BIOQUÍMICA Validación del método analítico por ...

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

Escuela Acedemico profesional de Farmacia y Bioquimica

“Validación del método analítico por espectrofotometría

UV/VIS para la cuantificación de albendazol en

suspensiones comerciales”

Tesis II

Para optar el grado académico de Bachiller en Farmacia y

Bioquímica

AUTOR:

PAREDES AYALA, Amarilis Silvia Iris

ASESOR:

Dr. ALVA PLASENCIA, Pedro Marcelo

TRUJILLO-PERÚ

2015

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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DEDICATORIA

A Dios como ser supremo y

creador nuestro y de todo los

nos rodea y por habernos

dado la inteligencia, paciencia

y ser nuestro guía en nuestras.

vidas.

A mis padres Sabina y Mario por

todo el esfuerzo y sacrificio para

brindarme todo el amor, la

comprensión, el apoyo

incondicional y la confianza en

cada movimiento de mi vida y

sobre todo en mis estudios

universitarios.

A mi preciosa hijita Satomy,

por toda la alegría e

inspiración que me brinda

cada día, es mi más grande

regalo del cielo.



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AGRADECIMIENTOS

A mi asesor, el Doctor Q. F.

Pedro Alva Plasencia, por

su apoyo y sobre todo

comprensión en la ejecución

de este trabajo.

Al Sr. Santiago del

Laboratorio de Tecnología

Farmacéutica por su apoyo

en la ejecución de este

trabajo.

A mi amor Ulises por su

tiempo y apoyo incondicional

en la ejecución de este trabajo.



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JURADO

Mg. MAYAR GANOZA YUPANQUI

(PRESIDENTE)

Dr. ERICSON CASTILLO SAAVEDRA (MIEMBRO)

Dr. PEDRO ALVA PLASENCIA (MIEMBRO)



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INDICE

I. INTRODUCCION 1

II. MATERIAL Y METODO 9

III. RESULTADOS 24

IV. DISCUSION 27

V. CONCLUSIONES 30

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 31

ANEXOS



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PRESENTACION

Señores Miembros del Jurado Dictaminador.

Dando cumplimiento a lo establecido por el reglamento interno de la Facultad de

Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, someto a vuestra

honorable consideración y elevado criterio el presente informe de investigación II:

“Validación del método analítico por espectrofotometría UV/VIS para la

cuantificación de albendazol en suspensiones comerciales”.

Esperando vuestra aprobación Señores Miembros del Jurado dejo a su criterio la

calificación del presente informe de investigación.

Trujillo, Enero del 2015

Paredes Ayala, Amarilis Silvia Iris



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RESUMEN

En el presente trabajo de investigación se determinaron los parámetros para la

validación del método analítico espectrofotométrico UV para la cuantificación de

albendazol en suspensión.

En la validación de este método se utilizaron suspensiones comerciales de albendazol

100 mg/5ml, donde se evaluaron los parámetros de: linealidad, exactitud y precisión

(repetibilidad y precisión intermedia). En el ensayo de linealidad se encontró que el

coeficiente de correlación (R) tanto para el sistema como para el método fue 0,9989;

por cual cumple con el criterio (> 0,995). Se encontró que el coeficiente de

determinación (R2) para el sistema y el método fueron de 0,9977 y 0,9978

respectivamente, los cuales cumplen con lo establecido (> 0,990), valores

estadísticamente significativos, lo cual nos demuestra que el método es lineal. El

método es exacto, no existiendo una diferencia significativa entre la recuperación

media (99,79%) y el 100%, además en el test de G de Cochran, el G experimental

(0,636) es menor que el G tabla (0,8709), para el test de t-Student, se encontró un p <

0,05. En el ensayo de precisión se evaluó: la repetibilidad del sistema y el método,

donde se encontraron coeficientes de variación (C.V.) 1,0829 y 1,1732

respectivamente, los cuales cumplen la especificación (C.V.< 2), y la precisión

intermedia, donde el C.V. fue 0,9744, el cual también cumple con el criterio

establecido. Se concluye el método analítico estudiado es lineal, exacto y preciso, y

aplicable para la cuantificación de albendazol en suspensión.

PALABRAS CLAVES: Albendazol, linealidad, exactitud, precisión.



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ABSTRACT

In the present investigation was determined the parameters for validation of UV

spectrophotometric analytical method for quantification of suspensión albendazole.

Linearity, accuracy and precision (repeatability and intermediate precision): In this

method validation trade suspensions of albendazole 100 mg / 5ml, where the

parameters evaluated were used. Linearity in the assay it was found that the

correlation coefficient (R) for the system and method were 0.9989, by which meets

the criteria (> 0.995), it was also found that the coefficient of determination (R2)

system and method was 0.9977 and 0.9978 respectively, which comply with the

provisions (> 0.990), statistically significant values, which shows that the method is

linear. The method is accurate, existendo no significant difference between the mean

recovery (99.79%) and 100%, in addition G Cochran test, the experimental G (0.636)

is less than the table G (0.8709 ), for t-Student test, p <0.05 was found. In the assay

precision was evaluated: the repeatability of the system and method where

coefficients of variation (CV) 1.0829 and 1.1732 respectively, which satisfy the

specification (CV <2) and intermediate precision were found, where CV was 0.9744,

which also meets the established criteria. Is concluded Studied the analytical method

is linear, accurate and precise and is applicable to the quantification of suspensión

albendazole.

KEYWORDS: Albendazole, linearity, accuracy, precision.



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I. INTRODUCCIÓN

El método o técnica analítica consiste en el estudio de cada parte y/o procedimiento,

comprendiendo la causa, la naturaleza y los efectos. El análisis es la observación y

examen de un hecho en particular. Es necesario conocer la naturaleza del fenómeno y

objeto que se estudia para comprender su esencia. El método analítico permite

conocer más del objeto de estudio, con lo cual se pude: explicar, hacer analogías,

comprender mejor su comportamiento y establecer nuevas teorías 1, 2.

Los métodos analíticos son ampliamente utilizados en la industria farmacéutica para

la identificación y cuantificación de los componentes activos, impurezas y productos

de degradación en materias primas y formas terminadas, así como para la

determinación de propiedades específicas que influyen en la acción del producto,

como la disolución y la velocidad de liberación.El objetivo principal de la industria

farmacéutica siempre ha sido producir medicamentos seguros, estables y eficaces.

