Bioprospecção de microrganismos leveduriformes produtores de ...
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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA RODRIGO DE QUEIROZ OLIVEIRA Bioprospecção de microrganismos leveduriformes produtores de pectinases extracelulares isolados do Semi-árido baiano Feira de Santana, BA 2007
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
RODRIGO DE QUEIROZ OLIVEIRA
Bioprospecção de microrganismos leveduriformes produtores de
pectinases extracelulares isolados do Semi-árido baiano
Feira de Santana, BA
2007
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RODRIGO DE QUEIROZ OLIVEIRA
Bioprospecção de microrganismos leveduriformes produtores de
pectinases extracelulares isolados do Semi-árido baiano
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia.
Orientador: Profa. Dra. Sandra Aparecida de Assis (UEFS) Co-orientadores: Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa (UFMG)
Profa. Dra. Ana Paula Trovatti Uetanabaro (UEFS)
Feira de Santana, BA
2007
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À minha orientadora Profa. Dra. Sandra
Aparecida de Assis e aos meus Co-orientadores
Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa e Profa. Dra. Ana
Paula Trovatti Uetanabaro pelos valiosos
ensinamentos.
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AGRADECIMENTOS
A Deus o guia fundamental de toda minha vida espiritual.
À Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS), em especial ao Departamento de
Ciências Biológicas, pela oportunidade concedida para realização do Mestrado em
Biotecnologia com Ênfase em Recursos Naturais da Região Nordeste.
À Profa. Dra. Sandra Aparecida de Assis pelo acolhimento e orientação. Agradeço ainda
pelas condições de trabalho que me proporcionou, pela contínua disponibilidade, pela
paciência e, sobretudo, pela amizade em todos os momentos.
À Profa. Dra. Ana Paula Trovatti Uetanabaro do Departamento de Saúde da UEFS, pelo
incentivo, pela coleta, pelas críticas e sugestões, e pela amizade.
Ao Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa do Departamento de Microbiologia do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), pela valiosa
cooperação tanto na coleta dos microrganismos, quanto nas análises dos dados obtidos.
À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, tendo a frente o Prof.
Dr. Aristóteles Góes-Neto que se mostrou sempre atencioso e pronto a ajudar.
À aluna de iniciação científica Rita e aos colegas de Pós-Graduação Catiane e Paulo pela
colaboração nas técnicas de biologia molecular e análise filogenética.
Aos alunos de iniciação científica Fabiana, Danyo e Gildomar do Laboratório de
Enzimologia e Tecnologia das Fermentações (LAEN) do Departamento de Saúde da UEFS,
pelo auxílio nos ensaios enzimáticos.
Aos colegas do Laboratório de Pesquisa em Microbiologia (LAPEM) do Departamento de
Ciências Biológicas da UEFS: Thiago, Cléber, Alice, Carla, Isabela, Suzana, Suikinai e
Luciana pela convivência e apoio.
À Helton, pelo apoio na secretaria da Pós-Graduação.
5
Aos professores e colegas do Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia, pela
contribuição no meu desenvolvimento pessoal e profissional.
À Profa. Dra. Rosane Freitas Schwan do Laboratório de Fisiologia de Microrganismos do
Departamento de Biologia da Universidade Federal de Lavras (UFLA), pela gentil cessão da
levedura Kluyveromyces marxianus CCT 3172.
Ao Laboratório de Micologia (LAMIC) do Departamento de Ciências Biológicas da
UEFS, coordenado pelo Prof. Dr. Luís Fernando Pascholati Gusmăo, pelos registros
fotográficos dos microrganismos.
Ao Laboratório de Sistemática Molecular de Plantas (LAMOL) do Departamento de
Ciências Biológicas da UEFS, coordenado pelo Prof. Dr. Cassio van den Berg, pelo suporte
nos experimentos envolvendo biologia molecular.
A Sra. Valentina de Fátima De Martin do Laboratório de Biologia Molecular do
Departamento de Ciências Biológicas da Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz"
(ESALQ) da Universidade de São Paulo (USP), pelo seqüenciamento do material genético.
Ao Prof. Dr. Antonio Azeredo pela colaboração na análise estatística dos resultados.
Ao biólogo Domingos pela identificação botânica.
Aos meus pais Gilson e Maria Eneusa, e a meu irmão Ronaldo, que me ofereceram
condições para o vivenciamento puramente acadêmico.
À minha querida noiva Charlene pelo companheirismo e paciência que teve comigo.
À minha família “Queirozes, Oliveiras e Jesuses”, representada por meu primo Paulo
Marcelo, meu sogro César e minha sogra Ana, pela torcida.
À FAPESB pela concessão da bolsa de mestrado (Pedido Nº 3509/2006).
Aos membros da banca examinadora, Dra. Olga Maria Mascarenhas de Faria Oliveira e
Dr. Hélio Mitoshi Kamida, pelas sugestões e correções.
6
“O meu bom senso não me diz o que é, mas deixa claro que há algo que precisa ser sabido. Esta é a tarefa da ciência que, sem o bom senso do cientista, pode se desviar e se perder. Não tenho dúvida do insucesso do cientista a quem falte à capacidade de adivinhar, o sentido da desconfiança, a abertura à dúvida, a inquietação de quem não se acha demasiado certo das certezas. Tenho pena e, às vezes, medo do cientista demasiado seguro da segurança, senhor da verdade e que não suspeita da historicidade do próprio saber.”
(Paulo Freire – “Pedagogia da Autonomia”)
7
RESUMO
As enzimas pécticas de origem microbiana correspondem a 25% do total de enzimas
utilizadas na indústria alimentícia, sendo empregadas tradicionalmente na extração e
clarificação de suco de frutas. As leveduras despertam grande interesse para a produção em
larga escala destas enzimas, em virtude do seu crescimento rápido e meio de crescimento
geralmente sem indutor. Assim, seleções de microrganismos do ambiente são promissores
para prospecção de produtos de interesse industrial e biotecnológico. Desse modo, os
objetivos desse trabalho foram isolar, selecionar, identificar e verificar a atividade
pectinolítica de microrganismos leveduriformes (leveduras e fungos semelhantes a leveduras),
provenientes do Semi-árido baiano; além de depositá-los na Coleção de Culturas de
Microrganismos da Bahia (CCMB) da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS). Os
microrganismos foram isolados de flores, frutos, tecido vegetal necrosado, insetos e solos da
região Semi-árida baiana em meio YM, acrescido de cloranfenicol 0,01%; selecionados em
meio diferencial contendo ácido poligalacturônico (MP-5) para determinação da
poligalacturonase (PG) e de pectina (MP-7) para pectina liase (PL); sendo eles identificados
pela amplificação da seqüência do domínio D1/D2 do 26S rDNA. Os resultados obtidos
foram avaliados mediante análise de variância (ANOVA) e Teste de Tukey com o pacote
estatístico SPSS (Statistical Package for Social Sciences). Dos 250 isolados testados, 33
foram selecionados como pectinolíticos. Estes 33 microrganismos pectinolíticos foram:
Aureobasidium pullulans (18), Candida boidinii (1), Trichosporonoides sp. (3), Pseudozyma
sp. (4), Cryptococcus liquefaciens (1), “Fungal endophyte” (5) e o Kluyveromyces marxianus
(1), o qual tem aceitabilidade na indústria de processamento de alimentos. A atividade
pectinolítica diferiu significantemente entre os isolados (Tukey p<0,05). A atividade da
poligalacturonase foi verificada somente em nove deles, sendo o isolado Pseudozyma sp.
8
CCMB 300 e o Trichosporonoides sp. CCMB 304 os produtores mais ativos, apresentando
respectivamente 14,17 e 12,47 µmol de ácido galacturônico liberado por min/mg de proteínas.
Por outro lado, a atividade da pectina liase foi verificada em todos os 33 isolados, sendo os
produtores mais ativos o “Fungal endophyte” CCMB 327 e o “Fungal endophyte” CCMB
328, que apresentaram, respectivamente, 130,48 e 117,26 µmol de grupos uronídeos
insaturados formados por min/mg de proteínas. Este estudo demonstrou que microrganismos
leveduriformes isolados do Semi-árido baiano representam uma fonte de enzimas
extracelulares de interesse industrial e biotecnológico.
Palavras-chave: levedura, poligalacturonase, pectina liase, biotecnologia
9
ABSTRACT
The microbial pectic enzymes produced constitute 25% of the enzyme used in food market
and are used in extraction and clarification of juice fruits. Yeasts are an alternative source for
the large-scale production of commercial enzymes because have growth relatively simple and
in the general the growth medium does not require an inducer. In addition, screenings of
microorganisms from the environmental are promissory at prospection of products with
industrial and biotechnological interest. Our objective were isolate, select, identify and study
the enzymatic activity of yeast and like-yeast strains producers of pectinases extracelulars.
Other objective of this work was deposited the isolated microorganism in the Culture
Collections of Microorganisms of Bahia (CCMB) of the University of Feira de Santana
(UEFS). The microorganisms were isolated from flowers, fruits, necrotic plant tissue, insects
and soil from Semi-arid region of the State of Bahia, Brazil, using YM medium, in presence
of 0.01% of chloramphenicol. The yeasts isolated were grown in plates with mineral medium
containing polygalacturonic acid (MP-5) for polygalacturonase (PG) activity and mineral
medium containing pectin (MP-7) for pectin lyase activity (PL). Pectinolytic-secreting yeast
isolates were identified by amplification of the sequence of dominium D1/D2 of 26S rDNA.
Data were analyzed by analysis of variance (ANOVA) and Test of Tukey using SPSS
(Statistical Package for Social Sciences). From 250 strains 33 strains showed pectic activity.
These microorganisms are: Aureobasidium pullulans (18), Candida boidinii (1),
Trichosporonoides sp. (3), Pseudozyma sp. (4), Cryptococcus liquefaciens (1), “Fungal
endophyte” (5) e o Kluyveromyces marxianus (1). With K. marxianus additionally achieving
the status of being designated GRAS (Generally Regarded As Safe). The pectinolytic activity
differed in the strains (Tukey p<0,05). Nine strains showed pectinolytic activity of
polygalacturonase and the highest activity were verified in Pseudozyma sp. CCMB 300 and
10
Trichosporonoides sp. CCMB 304 that showed 14,17 e 12,47 µmol of galacturonic
acid/min/mg de protein. In relation to pectin lyase activity, these are verified in all 33 strains
and the highest activities occurred in “Fungal endophyte” CCMB 327 and in the “Fungal
endophyte” CCMB 328, that showed, respectively, 130,48 e 117,26 µmol of unsaturated
uronides/min/mg protein. Our study clearly revealed the potential of yeasts isolated from
Semi-arid environments to produce a wide range of pectinolytic enzymes.
Key words: yeast, polygalacturonase, pectin lyase, biotechnology
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Estrutura da parede celular vegetal. Fonte: IPPA,
http://www.ippa.info/what_is_pectin.htm....................................................
21
Figura 02 Estrutura da pectina. Fonte: Cook e Stoddart (1973) apud Sakai et al.
(1993)…........................................................................................................
22
Figura 03 Unidade de ácido galacturônico. Fonte: IPPA,
http://www.ippa.info/what_is_pectin.htm....................................................
22
Figura 04 Modo de ação das enzimas pectinolíticas. Fonte: Sakai et al. (1993)..........
24
Figura 05 Estrutura da unidade de DNA ribossomal (rDNA), o qual consiste de
seqüências altamente conservadas codificadoras dos RNAs ribossomais
(rRNAs) 18S, 5,8S e 28S, intercaladas com regiões não codificadoras
menos conservadas (ITS e IGS). Fonte: adaptado de VILGALYS LAB,
http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm..........................
29
Figura 06 Diversidade de áreas que envolvem a biotecnologia das leveduras. Fonte:
Walker (1998) apud Pinheiro (2004)............................................................
31
Figura 07 Halo de hidrólise do ácido poligalacturônico originado por
Saccharomyces cerevisiae CECT 1389, proveniente da Spanish Type
Culture Collection, Espanha. Fonte: Blanco et al. (1994) apud Blanco,
Sieiro e Villa (1999).....................................................................................
36
Figura 08 Mapa da Região Nordeste mostrando as ecorregiões do Bioma das
Caatingas e as 57 áreas prioritárias para conservação; as seis áreas de
Extrema Importância Biológica em vermelho estão sendo inventariadas
pelo PPBio. Fonte: PPBio, http://www.uefs.br/ppbio/index.html................
50
12
Figura 09 (a) Halo de hidrólise do ácido poligalacturônico, visualizado após adição
de hexadecil trimetil amônio brometo 1% (p/v), originado por
microrganismos leveduriformes isolado do Semi-árido baiano, crescidos a
28ºC por 48 h em meio MP-5. (b) Halo de degradação da pectina,
visualizado após adição de hexadecil trimetil amônio brometo 1% (p/v),
originado por microrganismo leveduriforme isolado do Semi-árido
baiano, crescido a 28ºC por 48 h em meio MP-7.........................................
66
Figura 10 Halo de degradação da pectina, visualizado após adição de hexadecil
trimetil amônio brometo 1% (p/v), originado por Kluyveromyces
marxianus CCT 3172, crescido a 28ºC por 48 h em meio MP-7.................
67
Figura 11 Produtos da PCR purificado de 33 isolados leveduriformes produtores de
pectinases, submetido à eletroforese em gel de agarose 1% em tampão
TAE 1X, 5V/cm, 1,5 hrs, corado com “SYBR Safe” (Invitrogen) e
fotografados pelo sistema de fotodocumentação Edas 290 (Kodak). Nas
amostras (canaletas) ocorre à amplificação do domínio D1/D2 do 26S
rDNA com os primers LR0R e LR5, e obtenção de um fragmento de
aproximadamente 900 pb, que é o tamanho próximo ao esperado para
estes domínios. O marcador (M) utilizado foi o “Gene Ruler 100 bp DNA
Ladder” (Fermentas).....................................................................................
70
Figura 12 Árvore filogenética dos microrganismos leveduriformes produtores de
pectinases extracelulares isolado Semi-árido baiano, obtida por análise de
“neighbour-joining” (modelo de Kimura dois parâmetros) do domínio
D1/D2 do 26S rDNA. Schizosaccharomyces pombe foi incluído para
enraizar a árvore. Os valores em porcentagem do bootstrap de 1000
replicações são dados a cada ramo (valores abaixo de 50% não são
mostrados). A designação do isolado (CCMB) são indicados após o
número do acesso no GenBank, exceto no grupo externo............................
73
13
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 01 Mercados globais de Enzima baseados nos setores da aplicação, 2002-
2009 (milhões de dólares). Fonte: BCC Inc, 2004.....................................
39
Gráfico 02 Atividade específica (AE) da poligalacturonase (PG) em µmol de ácido
galacturônico liberado por min/mg de proteínas, obtida com
microrganismos leveduriformes isolado do Semi-árido baiano, crescidos
em agitador rotatório a 28ºC por 48 h em caldo de fermentação...............
78
Gráfico 03 Atividade específica (AE) da pectina liase (PL) em µmol de grupos
uronídeos insaturados formados por min/mg de proteínas, obtida com
microrganismos leveduriformes isolado do Semi-árido baiano, crescidos
em agitador rotatório a 28ºC por 48 h em caldo de fermentação...............
82
14
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Classificação das enzimas pécticas segundo a Comissão de Enzimas
(E.C.) adaptado de Jayani, Saxena e Gupta (2005)....................................
27
Tabela 02 Microrganismos leveduriformes isolados do Semi-árido baiano,
substratos do qual foram isolados e seus respectivos
georeferenciamentos...................................................................................
65
Tabela 03 Atividade semiquantitativa da poligalacturonase e pectina liase
extracelulares dos microrganismos leveduriformes isolados do Semi-
árido baiano crescidos a 28ºC por 48 h em meios diferencial, estimada
mediante o índice enzimático.....................................................................
69
Tabela 04 Caracterização molecular dos microrganismos leveduriformes
pectinolíticos isolados do Semi-árido baiano, a partir da análise da
sequência do domínio D1/D2 da subunidade (26S) de rDNA...................
72
Tabela 05 Biomassa seca, unidade de atividade da poligalacturonase, proteína total
e atividade específica da poligalacturonase produzidas por
microrganismos leveduriformes pectinolíticos isolados do Semi-árido
baiano, crescidos em caldo de fermentação em agitador rotatório a 150
rpm, a 28ºC por 48 h...................................................................................
81
Tabela 06 Biomassa seca, unidade de atividade da pectina liase, proteína total e
atividade específica da pectina liase produzidas por microrganismos
leveduriformes pectinolíticos isolados do Semi-árido baiano, crescidos
em caldo de fermentação em agitador rotatório a 150 rpm, a 28ºC por 48
h..................................................................................................................
84
15
LISTA DE ABREVIATURAS
AE: atividade específica
CCMB: Coleção de Culturas de Microrganismos da Bahia
cm: centímetro
EC: Comissão de Enzimas
h: hora
M: molaridade
mg: miligramas
min: minuto
mL: mililitro
MM: massa molar
mM: milimolar
nm: nanômetro
p/v: relação em porcentagem entre o peso do soluto e o volume da solução
pb: pares de bases
PG: poligalacturonase
pH: potencial hidrogeniônico
PL: pectina liase
PPBio: Programa de Pesquisa em Biodiversidade do Semi-árido
rpm: rotações por minuto
seg: segundo
UA: unidade de atividade
v/v: relação em porcentagem entre o volume do soluto e o volume da solução
µg: micrograma
µL: microlitro
16
SUMÁRIO
RESUMO........................................................................................................................... vi
ABSTRACT...................................................................................................................... viii
LISTA DE FIGURAS....................................................................................................... x
LISTA DE GRÁFICOS..................................................................................................... xii
LISTA DE TABELAS....................................................................................................... xiii
LISTA DE ABREVIATURAS.......................................................................................... xiv
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 18
2 OBJETIVOS................................................................................................................... 20
2.1 Objetivo Geral............................................................................................................. 20
2.2 Objetivos específicos................................................................................................... 20
3 Pectinases de interesse industrial e biotecnológico produzidas por leveduras: UMA
REVISÃO..........................................................................................................................
21
3.1 As substâncias pécticas................................................................................................ 21
3.2 As pectinases............................................................................................................... 24
3.2.1 Pectinesterases.......................................................................................................... 25
3.2.2 Enzimas despolimerizantes....................................................................................... 25
3.2.3 Protopectinases......................................................................................................... 26
3.3 Produção de pectinases por leveduras......................................................................... 28
3.3.1 Visão geral das leveduras......................................................................................... 28
3.3.2 Ocorrência de pectinase em leveduras...................................................................... 31
3.3.3 Generalidades sobre os fatores que afetam a produção de pectinases em leveduras 36
3.4 Produção e aplicação industrial das pectinases........................................................... 38
3.4.1Processamento de frutas e vegetais........................................................................... 41
3.4.2 Produção de vinho.................................................................................................... 43
3.4.3 Indústria têxtil........................................................................................................... 44
3.4.4 Extração de óleo....................................................................................................... 45
3.4.5 Fermentação do café, chá e cacau............................................................................. 46
3.4.6 Ração animal............................................................................................................ 47
3.4.7 Purificação de vírus de plantas................................................................................. 47
3.4.8 Tratamento de águas residuárias da indústria........................................................... 48
17
3.4.9 Indústria de papel e celulose..................................................................................... 48
3.5 O Semi-árido brasileiro como local potencial na obtenção de enzimas...................... 49
4 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................ 52
4.1 Isolamento e purificação dos microrganismos leveduriformes do Semi-árido baiano 52
4.2 Preservação dos microrganismos isolados.................................................................. 53
4.3 Seleção dos microrganismos leveduriformes produtores de enzimas pectinolíticas:
a poligalacturonase (PG) e a pectina liase (PL).................................................................
54
4.4 Identificação molecular dos microrganismos leveduriformes pectinolíticos.............. 55
4.4.1 Extração de DNA genômico..................................................................................... 55
4.4.2 Amplificação do domínio D1/D2 do 26S rDNA...................................................... 57
4.4.3 Sequenciamento dos produtos da PCR purificado................................................... 58
4.4.4 Análise das seqüências............................................................................................. 58
4.5 Determinação da poligalacturonase (PG) e da pectina liase (PL) extracelulares
produzidas por microrganismos leveduriformes em fermentação submersa.....................
59
4.5.1 Preparação das amostras para os ensaios enzimáticos.............................................. 59
4.5.2 Determinação da unidade de atividade (UA) da poligalacturonase (PG)................. 60
4.5.3 Determinação da unidade de atividade (UA) da pectina liase (PL).......................... 60
4.5.4 Doseamento da proteína total................................................................................... 61
4.5.5 Determinação da atividade específica (AE) da poligalacturonase (PG)................... 62
4.5.6 Determinação da atividade específica (AE) da pectina liase (PL)........................... 62
4.5.7 Determinação da biomassa....................................................................................... 62
4.5.8 Análise estatística..................................................................................................... 63
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................... 64
5.1 Isolamento e purificação dos microrganismos leveduriformes do Semi-árido baiano 64
5.2 Seleção dos microrganismos leveduriformes produtores de pectinases
extracelulares: a poligalacturonase (PG) e a pectina liase (PL)........................................
64
5.3 Filogenia molecular e biodiversidade dos microrganismos leveduriformes
pectinolíticos......................................................................................................................
70
5.4 Poligalacturonase (PG) e pectina liase (PL) extracelulares produzidas por
microrganismos leveduriformes por meio de fermentação submersa...............................
77
5.4.1 Atividade da poligalacturonase (PG)........................................................................ 77
5.4.2 Atividade da pectina liase (PL)................................................................................ 82
5.5 Resumo dos resultados............................................................................................... 85
18
6 CONCLUSÃO................................................................................................................ 88
REFERÊNCIAS................................................................................................................ 89
APÊNDICE(S)................................................................................................................... 102
APÊNDICE A – Fotografias dos substratos do Semi-árido baiano, dos quais
microrganismos leveduriformes produtores de pectinases extracelulares foram
isolados..............................................................................................................................
102
APÊNDICE B – Fotografias da microscopia de contraste de fase dos microrganismos
leveduriformes produtores de enzimas pectinolíticas extracelulares, isolados do Semi-
árido baiano, crescidos em ágar YM a 28ºC por 48 h, corados com azul de metileno
1% (p/v) e ampliação de 1.000x (imersão em óleo)..........................................................
