biorreator

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Biorreatores e

Processos Fermentativos

Aula 5 – Profa. Dra Ilana L. B. C. Camargo Ciências Físicas e Biomoleculares

IFSC - USP

Biotecnologia do bioprocesso tem três estágios:

Processo “Upstream”

Biorreatores e biorreação

Processo “Downstream”

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Parte I

Bioprocesso – aplicação industrial de reações ou vias biológicas

mediadas por células vivas inteiras de animais, plantas ou

microrganismos, ou enzimas sobre condições controladas para a

biotransformação de matérias primas em produtos.

Produto – alimento, medicamento ou composto industrial

Bioprocesso também pode ocorrer sem resultar em um produto

direto – biorremediação, desintoxicação de resíduos ou de efluentes

com ou sem subproduto ou derivados

Escala laboratorial Escala industrial

Estágios do processo produtivo

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Biorreatores, reatores bioquímicos, reatores biológicos são os reatores químicos nos quais ocorrem uma série de reações químicas catalisadas por biocatalisadores

Enzimas

Reatores enzimáticos ou

Bioquímicos

Células vivas

Biorreatores ou Reatores Biológicos

Biorreatores

Sistema não asséptico – onde não é absolutamente necessário

se operar com culturas inteiramente puras (sistemas de

descarte de efluentes);

Sistema asséptico – onde as condições de assepsia são pré-

requisitos para a formação do produto com sucesso;

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Nem todo processo de fermentação precisa

ser livre de contaminações!!

Antigamente, a maceração das uvas era feita com os pés!!

Produção caseira dos vinhos

http://www.viagemesabor.com.br/noticias/roteiros/br/norte/para/marajo

Nem todo processo de fermentação precisa ser livre de

contaminações!!

Queijo de leite de búfala

Tanque de maceração das uvas

Produção de vinhos

(Hoje: prensa hidráulica)

Quanto mais controle se tem sobre o processo de fermentação, maior é a

facilidade em se manter a qualidade e garantir a reprodução do processo.

Produção artesanal de queijo, vinho, vinagre, iogurte e cerveja, muitas

vezes eram processadas satisfatoriamente, mesmo sob condições

precárias de assepsia

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Chaim Weizmann e colaboradores, Inglaterra (1914-1918)

Início de FERMENTAÇÃO CONTROLADA

Processo submerso anaeróbio de produção de acetona-butanol

- grande escala com condições total de assepsia;

- condições estritas de anaerobiose (Clostridium

acetobutylicum);

Proteção contra aeróbios, mas não impedia a

contaminação por bacteriófagos!!

Dióxido de enxofre (conservante)

Hoje: prensa hidráulica

Maceração das uvas

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Biorreator ou fermentador


Variação em forma e tamanho dependendo da aplicação

O design do biorreator depende de um número de fatores que incluem:

-Tipo de células

-Tipo de reação metabólica

-Informação sobre a transferência de massa e calor

-Viscosidade e homogeneização

Tamanhos:

-Frascos agitados (erlenmeyers): 100 – 1.000 mL

-Fermentadores de bancada: 1 L – 30L

-Fermentadores piloto: 100 – 1.000 L

-Fermentadores industriais: 1.000 – 1.000.000 L

Também podem ser bandejas, garrafas (fermentação sólida), colunas

(imobilização células ou enzimas)

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1943 – EUA, Primeira planta industrial de fermentação para produção de

penicilina em fermentadores de aço-carbono de 54 m3

• Reatores em aço-carbono

• Sistemas de agitação e aeração

• Fundo e tampa torriesféricos esterilizáveis

• Entrada para a adição de inóculo

• Antiespumante

• Coleta de amostras

•Descarga e saída dos gases

formados durante a fermentação, etc.