Esto explica que actualmente constituya una exigencia legal de las agencias

reguladoras y comisiones de Farmacopeas la validación, no sólo de los procesos de

fabricación, sino también, de los métodos de análisis 3.

En el marco del aseguramiento de la calidad, el termino validación tiene muchas

definiciones. Aunque los términos dados son diferentes, el significado es siempre el

mismo: a) especificar e implementar, b) probar si cumple con las especificaciones y

c) documentar. Una de la definiciones más aceptadas de la validación es aquella



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promulgada por las autoridades oficiales de la Food Drugs Administration (FDA):

“Establecimiento de evidencia documentada que provee un alto grado de garantía de

que un proceso especifico producirá, de forma consistente, un producto que cumpla

con sus especificaciones predeterminadas y atributos de calidad” 4, 5.

Otro concepto, que se considera cuando se aplican las Buenas Prácticas de

Manufactura (BPM) en la industria farmacéutica, referente a la validación, es definida

por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como: “El acto documentado para

probar que los procedimientos, procesos, equipos, materiales, o sistemas aplicados

producen efectivamente los resultados esperados” 6.

En el Perú, el organismo regulador de calidad de los medicamentos es la Dirección

General de Insumos y Drogas (DIGEMID), el cual ha elaborado un Manual de

Buenas Prácticas de Manufactura de Productos Farmacéuticos, cuyas normativas son

de cumplimiento obligatorio por parte de los laboratorios farmacéuticos. En el

capítulo V, artículo 11º, del título primero, señala lo siguiente: “Los estudios de

validación constituyen una parte esencial de las BPM, deben efectuarse conforme a

protocolos definidos de antemano. Se debe prestar especial atención a la validación

de los procedimientos de proceso, limpieza y de los métodos analíticos” 7.

En las farmacopeas, para garantizar que los análisis se realicen con la exactitud

yprecisión requerida, los métodos se encuentranvalidados. No obstante, tanto la

variación de los excipientes utilizados en formasterminadas específicas como la

introducción de una nueva sustancia activa,conducen necesariamente a la



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validacióndel método analítico. Este proceso permiteademás, la detección de puntos

débilesen el método, lo que posibilita su desarrolloy puesta a punto 3.

La validación de un método analítico provoca una mayor fiabilidad y aceptación de

los datos generados, estando éstas en proporción con la calidad del proceso de

obtención de los mismos. Es por ello, que su realización es una tarea que puede ser

tediosa, pero las consecuencias de no hacerlo, es seguro, una pérdida de tiempo,

dinero y recursos. Dentro de las razones que justifican la validación de métodos

analíticos se encuentran: a) Demostrar que los métodos son adecuados a los análisis

propuestos en las condiciones descritas. La validación es la herramienta que permite

obtener las pruebas documentales al respecto y b) Trabajar con métodos que ofrezcan

confianza y seguridad en los resultados, lo cual a su vez minimizara el número de

fallos y repeticiones permitiendo un importante ahorro de costos 8, 9.

Los parámetros analíticosque pueden ser considerados en la validaciónde un método

analítico, según se expresa en la United Stated Pharmacopeia (USP) 36, son

exactitud, precisión, especificidad, límite dedetección, límite de cuantificación,

linealidad,rango, tolerancia y robustez 10.

Así, la precisión es un parámetro importante a considerar, el cual refleja la medida en

que los valores de una serie repetida de ensayos analíticos que se realizan sobre una

muestra homogénea son semejantes entre sí. Dentro de su estudio se incluyen: los

ensayos de repetibilidad y reproducibilidad, el primero estudia la variabilidad del

método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra en las mismas



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condiciones operativas (por un mismo analista, con los mismos equipos y reactivos,

etc.) en un mismo ambiente de laboratorio y en un periodo de tiempo corto. El

segundo, mide la precisión de los resultados de ensayos realizados sobre la misma

muestra homogénea, pero ejecutados por diferentes analistas y/o instrumentos, en

días diferentes y se expresa con los mismos parámetros matemáticos que la

repetibilidad 11, 12.

Otro parámetro es la exactitud, el cual nos indica la proximidad entre los resultados

de la prueba obtenidos mediante ese método y el valor verdadero, debe ser

demostrado en todo el rango especificado para el método analítico. La exactitud se

expresa como el porcentaje de recuperación de la cantidad valorada con respecto a la

cantidad conocida del analito añadida a la muestra o como la media obtenida y el

valor aceptado como verdadero, considerando los intervalos de confianza 10, 13.

También tenemos la selectividad que es la capacidad de un método analítico para

medir exacta y específicamente el analito sin interferencias de impurezas, productos

de degradación o excipientes que pueden estar presentes en la muestra.Se expresa

como el grado de inexactitud del método. Su evaluación es especialmente importante

en el caso de los métodos analíticos diseñados para la cuantificación del analito en

formulaciones y en estudios de estabilidad 13,14.

Aunque la especificidad y la selectividad se consideran términos equivalente, algunos

autoreslos diferencian, considerando la selectividad como la capacidad de detectar

simultánea o separadamente sustancias químicas diferentes presentes en una misma



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muestra y a la especificidad como la capacidad de detectar el analito sin interferencias

de otro compuesto. La selectividad se determina comparando los resultados del

análisis de muestras con los resultados del análisis de las muestras en presencia de

productos relacionados 15.

El hecho que sea necesario evaluar unos u otros parámetros dependerá básicamente

del tipo de ensayo; debido a su variedad, se hace necesario establecer categorías que

faciliten el estudio y reconozcan el tipo de información que se requiere para la

validación de un método analítico, según la clasificación de la USP 36, los métodos

se dividen en cuatro categorías: I) Cuantificación de componentes principales de

fármacos a granel o ingredientes activos (incluyendo conservantes) en productos

farmacéuticos terminados, II) Determinación de impureza en fármacos a granel o

productos de degradación en productos farmacéuticos terminados, III) Determinación

de las características de desempeño (disolución, liberación de fármacos) y la IV)

Pruebas de identificación 10, 15.

