

com os resultados obtidos no coração distrófico de 13 meses.

77

6. Conclusões

1. O ômega-3 diminuiu a cardiomiopatia de animais mdx idosos. Provavelmente, o

ômega-3, ao se incorporar no sarcolema, promove a sua estabilidade (aumento da -

distroglicana), afetando canais (TRPC-1) e proteínas (CSQ) reguladores do cálcio;

isto pode ter diminuído a entrada deste íon na fibra e reduzido a mionecrose.

Paralelamente, o ômega-3 atuou como anti-inflamatório, reduzindo moléculas pró-

inflamatórias (TNF- e MMP-9) e do estresse oxidativo (4-HNE), o que levou a

diminuição da fibrose e melhora do ECG.

2. Demonstramos que o ômega-3 protegeu o músculo diafragma em um estágio mais

tardio da doença. Os efeitos benéficos do ômega-3 podem estar relacionados a sua

capacidade de diminuir os níveis de TGF-1, um importante mediador para a

formação de fibrose.

3. Observamos que no músculo diafragma mdx houve redução significativa dos

metabólitos energéticos; o mesmo não foi observado no músculo cardíaco.

Provavelmente, isto se deva ao fato do coração e diafragma apresentarem perfis

metabólicos distintos devido a diferença na progressão da doença, em que o

diafragma se encontra mais acometido do que o coração.

4. Verificamos que o ômega-3 altera o perfil metabólico de ambos os músculos. As

alterações verificadas podem ser correlacionadas ao efeito protetor que o ômega-3

conferiu aos músculos estudados.

5. Nossos dados sugerem que o metabólito aspartato seria um bom marcador tecidual

para o coração distrófico, enquanto que a taurina e o oxipurinol seriam para o

diafragma.

78

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8. Anexos

8.1 Comitê de Ética

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8.2 Declaração dos direitos autorais

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