104
APÊNDICE C - Seqüências amplificadas do domínio D1/D2 do 26S rDNA dos
microrganismos leveduriformes produtores de enzimas pectinolíticas extracelulares,
isolados do Semi-árido baiano...........................................................................................
107
APÊNDICE D - Curvas de calibração............................................................................... 116
ANEXO(S)........................................................................................................................ 118
ANEXO A - Meios de cultura........................................................................................... 118
ANEXO B - Soluções, tampões e reagentes...................................................................... 120
18
1 INTRODUÇÃO
Desde a década de 30 que as pectinases são utilizadas em aplicações comerciais na
produção de vinhos e sucos de frutas (KASHYAP et al., 2001). Por outro lado, seu uso tem
aumentado consideravelmente, especialmente nas indústrias de alimentos, bebidas e vinhos,
têxtil e de papel e celulose. Segundo Uenojo e Pastore (2006) estas enzimas correspondem à
cerca de 20% do mercado mundial de enzimas e são produzidas naturalmente por plantas,
fungos, leveduras e bactérias.
Apesar de células vegetais e animais serem também fontes de enzimas, do ponto de vista
econômico e industrial, as enzimas extracelulares de microrganismos são preferíveis devido
ao custo de sua extração, isolamento e purificação (SAID; PIETRO, 2002).
As pectinases de origem microbiana correspondem a 25% do total de enzimas utilizadas
na indústria alimentícia, sendo empregadas tradicionalmente na extração e clarificação de
suco de frutas em razão de sua especificidade e do seu potencial catalítico, melhorando o
processo e qualidade do produto (JAYANI; SAXENA; GUPTA, 2005).
Não existem outros aditivos ou processos alternativos que se possam constituir em bons
substitutos das enzimas pectinolíticas nas indústrias alimentícias. Além disso, a tendência é de
aumento do consumo dessas enzimas pela incorporação ao mercado tanto de novos produtos
quanto de pequenos produtores, os quais estão pouco a pouco se tecnificando (CANTO;
MENEZES, 1995).
Preparações comerciais de pectinases são normalmente de origem fúngica, especialmente
do fungo filamentoso Aspergillus niger (BLANCO; SIEIRO; VILLA, 1999).
Outros microrganismos também são capazes de produzir estas enzimas, tais como as
leveduras dos gêneros Kluyveromyces, Saccharomyces, Stephanoascus, Pichia,
19
Zygosacchoromyces, Candida, Debaryomyces, Pseudozyma, Cryptococcus, Leucosporidium,
Metschnikowia, Rhodotorula, Torulaspora, Trichosporon, Kloeckera, Ambrosiozyma,
Bullera, Geotrichum, Rhodosporidium, Saccharomycopsis e Ustilago, além do fungo
semelhante à levedura Aureobasidium e de leveduras pretas (BIELY; SLÁVIKOVÁ, 1994;
STRAUSS et al., 2001; TRINDADE et al., 2002; BUZZINI; MARTINI, 2002; SILVA et al.,
2005; OLIVEIRA et al., 2006).
Assim sendo, as leveduras despertam grande interesse para a produção em larga escala,
quando comparadas aos fungos filamentosos, em virtude de inúmeras vantagens, destacando-
se, dentre outras, as seguintes: são unicelulares, o crescimento é rápido e o meio do
crescimento não requer um indutor (SILVA et al., 2005).
O artigo de revisão de Steele e Stowers (1991) e o de Bull, Goodfellow e Slater (1992),
enfatizam que, embora as modernas técnicas de biologia molecular permitam manipular os
microrganismos para gerar enzimas com propriedades desejáveis, programas de seleção e
triagem de microrganismos do ambiente são clássicos para prospecção de produtos de
interesse industrial e biotecnológico, pois microrganismos de uma mesma espécie em
ambientes diferentes podem apresentar diversidade genética.
Desse modo, o Semi-árido baiano representa um grande campo à prospecção
biotecnológica, pois leveduras adaptadas a esse ambiente físico significativamente
heterogêneo, incluindo diferentes climas, sistemas de chuvas, relevos, solos e hidrografias,
podem ser dotadas de características próprias, com peculiaridades de interesse industrial.
Além disso, pesquisas com estes microrganismos contribuem para o conhecimento da
biodiversidade nativa da região.
20
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Selecionar microrganismos leveduriformes (leveduras e fungos semelhantes a leveduras)
produtores de pectinases extracelulares do Semi-árido baiano.
2.2 Objetivos específicos
• Isolar microrganismos leveduriformes de substratos do Semi-árido baiano;
• Selecionar microrganismos leveduriformes produtores de pectinases extracelulares;
• Identificar os microrganismos pectinolíticos por meio da seqüência do domínio D1/D2
do 26S rDNA;
• Verificar a atividade enzimática das enzimas poligalacturonase (PG) e pectina liase
(PL) produzidas pelos microrganismos pectinolíticos;
• Depositar os isolados pectinolíticos na Coleção de Culturas de Microrganismos da
Bahia (CCMB) da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS).
21
3 Pectinases de interesse industrial e biotecnológico produzidas por
leveduras: UMA REVISÃO
3.1 As substâncias pécticas
Substância péctica é o nome genérico usado para um grupo complexo de polissacarídeos
coloidais de elevado massa molecular, acidificado e carregado negativamente, que ocorre
principalmente na lamela média e nas paredes celulares de vegetais superiores associadas à
celulose e à hemicelulose, contribuindo na firmeza e estrutura dos seus tecidos (Figura 01)
(GUMMADI; PANDA, 2003; JAYANI; SAXENA; GUPTA, 2005).
Figura 01. Estrutura da parede celular vegetal. Fonte: IPPA, http://www.ippa.info/what_is_pectin.htm
A cadeia principal dos polissacarídeos pécticos é constituída de resíduos de ácido D-
galacturônico unidos por ligações α - (1→ 4), intercalados ou não por resíduos de ramnose, e
cadeias laterais contendo principalmente arabinose, galactose e xilose (ALKORTA et al.,
22
1997; KASHYAP et al., 2001). Os grupos carboxílicos do ácido galacturônico podem estar
parcialmente esterificados por grupos metil e parcial ou completamente neutralizados por íons
sódio, potássio ou amônio (KASHYAP et al., 2001). Detalhes da molécula péctica são
ilustrados nas Figuras 02 e 03.
Figura 02. Estrutura da pectina. Fonte: Cook e Stoddart (1973) apud Sakai et al. (1993).
Figura 03. Unidade de ácido galacturônico. Fonte: IPPA, http://www.ippa.info/what_is_pectin.htm
23
A Sociedade Americana de Química classificou as substâncias pécticas conforme
descrito a seguir (SAKAI et al., 1993; HOONDAL et al., 2002):
• Protopectina – designação atribuída às substâncias precursoras das substâncias
pécticas, que apresentam como característica a insolubilidade na água; além disto,
quando hidrolisada transforma-se em ácidos pectínicos ou pectina.
• Ácido péctico - nome dado às substâncias pécticas compostas na maior parte de ácidos
poligalacturônicos coloidais, essencialmente livres de grupos metil ésteres. Os sais
destes ácidos são chamados de pectatos.
• Ácidos pectínicos - termo usado para designar o ácido poligalacturônico coloidal que
contém uma quantidade significativa de grupos metil ésteres (maior que zero e menor
que 75%), que, sob condições adequadas, podem formar géis com açúcar em meio
ácido ou na presença de certos íons metálicos. Os sais destes ácidos denominam-se
pectinatos.
• Pectina(s) – denominação dada ao material polimérico solúvel em água no qual,
aproximadamente 75% dos grupos carboxilas das unidades do ácido galacturônico
estão esterificados com metanol. Assim como os ácidos pectínicos, a pectina também
é capaz de formar géis com açúcar em meio ácido sob condições adequadas.
Genericamente, as pectinas com mais da metade dos grupos carboxila esterificados
com metanol, são chamadas de pectinas com alto grau de metoxilação e com menos da
metade, de pectinas com baixo grau de metoxilação, que pode também possuir grupos
amida. A pectina pode ser usada em um grande número de alimentos como agente
24
gelificante, espessante, texturizante, emulsificante e estabilizador (THAKUR et al.,
1997, ASSIS, 2004).
3.2 As pectinases
Enzimas pécticas, pectinases ou enzimas pectinolíticas são um grupo heterogêneo de
enzimas relacionadas que catalisam a degradação das substâncias pécticas nos vegetais
(BLANCO; SIEIRO; VILLA, 1999; JAYANI; SAXENA; GUPTA, 2005), sendo ilustrados
seus modos de ação na Figura 04.
Figura 04. Modo de ação das enzimas pectinolíticas. Fonte: Sakai et al. (1993).
As enzimas pectinolíticas são produzidas pelos vegetais, tendo importância na maturação
dos frutos, crescimento, abscisão e desenvolvimento do pólen (BLANCO; SIEIRO; VILLA,
25
1999). Por outro lado, também são produzidas por bactérias, fungos filamentosos, leveduras,
insetos, nematóides e protozoários (HOONDAL et al, 2002).
As pectinases podem ser classificadas em três grupos (SAKAI et al., 1993; ALKORTA et
al., 1997; KASHYAP et al., 2001; JAYANI; SAXENA; GUPTA, 2005):
3.2.1 Pectinesterases
As pectinesterases são enzimas que catalisam a desesterificação do grupo metoxílico da
pectina produzindo álcool metílico e ácido péctico, sendo produzidas por fungos filamentosos,
leveduras e plantas superiores, estando presentes em praticamente todos preparados
comerciais de enzimas pectinolíticas.
3.2.2 Enzimas despolimerizantes
As enzimas despolimerizantes rompem as ligações glicosídicas α-(1-4) entre os
monômeros galacturônicos das substâncias pécticas, podendo atuar por hidrólise (hidrolases)
ou por transeliminação (liases).
As hidrolases são classificadas em dois grupos. Desse modo, aquelas que preferem o
pectato como substrato, são chamadas de poligalacturonases (endo ou exo) e, aquelas que têm
preferência pela pectina são chamadas de polimetilgalacturonases (endo ou exo). Os prefixos
endo e exo denotam uma clivagem randômica ou terminal pelas enzimas sob os monômeros
galacturônico dos substratos, respectivamente.
As endopoligalacturonases são enzimas produzidas por uma variedade de
microrganismos, como muitos fungos filamentosos, bactérias e leveduras. Elas também são
encontradas em plantas superiores e em alguns nematóides parasitas de planta. Por outro lado,
26
as exopoligalacturonases ocorrem menos freqüentemente, sendo produzidas por fungos
filamentosos e algumas bactérias.
As poligalacturonases são, dentre as enzimas pectinolíticas, as mais estudadas, tanto pelo
seu papel biológico na interação planta-fungo quanto pela sua utilização industrial, sendo a
atividade enzimática determinada com base no aumento do número dos grupos redutores
formados e diminuição da viscosidade dos substratos da solução, durante a reação enzimática
(MILLER, 1959).
As liases também são classificadas em dois grupos: poligalacturonato liases (endo e exo),
também chamadas de pectato liases, as quais têm preferência pelo pectato como substrato, e
as polimetilgalacturonato liases (endo e exo), que preferem a pectina como substrato, também
conhecidas como pectina liases.
As poligalacturonato liases são enzimas produzidas por muitas bactérias e alguns fungos
patogênicos, sendo a endopoligalacturonato liase mais abundante.
Poucos trabalhos têm relatado a produção de polimetilgalacturonato liases. O método mais
empregado na detecção da atividade da liase é medir o aumento da absorbância a 235
nanômetros, devido à formação de dupla ligação entre os carbonos envolvidos na reação,
gerando produtos insaturados (ALBERSHEIM, 1966).
3.2.3 Protopectinases
As protopectinases são enzimas que solubilizam protopectina, formando pectina solúvel
altamente polimerizada. Além do mais, podem ser divididas em tipo A, que atuam na região
do ácido poligalacturônico da protopectina, e tipo B, que atuam nas cadeias de polissacarídeos
que conectam as cadeias do ácido poligalacturônico aos constituintes da parede celular
27
vegetal. Deve-se mencionar ainda que, o tipo A é encontrado em leveduras e fungos
semelhantes a leveduras (yeast-like), enquanto que o tipo B em bactérias.
A Comissão de Enzimas (E.C.) da União Internacional de Bioquímica e Biologia
Molecular definiram critérios para a classificação e denominação das enzimas. A mais recente
e elaborada classificação para as pectinases são encontradas na Tabela 01.
Tabela 01. C
lassificação d
as enzim
as pécticas seg
un
do
a Co
miss
ão d
e En
zimas (E
.C.), ad
aptad
o d
e Jayani, S
axena e
Gu
pta
(20
05).
28
3.3 Produção de pectinases por leveduras
Segundo artigo de revisão de Blanco, Sieiro e Villa (1999), a produção de enzimas
pectinolíticas por bactérias e fungos filamentosos foi extensamente estudada e relatada,
devido ao seu papel na fitopatogênese; enquanto que, a produção destas enzimas por
leveduras recebeu menos atenção.
Na citada revisão, os pesquisadores atribuíram mais que um papel ecológico para as
pectinases secretadas por leveduras, elas poderiam estar envolvidas ainda na colonização dos
frutos, pois a sua produção causaria a degradação do tecido da fruta e concomitantemente
liberação dos açúcares das células, que, por sua vez, podem ser assimilados para o
crescimento da levedura, o que causaria o apodrecimento do fruto.
3.3.1 Visão geral das leveduras
Os fungos são seres eucariontes, de nutrição quimio-heterotrófico absorvitiva,
predominantemente aeróbios, com temperatura ótima de crescimento entre 25 a 30º C e pH de
4 a 7, podendo apresentar-se sob a forma leveduriforme ou filamentosa (ALEXOPOULOS;
MIMS; BLACKWELL, 1996).
As leveduras são formadas por células únicas, caracteristicamente esféricas ou ovais, que
se reproduzem assexuadamente por brotamento ou fissão. No entanto, algumas leveduras
produzem brotos que não separam uns dos outros, formando pseudomicélio. Além disso,
alguns fungos exibem dimorfismo, ou seja, podem crescer tanto na forma de fungo
filamentoso quanto na forma de levedura (ALEXOPOULOS; MIMS; BLACKWELL, 1996;
LOGUERCIO-LEITE; ESPOSITO, 2004).
29
Na natureza as leveduras podem ocupar diversos nichos ecológicos, já que são capazes de
utilizar diversos substratos para sua nutrição absortiva. Essa característica permite que as
leveduras secretem ao meio, enzimas extracelulares que degradam macromoléculas a
moléculas pequenas, que serão incorporadas e utilizadas nutricionalmente. Contudo, esses
microrganismos não são tipicamente degradadores de polímeros, preferindo habitats onde
abundam os açúcares solúveis, tais como nectário das flores e a superfície de frutas
(ALEXOPOULOS; MIMS; BLACKWELL, 1996; SANTOS et al., 1996; GALVAGNO;
FORCHIASSIN, 2004).
As leveduras são tradicionalmente identificadas através de técnicas convencionais,
baseadas em características morfológicas (macro e micro) e fisiológicas, entre as quais:
fermentação de diferentes fontes de carbono, assimilação de diferentes fontes de carbono e
nitrogênio, crescimento em diferentes temperaturas, crescimento em diferentes concentrações
de glicose e cloreto de sódio, tolerância ao ácido acético, produção extracelular de compostos
amilóides, coloração com diazônio azul B e resistência a ciclohexamida (YARROW, 1998).
Segundo Alexopoulos, Mims e Blackwell (1996), as leveduras podem ser classificadas
como pertencente aos ascomicetos, basidiomicetos ou fungos mitospóricos.
Nos últimos anos, com a introdução de novas técnicas biotecnológicas grandes progressos
na taxonomia de leveduras vêm ocorrendo (ORBERA-RATON, 2004).
Para Valente, Ramos e Leoncini (1999), o DNA ribossômico (rDNA) é muito empregado
em estudos taxonômicos devido à presença de regiões que evoluem em diferentes taxas,
servindo como base para análise das relações evolucionárias (Figura 05).
Figura 05. Estrutura da unidade de DNA ribossomal (rDNA), o qual consiste de seqüências altamente conservadas codificadoras dos RNAs ribossomais (rRNAs) 18S, 5,8S e 28S, intercaladas com regiões não codificadoras menos conservadas (ITS e IGS). Fonte: adaptado de VILGALYS LAB, http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm
5.8S
25-28S
5S
18S
ITS-1
ITS-2
IGS-1
IGS-2
5’
3’
30
As seqüências do domínio D1/D2 da subunidade maior (26S) do rDNA, que são entre as
regiões as mais variáveis dentro do gene inteiro, estão disponíveis para todas as espécies
conhecidas de leveduras ascomicéticas (KURTZMAN; ROBNETT, 1995, 1997, 1998). Estes
dados estão disponíveis também para leveduras basidiomicéticas, embora em alguns casos
seja necessário seqüênciar mais de uma região do DNA para se obter uma identificação
precisa (FELL et al. 2000). Neste caso, tem-se escolhido as regiões internas não codificadoras
(ITS1 e ITS2) e as regiões não codificadoras intergênicas (IGS1 e IGS2) (FELL; BLATT,
1999; SCORZETTI et al., 2002).
De outra parte, a abordagem baseada em uma combinação de métodos clássicos
(fenotípicas) e moleculares (genotípicas), tem resultado na descoberta de novas espécies e
rearranjos taxonômicos das já conhecidas (MANFIO, 2000; JESPERSEN et al., 2005;
LOPANDIC et al., 2006; LEAW et al., 2006).
Sem as leveduras não existiriam bebidas fermentadas como cervejas e vinhos, e outros
alimentos nos quais esses microrganismos têm papel de destaque em sua produção, como
também na produção de pão e queijo. Deve-se mencionar ainda que as leveduras são
responsáveis pela produção de enzimas de interesse industrial e de valor econômico,
destacando-se as pectinases (ALEXOPOULOS; MIMS; BLACKWELL, 1996; ESPOSITO;
AZEVEDO, 2004). A Figura 06 descreve, de um modo geral, a aplicação biotecnológica das
leveduras em diversas áreas científicas.
Atualmente, há um grande interesse industrial e biotecnológico e, na verdade, um sentido
de urgência sobre a documentação da biodiversidade das leveduras no Brasil, onde,
invariavelmente, uma porcentagem das espécies encontradas é ainda desconhecida para a
ciência (SANTOS et al., 1996; MANFIO, 2000; BUZZINI; MARTINI, 2002; FUENTEFRIA,
2004; MORAES; ROSA; SENE, 2005; RUIVO et al. 2006; ROSA et al., 2007). Hawksworth
31
(2001) estima a existência de 1,5 milhões de espécies de fungos no planeta, e menciona que
apenas 5% da diversidade é conhecida.
Figura 06. Diversidade de áreas que envolvem a biotecnologia das leveduras. Fonte: Walker (1998) apud Pinheiro (2004).
3.3.2 Ocorrência de pectinase em leveduras
A partir da observação de que os trabalhos discordavam sobre a produção de pectinase por
leveduras, os pesquisadores Luh e Phaff (1951), realizaram um estudo qualitativo com vista a
evidenciar a produção de poligalacturonase por estes microrganismos. Os referidos autores
testaram um grande número de espécies e linhagens de leveduras em meio líquido contendo
pectina cítrica como substrato, todas oriundas da Division of Food Technology, University of
Biologia celular, genética, bioquímica, biologia
molecular.
Cancro, SIDA, genética Humana, metabolismo de
drogas. Investigação
biológica
Investigação biomédica
Biossorção de metais, utilização de
efluentes.
Tecnologia Ambiental
Fermento de padeiro, etanol, produtos resultantes da fermentação.
Tecnologia das fermentações
Vacinas, hormônios, factores sanguíneos, probióticos, produtos farmacêuticos.
Saúde pública
Aromas, enzimas , pigmentos, aditivos
alimentares, redutores químicos.
Indústria alimentar / química
32
Califórnia, Estados Unidos. No entanto, somente seis culturas foram capazes de degradar a
pectina do meio, clarificando-o, sendo identificadas como Saccharomyces fragilis e sua forma
anamórfica Candida pseudotropicalis.
Após a pesquisa de Luh e Phaff (1951), outros pesquisadores passaram a investigar a
produção de pectinase extracelular por leveduras.
Sanchez, Guiraud e Galzy (1984), estudaram a atividade pectinolítica de leveduras
isoladas na Costa do Marfim durante a fermentação do cacau, além de outras linhagens
obtidas na Ecole Nationale Superieure de Agronomie, França. Conforme foi verificado por
estudos viscosimétrico, as leveduras Torulopsis candida, Candida norvegenesis,
Kluyveromyces fragilis e Saccharomyces chevalieri degradaram a pectina do meio de cultura,
sendo as quatro positivas para poligalacturonase. No entanto, leveduras positivas para a
pectina liase não foram encontradas nesse estudo.
Outro método para detecção de levedura produtora de poligalacturonase foi descrito por
McKay (1988). Segundo esse método, após o crescimento da cultura em placa de agarose com
ácido poligalacturônico como substrato, se recobre a superfície da placa com solução de
vermelho de rutênio. Sem a degradação da poligalacturonase, o vermelho de rutênio não
penetra no meio, sendo facilmente lavado. Nesse caso, a degradação do ácido
poligalacturônico é detectada pela formação de halo vermelho intenso ao redor da colônia.
Ainda, segundo esse trabalho, as leveduras produtoras de poligalacturonase foram:
Cryptococcus macerans NCYC 578, Candida toressi NCYC 786, Kluyveromyces marxianus
NCYC 587 e C. pseudotropicalis NCYC 744, todas elas obtidas da National Collection of
Yeast Culturres, Inglaterra.
Em 1994, Biely e Sláviková, propuseram um método similar para seleção de leveduras
pectinolíticas em meio sólido. Entretanto, este método consiste na precipitação da pectina
cítrica não degradada em meio sólido, após a adição de brometo de cetil trimetil de amônio;
33
onde as linhagens positivas mostram áreas transparentes em torno das colônias. Dentre os
gêneros de leveduras que exibiram halo de degradação nesse trabalho, têm-se: Ambrosiozyma,
Aureobasidium, Bullera, Candida, Cryptococcus, Georrichum, Klyuveromyces,
Leucosporidium, Rhodosporidium, Saccharomycopsis, Strephanoascus, Trichosporon e
Ustilago, todas elas provenientes da Culture Collection of Yeasts (CCY), Eslováquia.