En la siguiente tabla se indican las características de los datos que normalmente se

requieren para cada una de las categorías de análisis:



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Características

de desempeño

analítico

Categoría I Categoría II Categoría III Categoría IV

Principio

activo

Prueba de

limite

cuantitativa

Prueba de

limite

cualitativa

Físico

químico

desempeño

identificación

Exactitud Si Si * * No

Precisión Si Si No Si No

Especificidad Si Si Si * Si

Límite de

Detección No No Si * No

Límite de

cuantificación No Si No * No

Linealidad Si Si No * No

Intervalo Si Si * * No

* Puede ser requerido dependiendo de la naturaleza de la prueba específica

Fuente: Guía de validación de métodos analíticos - colegio nacional de químicos farmacéuticos

biólogos México, A. C. 16

Por otro lado, el albendazol es un fármaco antihelmíntico de amplio espectro, muy

usado en nuestro medio, pertenece estructuralmente al grupo de los bencimidazoles,

siendo su nombre químico metil-5-(propiltio)-2-bencimidazolcarbamato. Dentro de

sus características físico-químicas, el albendazol posee un peso molecular de 265,3

g/mol y su punto de fusión está en el rango de 208º-210ºC con descomposición. Es

una base débil (pKa1=2,68; pKa2=11,83) y el logP es de 3,5. Se presenta como un

polvo cristalino e incoloro, es prácticamente insoluble en agua, soluble en

dimetilsulfóxido ácido acético, ácidos fuertes o bases y parcialmente soluble en

metanol y cloroformo; puede regenerarse a partir de estas soluciones por

neutralización si no se calienta o conserva durante un periodo demasiado prolongado

17, 18.



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En Perú, se toma como base para la metodología y especificaciones, a la USP; en

donde el método oficial para la determinación de albendazol como materia prima, es

por titulación potenciométrica acido- base y para las formulaciones farmacéuticas se

emplean cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) y cromatografía liquida

acoplada a espectrómetro de masas. También se puede emplear la espectrofotometría

ultravioleta (UV), la cual es un poderoso instrumento en una variedad de

problemasanalíticos, aunque en muchas oportunidadestiene el inconveniente de la

falta de especificidad,debido a la interferencia que se encuentraen los productos de

degradación, los cualesen ocasiones pueden presentar un espectroidéntico al

componente sin degradar y en otraslas concentraciones a determinar es muy pequeñay

está por debajo del límite de sensibilidaddel método o dentro de su error

experimental10, 18, 19.

A nivel mundial, entidades de carácter oficial como la FDA,OMS, USP además de las

farmacopeas europeas consignan la ineludible necesidad de la validación en procesos

analíticos, para el cumplimiento de las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM)en la

industria farmacéutica, todo con la finalidad de garantizar la calidad de un producto

terminado 20, 21,22.



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Se considera conveniente la realización de este trabajo de investigación, debido al

aporte que proporciona, en cuanto a un método de análisis, para el albendazol, siendo

este sencillo, rápido y económico en comparación con los métodos que ofrece la

USPy otros estudios 10, 21, 22, nos planteamos el siguiente problema: ¿Cumple con los

criterios de validación el método analítico espectrofotométrico UV/VIS para la

cuantificación de albendazol en suspensiones comerciales?

Se pretende alcanzar los siguientes objetivos:

Determinar los parámetros de validación del método analítico empleado para

la cuantificación de albendazol en suspensiones.

Establecer si los ensayos de linealidad, exactitud, precisión y especificidad

conducen a validar el método analítico utilizado para la cuantificación de

albendazol en suspensiones.



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II. MATERIAL Y METODO

A. MATERIAL

1. MUESTRA

La muestra estuvo conformada por 10 frascos de albendazol 100 mg/mL,

suspensión del laboratorio GENFAR S. A.

2. REACTIVOS

Albendazol estándar USP.

Ácido clorhídrico (HCl) grado A.C.S

Metanol (MeOH) grado A.C.S

3. EQUIPOS

Balanza analítica.Marca:METTLER TOLEDO.Modelo: AB2004

Ultrasonido.Marca:BRANSON 1510

Espectrofotómetro UV-visible.Marca:GENESYS 10UV

4. OTROS

Agua destilada

Papel watman Nº 1

Material de vidrio de uso de común en el laboratorio



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B. METODO

1. Selección de la técnica analítica

La técnica analítica propuesta por los autores Lourdes Mayet y Helgi Jung-

Cooka, del departamento de Farmacia de la Universidad Nacional

Autónoma de México, es una alternativa espectrofotométrica, que se

fundamenta en la solubilidad de albendazol en medio ácido y cuya lectura

se puede realizar a 310 nm de absorbancia 10, 23.

2. Obtención de la muestra

La adquisición de la suspensión de albendazol 100 mg/5 mL, del

laboratorio GENFAR S. A., se realizó en un establecimiento farmacéutico

del distrito de Trujillo registrado y autorizado por la Gerencia Regional de

Salud (GERESA) La Libertad, cuya elección se hizo al azar desde un

listado de establecimientos proporcionado por la entidad mencionada.

3. Preparación del estándar

Se pesaron 50 mg de albendazol estándar USP, se pasó a una matraz

aforado de 50 mL, se adicionaron 7 mL de metanol acidificado (ácido

clorhídrico 37% - metanol, 2%v/v) para disolver y se aforó con la solución

ácido clorhídrico (HCl) 0,1N, luego se tomaron 5 mL de la solución y se

pasó a una matraz aforado de 50 mL y se aforó con la solución HCl 0,1N;

luego de esta segunda solución se transfirieron 5 mL a una matraz aforado



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de 50 mL y se llevó a volumen con HCl 0,1N (concentración aproximada

0,01mg/mL), la lectura se realizó en el espectrofotómetro a una longitud de

310 nm utilizando como blanco la solución solvente 20, 21.

4. Preparación de la muestra

Se pesaron aproximadamente el equivalente a 100mg de suspensión de

albendazol, se transfirieron a un matraz aforado de 100mL, se adicionó 10

mL de metanol acidificado y se aforó con una solución de ácido clorhídrico

0,1N. Se filtró a través de papel filtro watman Nº 1, descartando los

primeros mililitros. Se transfirieron 5 mL de este filtrado a una matraz

aforado de 50 mL y se llevó a volumen con HCl 0,1N, luego se tomaron5

mL de esta solución y se transfirieron a un matraz aforado de 50 mL, para

llevarlo a volumen con HCl 0,1N (concentración aproximadamente de

0,01mg/mL) 20.