Padrões de materiais usados nos fermentadores sofisticados:

Todos os materiais que estão em contato com as soluções ou com a

cultura do organismo devem ser resistentes à corrosão para prevenir a

contaminação do processo com traços de metais;

Não podem ser tóxicos pois se houver alguma dissolução do material

ou componente não haverá inibição do crescimento da cultura;

Materiais precisam suportar repetidas esterilizações por vapor em alta

pressão;

O sistema de agitação, portas de entrada e de saída devem ser rígidas

o suficiente para não deformar ou quebrar sob estresse mecânico;

Inspeção visual do meio e cultura é uma vantagem, por isso deve haver

materiais transparentes quando possível

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Sistema de agitação

Agitadores: turbinas

Sonda pH

Sonda oxigênio dissolvido

Camisa de resfriamento

Reator agitado

mecanicamente

(STR: stirred tank reactor)

• Tanque cilíndrico vertical;

• Agitado mecanicamente ou não;

• Provido de sistema de

aquecimento e resfriamento;

• Demais controles necessários

ao processo;

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Serpentinas

Estudo atual Aumento de escala 12 Kg 800 Kg

http://www.cetem.gov.br/publicacao/CTs/CT2005-084-00.pdf

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Capacidade dos biorreatores de escala

industrial

1- Pequena escala: 1 a 2 m3 de capacidade – cultivo de microrganismos

patogênicos, ou para crescimento de células animais ou vegetais. Em geral, seu

uso tem como objetivo produtos ligados à área de saúde

2 – Escala intermediária: dezenas de metros cúbicos até 100 a 200 m3 –

especificamente empregado na produção de enzimas, antibióticos e vitaminas.

3- Grande escala: reatores com milhares de metros cúbicos de capacidade -

para processos que exigem poucos ou até mesmo nenhum cuidado de

assepsia: fermentação alcoólica ou do tratamento biológico de resíduos

1- O reator deve ser capaz de manter-se estéril por muitos

dias, trabalhar sem problemas por longos períodos e

satisfazer todas as exigências legislativas de contenção

ambiental;

2- As exigências metabólicas dos microrganismos, quanto a

aeração e agitação, devem ser plenamente satisfeitas,

mantendo porém a integridade física dos mesmos;

Função primária de fermentação

• fornecer condições ambientais adequadas ao crescimento

dos microrganismos

Para tanto, 12 pontos devem ser observados:

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6- Um sistema de tomada de amostras à prova de contaminação

do conteúdo do fermentador deve ser parte integrante do

equipamento.

3- A potência absorvida deve ser a menor possível;

4- Um eficiente sistema de controle de temperatura deve estar

disponível;

5- Um sistema de controle de pH deve estar disponível;


7- Perdas por evaporação devem ser mantidas ao mínimo;

8- Eficiente sistema de controle dos gases e saída do

fermentador devem estar disponíveis;

10 – O reator deve preencher, sempre que possível, a

característica de multi-propósito, contudo, a regulamentação

de contenção ambiental e a possibilidade de contaminações

cruzadas podem ser fatores limitantes

9 - O reator deve exigir o mínimo em mão-de-obra para sua

operação, limpeza e manutenção;


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11- O reator deve ter as superfícies internas polidas e todas as

suas conexões, na medida do possível, devem ser soldadas

e não rosqueadas;

12- Na medida do possível, o reator deve manter uma

geometria similar à dos reatores menores ou maiores, a fim

de facilitar a ampliação de escala do processo.


Biorreator de bancada

http://www.faperj.br/boletim_interna.phtml?obj_id=3930

Escala laboratorial ~1L


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Composição: Reatores de bancada

1. Reatores de vidro com fundo arredondado ou chato e tampa

superior de inox ligada ao corpo por uma flange. Diâmetro

máximo = 60 cm.

vidro borossilicato esterilizado em autoclave;

2. Reatores com corpo cilíndrico de vidro, com tampas superior

e inferior em aço inoxidável. Esterilizado in situ (10-20L).

http://www.ars-fla.com/Mainpages/Bio-Reactor/bioreactor.html


Composição: Reatores Pilotos e industriais

Volumes: 50 L a 500 m3

Analisar materiais quanto:

- Capacidade de resistir às pressões de esterilização

- Resistência à corrosão

- Toxicidade dos produtos resultante de uma eventual corrosão;

- Custo do material

Aço inoxidável 316 – considerado adequado

não resolve todos os problemas: produção de ácido cítrico

pH 1 ou pH 2 corrosão

Inox 317 com 3-4% de molibdênio

Classes de aço inox no Brasil segue American Iron and Steel Institute (AISI)

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Tipo de

aço Carbono Cromo Níquel Titânio Molibdênio

304 0,08 18-20 8-11 - -

304L 0,03 18-20 8-11 - -

321 0,08 17-19 9-12 ≥ 5 xC -

316 0,08 16-18 10-14 - 2-3

316L 0,03 16-18 10-14 - 2-3

Tabela 1. Composição de alguns tipos de aços inoxidáveis AISI. Composição nominal (%).

