26/9/2012

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Biomarcadores, Danos em Lipideos e Proteínas, Reparo

18/Set/2012

Biomarcadores

Biomarcadores ou marcadores biológicos

são entidades que podem ser medidas

experimentalmente e indicam a ocorrência

de uma determinada função normal ou

patológica de um organismo.

Os biomarcadores podem ser de diversos

tipos. Podem ser células específicas,

moléculas, genes, enzimas ou hormônios.

Fonte:http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/investigacao_ps/no

vos-desafios---biomarcadores/ “Fingerprinting”

Para espécies reativas, mede-se biomarcadores de danos oxidativos.

Mede-se produtos oxidados.

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Biomarcador de Dano Oxidativo “Ideal”

• Representativo do dano a ser monitorado

• Específico

• Estável (não ser degradadado ou formado durante a estocagem da amostra)

• Método deve ser sensível, específico e preciso

• Ensaio validado (baixo coeficiente de variação, reprodutível) para uso em estudos in vitro e in vivo.

• Medidas em amostras biológicas de fácil obtenção. Por exemplo, fluidos corporais (p. ex.: urina, sangue, saliva, cabelo, unha).

• Ensaio de baixo custo econômico.

Enzimático Não-Enzimático

Oxidação de

Lipídeos

Mecanismos de oxidação de lipídeos

COX

LOX

Espécies Reativas

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Peroxidação Lipídica

X

XH

X

XH

O2O2LH

L

LH

L

OO

OO

H

X = OH, RO, ROO, CO3

LH L LOO LOOH

ONOO-,

Produto Primário

O O

O

O

OH

Aldehydes

O

O

R

R

Cyclic peroxides

IsoprostanesNeuroprostanes

Produtos Secundários

Fonte: Miyamoto et al Chapter 2

Biomarkers for Antioxidant Defense and Oxidative Damage:

Principles and Practical Applications

Edited by Giancarlo Aldini, Kyung-Jin Yeum, Estuo Niki, and

Robert M. Russell ©2010 Blackwell Publishing Ltd.

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Peroxidação Lipídica

H H

H

R

RH

OOO2

HOO

LH

L

LOO

LOOH

L

LH

O

O

R

R

O OO

Fe2+

Fe3+

O O

O

O

OH

LO

LOO

Aldehydes

Cyclic peroxides

IsoprostanesNeuroprostanes

E0’ PUFA/PUFA = 0.6 V

R1 R2

H H

HH H H

H H

HH

H bis-alílico (75 kcal/mol)

H mono-alílico (88 kcal/mol)

C-H Bond Dissociation Energy (BDE)

Venkataraman et al 2004 Antioxid. Red. Signal.6, 631

H alquílico (101 kcal/mol)

A remoção do H-bis-alílico exige menor energia. Portanto a remoção deste H é mais favorável termodinamicamente.

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Velocidade de Propagação da

Peroxidação Lipídica

H bis-alílicos

2

6

8

10

dx.doi.org/10.1021/cr200084z | Yin et al. Chem. Rev. 2011, 111, 5944–5972

O kp aumenta com aumento do número de H bis-alílicos. Isso se reflete em uma velocidade maior de oxidação.

H H

H

R

RH

OOO2

HOO

LH

L

LOO

LOOH

L

LH

O

O

R

R

O OO

Fe2+

Fe3+

O O

O

O

OH

LO

LOO

Aldehydes

Cyclic peroxides

IsoprostanesNeuroprostanes

Ensaios para quantificação da Peroxidação Lipídica in vitro & in vivo??

1) Consumo do substrato

2) Detecção de radicais

intermediários

3) Detecção de produtos finais

Biomarcadores

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F2-Isoprostanos (IP)

Dr. Sean S. Davies Dr. L. Jackson Roberts Dr. Jason Morrow

• F2 isoprastanes são compostos similares à PGF2

• Formado pela oxidação não-enzimática do ácido araquidônico

– F2 isoprostanos podem ser gerados em fosfolipídeos e hidrolisados por fosfolipases

• Gerado em grandes quantidades in vivo

• Considerado o “melhor” biomarcador de dano oxidativo a lipídeos

F2-IsoPs como biomarcador

• BOSS study (2005)-IsoPs most accurate measure of oxidant stress in CCl4-treated rats.

• Deficiencies in antioxidants in vivo are associated with increased IsoP formation.

• Antioxidants decrease IsoP levels in animals and humans.

• IsoP levels are increased in animal models of human diseases and human disorders associated with oxidant stress.