Las lecturas del espectrofotómetro UV se realizaron a una longitud de310

nm, utilizando como blanco el ácido clorhídrico 0,1N. Las concentraciones

fuerondeterminadas a partir del estándar previamente elaborado 10, 20.

5. Cálculos para determinar el contenido 20.

Cont. Albendazol = [Abs mp

Abs St×

[St]

[mp]] × 5



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Donde:

Abs mp = Absorbancia de la muestra

[St] = Concentración de estándar en mg/mL

Abs St = Absorbancia del estándar

[mp] = Concentración de la muestra en mg/mL

6. Validación del método analítico 10, 24, 25.

6.1. Linealidad 10, 21, 25.

A. Linealidad del sistema

El estudio de linealidad de sistema se realizó con soluciones

preparadas a partir del estándar de albendazol correspondiente a

cinco concentraciones de dicho analito, las cuales se encuentran

dentro de los intervalos establecidos por la USP 36: 80, 90, 100,

110 y 120%.

Preparación de la solución stock de albendazolestándar

Se pesaron aproximadamente 50 mg de albendazol y se trasvasaron

a un matraz aforado de 50 mL de capacidad, luego se adicionaron 7

mL de metanol acidificado, y se aforo con HCl 0,1N. Se tomaron 5

mL de esta solución y se pasaron a un matraz aforado de 50 mL,

llevándolo a volumen con HCl 0,1N. Se obtuvo una concentración

de 0,1 mg/mL.



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Preparación de la curva estándar

Estándar al 80%

En un matraz aforado de 50 mL de capacidad, se adicionaron 4 mL

de la solución stock de albendazol y se aforó con ácido clorhídrico

0,1N, se agitó y la lectura se realizó por duplicado.

Estándar al 90%

En un matraz aforado de 50 mL de capacidad, se adicionaron 4,5

mL de la solución stock de albendazol y se aforó con ácido

clorhídrico 0,1N, se agitó y la lectura se realizó por duplicado.

Estándar al 100%




Estándar al 110%


mL de la solución stock de albendazol y se aforó con ácido

clorhídrico 0,1N, se agitó y la lectura se realizó por duplicado.



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Estándar al 120%




B. Linealidad del método10, 21, 22

Preparación de la solución stock de muestra

Se pesaron aproximadamente el equivalente a 100 mg de

suspensión de albendazol, se transfirieron a un matraz aforado de

100mL, se adicionaron 10 mL de metanol acidificado y se aforó con

una solución de ácido clorhídrico 0,1N. Se filtró a través de papel

filtro watman, descartando los primeros mililitros. Se transfirieron 5

mL de este filtrado a una matraz aforado de 50 mL y se llevó a

volumen con HCl 0,1N (concentración aproximadamente de

0,1mg/mL) 21.

Preparación de las muestras

Estándar al 80%


de la solución stock muestra y se aforó con ácido clorhídrico 0,1N,

se agitó y la lectura se realizó por duplicado.



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Estándar al 90%


mL de la solución stock muestra y se aforó con ácido clorhídrico


Estándar al 100%




Estándar al 110%


mL de la solución stock muestra y se aforó con ácido clorhídrico


Estándar al 120%






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6.2. Exactitud 10, 21, 22.

La evaluación de este parámetro se realizó pesando un aproximado

de 100 mg de muestra de albendazol, se transfirió a un matraz

aforado de 100 mL, se adicionaron 10 mL de metanol acidificado y

se llevó a volumen con una solución de ácido clorhídrico 0,1N.Se

filtró a través de papel filtro watman, descartando los primeros

mililitros. Se transfirió 5 mL de este filtrado a una matraz aforado de

50 mL y se llevó a volumen con HCl 0,1N (concentración

aproximadamente de 0,1mg/mL) 21, 23.

Preparación de las muestras

Estándar al 80%

Se transfirió a unmatraz aforado de 50 mL, una cantidad equivalente

a 0,4 mg de la muestra de albendazol, luego se llevó a volumen con

HCl 0,1N, se agitó y la lectura se realizó por triplicado.

Estándar al 100%

Se transfirió a un matraz aforado de 50 mL, una cantidad equivalente


HCl 0,1N, se agitó y la lectura se realizó por triplicado.



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Estándar al 120%

Se transfirió a un matraz aforado de 50 mL, una cantidad equivalente


HCl 0,1N, se agitó y la lectura se realizó por triplicado

6.3. Precisión 10, 24.

Es el grado de concordancia entre las valoraciones al hacerlas

repetidas veces.

6.3.1. Repetibilidad 10, 25.

A. Repetibilidad del sistema

Se prepararon 2 soluciones de estándar de albendazol de acuerdo

al punto 3, trabajándose a 3 niveles diferentes de concentraciones

(80, 100 y 120%), y se midieron 3 veces cada muestra, bajo las

mismas condiciones espectrofotométricas.

B. Repetibilidad del método

Se prepararon 6 muestras de albendazol individuales de

concentraciones aproximadas al 100% de acuerdo al punto 4 y se

midieron 3 veces cada muestra bajo las mismas condiciones

espectrofotométricas.



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6.3.2. Precisión intermedia 10, 24.

El análisis se llevó a cabo por 2 analistas en días diferentes, se

realizaron 3 determinaciones individuales de concentración

aproximada al 100%, su preparación se realizó de acuerdo al punto

4 y se midieron las muestras 3 veces bajo las mismas condiciones.

7. Análisis de los datos

Los datos se sometieron a un análisis estadístico considerando parámetros

descriptivos: promedios, desviación estándar y coeficiente de

determinación. Además se determinaron pruebas inferenciales: T-student y

ANOVA con un nivel de significancia del 5%, (α = 0,05) 25.

7.1. Evaluación estadística de la linealidad 23,25.

LINEALIDAD

Se determina para ambos (el sistema y el método) la curva de calibración

que relaciona respuesta (área, altura, absorbancia, gastos, etc.) con

concentraciones o cantidad de anualito 25.

Se calculó la recta de regresión con el método de ajuste de los mínimos

cuadrados o cálculos directos. Los datos obtenidos a partir de la mejor

recta se utilizaron para estimar matemáticamente el grado de linealidad.