No Brasil, em 1997, Schwan, Cooper e Wheals, isolaram, identificaram e depositaram na
Coleção de Culturas Tropicais da Fundação Tropical "André Tosello" (CCT), Brasil, as
linhagens de leveduras oriundas da fermentação do cacau. No mesmo trabalho, as linhagens
Kluyveromyces marxianus CCT 3172, K. thermotolerans CCT 1701, Saccharomyces
cervisiae var. chevalieri CCT 1698 e Candida rugopelliculose CCT 1702 foram hábeis na
secreção de poligalacturonase em meio líquido contendo pectina.
Strauss et al. (2001), pesquisaram a produção de enzimas extracelulares de 245 leveduras
não Saccharomyces, isoladas de vinhedos da África do Sul, tendo em vista o seu uso como
catalisadores durante a fermentação do vinho. Dentre outras enzimas, a pectinase foi estudada
por esses pesquisadores, sendo utilizado o meio sólido contendo ácido poligalacturônico para
detecção da produção da enzima. Entre as leveduras pectinolíticas, foram encontradas duas
linhagens de Candida stellata, uma de C. oleophila, uma de C. pulcherrima, uma de C. valida
e quatro de Kloeckera apiculata.
Por sua vez, Trindade et al. (2002), investigaram tanto a biodiversidade de leveduras em
frutas maduras e em polpa de fruta congelada coletadas no Brasil, quanto à produção de
enzimas por estas, incluindo pectinase, tendo em vista sua aplicação industrial. Assim, entre
as 381 linhagens pesquisadas nesse trabalho, somente 16 produziram pectinases
extracelulares, em meio sólido contendo ácido poligalacturônico, conforme listadas a seguir:
levedura preta, Candida azyma, levedura semelhante a C. bombicola, C. krusei,
Leucosporidium scotii, Metschnikowia spp., Pichia membranifaciens, P. antarctica, levedura
34
semelhante a P. fusiformata, Rhodotorula graminis, R. marina, levedura semelhante a
Torulaspora delbrueckii, Trichosporon spp., fungo semelhante a levedura e duas linhagens de
Cryptococcus spp.
Buzzini e Martini (2002) pesquisaram a produção de pectinase extracelular por leveduras
e fungos semelhantes a leveduras. Neste trabalho, os 394 microrganismos testados para
diferentes enzimas, foram isolados de solo, água, inseto e plantas coletadas em florestas do
Brasil. Os citados autores relataram à produção de pectinase, em meio sólido com pectina,
pelas linhagens Candida sake, Pichia guilliermondii, P. spartinae, correspondendo 1,5% do
total de linhagens positivas dos ascomicetos; Pseudozymas antarctica, correspondendo a
18,7% do total de linhagens positivas dos basidiomiceto; Aureobasidium pullulans,
correspondendo a 21,7% do total de linhagens positivas dos fungo semelhante a levedura.
Este estudo demonstrou o potencial de microrganismos isolados de ambiente tropical, como
fontes de enzimas de interesse industrial e biotecnológicas.
No trabalho de Nakagawa et al. (2004), leveduras psicrófilas foram isoladas do solo em
Abashiri no Japão, e testadas quanto a produção de enzimas pectinolíticas em baixas
temperaturas, usando meio sólido contendo pectina. Nesse trabalho, foram encontradas três
espécies de leveduras psicrófilas pectinolíticas, que podem ser utilizadas na indústria de
alimentos, são elas: Cryptococcus cylindricus, Mrakia frigida e Cystofilobasidium capitatum.
Já no trabalho de Silva et al. (2005), de um total de 300 leveduras isoladas de frutas
frescas e polpas de frutas tropicais do Brasil e da Colômbia, 21 foram positivas para
poligalacturonase, usando como substrato em meio sólido o ácido poligalacturônico. Essas 21
foram: Kluyveromyces wickerhamii (3), Stephanoascus smithiae (5), Debaryomyces hansenii
(2), D. polymorphus (1), Candida intermedia (1), C. pseudoglaebosa (1), C. krusei (1),
Zygosacchoromyces fermentati (1), Z. cidri (1), Pichia guilliermondii (2), P. angusta (1), P.
anomala (1), Pichia sp. (1). As leveduras S. smithiae (isolados FT-01, 168, 36 e 147), Pichia
35
sp. (FT-28), P. anomala (SL-125) e K. wickerhamii (185), também foram capazes de secretar
pectina liase, no entanto, em meio contendo pectina como substrato.
Mais recentemente, Oliveira et al. (2006) analisaram 201 isolados da levedura
Saccharomyces cerevisiae quanto à atividade pectinolítica de poligalactuonase e pectinase em
meio sólido, utilizando ácido poligalacturônico e pectina como substrato, respectivamente.
Todos esses isolados foram provenientes de amostras do “leite de leveduras” coletadas em
uma fábrica de etanol cítrico no Brasil. Neste trabalho os autores encontraram 107 isolados
que apresentaram secreção da poligalacturonase e 97 da pectinase.
Deve-se ainda mencionar o trabalho de Uenojo e Pastore (2006). Por sua vez, esses
pesquisadores isolaram 104 leveduras, de resíduos de agroindústrias, e as testaram quanto à
produção de pectinase em meio sólido contendo pectina cítrica, as quais 18 foram
consideradas positivas.
A aparente contradição entre os resultados encontrados por Luh e Phaff (1951), e dos
pesquisadores mais recentes, podem ser devido ao método empregado em cada caso
(BLANCO; SIEIRO; VILLA, 1999). Nos trabalhos recentes, os pesquisadores passaram a
aferir a produção de pectinase extracelular pelas leveduras através da formação de halo de
degradação do substrato em meio sólido (Figura 07).
O uso de meio sólido, ao contrário do meio líquido, permite a triagem de uma grande
quantidade de microorganismos, possibilitando uma rápida detecção de enzimas específicas,
além da determinação de variantes fisiológicos (BIELY; SLÁVIKOVÁ, 1994; STRAUSS et
al., 2001; TRINDADE et al., 2002; BUZZINI; MARTINI, 2002; FUENTEFRIA, 2004;
SILVA et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2006; UENOJO; PASTORE, 2006).
Cabe comentar que Kluyveromyces marxianus é uma levedura anteriormente designada K.
fragilis ou Saccharomyces fragilis (ROSE; HARRISON, 1969 apud PEREIRA, 2005).
36
3.3.3 Generalidades sobre os fatores que afetam a produção de pectinases em leveduras
O estudo regulatório de síntese e excreção de enzimas por microrganismos é um aspecto
do metabolismo celular de grande interesse para a indústria produtora de enzimas, sendo
dependente da linhagem selecionada, da forma de condução do processo fermentativo e das
características do meio de cultivo (SCHMIDELL, 2001).
Figura 07. Halo de hidrólise do ácido poligalacturônico originado por Saccharomyces cerevisiae CECT 1389, proveniente da Spanish Type Culture Collection, Espanha. Fonte: Blanco et al. (1994) apud Blanco, Sieiro e Villa (1999).
Segundo Said e Pietro (2002), as enzimas produzidas pelos microrganismos podem estar
localizadas dentro da célula (enzimas intracelulares), ou podem ser sintetizadas e
posteriormente excretadas no meio (enzimas extracelulares); sendo esta produção influenciada
pela fonte de carbono, tensão de oxigênio, pH do meio de cultivo, tempo de incubação e
tamanho do inoculo.
Conforme Galvagno e Forchiassin (2004), muitas vezes, as enzimas necessárias para
viabilizar o metabolismo básico de um fungo estão sempre presentes e são enzimas
constitutivas; em outros casos, é necessária a presença do substrato para induzir a síntese ou a
atividade da enzima para sua degradação, são as enzimas induzíveis. Além do mais, para os
37
citados autores, os fungos podem produzir enzimas adaptativas na presença de um substrato
que, normalmente não utilizam.
No trabalho de McKay (1988), as leveduras Kluyveromyces marxianus NCYC 587 e a
Candida pseudotropicalis NCYC 744, produziram a poligalacturonase em meio contendo
glicose como substrato, nesse caso a enzima foi constitutiva. Por outro lado, no mesmo
trabalho, as leveduras Cryptococcus macerans NCYC 578 e a Candida toressi NCYC 786,
produziram poligalacturonase quando utilizou o ácido poligalacturônico como única fonte de
carbono e de energia, indicando que a secreção da enzima foi induzida.
Entretanto, o trabalho de Schwan e Rose (1994) demonstrou que a produção de
poligalacturonase sob condições anaeróbicas acontece somente durante a fase de crescimento
da levedura Kluyveromyces marxianus CCT 3172, isolada da fermentação do cacau, sendo
uma capacidade constitutiva, porque pectina, ácido poligalacturônico e ácido galacturônico,
não foram requeridos para induzir a síntese desta enzima. Além do mais, uma fonte de
carbono e de energia facilmente metabolizável, como a glicose 1% (p/v), foi requerida para
regular a atividade pectinolítica, não ocorrendo o processo de repressão catabólica nesta
concentração de açúcar.
Said e Pietro (2002) chamam de repressão catabólica o processo pelo qual a síntese de
determinadas enzimas, em uma seqüência metabólica, é suprimida quando uma fonte de
carbono facilmente metabolizável está presente.
Já o trabalho de Moyo et al. (2003), que apresenta a otimização das condições de
crescimento e da atividade pectinolítica da levedura Kluyveromyces wickerhamii pela
metodologia de superfície de resposta, aponta que a produção de poligalacturonase
extracelular por essa linhagem foi parcialmente constitutiva; pois, a presença de pectina
[1%(p/v)] no meio contendo glicose [1%(p/v)] aumentou em aproximadamente 50% a
atividade pectinolítica. Além disso, as melhores condições estimadas para a atividade foram
38
na combinação das seguintes variáveis independentes: pH 5,0, temperatura 32º C e 91 horas
de incubação. Esse trabalho indicou ainda que o extrato cru com a enzima foi termoestável em
várias temperaturas quando na presença de íons Ca2+, sendo inibido pelos íons Mg2+, Zn2+,
Co2+, Mn2+ e Na+.
Em sentido amplo, Said e Pietro (2002) consideram que a produção de pectinases
extracelulares pelos microrganismos requer muitas vezes um indutor, por exemplo, a pectina.
Devendo-se ainda destacar que em alguns casos, a principal fonte de carbono pode também
servir como indutor. Da mesma forma, Hoondal et al. (2002) em artigo de revisão relatam que
as enzimas pectinolíticas microbianas são induzidas.
Com base nas considerações de Blanco, Sieiro e Villa (1999), dois tipos de leveduras
podem ser discernidos quanto à produção de enzimas. Um grupo compreende aquelas
incapazes de usar a pectina, o pectato ou seus produtos da hidrólise (ácido galacturônico)
como fonte de carbono. O outro grupo abrange as leveduras que, assim como fungos
semelhantes a leveduras, têm habilidade de crescer usando substâncias pécticas com a única
fonte de carbono, sugerindo um sistema enzimático mais complexo.
3.4 Produção e aplicação industrial das pectinases
A utilização de enzimas de forma geral e, em particular o uso industrial, tenderá a
aumentar no futuro, porque grande parte dos produtos manufaturados, em países
desenvolvidos, é de origem biológica e também porque os custos das enzimas utilizadas têm
declinado (ABRAHÃO NETO, 2001).
Atualmente, apenas 5% das enzimas comercialmente importantes são produzidas por
fermentação, em estado sólido (SAID; PIETRO, 2002). A produção de enzimas em escala
industrial se faz majoritariamente por fermentação submersa (SANT’ANNA JR., 2001). Os
39
processos de fermentação submersa dominam a produção da maioria das enzimas comerciais,
principalmente, porque o controle do processo é mais fácil neste sistema, predominando os
reatores agitados mecanicamente (SANT’ANNA JR., 2001; SAID; PIETRO, 2002).
O mercado industrial total de enzima em 2009 espera alcançar quase 2,4 bilhões de
dólares (Gráfico 01). Em artigo de revisão, Jayani, Saxena e Gupta (2005), relatam que as
pectinases microbianas correspondem a 25% das vendas globais de enzimas para indústria de
alimentos.
As primeiras aplicações comerciais das pectinases foram realizadas em 1930 na
produção de vinhos e sucos de frutas (KASHYAP et al., 2001). Atualmente, a maioria das
preparações comerciais deste grupo de enzimas é produzida por fungos filamentosos, sendo o
Aspergillus niger a principal fonte (BLANCO; SIEIRO; VILLA, 1999).
Gráfico 01. Mercados globais de Enzima baseados nos setores da aplicação, 2002-2009 (milhões de dólares). Fonte: BCC Inc, 2004.
Enzimas para a transformação de matérias primas
Enzimas para a indústria de alimentos
Enzimas para a indústria de ração animal
Milh
ões
de d
ólar
es
40
Além do mais, o A. niger têm o status de microrganismo GRAS (Generally Regarding
As Safe), produzindo várias pectinases, incluindo poligalacturonase, pectina liase e a
indesejável pectinesterase (BLANCO; SIEIRO; VILLA, 1999). Além destas enzimas são
produzidas outras (amilase, por exemplo), assim como metabólitos (metanol, por exemplo)
que conferem uma grande complexidade à solução, conduzindo a maiores dificuldades
técnicas e financeiras no processo de separação (BLANCO; SIEIRO; VILLA, 1999; SILVA
et al., 2005; PEREIRA, 2005). Para Solis, Flores e Huitron (1990), em fungo filamentoso a
produção das enzimas pécticas é regulada por um indutor e mecanismos de repressão
catabólica.
As leveduras representam uma alternativa à produção das pectinases, pois algumas
linhagens produzem somente um tipo de enzima pectinolítica (poligalacturonase ou pectina
liase) e geralmente não apresentam atividade para pectinesterase, dando origem a misturas
menos complexas (BLANCO; SIEIRO; VILLA, 1999; SILVA et al., 2005; PEREIRA, 2005).
No caso da levedura Kluyveromyces marxianus, cerca de 90% do total de proteína secretada
são poligalacturonase (BARNBY, 1987 apud PEREIRA, 2005); além disso, K. marxianus
também é considerado microrganismo GRAS (BLANCO; SIEIRO; VILLA, 1999; PEREIRA,
2005).
Além disso, com a manipulação genética de microrganismos pectinolíticos, como
linhagens das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Kluyveromyces marxianus, é possível
aumentar a produção da enzima desejada de modo a tornar o processo rentável
industrialmente (JIA; WHEALS, 2000). Gene para poligalacturonase da levedura
Saccharomyces cerevisiae envolvido na degradação da pectina tem sido clonado e
seqüenciado, resultando em hiperexpressão em linhagem não pectinolítica (GOGNIES et al.,
1999). O trabalho de Blanco et al. (1998), por sua vez, mostrou que a expressão do gene
41
pectinolítico de diversas linhagens de Saccharomyces cerevisiae dependeu do plasmídio
usado e da base genética de cada linhagem.
Os seguintes tópicos discorrem sobre algumas das convencionais e novas aplicações das
enzimas pectinolíticas.
3.4.1 Processamento de frutas e vegetais
O consumo de sucos, néctares e polpas a base de frutas e vegetais tem registrado um
expressivo crescimento no mundo, tanto por seus sabores quanto por suas propriedades
nutritivas. De outra parte, o uso de enzimas nas etapas de produção tem aumentado o
rendimento e a qualidade destes produtos (BHAT, 2000).
As enzimas pectinolíticas são componentes importantes em toda a tecnologia empregada
no processamento de frutas e vegetais, sendo usadas geralmente para extração, clarificação e
estabilização da turbidez (BHAT, 2000; JAYANI; SAXENA; GUPTA, 2005).
Assim sendo, a pectinase é empregada no processo de extração para reduzir a viscosidade
e aumentar o rendimento do processo. Também é usada na clarificação a fim de remover
partículas responsáveis pela turbidez, conferindo melhor aparência aos produtos finais,
visando alcançar melhor aceitação dos mesmos, por parte dos consumidores (CANTO;
MENEZES, 1995).
Muitas vezes, as pectinases estão disponíveis na forma de misturas com outras enzimas,
ou seja, como complexos enzimáticos, contendo também celulase, hemicelulase e xilanase
(BHAT, 2000; KASHYAP et al., 2001).
Segundo Canto e Menezes (1995), no suco de maçã o uso de complexos enzimáticos é
muito importante para hidrolisar a pectina que ocorre em grande quantidade nessa fruta,
mesmo nas maçãs mais maduras. Já na produção de suco clarificado de limão, emprega-se um
42
complexo contendo pectinase e celulase para atuar tanto na hidrólise da pectina, quanto na
membrana externa da célula contendo o suco da fruta. No caso do suco de uva, não são
empregados complexos enzimáticos por estes conterem celulases, as quais levariam à
extração de muita polpa, o que não é desejável quando o objetivo é obter suco clarificado.
Cardoso et al. (1998), utilizaram complexos pectinolíticos e enzimáticos para aumentar o
rendimento e reduzir a viscosidade do suco de banana. Assim, o suco obtido com pectinase
comercial (Clarex) apresentou rendimento 9% maior que aquele obtido com pectinase e
celulase (Sigma), sugerindo que a concentração de pectinase na Clarex teria sido maior do que
a encontrada no Sigma.
Em artigo de revisão, Bhat (2000) menciona que a maceração enzimática na produção de
néctares e polpas de frutas possui grande valor industrial e comercial, particularmente no
aproveitamento de frutas tropicais facilmente perecíveis, como manga, goiaba e mamão.
Já na revisão de Lang e Dörnenburg (2000), considera-se que as poligalacturonases
fúngicas são utilizadas no processamento de sucos para aumentar o seu rendimento, pois
facilita a maceração e filtração.
Granada, Vendruscolo e Treptow (2001), utilizaram enzimas pectinolíticas na extração do
suco de amora-preta, incrementando o rendimento em 52% na prensagem da polpa. Além
disso, a utilização do preparado enzimático resultou em um suco mais encorpado, com mais
cor e sabor, sendo preferido pelos consumidores.
Por sua vez, Bastos et al. (2002) com o objetivo de aumentar o rendimento durante o
processo de extração da polpa de cupuaçu, adicionaram à polpa bruta dois tipos de
preparações enzimáticas de ação pectolítica (Citrozym-L e Rohament-PL). A utilização destas
preparações enzimáticas comerciais apresentou efeitos relevantes no aumento do rendimento
da extração da polpa, onde a Citrozym-L mostrou maior eficiência durante o processo de
extração, devido a sua constituição com pectinases, celulases e arabinases.
43
No trabalho de Santini (2004), a hidrólise enzimática utilizando Pectinex AFP L-3
(Novozymes) apresentou-se muito eficiente no processo de clarificação do suco de pêssego,
devido à redução da viscosidade e dos sólidos suspensos.
Semenova et al. (2006) utilizaram pectina liase de fungo para a produção do suco de
cranberry e na clarificação do suco de maçã, sendo esta pectinase mais eficientemente na
remoção da pectina altamente esterificada.
3.4.2 Produção de vinho
Outra grande área importante de utilização de pectinase é a indústria de vinhos.
Na indústria de vinho, frequentemente, são usadas formulações prontas contendo um
complexo constituído de pectinases, celulases e proteases. No caso dos vinhos brancos é
empregada pectinase durante o processamento, para obter um maior rendimento de extração e
para facilitar a prensagem. Entretanto doses excessivas da enzima, empregadas para aumentar
a extração também pode extrair os polifenóis da casca da uva, os quais oxidam o vinho
branco, tornando-o amarelo. No caso dos vinhos tintos, as enzimas nem sempre são
empregadas logo após o esmagamento, porque a casca fica em contato com o mosto por um
tempo muito mais prolongado. Assim, na produção de vinhos tintos de alta qualidade, as
enzimas são empregadas apenas na fase de acabamento do produto, após a fermentação, para,
tão somente, clarificar o vinho (CANTO; MENEZES, 1995).
Fertonani et al. (2006) obtiveram em condições semelhantes às observadas no setor
industrial, vinhos de maçã utilizando o mosto despectinizado com uma pectinase de nome
comercial Pectinex 3XL (Novozymes).
44
3.4.3 Indústria têxtil
O retting microbiano é um processo antigo, muito utilizado pela indústria têxtil, no qual
populações de microrganismos fermentadores, principalmente bactérias e fungos
filamentosos, degradam a pectina da casca do vegetal, tradicionalmente da juta e do linho,
liberando as fibras (HOONDAL et al., 2002).
Evans, Akin e Foulk (2002), estudaram o efeito da poligalacturonase fúngica no retting do
linho. Como resultado do tratamento, houve um eficiente aumento na liberação das fibras.
Na indústria têxtil, os fios obtidos do algodão cru são engomados para protegê-los da
abrasão durante a sua transformação em tecido. Entretanto, antes do tingimento, essa goma
deve ser removida, assim com as substâncias não celulósicas. O tratamento químico utilizado
na desengomagem emprega, entre outros, a soda cáustica, porém seu emprego tem sido
reduzido, sobretudo pelos problemas ambientais decorrentes do efluente (HOONDAL et al.,
2002).
Ainda segundo Hoondal et al. (2002), o uso de enzimas específicas tais como pectinases
(degradação das substâncias pécticas) e amilase (degradação da goma), tem diminuído o uso
dos produtos químicos no processamento do algodão, melhorando tanto a qualidade dos
efluentes, quanto do produto final, além de reduzir o consumo de energia.
No trabalho de Agrawal et al. (2007), as pectinases alcalinas foram 75% mais eficientes
do que as pectinases ácidas na degradação das substâncias pécticas associadas às fibras do
algodão.
Na degomagem de fibras de caule, por exemplo, do linho, rami, juta e o cânhamo, também
tem sido empregado complexos enzimáticos contendo pectinase e xilanase, porém livres de
celulase, pois essa pode danificar a fibra, comprometendo a qualidade do produto
(HOONDAL et al., 2002).
45
3.4.4 Extração de óleo
Os processos industriais para a produção de óleos vegetais geralmente envolvem extração
por solventes orgânicos, precedidos ou não de processos mecânicos (ROSENTHAL; PYLE;
NIRANJAN, 1996). O hexano é o solvente comumente utilizado, porém é potencialmente
carcinogênico e têm propriedades tóxicas (ROSENTHAL; PYLE; NIRANJAN, 1996;
KASHYAP et al., 2001).