Fermentação com células animais corrosão dos metais pesados insuspeitáveis problemas


Composição: Reatores Pilotos e industriais

Outros materiais:

Cobre (cervejarias – resistência pelas leveduras chega a 30 ppm)

Alumínio – raramente utilizado pois reagentes podem atacá-lo;

Níquel – elevada resistência à corrosão;

Titânio – alto custo;

Vidro borossilicato – instalação de visores;

Plásticos – resistentes à corrosão, mas alguns não resistem

muito a solventes (polietileno, polipropileno, PVC rígido...)

Aço carbono – Ferro + carbono: utilizado nos primeiros reatores

empregados na produção de penicilina. Não é mais utilizado

devido à dificuldade de limpeza e contaminação do produto

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Fermentação microbiana: um sistema de três fases

1. Fase líquida: contém sais, substratos e metabólitos dissolvidos.

Pode também possuir substrato imiscível em água;

2. Fase sólida: consiste nas células, substratos ou produtos insolúveis;

3. Fase gasosa: oxigênio, CO2

1 - Oxigênio 2 - Temperatura 3 - pH

Fatores importantes:

Entrada de Inóculo

meios/nutrientes anti-espumante

Sistema de aeração

Sistema de colheita

de amostras

Sistema de agitação

Sondas para determinação de

pH pO2

Fatores físico-químicos que devem ser

considerados em uma fermentação industrial

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1- Oxigênio

Processos aeróbios têm destaque na Biotecnologia Industrial, pois

estão envolvidos no cultivo de microrganismo para produção de

antibióticos, enzimas, vitaminas, fermentos e inoculantes, proteínas

recombinantes (hormônios, insulina), etc.

Processos fermentativos envolvendo cultivo de células aeróbias ou

aneróbias facultativas visando formação de produtos ou tratamento

biológico de águas residuárias têm em comum o aspecto de exigirem

um adequado dimensionamento do sistema de transferência de

oxigênio (fase gasosa fase líquida)



1- Oxigênio

(Tortora, Funke & Case, 2000)

Último elemento a aceitar elétrons

Permite:

- Armazenamento de energia – ATP;

- Reoxidação das coenzimas que participam

das reações de desidrogenação.

NADH

NADH

NADH



Diagrams:

Prokaryotic Mariana Ruiz

Binary Fission, JW Schmidt6

Participam das reações de síntese de

moléculas levando à sobrevivência

das células e ao surgimento de novas

células no processo de proliferação da

biomassa microbiana, para a qual a

energia é fundamental.

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1- Oxigênio C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O

Para a oxidação de 1 mol de glicose, é necessário o consumo de 6 mols de O2

Glicose é bastante solúvel, já O2 é pouco solúvel em água.

A concentração de oxigênio dissolvido na saturação é apenas da ordem

de 7 mg O2/L (7ppm), ao se borbulhar ar atmosférico à pressão de 1 atm

e a 35oC.

Nada adianta alimentar o biorreator se não houver um ótimo

sistema de transferência de oxigênio

http://www.pptechnologygroup.com/cfd_engineering.htm

- Transferência entre fases gasosa e aquosa;

- Oxigênio dissolvido deve chegar às células;

- Oxigênio deve penetrar nas células;

- Oxigênio deve ser consumido na reação



1- Oxigênio Em reatores não aerados, o oxigênio é

transferido do espaço livre acima do

líquido.

A agitação quebra continuamente a

superfície do líquido e aumenta a área de

transferência.