Se determino el coeficiente de correlación, la ordenada al origen y la

pendiente de la recta de regresión.



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La recta de calibración es del tipo:

y = bx + a

Donde:

X: Concentración (mg/mL)

Y: Absorbancia (Abs)

b: Valor de la pendiente

a: Termino independiente (intercepto, estimador de la ordenada de origen)

𝐚 = ∑ 𝒚 − ∑ 𝒙

𝐧 𝐛 =

∑ 𝒙𝒚 − ∑ 𝒙 ∑ 𝒚𝒏

∑ 𝒙𝟐 − (∑ 𝒙)𝟐

𝒏

Serealizó el análisis estadístico de los datos con la finalidad de evaluar la

linealidad y proporcionalidad de método.

Coeficiente de correlación “r”,refleja el grado de relación o ligazón

entre las variables X e Y.

𝑟 =𝑛 ∑ 𝑋𝑌 − ∑ 𝑋 ∑ 𝑌

[𝑛 ∑ 𝑋2 − (∑ 𝑋)2

][𝑛 ∑ 𝑌2 − (∑ 𝑌)2]

Coeficiente de determinación “r2”

Es el cuadrado del coeficiente de correlación “r”, e indica la

proporción de la varianza total de “Y”.

Este coeficiente “r2” debe ser mayor de 0.990, para ser aceptable.



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Test estadístico de linealidad

Significación estadística de la varianza (S2) de la pendiente b:

𝑆𝑋,𝑌2 =

∑ 𝑌2 − 𝑎 ∑ 𝑌 − 𝑏 ∑ 𝑋𝑌

𝑛 − 2

𝑆𝑏2 =

𝑆𝑋,𝑌2

∑ 𝑋2 − (∑ 𝑋)2 𝑛⁄

Desviación estándar relativa (Srel) de la pendiente b:

𝑆𝑏𝑟𝑒𝑙 % =𝑆𝑏

𝑏× 100

Límites de confianza de la pendiente:

𝐵 = 𝑏 ± 𝑡𝑆𝑏

Significación estadística del intercepto (proporcionalidad) a:

𝑆𝑎2 =

𝑆𝑏2 × ∑ 𝑋2

𝑛

Desviación estándar relativa (Srel) de la pendiente b:

𝑆𝑎𝑟𝑒𝑙 % =𝑆𝑎

𝑎× 100

Límites de confianza de la pendiente:

𝐴 = 𝑎 ± 𝑡𝑆𝑎



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Test estadístico del coeficiente de correlación (R):

𝑡𝑅 =|𝑅|√𝑛 − 2

√1 − 𝑅2

Coeficiente de variación de los factores de respuestas.

𝑓 =𝑦

𝑥𝑪. 𝑽. % =

𝑺

�̅�× 𝟏𝟎𝟎

Donde:

y: Absorbancia, área, etc.

x: Concentración mg/mL

C.V.%: coeficiente de variación de f

S: Desviación estándar de f

X̅: Promedio f

Significación estadística de la varianza de la pendiente b: Se aplica

las siguientes formulas estadísticas.

EXACTITUD

La exactitud se expresa como el porcentaje de recuperación en la

valoración de una cantidad conocida de analito añadida sobre la

muestra 25.

Para el cálculo del porcentaje de recuperación se realizara la siguiente

expresión matemática:



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𝐏𝒓𝒆𝒄𝒖𝒑𝒆𝒓𝒂𝒄𝒊𝒐𝒏 =𝐂𝒆𝒏𝒄𝒐𝒏𝒕𝒓𝒂𝒅𝒐𝒔

𝐂𝒂ñ𝒂𝒅𝒊𝒅𝒂× 𝟏𝟎𝟎

Se aplicara el test de igualdad de varianzas: test de G de Cochran, y

para confirmar se empleara el test t-student.

𝑆2 = 𝑉𝑎𝑟𝑖𝑎𝑛𝑧𝑎

Test de t-student

𝑇𝑒𝑥𝑝 =100 − 𝑅√𝑛

𝐶𝑉

Donde:

R : Recuperación media

n : Numero de determinaciones

CV: coeficiente de variación

Test de G –Cochran

𝑮𝒆𝒙𝒑 =𝑺𝒎𝒂𝒙

𝟐

𝑺𝟏𝟐 + 𝑺𝟐

𝟐 + 𝑺𝟑𝟐 + ⋯ 𝑺𝒏

𝟐

PRECISION

Se expresa como el coeficiente de variación (dispersión de los datos

respecto a la media) de una serie de medidas y se calcula por medio de

la siguiente formula estadística 20, 25:



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𝑪. 𝑽. % =𝑺

�̅�× 𝟏𝟎𝟎

Donde:

S: Desviación estándar.

X̅: Media aritmética de los resultados



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III. RESULTADOS

TABLA 1: Evaluación estadística de la linealidad del método para la cuantificación de albendazol en suspensión.

PARAMETROS DE DESEMPEÑO DATOS EVALUADOS CRITERIOS RESULTADOS

LINEALIDAD

LINEALIDAD DEL

SISTEMA

Coeficiente de correlación > 0,995 0,9989

Coeficiente de determinación > 0,990 0,9977

Coeficiente de variación de f(y/x) No mayor a 5% 0,6936432

Prueba T-Student texp>Ttabla(ttabla=2,048) 110,3042

LINEALIDAD DEL

MÉTODO

Coeficiente de correlación > 0,995 0,9989

Coeficiente de determinación > 0,990 0,9978

Coeficiente de variación de f(y/x) No mayor a 5% 0,7204

Prueba T-Student texp>Ttabla (ttabla=2,048) 111,981



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Figura 1: Perfil de la recta para la estimación del grado de linealidad del sistema, para la

cuantificación por espectrofotometría UV de albendazol en suspensión.

Figura 2: Perfil de la recta para la estimación del grado de linealidad del método, para la

cuantificación por espectrofotometría UV de albendazol en suspensión.

TABLA 2:Evaluación estadística de la exactitud del método para la cuantificación de

albendazol en suspensión.