Com isso, uma alternativa ao uso deste solvente é a utilização de soluções aquosas
enzimáticas (ROSENTHAL; PYLE; NIRANJAN, 1996). Por sua vez, a seleção do extrato
enzimático depende da composição da parede da oleaginosa em questão (SANTOS;
FERRARI, 2005). Geralmente, o extrato contém uma mistura de celulases, hemicelulases,
pectinases, amilases e proteases, pois são mais eficientes que isoladamente (ABDULKARIM
et al., 2006). Estas enzimas hidrolizam principalmente os polissacarídeos estruturais da parede
celular, ocorrendo também o rompimento das proteínas e lipídeos que dão forma à membrana
celular, liberando óleo que por outro método dificilmente seria extraído (ROSENTHAL;
PYLE; NIRANJAN, 1996).
A aplicação industrial da comercial enzima Olivex, um preparado de pectinase com baixa
concentração de celulase e hemicelulase produzida por Aspergillus aculeatus, melhorou a
extração do óleo de oliva (KASHYAP et al., 2001). Hadj-Taieb et al. (2006), compararam o
rendimento obtido na extração do óleo de oliva com e sem enzimas pectinolíticas, concluindo
que a aplicação enzimática melhorou a extração em aproximadamente 10%.
O Centro Nacional de Pesquisa de Tecnologia Agroindustrial de Alimentos (CTAA) da
Unidade da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) vêm desenvolvendo
pesquisa que visam produzir enzimas específicas (celulase, hemicelulase, poligalacturonase e
46
xilanase) para a extração de óleos vegetais, em especial dos óleos de abacate, soja e palma
(FREITAS et al., 1998).
3.4.5 Fermentação do café, chá e cacau
A diversidade de microrganismos associados com o processamento dos grãos do café foi
estudada por Silva et al. (2000). Geralmente, em todos os estágios do processo, as bactérias
foram o grupo mais abundante, seguido por fungos filamentosos e finalmente leveduras, as
quais mostraram um aumento durante a fermentação. Os gêneros mais comuns de leveduras
foram Pichia, Candida, Arxula e Saccharomycopsis, sendo que, dentre as espécies
identificadas encontram linhagens produtoras de pectinase, as quais contribuíram na
degradação da mucilagem aderente aos grãos, colaborando na qualidade final do produto.
Por sua vez, Masoud e Jespersen (2006), concluíram que linhagens de Pichia anomala e
P. kluyveri poderiam estar envolvidas na degradação da pectina durante a fermentação do café
por produzirem poligalacturonase.
O crescente interesse pelo consumo de chá deve-se grandemente a estudos que mostram a
relação inversa entre seu consumo e o risco de doenças degenerativas, como câncer e doenças
do coração (MATSUBARA; RODRIGUEZ-AMAYA, 2006).
Há, portanto, um interesse na utilização de preparações enzimáticas para melhorar a
produção de chás. Assim, as pectinases são requisitadas porque aceleram a fermentação dessa
bebida ao degradar as substâncias pécticas das folhas (ANGAYARKANNI et al., 2002).
Segundo Schwan e Wheals (2004), a fermentação microbiana é uma etapa essencial para a
produção de chocolate, sendo a sucessão de microrganismos (bactérias, fungos filamentosos e
leveduras) propiciada pela polpa mucilaginosa que envolve as amêndoas do cacau. Contudo, a
redução da quantidade de pectina pode conduzir para uma degradação da mucilagem,
47
contribuindo na melhora no processamento. Assim, um inóculo iniciador com leveduras
pectinolíticas pode render um chocolate de boa qualidade.
No trabalho de Ardhana e Fleet (2003), a poligalacturonase provavelmente contribuiu para
degradação da mucilagem das amêndoas do cacau.
3.4.6 Ração animal
Os animais monogástricos (aves e suínos, por exemplo) apresentam limitações no
aproveitamento de certos nutrientes presentes nos vegetais. Entretanto, as pectinases fazem
parte de uma mistura enzimática utilizada atualmente na alimentação desses animais. Como
conseqüência, ocorre uma melhora no desempenho do animal, os quais apresentam fezes mais
secas e sem resíduos de alimento (LECZNIESKI, 2006).
Saleh et al. (2005) concluíram que o rendimento da carcaça de frangos de corte foi
influenciado pela combinação de celulase, hemicelulose e pectinases adicionadas na dieta.
3.4.7 Purificação de vírus de plantas
O desenvolvimento das técnicas de purificação de vírus tem simplificado o isolamento das
partículas virais dos constituintes da planta, contribuindo para estudos morfológicos e
fisiológicos. Entretanto, para liberar os vírus dos tecidos vegetais, determinadas enzimas são
requeridas, como por exemplo, as pectinases (HOONDAL et al., 2002).
Assim sendo, para detecção do vírus da hepatite A em framboesa e morango, foram
utilizadas pectinases para remoção da pectina dessas frutas, facilitando a liberação dos vírus,
os quais foram identificados via amplificação do DNA in vitro (RZEZUTKA; D'AGOSTINO;
COOK, 2006).
48
Já na detecção de vírus entéricos (vírus da hepatite A, norovirus e rotavirus) em amostras
de bagas frescas, a adição de um tratamento com pectinase melhorou a sensibilidade do
método, pois as substâncias pécticas do fruto atuavam como inibidores (BUTOT;
PUTALLAZ; SANCHEZ, 2007).
3.4.8 Tratamento de águas residuárias da indústria
Compondo os resíduos gerados pelas indústrias de processamento de alimentos vegetais,
encontramos as substâncias pécticas. Entretanto, segundo Hoondal et al. (2002), o pré-
tratamento deste resíduo industrial com enzimas pectinolíticas provavelmente removerá o
material pectinoso, facilitando a decomposição da matéria orgânica pelo sistema de lodo
ativado.
Segundo estudo de Margesin, Fauster e Fonteyne (2005), leveduras psicrófilas produtoras
de pectato liase, isoladas e identificadas como Mrakia frigida, poderiam ser utilizadas em
escala industrial no pré-tratamento, a baixas temperaturas, de águas residuarias que
contenham substâncias pécticas.
3.4.9 Indústria de papel e celulose
A indústria de papel e celulose representa um dos mais expressivos setores industriais do
mundo e espera-se intensificar seus processos com o uso de enzimas microbianas (BAJPAI,
1999).
Durante a fabricação de papel, as pectinases podem despolimerizar o ácido
poligalacturônico em unidades de ácido galacturônico e subsequentemente baixar a demanda
catiônica da polpa celulósica, descorada com peróxido alcalino. A variação na retenção entre
49
substâncias pécticas e polímeros catiônicos atinge diretamente a qualidade final do produto.
Logo, o controle deste processo é de grande importância para a indústria de papel e polpa de
celulose (REID; RICARD, 2000).
Convem ainda mencionar que se empregam as pectinases para obtenção de outros
produtos e processos, como apresentados, a seguir:
Menezes, Sarmento e Daiuto (1998) verificaram a influência da adição de preparados
comerciais de celulase e pectinase na pubagem. Segundo estes pesquisadores, a adição desses
preparados enzimáticos acelerou a fermentação das raízes da mandioca, antecipando a
estabilização do pH e da acidez.
Leonel e Cereda (2000) avaliaram a menor concentração de pectinase (Pectinex Ultra SP-
L) necessária no processo de hidrólise e sacarificação do farelo de mandioca para produção de
etanol e à geração de um resíduo fibroso, com características para o aproveitamento como
fibra dietética.
3.5 O Semi-árido brasileiro como local potencial na obtenção de enzimas
No relatório final sobre a Diversidade Microbiana no Brasil, onde as fontes de consulta
incluíram questionários enviados para pesquisadores atuantes em Microbiologia, bem como
consultas às bases de dados on-line e publicações científicas em revistas indexadas nos
últimos 10 anos (1989-1999), Manfio (2000) pôde concluir preliminarmente que a atividade
de pesquisa em diversidade microbiana, e, consequentemente, a exploração tecnológica dos
recursos microbianos, são ainda bastante limitados no Brasil.
O Semi-árido brasileiro ocupa uma área de aproximadamente 900.000 km², cobrindo
quase 8% do território nacional e o Bioma Caatinga ocupa a maior parte dessa região, sendo
50
estimada a sua biodiversidade na ordem de mais de 20.000 espécies, entre animais, fungos e
plantas (Figura 08). Entretanto, dois dos maiores problemas associados ao Semi-árido são o
elevado grau de degradação ambiental e o baixo conhecimento da sua biodiversidade (PPBio,
http://www.uefs.br/ppbio/index.html).
Figura 08. Mapa da Região Nordeste mostrando as ecorregiões do Bioma das Caatingas e as 57 áreas prioritárias para conservação; as seis áreas de Extrema Importância Biológica em vermelho estão sendo inventariadas pelo PPBio. Fonte: PPBio, http://www.uefs.br/ppbio/index.html
51
Mais recentemente, a pesquisa em biodiversidade microbiana no Brasil ganhou força, com
a criação do Programa de Pesquisa em Biodiversidade (PPBio). Um dos projetos temáticos do
PPBio no Semi-árido está relacionado com prospecção de compostos bioativos produzidos
por microorganismos. Neste projeto, estão sendo isolados e identificados microorganismos de
diversos grupos (bactérias, leveduras e fungos filamentosos) do Semi-árido brasileiro para que
suas atividades microbianas e enzimáticas possam ser analisadas (PPBio,
http://www.uefs.br/ppbio/index.html).
Em sentido amplo, a biodiversidade de microrganismos no Semi-árido brasileiro é mais
amplamente conhecida e melhor documentada para os fungos filamentosos (GUSMÃO,
2004). Os resultados de projetos relacionados ao estudo da diversidade de fungos na região
Semi-árida do Estado da Bahia têm revelado um número surpreendente de novos registros
para o Brasil e para o Semi-árido; cerca de 30% do material coletado e identificado
representam novos registros ou espécies novas (GUSMÃO; MARQUES, 2006). Entretanto,
somente dois trabalhos voltados para leveduras no Semi-árido foram encontrados, os quais
determinaram espécies associadas a flores e frutos (SANTOS et al., 1996) e a solo (COSTA,
2006).
Assim, a diversidade de leveduras do Semi-árido e seu potencial biotecnológico são ainda
muito pouco conhecidos, porém altamente interessante dentro de um programa de
desenvolvimento científico, tecnológico, econômico e ambiental.
52
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Isolamento e purificação dos microrganismos leveduriformes do Semi-árido baiano
Os substratos foram coletados em abril de 2006, ao longo das rodovias baianas, sendo
fotografados e georreferenciados os pontos das coletas.
Amostras de solos e flores foram coletadas e acondicionadas em sacos plásticos
individuais. Por outro lado, parte de frutos e necroses vegetais foram retiradas e transferidas
individualmente para tubo de ensaio com 1,0 mL de solução de extrato de levedura 1% (p/v),
para estimular o crescimento dos microrganismos leveduriformes, acrescido de cloranfenicol
0,01% (p/v), para inibir o crescimento de contaminantes bacterianos. Os insetos associados as
diferentes espécies de flores foram capturados individualmente.
Para o isolamento dos microrganismos leveduriformes a partir das amostras de solo foi
empregado o método de diluição seriada (SILVA; JUNQUEIRA; SIVEIRA, 2001), sendo
realizadas diluições de 10-1 a 10-3, preparadas em solução salina estéril 0,45% (p/v), pH 7,0.
De cada diluição, uma alíquota de 0,1 mL foi retirada e espalhada, em triplicadas, com auxílio
de uma alça de Drigalski, em placa de Petri contendo ágar YM (WICKERHAM, 1951 apud
MAZUR, 1961), acrescido de cloranfenicol 0,01%.
Para obtenção dos microrganismos leveduriformes das flores, o nectário floral foi
perfurado e raspado com uma alça de inoculação e esta estriada em ágar YM, acrescido de
cloranfenicol 0,01%.
Para o isolamento dos microrganismos leveduriformes de frutos e necrose, após
crescimento por 12 h a temperatura ambiente, a alça de inoculação foi mergulhada nos tubos
53
contendo a amostra, sendo em seguida semeada em ágar YM, acrescido de cloranfenicol
0,01%.
Para isolar os microrganismos leveduriformes associados aos insetos, esses foram
colocados a caminhar por alguns minutos sobre o ágar YM, acrescido de cloranfenicol 0,01%,
sendo posteriormente preservados em álcool a 70%.
Todas as placas inoculadas foram incubadas a 28ºC, sendo observadas diariamente, num
período de 2 a 5 dias. Colônias morfologicamente distintas de cada placa foram semeadas por
esgotamento em ágar YM e incubadas a 28ºC por 24 horas, para obtenção de culturas puras.
A triagem foi realizada no Laboratório de Pesquisa em Microbiologia (LAPEM) do
Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS).
4.2 Preservação dos microrganismos leveduriformes
Das colônias puras foram preparadas lâminas para exame microscópico para a verificação
da morfologia e pureza dos microrganismos, para isso foi utilizando o corante azul de
metileno 1% (p/v).
Os isolados leveduriformes foram repicados em tubos de ensaio contendo o ágar YM
inclinado. Após incubação a 28ºC por 24 h, foram adicionados sobre as colônias obtidas, 4,0
mL do crioprotetor glicerol 15% (v/v) estéril, sendo o conteúdo do tubo homogeneizado em
um agitador rotatório até o desprendimento das colônias do ágar. Imediatamente foi
transferidos, em triplicadas, 1,0 mL da suspensão obtida para tubos de polipropileno com
capacidade para 1,5 mL, sendo estes incubados por 10 min em gelo. Em seguida, os tubos
foram transferidos para um ultrafreezer a -86ºC e aí mantidos até sua utilização.
Sempre que necessário procedia-se a recuperação das células, semeando a solução
descongelada em uma placa com o ágar YM, seguindo de incubação a 28ºC por 24 a 48 h e a
54
verificação da pureza do material macroscópicamente e microscópicamente, quando
necessário.
4.3 Seleção dos microrganismos leveduriformes produtores de pectinases extracelulares:
a poligalacturonase (PG) e a pectina liase (PL)
Os microrganismos leveduriformes preservados foram crescidos em ágar YM a 28ºC por
pelo menos 18 h, mas não mais do que 48 h, para verificação da pureza e obtenção de células
metabolicamente ativas.
A seguir, foram preparados os inóculos em solução salina estéril, equivalentes a escala 3
de McFarland (Colorímetro VITEK, bioMérieux), que contém aproximadamente 108
UFC/mL. As suspensões obtidas foram homogeneizadas em agitador rotatório de tubo, e uma
alíquota de 0,3 µL foi inoculada na superfície do meio diferencial (meio MP-5) para verificar
a produção da enzima poligalacturonase (PG); e igual alíquota no meio diferencial (meio MP-
7) para verificar a produção de pectina liase (PL) (HANKIN; LACY, 1984 apud SILVA,
2003).
As placas contendo o inóculo foram incubadas a 28ºC e, após 48 h, sobre a superfície do
meio, foram cuidadosamente adicionados 3 mL da solução aquosa de hexadecil trimetil
amônio brometo 1% (p/v). Neste caso, o reagente precipita as substâncias pécticas intactas no
meio, tornando-o opaco; por outro lado, um halo claro ao redor das colônias pectinolíticas é
formado, indicando degradação do ácido poligalacturônico ou da pectina, substratos presentes
nos meios MP-5 e MP-7, respectivamente.
Tanto o diâmetro do halo, quanto o da colônia foram mensurados com uma régua
milimetrada.
55
A atividade enzimática em meio sólido foi determinada semiquantitativamente, através da
relação entre diâmetro médio do halo de degradação do substrato e o diâmetro médio de
crescimento da colônia, expresso como Índice Enzimático, conforme Hankin e Anagnostakis
(1975). Desse modo, quanto maior o halo de degradação, maior é o índice e,
conseqüentemente, maior é a atividade enzimática no meio.
O experimento foi conduzido em triplicadas e a levedura Kluyveromyces marxianus CCT
3172, cedida gentilmente pela Professora Dra. Rosane Freitas Schwan (Laboratório de
Fisiologia de Microrganismos, Departamento de Biologia da Universidade Federal de
Lavras), foi utilizada como controle positivo para poligalacturonase.
4.4 Identificação molecular dos microrganismos leveduriformes pectinolíticos
4.4.1 Extração de DNA genômico
Para obtenção do DNA, os isolados foram incubadas a 28ºC em 15 mL de caldo YM, sob
agitação orbital mecânica a 250 rpm por 12 h, seguido de centrifugação de 1,5 mL de cada
amostra a 13.000 rpm por 10 minutos em microtubos de 2 mL. O sobrenadante foi descartado
e a massa celular obtida submetida à maceração com nitrogênio líquido com auxílio de
bastões de vidro.
Imediatamente após a maceração, adicionou-se em cada tubo 1 mL de tampão de extração
de DNA [2% CTAB; 1,4 M NaCl; 20 mM EDTA (pH 8,0); 100 mM Tris HCl (pH 8,0); 2%
PVP-40] previamente aquecido a 65ºC e 4 µL de β-mercaptoetanol, protocolo modificado de
Doyle e Doyle (1987). Os tubos foram invertidos por algumas vezes e colocados em banho-
maria a 65ºC por 30 min. Em seguida a incubação no banho-maria, adicionou-se aos tubos,
56
em temperatura ambiente, 800 µL de Clorofórmio: Álcool Isoamílico (24:1), sendo
submetidos à agitação constante por 60 min, até formar uma emulsão.
Posteriormente, a emulsão foi centrifugada a 13.000 rpm por 10 min, seguindo da
transferência da fase aquosa superior para novos tubos, tomando cuidado para não contaminá-
la com a interfase. Adicionou-se a solução dos novos tubos, um volume igual de isopropanol
gelado, invertendo gentilmente o tubo por algumas vezes e deixando-os a -20ºC por 12 h.
Após esse tempo, realizou-se uma nova centrifugação a 13.000 rpm por 10 min para obtenção
do precipitado, o qual foi lavado três vezes com 1 mL de etanol 70%, tomando cuidado para
não perder o precipitado (centrifugação a 13.000 rpm por 5 min), e colocado a secar em
temperatura ambiente.
Depois de seco, acrescentou-se ao precipitado de 50 - 100 µL (dependendo do tamanho do
precipitado) de tampão Tris-EDTA (TE). As amostras foram submetidas à análise ou
estocadas a -20ºC. Para estimativa da qualidade e quantidade do DNA extraído, 3 µL de cada
amostra, acrescida de 4 µL do corante azul de bromofenol, foram submetidos ao processo de
eletroforese em gel de agarose 1% (p/v) em tampão TAE 1X, corado com 2 µL “SYBR Safe”
(Invitrogen), submersos na cuba com tampão TAE 1X. Como parâmetro das estimativas,
utilizou-se o marcador “Lambda DNA/HindIII Markers” (Promega).
O gel foi submetido a uma voltagem de 60 volts (V) e corrente de 50 miliamperes (mA)
por 1 h e 30 min. Ao final da eletroforese, o gel foi visualizado em transiluminador de UV. As
imagens foram fotodocumentadas pelo sistema EDAS 290 (Kodak). Em seguida, as amostras
foram diluídas em TE na concentração de 50 ng/mL e estocadas a 4°C para posterior
utilização nas reações de amplificação.
57
4.4.2 Amplificação do domínio D1/D2 do 26S rDNA
Para amplificação da seqüência do domínio D1/D2 do 26S rDNA, foram utilizados o
primer direto LR0R (5’-ACCCGCTGAACTTAAGC-3’) e o primer reverso LR5 (5’-
TCCTGAGGGAAACTTCG-3’), os quais se alinham respectivamente, com as seqüências
homólogas nas posições 26-42 e 964-948, da subunidade maior do RNA ribossomal (rRNA)
da levedura Saccharomyces cerevisae disponível no GenBank.
As reações da PCR (Polymerase Chain Reaction) foram realizadas em tubo de 0,2 mL,
para um volume final de 25 µL. A concentração final dos componentes foi: tampão da Taq
DNA polimerase 1X, 2,5 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 1 pmol/µL de cada primer,
0,02 µL de Taq DNA polimerase, 1 ng/µL de DNA genômico e água mili-Q. Estas reações
foram feitas com um controle negativo em paralelo para verificar contaminações.
As amplificações foram realizadas em termociclador (Mastercycler, Eppendorf),
programado para um ciclo de desnaturação inicial de 94ºC por 1 min e 25 segundos, seguido
de 35 ciclos de desnaturação a 95ºC por 35 seg, anelamento a 55ºC por 55 seg e extensão a
72ºC por 2 min. Ao final dos 35 ciclos, as amostras foram submetidas a mais um ciclo de
extensão a 72º C por 10 min; protocolo modificado de Gardes e Bruns (1993).
Após a amplificação, cada amostra foi submetida à eletroforese em gel de agarose como
descrito anteriormente no item 3.4.1. Entretanto, a qualidade e quantidade do DNA
amplificado foram estimadas através de comparação com o marcador de peso molecular
“Gene Ruler 100 bp DNA Ladder” (Fermentas).
Para a purificação dos produtos da PCR utilizou-se o “PureLink PCR Purification Kit”
(Invitrogen), seguindo as orientações do fabricante. Para a quantificação do produto da PCR
purificado comparou-se a intensidade da banda do material purificado com a do marcador
“Gene Ruler 100 bp DNA Ladder” (Fermentas), conforme anteriormente descrito.
58
4.4.3 Seqüenciamento dos produtos da PCR purificado
Os produtos da PCR purificado foram seqüenciados no Laboratório de Biologia
Molecular do Departamento de Ciências Biológicas da Escola Superior de Agricultura "Luiz
de Queiroz" (ESALQ) da Universidade de São Paulo (USP). As reações de seqüenciamento
foram realizadas utilizando-se o “DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit”
(Amersham Biosciences), conforme manual do fabricante; e, o processamento das mesmas foi
realizado em um seqüenciador ABI 3100 “Genetic Analyzer” (Applied Biosystems).