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Biomarkers of Oxidative Stress Study (BOSS Study, 2005)

dx.doi.org/10.1021/cr200160h | Milne et al. Chem. Rev. 2011, 111, 5973–5996

dx.doi.org/10.1021/cr2002992 | Smith et al. Chem. Rev. 2011, 111, 5821–5865

Oxidação enzimática & não-enzimática do ácido araquidônico

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Espécies Reativas Produtos da Lipoperoxidação

Danos em

Proteínas

Danos oxidativos em proteínas

Dano direto Dano indireto

Reversíveis/Irreversíveis

Danos em Proteínas

Aminoácidos facilmente oxidáveis em proteínas:

-Tirosina, Fenilalanina, Triptofano

- Lisina, Arginina

- Cisteína e Metionina

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o,o’-dityrosine

+

NH 3 +

COO –

O •

NH 3 +

COO –

OH

NH 3

COO –

OH

NH 3 +

COO –

OH

NO2•

Tyr•

Ox

Ox

Tyrosine Tyrosyl radical

NH 3 +

COO –

OH

Cl

3-Cl-tyrosine (RHS)

NH 3 +

COO –

OH

NO2

3-NO2-tyrosine (RNS)

NH 3 +

COO –

OH

OH

3,4,-diOH-Phe (DOPA)

Tirosina é alvo preferencial de modificação em proteínas

Stable oxidation markers:

HOCl, Cl2

Dímero

Produto

Nitrado Produto

Clorado

Produto

Hidroxilado

Triptofano

Fonte: Thornalley and Rabbani Chapter 9

Biomarkers for Antioxidant Defense and Oxidative

Damage: Principles and Practical Applications

Edited by Giancarlo Aldini, Kyung-Jin Yeum, Estuo

Niki, and Robert M. Russell

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Msr: Metionina Sulfóxido Redutase. Enzima de reparo para metionina sulfóxido.

Metionina

Camundongos transgênicos sem Msr tem tempo de vida reduzido em 40% e apresentam disfunção do cerebelo. (vide Fig. 4.10 Augusto, O.) Bacteria sem Msr é hipersensível à H2O2. Drosophila com Msr superexpressa vive mais.

Oxidação metionina à metionina sulfóxido é um evento muito comum in vivo. (Augusto, O. p. 94)

Oxidação Não-Reparável

Fonte: Thornalley and Rabbani Chapter 9

Biomarkers for Antioxidant Defense and Oxidative Damage:

Principles and Practical Applications

Edited by Giancarlo Aldini, Kyung-Jin Yeum, Estuo Niki, and

Robert M. Russell

Cisteína

Não-Reparável

Reparo de sulfênico e sulfínico na presença de redutores (GSH, Tioredoxina e/ou Glutaredoxina)

Sulfênico reage com tiois livres formando disulfetos (intra ou intermoleculares), os quais são reduzidos de volta na presença de redutores.

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DalleDone et al 2007

Free Radic. Biol. Med. 43, 883

Cisteína

É muito comum também ocorrer a formação de disulfetos mistos envovendo cisteínas livres ou GSH (glutationilação de proteínas)

Fonte: Uchida, K. In Biomarkers for Antioxidant Defense and Oxidative Damage: Principles and Practical

Applications. Edited by G Aldini, K Yeum, E Niki, and R M. Russell

Modificação de Lisina por aldeídos da peroxidação lipídica: Formação de Base de Schiff

Lisina

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Modificação de Lisina, Cisteína e Histidina por HNE: Adição de Michael

Fonte: Uchida, K. In Biomarkers for Antioxidant Defense and Oxidative Damage: Principles and Practical

Applications. Edited by G Aldini, K Yeum, E Niki, and R M. Russell

Lisina

Cisteína

Histidina

Danos em

Proteínas

Danos oxidativos em proteínas

Reversíveis / Irreversíveis

Reparados por enzimas de reparo. Até o momento são reparáveis apenas oxidações em metionina (metionina sulfóxido) e cisteína (sulfênico e sulfínico)

Oxidações de aminoácidos além de cisteína e meitionina não são, até o momento, reparáveis por enzimas. Proteínas modificadas são encaminhadas para o “desmonte” (proteólise), via proteassoma. Muitas proteínas modificadas são propensas à agregação. Esses agregados podem se acumular formando fibrilas insolúveis.

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Degradação/Remoção de Proteínas danificadas

Proteínas danificadas Lisossomos/Hidrólise de proteínas

Proteassomo (20S e 26S) Fig. 4.11 Livro Ohara p. 95

Agregação

Formação de precipitados/fibrilas insolúveis

Métodos para monitorar danos oxidativos em proteínas

1) Consumo do substrato (aminoácido)

Perda de tióis

Perda da fluorescência do triptofano

2) Medida de radicais intermediários

Ex. Radical tirosil

3) Medida de produtos finais

Análise de produtos/aminoácidos oxidados específicos

Ex. 3-nitrotirosina, 3-clorotirosina, N-formilkinurenina, etc.

Proteínas carboniladas

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Proteínas Carboniladas

• Proteínas carboniladas são relativamente estáveis

• Formadas in vitro por diversos agentes oxidantes (reações catalisadas por metais, radiações ionizantes, HOCl, ozonio, 1O2, produtos da oxidação de lipídeos)

• Facilmente detectados utilizando-se o reagente DNPH (ensaios colorimétricos e imunológicos)

Vias de formação de proteínas carboniladas

1- Oxidação direta de aminoácidos, em particular por Fenton (ver Fig. 4.6 Livro Ohara)

2- Quebra da ligação peptídica

3- Reação de Lys, His, Cys com aldeídos da peroxidação lipídica

4- Reação de Lys com açucares redutores ou seus compostos de oxidação

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Ensaio de proteínas carboniladas

Ensaio de proteínas carboniladas