PARAMETROS DE DATOS CRITERIOS RESULTADOS

y = 29.597x - 0.0024R² = 0.9999

0.200

0.250

0.300

0.350

0.400

0.007 0.008 0.009 0.010 0.011 0.012 0.013

AB

SOR

BA

NC

IA

CONCENTRACION (mg/ml)

y = 29.824x - 0.0029R² = 0.9989

0.2000

0.2500

0.3000

0.3500

0.4000

0.0070 0.0080 0.0090 0.0100 0.0110 0.0120 0.0130

AB

SOR

BA

NC

IA




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DESEMPEÑO EVALUADOS

EXACTITUD

Recuperación

promedio (Rprom) 98 – 102% 99,785%

Test G COCHRAN G exp< G tablas

(G tablas=0,8709) 0,636

Test estadístico t de

STUDENT

texp< t tabla (G

(Ttabla=2,306) 1,3643

TABLA 3: Evaluación estadística de la precisión para la cuantificación de albendazol en

suspensión.

PARAMETROS DE

DESEMPEÑO

DATOS

EVALUADOS CRITERIOS RESULTADOS

PRECISION

Repetibilidad del

sistema CV ≤ 2% 1,0829

Repetibilidad del

método CV < 2% 1,1732

Precisión intermedia

Promedio CV < 2% 0,9744



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IV. DISCUSION

En el análisis de la linealidad, la USP 36 recomienda para la valoración de fármaco, se

utilicen normalmente un mínimo de cinco concentraciones, en el intervalo entre 80 a 120%,

cada una por triplicado 10, 16. Es así que, en la tabla 1, se muestran los resultados obtenidos

para el parámetro de linealidad, en donde se evaluó la linealidad del sistema y del método. El

coeficiente de determinación R2 tanto para el sistema como para el método fue de 0,9977 y

0,9978 respectivamente, los cuales cumplen con el criterio (> 0,990), por lo que existe una

elevada correlación lineal entre la respuesta analítica y la concentración de analito en los

rangos analizados, conservando la linealidad esperada. Para confirmar que dicha regresión es

lineal, se aplicó el test de t -Student, cuyos valores de t experimental, para el sistema y el

método, fueron 110,3042 y 111,981 respectivamente, ambos son mayores que el t tabla

(2,048), para el p=0,05% de confianza, por lo que elintervalo de confianza del intercepto

incluye al cero, lo que permite excluir la significación del error del intercepto 25.

También encontramos que los coeficientes de variación (C.V.) del factor de respuesta “f”, del

sistema y del método fueron de 0,694% y 0,720%, respectivamente, cuyo valor no debe ser

mayor del 5%, por tanto ambos valores cumplen con las especificaciones 16.

Otro de los parámetros evaluados es la exactitud, considerada en un procedimiento analítico

como aquella que expresa la proximidad entre el valor que es aceptado convencionalmente

como valor verdadero o un valor referencia y el valor experimental encontrado 10, 24. Se

observa en la tabla 2, el valor de los porcentajes promedio de muestra recuperada de

albendazol fue 99,785%, que se encuentra dentro de los límites de las especificaciones (98 –

102%); al aplicar es test de Cochran, se encontró que el G experimental es menor que el G

tablas (0,636 < 0,8709), lo que significa que las varianzas de las tres concentraciones son

equivalentes, es decir, que la recuperación fue satisfactoria. La recuperación esperada



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depende de la matriz de la muestra, del procedimiento de preparación de la muestra y de la

concentración del analito en la misma 16, 26.

En el test de t - Student, que se aplicó al parámetro de exactitud, el valor obtenido de t

experimental fue de 1,3643, menor que el t tabla (2,306), de este modo se puede afirmar que

el método fue exacto y no se afectó por errores sistemáticos de forma significativa, por lo que

se pueden obtener valores experimentales muy próximos al valor verdadero 26.

En el parámetro de precisión, cuyo objetivo principal es conocer la variabilidad del método,

se determinó: la repetibilidad del sistema y el método, y la precisión intermedia 10, 26. En la

tabla 3, se muestran los coeficientes de variación del sistema y del método, los cuales fueron

de 1,0829% y de 1,1732% respectivamente, los cuales cumplen con el criterio establecido

(C.V. < 2%). El coeficiente de variación (C.V. %) permite deducir el número de replicados

que se deben realizar en el ensayo para un determinado intervalo de aceptación 27.

En este parámetro los resultados obtenidos para la repetibilidad del sistema dependen del

equipo, mientras que la repetibilidad del método depende del proceso de preparación de la

muestra 26, 28.

Finalmente se analizó el parámetro de precisión intermedia, en donde se estudia la variación

que existe cuando el método se emplea por diferentes analistas, en diferentes días y con

diferentes materiales. En la tabla 3, se muestra el resultado obtenido para este parámetro,

siendo el coeficiente de variación (C.V. %) de 0,9744%, el cual cumple con lo establecido (<

3%), lo que se deduce que la técnica analítica es capaz de brindar valores cercanos entre sí,

cuando se aplica por diferentes analistas 26, 28, esto permitirá reemplazar analistas cuando sea

necesario.

De esta manera, se constata que el método es repetible y reproducible, es decir preciso, por lo

que no repercutieron apreciablemente los errores aleatorios en la determinación.



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También cabe mencionar, que el criterio de selectividad no se realizó, ya que, no se cuenta

con un placebo y/o los excipientes de la forma farmacéutica estudiada, por lo que la USP 36 10

y la Guía de Validación Mexicana 16, nos indica que si el método no cuenta con este

parámetro, la validación se sustenta en los resultados obtenidos de la linealidad y la exactitud,

si es que estos cumplieran con los criterios de aceptación.

Por tanto, se puede concluir que los resultados obtenidos en la validación de este método

analítico, cumplen los parámetros establecidos por la literatura, asegurando así su

confiabilidad y utilidad.

V. CONCLUSIONES

El método espectrofotométrico demuestra ser lineal, exacto y preciso, para la

cuantificación de albendazol en suspensión, permitiendo obtener resultados confiables

para su empleo en control de calidad.

Los valores obtenidos para los parámetros de validación (linealidad, exactitud y

precisión) cumplen con los criterios establecidos por la United Stated Pharmacopeia

(USP) 36.