4.4.4 Análise das seqüências
Os seqüenciamentos obtidos foram editados e analisados utilizando-se o Pregap4 version
1.4b1, Gap v4.8b1 e o Trev 1.8b1 do pacote de programas “Staden Package” (STADEN
PACKAGE, http://staden.sourceforge.net/). As seqüências resultantes foram submetidas ao
BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool) do NCBI (National Center for Biotechnology
Information) (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov), comparando-as com as seqüências
depositadas no GenBank.
Após a identificação, os microrganismos leveduriformes (leveduras e fungos semelhantes
a leveduras) foram depositados na Coleção de Culturas de Microrganismos da Bahia (CCMB)
da UEFS.
A árvore filogenética foi gerada com o pacote PAUP* (SWOFFORD, 2001), usando o
método “neighbour-joining” (SAITOU; NEI 1987). A distância entre as seqüências foi
calculada baseada no modelo Kimura de dois parâmetros (KIMURA 1980). A análise do
bootstrap (FELSENSTEIN, 1985) foi baseada em 1000 replicações.
59
4.5 Determinação da poligalacturonase (PG) e da pectina liase (PL) extracelulares
produzidas por microrganismos leveduriformes em fermentação submersa
4.5.1 Preparação das amostras para os ensaios enzimáticos
O processo de fermentação submersa foi realizado no Laboratório de Enzimologia
(LAEN) do Departamento de Saúde da UEFS.
Para se efetuar as fermentações, 5mL contendo células metabolicamente ativas,
padronizado conforme descrito anteriormente no item 4.3, foram transferidos para frasco de
vidro transparente de 250 mL contendo 50 mL de caldo de fermentação (PATCHING; ROSE,
1969 apud PEREIRA, 2005). Após receberem os inóculos, os frascos foram incubados em
agitador rotatório a 150 rpm, a 28ºC, durante 48 h.
Logo após a fermentação, as amostras foram transferidas assepticamente para tubos de
polipropileno com capacidade para 50 mL. Em seguida, estes tubos foram centrifugados a
10.000 rpm por 10 min a 4ºC. O sobrenadante decorrente, livre de células, considerado a
solução bruta de proteínas extracelulares, foi então homogeneizado e transferido para frascos
de vidro de 20 mL com tampa de borracha e mantidos a 4ºC em tampão acetato 0,05 M (pH
5,0), para poligalacturonase e tampão fosfato 0,05 M (pH 7,5), para pectina liase, até o
momento da análise, não ultrapassando o período de um mês.
Todos os ensaios enzimáticos e o doseamento da proteína total foram realizados em
triplicadas, sendo usado os resultados cuja diferença entre eles tenha sido de até 5%.
60
4.5.2 Determinação da unidade de atividade (UA) da poligalacturonase (PG)
A determinação da unidade de atividade da poligalacturonase foi adaptada de Pereira
(2005), usando o ácido 3,5-dinitrosalicíclico (DNS) proposto por Miller (1959), baseando-se
na quantificação de açúcares redutores liberados, pelo ácido poligalacturônico, para o meio.
A mistura da reação consistiu-se de 350 µL do sobrenadante da fermentação e 250 µL
de ácido poligalacturônico (Sigma) a 1% (p/v) em tampão acetato 0,05 M (pH 5,0). Todos os
tubos foram incubados a 45ºC, em banho-maria durante 1 h. Em seguida, em cada tubo
adicionou-se 600 µL de DNS. Esta mistura foi fervida, a 100ºC por 15 min. Parou-se a reação
mergulhando os tubos num banho de gelo e após arrefecimento foram adicionados 6,0 mL de
água destilada.
Usou-se 3,0 mL da solução obtida para leitura da absorbância. Esta foi mensurada em
espectrofotômetro UV/VIS (Varian, Cary 50) a 540 nm, contra um branco. A curva de
calibração foi realizada em duplicada utilizando como padrão o ácido D-galacturônico (Fluka)
(0,2162 – 1,19 mg/mL), para determinação do coeficiente angular da reta tangente.
Uma unidade de atividade da poligalacturonase (UAPG) foi definida como a
quantidade de enzima necessária para catalisar a formação de um µmol de ácido galacturônico
por minuto.
4.5.3 Determinação da unidade de atividade (UA) da pectina liase (PL)
A determinação da unidade de atividade da pectina liase foi adaptada de Piccoli-Valle
et al (2003), com base na taxa de produtos urônicos insaturados formados, os quais absorvem
a 235 nm (ALBERSHEIM, 1966).
61
A mistura da reação constou de 200 µL de tampão fosfato 0,1 M (pH 7,5), contendo
pectina cítrica (Sigma) a 2,5% (p/v) e 300 µL do sobrenadante da fermentação. Esta mistura
foi incubada a 40ºC por 15 min. A reação foi paralisada pela adição de 4,5 mL de H2SO4 0,01
M. Em seguida, a absorbância foi mensurada em espectrofotômetro a 235 nm, contra um
branco, sendo utilizados 3,0 mL da solução obtida para as leituras.
Uma unidade de atividade da pectina liase (UAPL) foi definida como um µmoles de
grupos uronídeos insaturados produzidos por minuto.
A unidade de atividade da pectina liase foi calculada através da subseqüente fórmula
(UENOJO; PASTORE, 2006):
Onde:
• ∆A = aumento da absorbância a 235 nm;
• v = volume da amostra enzimática utilizado na análise em mililitro;
• ε235nm = coeficiente de extinção molar dos produtos insaturados (5550 M-1cm-1);
• ∆T = tempo da reação enzimática em minutos;
• UAPL = unidade de atividade da pectina liase (µmol/mL/min).
4.5.4 Doseamento da proteína total
O doseamento da proteína total do sobrenadante advindo da fermentação foi efetuado
pelo método de Bradford (1976), utilizando como padrão albumina de soro bovino (BSA).
Em tubos de ensaio foram colocados 50 µL da solução bruta de proteínas
extracelulares e adicionados 2,5 mL do reagente de Bradford. Misturou-se o conteúdo e após
2 min, procedeu-se a leitura da absorbância 595 nm, contra um branco.
UAPL = ∆A / v / ε235nm x 106 / ∆T
62
A curva de calibração foi realizada em duplicada utilizando como padrão albumina de
soro bovina (10 – 100 µg/mL).
4.5.5 Determinação da atividade específica (AE) da poligalacturonase (PG)
A atividade específica da poligalacturonase foi calculada pela seguinte razão:
Onde:
• AEPG = µmol de ácido galacturônico liberado por min/mg de proteínas;
4.5.6 Determinação da atividade específica (AE) da pectina liase (PL)
A atividade específica da pectina liase foi calculada pela subseqüente razão:
Onde:
• AEPL = µmol de grupos uronídeos insaturados formados por min/mg de proteínas.
4.5.7 Determinação da biomassa
O pellet resultante da centrifugação das amostras fermentadas foram ressuspensos em
água destilada. Em seguida, a solução obtida foi transferida para placa de Petri previamente
preparada (60ºC por 24h), e levadas à estufa a 60ºC para secagem e pesados diariamente até
AE PL = UAPL / mg de proteína
AEPG = UAPG / mg de proteína
63
atingir massa constante. Posteriormente, a biomassa seca foi determinada pela diferença entre
a massa inicial e a final das placas, aferida em balança analítica.
4.5.8 Análise estatística
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias
comparadas pelo teste Tukey (p<0,05), através do pacote estatístico SPSS (Statistical
Package for the Social Sciences) versão 10.1 (SPSS, 1995).
64
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Isolamento, purificação e preservação dos microrganismos leveduriformes
proveniente do Semi-árido baiano
Foram utilizados um total de 138 exemplares de flores, 74 de frutos, 10 de insetos, 19
amostras de tecido vegetal necrosado e nove de solo, coletados ao longo das rodovias baianas,
como substratos do Semi-árido para o isolamento dos microrganismos leveduriformes, sendo
esses substratos identificados pela fotografia e os pontos de coleta pelo georreferenciamento
(Tabela 02).
A partir desses substratos, colônias foram obtidas em meio YM, sendo que diferentes
tipos morfológicos macroscopicamente distintos, foram selecionados de cada placa e
purificados. Todos os 250 microrganismos leveduriformes obtidos foram preservados em
glicerol 15% (v/v) a -86ºC.
5.2 Seleção dos microrganismos leveduriformes produtores de pectinases extracelulares:
a poligalacturonase (PG) e a pectina liase (PL)
No presente estudo, a detecção dos microrganismos pectinolíticos deu-se através da
visualização de halos claros ao redor da colônia em meio de cultura sólido específico: meio
MP-5 para identificação dos secretores da poligalacturonase (PG) e meio MP-7 para
identificação dos secretores da pectina liase (PL).
65
Tabela 02. Microrganismos leveduriformes pectinolíticos isolados do Semi-árido baiano, substratos do qual foram isolados e seus respectivos georeferenciamentos.
Código do isolado Substrato do isolamento Georeferenciamento da coleta
23.1 Flor (Solanum sp.) S 11°38’43,4” - W 040°55’09,6”
26d1 Flor (Pavonia sp.) S 11°31’20,8” - W 041°13’10,1”
27b3 Flor (Passiflora sp.) S 11°31’20,8” - W 041°13’10,1”
27c2 Flor (Passiflora sp.) S 11°31’20,8” - W 041°13’10,1”
27h4 Flor (Passiflora sp.) S 11°31’20,8” - W 041°13’10,1”
27.4.3 Flor (Passiflora sp.) S 11°31’20,8” - W 041°13’10,1”
28g2 Flor (Ipomoea sp.) S 11°31’21,7” - W 041°13’09,3”
29d1 Fruto (Clusia sp.) S 11°31’21,7” - W 041°13’11,2”
30a2.1 Flor (Pavonia sp.) S 11°31’21,7” - W 041°13’11,2”
31a1 Flor (Piptadenia sp.) S 11°31’21,7” - W 041°13’11,2”
33b1 Flor (Pavonia sp.) S 11°31’20,9” - W 041°13’11,7”
33b2 Flor (Pavonia sp.) S 11°31’20,9” - W 041°13’11,7”
72.2 Flor (Melocactus sp.) S 11°29’08,2” - W 041°20’10,8”
76.1 Flor (Melocactus sp.) S 11°29’08,2” - W 041°20’10,8”
90a1 Flor (Camptosema sp.) S 11°34’16,4” - W 041°06’51,4”
103.2 Flor (Stachytarpheta sp.) S 11°37’23,7” - W 040°59’58,3”
131 Fruto (Melocactus sp.) S 11°37’19,0” - W 040°59’56,7”
133.1 Fruto (Melocactus sp.) S 11°37’19,0” - W 040°59’56,7”
133.2 Fruto (Melocactus sp.) S 11°37’19,0” - W 040°59’56,7”
134.2 Fruto (Melocactus sp.) S 11°37’19,0” - W 040°59’56,7”
134.3 Fruto (Melocactus sp.) S 11°37’19,0” - W 040°59’56,7”
135 Fruto (Melocactus sp.) S 11°37’19,0” - W 040°59’56,7”
136 Fruto (Melocactus sp.) S 11°37’19,0” - W 040°59’56,7”
137 Fruto (Melocactus sp.) S 11°37’19,0” - W 040°59’56,7”
137.2 Fruto (Melocactus sp.) S 11°37’19,0” - W 040°59’56,7”
138 Fruto (Melocactus sp.) S 11°37’19,0” - W 040°59’56,7”
144.1 Tecido vegetal necrosado (Agave sp.) S 11°18’00,3” - W 041°01’11,7”
147i1 Flor (Agave sp.) S 11°18’00,3” - W 041°01’11,7”
147j1 Flor (Agave sp.) S 11°18’00,3” - W 041°01’11,7”
149.1 Flor (Jacaranda sp.) S 11°10’15,1” - W 040°53’58,2”
175a1 Fruto (Opuntia sp.) S 12°03’07,9” - W 039°58’95,2”
202 Solo (Arenoso) S 9°34’37.3” - W 038°43’56.9”
203 Solo (Arenoso) S 9°34’37.3” - W 038°43’56.9”
66
Dentre os 250 microrganismos avaliados, somente em 33 (13,2%) foi determinda a
produção de pelo menos uma das pectinases extracelulares. Desses 33, 18 (54,54%) foram
isolados de flores, os demais foram provenientes de frutos (36,36%), amostras de solo
(6,06%) e tecido vegetal necrosado (3,03%). Não sendo encontrado microrganismos
leveduriformes pectinolíticos nos insetos (Figura 09).
Figura 09. (a) Halo de hidrólise do ácido poligalacturônico, visualizado após adição de hexadecil trimetil amônio brometo 1% (p/v), originado por microrganismos leveduriformes isolado do Semi-árido baiano, crescidos a 28ºC por 48 h em meio MP-5. (b) Halo de degradação da pectina, visualizado após adição de hexadecil trimetil amônio brometo 1% (p/v), originado por microrganismo leveduriforme isolado do Semi-árido baiano, crescido a 28ºC por 48 h em meio MP-7
Ainda em relação à produção de pectinases extracelular, em três dos 33 isolados
positivos, não foi detectada à produção da pectina liase, esses foram os isolados 27.4.3, 147i1
e 147j1. Já a produção da poligalacturonase foi observada em todos os 33 isolados. A
levedura Kluyveromyces marxianus CCT 3172, utilizada como controle positivo para
poligalacturonase, nas condições experimentais estudadas, também secretou a pectina liase
(Figura 10).
Verifica-se que a percentagem de microrganismos leveduriformes pectinolíticos aqui
encontrada é corroborada pelo trabalho de investigação de atividade enzimática extracelular
27c2
131 27b3
27h4
(a)
134.3 (b)
67
realizada por Buzzini e Martini (2002), no qual foram encontrados 10,66% de pectinolíticos,
sendo estes isolados de solo, água, inseto e materiais vegetais coletadas em florestas do Brasil.
Figura 10. Halo de degradação da pectina, visualizado após adição de hexadecil trimetil amônio brometo 1% (p/v), originado por Kluyveromyces marxianus CCT 3172, crescido a 28ºC por 48 h em meio MP-7.
Convém salientar que uma percentagem mais baixa desses microrganismos foi
encontrada nos trabalhos de Trindade et al. (2002) e Silva el al. (2005), 4,2% e 7%,
respectivamente. Entretanto, nesses trabalhos estavam os microrganismos associados apenas a
frutas tropicais.
Flores que possuem glândulas nectaríferas e frutas são tradicionalmente consideradas
excelentes hábitat para leveduras, por oferecerem açúcares simples em sucessivos
microhábitat durante seus diferentes estágios de desenvolvimento e deterioração (SANTOS et
al., 1996; LACHANCE; STARMER, 1998).
Ainda, segundo os citados pesquisadores, insetos polinizadores são os vetores mais
importantes na dispersão das leveduras e sua especialização para certos nichos ecológicos
promove uma desigual distribuição e barreiras à troca genética entre as espécies de leveduras
de diferentes substratos e microhábitat, englobando leveduras ainda não descritas na literatura.
Silva (2003) inferiu que leveduras isoladas de frutas tropicais produzem pectinases
para despolimerizar a pectina presente nessas frutas, permitindo a assimilação dos açúcares da
68
cadeia lateral desse polissacarídeo péctico, tais como arabinose, galactose e xilose. Assim,
Trindade et al (2002), sugereriram que a atividade pectinolítica das leveduras é uma vantagem
competitiva para otimizar seu crescimento, quando se esgotam fontes de carbono mais
simples.
De fato, a assimilação de açúcares por leveduras é constatada em testes fisiológicos
quando se deseja identificar em nível de espécie (YARROW, 1998). Além disto, Schwan,
Cooper e Wheals (1997) verificaram que a pectina e o ácido poligalacturônico não são
utilizados como fonte de carbono pela levedura Kluyveromyces marxianus CCT 3172, não
estando sujeito a repressão catabólica a secreção das pectinases.
O maior índice enzimático para poligalacturonase foi determinado no isolado 144.1,
cujo valor foi de 5,667; sendo este inferior ao encontrado na levedura controle, o qual foi de
6,8. Por outro lado, entre os secretores de pectina liase, o isolado 33b1 apresentou o maior
índice (2,333), valor próximo ao do controle que foi de 2,5 (Tabela 03).
Lealem e Gashe (1994) sugereriram um índice enzimático ≥2,0 para considerar um
microrganismo como produtor potencial da enzima extracelular em meio sólido específico.
Entretanto, estudos voltados para seleção de microrganismos leveduriformes produtores de
enzimas extracelulares não fizeram uso desse índice, sendo as leveduras classificadas apenas
em secretoras ou não, das respectivas enzimas avaliadas (BIELY; SLÁVIKOVÁ, 1994;
STRAUSS et al., 2001; TRINDADE et al., 2002; BUZZINI; MARTINI, 2002;
FUENTEFRIA, 2004; SILVA et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2006).
Uma vez que a microbiologia industrial explora condições adequadas de crescimento e
síntese de produtos úteis, o presente estudo, ao contrário destes citados, envolveu o cálculo do
índice enzimático pelo fato de considerá-lo útil na comparação de isolados taxonomicamente
relacionados, pois estes podem apresentar diversidade fisiológica e fenotípica diferenciada.
69
Tabela 03. Atividade semiquantitativa da poligalacturonase e pectina liase extracelulares dos microrganismos leveduriformes isolados do Semi-árido baiano crescidos a 28ºC por 48 h em meios diferencial, estimada mediante o índice enzimático.
MP-5 MP-7 Designação
do isolado DMC DMH IE DMC DMH IE
23.1 0,5 1 2 0,6 0,6 1
26d1 2,1 0,2 0,095 1,6 1,2 0,75
27b3 0,5 1,2 2,4 0,9 0,6 0,667
27c2 0,6 1,8 3 0,7 0,5 0,714
27h4 0,6 1,8 3 0,7 0,6 0,857
27.4.3 0,5 0,8 1,6 0,7 ND ND
28g2 0,6 0,6 1 1,1 0,6 0,545
29d1 0,6 1,6 2,667 0,6 1,2 2
30a2.1 0,9 0,2 0,222 0,7 0,6 0,857
31a1 0,5 1,6 3,2 0,5 0,5 1
33b1 0,5 1,4 2,8 0,6 1,4 2,333
33b2 0,4 0,4 1 0,6 0,8 1,333
72.2 0,4 0,8 2 0,6 0,6 1
76.1 1,4 1,2 0,857 0,9 0,8 0,889
90a1 1,4 1,2 0,857 0,9 0,2 0,222
103.2 0,5 1,4 2,8 0,7 0,6 0,857
131 0,7 1,2 1,714 0,8 1,4 1,75
133.1 1,4 1,4 1 1 0,6 0,6
133.2 1,6 1,4 0,875 0,9 0,6 0,667
134.2 1,6 1,4 0,875 1 1 1
134.3 1,7 1,2 0,706 1 0,8 0,8
135 1 1,4 1,4 0,7 1,4 2
136 0,9 1,2 1,333 0,7 1,4 2
137 1,4 1,2 0,857 0,9 0,6 0,667
137.2 1,6 1 0,625 0,9 0,4 0,444
138 1,5 1,4 0,933 0,7 0,6 0,857
144.1 0,6 3,4 5,667 0,9 1,2 1,333
147i1 0,5 1 2 0,8 ND ND
147j1 0,3 0,6 2 0,7 ND ND
149.1 0,5 1,2 2,4 0,6 0,8 1,333
175a1 1,4 1,6 1,143 0,7 0,6 0,857
202 0,6 0,4 0,667 0,8 0,4 0,5
203 0,6 0,4 0,667 0,7 0,4 0,571
MC* 0,5 3,4 6,8 0,8 2 2,5
MP-5 = Meio diferencial para leveduras que produzem poligalacturonase; MP-7 = Meio diferencial para leveduras que produzem pectina liase; DMC = Diâmetro médio da colônia em centímetro; DMH = Diâmetro médio do halo de hidrólise do substrato em cm; IE = Índice enzimático, relação entre DMH e o DMC; ND = Não determinado. *MC = microrganismo controle positivo para poligalacturonase (Kluyveromyces marxianus CCT 3172).
70
5.3 Filogenia molecular e biodiversidade dos microrganismos leveduriformes
pectinolíticos
O DNA genômico extraído dos 33 microrganismos leveduriformes pectinolíticos
apresentou-se íntegro e sem contaminação. Através da PCR do domínio D1/D2 do 26S rDNA
com os primer LR0R e LR5, foi possível amplificar um fragmento de aproximadamente 900
pares de bases, fato este condizente com a literatura científica (VILGALYS LAB,
http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm) (Figura 11).
Figura 11. Produtos da PCR purificado de 33 isolados leveduriformes produtores de pectinases, submetido à eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TAE 1X, 5V/cm, 1,5 hrs, corado com “SYBR Safe" (Invitrogen) e fotografados pelo sistema de fotodocumentação Edas 290 (Kodak). Nas amostras (canaletas) ocorre à amplificação do domínio D1/D2 do 26S rDNA com os primers LR0R e LR5, e obtenção de um fragmento de aproximadamente 900 pb, que é o tamanho próximo ao esperado para estes domínios. O marcador (M) utilizado foi o “Gene Ruler 100 bp DNA Ladder” (Fermentas).
147j1 203 27b3 135 28g2 202 31a1 133.1 29d1 72.2 144.1 147j1 33b1 27c2 27h4 33b2 131 M
134.3 90a1 137.2 137 76.1 23.1 136 133.2 138 149.1 175a1 134.2 103.2 30a2.1 27.4.3 26d1 M
71
Entretanto, o tamanho do fragmento seqüenciado com os primers LR0R e LR5, variou
entre 324 e 810 pares de bases. Com a obtenção das seqüências, estas foram comparadas com
as disponíveis no GenBank para identificação dos microrganismos (Tabela 04). Além disto, as
seqüências obtidas foram utilizadas para gerar uma árvore filogenética (Figura 12).
Após a identificação molecular, os microrganismos leveduriformes (leveduras e
fungos semelhantes a leveduras) foram depositados na Coleção de Culturas de
Microrganismos da Bahia (CCMB) da UEFS, recebendo códigos da coleção. Foram
identificados seis gêneros (Pseudozyma, Trichosporonoides, Candida, Aureobasidium,
Cryptococcus e Kluyveromyces), havendo entre eles 23 isolados ascomicetos [Aureobasidium
pullulans (18), Candida boidinii (1), Trichosporonoides sp. (3) e Kluyveromyces marxianus
(1)] e cinco basidiomicetos [Cryptococcus liquefaciens (1) e Pseudozyma sp. (4)]. Entretanto
cinco dos 33 microrganismos leveduriformes pectinolíticos, foram identificados apenas como
“Fungal endophyte” no GenBank.