O efeito da velocidade de agitação na

entrada do gás em um biorreator de 2 L :

300 rpm 450 rpm 750 rpm



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1- Oxigênio Chicanas/Baffles Aumentam a turbulência e assim, melhoram a oxigenação do meio



Análise computacional de dinâmica de fluxos

1- Oxigênio Chicanas, quebra vórtice ou “baffles”

Aumentam a turbulência e assim, melhoram a oxigenação do meio

Normalmente:

4 chicanas equidistantes

Largura: 10% do diâmetro do reator

Devem ser fixadas a 1 ou 2 cm do corpo do

fermentador para evitar zonas de estagnação



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1- Oxigênio Chicanas afastadas da parede do biorreator Evita zonas de estagnação



Co

Co 1

t0 t1

Co

Concentração de Oxigênio dissolvida aumenta com a agitação

Con

cen

tração d

e O

2

Tempo

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1- Oxigênio

Quando a velocidade de agitação é:

Devagar rápida

Injetar ar esterilizado



•Bolhas não serão quebradas tendendo a subir direto para a superfície. Acumulam no eixo do agitador, coalescendo e diminuindo a transferência de oxigênio.

pequena

•as bolhas pequenas irão circular por todo o reator e terão o seu tempo de residência aumentado.

grande

kLa diminui com o

aumento do volume do

líquido

kLa aumenta com a

área superficial do

líquido

kLa é maior quando as

pequenas chicanas estão

presentes



1- Oxigênio

Métodos para aumentar a taxa de transferência de

oxigênio (kLa) no sistema:

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Métodos para aumentar a taxa de transferência de oxigênio (kLa)

no sistema:

-Aumento da pressão;

-Aumento da concentração de O2 no ar inserido no reator;

-Aumento da agitação;

-Aumento do fluxo de ar;

-Redução de espumas e remoção de bolhas de ar da superfície.



• Meio de fermentação: meios ricos em proteínas tendem a

formar mais espuma. Muitas células produzem moléculas

tipo detergente (ácidos nucléicos e proteínas excretadas

após lise das células ou compostos lipídicos produzidos

durante o crescimento);

• Taxa de aeração e velocidade do agitador (, formação

de espuma);

Fatores que favorecem a formação de espuma:


Sistema de Controle de espuma

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Formação excessiva de espuma pode:

1. Bloquear os filtros de saída de ar;

2. Aumentar a pressão do biorreator

O controle é feito com a adição de agentes antiespumantes baseados em

silicone ou óleos vegetais que desestabilizam a espuma pela redução

da tensão superficial.

ON-OFF. Uma parte fica no meio e a

outra acima do nível do líquido.

Quando a espuma atinge a superfície

do sensor que está em cima, existe a

produção de uma corrente elétrica

que é detectada pelo controlador,

resultando na ativação da bomba.

Fatores que auxiliam na diminuição da formação da espuma:

• O volume livre no reator: em sistemas nos quais a espuma é formada

facilmente, o volume de trabalho deve ser reduzido para facilitar o controle de

espuma. Quanto maior o volume livre, maior a probabilidade da espuma

colapsar por causa do seu próprio peso;



• Temperatura do condensador: em reatores de laboratório, uma temperatura mais

baixa pode ajudar no controle da espuma. A densidade da espuma aumenta

quando ela se move de uma região mais quente para a região fria do

condensador, causando o colapso da espuma;

• Quebradores mecânicos de espuma: agitador de alta velocidade. A bolha é

puxada para o agitador e colapsa por ação de forças mecânicas. Em pequenos

reatores de laboratório são utilizados quebradores ultrassônicos, que geram

vibrações de alta frequência responsáveis por quebrar as bolhas da espuma

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Fatores que alteram a aeração de uma cultura microbiana

Geometria do biorreator

Wi

Li

Di C

HL

DT

WB

Geralmente cilíndricos. São construídos em dimensões padrão publicadas pela

International Standards Organisation e British Standards Institution.

Reatores do tipo STR, em geral:

-Tanque cilíndrico

-Relação de altura:diâmetro (H:D)

2:1 ou 3:1

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Wi

Li

Di C

HL

DT

WB

Di = Diâmetro do impelidor (m) DT = Diâmetro do tanque (m)

HL = altura da coluna do líquido (m) C = distância do impelidor ao fundo do reator (m) Wi = altura da pá da turbina (m) WB = altura da chicana (m)

Esquema de tanque agitado por turbinas de pás planas, com indicação de dimensões importantes

na transmissão de potência ao líquido

Máxima potência com mais de um impelidor:

Di < Hi < 2Di

Hi = distância entre impelidores

Número de impelidores para uma máxima transferência de potência

> N˚Impelidores >

HL – Di

Di

HL – 2Di

Di


Razão Valores

Típicos OBS

Altura do líquido do reator e altura do reator Ht/Hl ~ 0,7 - 0,8 Depende do nível de espuma

produzido durante a fermentação

Altura do reator e diâmetro do tanque Ht/Dt ~ 1 - 2

Reatores europeus tendem a ser

mais altos que os projetados nos

EUA

Diâmetro do impelidor e diâmetro do tanque Da/Dt 1/3 – 1/2

Reatores com turb. Rushton são

geralmente 1/3 do diâmetro do

tanque. Os de fluxo axial são

maiores

Largura das chicanas e diâmetro do tanque Lb/Dt ~0,08 – 0,1 Geralmente 10% do diâmetro do

reator

Altura da pá do impelidor e diâmetro do impelidor W/Da 0,2

Largura da pá do impelidor e diâmetro do impelidor L/Da 0,25

Distância média entre o impelidor e a saída de gás e

altura da pá E/W 1


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Fluxos: Axial e Radial


Fluxo axial: o líquido é dirigido para

a base do reator, isto é, paralelo ao

eixo do agitador. São deficientes em

gerar turbulência e quebra das

bolhas de ar, o que os tornam

indesejáveis para cultivos aerados.

Algumas marcas comerciais: Impelidor Lightnin 320, Impelidor KPC – KROMA, Impelidor Pitched

Impelidor Lightnin

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No fluxo radial, o líquido é inicialmente

dirigido a parede do reator, isto é, ao

longo do raio do tanque. Não é tão

eficiente quanto o fluxo axial. Maior

quantidade de energia é necessária

para gerar o mesmo fluxo que o axial;

Algumas marcas comerciais: tipo

Arrowhead, de pás curvas, de pás retas

verticais, Impelidor Rushton, Impelidor

Smith.

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2- Temperatura



Reação no Biorreator

Exotérmica

Endotérmica

Equipamentos devem ter

sistema de transferência

de temperatura.

podem aquecer o sistema e também podem

ser úteis para esterilização do biorreator

antes do início do processo da fermentação;

Sistema de circulação

de vapor e água quente

2- Temperatura



Para o resfriamento de culturas, por

onde pode passar água, por exemplo,

com temperaturas menores

Camisa (Jacket) ou

serpentina de resfriamento

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2- Temperatura



Camisas são cada vez menos utilizadas – reduzida eficiência na

transferência de calor pela circulação irregular do vapor ou da

água de refrigeração;

Serpentinas internas permitem boa troca térmica e eficiente

circulação do fluido em alta velocidade

Inconvenientes:

a) Reduzem significativamente o volume útil do fermentador;

b) Dificultam a limpeza interna;

c) Dificultam a mistura eficiente do meio em fermentadores

agitados mecanicamente;

d) Podem ser um foco adicional de contaminação por defeito nas

soldas difíceis de detectar.

Serpentinas

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3- pH

No biorreator deve haver um sistema de determinação de pH

assim como uma entrada para balancear a reação com

ácido/base que não ofereça nenhum risco de contaminação

para o sistema.

Temperatura e pH também ficam mais homogêneos com a agitação



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Importância da agitação e mistura

Agitação adequada é essencial pois proporciona os seguintes efeitos nas três fases: 1- Dispersão do ar no meio de cultivo 2- Homogeneização para igualar a temperatura, pH e concentração de nutrientes 3- Suspensão dos microrganismos e dos nutrientes sólidos 4- Dispersão de líquidos imiscíveis

Importância da agitação e mistura

Quanto maior a agitação, melhor será o crescimento?

CUIDADO!!

Agitação excessiva pode romper as células e

aumentar a temperatura o que ocasiona uma

redução na viabilidade celular!!

Deve-se buscar o equilíbrio entre a necessidade

de mistura do meio evitando-se o dano celular.

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1. Sistema de agitação;

2. Sistema de distribuição de O2;

3. Sistema de controle de espuma;

4. Sistema de controle de temperatura;

Características básicas de biorreatores

5. Sistema de controle de pH;

6. Portas de amostragem;

7. Sistema de limpeza e esterilização;

8. Linhas para esvaziar o biorreator.

Bibliografia

Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioquímica. Volume 2. Ed Edgard Blücher LTDA, São Paulo, 2001. Cap. 8 e 20 Smith JE. Biotechnology. 4th ed. Cambridge University Press, 2004. Cap. 4

biorreator

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