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ANEXOS



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PARTE EXPERIMENTAL DE LA VALIDACION DEL MÉTODO ANALITICO

1. LINEALIDAD

A. LINEALIDAD DEL SISTEMA

Peso

estándar % Teórico Volumen (mL)

Concentración

(mg/mL)

50,3 80 4 0,00805

50,3 90 4,5 0,00905

50,3 100 5 0,01006

50,3 110 5,5 0,01107

50,3 120 6 0,01207

Peso


Concentración

(mg/mL)

50,2 80 4 0,00803

50,2 90 4,5 0,00904

50,2 100 5 0,01004

50,2 110 5,5 0,01104

50,2 120 6 0,01205

Peso


Concentración

(mg/mL)

50,7 80 4 0,00811

50,7 90 4,5 0,00913

50,7 100 5 0,01014

50,7 110 5,5 0,01115

50,7 120 6 0,01217

Cantidad de albendazol:

(𝑚𝑔/𝑚𝑙) =𝑃𝑠𝑡𝑑

50×

5

50×

𝑉𝑜𝑙 (𝑚𝑙)

50



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CALCULOS

Para 5 concentraciones crecientes de albendazol en suspensión (K= número de series =5), se

analizaron por duplicado (N= número de réplicas=2), con un total de 30 determinaciones

(n=30).

Siendo:

X= concentración (mg/ml)

Y= Absorbancia (Abs)

Muestra Concentración

Final (X)

Absorbancia

(Y) XY X2 Y2 f(Y/X)

80-1 0,008048 0,235 0,001891 0,00006477 0,05523 29,1998

80-1 0,008048 0,235 0,001891 0,00006477 0,05523 29,1998

80-2 0,008032 0,236 0,001896 0,00006451 0,05570 29,3825

80-2 0,008032 0,235 0,001888 0,00006451 0,05523 29,2580

80-3 0,008112 0,238 0,001931 0,00006580 0,05664 29,3393

80-3 0,008112 0,239 0,001939 0,00006580 0,05712 29,4625

90-1 0,009054 0,263 0,002381 0,00008197 0,06917 29,0479

90-1 0,009054 0,264 0,002390 0,00008197 0,06970 29,1584

90-2 0,009036 0,268 0,002422 0,00008165 0,07182 29,6591

90-2 0,009036 0,269 0,002431 0,00008165 0,07236 29,7698

90-3 0,009126 0,267 0,002437 0,00008328 0,07129 29,2571

90-3 0,009126 0,268 0,002446 0,00008328 0,07182 29,3666

100-1 0,01006 0,292 0,002938 0,00010120 0,08526 29,0258

100-1 0,01006 0,292 0,002938 0,00010120 0,08526 29,0258

100-2 0,01004 0,297 0,002982 0,00010080 0,08821 29,5817

100-2 0,01004 0,297 0,002982 0,00010080 0,08821 29,5817

100-3 0,01014 0,297 0,003012 0,00010282 0,08821 29,2899

100-3 0,01014 0,297 0,003012 0,00010282 0,08821 29,2899

110-1 0,011066 0,324 0,003585 0,00012246 0,10498 29,2789

110-1 0,011066 0,324 0,003585 0,00012246 0,10498 29,2789

110-2 0,011044 0,326 0,003600 0,00012197 0,10628 29,5183

110-2 0,011044 0,327 0,003611 0,00012197 0,10693 29,6088

110-3 0,011154 0,327 0,003647 0,00012441 0,10693 29,3168

110-3 0,011154 0,327 0,003647 0,00012441 0,10693 29,3168

120-1 0,012072 0,352 0,004249 0,00014573 0,12390 29,1584

120-1 0,012072 0,352 0,004249 0,00014573 0,12390 29,1584

120-2 0,012048 0,358 0,004313 0,00014515 0,12816 29,7145

120-2 0,012048 0,357 0,004301 0,00014515 0,12745 29,6315

120-3 0,012168 0,358 0,004356 0,00014806 0,12816 29,4214

120-3 0,012168 0,358 0,004356 0,00014806 0,12816 29,4214

Suma total 0,3024 8,879 0,091306 0,00310921 2,68143 880,7198



BIBLIO

TECA DE FARMACIA

Y B

IOQUÍM

ICA

46

Promedio 0,01008 0,295966667

29,3573

Calculo de la recta de regresión

y = bx + a

Donde:

X: Concentración (mg/ml)




𝐚 = ∑ 𝒚 − ∑ 𝒙

𝐧 𝐛 =

∑ 𝒙𝒚 − ∑ 𝒙 ∑ 𝒚𝒏

∑ 𝒙𝟐 − (∑ 𝒙)𝟐

𝒏

𝐚 = −0,0022671 𝐛 = 29,58669

Representación gráfica de la recta de regresión.

Y= 29,587X – 0,00227

y = 29.597x - 0.0024R² = 0.9999

0.200

0.250

0.300

0.350

0.400

0.007 0.008 0.009 0.010 0.011 0.012 0.013

AB

SOR

BA

NC

IA




BIBLIO

TECA DE FARMACIA

Y B

IOQUÍM

ICA

47

COEFICIENTE DE CORRELACION Y DETERMINACION

Coeficiente de correlación “r”

𝑟 =𝑛 ∑ 𝑋𝑌 − ∑ 𝑋 ∑ 𝑌

√[𝑛 ∑ 𝑋2 − (∑ 𝑋)2

][𝑛 ∑ 𝑌2 − (∑ 𝑌)2]

𝑟 = 0,9989


𝑟2 = 0,9977

TEST ESTADISTICO DE LINEALIDAD


𝑆𝑋,𝑌2 =

∑ 𝑌2 − 𝑎 ∑ 𝑌 − 𝑏 ∑ 𝑋𝑌

𝑛 − 2

𝑆𝑋,𝑌2 = 4,39023𝑒 − 06

𝑆𝑏2 =

𝑆𝑋,𝑌2

∑ 𝑋2 − (∑ 𝑋)2 𝑛⁄

𝑆𝑏2 = 0,0719463

𝑆2 = 0,2682281

Desviación estándar relativa (SREL) de la pendiente b:

𝑆𝑅𝐸𝐿% =𝑆𝑏

𝑏× 100

𝑆𝑅𝐸𝐿% = 0,9065839



BIBLIO

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Y B

IOQUÍM

ICA

48

B. LINEALIDAD DEL MÉTODO

Peso estándar % Teórico Volumen

(mL)