Na análise da árvore filogenética observou-se que com exceção dos isolados “Fungal
endophyte” CCMB 328 e “Fungal endophyte” CCMB 327, oriundos de solo, os demais
(“Fungal endophyte” CCMB 305, “Fungal endophyte” CCMB 311 e “Fungal endophyte”
CCMB 308), proveniente de flores, apresentaram suporte estatístico de 82% na análise de
bootstrap na formação de subgrupos por meio de reamostragem dos dados, incluindo os
subgrupos do gênero Aureobasidium. Além disto, o isolado “Fungal endophyte” CCMB 308
obtido de Melocactus sp. apresentou valor de bootstrap de 80% com os subgrupos onde foram
incluídos os Aureobasidium, também procedente do citado substrato, apontando uma pequena
distância genética entre eles. Partindo destas observações pode-se sugerir que estes isolados
possuem uma percentagem de complementariedade de DNA muito próximas.
72
Tabela 04. Caracterização molecular dos microrganismos leveduriformes pectinolíticos isolados do Semi-árido baiano, a partir da análise da sequência do domínio D1/D2 da subunidade (26S) de rDNA.
Código
do
Isolado
Pares de
bases
seqüenciadas
Código de
acesso no
GenBank Organismo relativo
Valor de
expectitiva
(E-value)
Identidade
(%)
Grupo
taxonômico
Número
depósito
na CCMB
23.1 716 AB217520 Aureobasidium pullulans 0.0 99 Ascomycota 296
26d1 324 AY791700 Candida boidinii 2e -93 87 Ascomycota 297
27b3 735 DQ400366 Trichosporonoides sp. 0.0 99 Ascomycota 298
27c2 716 DQ178644 Pseudozyma sp. 0.0 98 Basidiomycota 299
27h4 797 DQ178644 Pseudozyma sp. 0.0 98 Basidiomycota 300
27.4.3 810 DQ178644 Pseudozyma sp. 0.0 98 Basidiomycota 301
28g2 440 AB217512 Cryptococcus liquefaciens 0.0 96 Basidiomycota 302
29d1 620 DQ400366 Trichosporonoides sp. 0.0 99 Ascomycota 303
30a2.1 662 DQ400366 Trichosporonoides sp. 4e -144 89 Ascomycota 304
31a1 729 EF420058 Fungal endophyte 0.0 98 Fungi 305
33b1 775 DQ178644 Pseudozyma sp. 0.0 98 Basidiomycota 306
33b2 761 AB217520 Aureobasidium pullulans 0.0 100 Ascomycota 307
72.2 635 EF420058 Fungal endophyte 0.0 99 Fungi 308
76.1 733 AB217520 Aureobasidium pullulans 0.0 100 Ascomycota 309
90a1 708 AB217520 Aureobasidium pullulans 0.0 99 Ascomycota 310
103.2 581 EF420058 Fungal endophyte 0.0 97 Fungi 311
131 556 AB217520 Aureobasidium pullulans 0.0 99 Ascomycota 312
133.1 728 AB217520 Aureobasidium pullulans 0.0 100 Ascomycota 313
133.2 504 AB304735 Aureobasidium pullulans 0.0 100 Ascomycota 314
134.2 526 AB304735 Aureobasidium pullulans 0.0 100 Ascomycota 315
134.3 591 AB217520 Aureobasidium pullulans 0.0 100 Ascomycota 316
135 692 AB217520 Aureobasidium pullulans 0.0 100 Ascomycota 317
136 527 AB217520 Aureobasidium pullulans 0.0 99 Ascomycota 318
137 733 AB217520 Aureobasidium pullulans 0.0 99 Ascomycota 319
137.2 740 AB217520 Aureobasidium pullulans 0.0 100 Ascomycota 320
138 705 AB217520 Aureobasidium pullulans 0.0 100 Ascomycota 321
144.1 685 AF543841 Kluyveromyces marxianus 0.0 100 Ascomycota 322
147i1 784 AB217520 Aureobasidium pullulans 0.0 99 Ascomycota 323
147j1 525 EF375702 Aureobasidium pullulans 0.0 99 Ascomycota 324
149.1 408 AB304735 Aureobasidium pullulans 0.0 99 Ascomycota 325
175a1 708 AB217520 Aureobasidium pullulans 0.0 99 Ascomycota 326
202 715 EF420074 Fungal endophyte 0.0 99 Fungi 327
203 715 EF420074 Fungal endophyte 0.0 99 Fungi 328
CCMB = Coleção de Culturas de Microrganismos da Bahia
73
Figura 12. Árvore filogenética dos microrganismos leveduriformes produtores de pectinases extracelulares isolado Semi-árido baiano, obtida por análise de “neighbour-joining” (modelo de Kimura dois parâmetros) do domínio D1/D2 do 26S rDNA. Schizosaccharomyces pombe foi incluído para enraizar a árvore. Os valores em porcentagem do bootstrap de 1000 replicações são dados a cada ramo (valores abaixo de 50% não são mostrados). A designação do isolado (Coleção de Culturas de Microrganismos da Bahia, CCMB) são indicados após o número do acesso no GenBank, exceto no grupo externo.
Schizosaccharomyces pombe DQ442711
Fungal endophyte EF420074 CCMB 328
Fungal endophyte EF420074 CCMB 327
Kluyveromyces marxianus AF543841 CCMB 322
Candida boidinii AY791700 CCMB 297
Cryptococcus liquefaciens AB217512 CCMB 302
Trichosporonoides sp. DQ400366 CCMB 304
Trichosporonoides sp. DQ400366 CCMB 298
Trichosporonoides sp. DQ400366 CCMB 303
Pseudozyma sp. DQ178644 CCMB 299
Pseudozyma sp. DQ178644 CCMB 301
Pseudozyma sp. DQ178644 CCMB 300
Pseudozyma sp. DQ178644 CCMB 306
Fungal endophyte EF420058 CCMB 305
Fungal endophyte EF420058 CCMB 311
Fungal endophyte EF420058 CCMB 308
Aureobasidium pullulans AB217520 CCMB 296
Aureobasidium pullulans EF375702 CCMB 324
Aureobasidium pullulans AB217520 CCMB 323
Aureobasidium pullulans AB217520 CCMB 317
Aureobasidium pullulans AB217520 CCMB 326
Aureobasidium pullulans AB217520 CCMB 310
Aureobasidium pullulans AB217520 CCMB 321
Aureobasidium pullulans AB217520 CCMB 307
Aureobasidium pullulans AB217520 CCMB 318
Aureobasidium pullulans AB217520 CCMB 309
Aureobasidium pullulans AB304735 CCMB 314
Aureobasidium pullulans AB217520 CCMB 312
Aureobasidium pullulans AB217520 CCMB 316
Aureobasidium pullulans AB304735 CCMB 315
Aureobasidium pullulans AB217520 CCMB 313
Aureobasidium pullulans AB217520 CCMB 320
Aureobasidium pullulans AB304735 CCMB 325
Aureobasidium pullulans AB217520 CCMB 319
94
76100
100
76
100100
60
57 82
80
8775
51
0.05 substitutions/site
74
Os basidiomicetos pectinolíticos foram isolados apenas de flores, enquanto que os
ascomicetos de frutos e flores.
Segundo Santos et al. (1996), comunidades de leveduras basidiomicéticas são
dominantes em flores, enquanto que leveduras ascomicéticas predominam em frutos. Quando
comparadas, a maioria das espécies de leveduras basidiomicéticas possui um perfil
assimilativo amplo de fontes de carbono quando comparadas com as leveduras ascomicéticas,
que se restringe a pouca fontes de carbono (KURTZMAN; FELL, 1998).
Deve-se ainda salientar que, entre os cinco isolados identificados como “Fungal
endophyte”, dois foram isolados de solo. Já o isolado Kluyveromyces marxianus CCMB 322,
foi proveniente do tecido vegetal necrosado de Agave sp.
A grande maioria dos estudos publicados tem mostrado que a levedura K. marxianus é
muito versátil, tendo interesse científico, industrial e biotecnológico, já que tem o status de
GRAS. Além da produção de enzimas como as pectinases e inulinase (BENDER et al., 2006),
outras aplicações incluem a produção de aromas (ETSCHMANN; SELL; SCHRADER,
2004).
A espécie Aureobasidium pullulans, muitas vezes referida na literatura científica como
fungo semelhante à levedura (yeast-like) ou levedura preta (black-yeast) (BUZZINI;
MARTINI, 2002; LAITILA et al., 2006), foi dentre os microrganismos pectinolíticos,
isolados no presente trabalho, o mais freqüente, apresentando uma forte associação com
Melocactus sp. Em estudos anteriores a espécie Aureobasidium pullulans também foi
freqüentemente encontrada fazendo parte da microbiota natural de flores e frutos (HAGLER
et al., 1993; ROSA et al, 1995; BUZZINI; MARTINI, 2002).
Espécies do gênero Trichosporonoides também são mencionadas como fungo
semelhante à levedura (HOCKING; PITT, 1981; RAMIREZ, 1989). Entretanto, na literatura
75
existem poucos relatos do isolamento e identificação destes microrganismos (HOCKING;
PITT, 1981; RAMIREZ, 1989).
No presente estudo o Trichosporonoides sp. CCMB 304, isolado de flor (Pavonia sp.),
apresentou na análise molecular valor de expectativa (E-value) de 4e-144, e identidade de
apenas 89% com a seqüência com maior escore, que é um valor de identidade considerado
pouco significativo estatisticamente para indicar uma possível homologia com as seqüências
disponíveis no banco de dados do GenBank para o segmento de DNA em estudo. Além disto,
na árvore filogenética observa-se que esse microrganismo está como subgrupo do grupo que
inclui os Trichosporonoides, apresentando valor de bootstrap de 100%, subsidiando a
diferenciação dentre os isolados do gênero.
Outro valor de expectativa diferente de 0 (zero) foi encontrado com o isolado Candida
boidinii CCMB 297, proveniente de flor (Pavonia sp.), indicando que não existe “boa”
similaridade com as seqüências disponíveis no banco de dados do GenBank.
Nesta abordagem, inferimos que Trichosporonoides sp. CCMB 304 e Candida boidinii
CCMB 297 são possivelmente dois novos táxons, ainda não descritos na literatura.
Entretanto, apesar das informações obtidas com o seqüenciamento dos domínios
D1/D2, para confirmar que os ambos representam duas espécies novas, são necessários dados
complementares provenientes do seqüenciamento da região ITS, além de características
morfológicas e fisiológicas, pois pode ter sido utilizado uma seqüência parcial, como no caso
do isolado Candida boidinii (324 pares de bases) ou ainda com um gene ainda não descrito.
Recentes pesquisas têm identificado novas espécies de leveduras isoladas de flores
(HONG, 2001), frutos (RUIVO, 2005), insetos associados a flores (LACHANCE; BOWLES,
2002), solo (MIDDELHOEVEN; SCORZETTI; FELL, 2001), água de tanque (RUIVO,
2005), exudatos de plantas (MORAIS et al, 2004) e polpa de fruta (TRINDADE et al, 2004),
76
corroborando a possibilidade de termos encontrado novas espécies ainda não descritas na
literatura.
Além disso, quatro dos microrganismos leveduriformes pectinolíticos foram
identificados apenas em nível de gênero como Pseudozyma, sendo que linhagens desse gênero
também são mencionadas na literatura como fungo semelhante à levedura (AVIS et al., 2005).
Leveduras pertencentes a este gênero possuem algumas características peculiares de interesse
biotecnológico, como por exemplo, produção de proteínas heterológas (AVIS et al., 2005) e
glicolipídios biosurfactantes (KONISHI et al., 2007).
Analisando a árvore filogenética verifica-se que os quatros isolados do gênero
Pseudozyma correspondem a um grupo com valor de bootstrap de 100%, sendo este grupo,
próximo filogeneticamente do grupo dos isolados do gênero Trichosporonoides, com um
suporte estatístico de 76%.
Da flor de Ipomoea sp. foi isolada a levedura Cryptococcus liquefaciens CCMB 302.
Esta espécie é considerada como um microrganismo capaz de habitar ambientes extremos,
como geleiras (BUTINAR; SPENCER-MARTINS; GUNDE-CIMERMAN, 2007) e mar
profundo (KANAMASA et al., 2007). Microrganismos de ambientes extremos já foram
estudados e representam comercialmente uma fonte potencial de enzimas termoestáveis
(HAKI; RAKSHIT, 2003).
Verifica-se que o número de pesquisa em estudos de sistemática e diversidade de
leveduras no Semi-árido brasileiro é bastante limitado, não sendo detectado publicações
ligadas ao potencial biotecnológico destes microrganismos. Assim, os únicos registros
encontrados nos últimos anos, foram os trabalhos de Santos et al. (1996) e mais recentemente,
o de Costa (2006).
Santos et al. (1996) determinaram espécies de leveduras associadas a flores e frutos de
cajueiro (Anacardium occidentale), cajazeiro (Spondia lutea), umbuzeiro (Spondia sp.) e
77
mangueira (Mangifera indica) da região Semi-árida do Brasil. Neste trabalho as leveduras
encontradas foram: Candida spp., C. albicans, semelhante a C. entomaea, C. guilliermondii,
C. krusei, C. parapsilosis, C. shehate, C. sorbosa, semelhante a C. torresii, C. tropicalis,
Cryptococus spp., C. laurentii, Debaryomyces sp., Geotrichum sp., Haltermannia
corniformus, Hanseniaspora occidentalis, Issatchenkia orientalis, I. terricola, Kloeckera sp.
K. apiculata, K. javanica, levedura preta (black-yeast), Metschnikowia sp., M. pulcherrima,
Pichia etchellsii, P. membranaefaciens, Rhodotorula spp., R. aurantiaca, R. glutinis, R.
graminis, R. minuta, R. rubra, Sporobolomyces roseus, Torulaspora delbruckii, Tremella spp.
Por outro lado, o trabalho de Costa (2006) constitui num levantamento taxonômico de
leveduras associadas ao solo de três localidades do Semi-árido da Bahia (Mucugê, Ipirá e
Paulo Afonso), em período seco e chuvoso, registrando os seguintes táxons: Aureobasidium
pullulans, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces sp., Bullera alba, Candida sp., C.
catenulata, C. colliculosa, C. famata, C. glabrata, C.guilliermondii, C. parapsilosis, C.
zeylanoides, C. insectorum, C. robusta, C. sake, Cryptococcus sp., C. albidus, C. humicola, C.
laurentii, C. luteolus, C. terreus, Hormonema schizolunatum, levedura preta (black-yeast),
Pichia ohmeri, Rhodotorula sp., R. glutinis, R. minuta, R. mucilaginosa, Sporobolomyces
salmonicolor, S. roseus, Schizosaccharomyces sp., Trichosporon pullulans e T.dulcitum.
5.4 Poligalacturonase (PG) e pectina liase (PL) extracelulares produzidas por
microrganismos leveduriformes por meio de fermentação submersa
5.4.1 Atividade da poligalacturonase (PG)
A atividade da poligalacturonase extracelular foi verificada apenas em nove dos 33
isolados leveduriformes (Gráfico 02), sendo que as médias dessa atividade não diferiram
78
significativamente apenas entre dois dos nove isolados pelo teste “post-hoc” de Tukey, para
p<0,05 (Tabela 05). Esta tabela traz ainda as biomassas das culturas obtidas na fermentação
submersa.
Dentre aqueles nove isolados, o Pseudozyma sp. CCMB 300 foi quem apresentou o maior
valor de atividade (14,18 µmol de ácido galacturônico liberado por min/mg de proteínas). Em
contrapartida, ela apresentou o menor valor de biomassa seca (67 mg). Segundo Malavolta
(2000) o sistema de regulação do crescimento, parece ser independente do sistema de
regulação da expressão de atividades pectinolíticas em leveduras.
Gráfico 02. Atividade específica (AE) da poligalacturonase (PG) em µmol de ácido galacturônico liberado por min/mg de proteínas, obtida com microrganismos leveduriformes* isolado do Semi-árido baiano, crescidos em agitador rotatório a 28ºC por 48 h em caldo de fermentação. *No gráfico os microrganismos são em ordem crescente: 1-Aureobasidium pullulans CCMB 296; 2-Candida boidinii CCMB 297; 3-Trichosporonoides sp. CCMB 298; 4-Pseudozyma sp. CCMB 299; 5-Pseudozyma sp. CCMB 300; 6-Pseudozyma sp. CCMB 301; 7-Cryptococcus liquefaciens CCMB 302; 8-Trichosporonoides sp. CCMB 303; 9-Trichosporonoides sp. CCMB 304; 10-Fungal endophyte CCMB 305; 11-Pseudozyma sp. CCMB 306; 12-Aureobasidium pullulans CCMB 307; 13-Fungal endophyte CCMB 308; 14-Aureobasidium pullulans CCMB 309; 15-Aureobasidium pullulans CCMB 310; 16-Fungal endophyte CCMB 311; 17-Aureobasidium pullulans CCMB 312; 18-Aureobasidium pullulans CCMB 313; 19-Aureobasidium pullulans CCMB 314; 20-Aureobasidium pullulans CCMB 315; 21-Aureobasidium pullulans CCMB 316; 22-Aureobasidium pullulans CCMB 317; 23-Aureobasidium pullulans CCMB 318; 24-Aureobasidium pullulans CCMB 319; 25-Aureobasidium pullulans CCMB 320; 26-Aureobasidium pullulans CCMB 321; 27-Kluyveromyces marxianus CCMB 322; 28-Aureobasidium pullulans CCMB 323; 29-Aureobasidium pullulans CCMB 324; 30-Aureobasidium pullulans CCMB 325; 31-Aureobasidium pullulans CCMB 326; 32-Fungal endophyte CCMB 327; 33-Fungal endophyte CCMB 328; 34-Kluyveromyces marxianus CCT 3172. O microrganismo 34 corresponde ao controle positivo Kluyveromyces marxianus CCT 3172. As cores das colunas não possuem significado estatístico.
79
Além do mais, entre os quatro isolados do gênero Pseudozyma avaliados, apenas no
isolado Pseudozyma sp. CCMB 301, não foi determinada a atividade da poligalacturonase.
O isolado Kluyveromyces marxianus CCMB 322 apresentou valores de atividade (1,041
µmol de ácido galacturônico liberado por min/mg de proteínas) e biomassa seca (183,1 mg),
próximos ao encontrado na levedura controle Kluyveromyces marxianus CCT 3172 (1,274
µmol de ácido galacturônico liberado por min/mg de proteínas e 179 mg).
Dos três isolados do gênero Trichosporonoides, apenas no Trichosporonoides sp. CCMB
304, o qual corresponde possivelmente a uma nova espécie, foi determinada a atividade da
poligalacturonase (12,43 µmol de ácido galacturônico liberado por min/mg de proteínas),
sendo que este isolado apresenta uma variação genética, pois na árvore filogenética ele
aparece como subgrupo dentro do grupo formado pelo gênero Trichosporonoides.
O terceiro maior valor encontrado na atividade da poligalacturonase foi proveniente do
isolado Cryptococcus liquefaciens CCMB 302, equivalente a 10,58 µmol de ácido
galacturônico liberado por min/mg de proteínas. Abe et al. (2006), também produziram
poligalacturonase, utilizando Cryptococcus liquefaciens linhagem N6, porém em condições
extremas, utilizando baixa temperatura e alta pressão.
Entre os três “Fungal endophyte” isolados de flor, apenas no proveniente de Melocactus
sp., (“Fungal endophyte” CCMB 308), foi determinada a atividade da poligalacturonase
(0,493 µmol de ácido galacturônico liberado por min/mg de proteínas), sendo esta o menor
valor dentre os nove determinados.
Pela análise da árvore filogenética, verifica-se que este isolado está como subgrupo dentro
do grupo que inclui os demais “Fungal endophyte” isolados de flor e o gênero
Aureobasidium. Por outro lado, as médias da atividade da poligalacturonase de um grupo a
parte, formado pelos isolados “Fungal endophyte” CCMB 327 e “Fungal endophyte” CCMB
328 proveniente de solo arenoso, não diferiram significativamente pelo teste “post-hoc” de
80
Tukey, para p<0,05 (2,656 e 2,965 µmol de ácido galacturônico liberado por min/mg de
proteínas, respectivamente).
Em Candida boidinii CCMB 297, assim como em todos os isolados do gênero
Aureobasidium não foi não determinada à atividade da poligalacturonase nas condições
experimentais. Blanco, Sieiro e Villa (1999), em artigo de revisão, sugerem que este
comportamento deve-se a um sistema enzimático mais complexo presente nestes
microrganismos.
Vários fatores podem ter influenciado para que a atividade da poligalacturonase nesses
isolados não fosse determinada. Desta forma, comparando-se a fermentação submersa com a
fermentação em estado sólido, onde todos os 33 foram secretores da poligalacturonase, temos
que no caldo de cultivo não estava presente o ácido poligalacturônico; enquanto que, no meio
sólido, ele estava presente como substrato, podendo ter induzido a síntese da enzima. Além
disto, a quantidade de glicose utilizada no caldo de fermentação [10% (p/v)] foi duas vezes
maior que a do meio sólido, o que pode ter causado a repressão catabólica, visto que a fonte
de carbono facilmente metabolizavel estava abundante naquele meio.
Verifica-se, pela análise dos resultados que nove isolados do presente estudo, produziram
a poligalacturonase na ausência de um indutor (ácido poligalacturônico), demonstrando a
natureza constitutiva dessa enzima nestes isolados.
Por outro lado, estes nove isolados não foram suscetíveis à repressão catabólica por
glicose na concentração de 10% (p/v). Este fato difere do encontrado por Blanco et al. (1998)
apud Blanco, Sieiro e Villa (1999), no qual a atividade pectinolítica foi completamente inibida
quando a concentração de glicose ultrapassou 2%. Por outro lado, no estudo de Malavolta
(2000), os efeitos regulatórios da glicose quanto à secreção de enzimas pectinolíticas foram
dependentes do isolado.
81
Tabela 05. Biomassa seca, unidade de atividade da poligalacturonase, proteína total e atividade específica da poligalacturonase produzidas por microrganismos leveduriformes pectinolíticos isolados do Semi-árido baiano, crescidos em caldo de fermentação em agitador rotatório a 150 rpm, a 28ºC por 48 h.
Microrganismo BS UAPG PT AEPG*
Aureobasidium pullulans CCMB 296 172 ND 0,084 ND
Candida boidinii CCMB 297 329,2 ND 0,127 ND
Trichosporonoides sp. CCMB 298 212,9 ND 0,059 ND
Pseudozyma sp. CCMB 299 162,9 0,584 0,089 6,562 d
Pseudozyma sp. CCMB 300 67 0,879 0,062 14,18 h
Pseudozyma sp. CCMB 301 213 ND 0,088 ND
Cryptococcus liquefaciens CCMB 302 351,3 1,206 0,114 10,58 f
Trichosporonoides sp. CCMB 303 301,6 ND 0,1 ND
Trichosporonoides sp. CCMB 304 163,3 1,255 0,101 12,43 g
Fungal endophyte CCMB 305 222,3 ND 0,075 ND
Pseudozyma sp. CCMB 306 141,8 0,725 0,086 8,43 e
Aureobasidium pullulans CCMB 307 152,8 ND 0,07 ND
Fungal endophyte CCMB 308 133 0,101 0,205 0,493 a
Aureobasidium pullulans CCMB 309 201,1 ND 0,12 ND
Aureobasidium pullulans CCMB 310 161,1 ND 0,074 ND
Fungal endophyte CCMB 311 106,5 ND 0,063 ND
Aureobasidium pullulans CCMB 312 117,5 ND 0,06 ND
Aureobasidium pullulans CCMB 313 118 ND 0,096 ND
Aureobasidium pullulans CCMB 314 97 ND 0,06 ND
Aureobasidium pullulans CCMB 315 147,4 ND 0,091 ND
Aureobasidium pullulans CCMB 316 237,2 ND 0,076 ND
Aureobasidium pullulans CCMB 317 227,3 ND 0,076 ND
Aureobasidium pullulans CCMB 318 108,8 ND 0,078 ND
Aureobasidium pullulans CCMB 319 110 ND 0,058 ND
Aureobasidium pullulans CCMB 320 236,9 ND 0,06 ND
Aureobasidium pullulans CCMB 321 147,1 ND 0,088 ND
Kluyveromyces marxianus CCMB 322 183,1 0,201 0,193 1,041 ab
Aureobasidium pullulans CCMB 323 250 ND 0,053 ND
Aureobasidium pullulans CCMB 324 250,5 ND 0,055 ND
Aureobasidium pullulans CCMB 325 218,8 ND 0,086 ND
Aureobasidium pullulans CCMB 326 179,5 ND 0,086 ND
Fungal endophyte CCMB 327 166 0,17 0,064 2,656 c
Fungal endophyte CCMB 328 214 0,169 0,057 2,965 c
Kluyveromyces marxianus CCT 3172** 179 0,237 0,186 1,274 b
CCMB = Coleção de Culturas de Microrganismos da Bahia; BS = biomassa seca (mg); UAPG = unidade de atividade da poligalacturonase (µmol/mL/min); PT = Proteína total (mg/mL); AEPG = atividade específica da poligalacturonase (µmol de ácido galacturônico liberado por min/mg de proteínas); ND = não determinada. * Médias com letras minúsculas desiguais correspondem a grupos significativamente diferentes para p<0,05, de acordo com o teste “post-hoc” de Tukey; ** Microrganismo controle positivo para poligalacturonase.
82
5.4.2 Atividade da pectina liase (PL)
A atividade da pectina liase extracelular foi verificada em todos os 33 isolados
leveduriformes (Gráfico 03).
Gráfico 03. Atividade específica (AE) da pectina liase (PL) em µmol de grupos uronídeos insaturados formados por min/mg de proteínas, obtida com microrganismos leveduriformes* isolado do Semi-árido baiano, crescidos em agitador rotatório a 28ºC por 48 h em caldo de fermentação. *No gráfico os microrganismos são em ordem crescente: 1-Aureobasidium pullulans CCMB 296; 2-Candida boidinii CCMB 297; 3-Trichosporonoides sp. CCMB 298; 4-Pseudozyma sp. CCMB 299; 5-Pseudozyma sp. CCMB 300; 6-Pseudozyma sp. CCMB 301; 7-Cryptococcus liquefaciens CCMB 302; 8-Trichosporonoides sp. CCMB 303; 9-Trichosporonoides sp. CCMB 304; 10-Fungal endophyte CCMB 305; 11-Pseudozyma sp. CCMB 306; 12-Aureobasidium pullulans CCMB 307; 13-Fungal endophyte CCMB 308; 14-Aureobasidium pullulans CCMB 309; 15-Aureobasidium pullulans CCMB 310; 16-Fungal endophyte CCMB 311; 17-Aureobasidium pullulans CCMB 312; 18-Aureobasidium pullulans CCMB 313; 19-Aureobasidium pullulans CCMB 314; 20-Aureobasidium pullulans CCMB 315; 21-Aureobasidium pullulans CCMB 316; 22-Aureobasidium pullulans CCMB 317; 23-Aureobasidium pullulans CCMB 318; 24-Aureobasidium pullulans CCMB 319; 25-Aureobasidium pullulans CCMB 320; 26-Aureobasidium pullulans CCMB 321; 27-Kluyveromyces marxianus CCMB 322; 28-Aureobasidium pullulans CCMB 323; 29-Aureobasidium pullulans CCMB 324; 30-Aureobasidium pullulans CCMB 325; 31-Aureobasidium pullulans CCMB 326; 32-Fungal endophyte CCMB 327; 33-Fungal endophyte CCMB 328; 34-Kluyveromyces marxianus CCT 3172. As cores das colunas não possuem significado estatístico.
83
As médias da atividade da pectina liase não diferiram significativamente pelo teste “post-
hoc” de Tukey, para p<0,05 (Tabela 06), dentro dos seguintes grupos de isolados:
Aureobasidium pullulans CCMB 296, Pseudozyma sp. CCMB 299 e Pseudozyma sp. CCMB
301; Candida boidinii CCMB 297, Trichosporonoides sp. CCMB 304, Aureobasidium
pullulans CCMB 309 e Aureobasidium pullulans CCMB 313; Trichosporonoides sp. CCMB
298, Pseudozyma sp. CCMB 306 e Aureobasidium pullulans CCMB 320; Pseudozyma sp.
CCMB 300 e Aureobasidium pullulans CCMB 317; Cryptococcus liquefaciens CCMB 302 e
Kluyveromyces marxianus CCMB 322; “Fungal endophyte” CCMB 305, Aureobasidium
pullulans CCMB 310 e Aureobasidium pullulans CCMB 321; Aureobasidium pullulans
CCMB 314 e Aureobasidium pullulans CCMB 319; Aureobasidium pullulans CCMB 318 e
Aureobasidium pullulans CCMB 326. A Tabela 06 traz ainda as biomassas obtidas na
fermentação submersa de todas as 33 culturas.
O isolado “Fungal endophyte” CCMB 328 apresentou atividade de 130,48 µmol de
grupos uronídeos insaturados formados por min/mg de proteínas, sendo este o maior valor
encontrado no presente trabalho.
Os resultados para as leveduras Kluyveromyces foram contrários aos encontados em
outros estudos (SCHWAN; ROSE, 1994; MOYO et al., 2003). Nestes estudos, não foram
encontrado atividade para leveduras do gênero Kluyveromyces, enquanto que no presente
estudo esta atividade foi determinada, sendo 22,624 µmol de grupos uronídeos insaturados
formados por min/mg de proteínas para a Kluyveromyces marxianus CCT 3172 e 17,425
µmol de grupos uronídeos insaturados formados por min/mg de proteínas para a
Kluyveromyces marxianus CCMB 322.
84
Tabela 06. Biomassa seca, unidade de atividade da pectina liase, proteína total e atividade específica da pectina liase produzidas por microrganismos leveduriformes pectinolíticos isolados do Semi-árido baiano, crescidos em caldo de fermentação em agitador rotatório a 150 rpm, a 28ºC por 48 h.
Microrganismo BS UAPL PT AEPL*
Aureobasidium pullulans CCMB 296 172 2,472 0,084 29,429 cde
Candida boidinii CCMB 297 329,2 3,881 0,127 30,559 de
Trichosporonoides sp. CCMB 298 212,9 2,964 0,059 50,237 ijl
Pseudozyma sp. CCMB 299 162,9 2,553 0,089 28,685 cde
Pseudozyma sp. CCMB 300 67 3,343 0,062 53,919 jl
Pseudozyma sp. CCMB 301 213 2,564 0,088 29,136 cde
Cryptococcus liquefaciens CCMB 302 351,3 1,887 0,114 16,553 a
Trichosporonoides sp. CCMB 303 301,6 4,12 0,1 41,2 gh
Trichosporonoides sp. CCMB 304 163,3 3,026 0,101 29,96 de
Fungal endophyte CCMB 305 222,3 4,665 0,075 62,2 mno
Pseudozyma sp. CCMB 306 141,8 4,517 0,086 52,523 ijl
Aureobasidium pullulans CCMB 307 152,8 4,614 0,07 65,914 o
Fungal endophyte CCMB 308 133 3,963 0,205 19,332 ab
Aureobasidium pullulans CCMB 309 201,1 3,746 0,12 31,217 de
Aureobasidium pullulans CCMB 310 161,1 4,529 0,074 61,203 mno
Fungal endophyte CCMB 311 106,5 3,055 0,063 48,492 ij
Aureobasidium pullulans CCMB 312 117,5 3,804 0,06 63,4 no
Aureobasidium pullulans CCMB 313 118 2,994 0,096 31,188 de
Aureobasidium pullulans CCMB 314 97 3,389 0,06 56,483 lmn
Aureobasidium pullulans CCMB 315 147,4 3,066 0,091 33,692 ef
Aureobasidium pullulans CCMB 316 237,2 3,08 0,076 40,526 fg
Aureobasidium pullulans CCMB 317 227,3 4,103 0,076 53,987 jl
Aureobasidium pullulans CCMB 318 108,8 3,534 0,078 45,308 ghi
Aureobasidium pullulans CCMB 319 110 3,289 0,058 56,707 lmn
Aureobasidium pullulans CCMB 320 236,9 3,072 0,06 51,2 ijl
Aureobasidium pullulans CCMB 321 147,1 5,341 0,088 60,693 mno
Kluyveromyces marxianus CCMB 322 183,1 3,363 0,193 17,425 a
Aureobasidium pullulans CCMB 323 250 2,984 0,053 56,302 lm
Aureobasidium pullulans CCMB 324 250,5 2,607 0,055 47,4 hij
Aureobasidium pullulans CCMB 325 218,8 2,141 0,086 24,895 bcd
Aureobasidium pullulans CCMB 326 179,5 3,889 0,086 45,221 ghi
Fungal endophyte CCMB 327 166 8,351 0,064 130,48 q
Fungal endophyte CCMB 328 214 6,684 0,057 117,26 p
Kluyveromyces marxianus CCT 3172** 179 4,208 0,186 22,624 abc
CCMB = Coleção de Culturas de Microrganismos da Bahia; BS = biomassa seca (mg); UAPL = unidade de atividade da pectina liase (µmol/mL/min); PT = Proteína total (mg/mL); AEPL = atividade específica da pectina liase (µmol de grupos uronídeos insaturados formados por min/mg de proteínas). * Médias com letras minúsculas desiguais correspondem a grupos significativamente diferentes para p<0,05, de acordo com o teste “post-hoc” de Tukey; ** Microrganismo controle positivo para poligalacturonase.
85
Além disso, pectina liase não tem sido frequentemente detectada em leveduras, sendo
bastante relatada como secretada por fungos filamentosos (SCHWAN; COOPER; WHEALS,
1997).
No trabalho de Silva (2003), não foi determinada a atividade da pectina liase em nenhuma
cultura das leveduras submetidas à fermentação submersa. Segundo ela, uma possível causa
para a não detecção desta enzima pode ter sido devido à baixa sensibilidade do método
empregado, um método espectrofotométrico (ALBERSHEIM, 1966).
De fato, Nedjma, Hoffmann e Belarbi (2001) determinaram atividade da pectina liase na
levedura Saccharomyces cerevisiae SCPP, empregando um teste colorimétrico usando ácido
tiobarbitúrico na sua detecção.
Entretanto, no presente trabalho assim como em outros (PICCOLI-VALLE et al., 2003;
GUMMADI; KUMAR, 2006), a determinação da atividade da pectina liase deu-se pelo
método de Albersheim (1966). Deste modo, estudos com outros parâmetros (físicos e
químicos) fazem-se necessários.
A concentração de açúcar [10% (p/v)] no meio de cultivo não causou a repressão
catabólica da pectina liase no presente estudo. Além disto, não foi necessária a presença do
substrato (pectina) para induzir a síntese da pectina liase, sendo essa enzima constitutiva para
os 33 isolados avaliados, nas condições estudadas.
5.5 Resumo dos resultados
• Dentre os 250 microrganismos leveduriformes avaliados, 33 foram selecionados por
produzirem enzimas pectinolíticas em meio sólido especifíco. Em todos eles foi
possível determinar a produção da poligalacturonase e em três destes, não foi possível
determinar a pectina liase;
86
• O índice enzimático mostrou-se útil na comparação de isolados taxonomicamente
relacionados, sendo que nenhum isolado pectinolítico apresentou índice maior que o
encontrado no controle Kluyveromyces marxianus CCT 3172;
• Os 33 isolados pectinolíticos foram identificados molecularmente em seis gêneros
(Pseudozyma, Trichosporonoides, Candida, Aureobasidium, Cryptococcus e
Kluyveromyces), havendo entre eles 23 isolados ascomicetos [Aureobasidium
pullulans (18), Candida boidinii (1), Trichosporonoides sp. (3) e Kluyveromyces
marxianus (1)] e cinco basidiomicetos [Cryptococcus liquefaciens (1) e Pseudozyma
sp. (4)];
• Cinco dos 33 microrganismos leveduriformes pectinolíticos, foram identificados
apenas como “Fungal endophyte”;
• Os 33 microrganismos leveduriformes pectinolíticos isolados de substratos do Semi-
árido baiano foram depositados na Coleção de Culturas de Microrganismos da Bahia
(CCMB) da UEFS;
• O isolado Trichosporonoides sp. CCMB 304 e o Candida boidinii CCMB 297 são
possivelmente dois novos táxons, ainda não descritos na literatura, embasando-se nos
seus valores de expectativa (E-value) e de identidade (%);
• As médias da atividade da poligalacturonase não diferiram significativamente apenas
entre dois dos nove isolados produtores desta enzima (Tukey p<0,05);
• A atividade da poligalacturonase foi verificada somente em nove dos isolados
pectinolítios, sendo o isolado Pseudozyma sp. CCMB 300 e o Trichosporonoides sp.
CCMB 304 os secretores mais ativos, apresentando respectivamente 14,17 e 12,47
µmol de ácido galacturônico liberado por min/mg de proteínas;
87
• A poligalacturonase secretada por estes nove isolados, caracterizou-se como uma
enzima constitutiva, não sendo reprimida catabolicamente em caldo com glicose a
10% (p/v);
• A atividade da pectina liase foi verificada em todos os 33 isolados, sendo uma enzima
constitutiva, não tendo repressão catabólica em caldo com glicose a 10% (p/v);
• As médias da atividade da pectina liase diferiram significativamente entre grupos de
isolados produtores desta enzima (Tukey p<0,05);
• Os secretores mais ativos da pectina liase foram o “Fungal endophyte” CCMB 327 e o
“Fungal endophyte” CCMB 328, que apresentaram, respectivamente, 130,48 e 117,26
µmol de grupos uronídeos insaturados formados por min/mg de proteínas;
• É possível que proteases extracelulares produzidas pelos micorganismos
leveduriformes pectinolíticos durante a fermentação submersa tenham degradado
proteínas da solução bruta de proteínas extracelulares, justificando os baixos valores
encontrados no doseamento da proteína total.
88
6 CONCLUSÃO
Esse estudo demonstrou que microrganismos leveduriformes isolados do Semi-árido
baiano representam uma fonte de pectinases extracelulares de interesse industrial e
biotecnológico, com propriedades peculiares, tais como: tempo de fermentação curto em
caldo não dispendioso economicamente, secreção da enzima na ausência de um indutor e não
repressão catabólica quando presente uma fonte de carbono facilmente metabolizável.
Além disso, pesquisas com estes microrganismos contribuirão para o conhecimento da
biodiversidade de microrganismos do Semi-árido, pois até o atual, existe uma relativa
escassez de trabalhos.
É interessante que se dê continuidade ao trabalho otimizando a produção destas
enzimas, além de aplicá-las tendo em vista fins comerciais. Espera-se também, com métodos
complementares, diferenciar as espécies de microrganismos leveduriformes pectinolíticos
encontrados no presente estudo.
89
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102
APÊNDICE(S)
APÊNDICE A – Fotografias dos substratos do Semi-árido baiano, dos quais
microrganismos leveduriformes produtores de pectinases extracelulares foram isolados.
Solanum sp. Pavonia sp.
Melocactus sp. Stachytarpheta sp.
Clusia sp. Piptadenia sp.
103
Jacaranda sp. Camptosema sp.
Opuntia sp. Agave sp.
Passiflora sp. Ipomoea sp.
104
APÊNDICE B – Fotografias da microscopia de contraste de fase dos microrganismos
leveduriformes produtores de enzimas pectinolíticas extracelulares, isolados do Semi-
árido baiano, crescidos em ágar YM a 28ºC por 48 h, corados com azul de metileno 1%
(p/v) e ampliação de 1.000x (imersão em óleo).
Pseudozyma sp. CCMB 299
Pseudozyma sp. CCMB 300
Aureobasidium pullulans CCMB 296
Candida boidinii CCMB 297
Trichosporonoides sp. CCMB 298
Pseudozyma sp. CCMB 301
Cryptococcus liquefaciens CCMB 302
Trichosporonoides sp. CCMB 303
Trichosporonoides sp. CCMB 304
Fungal endophyte CCMB 305
Pseudozyma sp. CCMB 306
Aureobasidium pullulans CCMB 307
105
Fungal endophyte CCMB 308
Aureobasidium pullulans CCMB 309
Aureobasidium pullulans CCMB 310
Fungal endophyte CCMB 311
Aureobasidium pullulans CCMB 312
Aureobasidium pullulans CCMB 313
Aureobasidium pullulans CCMB 314
Aureobasidium pullulans CCMB 315
Aureobasidium pullulans CCMB 316
Aureobasidium pullulans CCMB 317
Aureobasidium pullulans CCMB 318
Aureobasidium pullulans CCMB 319
Aureobasidium pullulans CCMB 321
Aureobasidium pullulans CCMB 320
Kluyveromyces marxianus CCMB 322
106
Aureobasidium pullulans CCMB 324
Aureobasidium pullulans CCMB 323
Aureobasidium pullulans CCMB 325
Aureobasidium pullulans CCMB 326
Fungal endophyte CCMB 327
Fungal endophyte CCMB 328
107
APÊNDICE C - Seqüências amplificadas do domínio D1/D2 do 26S rDNA dos
microrganismos leveduriformes produtores de enzimas pectinolíticas extracelulares,
isolados do Semi-árido baiano.
1. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 296 5’gcctccaccagagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgatggtgcaccttgcggttcccacctccgttcactttcattacgcgcaggggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacacactgggctataacacctccaccgaagtgaaggccacattcccaatgcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagactggcgttttacccaaagcatcctctacaaattacaatg3’
2. Seqüência do isolado Candida boidinii CCMB 297 5’gcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatctgaaaacatcaggatcggtcgataatgcacctaaaaggctcttatcttcgttcactttcattacgcgtaagagtttgacaccctaacactcgcatagacgttagactccttggtccatgtttcaagacgggcggtactgtatcattacgccaaaatcctagccgaagcgcagtcctgagacaagttaggagtcattacttaagactataacactctaaaagagccacatttcaaaagctttttcactccaacaa3’
3. Seqüência do isolado Trichosporonoides sp. CCMB 298 5’tacccaggtcagacgatcgatttgcacgtcagaaccgcggcggccctccaccagagtttcctctggctttagcctacccaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacatatctgctcttgctcagaccagtattgcccgcaggcgcatggccggccggtgctgctcttacgatcgcacctacattactttcattgcgccctccgggtttgccacccaaagactcgcaaacatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgctgacggccattaagcctgcaccagtcggtcgcgaagcatccactgcgaggctataacactcccgaaagagccacattcctcacagccttctcctacacaacccaccaacgcagaccccacacaaaacgcatagcccagcagaaactaggtgtacgccaagtgctacggtactgacagccagcgcttcccttttggcaatttcacgtactctttcactctctttccaaagttcttttcatctttccctcacgggtacttgttcgctatcggtctctccccgttatttagccttagatggcgtttaccacccattttgcgctgcattcccaaacaacgcgactcgtcgagcgcaccccacaaagcaacagcaaccacaccaagcacgggattctcaccctctctgatgctgctttccagcagacttgggcatggtaccattacaggaggtacgtctccagcttaca3’
108
4. Seqüência do isolado Pseudozyma sp. CCMB 299 5’agagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacaggtatgctcttactcaaatccacgacataaatgacgtgaggatcggtcgatggtgcaccttgcggatcccacctgaattcactttcattgcgcctatgggtttgccacccaaagactcgcatacatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtggtagagggccattatgccaacgccctaagcgtaaaggtgcccgaaggcccgctcttgcgagtacgctgctgtcctcggtctcggtcgctgtatccagtagaaggctataacacaccccgagaggtgccacgttccttccacccttctccagtgcccaaaaccgacgttggcctgcaatctaggaaaaacaccaagcaaaagcaaggctgaatcctaggccgcatctctgacctcctacccttcccttttggcaatttcacgtactgtttaactctcttttcaaagttcttttcatctttccatcactgtacttgttcgctatcggtctctccccaatatttagccttagatggcatttaccacccattttgagctgcattcccaaacaactcgactcttagaaagtgtatcacaaagctacgggcgctccaagccatgtacgggattatcaccctctatgatgcccctttccaggggacttaggcttggtccgaagc3’
5. Seqüência do isolado Pseudozyma sp. CCMB 230 5’agagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacaggtatgctcttactcaaatccacgacataaatgacgtgaggatcggtcgatggtgcaccttgcggatcccacctgaattcactttcattgcgcctatgggtttgccacccaaagactcgcatacatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtggtagagggccattatgccaacgccctaagcgtaaaggtgcccgaaggcccgctcttgcgagtacgctgctgtcctcggtctcggtcgctgtatccagtagaaggctataacacaccccgagaggtgccacgttccttccacccttctccagtgcccaaaaccgacgttggcctgcaatctaggaaaaacaccaagcaaaagcaaggctgaatcctaggccgcatctctgacctcctacccttcccttttggcaatttcacgtactgtttaactctcttttcaaagttcttttcatctttccatcactgtacttgttcgctatcggtctctccccaatatttagccttagatggcatttaccacccattttgagctgcattcccaaacaactcgactcttagaaagtgtatcacaaagctacgggcgctccaagccatgtacgggattatcaccctctatgatgcccctttccaggggacttaggcttggtccgaagcggaaaacacttcttgagattacaatgcggacgccgaagacgccagctttcaatcttgggctcttccctcttcactcgccgt3’
6. Seqüência do isolado Pseudozyma sp. CCMB 301 5’tatacccaaatttgacgatcgatttgcacgtcagaaccgctacgagcctccaccagagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacaggtatgctcttactcaaatccacgacataaatgacgtgaggatcggtcgatggtgcaccttgcggatcccacctgaattcactttcattgcgcctatgggtttgccacccaaagactcgcatacatgttagactccttgggtccgtgtttcaagacgggtggtagagggccattatgccaacgccctaagcgtaaaggtgcccgaaggcccgctcttgcgagtacgctgctgtcctcggtctcggtcgctgtatccagtagaaggctataacacaccccgagaggtgccacgttccttccacccttctccagtgcccaaaaccgacgttggcctgcaatctaggaaaaacaccaagcaaaagcaaggctgaatcctaggccgcatctctgacctcctacccttcccttttggcaatttcacgtactgtttaactctcttttcaaagttcttttcatctttccatcactgtacttgttcgctatcggtctctccccaatatttagccttagatggcatttaccacccattttgagctgcattcccaaacaactcgactcttagaaagtgtatcacaaagctacgggcgctccaagccatgtacgggattatcaccctctatgatgcccctttccaggggacttaggcttggtccgaagcggaaaacacttcttgagattacaatgcggacgccgaaga3’
7. Seqüência do isolado Cryptococcus liquefaciens CCMB 302 5’tttcctctggcttcgccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacatatatgctcttactcaaatccatcactaaagatccagatcggtcgaagctgcaccttgcggatcgctcctacgttcactttcattgcgcactcgggtttgacacccaaatactcgcagatatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgtttaaagccattatgtcaacatcctaagcatgtacgtggacgaatcccggccaaaaggcatgctgcgttcctcagtcccaatcaatgtatatgacgcgaggctataagttcacccgagagtgctaccttccccgtgcctttatccatcgatcaaaactgatgttgaccccactcaagggaggtaagtcccaagagcatgactgacttcaatcgtttccctttcaacaa3’
109
8. Seqüência do isolado Trichosporonoides sp. CCMB 303 5’ctcagaccagtattgcccgcaggcgcatggccggccggtgctgctcttacgatcgcacctacattactttcattgcgccctccgggtttgccacccaaagactcgcaaacatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgctgacggccattaagcctgcaccagtcggtcgcgaagcatccactgcgaggctataacactcccgaaagagccacattcctcacagccttctcctacacaacccaccaacgcagaccccacacaaaacgcatagcccagcagaaactaggtgtacgccaagtgctacggtactgacagccagcgcttcccttttggcaatttcacgtactctttcactctctttccaaagttcttttcatctttccctcacggtacttgttcgctatcggtctctccccgttatttagccttagatggcgtttaccacccattttgcgctgcattcccaaacaacgcgactcgtcgagcgcaccccacaaagcaacagaaaccacaccaagcacgggattctcaccctctctgatgctgctttccagcagacttgggcatggtaccattacaggaggtacgtctccagcttacaatgcgctac3’
9. Seqüência do isolado Trichosporonoides sp. CCMB 304 5’tatacccaagtcagacgatcgatttgcacgtcagaaccgcgacggtcctccaccagagtttcctctggcttcaacctactcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacatatctgctcttgctcaaaccattcttgcccgcaggcgcatggtcggccggtgctgctccgaagatcgcacccacatcactttcattgcgccccccgggtttgccacccaaagactcgcaaacatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggccgctgacggccattaagcaccagcccgtcggcagcgaggcatccacgtgcgggctataacactcccgagggagccacattcccacacgccttctcccccaccagccaacgggccggggccccacacgcagcgagtagcccggcagaaaccaggtgtacaccacgtgcttcggtactgacagccagcgcttcccttttggcaatttcacgtactctttcactctctttccaaagtgcttttcatctttccctcacggtacttgttcgctatcggtctctccccaatatttagccgtagatggcgtttaccacccattttgcgctgcattcccaaacaacgcgactcgtcgagcgcaccccacaacgcagcagacaccacaccaagcacgggat3’
10. Seqüência do isolado Fungal endophyte CCMB 305 5’tttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgatggtgcaccttgcggttcccacctccgttcactttcattacgcgcaggggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacacccagggctataacactcccaccgaagtgagagccacattccctgagcctttatccggccgccaaaactgatgctggcctgtccagactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtcaaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccggtatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacatagggtgccatgtcctgtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagacaggcggctgccccaaagcatcctctacaaattacaatgcggacccgaaggccagctttcaaatt3’
11. Seqüência do isolado Pseudozyma sp. CCMB 306 5’gagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacaggtatgctcttactcaaatccacgacataaatgacgtgaggatcggtcgatggtgcaccttgcggatcccacctgaattcactttcattgcgcctatgggtttgccacccaaagactcgcatacatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtggtagagggccattatgccaacgccctaagcgtaaaggtgcccgaaggcccgctcttgcgagtacgctgctgtcctcggtctcggtcgctgtatccagtagaaggctataacacaccccgagaggtgccacgttccttccacccttctccagtgcccaaaaccgacgttggcctgcaatctaggaaaaacaccaagcaaaagcaaggctgaatcctaggccgcatctctgacctcctacccttcccttttggcaatttcacgtactgtttaactctcttttcaaagttcttttcatctttccatcactgtacttgttcgctatcggtctctccccaatatttagccttagatggcatttaccacccattttgagctgcattcccaaacaactcgactcttagaaagtgtatcacaaagctacgggcgctccaagccatgtacgggattatcaccctctatgatgcccctttccaggggacttaggcttggtccgaagcggaaaacacttcttgagattacaatgcggacgccgaagacgccagctttcaatcttgggc3’
110
12. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 307 5’tatacccaaatttgacgatcgatttgcacgtcagaaccgctgcgagcctccaccagagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgatggtgcaccttgcggttcccacctccgttcactttcattacgcgcaggggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacaccctgggctataacaccttcaccgaagtgaaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagactggcgtttcacccaaagcatcctctacaaattacaatg3’
13. Seqüência do isolado Fungal endophyte CCMB 308 5’tttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgatggtgcaccttgcggttcccacctccgttcactttcattacgcgcaggggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacaccctgggctataacacctccaccgaagtggaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacatagggtgccatgtcctgtcacatacgggattctcaccct3’
14. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 309 5’agagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgatggtgcaccttgcggttcccacctccgttcactttcattacgcgcaggggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacaccctgggctataacaccttcaccgaagtgaaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagactggcgtttcacccaaagcatcctctacaaattacaatgcggacccgaaggccagctttcaaatt3’
15. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 310 5’agagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgatggtgcaccttgcggttcccacctccgttcactttcattacgcgcaggggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttgggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacaccctgggctataacaccttcaccgaagtgaaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagactggcgtttcacccaaagcatcctctacaaattacaatg3’
111
16. Seqüência do isolado Fungal endophyte CCMB 311 5’gggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacacccagggctataacactcccaccgaagtgagagccacattccctgggcctttatccggccgccaaaactgatgctggcctgtccagactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtcaaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccggtatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacatagggtgccatgtcctgtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagacaggcggctgccccaaagcatcctctacaaattacaatgcggacccgaaggccagctttcaaatt3’
17. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 312 5’ggggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttgggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacaccctgggctataacaccttcaccgaagtgaaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagactggcgtttcacccaaagcatcctctacaaattacaat3’
18. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 313 5’tttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgatggtgcaccttgcggttcccacctccgttcactttcattacgcgcaggggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacaccctgggctataacaccttcaccgaagtgaaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagactggcgtttcacccaaagcatcctctacaaattacaatgcggacccgaaggccagctttcaaat3’
19. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 314 5’caagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacaccctgggctataacaccttcaccgaagtgaaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagactggcgtttcacccaaagcatcctctacaaattacaatgc3’
112
20. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 315 5’gacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacaccctgggctataacaccttcaccgaagtgaaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagactggcgtttcacccaaagcatcctctacaaattacaatgcggacccgaaggccagctttcaaatt3’
21. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 316 5’gcggttcccacctccgttcactttcattacgcgcaggggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacaccctgggctataacaccttcaccgaagtgaaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagactggcgtttcacccaaagcatcctctacaaattacaatg3’
22. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 317 5’acccaaatttgacgatcgatttgcacgtcagaaccgctgcgagcctccaccagagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgatggtgcaccttgcggttcccacctccgttcactttcattacgcgcaggggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacaccctgggctataacaccttcaccgaagtgaaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctct3’
23. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 318 5’cactttcattacgcgcaggggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacaccctggggctataacaccttcaccgaagtgaaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaagg3’
113
24. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 319 5’gagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgatggtgcaccttgcggttcccacctccgttcactttcattacgcgcaggggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttgggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacaccctgggctataacaccttcaccgaagtgaaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagactggcgtttcacccaaagcatcctctacaaattacaatgcggacccgaaggccagctttcaaatt3’
25. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 320 5’cctccaccagagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgatggtgcaccttgcggttcccacctccgttcactttcattacgcgcaggggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacaccctgggctataacaccttcaccgaagtgaaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagactggcgtttcacccaaagcatcctctacaaattacaatgcggacccgaaggccagctttcaaat3’
26. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 321 5’agtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgatggtgcaccttgcggttcccacctccgttcactttcattacgcgcaggggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacaccctgggctataacaccttcaccgaagtgaaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagactggcgtttcacccaaagcatcctctacaaattacaatg3’
27. Seqüência do isolado Kluyveromyces marxianus CCMB 322 5’tttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgatgatgcacccttgcgggccctcacctacgttcactttcattacgcgtacgggttttacacccaaacactcgcatagacgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggcggcatttaaccattacgccagcatccttgacaaaagtcgcaatcctcagtcccagctggctgtattcccacgggctataacactctaccgaagcagagccacattcccgaggatttatccaaccgctaaaactgatgctggcccagcgaaagccgaagcaaacgccatgtctgatcaaatgcccttccctttcaacaatttcacgtactttttcactctcttttcaaagttcttttcatctttccatcactgtacttgttcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagatggaatttaccacccacttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaagcactttacaaataactgggatcctcgccacacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacatagacaaggaccagctacaaagtcgccttcttcaaattacaactcggacgtcg3’
114
28. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 323 5’acccaaatttgacgatcgatttgcacgtcagaaccgctgcgagcctccaccagagtttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgatggtgcaccttgcggttcccacctccgttcactttcattacgcgcaggggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacacactgggctataacacctccaccgaagtggaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagactggcgttttacccaaagcatcctctacaaattacaatgcgaacccgaaggctagctttcaaatt3’
29. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 324 5’gtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacacactgggctataacacctccaccgaagtggaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagactggcgttttacccaaagcatcctctacaaattacaatgcgaacccgaagg3’
30. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 325 5’gggcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacgtttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagactggcgtttcacccaaagcatcctctacaaattacaatgcggacccgaaggccagctttcaaatt3’
31. Seqüência do isolado Aureobasidium pullulans CCMB 326 5’agagtttcctctgggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtcccaacagctatgctcttactcaaatccatccgaagacatcaggatcggtcgatggtgcaccttgcggttcccacctccgttcactttcattacgcgcaggggtttgacacccgaacactcgcatagatgttagactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgcttacaaccattacgccagcatcctagccgaagcgcggacctcagtcccggctggccgtattacaccctgggctataacaccttcaccgaagtgaaggccacattcccagagcctttatccggccgccgaaactgatgctggcctgtccaaactgagtaaaccggtcagaagaccggccgaacagtttaaacaagtctgattgcaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctttttaactctctttccaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagaagaaatttacctcccatttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgaaggagctttacataggttaacatttccagtcacatacgggattctcaccctctatgacgtcctgttccaaggaacttagactggcgtttcacccaaagcatcctctacaaattacaatg3’
115
32. Seqüência do isolado Fungal endophyte CCMB 327 5’tttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtccgaggctttacgctcttactcaaatccatccgaatacatcaggatcggtcgatgatgcgccgaagctctcacctacgttcactttcattacgcgtgcgggttttacacccaaacactcgcgcaaaacctcgactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgctgatgaccattatgccagcgtccttgcagagcgcgaacctcggtccccgcgagggtattaaacgacgggctataacactcccggaggagccacgttcccgacgcttttatccccccgcgagaaccgacgctggcctgagccgggtcgagtgcaccagtgagaacactggatgatcagcccggcgcaagtctggtcacaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctatttaaccctcttttcaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctggcctatatttagctttagaagagatatacctcccattttgagcagcattcccaaactactcgactcgtcgaaggagctttacagaggctaggtgtccgactatacggggctctcaccctctctggcgtcccgttccagggaactcagaaggcacctcgccaaaagcatcctctacaaattacaactcgggccgaagccagatttcaaatt3’
33. Seqüência do isolado Fungal endophyte CCMB 328 5’tttcctctggcttcaccctattcaggcatagttcaccatctttcgggtccgaggctttacgctcttactcaaatccatccgaatacatcaggatcggtcgatgatgcgccgaagctctcacctacgttcactttcattacgcgtgcgggttttacacccaaacactcgcgcaaaacctcgactccttggtccgtgtttcaagacgggtcgctgatgaccattatgccagcgtccttgcagagcgcgaacctcggtccccgcgagggtattaaacgacgggctataacactcccggaggagccacgttcccgacgcttttatccccccgcgagaaccgacgctggcctgagccgggtcgagtgcaccagtgagaacactggatgatcagcccggcgcaagtctggtcacaagcgcttccctttcaacaatttcacgtgctatttaaccctcttttcaaagtgcttttcatctttcgatcactctacttgtgcgctatcggtctctggcctatatttagctttagaagagatatacctcccattttgagcagcattcccaaactactcgactcgtcgaaggagctttacagaggctaggtgtccgactatacggggctctcaccctctctggcgtcccgttccagggaactcagaaggcacctcgccaaaagcatcctctacaaattacaactcgggccgaagccagatttcaaatt3’
116
Curva padrão do ácido galacturônico
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Concentração (mg/mL)
Abs
orbâ
ncia
(54
0nm
) y = 0,8055x - 0,0069R2 = 0,9976
APÊNDICE D - Curvas de calibração
1. Curva padrão obtida com o ácido D-galacturônico pelo método do DNS (MILLER,
1959), para determinação da atividade da poligalacturonase (PG).
Concentração (mg/mL)
Absorbância1 Absorbância2 Média da Absorbância (540nm)
0,2162 0,1761 0,171 0,17355 0,324 0,2689 0,2596 0,29645 0,4324 0,351 0,3436 0,3917 0,5405 0,4155 0,4188 0,478 0,6486 0,5001 0,5032 0,57435 0,7567 0,5814 0,5926 0,66905 0,8648 0,7082 0,7 0,7865 0,9729 0,7536 0,7634 0,86325 1,08 0,8858 0,8634 0,9829 1,19 0,9585 0,9653 1,07425
117
Curva padrão da albumina de soro bovino (BSA)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 20 40 60 80 100 120
Concentração ( µg/mL)
Abs
orbâ
ncia
(59
5nm
)
y = 0,0089x - 0,0069R2 = 0,9931
2. Curva padrão obtida com albumina de soro bovino (BSA) usando o método de
Bradford (1976), para determinação da proteína total.
Concentração (µg/mL)
Absorbância1 Absorbância2 Média da Absorbância (595nm)
10 0,0802 0,0808 0,0805 20 0,1711 0,1507 0,1609 30 0,2423 0,2539 0,2481 40 0,3502 0,3524 0,3513 50 0,4428 0,421 0,4319 60 0,5389 0,5133 0,5261 70 0,6687 0,6685 0,6686 90 0,7851 0,7867 0,7859 100 0,851 0,8514 0,8512
118
ANEXO(S)
Todo material de laboratório, meios de cultura, soluções e tampões utilizados foram
esterilizado em autoclave, a 121º C por 15 minutos.
ANEXO A - Meios de cultura
1. Agar YM (WICKERHAM, 1951 apud MAZUR, 1961)
Composto de extrato de levedura 3% (p/v), extrato de malte 3% (p/v), peptona 5%
(p/v), glicose 10% (p/v) e agar 20% (p/v) dissolvidos em água destilada; pH 6,2.
2. Agar MP-5 (HANKIN; LACY, 1984 apud SILVA, 2003)
Composto de ácido poligalacturônico 5% (p/v), glicose 5% (p/v), KH2PO4 4% (p/v),
NaHPO4 6% (p/v), (NH4)2SO4 2% (p/v), extrato de levedura 1% (p/v), FeSO4 0,001% (p/v),
MgSO4 0,20% (p/v), CaCl2 0,001% (p/v), H3BO3 0,00001% (p/v), MnSO4 0,00001% (p/v),
ZnSO4 0,00007% (p/v), CuSO4 0,00005% (p/v), MoO3 0,00001% (p/v) e ágar 15% (p/v)
dissolvidos em água destilada; pH 5,5.
119
3. Agar MP-7 (HANKIN; LACY, 1984 apud SILVA, 2003)
Composto de pectina 5% (p/v), glicose 5% (p/v), KH2PO4 4% (p/v), NaHPO4 6%
(p/v), (NH4)2SO4 2% (p/v), extrato de levedura 1% (p/v), FeSO4 0,001% (p/v), MgSO4 0,20%
(p/v), CaCl2 0,001% (p/v), H3BO3 0,00001% (p/v), MnSO4 0,00001% (p/v), ZnSO4 0,00007%
(p/v), CuSO4 0,00005% (p/v), MoO3 0,00001% (p/v) e ágar 15% (p/v) dissolvidos em água
destilada; pH 7,2.
4. Caldo de fermentação (PATCHING; ROSE, 1969 apud PEREIRA, 2005)
Composto de extrato de levedura 1% (p/v), glicose 10% (p/v), (NH4)2SO4 3% (p/v),
KH2PO4 4,5% (p/v), MgSO4 0,25% (p/v), CaCl2 0,25% (p/v) dissolvidos em água destilada;
pH 5,0.
120
ANEXO B - Soluções, tampões e reagentes
1. Solução de Tris-HCl 1 M (pH 8,0)
Dissolveu-se 121,1 g de Trizma base em 800 mL de água milli-Q, ajustando o pH para
8,0 com HCl e completando-se o volume para 1000 mL com água milli-Q.
2. Solução de Ácido etileno diamino tetra acético (EDTA) 0,5 M (pH 8,0)
Dissolveu-se 37,22 g de EDTA em 160 mL de água milli-Q, ajustando o pH para 8,0
com pastilhas de NaOH e completando-se o volume para 200 mL com água milli-Q.
3. Tampão de extração de DNA, modificado de Doyle e Doyle (1987)
Dissolveu-se (em banho-maria 65ºC) 2 g de CTAB em 28 mL de NaCl 5 M, 10 mL de
Tris-HCl 1 M (pH 8,0) e 4 mL de EDTA 0,5 M. Em seguida, acrescentou-se 2 g de PVP-40 e
pôs no agitador por 10 h, sendo o volume completado para 100 mL com água milli-Q.
4. Tampão Tris-EDTA (TE)
Misturou-se 1 mL de Tris-HCl 1 M (pH 8,0) com 0,2 mL de EDTA 0,5 M (pH 8,0),
completando o volume com água milli-Q para 100 mL.
121
5. Tampão Tris-Acetato/EDTA (TAE) 50X
Dissolveu-se 242 g de Trizma base em 57,1 mL de ácido acético glacial e 100 mL de
EDTA 0,5 M (pH 8,0), sendo o volume completado para 1000 mL com água milli-Q.
6. Solução de ácido acético 0,05 M
Misturou-se 0,29 mL de ácido acético em 100 mL de água milli-Q.
7. Solução de acetato de sódio 0,05 M
Dissolveu-se 0,41 g de acetato de sódio em 100 mL de água milli-Q.
8. Tampão acetato 0,05 M (pH 5,0)
Misturou-se 14,8 mL da solução de ácido acético com 35,2 da solução de acetato de
sódio, sendo o volume completado para 100 mL com água milli-Q.
9. Solução de Fosfato de sódio monobásico 0,05 M
Dissolveu-se 0,695 g de fosfato de sódio monobásico em 100 mL de água milli-Q.
9.1 Solução de Fosfato de sódio dibásico 0,05 M
Dissolveu-se 1,34 g de fosfato de sódio dibásico (heptahidratado) em 100 mL de água
milli-Q.
122
9.2 Tampão fosfato 0,05 M (pH 7,5)
Misturou-se 16,0 mL da solução de fosfato de sódio monobásico com 84,0 mL da
solução de fosfato de sódio dibásico (heptahidratado), sendo o volume completado para 100
mL com água milli-Q.
9.3 Reagente Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) (MILLER, 1959)
Dissolveu-se 10 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico em 500 mL de água destilada a 85ºC.
Em seguida, adicionou-se 200 mL de solução de NaOH 2 N e 300 g de tartarato duplo de
sódio e potássio, completando o volume com água destilada para 1000 mL
9.4 Reagente de Bradford (BRADFORD, 1976)
Dissolveu-se 50 mg de Azul Brilhante de Coomassie G-250 em 25 mL de etanol 95%.
Em seguida, adicionou-se 50 mL de ácido fosfórico 85%, sendo o volume completado para
500 mL com água destilada.