Concentración

(mg/mL)

99,25 80 4 0,007939641

99,25 90 4,5 0,008932097

99,25 100 5 0,009924552

99,25 110 5,5 0,010917007

99,25 120 6 0,011909462

Peso estándar % Teórico

Volumen

(mL)

Concentración

(mg/mL)

100,26 80 4 0,008020654

100,26 90 4,5 0,009023236

100,26 100 5 0,010025817

100,26 110 5,5 0,011028399

100,26 120 6 0,012030981

Peso estándar % Teórico

Volumen

(mL)

Concentración

(mg/mL)

100,26 80 4 0,008020654

100,26 90 4,5 0,009023236

100,26 100 5 0,010025817

100,26 110 5,5 0,011028399

100,26 120 6 0,012030981

Cantidad de albendazol suspensión:

(𝑚𝑔/𝑚𝑙) =𝑃𝑚𝑠𝑡

100×

5

50×

𝑉𝑜𝑙 (𝑚𝑙)

50



BIBLIO

TECA DE FARMACIA

Y B

IOQUÍM

ICA

49

CALCULOS

Para 5 concentraciones crecientes de albendazol en suspensión (K= número de series =5), se

analizaron por duplicado (N= número de réplicas=2), con un total de 30 determinaciones

(n=30).

Siendo:

X= concentración (mg/ml)

Y= Absorbancia (Abs)

Muestra Concentracion

Final (X)

Absorbancia

(Y) XY X2 Y2 f(Y/X)

80-1 0,00794 0,233 0,001850 0,00006304 0,05429 29,3464

80-1 0,00794 0,233 0,001850 0,00006304 0,05429 29,3464

80-2 0,00802 0,236 0,001893 0,00006433 0,05570 29,4240

80-2 0,00802 0,236 0,001893 0,00006433 0,05570 29,4240

80-3 0,00802 0,234 0,001877 0,00006433 0,05476 29,1747

80-3 0,00802 0,234 0,001877 0,00006433 0,05476 29,1747

90-1 0,00893 0,267 0,002385 0,00007978 0,07129 29,8922

90-1 0,00893 0,267 0,002385 0,00007978 0,07129 29,8922

90-2 0,00902 0,268 0,002418 0,00008142 0,07182 29,7011

90-2 0,00902 0,268 0,002418 0,00008142 0,07182 29,7011

90-3 0,00902 0,264 0,002382 0,00008142 0,06970 29,2578

90-3 0,00902 0,264 0,002382 0,00008142 0,06970 29,2578

100-1 0,00992 0,293 0,002908 0,00009850 0,08585 29,5227

100-1 0,00992 0,293 0,002908 0,00009850 0,08585 29,5227

100-2 0,01003 0,296 0,002968 0,00010052 0,08762 29,5238

100-2 0,01003 0,296 0,002968 0,00010052 0,08762 29,5238

100-3 0,01003 0,296 0,002968 0,00010052 0,08762 29,5238

100-3 0,01003 0,296 0,002968 0,00010052 0,08762 29,5238

110-1 0,01092 0,326 0,003559 0,00011918 0,10628 29,8617

110-1 0,01092 0,326 0,003559 0,00011918 0,10628 29,8617

110-2 0,01103 0,328 0,003617 0,00012163 0,10758 29,7414

110-2 0,01103 0,328 0,003617 0,00012163 0,10758 29,7414

110-3 0,01103 0,327 0,003606 0,00012163 0,10693 29,6507

110-3 0,01103 0,327 0,003606 0,00012163 0,10693 29,6507

120-1 0,01191 0,351 0,004180 0,00014184 0,12320 29,4724

120-1 0,01191 0,351 0,004180 0,00014184 0,12320 29,4724

120-2 0,01203 0,356 0,004283 0,00014474 0,12674 29,5903

120-2 0,01203 0,356 0,004283 0,00014474 0,12674 29,5903

120-3 0,01203 0,352 0,004235 0,00014474 0,12390 29,2578

120-3 0,01203 0,352 0,004235 0,00014474 0,12390 29,2578

Suma total 0,299761867 8,854 0,090258 0,00305521 2,66652 885,8815

Promedio 0,009992062 0,295133333 29,5294



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Y B

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ICA

50

Calculo de la recta de regresión

y = bx + a

Donde:

X: Concentración (mg/ml)




𝐚 = ∑ 𝒚 − ∑ 𝒙

𝐧 𝐛 =

∑ 𝒙𝒚 − ∑ 𝒙 ∑ 𝒚𝒏

∑ 𝒙𝟐 − (∑ 𝒙)𝟐

𝒏

𝐚 = −0,002722 𝐛 = 29,80915

Representación gráfica de la recta de regresión.

Y= 29,809X – 0,00272

y = 29.824x - 0.0029R² = 0.9989

0.2000

0.2500

0.3000

0.3500

0.4000

0.0070 0.0080 0.0090 0.0100 0.0110 0.0120 0.0130

AB

SOR

BA

NC

IA




BIBLIO

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Y B

IOQUÍM

ICA

51

COEFICIENTE DE CORRELACION Y DETERMINACION

Coeficiente de correlación “r”

𝑟 =𝑛 ∑ 𝑋𝑌 − ∑ 𝑋 ∑ 𝑌

√[𝑛 ∑ 𝑋2 − (∑ 𝑋)2

][𝑛 ∑ 𝑌2 − (∑ 𝑌)2]

𝑟 = 0,9989


𝑟2 = 0,9978

TEST ESTADISTICO DE LINEALIDAD


𝑆𝑋,𝑌2 =

∑ 𝑌2 − 𝑎 ∑ 𝑌 − 𝑏 ∑ 𝑋𝑌

𝑛 − 2

𝑆𝑋,𝑌2 = 4,2499𝑒 − 06

𝑆𝑏2 =

𝑆𝑋,𝑌2

∑ 𝑋2 − (∑ 𝑋)2 𝑛⁄

𝑆𝑏2 = 0,07086

𝑆𝑏 = 0,2661988

Desviación estándar relativa (SREL) de la pendiente b:

𝑆𝑅𝐸𝐿% =𝑆𝑏

𝑏× 100

𝑆𝑅𝐸𝐿% = 0,893011



BIOQUÍMICA Validación del método analítico por ...

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